JP2022533069A - 腸内細菌胆汁酸代謝の小分子モジュレーター - Google Patents

腸内細菌胆汁酸代謝の小分子モジュレーター Download PDF

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Abstract

本明細書に記載されるのは、胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)の阻害に関する方法および組成物、ならびにそれらの使用である。本明細書に提供されるのは、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん、肝臓がん)、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、およびリウマチ性関節炎)の処置を、これを必要とする対象においてするための方法であって、式(I)～(XVIII)で表される化合物を対象へ投与することを含む前記方法である。

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下、2019年5月10日に出願された米国仮出願第(U.S.S.N.)62/846,457号、および2020年1月16日に出願された第62/962,048号(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に対し優先権を主張するものである。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約番号R35 GM128618および5P30DK034854-32の下、政府の支援でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明の分野
本明細書に記載の技術は、胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)を阻害するための化合物、組成物、および方法に関する。
本発明の背景
胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)酵素は、ヒト腸内細菌によって幅広く発現されており、宿主によって産生された一次(primary)胆汁酸の、細菌によって修飾された二次(secondary)胆汁酸への変換へ繋がる入り口の(gateway)反応を触媒する。一次胆汁酸および二次胆汁酸の両方とも、宿主受容体へのリガンドとして作用することによって、宿主における主要な代謝および免疫プロセスを調節する。目下、がん、炎症、肥満、糖尿病、および胃腸疾患などの疾患の処置のためにBSHを阻害し、かつ宿主対象において胆汁酸の生理学を理解するためのツールとして使用する、強力かつ選択的な剤への満たされていないニーズがある。
本発明の概要
一側面において、本明細書に提供されるのは、式(I):
Figure 2022533069000002
式中:
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である;
mは、1、2、3または4である;
Xは、求電子基である;
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、OR18、N(R18)2、SR18、ハロゲン、CN、-CHO、-CO2H、-CO2R18、-NO2、-ONO2、-SO2Cl、-SO3 -、-OSO3 -、-NR18SO3 -、-PO3 2-、-OPO3 2-、-OSO2R18、-SO2N(R18)2、-OSO2N(R18)2、-NR18SO2R18、-SO2N(R18)2、-NHNH2、-ONH2、または-NHC(O)NHNH2である;
各R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;
で表される化合物、またはその薬学的許容し得る塩である。
一側面において、式(I)で表される化合物は、式(I'):
Figure 2022533069000003
式中:
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である;
mは、1、2、3または4である;
Xは、求電子基である;
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、OR18、N(R18)2、SR18、ハロゲン、CN、-CHO、-CO2H、-CO2R18、-NO2、-ONO2、-SO2Cl、-SO3H、-OSO3H、-NR18SO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2R18、-SO2N(R18)2、-OSO2N(R18)2、-NR18SO2R18、-SO2N(R18)2、-NHNH2、-ONH2、または-NHC(O)NHNH2であるが、ここで各R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
別の側面において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される化合物、および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
別の側面において、本明細書に提供されるのは、胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)を阻害するための方法であって、方法は、BSHを、本明細書に提供される化合物と接触させることを含む。
別の側面において、本明細書に提供されるのは、対象における胆汁酸脱抱合を阻害する方法であって、方法は、治療的に有効な量の本明細書に提供される化合物を対象へ投与することを含む。
別の側面において、本明細書に提供されるのは、対象における胆汁酸抱合を促進する方法であって、方法は、治療的に有効な量の本明細書に提供される化合物を対象へ投与することを含む。
別の側面において、本明細書に提供されるのは、対象において胆汁酸をモジュレートする方法であって、方法は、治療的に有効な量の本明細書に提供される化合物を、これを必要とする対象へ投与することを含む。別の側面において、本明細書に提供されるのは、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis)(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏(leaky gut);およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん(colon cancer);食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)例として、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、肝疾患、胆道閉鎖、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ性関節炎)を処置するための方法であって、方法は、式(I)～(XVIII)で表される化合物を、これを必要とする対象へ投与することを含む。遺伝子学的に改変された微生物またはこれらの集団は、コール酸7-スルファートを分泌する。
別の側面において、提供されるのは、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)例として、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、肝疾患、胆道閉鎖、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ性関節炎)の処置を、これを必要とする対象においてするのに使用するための、式(I)～(XVIII)で表される化合物、もしくはこれらの薬学的に許容し得る塩、または式(I)～(XVIII)で表される化合物を含む医薬組成物である。
別の側面において、提供されるのは、式(I)～(XVIII)で表される化合物、もしくその薬学的許容し得る塩、または式(I)～(XVII)で表される化合物を含む医薬組成物、を含むキットである。ある態様において、キットは、投与(例として、ヒト投与)および/または使用のための指示をさらに含む。
本発明のある態様の詳細は、下に記載されるとおり、ある態様の詳細な記載で表される。本発明の他の特色、目的、および利点は、定義、例、図、およびクレームから明らかであろう。
図面の簡単な記載
本特許または本出願は、カラーで作成された少なくとも1の図面を含有する。カラー図面(単数もしくは複数)をもつ本特許または特許出願刊行物のコピーは、請求および必要な手数料の支払いをすれば、庁によって提供されるであろう。
図1Aおよび1Bは、腸内細菌の胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)の化学的効果および生物学的効果を実証する。図1Aは、BSHが、一次(宿主によって産生された)胆汁酸の、二次(細菌によって産生された)胆汁酸への変換における入り口の酵素であることを示す。BSHの除去または阻害は、脱抱合した一次胆汁酸および二次胆汁酸の減少をもたらすはずである。図1Bは、ある一次胆汁酸および二次胆汁酸が、宿主の核ホルモン受容体(NhR)およびGタンパク質共役受容体(GPCR)へのリガンドであることを示す。これらの受容体に対しアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することによって、これらの胆汁酸は、代謝制御および免疫応答を包含する宿主プロセスに影響を及ぼす。
図2A～図2Eは、小分子である、広範囲のBSHインヒビターの合理的デザインを実証する。図2Aは、BSHによる酵素的アミド結合切断の機序を示す。図2Bは、グラム陽性腸内細菌Clostridium perfringensからのBSHと、インヒビターデザインによってガイドされた脱抱合したタウロ-デオキシコール酸(TDCA)(PDB 2BJF)との共結晶構造を示す。疎水性相互作用が活性部位(赤紫色残基)中の胆汁酸コアを正しい方向に置き(orient)つつ、D環側鎖およびアミノ酸は溶媒へ晒されている。図2Cは、合理的にデザインされたインヒビターによるBSH阻害の代表的な機序を示す。触媒に関する求核性システイン残基の、BSH活性部位における攻撃は、インヒビターへの共有結合をもたらし得る。 図2Dは、合成されたインヒビターのライブラリを示す。広範囲のBSHインヒビターを創出するために、キナーゼおよびプロテアーゼのインヒビターのデザイン中へ成功裏に組み込まれた求電子ウォーヘッド(Electrophilic warheads)を、ケノデオキシコール酸胆汁コアへ付け加えた。 図2Eは、ハイスループットスクリーニングから同定された最も強力なBSHインヒビターであるリボフラビンおよびコーヒー酸フェネチルエステル(CAPE)を示すが、これらもまた本研究に包含させた。
図3A～3Bは、スクリーニングによってインヒビター7が組換えBSHの強力かつ長期にわたるインヒビターとして同定されたことを実証する。図3Aは、2時間および21時間での％脱抱合を示すインヒビターライブラリ対B.theta BSHのスクリーニングを示す。図3Bは、2時間および21時間での％脱抱合を示す化合物1、7、およびCAPE対B.longum BSHのスクリーニングを示す。インヒビター(100μM)を200nM rBSHとともに30minsインキュベートし、これに続きタウリンに抱合された胆汁酸基質(TβMCA、TCA、TUDCA、およびTDCA、各25μM)を加えた。基質の脱抱合がUPLC-MSに続いた。アッセイは生物学的に三重に実施した。データは平均値±SEMとして提示されている。
図4A～4Dは、化合物7が、グラム陽性およびグラム陰性の腸内細菌の成長過程にある(growing)培養物において、BSHの強力な非毒性インヒビターであることを示す。図4Aは、化合物7が、生きているグラム陰性(B.theta VPI 5482、Bacteroides fragilis ATCC 25285、およびBacteroides vulgatus ATCC 8482)細菌、ならびにグラム陽性(Lactobacillus plantarum WCFS1、Clostridium perfringens ATCC 13124、およびBifidobacterium adolescentis L2-32)細菌中のBSH活性を阻害することを実証する。インヒビター(100μMの化合物7またはCAPE)およびタウリンに抱合された胆汁酸基質(TβMCA、TCA、TUDCAおよびTDCA、各25μM)を細菌培養物へOD600 0.1にて加えた。細菌培養物を成長させることで定常期に入らせて、24hでのパーセント脱抱合をUPLC-MSによって決定した。アッセイを生物学的に三重に実施した。データを平均値±SEMとして提示する。一元配置(One-way)ANOVAに続きテューキーの多重比較検定をした。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.0001、****p＜0.00001。B.vulgatusについては、再現したものがゼロの標準誤差を有したことから、統計分析を提示していない。図4Bは、化合物7が殺菌性ではないことを示す。細菌培養物のOD600を24時間にて測定した。CAPEは、試験されたグラム陽性株の成長を阻害した。赤色下向き矢印は、DMSO対照と比較されたパーセンテージ減少を指し示す。 図4Cは、B.theta(グラム陰性)とB.adolescentis(グラム陽性)との成長過程にある培養物とともにインキュベートされた化合物7に係る用量応答曲線および算出されたIC50値によって、化合物7が強力な広範囲のBSHインヒビターであることが実証されることを示す。 図4Dは、成長過程にあるB.theta培養物に対しインヒビターの構造によってBSH阻害活性が決定されることを示す代表的なUPLC-MSトレース(traces)を示す。化合物1、7および9を、1および10μM濃度にて試験した。簡略化のため、1種の基質(GUDCA)を細菌培養物へ加えて、そのUDCAへの脱抱合をUPLC-MSによって追跡した。インヒビター9は、コール酸(C12=OH)コアおよびα-FMKウォーヘッドを有するが、B.theta BSHを阻害する活性が有意に衰えていたことを実証する。
図5A～5Cは、化合物7がB.theta BSHを活性部位システイン残基にて共有結合的に修飾することを実証する。図5A～5Bは、質量分析によって化合物7がB.theta BSHを単一標識化する(monolabels)ことが明らかにされたことを示す。図5Aは、DMSO(上、赤色でトレース)で、または10倍過剰インヒビター化合物7で2h(下、緑色でトレース)処置されたBSHの質量スペクトル（左）およびゼロ電荷質量スペクトル(右、重ね合わせた)を示す。388Daの質量シフトは、HFが喪失されたBSHの共有結合修飾と一致する。図5Bは、10倍過剰インヒビター化合物7で処置されたBSHのトップダウン(top-down)MSを示す。タイプcおよびzのイオンは夫々、赤色および緑色の記号(glyphs)で指し示される。イオンc3は、修飾がN末端上Cys2残基にあることを指し示す。図5Cは、B.theta BSHへ結合された化合物7のX線共結晶構造によって、化合物7が活性部位のCys67ではなくCys2へ共有結合的に連結されたこと、およびC25フッ素が除去されていたことが確認されたことを示す。ステロイドコアのC3が溶媒に晒されたが、これはこの部位が修飾を受け入れ得ることを指し示している。
図6A～6Cは、化合物7が最小限のオフターゲット効果を呈することを実証する。図6Aは、FXRコアクチベーター動員アッセイによって決定されたとおり、化合物7が、ファルネソイドX受容体(FXR)のアゴニストでもアンタゴニストでもないことを示す。化合物7のFXRへのFXRアンタゴニスト活性を、知られているFXRアゴニストGW4064の存在下そのEC50値(50nM)にて評価した。n=4は濃度につき生物学的に再現する。データを平均値±SEMとして提示する。図6Bは、化合物7がGタンパク質共役胆汁酸受容体(GPBAR1、またTGR5としても知られている)のアゴニストでもアンタゴニストでもないことを示す。内在性TGR5アゴニスト活性を、濃度を変動させた化合物7とともにCaco-2細胞を終夜インキュベートすることによって測定した。内在性TGR5アンタゴニスト活性を、10μMのTGR5アゴニストLCAの存在下で評価した。n≧3は濃度につき生物学的に再現する。データを平均値±SEMとして提示する。一元配置ANOVAに続きダネットの多重比較検定をした。ns=有意ではない。図6Cは、化合物7が最大50μMの濃度までCaco-2細胞に対し毒性を顕さなかったことを示す。n≧3は濃度につき生物学的に再現する。データを平均値±SEMとして提示する。一元配置ANOVAに続きダネットの多重比較検定をした。*p＜0.05。
図7A～7Fは、化合物7がBSH活性をex vivoおよびin vivoで阻害することを実証する。図7Aは、糞の(fecal)BSH活性アッセイのデザインを示す。従来のマウスから新たに収集された糞(1mg/mL)をPBSに再懸濁し、20μMのインヒビター(化合物1、7、またはCAPE)とともに30分間インキュベートした。グリコケノデオキシコール酸-d4(GCDCA-d4、100μM)を基質として加え、脱抱合を18時間後にUPLC-MSによって決定した。図7Bは、CAPEが最小限の阻害活性を顕した一方で、化合物7が糞スラリー中のBSH活性を有効に阻害したことを示す。in vitroでの結果と矛盾せず、化合物1は中程度のBSH阻害を顕した。アッセイを生物学的に三重に実施した。データを平均値±SEMとして提示する。図7C～7Eは、単回用量の化合物7での従来のマウスの処置が、BSH活性の再生可能な(recoverable)阻害および脱抱合された胆汁酸へのシフトをもたらしたことを示す。群につきn=4マウス、ウェルチのt検定、*p＜0.05、**p＜0.01、ns=有意ではない。図7Cは、in vivoでのBSH阻害実験のデザインを示す。従来のC57BL/6マウス(オス)を単回用量の化合物7(10mg/kg)またはビヒクル対照で強制飼養した(gavaged)。糞を強制飼養から1日後、1.5日後、2日後、および2.5日後に収集した。胆汁酸プロファイリングを強制飼養から1日後に実施した。 図7Dは、糞中のBSH活性によって決定されたとおり、強制飼養から1日および1.5日後のBSH活性が、対照群と比較された化合物7での処置群において有意に低かったことを示す。BSHは強制飼養から2日後に再生していた。BSH活性を、インヒビター処置群またはビヒクル処置群からの新たな糞を基質(GCDCA-d4、100μM)とともに再懸濁し、25minインキュベートし、脱抱合をUPLC-MSによって定量化したことによって決定した。図7Eは、強制飼養から1日後の糞胆汁酸組成物を示す。脱抱合された胆汁酸(二次胆汁酸デオキシコール酸(DCA)を包含する)は、インヒビター処置群において減少した。図7Fは、微生物バイオマス(microbial biomass)が、強制飼養から1日後または2.5日後のインヒビター処置群とビヒクル処置群との間に差がなかったことを示す。群につきn=4マウス、マン・ホイットニー検定。
図8A～8Dは、化合物7の腸内制限(gut-restricted)誘導体である3-硫酸化-リトコール酸-フルオロメチルケトン(3S-LCA-FMK)の投与(固形飼料(chow)中に給餌されたとき)によって1週間にわたりBSH活性の有意な低減がもたらされたことを実証する。図8Aは、3-硫酸化-リトコール酸-フルオロメチルケトン(3S-LCA-FMK)の構造を示す。図8Bは、in vivoでのBSH阻害実験のデザインを示す。従来のC57Bl/6マウス(オス)に、通常の固形飼料または固形飼料中3S-LCA-FMK(0.03％重量/重量)を7日間不断(ad libitum)給餌した(fed)。糞を、飼料(diet)変更前および飼料変更から第3,4,7日後に収集した。群につきn=5マウス。図8Cは、BSH活性が、固形飼料中3S-LCA-FMKを給餌されたマウスの糞において有意に低減していたことを示す。 図8Dは、サクリファイス時の糞および盲腸内容物中の測定された3S-LCA-FMKの濃度を示す。第4日の循環血漿中から3S-LCA-FMKは検出不能であったが、これは化合物が腸に制限されたことを指し示している。
図9Aは、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換における主要な反応が、抱合された一次胆汁酸のC24アミド結合の加水分解(脱抱合)であることを示す。図9Bは、BSHタンパク質配列には腸内株にわたり有意な相違があるものの、すべてのBSHが、保存された活性部位(触媒システイン(Cys2)を包含する)を保有することを示す。図9Cは、Clostridium perfringens BSHと基質タウロデオキシコール酸との共結晶構造を示すが、これによって疎水性相互作用は、アミノ酸が溶媒に晒されたままであると、胆汁酸コアをはめ込み、かつアミドをCys2への正しい方向に置いたことが示された。図9Dは、本開示の化合物を示す。
図10は、2時間および21時間でのタウロ胆汁酸の％脱抱合を示す、インヒビター対B.theta BSH(図10A)およびB.longum BSH(図10B)のスクリーニングを示す。菌株を100μMの抱合された胆汁酸とともにインキュベートし、21hにて播種することで株の生存率を査定した(図10C)。化合物7は殺菌性がない(図10D)。CAPEは、試験されたグラム陰性株の細胞生存率を減少させた。赤色下向き矢印は、DMSO対照と比較された倍率減少を指し示す。(図10C)および(図10D)について、一元配置ANOVAに続きダネットの多重比較検定をした。(図10E)化合物7は糞スラリー中のBSH活性を阻害した。すべてのアッセイを生物学的に三重に実施した。データを平均値±SEMとして提示する。
図11Aは、B.theta BSHへ結合された化合物7のX線構造を示す。BSH(青緑色)はリボン表示で示され、側鎖(青緑色、ヘテロ原子はCPKカラーで)はスティック表示で指し示される。図11Bは、リボンで示されたB.theta BSHと化合物7との共結晶構造(左、青色網として示される化合物の電子密度とともに)および表面(右)表示を示す。C3ヒドロキシル基を包含する7のA環は、溶媒に晒されている。パネルaおよびbを、PYMOLソフトウェア(Schroedinger)を使用して作成した。
図12Aは、オン-およびオフ-ターゲット研究について「クリック可能な(clickable)」7である7-N3(12)の構造を示す。図12Bは、7-N3が従来のマウス糞中で有意なBSH阻害を顕したことを示すが、これはこのプローブがBSHインヒビターとしてその機能を保持したことを示す。図12Cは、7-N3でのB.adolescentis L-32培養物の1時間の処置、これに続く細胞溶解(cell lysis)、Fluor 488-アルキンとのクリック反応、およびたった1種のタンパク質(サイズが～35kDa、注釈付きB.adolescentis BSHの質量)のみのゲル中蛍光顕示標識化(in-gel fluorescence revealed labeling)を使用する可視化を示す。図12Dは、B.adolescentis培養物を7-N3で処置したものからのライセートをデスチオビオチン-アルキンと反応させ、SDS-PAGEによって分解し、銀染色によって視覚化したことを示す。矢印は、BSHの予測分子量(～35kDa)にて、プローブで処置された試料中のバンドを指し示す。図12Eは、化合物7でこの濃度を減少させつつB.adolescentis培養物を処置、これに続く10βM 7-N3での処置、およびFluor 488-アルキンとのクリック反応が、注釈付きB.adolescentis BSHの蛍光標識化の用量依存的増加をもたらしたことを示す。図12Fは、NCI-H716腸細胞の7-N3での1時間の処置、これに続くFluor 488-アルキンとのクリック反応、およびゲル中蛍光による可視化によって、対照で処置された細胞と比較してタンパク質の有意な標識化がもたらされなかったことを示す。(図12B、12C、12D、および12F)について、n=3は条件につき生物学的に再現する。(図12B)について、データを平均値±SEMとして提示する。
図13A～13Cは、単回用量の化合物7での従来のマウスの処置によって、BSH活性の再生可能な阻害および抱合された胆汁酸へのシフトがもたらされたことを示す。群につきn=4マウス、スチューデントt検定。図13Aは、in vivoでのBSH阻害実験のデザインを示す。成体オスC57BL/6マウスを単回用量の化合物7(10mg/kg)またはビヒクル対照で強制飼養した。図13Bは、BSH活性を、強制飼養から1日後に開始して半日単位で(in half-day increments)測定したことを示す。インヒビター処置群またはビヒクル処置群からの再懸濁された新たな糞を基質(GCDCA-d4、100μM)とともに25minインキュベートし、産物の形成をUPLC-MSによって定量化した。群につきn=4マウス、両側(two-tailed)スチューデントt検定。図13Cは、強制飼養から1日後の糞胆汁酸組成物を示す。脱抱合された胆汁酸(二次胆汁酸デオキシコール酸(DCA)を包含する)は、インヒビター処置群において減少していた。群につきn=4マウス、両側スチューデントt検定。図13Dは、細菌のOTU(操作的分類単位)が、強制飼養から1日後のインヒビター処置群とビヒクル処置群との間で差がなかったことを示す。群につきn=4マウス、一元配置ANOVAに続きテューキーの多重比較検定をした。図13Eは、腸内制限化合物7(GR-7、13)の構造を示す。図13Fは、GR-7を用いたin vivoでの概念実証(proof-of-concept)研究のデザインを示す。成体オスC57BL/6マウスに、0.09％(w/w)GR-7を含有する粉末状の固形飼料または粉末状の固形飼料を単独で、30時間給餌した。糞ペレットを飼料変更から8時間後に収集した。群につきn=10マウス。図13Gは、インヒビターまたは対照で処置されたマウスからの再懸濁された新たな糞(20mg/mL)を基質(GCDCA-d4、100μM)とともに25minインキュベートし、産物の形成をUPLC-MSによって定量化したことを示す。対照で処置されたマウスと比較して、BSH活性の有意な阻害が、GR-7で処置された糞において観察された。スチューデントt検定。群につきn=10マウス、両側スチューデントt検定。図13Hは、組織および血漿中のGR-7の定量化を示す。インヒビターを糞中、飼料変更から8時間後に検出し、サクリファイス時に盲腸内容物から検出した。GR-7は肝臓からも血漿からも検出されなかった。N.D.=検出されなかった。群につきn=10マウス。すべてのデータを平均値±SEMとして提示する。
図14は、BSHの精製および速度論的な特徴付けを示す。(図14A)B.theta BSH精製のSDS-PAGE。実験を7回繰り返し、結果は同様であった。(図14B)B.longum BSH精製のSDS-PAGE。BSH速度論的データのミカエリス・メンテン分析。B.theta BSH(図14C)およびB.longum BSH(図14D)に係る、速度 vs 基質濃度の曲線。
図15は、強力な広範囲のBSHインヒビターとしての化合物7の同定を示す。図15A～Bは、5時間でのタウロ胆汁酸の％脱抱合を示す、インヒビター対B.theta BSH(図15A)およびB.longum BSH(図15B)のスクリーニングを示す。インヒビター(100μM)を200nM rBSHとともに30minsインキュベートし、タウリンに抱合された胆汁酸基質(タウロ-β-ムリコール酸、TβMCA;タウロ-コール酸、TCA;タウロ-ウルソデオキシコール酸、TUDCA;およびタウロ-デオキシコール酸、TDCA、各25μM)の添加がこれに続いた。基質の脱抱合に続きUPLC-MSをした。アッセイを生物学的に三重に実施し、すべてのデータを平均値±SEMとして提示する。
図16は、％脱抱合を報告するための胆汁酸定量化、精製されたBSHタンパク質を示す。形成された産物(脱抱合された胆汁酸)および未反応の出発材料(SM)の各時点での濃度を、B.theta BSH(図16A)とB.longum BSH(図16B)との両方についてUPLC-MSを使用し決定した。次いで、各試料に係る％脱抱合を、以下の方程式:％脱抱合=産物の濃度/(産物の濃度+出発材料の濃度)*100を使用して決定した。
図17は、化合物構造が成長過程にあるB.theta培養物に対するBSH阻害活性に影響を及ぼすことを示す。(図17A)化合物8および9は、化合物7より強力ではないB.theta BSHのインヒビターである。インヒビター(10μMの化合物7、8または9)および100μM TUDCAを、OD600が0.1にてB.theta培養物へ加えた。(図17B)化合物7、8および9の構造上の比較。化合物8はα-FMKウォーヘッドを欠き、化合物9はC12=OHヒドロキシル基を保有する。
図18は、化合物7が組換えBSHの強力なインヒビターであることを示す。化合物7に係る用量応答曲線および算出されたIC値。200nM組換えB.theta BSH(図18A、グラム陰性)またはB.adolescentis BSH(図18B、グラム陽性)を、変動させた濃度の化合物7とともに60minsプレインキュベートし、これに続き、抱合される胆汁酸基質TUDCAおよびTDCAを夫々加えた。
図19Aは、B.theta BSHの完全阻害に要される時間を示す。100μM化合物7ならびに抱合される胆汁酸(タウロ-β-ムリコール酸、TβMCA;タウロ-コール酸、TCA;タウロ-ウルソデオキシコール酸、TUDCA;およびタウロ-デオキシコール酸、TDCAの各々25μM)を、プレインキュベーション期間を伴わず、200nM rBSHへ同時に加えた。脱抱合された胆汁酸の形成を、UPLC-MSをベースとしたアッセイを使用して測定し、％変換として報告した。図19Bは、化合物7の存在下では、産物形成の増加が15secs後に観察されなかったことを示すが、これは酵素活性が阻害されたことを指し示している。
図20は、％脱抱合を報告するための胆汁酸定量化、細菌培養物を示す。形成された産物(脱抱合された胆汁酸)(図20A)および未反応の出発材料(SM)(図20B)の、各培養物中の濃度を、UPLC-MSを使用して決定した。次いで、各試料に係る％脱抱合を、以下の方程式:％脱抱合=産物の濃度/(産物の濃度+出発材料の濃度)*100を使用して決定した。
図21は、化合物7が、B.theta BSH KO株とともにインキュベートされたとき、胆汁酸プールを変えなかったことを示す。(図21A)タウリンに抱合された胆汁酸(TCA、TβMCA、TUDCAおよびTDCA、各25μM)の100μMのプールと、100μMインヒビター(化合物7もしくはCAPE)またはDMSOとを、成長過程にあるB.thetaへ加えた。培養物を24hインキュベートし、次いで胆汁酸プロファイリングを、UPLC-MSを使用して実施した。出発材料(TCA、TβMCA、TUDCA、およびTDCA)以外に、胆汁酸は培養物のいずれからも検出されなかった。(図21B)コロニー形成単位(CFU)を、パネル(図21A)におけるアッセイから24h後に決定した。化合物7には、BSHが欠失されたB.thetaに対して殺菌性があることは見出されなかった一方、CAPEはこの細菌の成長に有意に影響及ぼすことが見出された。
図22は、化合物7が、成長過程にある細菌培養物において強力なBSHインヒビターであることを示す。化合物7に係る用量応答曲線および算出されたIC値。B.theta(図22A、グラム陰性)およびB.adolescentis(図22B、グラム陽性)の対数期前の培養物を、抱合される基質(TUDCAまたはTDCA)とともにインキュベートし、夫々48hおよび24h、嫌気的に成長させた。
図23は、質量分析によって、化合物7がB.theta BSHを単一標識化することが明らかにされたことを示す。(図23A)DMSO(上、赤色でトレース)または10倍過剰の化合物7(下、緑色でトレース)で2h処置されたBSHの質量スペクトル(左)およびゼロ電荷質量スペクトル(右)。388Daの質量シフトは、HFが喪失したBSHの共有結合修飾と一致する。2つの独立した標識化反応は同様の結果を生み出した。(図23B)10倍過剰の化合物7で処置されたBSHのトップダウンMS/MS。タイプcおよびzのイオンは夫々、赤色および緑色の記号で指し示される。イオンc3は、修飾がN末端上Cys2残基にあることを指し示す。
図24は、B.theta BSHのApoおよび共結晶構造を示す。B.theta BSH アポタンパク質のX線構造(図24A)を、化合物7へ共有結合的に結合されたB.theta BSHのX線構造上に重ね合わせた(図24B)。BSH(アポを赤紫色で、共結晶構造を青緑色で)はリボン表示で示され、側鎖(夫々赤紫色または青緑色、ヘテロ原子はCPKカラーで)はスティック表示で指し示される。化合物7(緑色、ヘテロ原子はCPKカラーで)はスティック形態で指し示される。ボックス(破線)は、共結晶構造中で再度位置付けられたループ(残基127～138)を指し示す。パネルを、PYMOLソフトウェア(Schroedinger)を使用して作成した。
図25は、化合物7が、FXRまたはTGR5のアゴニストでもアンタゴニストでもなく、ヒト細胞へ毒性がないことを示す。(図25A)化合物7は、FXRコアクチベーター動員アッセイによって決定されたとおり、ファルネソイドX受容体(FXR)アゴニストではない。n=4は濃度につき生物学的に再現する。(図25B)化合物7のFXRアンタゴニスト活性を、FXRアゴニストGW4064の存在下、そのEC50値にて評価した(50nM、対応するアゴニストアッセイにおいて決定されたとおり)。n=4は濃度につき生物学的に再現する。(図25C)化合物7は、Gタンパク質共役胆汁酸受容体(GPBAR1/TGR5)アゴニストではない。内在性TGR5アゴニスト活性を、変動させた濃度の7とともにCaco-2細胞を終夜インキュベートすることによって測定した。n=3は濃度につき生物学的に再現し、一元配置ANOVAに続きダネットの多重比較検定をした。(図25D)内在性TGR5アンタゴニスト活性を、10μMのTGR5アゴニストLCAの存在下、変動させた濃度の化合物7とともにCaco-2細胞を終夜インキュベートすることによって測定した。n=3は濃度につき生物学的に再現し、一元配置ANOVAに続きダネットの多重比較検定をした。(図25E)化合物7が夫々最大50μMおよび100μMの濃度までCaco-2細胞またはNCI-H716細胞に対し毒性を顕さなかったことを示す。n=5およびn=3は夫々、濃度につき生物学的に再現する。一元配置ANOVAに続きダネットの多重比較検定をした。データを平均値±SEMとして提示する。
図26は、化合物7もGR-7も、上皮性関門の完全性(integrity)に有意に影響を及ぼさなかったことを示す。4kDa FITC-デキストランの受動輸送によって測定されたとおり、分化したCaco-2細胞との、化合物7またはGR-7の6時間および12時間インキュベーションによって、上皮単層の完全性は損なわれなかった。n=2はDMSO対照につき生物学的に再現し、n=3はインヒビターで処置された条件生物学的に再現する。すべてのデータを平均値±SEMとして提示する。
図27Aは、化合物7-Nが最小限のオフターゲット反応性でB.adolescentis BSHを標識することを示す。図27Bは、BSHバンドの蛍光強度が定量化されたことを示す。両側スチューデントt検定。データを平均値±SEMとして提示する。図27Cは、図4Hに記載される実験に係る全SDS-PAGEゲルを示す。B.adolescentis培養物を、逓減する濃度の化合物7で1時間処置し、次いで0μM化合物7-Nでもう1時間処置した。BSHの用量依存的な標識化が、逓減する濃度の化合物7で観察された。実験を2度繰り返し、結果が同様であった。図27Dは、生物学的に三重に実施された図4Gに記載の実験に係る銀染色されたゲルを示す。図27Eは、図27Dに指し示されたバンドに対し実施されたゲル中消化のLC-MS/MS分析によって同定されたBSH派生(derived)トリプシンペプチドを示す。赤色で強調されたアミノ酸は、～1％FDRにて同定されたトリプシンペプチドに対しマッピングする。
図28は、7-N3が、哺乳動物細胞において最小限のオフターゲット標識化を顕したことを示す。生物学的に三重に実施された図4Iに記載の実験に係るSDS-PAGEゲル(すなわち、NCI-H716細胞の10μM 7-N3での1時間の処置、これに続く、Fluor 488-アルキンとのクリック反応)。
図29は、化合物7が、細菌群集組成または微生物バイオマスにin vivoで有意に影響を及ぼさなかったことを示す。(図29A)分類群をベースとした分析による門(phylum)レベルでの微生物叢の平均の相対存在量、n=4マウス群。(図29B)CFU/gは、強制飼養から0.5、1、1.5、2または2.5日後のインヒビター処置群とビヒクル処置群との間に差がなかった。群につきn=4マウス、両側マン・ホイットニー検定。すべてのデータを平均値±SEMとして提示する。
図30は、GR-7の活性およびin vivo効果を示す。(図30A)GR-7は、糞スラリー中のBSH活性を阻害した。従来のマウスから新たに収集された糞をPBS(1mg/mL)に再懸濁し、20μMまたは60μMのGR-7とともに30minsインキュベートした。グリコケノデオキシコール酸-d4(GCDCA-d4、100μM)を基質として加え、産物形成をUPLC-MSによって18時間後に決定した。アッセイを生物学的に三重に実施した。(図30B)飼料変更から30時間後の16S rDNAコピー/g盲腸内容物中。微生物バイオマスは、インヒビター処置群とビヒクル処置群との間で差がなかった。両側マン・ホイットニー検定。群につきn=10マウス。すべてのデータを平均値±SEMとして提示する。
図31は、ビヒクルが投薬されたマウスと比較して、従来のマウスにおいて、3S-LCA-FMKによって食糧摂取が低減されることを示す(群につきn=8マウス)。
定義
化学の定義
便宜上、本明細書、例、および添付のクレームに使用されているいくつかの用語および句の意味は、下に提供されている。別様に、または文脈から暗に述べられない限り、以下の用語および句は、下に提供される意味を包含する。定義は提供させることで具体的な態様を記載するのに役立つが、技術の範囲はクレームによってのみ限定されるところ、クレームされた技術を限定することを意図しない。別様に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本技術分野に属する当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。当該技術分野における用語と本明細書に提供されるその定義との間の利用に明らかな相違がある場合、本明細書内に提供される定義を優先させるものとする。
免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,19th Edition,published by Merck Sharp & Dohme Corp.,2011(ISBN978-0-911910-19-3);Robert S.Porter et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine,published by Blackwell Science Ltd.,1999-2012(ISBN 9783527600908);およびRobert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN1-56081-569-8);Immunology by Werner Luttmann,published by Elsevier,2006;Janeway's Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(eds.),Taylor & Francis Limited,2014(ISBN0815345305,9780815345305);Lewin's Genes XI,published by Jones & Bartlett Publishers,2014(ISBN-1449659055);Michael Richard Green and Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN1936113414);Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(2012)(ISBN044460149X);Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch(ed.)Elsevier,2013(ISBN0124199542);Current Protocols in Molecular Biology(CPMB),Frederick M.Ausubel(ed.),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X,9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(ed.),John Wiley and Sons,Inc.,2005;ならびにCurrent Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe,(eds.)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN0471142735,9780471142737)に見出され得るが、これらの内容はすべて、それら全体が本明細書に参照されることによって組み込まれる。
特定の官能基および化学用語の定義は、より詳細に下に記載される。化学元素は、Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.内表紙の元素周期表CAS版に従って同定され、特定の官能基はそこに記載のとおり、一般に定義される。加えて、有機化学の一般法則、ならびに特定の官能部分および反応性は、Thomas Sorrell,Organic Chemistry,University Science Books,Sausalito,1999；Michael B.Smith,March's Advanced Organic Chemistry,7th Edition,John Wiley & Sons,Inc.,New York,2013；Richard C.Larock,Comprehensive Organic Transformations,John Wiley & Sons,Inc.,New York,2018;およびCarruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis,3rd Edition,Cambridge University Press,Cambridge,1987に記載されている。
本明細書に記載の化合物は、1以上の不斉中心を含み得、よって様々な立体異性体の形態、例として鏡像異性体および/またはジアステレオマーで存在し得る。例えば、本明細書に記載の化合物は、個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、または幾何異性体の形態であり得るか、または立体異性体の混合物(ラセミ混合物、および1以上の立体異性体が富化された混合物を包含する)の形態であり得る。異性体は、当業者に知られている方法(キラル高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、およびキラル塩の形成および結晶化を包含する)によって混合物から単離され得る;または好ましい異性体は、不斉合成によって調製され得る。例えば、Jacques et al.,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Wilen et al.,Tetrahedron 33:2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962);およびWilen,S.H.,Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p.268(E.L.Eliel,Ed.,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)を参照。本開示は加えて、他の異性体が実質的にない個々の異性体としても、代わりに様々な異性体の混合物としても化合物を網羅する。
本明細書に記述される化学構造および式は、化学の技術分野において知られている化学原子価(chemical valency)の標準規則に従って構築されている。
置換基が、左から右へ書かれるそれら従来の化学式によって特定されるとき、これらは、右から左へ書かれる構造に由来する化学的に同一の置換基を等しく網羅する(例として、-CH2O-は、-OCH2-と等価である)。
用語「アルキル」は、別様に述べられない限り、それ自体によって、または別の置換基の一部として、直鎖状の(すなわち、非分枝の)または分枝状の炭素鎖(もしくは炭素)あるいはこれらの組み合わせであって、完全飽和、単-または多不飽和であってもよく、かつ指定された炭素原子数を有する(すなわち、C1～C10は、1～10個の炭素を意味する)一価-、二価-および多価ラジカルを包含し得る前記炭素鎖を意味する。アルキルは、非閉環(uncyclized)鎖である。飽和炭化水素ラジカルの例は、これらに限定されないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、(シクロヘキシル)メチル、例えば、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-へプチル、n-オクチル等のホモログおよび異性体などの基を包含する。不飽和アルキル基は、1以上の二重結合または三重結合を有する前記基である。不飽和アルキル基の例は、これらに限定されないが、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、ならびに高級(higher)ホモログおよび異性体を包含する。アルコキシは、分子の残部(remainder)へ酸素リンカー(-O-)を介して付着されたアルキルである。
用語「アルキレン」は、別様に述べられない限り、それ自体によって、または別の置換基の一部として、-CH2CH2CH2CH2-に例示されるとおり(これによって限定されないが)、アルキルに由来する二価ラジカルを意味する。典型的には、アルキル(またはアルキレン)基は、1個から24個までの炭素原子を有するであろうが、本発明においては10個以下の炭素原子を有するそれらの基が好ましい。アルキレンは、非閉環鎖である。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキル基またはアルキレン基であって、一般に8個以下の炭素原子を有する。用語「アルケニレン」は、別様に述べられない限り、それ自体によって、または別の置換基の一部として、アルケンに由来する二価ラジカルを意味する。
用語「ヘテロアルキル」は、別様に述べられない限り、それ自体によって、または別の用語と組み合わせて、少なくとも1個の炭素原子と、O、N、P、SiおよびSからなる群から選択される少なくとも1個のヘテロ原子とを包含する、安定した直鎖状のもしくは分枝状の鎖、またはそれらの組み合わせを意味するが、ここで窒素原子および硫黄原子は任意に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意に四級化されていてもよい。ヘテロアルキルは、非閉環鎖である。ヘテロ原子(単数または複数)O、N、P、S、B、AsおよびSiは、ヘテロアルキル基内部のいずれかの位置にて、またはアルキル基が分子の残部へ付着された位置にて、置かれていてもよい。例は、これらに限定されないが、以下:-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、-CH=CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3、および-CNを包含する。最大2個または3個までのヘテロ原子は、例えば、-CH2-NH-OCH3および-CH2-O-Si(CH3)3など、連続していてもよい。
用語「ヘテロアルキレン」は、別様に述べられない限り、それ自体によって、または別の置換基の一部として、-CH2-CH2-S-CH2-CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-に例示されるとおり(これによって限定されないが)、ヘテロアルキルに由来する二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基についても、ヘテロ原子はまた、鎖の末端のいずれかまたはその両方を占め得る(例として、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等)。またさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンを連結する基について、連結基の配向は、連結基の式が書かれた方向によって黙示されてはいない。例えば、式-C(O)2R'-は、-C(O)2R'-と-R'C(O)2と-の両方を表す。ヘテロアルキレンは、非閉環鎖である。上に記載のとおり、ヘテロアルキル基は、本明細書に使用されるとき、-C(O)R'、-C(O)NR'、-NR'R''、-OR'、-SR'、および/または-SO2R'などのヘテロ原子を通して、分子の残部へ付着されたそれらの基を包含する。「ヘテロアルキル」が記載され、特定のヘテロアルキル基(-NR'R''など、または同種のもの)の列挙がそれに続く場合、用語ヘテロアルキルおよび-NR'R''が冗長でも相容れないものでもないことは理解されるであろう。むしろ、特定のヘテロアルキル基は、明確さを加えるために列挙される。よって、用語「ヘテロアルキル」は本明細書中、特定のヘテロアルキル基(-NR'R''など、または同種のもの)を排除するものとして解釈されないはずである。
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は夫々、別様に述べられない限り、それら自体によって、または他の用語と組み合わせて、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを意味する。加えて、ヘテロシクロアルキルについても、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残部へ付着された位置を占め得る。シクロアルキルまたはヘテロアルキルは、芳香族ではない。シクロアルキルの例は、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロへプチル等を包含する。ヘテロシクロアルキルの例は、これらに限定されないが、1-(1,2,5,6-テトラヒドロピリジル)、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、3-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1-ピペラジニル、2-ピペラジニル等を包含する。「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」は夫々、単独で、または別の置換基の一部として、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルに由来する二価ラジカルを意味する。
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、別様に述べられない限り、それら自体によって、または別の置換基の一部として、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを包含することが意図される。例えば、用語「ハロ(C1～C4)アルキル」は、これらに限定されないが、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピル等を包含する。
用語「アシル」は、別様に述べられない限り、-C(O)Rを意味するが、ここでRは、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。
用語「アリール」は、別様に述べられない限り、単一の環であり得るか、または一緒に縮合された(すなわち、縮環アリール)もしくは共有結合的に連結された複数の環(好ましくは、1個から3個までの環)であり得る、多不飽和の、芳香族の、炭化水素の置換基を意味する。縮環アリールは、一緒に縮合された複数の環を指すが、ここで縮環の少なくとも1個はアリール環である。用語「ヘテロアリール」は、N、OまたはSなどの少なくとも1個のヘテロ原子を含有するアリール基(または環)を指すが、ここで窒素原子および硫黄原子は任意に酸化されていてもよく、窒素原子(単数または複数)は任意に四級化されていてもよい。よって、用語「ヘテロアリール」は、縮環ヘテロアリール基(すなわち、一緒に縮合された複数の環、ここでの縮環の少なくとも1個はヘテロ芳香環である)を包含する。5,6-縮環ヘテロアリーレンは、一緒に縮合された2個の環であって、一方の環は5員を有し、かつ他方の環は6員を有し、ここで少なくとも1個の環はヘテロアリール環である、前記2環を指す。同じく、6,6-縮環ヘテロアリーレンは、一緒に縮合された2個の環であって、一方の環は6員を有し、かつ他方の環も6員を有し、ここで少なくとも1個の環はヘテロアリール環である、前記2環を指す。ならびに、6,5-縮環ヘテロアリーレンは、一緒に縮合された2個の環であって、一方の環は6員を有し、かつ他方の環は5員を有し、ここで少なくとも1個の環はヘテロアリール環である、前記2環を指す。ヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子を通して分子の残部へ付着され得る。アリール基およびヘテロアリール基の非限定例は、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソオキサゾリル、4-イソオキサゾリル、5-イソオキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリル、および6-キノリルを包含する。上に述べられたアリール環系およびヘテロアリール環系の各々に係る置換基は、下に記載の許容し得る置換基の群から選択される。「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」は夫々、単独で、または別の置換基の一部として、アリールおよびヘテロアリールに由来する二価ラジカルを意味する。ヘテロアリール基という置換基は、環ヘテロ原子の窒素へ-O-結合されていてもよい。
「縮環アリール-ヘテロシクロアルキル」は、ヘテロシクロアルキルへ縮合されたアリールである。「縮環ヘテロアリール-ヘテロシクロアルキル」は、ヘテロシクロアルキルへ縮合されたヘテロアリールである。「縮環ヘテロシクロアルキル-シクロアルキル」は、シクロアルキルへ縮合されたヘテロシクロアルキルである。「縮環ヘテロシクロアルキル-ヘテロシクロアルキル」は、別のヘテロシクロアルキルへ縮合されたヘテロシクロアルキルである。縮環アリール-ヘテロシクロアルキル、縮環ヘテロアリール-ヘテロシクロアルキル、縮環ヘテロシクロアルキル-シクロアルキル、または縮環ヘテロシクロアルキル-ヘテロシクロアルキルは、各々独立して、非置換であっても、または本明細書に記載の置換基の1以上で置換されていてもよい。縮環アリール-ヘテロシクロアルキル、縮環ヘテロアリール-ヘテロシクロアルキル、縮環ヘテロシクロアルキル-シクロアルキル、または縮環ヘテロシクロアルキル-ヘテロシクロアルキルは、各々独立して、縮環各々のサイズに従って命名されていてもよい。よって、例えば、6,5アリール-ヘテロシクロアルキル縮環は、5員ヘテロシクロアルキルへ縮合された6員アリール部分を記載する。スピロ環状の環は、2個以上の環であって、隣接する環が単一の原子を通して付着されている。スピロ環状の環内の個々の環は、同一であっても、または異なっていてもよい。スピロ環状の環中の個々の環は、置換されていてもまたは非置換であってもよく、一連のスピロ環状の環内の他の個々の環とは異なる置換基を有していてもよい。スピロ環状の環内の個々の環に係るあり得る置換基は、スピロ環状の環の一部ではないとき、同じ環に係るあり得る置換基である(例として、シクロアルキル環またはヘテロシクロアルキル環に係る置換基)。スピロ環状の環は、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキレン、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレンであってもよく、スピロ環状の環内の個々の環の基は、すぐ先の列挙のいずれかであってもよく、すべての環が1タイプである(例として、すべての環が置換ヘテロシクロアルキレンであって、ここで各環が、同じかまたは異なる置換ヘテロシクロアルキレンであってもよい)場合も包含する。スピロ環状の環系を指すとき、複素環式のスピロ環状の環は、少なくとも1個の環が複素環式の環であって、各環が異なる環であってもよい、スピロ環状の環を意味する。スピロ環状の環系を指すとき、置換されたスピロ環状の環は、少なくとも1個の環が置換されており、かつ各置換基が任意に異なっていてもよいことを意味する。
用語「オキソ」は、本明細書に使用されるとき、炭素原子へ二重結合された酸素を意味する。
上の用語の各々(例として、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」)は、指し示されたラジカルの置換形態と非置換形態との両方を包含する。
本明細書に使用されるとき、用語「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」は、酸素(O)、窒素(N)、硫黄(S)、リン(P)、ホウ素(B)、ヒ素(As)、およびケイ素(Si)を包含することが意図される。
「置換基」は、本明細書に使用されるとき、以下の部分から選択される基を意味する:
(A)オキソ、ハロゲン、-CF3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC=(O)NHNH2、-NHC=(O)NH2、-NHSO2H、-NHC=(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに
(B)以下から選択される少なくとも1個の置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール:
(i)オキソ、ハロゲン、-CF3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC=(O)NHNH2、-NHC=(O)NH2、-NHSO2H、-NHC=(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに
(ii)以下から選択される少なくとも1個の置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール:
(a)オキソ、ハロゲン、-CF3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC=(O)NHNH2、-NHC=(O)NH2、-NHSO2H、-NHC=(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに
(b)以下:オキソ、ハロゲン、-CF3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC=(O)NHNH2、-NHC=(O)NH2、-NHSO2H、-NHC=(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、および非置換ヘテロアリールから選択される少なくとも1個の置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール。
本明細書に使用されるとき、用語「異性体」は、同じ数および種類の原子、ゆえに同じ分子量を有するが、原子の構造上の配置または立体配置に関しては異なる化合物を指す。
用語「互変異性体」は、本明細書に使用されるとき、2以上の構造上の異性体の一方を指すが、これは平衡状態で存在し、かつ一方の異性体の形態から別の形態へ容易に変換される。
本発明のある化合物が互変異性体の形態で存在していてもよく、化合物すべてのかかる互変異性体の形態が本発明の範囲内にあることは、当業者には明らかであろう。
用語「シリルエーテル」は、本明細書に使用されるとき、一般に構造RwRxRySi-O-Rz(式中 Rw、Rx、Ry、およびRzは、独立して、アルキル基またはアリール基である)を有するアルコキシ基へ共有結合的に結合されたケイ素原子を含有する化学化合物を指す。
用語「薬学的に許容し得る塩」は、本明細書に記載の化合物上に見出される具体的な置換基に応じて相対的に非毒性の酸または塩基を用い調製された活性化合物の塩を包含することが意図される。本発明の化合物が相対的に酸性の官能性を含有するとき、塩基付加塩は、中性形態のかかる化合物を、充分な量の所望される塩基(溶媒なし(neat)で、または好適な不活性溶媒中のいずれか)と接触させることによって得られ得る。薬学的に許容し得る塩基付加塩の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウムの塩、または同様の塩を包含する。本発明の化合物が相対的に塩基性の官能性を含有するとき、酸付加塩は、中性形態のかかる化合物を、充分な量の所望される酸(溶媒なし(neat)で、または好適な不活性溶媒中のいずれか)と接触させることによって得られ得る。薬学的に許容し得る酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素酸(monohydrogencarbonic)、リン酸、リン酸一水素酸(monohydrogenphosphoric)、水素リン酸二水素酸(dihydrogenphosphoric)、硫酸、硫酸一水素酸(monohydrogensulfric)、ヨウ化水素酸、または亜リン酸等の無機酸に由来する塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、メタンスルホン酸等の相対的に非毒性の有機酸に由来する塩を包含する。また包含されるのには、アルギニン酸等のアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸等の有機酸の塩もある(例えば、Berge et al.,"Pharmaceutical Salts,"Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1-19を参照)。本発明のある特定の化合物は、化合物が変換されて塩基付加塩または酸付加塩のいずれかになり得る塩基性の官能性と酸性の官能性との両方を含有する。
本明細書に使用されるとき、用語「塩」は、本発明の方法に使用される化合物の酸または塩基の塩を指す。塩の説明に役立つ例は、鉱酸(塩酸、臭化水素酸、リン酸等)の塩、有機酸(酢酸、プロピオン酸、グルタミン酸、クエン酸等)の塩、四級アンモニウム(ヨウ化メチル、ヨウ化エチル等)の塩を包含する。塩という用語はまた、2つの化合物間の塩の形成も指す。
用語「代謝障害」は、炭水化物、脂質、タンパク質、核酸、またはそれらの組み合わせの正常な代謝における変化を伴ういずれの傷害をも指す。代謝障害は、核酸、タンパク質、脂質、および/または炭水化物の代謝において不均衡をもたらす、代謝経路中の欠乏または過剰のいずれかに関連する。代謝に影響を及ぼす因子は、これらに限定されずに、内分泌(ホルモン)制御系(例として、インスリン経路、腸内分泌ホルモン(GLP-1、PYYを包含する)、もしくは同種のもの)、神経制御系(例として、脳中GLP-1)、または同種のものを包含する。代謝障害の例は、これらに限定されないが、糖尿病(例として、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病)、高血糖症、高インスリン血症、インスリン抵抗性、および肥満を包含する。
用語「肥満」は、身体における過剰な脂肪を指す。肥満は、当業者に許容され利用されるいずれかの評価基準(measure)によって決定され得る。目下、許容される肥満の評価基準は、メートル単位の身長(height)の二乗に対するキログラム単位の体重を評価基準とする肥満度指標(body mass index)(BMI)である。一般に、20歳を超える成人について、約18.5と24.9との間のBMIは正常と見なされ、約25.0と29.9との間のBMIは過体重と見なされ、約30.0またはこれを上回るBMIは肥満と見なされ、約40またはこれを上回るBMIは病的肥満と見なされる。(例として、Gallagher et al.(2000)Am J Clin Nutr 72:694-701を参照。)これらのBMI範囲は、疾患への増大したリスクに対する体重の効果に基づく。高BMIおよび肥満に関していくつかの共通する疾病は、心血管疾患、高血圧(すなわち、高血圧症)、骨関節炎、がん、および糖尿病を包含する。BMIは体脂肪と相関するが、BMIと実際の体脂肪との間の関係は、年齢および性別で異なる。例えば、女性は、同じBMIの男性より高いパーセントの体脂肪を有する可能性が高い。さらにまた、正常、過体重、および肥満を分離するBMI閾値は、例として、年齢、性別、民族性、体力(fitness)、および体型などの因子(amongst other factors)で変動し得る。いくつかの態様において、肥満の対象は、本明細書に記載のとおりの処置を施すのに先立ち、肥満度指標が少なくとも約25kg/m2の対象であり得る。いくつかの態様において、肥満の対象は、本明細書に記載のとおりの処置、化合物、または剤の投与に先立ち、肥満度指標が少なくとも約30kg/m2の対象であり得る。
本明細書に使用されるとき、用語「炎症」または「炎症を起こした」または「炎症性の」は、免疫系または免疫細胞(例として、T細胞、B細胞、マクロファージ)の活性化または動員を指す。炎症を有する組織は、赤く、白く、浮腫み、熱く、痛むようになり得るか、機能の喪失を呈し得るか、または薄い膜(film)もしくは粘液を有し得る。炎症を同定する方法は、当該技術分野において周知である。炎症は一般に、微生物による損傷または感染を受けて生じる。いくつかの態様において、感染は、以下:Staphylococcus;Helicobacter pylori;Escherichia coli;Salmonella;Campylobacter;Yersinia enterocolitica;Shingella;Clostridium;Bacteroides;Lactobacillus;Parabacteroides;Bifidobacterium;Listeria;およびStreptococcusからなる群から選択される細菌によって引き起こされる。
本明細書に使用されるとき、用語「炎症性疾患」は、免疫系に影響を及ぼすいずれの疾患も指す。炎症性疾患は、疾患の少なくとも1つの症状を引き起こし得る。これらの症状は、これらに限定されないが、下痢、嘔吐、吐き気、胃のむかつき、疼痛、関節腫脹、倦怠感、発熱、体重減少、体重増加、出勤、便通もしくは糞便(stool)の粘度または頻度のいずれかの変化、あるいは対象における炎症性疾患に関連するいずれの他の症状を包含し得る。いくつかの態様において、炎症性疾患は、自己免疫疾患である。
側面のいずれかのいくつかの態様において、炎症性疾患は、以下:感染症;クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、肝疾患、胆道閉鎖、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ性関節炎、または当該技術分野において知られているいずれの他の炎症性疾患からなる群から選択される。
本明細書に使用されるとき、用語「胃腸疾患」は、胃腸管または腸に影響を及ぼすいずれの疾患も指す。胃腸疾患は、疾患の少なくとも1つの症状を引き起こし得る。これらの症状は、これらに限定されないが、下痢、嘔吐、吐き気、胃のむかつき、疼痛、関節腫脹、倦怠感、発熱、体重減少、体重増加、出勤、便通もしくは糞便の粘度または頻度のいずれかの変化、あるいは対象における胃腸疾患に関連するいずれの他の症状を包含し得る。胃腸疾患の非限定例は、胃腸感染症、炎症性腸疾患(IBD)、胃腸損傷、虫垂炎、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、胃炎、腸炎、食道炎、胃食道逆流症(GERD)、セリアック病、憩室炎、食物不耐性、潰瘍、感染性大腸炎、過敏性腸症候群、腸管壁侵漏、膵炎、糖尿病、肝炎、肝疾患、およびがんを包含する。
本明細書に使用されるとき、用語「肝疾患」は、肝臓に影響を及ぼすいずれの疾患も指す。
肝疾患は、疾患の少なくとも1つの症状を引き起こし得る。これらの症状は、これらに限定されないが、胆汁酸の腸内毒素症、疲労、重量減少、疼痛、皮膚および/または目の黄変、または暗色尿を包含する。肝疾患の例は、これらに限定されないが、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症を包含する。
本明細書に使用されるとき、用語「がん」は、正常な細胞制御の喪失を呈する細胞の過剰増殖を指し、無秩序な成長、分化の欠如、局部組織への浸潤、および転移をもたらす。がんは、固形腫瘍、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫であり得る。本明細書に使用されるとき、用語「腫瘍」は、細胞または組織の正常でない(例として、悪性タイプまたは良性のタイプの)成長を指す。がんの非限定例は、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがんを包含する。
本明細書に使用されるとき、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。大抵、動物は、霊長目の動物、齧歯類の動物、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長目の動物は、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモサル、およびマカク、例として、赤毛猿を包含する。齧歯類の動物は、例えば、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターを包含する。飼育動物および狩猟動物は、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ科の種(例として、飼い猫)、イヌ科の種(例として、イヌ、キツネ、オオカミ)、トリ科の種(例として、ニワトリ、エミュー、ダチョウ)、ならびに魚類(例として、マス、ナマズ、およびサケ)を包含する。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物、例として、霊長目の動物、例として、ヒトである。用語「個体」、「罹患個体(patient)」、および「対象」は本明細書中、互換的に使用される。
本明細書に使用されるとき、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「回復(amelioration)」は、治療的処置を指すが、ここで目的は、疾患に関連する状態の進行もしくは重症度を、逆転(reverse)、軽減(alleviate)、回復(ameliorate)、阻害(inhibit)、遅延(slow down)、または阻止(stop)させることである。用語「処置すること」は、糖尿病の少なくとも1つの弊害もしくは症状を低減または軽減させることを包含する。処置は一般に、1以上の症状または臨床マーカーが低減した場合に「有効」である。代替的に、処置は、疾患の進行が低減または中断した場合に「有効」である。つまり、「処置」は、症状またはマーカーの改善のみならず、処置しない場合に予想されるものと比較して症状の進行もしくは悪化の停止、または少なくともその遅延もまた包含する。有益なまたは所望される臨床治療の結果は、これらに限定されないが、検出可能または検出不能にかかわらず、1以上の症状(単数もしくは複数)の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の安定化した(すなわち、悪化しない)状態、疾患進行の遅滞もしくは遅延、病状の回復または緩和、寛解(部分もしくは完全にかかわらず)、および/または減少した死亡率を包含する。疾患の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副作用からの軽減(緩和処置を包含する)を提供することも包含する。
本明細書に使用されるとき、用語「小分子」は、天然(すなわち、自然界から見出される)もしくは非天然(すなわち、自然界から見出されない)のいずれかの、有機または無機の分子を指すが、これらは、ペプチド、ペプチド模倣薬、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が1モルあたり約10,000グラム未満を有する有機または無機の化合物(例として、ヘテロ有機(heterorganic)および有機金属の化合物を包含する)、分子量が1モルあたり約5,000グラム未満を有する有機または無機の化合物、分子量が1モルあたり約1,000グラム未満を有する有機または無機の化合物、分子量が1モルあたり約500グラム未満を有する有機または無機の化合物、ならびにかかる化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容し得る形態に限定されないが、これらも包含し得る。天然に存在する「小分子」の例は、これらに限定されないが、タキソール、ジネマイシン、およびラパマイシンを包含する。他の好ましいある態様において、天然産物様小分子も利用される。
本明細書に使用されるとき、「化合物」は、いずれの化学物質、試験化学物質、薬物、新しい化学的実体(NCE)、または他の部分も指す。例えば、化合物は、哺乳動物(ヒトを包含する)などの対象において通常は存在しない、いずれの外来化学物質でもあり得る。化合物はまた、哺乳動物(ヒトを包含する)などの生体系において通常存在し合成される内在性の化学物質でもあり得る。例えば、、薬物などの試験化合物などの化合物は、本明細書に提供されるとおりの一次および二次胆汁酸の脱抱合を低減させ得る。
用語「誘導体」は、本明細書に使用されるとき、剤のいずれの化学的、保存的置換、または構造上の修飾を意味する。誘導体は、特定の受容体に対する薬理学、薬物動態、吸収、分布、送達、標的化などの剤もしくは小分子の特徴、または効き目を改善し得る。例えば、小分子について、誘導体は本質的に、少なくとも1つの化学的な修飾～約10の修飾からなり得る。誘導体はまた、剤の対応する塩でもあり得る。誘導体は、本明細書に提供されるとおりの小分子のプロドラッグであり得る。
本明細書に使用されるとき、用語「胆汁酸」は、脂肪の乳化剤として消化を補助するステロイド酸を指し、また様々な全身性の内分泌ホルモン様機能における役割も果たすこともある。哺乳動物の胆汁酸は、肝臓においてコレステロールから一次胆汁酸として合成され、具体的な哺乳動物の腸微生物によって二次胆汁酸へ代謝される。胆汁酸は胆嚢中に蓄えられており、食糧消化の際に十二指腸中へ放出されるが、ここでこれらは、脂質および脂溶性ビタミンの吸収を補助する。胆汁酸の95％超は、回腸において再吸収されて肝臓へ再循環される。残りの～5％は、大多数の腸内細菌が存在する結腸へ入る。次いで、腸内細菌は一次胆汁酸を酵素的に修飾し、二次胆汁酸と呼ばれる一群の分子を産生する。
哺乳動物の胆汁酸は、ファルネソイドX受容体ならびにTGR5などのG-タンパク質共役受容体(GPCR)の活性化によって代謝経路を調節する。これらの多様なシグナリング経路の活性化を通して、胆汁酸は、それら自身の腸肝循環を調節し得るが、トリグリセリド、コレステロール、エネルギー、およびグルコースのホメオスタシスもまた調節し得る。胆汁酸の非限定例は、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸(CDCA)、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸(TCDA)、リトコール酸(LCA)、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、ムリコール酸、オベチコール酸、および当該技術分野において知られているいずれの他の胆汁酸も包含する。用語「胆汁酸」または「胆汁塩」はさらに、胆汁酸、硫酸化胆汁酸、および他の代謝体の塩形態を指し得る。
本明細書に使用されるとき、「胆汁塩ヒドロラーゼ」または「BSH」は、宿主から産生された一次胆汁酸を変換して細菌によって修飾された二次胆汁酸にする、哺乳動物の腸内細菌によって幅広く発現された酵素を指す。図1Aは、BSHによる一次および二次胆汁酸の脱抱合の例、および細菌の胆汁酸修飾酵素による二次胆汁酸への変換を提供する。様々な細菌種のBSHに係る無数のアミノ酸配列が当該技術分野において知られている(例として、NCBI受託番号Accession:ABC26911.1;Accession:ABC26910.1;Accession:ACL98203.1;Accession:AAS98803.1;Accession:AKI55714.1;Accession:AAP20760.1)。BSHは、限定せずに、いずれの細菌のBSH酵素も指し得る。一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換において要となる(keystone)反応は、腸内細菌BSHによる、抱合された一次胆汁酸のC24-アミド結合の加水分解である(図1A)。
本明細書に使用されるとき、「適切な対照」は、処置されなかった以外は同一の細胞または集団(例として、非対照細胞と比較して、本明細書に提供される剤が投与されなかった対象、または本明細書に提供されるほんの一部の剤によって投与された対象)を指す。本明細書に使用されるとき、用語「医薬組成物」は、活性成分(例として、化合物7またはその誘導体)と組み合わされたとき、成分が生物活性を保持でき、かつ対象の免疫系には反応しない、いずれの材料または物質も包含し得る。例は、これらに限定されないが、標準的な医薬担体(リン酸緩衝生理食塩溶液など)、エマルション(油/水エマルションなど)、および様々なタイプの湿潤剤のいずれも包含する。句「薬学的に許容し得る」は、妥当な医学的判断の範囲内にあり、合理的なベネフィット/リスク比に見合う過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症もない、人間および動物の組織との接触における使用に好適な、それらの化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すよう本明細書に採用される。
「剤」は、本明細書に使用されるとき、合成起源または生物学的起源の化学分子である。本発明の文脈において、剤は一般に、医薬組成物において使用され得る分子である。
句「薬学的に許容し得る担体」は、本明細書に使用されるとき、対象とする剤をある器官から(もしくは身体のある部分から)別の器官(もしくは身体の別の部分)へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料などの、薬学的に許容し得る材料、組成物、あるいはビヒクルを意味する。用語「薬学的に許容し得る担体」は、組織培養培地を排除する。各担体は、製剤の他の成分に適合するという意味において「許容し得る」ものでなければならず、例えば、担体は、処置の際に剤の影響を減少させない。換言すれば、担体は、薬学的に不活性である。用語「生理学的に忍容性のある担体」および「生体適合性のある送達ビヒクル」は互換的に使用される。医薬担体の非限定例は、ナノ粒子、マイクロ粒子、ポリマーミクロスフェア、もしくはポリマー-薬物抱合体などの、粒子またはポリマーをベースとしたビヒクルを包含する。
本明細書に使用されるとき、用語「組成物の胃腸管への送達を制限する」は、本明細書に記載の剤もしくは医薬組成物の、結腸(colon)、大腸(large intestine)、または小腸(small intestine)への送達を容認あるいは容易にする、実行可能な形態の製剤を指す。腸溶コーティングまたはマイクロ-もしくはナノ-粒子製剤は、例えば、緩衝剤または他の保護製剤ができるような送達を容易にすることができる。
用語「有効量」は、用語「治療的に有効な量」または「充分な量」と交換可能に使用され、所望される治療結果を獲得する(例えば、糖尿病、肥満、もしくは炎症性疾患の少なくとも1つの症状を「減衰」、低減、または阻止する)のに必要な期間および投薬量での医薬組成物の、少なくとも1つのBSHのインヒビター(例として、式(I)～(XVIII)またはそれらの誘導体のいずれか1つ)の量を指す。例えば、本明細書に開示のとおりの方法を使用する有効量は、糖尿病、肥満、または炎症性疾患の1以上の症状を少なくとも10％まで低減するのに充分な量とみなされるであろう。有効量はまた、本明細書に使用されるとき、かかる症状の発症を予防もしくは遅滞させるのに、疾患の症状の経過を変えるのに(例えば、これらに限定されないが、疾患の症状の進行を遅延させるのに)、または糖尿病、前糖尿病、高血糖症、肥満、もしくは炎症性疾患を患う対象において疾患の症状を逆転させるのに、充分な量も包含するであろう。結果的に、用語「有効量」または「治療的に有効な量」は、本明細書に使用されるとき、疾患の少なくとも1つの症状を軽減する医薬組成物の治療剤(例として、式(I)～(XVIII)で表される化合物またはそれらの誘導体)の量を指す。別の言い方をすれば、本明細書に開示のとおりのBSHのインヒビターの「治療的に有効な量」は、例えば、疾患の症状(例として、炎症性疾患、胃腸疾患、がん、肥満等々)に対して有益な効果を発揮するアゴニストの量である。単回用量または複数回用量として個体へ投与される投薬量は、インヒビターの薬物動態特性、投与ルート、対象の状態および特徴(性、齢(age)、体重、健康状態、サイズ)、症状の程度、並列(concurrent)処置、処置の頻度、および所望される効果を包含する、様々な因子に依存して変動するであろう。治療的に有効な量はまた、治療的に有益な効果が治療剤のいずれの毒性または有害作用よりも上回る量でもある。各個体の症例における有効量は、当該技術分野において確立された方法に従い、かつ過度の実験をせずに、当業者によって経験的に決定され得る。一般に、句「治療的に有効な」および「処置、予防、または阻害に有効な」は、糖尿病、がん、胃腸疾患、肥満、もしくは炎症性疾患の重症度の、またはそれらの関連する症状での低減という目標を達成するであろう、本明細書に開示のとおりのアゴニストを認定する(qualify)ことを意図する。
用語「共投与」または同種のものは、本明細書に使用されるとき、選択された治療剤の単一罹患個体への投与を網羅することが意図され、投与が同じルートもしくは異なるルートによって、または同じ時間もしくは異なる時間にて剤が投与される処置計画を包含することを意図する。
「単位剤形」は、この用語が本明細書に使用されるとき、1回の投与に好適な投薬量を指す。一例として、単位剤形は、送達デバイス(例として、シリンジまたは点滴用バッグ(intravenous drip bag))中に配置された治療薬の量であり得る。側面のいずれかの一態様において、単位剤形は、単回投与において投与される。別の態様において、1単位剤形より多い単位剤形は、同時に投与され得る。
用語「投与される」および「供される」は、疾患または障害の処置という文脈において、互換的に使用される。
人体に対して実践される方法の特許を禁じる法域において、ヒト対象へ組成物を「投与すること」という意味は、ヒト対象がいずれかの技法(例として、経口、吸入、局所適用、注射、挿入等々)によって自己投与するであろう規制物質を処方することが制限されるものとする。特許性のある主題を定義する法律または規則と一致する最も広い合理的な解釈を意図している。人体に対して実践される方法の特許を禁じていない法域において、組成物を「投与すること」は、人体に対して実践される方法も、また上記の活動も、包含する。
本明細書に使用されるとき、用語「投与する」は、所望される効果が生じるように所望される部位にて組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法またはルートによって、対象中へ組成物を置くことを指す。本明細書に記載の化合物または組成物は、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道(エアロゾル)、肺、経鼻、直腸、および局所の(口腔内および舌下を包含する)投与を包含する、経口または非経口のルートを包含する、当該技術分野において知られているいずれの適切なルートによって投与され得る。
句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、本明細書に使用されるとき、大抵注射による、腸内投与および局所投与以外の投与モードを意味し、限定せずに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨下の注射、注入、および他の注射または注入技法を、限定せずに包含する。限定せずに、経口投与は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤、含嗽剤、粉末等の形態であり得る。
本明細書に使用されるとき、用語「モジュレートする」は、所定パラメータ(これらの用語は本明細書に定義されるとおり)を増加または減少させることを包含する効果を指す。
本明細書に使用されるとき、用語「接触させること」は、細胞または器官を参照して使用されるとき、細胞と剤、表面、ホルモン等々との物理的な接触を容認するやり方で、剤、表面、ホルモン等々を、細胞、組織、もしくは器官へ導入または投与することと、剤(miRNA、ポリペプチド、または他の発現産物など)の細胞中の発現を容認する遺伝子構築物またはベクターなどの要素を導入することとの両方を網羅する。剤を発現するよう遺伝子学的に修飾された細胞が剤と「接触させられ」、その剤を発現する細胞の子孫も同様であることは理解されるはずである。
用語「統計的に有意」または「有意」は統計的有意性を指し、一般に2つの標準偏差(2SD)またはより大きな差を意味する。
本明細書に使用されるとき、用語「含むこと」または「含む」は、組成物、方法、およびそれら夫々の構成要素(単数または複数)を参照して使用され、前記構成要素は方法または組成物に不可欠であるが、不可欠か否かにかかわらず、不特定の要素を包含するのにオープンである。
本明細書に使用されるとき、用語「本質的に…からなる」は、所定の態様に要されるそれら要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基本的かつ新規なまたは機能的な特徴(単数もしくは複数)に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在は容認する。
本発明のある態様の詳細な記載
ヒト関連細菌は、健康状態および疾患において欠かせない役割を果たしている。微生物の不均衡は広範な病状へ繋がる。細菌の単一株、複数株、または規定の(defined)群集を定着させた無菌マウスの研究によって、宿主プロセス(代謝、免疫機能、および神経学的応答を包含する)に影響を及ぼす腸内細菌の能力が明らかにされた。特定細菌の代謝体およびタンパク質のレベルを選択的に変化させる化合物は、細菌産物が、複雑な微生物群集を保有する完全成熟動物において宿主の生理学に如何に影響を及ぼすかを評価するのに有用であり得、かつ代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患、がん(例として、肝臓がん)、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、肝疾患、胆道閉鎖、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ性関節炎)などの疾患を処置するための治療法として使用され得る。
本明細書に提供される組成物および方法は、対象において胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)を阻害し、かつ一次および二次胆汁酸の脱抱合をモジュレートする数種の化合物の発見に、一部関する。
本明細書に提供される化合物は、広範囲の細菌において選択的に強力にBSHを阻害し、宿主においてオフターゲット効果を有さず、腸への制限を可能にさせ得、および宿主対象に存在する胆汁酸をモジュレートする。
化合物
一側面において、本明細書に提供されるのは、式(I):
Figure 2022533069000004
式中:
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である;
mは、1、2、3または4である;
Xは、求電子基である;
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、OR18、N(R18)2、SR18、ハロゲン、CN、-CHO、-CO2H、-CO2R18、-NO2、-ONO2、-SO2Cl、-SO3 -、-OSO3 -、-NR18SO3 -、-PO3 2-、-OPO3 2-、-OSO2R18、-SO2N(R18)2、-OSO2N(R18)2、-NR18SO2R18、-SO2N(R18)2、-NHNH2、-ONH2、または-NHC(O)NHNH2であって、ここで各R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;
で表される化合物、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)で表される化合物は、式(I'):
Figure 2022533069000005
式中:
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である;
mは、1、2、3または4である;
Xは、求電子基である;
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、OR18、N(R18)2、SR18、ハロゲン、CN、-CHO、-CO2H、-CO2R18、-NO2、-ONO2、-SO2Cl、-SO3H、-OSO3H、-NR18SO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2R18、-SO2N(R18)2、-OSO2N(R18)2、-NR18SO2R18、-SO2N(R18)2、-NHNH2、-ONH2、または-NHC(O)NHNH2であって、ここで各R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)で表される化合物は、式(I-a):
Figure 2022533069000006
式中:
各R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I-a)で表される化合物は、式(I-a'):
Figure 2022533069000007
式中:
各R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)で表される化合物は、式(I-b):
Figure 2022533069000008
式中:
各R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I-b)で表される化合物は、式(I-b'):
Figure 2022533069000009
式中:
各R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-c):
Figure 2022533069000010
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-d):
Figure 2022533069000011
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I’)で表される化合物は、of 式(I-e):
Figure 2022533069000012
またはその薬学的許容し得る塩。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-f):
Figure 2022533069000013
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-g):
Figure 2022533069000014
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-h):
Figure 2022533069000015
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-i):
Figure 2022533069000016
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-c’):
Figure 2022533069000017
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩であって、
式中:
R3a、R7a、およびR12aは、独立して、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3(R18)2、-OPO3(R18)2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3a、R7a、およびR12aは、独立して、-OR18、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2H、および-SO2NH2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3a、R7a、およびR12aは、独立して、-OR18、-SO3H、および-OSO3Hからなる群から選択されるが、ここでR18は、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3a、R7a、およびR12aは、独立して、-OHおよび-OSO3Hからなる群から選択される。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-d'):
Figure 2022533069000018
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩であって、
式中:
R3aおよびR12aは、独立して、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3(R18)2、-OPO3(R18)2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3aおよびR12aは、独立して、-OR18、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2H、および-SO2NH2からなる群から選択されるが、ここでR18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3aおよびR12aは、独立して、-OHおよび-OSO3Hからなる群から選択される。ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-d''):
Figure 2022533069000019
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-e'):
Figure 2022533069000020
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩であって、
式中:
R3aおよびR7aは、独立して、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3(R18)2、-OPO3(R18)2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3aおよびR7aは、独立して、-OR18、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2H、および-SO2NH2からなる群から選択されるが、ここでR18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3aおよびR7aは、独立して、-OHおよび-OSO3Hからなる群から選択される。ある態様において、R3aは、-OSO3H、およびR7aは、-OR18、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2H、および-SO2NH2からなる群から選択されるが、ここでR18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3aは、-OHであり、ならびにR7aは、-OR18、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2H、および-SO2NH2からなる群から選択されるが、ここでR18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。
ある態様において、式(I-e)で表される化合物は、式(I-e''):
Figure 2022533069000021
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I-e'')で表される化合物は、式:
Figure 2022533069000022
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-f'):
Figure 2022533069000023
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩であって、
式中:
R3aは、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3(R18)2、-OPO3(R18)2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3aは、-OR18、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2H、および-SO2NH2からなる群から選択されるが、ここでR18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3aは、-OSO3Hである。ある態様において、R3aは、-OHである。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-f''):
Figure 2022533069000024
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I-f')で表される化合物は、式(I-f'''):
Figure 2022533069000025
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I-f''')で表される化合物は、式:
Figure 2022533069000026
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-g'):
Figure 2022533069000027
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩であって、
式中:
R3a、R6a、およびR7aは、独立して、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3(R18)2、-OPO3(R18)2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3a、R6a、およびR7aは、独立して、-OR18、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2H、および-SO2NH2からなる群から選択されるが、ここでR18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3a、R6a、およびR7aは、独立して、-OHおよび-OSO3Hからなる群から選択される。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-g''):
Figure 2022533069000028
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-h'):
Figure 2022533069000029
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩であって、
式中:
R7aおよびR12aは、独立して、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3(R18)2、-OPO3(R18)2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R7aおよびR12aは、独立して、-OR18、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2H、および-SO2NH2からなる群から選択されるが、ここでR18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R7aおよびR12aは、独立して、-OHおよび-OSO3Hからなる群から選択される。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-h''):
Figure 2022533069000030
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、式(I-i'):
Figure 2022533069000031
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩であって、
式中:
R3aおよびR6aは、独立して、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3(R18)2、-OPO3(R18)2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3aおよびR6aは、独立して、-OR18、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2H、および-SO2NH2からなる群から選択されるが、ここでR18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3aおよびR6aは、独立して、-OHおよび-OSO3Hからなる群から選択される。
ある態様において、式(I)または式(I')で表される化合物は、of 式(I-i''):
Figure 2022533069000032
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I-c')、(I-d')、(I-e')、(I-f')、(I-g')、(I-h')、または(I-i')のいずれか1つで表される化合物は、置換基R3a、R6a、R7a、またはR12aを含有していてもよい。ある態様において、R3a、R6a、R7a、およびR12aは、独立して、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3(R18)2、-OPO3(R18)2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである。ある態様において、R3a、R6a、R7a、またはR12aのうち少なくとも1の場合は、独立して、-OR18である。ある態様において、R3a、R6a、R7a、またはR12aのうち少なくとも1の場合は、独立して、-SO3R18である。ある態様において、R3a、R6a、R7a、またはR12aのうち少なくとも1の場合は、独立して、-OSO3R18である。ある態様において、R3a、R6a、R7a、またはR12aのうち少なくとも1の場合は、独立して、-PO3(R18)2である。ある態様において、R3a、R6a、R7a、またはR12aのうち少なくとも1の場合は、独立して、-OPO3(R18)2である。ある態様において、R3a、R6a、R7a、またはR12aのうち少なくとも1の場合は、独立して、-OSO2R18である。ある態様において、R3a、R6a、R7a、またはR12aのうち少なくとも1の場合は、独立して、-SO2N(R18)2である。ある態様において、R3aは、-OH、およびR6a、R7a、およびR12aは、独立して、-OHおよび-OSO3Hからなる群から選択される。ある態様において、R3aは、-OSO3Hであり、ならびにR6a、R7a、およびR12aは、独立して、-OHおよび-OSO3Hからなる群から選択される。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、式(I)で表される化合物は、式(II)～(XV):
Figure 2022533069000033
Figure 2022533069000034
のいずれか1つで表される化合物であり得る。
式(I)～(XV)で表される化合物において、Xは、求電子基である。用語「求電子試薬」および「求電子」は、求核攻撃を起こしやすい官能基、すなわち、入ってくる(incoming)求核基(例として、チオール、アミン)との反応を起こしやすい官能基を指す。一般に、求電子基は原子の集団(grouping)であって、前記原子の1以上は電子が欠乏している。大抵、求電子基は、電子を寄せる基を含む。電子を寄せる基の例は、これらに限定されないが、ハロ基、ニトロ基、シアノ基、エステル基、アルデヒド基、ケト基、スルホン基、またはアミド基を包含する。電子を欠乏した原子(単数または複数)は求電子中心と称され、それらの代表的な例は、カルボニル、チオカルボニル、ホスフィニル、およびチオホスフィニルを包含する。例示の求電子基は、これらに限定されないが、 酸ハロゲン化物、イソチオシアナート、イソシアナート、エポキシ、および無水物基を包含する。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、Xは、チオール反応性の求電子基である。用語「チオール反応性の求電子基」は、本明細書に使用されるとき、チオール基の硫黄原子上の孤立電子対によってまたはチオラートアニオンによって求核攻撃を起こしやすい、いずれの基でもある。チオール反応性の求電子基の例は、良好な脱離基を有する基を包含する。例えば、ハロゲン化物を有する、α-ハロカルボニル基、イソチオシアナート基、イソシアナート基、アルキル基、またはそれに付着されたアルコキシ基、および電子欠損ビニル基。いくつかの態様において、Xは、α-ハロカルボニル基またはイソチオシアナート基である。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、Xは、-C(O)R19、-NCS、-NHC(O)R19、-CH=C(CN)CO2R20、または-CNであるが、ここでR19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニル、およびR20は、アルキルである。
ある態様において、Xは、-C(O)R19であるが、ここでR19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである。ある態様において、Xは、-C(O)R19であるが、ここでR19は、-CH2Fである。ある態様において、Xは、-NCSである。ある態様において、Xは、-NHC(O)R19であるが、ここでR19は、アルキル(例として、Me、Et、Pr)、ハロアルキル(例として、CH2F)であり、ある態様において、Xは、-CH=C(CN)CO2R20であるが、ここでR20は、アルキルである。ある態様において、Xは、-CNである。
ある態様において、Xは、
Figure 2022533069000035
からなる群から選択される求電子基である。
ある態様において、Xは、
Figure 2022533069000036
である。ある態様において、Xは、
Figure 2022533069000037
である。ある態様において、Xは、
Figure 2022533069000038
である。ある態様において、Xは、
Figure 2022533069000039
である。ある態様において、Xは、
Figure 2022533069000040
である。ある態様において、Xは、
Figure 2022533069000041
である。ある態様において、Xは、
Figure 2022533069000042
いくつかの態様において、Xは、-C(O)R19または-NCSであるが、ここでR19は、ハロアルキルである。例えば、Xは、-C(O)CH2Fまたは-NCSである。
ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、Hである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、置換または非置換のアルキルである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、置換または非置換のヘテロアルキルである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、置換または非置換のシクロアルキルである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、置換または非置換のヘテロシクロアルキルである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、置換または非置換のアリールである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、置換または非置換のヘテロアリールである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、OR18である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、N(R18)2である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、SR18である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、ハロゲンである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、CNである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-CHOである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-CO2Hである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-CO2R18である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-NO2である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-ONO2である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-SO2Clである。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-SO3 -である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-OSO3 -である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-NR18SO3 -である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-PO3 2-である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-OPO3 2-である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-OSO2R18である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-SO2N(R18)2である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-OSO2N(R18)2である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-NR18SO2R18である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-SO2N(R18)2である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-NHNH2である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-ONH2である。ある態様において、R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、-NHC(O)NHNH2である。
ある態様において、R18は、Hである。ある態様において、R18は、置換または非置換のアルキルである。ある態様において、R18は、置換または非置換のヘテロアルキルである。ある態様において、R18は、置換または非置換のシクロアルキルである。ある態様において、R18は、置換または非置換のヘテロシクロアルキルである。ある態様において、R18は、置換または非置換のアリールである。ある態様において、R18は、置換または非置換のヘテロアリールである。
式(I)で表される化合物において、R1、R2、R4、R6、R11、R15、およびR16の少なくとも1個は、Hであり得る。例えば、R1、R2、R4、R6、R11、R15、およびR16のうち、1個、2個、3個、4個、5個、6個または7個すべてが、Hであり得る。本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、R1、R2、R4、R6、R11、R15、およびR16のすべてが、Hである。
式(I)で表されるいくつかの化合物において、R3、R7およびR12の少なくとも1個は、-OR18であり得る。例えば、R3、R7、およびR12のうち1個、2個または3個すべてが、-OR18であり得る。結果的に、本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、R3は、-OR18である。本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、R7は、-OR18である。本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、R12は、-OR18である。いくつかの態様において、R3およびR7は、-OR18である。いくつかの態様において、R3およびR12は、-OR18である。いくつかの態様において、R7およびR12は、-OR18である。いくつかの態様において、R3、R7、およびR12のすべてが、-OR18であり得る。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、R3およびR7の少なくとも1個は、-OR18であり、およびR12は、HまたはOR18である。例えば、R3およびR7の少なくとも1個は、-OHであり、およびR12は、Hまたは-OHである。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの追加の態様において、R3およびR7は、-OR18であり、およびR12は、Hまたは-OR18である。例えば、R3およびR7は、-OHであり、およびR12は、Hまたは-OHである。
式(I)で表されるいくつかの化合物において、R3、R6、R7、およびR12の少なくとも1個は、-OSO3 -、-NR18SO3 -、または-OPO3 2-であり得る。これのいくつかのさらなる態様において、R3、R6、R7、およびR12の少なくとも1個は、-OSO3 -である。いくつかの具体的な態様において、R3は、-OSO3 -である。
例示のR18基は、これらに限定されないが、HおよびC1～C6アルキルを包含する。本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、R18は、Hである。
式(I)で表される化合物において、R17は、C1～C6アルキルであり得る。例えば、R17は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルであり得る。本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、R17は、メチルである。
ある態様において、nは、1である。ある態様において、nは、2である。ある態様において、nは、3である。ある態様において、nは、4である。ある態様において、nは、5である。ある態様において、nは、6である。ある態様において、nは、7である。ある態様において、nは、8である。ある態様において、nは、9である。ある態様において、nは、10である。
ある態様において、mは、1である。ある態様において、mは、2である。ある態様において、mは、3である。ある態様において、mは、4である。
式(I)で表される化合物において、nは、1または2であり得る。式(I)～(XVIII)で表されるいくつかの例示の化合物において、nは、2である。
式(I)で表される化合物において、mは、1、2または3であり得る。式(I)～(XVIII)で表されるいくつかの例示の化合物において、mは、1である。
本明細書に記載の様々な側面のいくつかの態様において、式(I)で表される化合物は、式(XVI):
Figure 2022533069000043
で表されるが、ここでR19は、ハロアルキルである;R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16、R17、n、およびmは、式(I)について定義されたとおりである。式(XVI)で表されるいくつかの例示化合物において、mは、1または2である;nは、1または2である;R1、R2、R4、R6、R11、R15、R16は、Hである;R3およびR7は、OHである;R12は、Hまたは-OHである;R17は、メチルである;ならびにR19は、ハロアルキル、例として、-CH2Fである。式(XVI)で表されるいくつかの他の例示化合物において、mは、1または2である;nは、1または2である;R1、R2、R4、R6、R11、R15、R16は、Hである;R3は、-OSO3 -である;R7は、OHである;R12は、Hまたは-OHである;R17は、メチルである;およびR19は、ハロアルキル、例として、-CH2Fである。
本明細書に記載の様々な側面のいくつかの態様において、式(I)で表される化合物は、式(XVII):
Figure 2022533069000044
で表されるが、ここでR19は、ハロアルキルである;R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16、R17、nおよびmは、式(I)について定義されたとおりである。式(XVII)で表されるいくつかの例示化合物において、mは、1または2である;nは、1または2である;R1、R2、R4、R6、R11、R15、R16は、Hである;R3およびR7は、OHである;R12は、HまたはOHである;R17は、メチルである;ならびにR19は、ハロアルキルである。式(XVII)で表されるいくつかの他の例示化合物において、mは、1または2である;nは、1または2である;R1、R2、R4、R6、R11、R15、R16は、Hである;R3は、-OSO3 -である;R7は、OHである;R12は、Hまたは-OHである;R17は、メチルである;およびR19は、ハロアルキル、例として、-CH2Fである。
本明細書に記載の様々な側面のいくつかの態様において、式(I)で表される化合物は、式(XVIII):
Figure 2022533069000045
で表わされるが、ここでR19は、ハロアルキルである;R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16、R17、nおよびmは、式(I)について定義されたとおりである。式(XVIII)で表されるいくつかの例示化合物において、mは、1または2である;nは、1または2である;R1、R2、R4、R6、R11、R15、R16は、Hである;R3およびR7は、OHである;R12は、HまたはOHである;R17は、メチルである;ならびにR19は、ハロアルキル、例として、-CH2Fである。式(XVIII)で表されるいくつかの他の例示化合物において、mは、1または2である;nは、1または2である;R1、R2、R4、R6、R11、R15、R16は、Hである;R3は、-OSO3 -である;R7は、OHである;R12は、HまたはOHである;R17は、メチルである;およびR19は、ハロアルキル、例として、-CH2Fである。
ある態様において、式(XVIII)で表される化合物は、式(XVIII-a):
Figure 2022533069000046
式中:
R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;および
R19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、
で表されるが、またはその薬学的許容し得る塩である。ある態様において、R18は、Hであり、およびR19は、ハロアルキル(例として、-CH2F)である。
ある態様において、式(XVIII-a)で表される化合物は、式(XVIII-a'):
Figure 2022533069000047
式中:
R19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。ある態様において、R19は、ハロアルキル(例として、-CH2F)である。
ある態様において、式(XVIII)で表される化合物は、式(XVIII-b):
Figure 2022533069000048
式中:
R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;および
R19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。ある態様において、R18は、Hであり、およびR19は、ハロアルキル(例として、-CH2F)である。
ある態様において、式(XVIII-b)で表される化合物は、式(XVIII-b'):
Figure 2022533069000049
式中:
R19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。ある態様において、R19は、ハロアルキル(例として、-CH2F)である。
ある態様において、式(XVIII)で表される化合物は、式(XVIII-c):
Figure 2022533069000050
式中:
R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;および
R19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。ある態様において、R18は、Hであり、およびR19は、ハロアルキル(例として、-CH2F)である。
ある態様において、式(XVIII-c)で表される化合物は、式(XVIII-c'):
Figure 2022533069000051
式中:
R19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。ある態様において、R19は、ハロアルキル(例として、-CH2F)である。
ある態様において、式(XVIII)で表される化合物は、式(XVIII-d):
Figure 2022533069000052
式中:
R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;および
R19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。ある態様において、R18は、Hであり、およびR19は、ハロアルキル(例として、-CH2F)である。
ある態様において、式(XVIII-d)で表される化合物は、式(XVIII-d'):
Figure 2022533069000053
式中:
R19は、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。ある態様において、R19は、ハロアルキル(例として、-CH2F)である。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、mは、1である;nは、2である;Xは、-C(O)CH2F、-NCS、-C(O)CH=CH2、-C(O)C=CH、-NHC(O)CH=CH2、-CN、-CH=C(CN)CO2Et、または-C(O)CH3である;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16は、Hである;R3は、-OHまたは-OSO3 -である;R7は、-OHである;およびR12は、Hまたは-OHである。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、mは、1である;nは、2である;Xは、-C(O)CH2F、-NCS、-C(O)CH=CH2、-C(O)C≡CH、-NHC(O)CH=CH2、-CN、-CH=C(CN)CO2Et、または-C(O)CH3である;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16は、Hである;R3は、-OHまたは-OSO3Hである;R7は、-OHである;およびR12は、Hまたは-OHである。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、mは、1である;nは、2である;Xは、-C(O)CH2Fまたは-NCSである;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16は、Hである;R3は、-OHまたは-OSO3 -である;R7は、-OHである;およびR12は、Hまたは-OHである。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、mは、1である;nは、2である;Xは、-C(O)CH2Fまたは-NCSである;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16は、Hである;R3は、-OHまたは-OSO3Hである;R7は、-OHである;およびR12は、Hまたは-OHである。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、mは、1である;nは、2である;Xは、-C(O)CH2Fである;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16は、Hである;R3は、-OHまたは-OSO3 -である;R7は、-OHである;およびR12は、Hまたは-OHである。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、mは、1である;nは、2である;Xは、-C(O)CH2Fである;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16は、Hである;R3は、-OHまたは-OSO3Hである;R7は、-OHである;およびR12は、Hまたは-OHである。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、mは、1である;nは、2である;Xは、-C(O)CH2Fである;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16は、Hである;R3は、-OHおよびR7は、OHである;ならびにR12は、Hまたは-OHである。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、mは、1である;nは、2である;Xは、-C(O)CH2Fである;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16は、Hである;R3は、-OSO3 -である;ならびにR7は、-OHである;ならびにR12は、Hである。
本明細書に開示の様々な側面のいくつかの態様において、mは、1である;nは、2である;Xは、-C(O)CH2Fである;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16は、Hである;R3は、-OSO3Hである;ならびにR7は、-OHである;ならびにR12は、Hである。
本明細書に開示の様々な側面の態様において、式(I)で表される化合物は、TGR5の活性をモジュレートしない。換言すれば、式(I)で表される化合物は、TGR5のアゴニストでもアンタゴニストでもない。
アルキルおよびヘテロアルキルのラジカルに係る置換基(しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称されるそれらの基を包含する)は、これらに限定されないが、ゼロから(2m'+1)までに及ぶ数で(ここでm'は、かかるラジカル中の炭素原子の総数である)、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R''R''')=NR''''、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-NR'NR''R'''、-ONR'R''、-NR'C=(O)NR''NR'''R''''、-CN、-NO2、-NR'SO2R''、-NR'C=(O)R''、-NR'C(O)-OR''、-NR'OR''から選択される様々な基の1以上であり得る。R'、R'、R''、R'''、およびR''''は各々、好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル基、置換もしくは非置換のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基(例として、1～3個のハロゲンで置換されたアリール基)、置換もしくは非置換のヘテロアリール基、置換もしくは非置換のアルキル基、アルコキシ基、またはチオアルコキシ基、もしくはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が1個より多くのR基を包含するとき、例えば、R基の各々は、1個より多くのこれらの基が存在するとき、独立して、各R'基、R''基、R'''基、およびR''''基と同様に選択される。R'およびR''が、同じ窒素原子へ付着されているとき、これらは窒素原子と組み合わせて4-、5-、6-、または7員の環を形成し得る。例えば、-NR'R''は、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルに限定されないが、これらを包含する。置換基の上の考察から、当業者は、用語「アルキル」が、ハロアルキル(例として、-CF3および-CH2CF3)ならびにアシル(例として、-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)などの水素基以外基へ結合された炭素原子を包含する基を包含することが意図されることを理解するであろう。
アルキルラジカルについて記載された置換基と同様、アリール基およびヘテロアリール基に係る置換基も変動し、ゼロから芳香環系上のオープンな(open)原子価の総数までに及ぶ数で、例えば:-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R''R''')=NR''''、-NR-C(NR''R'')-NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-NR'NR''R'''、-ONR'R''、-NR'C=(O)NR''NR'''R''''、-CN、-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、フルオロ(C1～C4)アルコキシ、およびフルオロ(C1～C4)アルキル、-NR'SO2R''、-NR'C=(O)R''、-NR'C(O)-OR''、-NR'OR''から選択される;ならびにここでR'、R''、R'''、およびR''''は、好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が1個より多くのR基を包含するとき、例えば、R基の各々は、1個より多くのこれらの基が存在するとき、独立して、各R'基、R''基、R'''基、およびR''''基と同様に選択される。
環(例として、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレン)に係る置換基は、環の特定の原子上よりむしろ、環上の置換基として描かれていてもよい(一般的に流動(floating)置換基と称される)。かかるケースにおいて、置換基は、環原子のいずれにも付着されていてもよい(化学原子価の規則に従う)。そして、縮環またはスピロ環状の環のケースにおいて、縮環またはスピロ環状の環の1員と結び付けられたものとして描かれる置換基(単環上の流動置換基)は、縮環上またはスピロ環状の環上のいずれかにある置換基であってもよい(多環上の流動置換基)。置換基が、特定の原子ではなく環へ付着されているとき(流動置換基)、かつ置換基に係る下付き文字が、1より大きい整数であるとき、複数の置換基は、同じ原子上、同じ環上、異なる原子上、異なる縮環上、異なるスピロ環状の環上にあってもよく、かつ各置換基は任意に異なっていてもよい。分子の残部への環の付着点が単一の原子に限定されていない場合(流動置換基)、付着点は環のいずれの原子であってもよく、縮環またはスピロ環状の環のケースにおいては、縮環またはスピロ環状の環のいずれかのいずれの原子であってもよいが、化学原子価の規則に従う。単環、縮環、またはスピロ環状の環が1以上の環ヘテロ原子を含有している場合、かつ単環、縮環、またはスピロ環状の環が、1個より多く流動置換基とともに示される場合(これらに限定されないが、分子の残部への付着点を包含する)、流動置換基は、ヘテロ原子へ結合されていてもよい。環ヘテロ原子が、流動置換基をもつ構造または式において、1以上の水素へ結合していることが示されている場合(例として、環原子への2つの結合と水素への第3の結合とをもつ環窒素)、ヘテロ原子が流動置換基へ結合されているとき、置換基は、化学原子価の規則に従いつつ水素と置き換わることが理解されるであろう。
2以上の置換基は、任意に結び合うことで、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、またはヘテロシクロアルキル基を形成してもよい。所謂、かかる環形成置換基は、典型的には、必ずしもそうではないが、環状の基盤構造へ付着されていることが見出される。側面のいずれかのいくつかの態様において、環形成置換基は、基盤構造の隣接する員へ付着されている。例えば、環状の基盤構造の隣接する員へ付着されている2個の環形成置換基は、縮環構造を創出する。側面のいずれかの別の態様において、環形成置換基は、基盤構造の単一の員へ付着されている。例えば、環状の基盤構造の単一の員へ付着されている2個の環形成置換基は、スピロ環状の構造を創出する。もう1つの態様において、環形成置換基は、基盤構造の非隣接の員へ付着されている。
アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の2個は任意に、式-T-C(O)-(CRR')q-U-で表される環を形成していてもよく、式中TおよびUは、独立して、-NR-、-O-、-CRR'-、または単結合であり、ならびにqは、0から3までの整数である。代替的に、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の2個は任意に、式-A-(CH2)r-B-で表される置換基に置き換えられていてもよく、式中AおよびBは、独立して、-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-、または単結合であり、ならびにrは、1から4までの整数である。そのように形成された新しい環の単結合の1つは任意に、二重結合に置き換えられていてもよい。代替的に、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の2個は任意に、式-(CRR')s-X'-(C''R''R''')d-で表される置換基に置き換えられていてもよく、ここでrおよびdは、独立して、0から3までの整数であり、ならびにX'は、-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、または-S(O)2NR'-である。置換基R'、R'、R''、およびR'''は、好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のヘテロアリールから選択される。
ある態様において、式(I)で表される化合物は、式:
Figure 2022533069000054
Figure 2022533069000055
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)で表される化合物は、式:
Figure 2022533069000056
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)で表される化合物は、式:
Figure 2022533069000057
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)で表される化合物は、式:
Figure 2022533069000058
で表されるか、またはその薬学的許容し得る塩である。
ある態様において、式(I)で表される化合物は、式:
Figure 2022533069000059
では表されない。
ある態様において、式(I)で表される化合物は、式:
Figure 2022533069000060
では表されない。
いくつかの態様において、本明細書中、化合物において記載された各置換基は、少なくとも1個の置換基で置換されている。より具体的に言うと、いくつかの態様において、本明細書中、化合物において記載された各置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および/または置換ヘテロアリーレンは、少なくとも1個の置換基で置換されている。他の態様において、これらの基のうち少なくとも1個またはすべては、サイズが限定された少なくとも1個の置換基で置換されている。他の態様において、これらの基のうち少なくとも1個またはすべては、少なくとも1個の低級置換基で置換されている。
本明細書中の化合物の他の態様において、各置換もしくは非置換のアルキルは、置換もしくは非置換のC1～C20アルキルであってもよく、各置換もしくは非置換のヘテロアルキルは、置換もしくは非置換の2～20員ヘテロアルキルであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキルは、置換もしくは非置換のC3～C8シクロアルキルであり、および/または、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルは、置換もしくは非置換の3～8員ヘテロシクロアルキルである。本明細書中の化合物のいくつかの態様において、各置換もしくは非置換のアルキレンは、置換もしくは非置換のC1～C20アルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキレンは、置換もしくは非置換の2～20員ヘテロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキレンは、置換もしくは非置換のC3～C8シクロアルキレンであり、および/または、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレンは、置換もしくは非置換の3～8員ヘテロシクロアルキレンである。
いくつかの態様において、各置換もしくは非置換のアルキルは、置換もしくは非置換のC1～C8アルキルであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキルは、置換もしくは非置換の2～8員ヘテロアルキルであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキルは、置換もしくは非置換のC3～C7シクロアルキルであり、および/または、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキルは、置換もしくは非置換の3～7員ヘテロシクロアルキルである。いくつかの態様において、各置換もしくは非置換のアルキレンは、置換もしくは非置換のC1～C8アルキレンであり、各置換もしくは非置換のヘテロアルキレンは、置換もしくは非置換の2～8員ヘテロアルキレンであり、各置換もしくは非置換のシクロアルキレンは、置換もしくは非置換のC3～C7シクロアルキレンであり、および/または、各置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキレンは、置換もしくは非置換の3～7員ヘテロシクロアルキレンである。
本発明のある化合物は、不斉炭素原子(光学中心もしくはキラル中心)または二重結合を保有する;絶対立体化学の観点から、アミノ酸については(R)-もしくは(s)-として、または(D)-もしくは(L)-として定義されることもある、鏡像異性体、ラセミ化合物、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、立体異性体の形態、および個々の異性体は、本発明の範囲内に網羅される。本発明の化合物は、当該技術分野において合成および/または単離するのに不安定過ぎることが知られているものを包含しない。本発明は、ラセミの形態および光学に純粋な形態の化合物を包含することが意図される。光学活性(R)-および(S)-、または(D)-および(L)-異性体は、キラルシントンまたはキラル試薬を使用して調製されてもよく、または従来の技法を使用して分解されてもよい。本明細書に記載の化合物がオレフィン結合または他の幾何学的不斉中心を含有するときであって、別様に特定されない限り、化合物はE幾何異性体とZ幾何異性体との両方を包含することを意図する。
よって、本発明の化合物は、薬学的に許容し得る酸などとの塩として存在していてもよい。本発明は、かかる塩を包含する。かかる塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩(例として、(+)-酒石酸塩、(-)-酒石酸塩、またはラセミ混合物を包含するそれらの混合物)、コハク酸塩、安息香酸塩、およびグルタミン酸などのアミノ酸との塩を包含する。これらの塩は、当業者に知られている方法によって調製されてもよい。
中性の形態の化合物は、好ましくは、従来のやり方で塩を塩基または酸と接触させること、および親化合物を単離することによって再生される。化合物の親の形態は、極性溶媒における可溶性などのある物理的な特性の点で、様々な塩形態と異なる。
塩形態に加えて、本発明は、プロドラッグ形態の化合物を提供する。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、生理学的条件の下で容易に化学的変化を経ることで本発明の化合物を提供するそれらの化合物である。加えて、プロドラッグは、ex vivoでの環境における化学的方法または生化学的方法によって、本発明の化合物へ変換され得る。例えば、プロドラッグは、好適な酵素または化学試薬とともに経皮パッチリザーバ中に置かれたとき、本発明の化合物へゆっくり変換され得る。
本発明のある化合物は、非溶媒和形態、ならびに水和形態を包含する溶媒和形態で存在し得る。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と等価であって、本発明の範囲内に網羅される。本発明のある化合物は、複数の結晶形態またはアモルファス形態で存在することもある。一般に、すべての物理的な形態は、本発明によって企図される使用にとって等価であり、本発明の範囲内にあることを意図する
別様に述べられない限り、本明細書中に描かれる構造はまた、構造のすべての立体化学的形態;すなわち、各不斉中心に係るRおよびS立体配置も包含することが意図される。したがって、本化合物の単一の立体化学的異性体、ならびに鏡像異性のおよびジアステレオマーの混合物は、本発明の範囲内にある。
別様に述べられない限り、本明細書中に描かれる構造はまた、1以上の同位体が濃縮された原子の存在においてのみ異なる化合物も包含することが意図される。例えば、重水素もしくはトリチウムによる水素の置き換え、または13Cもしくは14Cが濃縮された炭素による炭素の置き換えを除く、本構造を有する化合物は、本発明の範囲内にある。
本発明の化合物はまた、かかる化合物を構成する原子の1以上にて、非天然の割合で原子の同位体も含有していてもよい。例えば、化合物は、例えば、トリチウム(3H)、ヨウ素-125(125I)、または炭素-14(14C)などの放射性同位体で放射性標識されていてもよい。本発明の化合物のすべての同位体のバリエーションは、放射性であるか否かにかかわらず、本発明の範囲内に網羅される。
医薬組成物、キット、および投与
なおも別の側面において、本明細書に提供されるのは、式(I)～(XVIII)で表される化合物、および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む、医薬組成物である。
側面のいずれかのいくつかの態様において、本明細書に提供されるとおりの剤または化合物は、医薬組成物で製剤化されている。側面のいずれかの別の態様において、医薬組成物は、疾患(例として、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)例として、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、肝疾患、胆道閉鎖、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ性関節炎))を処置するよう製剤化されている。
態様のいずれかの別の側面において、本明細書に提供されるのは、対象における胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)を阻害する剤を含む組成物。
側面のいずれかの別の態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体または賦形剤をさらに含む。
本開示は、式(I)～(XVIII)で表される化合物、またはその薬学的許容し得る塩、および任意に、薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ある態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、式(I)～(XVIII)で表される化合物、またはその薬学的許容し得る塩、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む。
いくつかの態様において、医薬組成物は、液体剤形または固体剤形である。経口投与のための液体剤形は、これらに限定されないが、薬学的に許容し得るエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤を包含する。式(I)～(XVIII)のいずれかで表される化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒などの、当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(とりわけ、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなどの、可溶化剤および乳化剤、およびこれらの混合物を含有し得る。不活性希釈剤の他にも、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤などのアジュバント、甘味料、フレーバー剤、および芳香剤も包含し得る。
経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒を包含する。かかる固体剤形において、式(I)～(XVIII)のいずれかで表される化合物は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの少なくとも1つの不活性な、薬学的に許容し得る賦形剤もしくは担体、および/または a)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤、b)例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなどの結合剤、c)グリセロールなどの保湿剤、d)寒天(agar-agar)、炭酸カルシウム、ジャガイモ、またはタピオカデンプン、アルギン酸、あるシリカート、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、e)パラフィンなどの溶解遅延剤(solution retarding agent)、f)四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、g)例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアラートなどの湿潤剤、h)カオリンおよびベントナイトクレーなどの吸収剤、ならびにi)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、およびこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬のケースにおいて、剤形はまた、緩衝剤を含み得る。
同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用する、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても採用され得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬製剤の技術分野において周知の他のコーティングなどのコーティングならびに外郭(shells)を用いて調製され得る。それらは任意に、不透明化剤を含有し得、それらはまた、活性成分(単数もしくは複数)のみを、またはこれを優先的に、腸管のある部分において、任意に遅延様式で、放出するという組成からも成り得る。使用され得る包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用する、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても採用され得る。
式(I)～(XVIII)のいずれかで表される化合物はまた、上述のとおりの1以上の賦形剤とともに、マイクロカプセル化された形態でもあり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬製剤の技術分野において知られている他のコーティングなどのコーティングならびに外郭を用いて調製され得る。かかる固体剤形において、式(I)～(XVIII)のいずれかで表される化合物は、少なくとも1種の不活性な希釈剤(スクロース、ラクトース、およびデンプンなど)と混和され得る。かかる剤形はまた、常道であるように、不活性な希釈剤以外の追加の物質、例として、錠剤化潤滑剤および他の錠剤化補助剤(ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなど)も含み得る。カプセル、錠剤、および丸薬のケースにおいて、剤形はまた、緩衝剤を含み得る。
それらは任意に、不透明化剤を含有し得、それらはまた、活性成分(単数もしくは複数)のみを、またはこれを優先的に、腸管のある部分において、任意に遅延様式で、放出するという組成からも成り得る。使用され得る包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。
いくつかの態様において、担体または賦形剤は、組成物の胃腸管への送達を制限する。いくつかの態様において、本明細書に提供される組成物は、スルファート基または極性基の化合物への付加によって、胃腸管に対して制限される。
いくつかの態様において、担体または賦形剤は、腸溶コーティングまたは腸溶コーティングされた薬物送達デバイスである。本明細書に使用されるとき、用語「腸溶コーティング」または「腸溶コーティングされた薬物送達デバイス」は、経口的に投与され得るが、デバイスが腸に入るまで分解も活性化もされない、いずれの薬物送達方法も指す。かかる方法は、例として、pH依存的手段を使用して、分解されるコーティングまたはカプセル化を利用し得、投与または移植されるべき送達デバイスおよび剤の胃腸管全体にわたる保護を、デバイスが腸(例として、盲腸または結腸)のアルカリ性pHに達するまで可能にする。
腸溶コーティングは、剤が放出される消化器系中の場所を制御し得る。よって、医薬組成物が胃において剤を溶解(dissolve)、放出せずに、むしろ腸(ここで医薬組成物が、BSHを阻害する(例として、盲腸、回腸、大腸、または結腸に位置付けられた最近を標的にする)のに最も有益な環境において、剤を溶解し放出する)まで流れるように、腸溶コーティングが使用され得る。腸溶コーティングは、低pHにて(胃などにおいて)安定し得、かつより高いpHにて(例えば、腸において)溶解し得る。腸溶コーティングに使用され得る材料は、例えば、アルギン酸、酢酸フタル酸セルロース、プラスチック、ワックス、シェラック、および脂肪酸(例として、ステアリン酸、パルミチン酸)を包含する。腸溶コーティングは、例えば、米国特許第5,225,202号、第5,733,575号、第6,139,875号、第6,420,473号、第6,455,052号、および第6,569,457号(これらのすべては、それら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されている。腸溶コーティングは、水性の腸溶コーティングであり得る。腸溶コーティングに使用され得るポリマーの例は、例えば、シェラック(商品名EmCoat 120 N、Marcoat 125);酢酸フタル酸セルロース(商品名AQUACOAT(登録商標)、AQUACOAT ECD(登録商標)、SEPIFILM(登録商標)、KLUCEL(登録商標)、およびMETOLOSE(登録商標));ポリビニルアセタートフタラート(商品名SURETERIC(登録商標));ならびにメタクリル酸(Evonik Industries(Germany)からの、商品名EUDRAGIT(登録商標)、EUDRAGIT L 100-55(登録商標))を包含する。
医薬組成物の腸への制限を可能にさせる、当該技術分野において知られている方法の別の例は、腸溶性のマグネシウムマイクロモーター(enteric magnesium micromotor)(EMgM)を包含する。EMgMは、当該技術分野において、例えば、Li et al.,ACS NANO,(2016)において記載されている。
医薬組成物は、錠剤、カプセル、カシェー(cachet)、シロップ剤、エリキシル剤、加工食品、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、トローチ剤、またはゲルでコーティングされたアンプルなどの不連続単位(各々は、予め決められた量の活性化合物を;粉末または顆粒として;水性液体もしくは非水性液体における溶液または懸濁液として;あるいは水中油型または油中水型のエマルションとして含有する)として提供されてもよい、経口投与に好適な製剤を包含する。
結果的に、直腸投与に好適な製剤は、ゲル、クリーム、ローション、水性または油性の懸濁液、分散性の粉末または顆粒、エマルション、溶解可能な(dissolvable)固体材料、注水(douches)等を包含し、これらが使用され得る。製剤は、好ましくは、坐薬基剤を形成する1種以上の固体担体(例えば、カカオバター)中に活性成分を含む単位用量坐薬として提供される。かかる製剤のための好適な担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびそれらの組み合わせを包含する。代替的に、本開示の高速コロニー再形成/配置剤(rapid recolonization deployment agent)での結腸洗浄は、結腸または直腸の投与のために製剤化され得る。
ある態様において、化合物または医薬組成物は、固体である。ある態様において、化合物または医薬組成物は、粉末である。ある態様において、化合物または医薬組成物は、液体に溶解する(dissolved)ことで溶液になり得る。ある態様において、化合物または医薬組成物は、水に溶解することで水性溶液になり得る。ある態様において、医薬組成物は、非経口注射のための液体である。ある態様において、医薬組成物は、経口投与(例として、摂取)のための液体である。ある態様において、医薬組成物は、静脈内注射のための液体(例として、水性溶液)である。ある態様において、医薬組成物は、皮下注射のための液体(例として、水性溶液)である。
所望される投薬量の、適切な薬学的に許容し得る賦形剤との製剤化の後、本開示の医薬組成物は、処置されている疾患または疾病に応じて、経口的に、非経口的に、嚢内に、腹腔内に、局所的に、頬側に、または同種のもので、ヒトおよび他の動物へ投与され得る。
ある態様において、式(I)～(XVIII)で表される化合物を含む医薬組成物は、1日または数日に(投与モードに応じて)1回以上の用量投与において約0.001mg/kgから約200mg/kgまでを送達するのに充分な各医薬組成物の投薬量レベルにて、経口的または非経口的に投与される。ある態様において、用量あたりの有効量は、所望される治療効果および/または予防効果を得るため、1日あたり、1日1回以上、対象体重の約0.001mg/kgから約200mg/kgまで、約0.001mg/kgから約100mg/kgまで、約0.01mg/kgから約100mg/kgまで、約0.01mg/kgから約50mg/kgまで、好ましくは、約0.1mg/kgから約40mg/kgまで、好ましくは、約0.5mg/kgから約30mg/kgまで、約0.01mg/kgから約10mg/kgまで、約0.1mg/kgから約10mg/kgまで変動する。ある態様において、本明細書に記載の化合物は、所望される治療効果および/または予防効果を得るため、1日あたり、1日1回以上、対象体重の約0.001mg/kgから約200mg/kgまで、約0.001mg/kgから約100mg/kgまで、約0.01mg/kgから約100mg/kgまで、約0.01mg/kgから約50mg/kgまで、好ましくは、約0.1mg/kgから約40mg/kgまで、好ましくは、約0.5mg/kgから約30mg/kgまで、約0.01mg/kgから約10mg/kgまで、約0.1mg/kgから約10mg/kgまで、およびより好ましくは、約1mg/kgから約25mg/kgまでを送達するのに充分な投薬量レベルにあってもよい。所望される投薬量は、1日3回、1日2回、1日1度、隔日毎、3日毎、1週毎、2週毎、3週毎、または4週毎に送達されてもよい。ある態様において、所望される投薬量は、複数回投与(例として、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回以上の投与)を使用して送達されてもよい。ある態様において、本明細書に記載の組成物は、化合物または剤が非特異的効果を引き起こす用量を下回る用量にて投与される。
ある態様において、医薬組成物は、単位用量あたり約0.001mg～約1000mgの用量にて投与される。ある態様において、医薬組成物は、単位用量あたり約0.01mg～約200mgの用量にて投与される。ある態様において、医薬組成物は、単位用量あたり約0.01mg～約100mgの用量にて投与される。ある態様において、医薬組成物は、単位用量あたり約0.01mg～約50mgの用量にて投与される。ある態様において、医薬組成物は、単位用量あたり約0.01mg～約10mgの用量にて投与される。ある態様において、医薬組成物は、単位用量あたり約0.1mg to 約10mgの用量にて投与される。
本明細書に記載の医薬組成物は、薬理学の分野において知られているいずれの方法によっても調製され得る。一般に、かかる調製方法は、式(I)～(XVIII)で表される化合物を含む組成物を、担体および/または1以上の他の補助成分と結び付けさせるステップ、次いで、必要ならばおよび/または所望ならば、生成物を所望の単回用量または複数回用量の単位に成形および/または梱包するステップを包含する。
医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、および/または複数の単回単位用量として、調製、梱包、および/または販売され得る。本明細書に使用されるとき、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は一般に、対象へ投与されるであろう活性成分の投薬量、および/または、かかる投薬量の2分の1または3分の1など、かかる投薬量の好都合な画分に等しい。
本開示の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容し得る賦形剤、および/またはいずれの追加の成分の相対量は、処置される対象の固有性(identity)、サイズ、および/または状態に応じて、さらに、組成物が投与されるべき経路に応じて、変動するであろう。一例として、組成物は、0.1％と100％(w/w)との間で活性成分を含んでいてもよい。
提供される医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容し得る賦形剤は、不活性希釈剤、分散剤および/または造粒剤、界面活性剤および/または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存料、緩衝剤(buffering agents)、平滑剤、および/または油を包含する。カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤、着色剤、コーティング剤、甘味料、フレーバー剤(flavoring)、および芳香剤(perfuming agents)もまた、組成物中に存在していてもよい。
例示の希釈剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉砂糖、およびこれらの混合物を包含する。
例示の造粒剤および/または分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、クレー、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロース、および木製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ(ビニル-ピロリドン)(クロスポビドン)、カルボキシメチルスターチナトリウム(デンプングリコール酸ナトリウム)、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム(クロスカルメロース)、メチルセルロース、アルファ化デンプン(starch 1500)、微晶質デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム(Veegum)、ラウリル硫酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物、およびこれらの混合物を包含する。
例示の界面活性剤および/または乳化剤は、天然の乳化剤(例として、アカシア、寒天(agar)、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス(chondrux)、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン)、コロイドクレー(例として、ベントナイト(ケイ酸アルミニウム)およびVeegum(ケイ酸アルミニウムマグネシウム))、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール(例として、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアラート、エチレングリコールジステアラート、グリセリルモノステアラート、およびプロピレングリコールモノステアラート、ポリビニルアルコール)、カルボマー(例として、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー)、カラギーナン、セルロース誘導体(例として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース)、ソルビタン脂肪酸エステル類(例として、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート(Tween 20)、ポリオキシエチレンソルビタン(Tween 60)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート(Tween 80)、ソルビタンモノパルミタート(Span 40)、ソルビタンモノステアラート(Span 60)、ソルビタントリステアラート(Span 65)、グリセリルモノオレアート、ソルビタンモノオレアート(Span 80))、ポリオキシエチレンエステル(例として、ポリオキシエチレンモノステアラート(Myrj 45)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアラート、およびSolutol)、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例として、Cremophor(商標))、ポリオキシエチレンエーテル(例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル(Brij 30))、ポリ(ビニルピロリドン)、ジエチレングリコールモノラウラート、トリエタノールアミンオレアート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、Pluronic F-68、Poloxamer-188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサート・ナトリウム、および/またはこれらの混合物を包含する。
例示の結合剤は、デンプン(例として、コーンスターチおよびデンプン糊)、ゼラチン、糖(例として、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトールなど)、天然および合成ゴム(例として、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワルゴム(panwar gum)、ガッチゴム(ghatti gum)、イサポール殻(isapolhusk)の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ(ビニルピロリドン)、ケイ酸アルミニウムマグネシウム(Veegum)、および落葉松アラボガラクタン)、アルギナート、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリラート、ワックス、水、アルコール、および/またはこれらの混合物を包含する。
例示の保存料は、抗酸化剤、キレート剤、抗微生物性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール保存料、酸性保存料、および他の保存料を包含する。ある態様において、保存料は、抗酸化剤である。他の態様において、保存料は、キレート剤である。
例示の酸化防止剤は、アルファ トコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムを包含する。
例示のキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)およびその塩および水和物(例として、エデト酸ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二カリウム等)、クエン酸およびその塩および水和物(例として、クエン酸一水和物)、フマル酸およびその塩および水和物、リンゴ酸塩およびその塩および水和物、リン酸およびその塩および水和物、ならびに酒石酸およびその塩および水和物を包含する。例示の抗菌性保存剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、およびチメロサールを包含する。
例示の抗真菌性保存料は、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、およびソルビン酸を包含する。
例示のアルコール保存料は、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾアート、およびフェニルエチルアルコールを包含する。
例示の酸性保存料は、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンE、ベータ-カロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、およびフィチン酸を包含する。
他の保存料は、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム(deteroxime mesylate)、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、Glydant Plus、Phenonip、メチルパラベン、Germall 115、Germaben II、Neolone、Kathon、およびEuxylを包含する。
例示の緩衝剤は、クエン酸緩衝溶液(buffer solutions)、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、D-グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、リン酸カルシウムヒドロキシド(calciumhydroxide phosphate)、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質非含有水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、およびこれらの混合物を包含する。
例示の平滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物を包含する。
例示の天然油は、アーモンド、杏仁、アボカド、ババス、ベルガモット、ブラックカレント種子、ルリジサ、カデ、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナバ、ヒマシ油、シナモン、カカオバター、ココナッツ、タラ肝臓、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、アマニ、ゲラニオール、ヘチマ、ブドウ種子、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リツェアクベバ、マカデミアナッツ、ゼニアオイ、マンゴー種子、メドウフォームシード、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、桃仁、ピーナッツ、ケシの実、カボチャの種、菜種、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、サンダルウッド、サザンカ、セイボリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチベル、クルミ、および小麦胚芽を包含する。例示の合成油は、これらに限定されないが、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコーン360、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、およびこれらの混合物を包含する。
経口および非経口の投与のための液体剤形は、これらに限定されないが、薬学的に許容し得るエマルション、マイクロエマルション、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシル剤を包含する。活性剤に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒などの、当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(とりわけ、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなどの、可溶化剤および乳化剤、およびこれらの混合物を含有していてもよい。不活性希釈剤の他にも、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤などのアジュバント、甘味料、フレーバー剤、および芳香剤も包含し得る。非経口投与のためのある態様において、本発明の剤は、CREMOPHOR EL(登録商標)(ポリエトキシル化ヒマシ油)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルバート、シクロデキストリン、ポリマー、およびこれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。
注射用調製物において、例えば、無菌の注射用水性または油性の懸濁液は、好適な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して、知られている技術に従って製剤化されていてもよい。無菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒中の無菌の注射用溶液、懸濁液、またはエマルション、例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液であってもよい。許容し得るビヒクルおよび溶媒のうち採用されてもよいのは、水、Ringer溶液(U.S.P.)、および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の固定油は従来、溶媒または懸濁媒体として採用されている。この目的において、合成モノ-またはジ-グリセリドを包含するいずれの無刺激性の固定油も採用され得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射用の調製物に使用される。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通す濾過によって、または使用に先立ち、滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体に溶解(dissolved)または分散され得る滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌され得る。
経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒を包含する。かかる固体剤形において、活性剤は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの少なくとも1つの不活性な、薬学的に許容し得る賦形剤もしくは担体、および/または a)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤、b)例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなどの結合剤、c)グリセロールなどの保湿剤、d)寒天(agar-agar)、炭酸カルシウム、ジャガイモ、またはタピオカデンプン、アルギン酸、あるシリカート、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、e)パラフィンなどの溶解遅延剤(solution retarding agent)、f)四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、g)例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアラートなどの湿潤剤、h)カオリンおよびベントナイトクレーなどの吸収剤、ならびにi)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、およびこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬のケースにおいて、剤形はまた、緩衝剤を含んでいてもよい。
同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用する、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤として採用されてもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬製剤の技術分野において知られている他のコーティングなどのコーティングならびに外郭を用いて調製され得る。それらは任意に、不透明化剤を含有していてもよく、それらはまた、活性成分(単数もしくは複数)のみを、またはこれを優先的に、腸管のある部分において、任意に遅延様式で、放出するという組成からも成り得る。使用され得る包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用する、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤として採用されてもよい。
活性剤はまた、上述のとおりの1以上の賦形剤とともに、マイクロカプセル化された形態でもあり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬製剤の技術分野において知られている他のコーティングなどのコーティングならびに外郭を用いて調製され得る。かかる固体剤形において、活性剤は、少なくとも1種の不活性な希釈剤(スクロース、ラクトース、およびデンプンなど)と混和され得る。かかる剤形はまた、常道であるように、不活性な希釈剤以外の追加の物質、例として、錠剤化潤滑剤および他の錠剤化補助剤(ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなど)も含み得る。カプセル、錠剤、および丸薬のケースにおいて、剤形はまた、緩衝剤も含んでいてもよい。それらは任意に、不透明化剤を含有していてもよく、それらはまた、活性成分(単数もしくは複数)のみを、またはこれを優先的に、腸管のある部分において、任意に遅延様式で、放出するという組成からも成り得る。使用され得る包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。
局所投与に好適な製剤は、塗布薬(liniments)、ローション、ゲル、塗布剤(applicants)、水中油型または油中水型のエマルション(クリーム、軟膏、もしくはペーストなど)などの、液体または半液体の調製物;あるいは点滴薬などの溶液または懸濁液を包含する。皮膚表面への局所投与のための製剤は、ローション、クリーム、軟膏、または石鹸などの皮膚科学的に許容し得る担体とともに分散性薬物によって調製され得る。有用な担体は、適用を局在化させかつ除去を阻害するために、皮膚上に薄い膜(film)または層を形成することが可能である。内部組織表面への局所投与について、剤は、液体の組織接着剤中、または組織表面への吸着を増強することが知られている他の物質中に分散させられ得る。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノゲン/トロンビン溶液は、有利に使用され得る。代替的に、ペクチン含有製剤などの組織コーティング溶液が使用され得る。点眼用製剤、点耳薬、および点眼薬もまた、本開示の範囲内にあるものとして企図される。加えて、本開示は、剤の身体への制御送達を提供する利点を付加する経皮パッチの使用を企図する。かかる剤形は、正しい媒体に剤を溶解(dissolving)または分散させることによって作製され得る。吸収増強剤もまた、皮膚を越える剤の流動を増大させるのに使用され得る。速度は、ポリマーマトリックス中またはゲル中に、速度制御膜または分散剤のいずれかを提供することによって制御され得る。
加えて、局所製剤のための担体は、含水アルコール系(例として、かみたばこ(quids)およびゲル)、無水の油もしくはシリコーンをベースとした系、またはエマルション系(これらに限定されないが、水中油型、油中水型、水中油中水型、およびシリコーン中水中油型のエマルションを包含する)の形態であり得る。エマルションは、希薄な(thin)ローション(これはまた、スプレー送達またはエアロゾル送達にも好適であり得る)、クリーム状のローション、ライトクリーム、ヘビークリーム等を包含する、広範囲の粘度をカバーし得る。エマルションはまた、マイクロエマルション系を包含し得る。他の好適な局所用担体は、無水固体および半固体(ゲルおよびスティックなど);ならびに水性ベースのムース系を包含する。
また、本開示によって網羅されるのには、キット(例として、医薬パック)もある。提供されるキットは、本明細書に記載の医薬組成物または化合物および容器(例として、バイアル、アンプル、瓶、シリンジ、および/またはディスペンサ梱包、または他の好適な容器)を含んでいてもよい。いくつかの態様において、提供されるキットは任意に、本明細書に記載の医薬組成物もしくは化合物の希釈または懸濁のための医薬賦形剤を含む第2容器をさらに包含していてもよい。いくつかの態様において、第1容器中および第2容器中に提供される、本明細書に記載の医薬組成物または化合物は、1単位剤形を形成するために組み合わせられる。
よって、一側面において、提供されるのは、本明細書に記載の式(I)～(XVIII)で表される化合物または医薬組成物を含む第1容器を包含するキットである。ある態様において、キットは、疾患(例として、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)、炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、および胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、ならびにリウマチ性関節炎)の処置を、これを必要とする対象においてするのに有用である。ある態様において、キットは、疾患(例として、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)、炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、および胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、ならびにリウマチ性関節炎)の予防を、これを必要とする対象においてするのに有用である。ある態様において、キットは、疾患(例として、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患、がん、炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、および胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、ならびにリウマチ性関節炎)の発症リスクの低減を、これを必要とする対象においてするのに有用である。
ある態様において、本明細書に記載のキットは、キットを使用するための指示をさらに包含する。本明細書に記載のキットはまた、必要に応じ米国食品医薬品局(FDA)などの規制当局による情報も包含していてもよい。ある態様において、キットに包含される情報は、処方情報である。ある態様において、キットおよび指示は、疾患(例として、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、および胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、ならびにリウマチ性関節炎)の処置を、これを必要とする対象において提供する。ある態様において、キットおよび指示は、疾患(例として、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)例として、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、肝疾患、胆道閉鎖、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ性関節炎)の予防を、これを必要とする対象において提供する。ある態様において、キットおよび指示は、疾患(例として、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患、がん(例として、肝臓がん)、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、肝疾患、胆道閉鎖、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ性関節炎)の発症リスクの低減を、これを必要とする対象において提供する。本明細書に記載のキットは、別々の組成物中に、本明細書に記載の1以上の追加の医薬化合物を包含していてもよい。
処置の方法
一側面において、本明細書に提供されるのは、対象において胆汁酸をモジュレートする方法である。別の側面において、本明細書に提供されるのは、対象において胆汁酸の脱抱合を阻害する方法である。もう1つの側面において、本明細書に提供されるのは、対象において胆汁酸の抱合を促進する方法である。
態様のいずれかの一側面において、本明細書に提供されるのは、対象において胆汁酸をモジュレートする方法であって、方法は以下:治療的に有効な量の、本明細書に提供される式I～XVIIIのいずれか1つで表される化合物、その誘導体、または医薬組成物を、これを必要とする対象へ投与することを含む。
側面のいずれかのいくつかの態様において、剤は、BSHのインヒビターである。側面のいずれかのいくつかの態様において、剤は、宿主対象中に存在する細菌のBSHのインヒビターである。
側面のいずれかの別の態様において、剤またはインヒビターは、式(I)～(XVIII)で表される化合物もしくはその誘導体;化合物1～9もしくはその誘導体;リボフラビン;またはコーヒー酸フェネチルエステル(CAPE)である。化合物1～9はまた、図2Dにも示される。
側面のいずれかの別の態様において、インヒビターは、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、shRNA、およびsiRNAからなる群から選択される。
側面のいずれかのいくつかの態様において、BSHを阻害する剤は、RNAi、siRNA、またはshRNAである。用語「RNAi」または「siRNA」または「shRNA」は、本明細書に使用されるとき、干渉RNAまたはRNA干渉を指す。RNAiは、mRNAに結合してそのプロセシングを阻害する(例えば、mRNA翻訳を阻害する)かまたはmRNA分解をもたらす分子によって特定のmRNAを破壊することによる、選択的転写後遺伝子サイレンシングの手段を指す。本明細書に使用されるとき、用語「RNAi」は、これらに限定されないが、siRNA、shRNA、内在性マイクロRNA、および人工マイクロRNAを包含する、いずれのタイプの干渉RNAも指す。実例として、それは、RNAの下流プロセシングの機序を問わず、これまでにsiRNAとして同定された配列を包含する。
側面のいずれかのいくつかの態様において、BSHを阻害する剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書に使用されるとき、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、マイクロRNAの配列などの、DNA配列またはmRNA配列に相補的な合成核酸配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、DNA標的またはRNA標的の発現を、標的へ結合し転写、翻訳、またはスプライシングのレベルにて発現を停止させることによってブロックするようデザインされている。本明細書に記載のとおりのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞条件の下で遺伝子とハイブリダイズするようデザインされた相補的な核酸配列である。よって、標的に充分相補的であるオリゴヌクレオチド、すなわち、細胞の環境という文脈において充分な特異性をもって所望の効果を与える、充分にハイブリッドするオリゴヌクレオチドが選ばれる。例えば、BSHレベルまたは活性を直接的または間接的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細菌BSHのコード配列の一部に相補的な、少なくとも5塩基、少なくとも10塩基、少なくとも15塩基、少なくとも20塩基、少なくとも25塩基、少なくとも30塩基、またはそれ以上の塩基を含んでいてもよい。さらにまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細菌BSHの発現を調節する転写因子を標的にし得る。
いくつかの態様において、BSHを阻害する剤は、抗体である。本明細書に使用されるとき、用語「抗体」は、少なくとも1個の免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含し、かつ所定の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体の抗原結合ドメインを含む抗体またはポリペプチドを含み得る。側面のいずれかのいくつかの態様において、抗体試薬は、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書中VHとして略される)、および軽(L)鎖可変領域(本明細書中VLとして略される)を包含し得る。別の例において、抗体は、2つの重(H)鎖可変領域および2つの軽(L)鎖可変領域を包含する。用語「抗体試薬」は、抗体(例として、単鎖抗体、FabおよびsFabフラグメント、F(ab')2、Fdフラグメント、Fvフラグメント、scFv、CDR、ならびにドメイン抗体(dAb)フラグメント(例として、de Wildt et al.,Eur J.Immunol.1996;26(3):629-39を参照;これは、incorporated by reference 本明細書中その全体が参照されることによって組み込まれる))ならびに完全抗体の抗原結合性フラグメントを網羅する。抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、またはIgM(ならびにサブタイプおよびそれらの組み合わせ)という構造上の特色を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、および霊長目の動物(ヒトおよび霊長目の非ヒト動物)の抗体、ならびに霊長目の動物化(primatized)抗体を包含するいずれの供給源からのものであり得る。抗体はまた、広く中和する抗体、ミニボディー、ナノボディー、ヒト化抗体、キメラ抗体等も包含する。
他の態様において、BSHを阻害する剤は、ポリペプチドである。本明細書に使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド」ならびに複数形の「ポリペプチド」を包含することを意図し、2以上のアミノ酸のいずれの鎖(単数または複数)も包含する。よって、本明細書に使用されるとき、これらに限定されないが、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」、および「連続したアミノ酸配列」を包含する用語はすべて、「ポリペプチド」の定義内に網羅され、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれと交換可能に使用され得る。用語は、例えば、これらに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク分解的切断、翻訳後プロセシング、または天然には存在しない1以上のアミノ酸を包含させることによる修飾を包含する、1以上の翻訳後修飾(単数または複数)を経るポリペプチドをさらに包含する。従来の命名法は、当該技術分野において、ポリヌクレオチド構造およびポリペプチド構造について存在している。例えば、1文字および3文字の略語は、アミノ酸:アラニン(A;Ala)、アルギニン(R;Arg)、アスパラギン(N;Asn)、アスパラギン酸(D;Asp)、システイン(C;Cys)、グルタミン(Q;Gln)、グルタミン酸(E;Glu)、グリシン(G;Gly)、ヒスチジン(H;His)、イソロイシン(I;Ile)、ロイシン(L;Leu)、メチオニン(M;Met)、フェニルアラニン(F;Phe)、プロリン(P;Pro)、セリン(S;Ser)、トレオニン(T;Thr)、トリプトファン(W;Trp)、チロシン(Y;Tyr)、バリン(V;Val)、およびリシン(K;Lys)を記載するための幅広く採用される。本明細書に提供されるアミノ酸残基は、「L」異性体の形態であるのが好ましい。しかしながら、「D」異性体の形態の残基は、いずれのL-アミノ酸残基とも置換されてもよいが、ただしポリペプチドの所望される特性は保持される。
側面のいずれかの別の態様において、BSHは、これらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、メガヌクレアーゼ、およびCRISPR/Cas系を包含するゲノム編集系を使用し、細菌性細胞ゲノムにおいて阻害される。側面のいずれかのいくつかの態様において、1以上のガイドRNAをコードする核酸を細胞のゲノム中へ組み込むのに使用されるゲノム編集系は、CRISPR/Cas系ではない;これは、少量のCas酵素/タンパク質を保持する細胞において、望ましくない細胞死を防止し得る。Cas酵素またはsgRNAのいずれかが、異なる誘導性プロモーターの制御下で各々発現され、それによって各々の一時的な発現が、かかる干渉を防止できるようになることもまた、本明細書に企図される。遺伝子編集系は、直接的または間接的に、BSHのレベルもしくは活性、または発現をモジュレートし得る。
態様のいずれかの一側面において、本明細書に提供されるのは、胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)を阻害するための方法であって、方法は、BSHを本明細書に提供される化合物と接触させることを含む。
側面のいずれかのいくつかの態様において、剤は、胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)のインヒビターである。側面のいずれかの別の態様において、剤は、式I～XVIIIのいずれか1つで表される化合物または3-硫酸化-リトコール酸-フルオロメチルケトン(3S-LCA-FMK)である。側面のいずれかの別の態様において、剤は、式I～XVIIIのいずれか1つで表される誘導体または3-硫酸化-リトコール酸-フルオロメチルケトン(3S-LCA-FMK)である。側面のいずれかの別の態様において、剤は、胆汁酸またはその誘導体である。側面のいずれかの別の態様において、剤は、ケノデオキシコール酸(CDCA)またはその誘導体である。
いくつかの態様において、BSHの阻害は、二次胆汁酸の低減をもたらす。他の態様において、BSHの阻害は、胆汁酸の抱合を促進する。別の態様において、BSHの阻害は、胆汁酸の脱抱合を低減する。BSHの活性は、脱抱合された胆汁酸の有無によって決定され得る。
側面のいずれかのいくつかの態様において、BSHの活性またはレベルは、適切な対照と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、またはそれ以上まで阻害される。
胆汁酸ホメオスタシスの不均衡は、高コレステロール血症、肥満、糖尿病、がん、胃腸疾患、および胆石の形成を包含する疾患の病態生理学において因果的役割を果たし得、これら代謝体の生物学的な重要性をさらに強調する。
側面のいずれかのいくつかの態様において、対象は、胃腸疾患を有するリスクがあるか、またはこれを有する。(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)。
側面のいずれかのいくつかの態様において、疾患は、胃腸疾患である。ある態様において、胃腸疾患 胃腸感染症である。ある態様において、胃腸感染症は、Staphylococcus;Helicobacter pylori;Escherichia coli;Salmonella;Campylobacter;Yersinia enterocolitica;Shingella;Clostridium;Bacteroides;Lactobacillus;Parabacteroides;Bifidobacterium;Listeria;およびStreptococcusからなる群から選択される細菌によって引き起こされる感染症である。ある態様において、胃腸疾患は、炎症性腸疾患(IBD)である。ある態様において、胃腸疾患は、虫垂炎である。ある態様において、胃腸疾患は、クローン病(CD)である。ある態様において、胃腸疾患は、潰瘍性大腸炎(UC)である。ある態様において、胃腸疾患は、胃炎である。ある態様において、胃腸疾患は、腸炎である。ある態様において、胃腸疾患は、食道炎である。ある態様において、胃腸疾患は、膵炎である。ある態様において、胃腸疾患は、糖尿病である。ある態様において、胃腸疾患は、肝炎である。ある態様において、胃腸疾患は、肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症)である。ある態様において、胃腸疾患は、胃食道逆流症(GERD)である。ある態様において、胃腸疾患は、セリアック病である。ある態様において、胃腸疾患は、憩室炎である。ある態様において、胃腸疾患は、食物不耐性である。ある態様において、胃腸疾患は、潰瘍である。ある態様において、胃腸疾患は、感染性大腸炎である。ある態様において、胃腸疾患は、過敏性腸症候群である。ある態様において、胃腸疾患は、腸管壁侵漏である。ある態様において、胃腸疾患は、がんである。
側面のいずれかの別の態様において、胃腸疾患は、肝疾患である。ある態様において、肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)である。ある態様において、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)である。ある態様において、肝疾患は、A型肝炎である。ある態様において、肝疾患は、B型肝炎である。ある態様において、肝疾患は、C型肝炎である。ある態様において、肝疾患は、自己免疫性肝炎である。ある態様において、肝疾患は、肝臓の硬変症である。
側面のいずれかの別の態様において、対象は、肥満を有するリスクがあるか、またはこれを有する。本明細書に使用されるとき、用語「肥満」は、身体における過剰な脂肪を指す。
側面のいずれかのいくつかの態様において、肥満の対象は、本明細書に記載のとおりの処置を施すのに先立ち、肥満度指標が少なくとも約25kg/m2の対象であり得る。いくつかの態様において、肥満の対象は、本明細書に記載のとおりの処置、化合物、または剤の投与に先立ち、肥満度指標が少なくとも約30kg/m2の対象であり得る。
側面のいずれかの別の態様において、対象は、炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、肝疾患、胆道閉鎖、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、リウマチ性関節炎)を有するリスクがあるか、またはこれを有する。
一側面において、本明細書に提供されるのは、対象における糖尿病を処置する方法である。
いくつかの態様において、糖尿病は、I型糖尿病、II型糖尿病、新生児糖尿病、若年発症成人型糖尿病、または妊娠糖尿病である。
いくつかの態様において、糖尿病は、肥満によって引き起こされる。一側面において、本明細書に提供されるのは、対象において肥満を処置する方法である。
ある態様において、疾患は、がんである。ある態様において、がんは、消化器系のがんである。ある態様において、がんは、肝癌である。ある態様において、がんは、肝臓がんである。ある態様において、がんは、結腸がんである。ある態様において、がんは、食道がんである。ある態様において、がんは、胃部のがんである。ある態様において、がんは、肝がんである。ある態様において、がんは、腎臓または腎がんである。ある態様において、がんは、口腔がんである。ある態様において、がんは、膵臓がんである。ある態様において、がんは、前立腺がんである。ある態様において、がんは、直腸がんである。ある態様において、がんは、胃がんである。ある態様において、がんは、基底細胞癌である。ある態様において、がんは、胆道がんである。ある態様において、がんは、肺がんである。ある態様において、がんは、膀胱がんである。ある態様において、がんは、子宮頸がんである。ある態様において、がんは、子宮内膜がんである。ある態様において、がんは、子宮がんである。ある態様において、がんは、泌尿器系のがんである。
いくつかの態様において、炎症性疾患は、以下:クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、および胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、およびリウマチ性関節炎からなる群から選択される。いくつかの態様において、炎症性疾患は、クローン病である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、潰瘍性大腸炎である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、膵炎、肝炎である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、虫垂炎である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、胃炎である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、憩室炎である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、セリアック病である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、食物不耐性である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、腸炎である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、潰瘍である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、胃食道逆流症(GERD)である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、乾癬性関節炎である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、乾癬である。いくつかの態様において、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎である。
ある態様において、処置されている対象は、動物である。動物は、いずれの性であってもよく、いずれの発生段階にあってもよい。ある態様において、対象は、哺乳動物である。ある態様において、処置されている対象は、ヒトである。ある態様において、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの飼育動物である。ある態様において、対象は、イヌまたはネコなどの伴侶動物である。ある態様において、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜動物である。ある態様において、対象は、動物園の動物である。別の態様において、対象は、齧歯類の動物(例として、マウス、ラット)、イヌ、ブタ、または霊長目の非ヒト動物などの研究動物である。ある態様において、動物は、遺伝子学的に改変された動物である。ある態様において、動物は、トランスジェニック動物である。
側面のいずれかの別の態様において、対象は、がんを有するリスクがあるか、またはこれを有する。一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換は、肝臓中の腫瘍サプレッサーの減少へ繋がり得る。この機序は、他のタイプのがんまで拡張され得ることが企図される。例えば、Ma et al.Science(2018)を参照(これは、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)。
本明細書に提供される方法および組成物はさらに、対象において前糖尿病を処置または予防するために適用され得る。対象はまた、糖尿病もしくは前糖尿病状態(pre-diabetic condition)を患うか、またはこれを発症するリスクがあるものでもあり得る。糖尿病の原因は、遺伝子突然変異、遺伝性の糖尿病、肥満、生活様式、または特発性に起因し得る。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための広範な投薬量を製剤化するのに使用され得る。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないかまたはまったくないED50を包含する血中濃度の範囲内にある。投薬量は、採用される剤形および利用される使用または投与のルートに依存して、この範囲内で変動させてもよい。
有効な用量は、初めに、細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、動物において製剤化され得る。一般に、組成物は、本明細書に開示の化合物が、1μg/kgから1000mg/kgまで;1μg/kg～500mg/kg;1μg/kg～150mg/kg、1μg/kg～100mg/kg、1μg/kg～50mg/kg、1μg/kg～20mg/kg、1μg/kg～10mg/kg、1μg/kg～1mg/kg、100μg/kg～100mg/kg、100μg/kg～50mg/kg、100μg/kg～20mg/kg、100μg/kg～10mg/kg、100μg/kg～1mg/kg、1mg/kg～100mg/kg、1mg/kg～50mg/kg、1mg/kg～20mg/kg、1mg/kg～10mg/kg、10mg/kg～100mg/kg、10mg/kg～50mg/kg、もしくは10mg/kg～20mg/kgの用量にて、使用されるかまたは与えられるように、投与される。ここに与えられる範囲が、すべての中域(intermediate ranges)を包含する、例えば、範囲1mg/kg～10mg/kgは、1mg/kg～2mg/kg、1mg/kg～3mg/kg、1mg/kg～4mg/kg、1mg/kg～5mg/kg、1mg/kg～6mg/kg、1mg/kg～7mg/kg、1mg/kg～8mg/kg、1mg/kg～9mg/kg、2mg/kg～10mg/kg、3mg/kg～10mg/kg、4mg/kg～10mg/kg、5mg/kg～10mg/kg、6mg/kg～10mg/kg、7mg/kg～10mg/kg、8mg/kg～10mg/kg、9mg/kg～10mg/kg等を包含することは理解されるべきである。さらに企図されるのは、約0.1mg/kg～約10mg/kg、約0.3mg/kg～約5mg/kg、または0.5mg/kg～約3mg/kgの用量(ボーラスまたは連続注入のいずれかとしての)である。上に与えられる範囲に対する中域(ranges intermediate)、例えば、範囲1mg/kg～10mg/kg、例えば、2mg/kg～8mg/kg、3mg/kg～7mg/kg、4mg/kg～6mg/kg等の使用もしくは用量の範囲もまた、本開示の範囲内にあることは、さらに理解されるべきである。
本明細書に記載の化合物は、一度に(at once)投与され得るか、または数多のより小さな用量に分けることで時間を空けて(at intervals of time)投与され得る。正確な投薬量および処置の期間が、組成物が非経口的に投与される場所に、知られている試験プロトコルを使用するかまたはvivoもしくはin vitroでの試験データからの補外(extrapolation)によって決定され得る担体および他の可変要素(variables)に、応じるであろうことは理解される。濃度および投薬量の値もまた、処置される個体の齢とともに変動し得ることに留意すべきである。具体的ないずれの対象にとって、特定の投薬量レジメンが、個々のニーズおよび製剤を投与するかまたは製剤の投与を管理する人の専門家としての判断に従って、経時的に調整される必要があり得ることは、さらに理解されるべきである。ゆえに、本明細書に記述される濃度範囲は例示を意図しており、クレームされる製剤の範囲または実践を限定することは意図していない。
側面のいずれかの一態様において、剤、化合物、または組成物は、絶え間なく投与される(例として、ある期間にわたり一定レベルにて)。剤または化合物の連続投与は、例として、表皮パッチ、連続放出製剤、またはオンボディ(on-body)注射器(injectors)によって、達成され得る。
化合物は、単一ボーラスもしくは複数ボーラスとして、連続注入として、またはそれらの組み合わせとして投与され得る。例えば、化合物は、単一ボーラスとして最初に投与され、次いでボーラスの後に連続注入として投与され得る。注入速度は、いずれの所望される速度でもあり得る。いくつかの企図される注入速度は、1μg/kg/minから100mg/kg/minまで、または1μg/kg/hrから1000mg/kg/hrまでを包含する。注入速度は、0.2～1.5mg/kg/min、またはより具体的に言うと0.25～1mg/kg/min、またはさらにいっそう具体的に言うと0.25～0.5mg/kg/minを包含し得る。化合物が、血流中化合物の充分有効な血漿濃度を安全に維持するのに充分な速度での注入を介して投与されるように、注入速度が、化合物の有効な血漿濃度および脱離速度を維持するのに必要な用量に基づき決定され得ることは解されるであろう。
本明細書に記載のとおりの剤または化合物の投薬量は医師によって決定され、必要次第、観察される処置の効果に適するように調整され得る。処置の期間および頻度に関して、処置が治療的な利益を提供するときを決定するために、かつ、さらなる剤を投与するか、処置を中断するか、処置を再開するか、または他に処置計画へ変更を加えるかにかかわらず決定するために、対象を監視することは、熟練した臨床医にとって典型的なことである。投薬量は、サイトカイン放出症候群などの有害な副作用を引き起こすほど多くはないはずである。一般に、投薬量は、罹患個体の齢、状態、および性とともに変動するであろうし、当業者によって決定され得る。投薬量はまた、合併症が発生した場合に、個々の医師によっても調整され得る。
側面のいずれかの一態様において、本明細書に記載の剤、化合物、または組成物は、単剤治療として使用される。側面のいずれかの別の態様において、本明細書に記載の剤または化合物は、糖尿病のための他の知られている剤および治療剤と組み合わせて使用され得る。「組み合わせて」投与されるは、本明細書に使用されるとき、2つの(またはそれ以上の)異なる処置が、対象が障害で苦痛を感じている過程で、対象へ送達されること、例として、2以上の処置が、対象が障害(例として、糖尿病)と診断された後、かつ障害が治癒もしくは除去される前、または処置が他の理由で止められる前に送達されることを意味する。いくつかの態様において、投与の点から重複するように、ある処置は、第2の送達が始まったときも、まだ送達されている。これは、ときに「同時(simultaneous)送達」または「並列(concurrent)送達」として本明細書に言及される。
他の態様において、一方の処置の送達は、他方の処置の送達が始まる前に終わっている。いずれかのケースのいくつかの態様において、処置は、組み合わされた投与のせいで、より有効である。例えば、第2の処置は、第2の処置が第1の処置の不在下で施された場合に見られる効果(または第1の処置でも類似の状況が見られる効果)より、有効である(例として、第2の処置がないときの効果と等しい効果しか見られない)か、または第2の処置が症状を大きく低減させる。いくつかの態様において、送達は、症状の低減または障害に関する他のパラメータの低減が、一方の処置が他方の不在下で送達されるときに観察されるものより大きくなるようになされる。2つの処置の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的より大きくてもよい。送達は、送達される第1の処置の効果が、第2の処置が送達されたときに依然として検出可能であるようになされる。本明細書に記載の化合物および剤、ならびに少なくとも1つの追加の治療剤は、同時に、同じ組成物においてもしくは別々の組成物において、または連続して、投与され得る。逐次的な投与について、本明細書に記載の剤が第1に投与され得、かつ追加の剤が第2に投与され得るか、または投与の順序は逆転され得る。剤および/または他の治療剤、手順、あるいはモダリティ(modalities)は、活動性(active)障害の期間中、または寛解もしくは活動性が低い(less active)疾患の期間中に施され得る。剤は、別の処置の前、その処置と並列に、処置後、または障害の寛解の間に、投与され得る。
目下、胃腸疾患、炎症性疾患、肝疾患、および代謝障害(例として、肥満)を処置または予防するのに使用される治療法は、これらに限定されないが、インスリン治療、スルホニル尿素(例として、グリブリド)、メグリチニド(例として、ナテグリニド)、SGLT2インヒビター(例として、カナグリフロジン)、胆汁酸捕捉剤(例として、コレセベラム)、ドパミン-2-アゴニスト(例として、ブロモクリプチン)、ビグアナイド(例として、メトホルミン)、DPP-4インヒビター(例として、アログリプチン、リナグリプチン等々)、アルファ-グルコシダーゼインヒビター(例として、アカルボースおよびミグリトール)、チアゾリジンジオン(例として、ロシグリタゾン)、抗生物質(例として、アミノサリチル酸、ノルフロキサシン、ペニシリン、セファロスポリン)、抗ウイルス剤(例として、ザナミビル、オセルタミビル)、ワクチン、コルチコステロイド(例として、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ブデソニド)、鎮痛薬(例として、アセトアミノフェン、イブロプロフェン)、非ステロイド性抗炎症薬(例として、メサラミン)、抗炎症薬(例として、スルファサラジン)、免疫抑制薬(例として、インフリキシマブ、アザチオプリン、アダリムマブ、メルカプトプリン)、栄養補助食品(例として、鉄)、外科手術(例として、人工肛門形成術、回腸瘻造設術、大腸切除術、直腸結腸切除術、胃バイパス術)、ウルソデオキシコール酸(UDCA、またウルソジオールとしても知られている、INN、NAN、AAN、またはUSAN)、コレスチラミン、スタノゾロール、ナルトレキソン、リファンピシン、ピオグリタゾン、メトホルミン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、レチノールエステル、ビタミンA、肝臓透析、または肝臓移植、IV輸液(fluids)、浣腸剤を包含し、他の処置も当該技術分野において知られている。
上の疾患のための処置に加えて、化学治療剤もまた投与され得る。がん(例として、肝臓がん)のための処置の非限定例は、ヌクレオシド類似体(例として、テガフール)、抗葉酸剤、アントラサイクリン、ポドフィロトキシン、タキサン、アルカロイド、アルキル化剤、白金化合物、抗体、レチノイド、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、三酸化ヒ素、キナーゼインヒビター(例として、ソラフェニブ)、外科手術、または当該技術分野において知られているいずれの他の化学治療も包含する。当業者は、使用する化学治療剤を容易に同定し得る(例として、Slapak and Kufe,Principles of Cancer Therapy,Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine,14th edition;Perry et al.,Chemotherapy,Ch.17 in Abeloff,Clinical Oncology 2nd ed.2000 Churchill Livingstone,Inc;Baltzer L,Berkery R(eds):Oncology Pocket Guide to Chemotherapy,2nd ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1995;Fischer D S,Knobf M F,Durivage H J(eds):The Cancer Chemotherapy Handbook,4th ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1993を参照)。
上の疾患のための処置に加えて、化学治療剤もまた投与され得る。がん(例として、肝臓がん)のための処置の非限定例は、ヌクレオシド類似体(例として、テガフール)、抗葉酸剤、アントラサイクリン、ポドフィロトキシン、タキサン、アルカロイド、アルキル化剤、白金化合物、抗体、レチノイド、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、三酸化ヒ素、キナーゼインヒビター(例として、ソラフェニブ)、外科手術、または当該技術分野において知られているいずれの他の化学治療も包含する。当業者は、使用する化学治療剤を容易に同定し得る(例として、Slapak and Kufe,Principles of Cancer Therapy,Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine,14th edition;Perry et al.,Chemotherapy,Ch.17 in Abeloff,Clinical Oncology 2nd ed.2000 Churchill Livingstone,Inc;Baltzer L,Berkery R(eds):Oncology Pocket Guide to Chemotherapy,2nd ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1995;Fischer D S,Knobf M F,Durivage H J(eds):The Cancer Chemotherapy Handbook,4th ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1993を参照)。
組み合わせて投与されるとき、剤または組成物、および追加の剤(例として、第2剤もしくは第3剤)、あるいはすべてが、個々に(例として、単剤治療として)使用される各剤の量もしくは投薬量より多い、少ない、または同じ量あるいは用量で投与され得る。ある態様において、投与される剤、追加の剤(例として、第2剤もしくは第3剤)、またはすべての量あるいは投薬量は、個々に使用される各剤の量または投薬量より少ない(例として、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％)。他の態様において、所望される効果(例として、糖尿病の処置)をもたらす、剤、追加の剤(例として、第2剤もしくは第3剤)、またはすべての量あるいは投薬量は、同じ治療効果を達成するのに個々に要される各剤の量または投薬量より少ない(例として、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％少ない)。
投与
側面のいずれかのいくつかの態様において、剤は、直接注射、皮下注射、筋肉注射、経口投与、または経鼻投与によって投与される。いくつかの態様において、本明細書に提供される剤または医薬組成物を投与することは、対象の血清中のグルコースレベルを低減する。
例示の投与モードは、、これらに限定されないが、注射、注入、点滴、吸入、または摂取を包含する。「注射」は、限定せずに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨下の注射ならびに注入を包含する。好ましいある態様において、組成物は、経口的に投与される。いくつかの態様、本明細書に提供される剤または組成物は、門脈中へ直接注射される。例えば、門脈中への注射は、剤または医薬組成物の全身性副作用を限定し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される組成物は、持続放出のため門脈中へ埋め込まれる。いくつかの態様において、組成物は、注入ポートを介して投与される。
非経口剤形の投与が、典型的には、夾雑物に対する罹患個体の自然防御を回避することから、非経口剤形は、好ましくは、滅菌されているか、または罹患個体への投与に先立ち滅菌されることが可能である。非経口剤形の例は、これらに限定されないが、注射用に準備された溶液、薬学的に許容し得る注射用ビヒクルに溶解(dissolved)または懸濁される用意がある乾燥製品、注射用に準備された懸濁液、制御放出非経口剤形、およびエマルションを包含する。
本開示の非経口剤形を提供するのに使用され得る好適なビヒクルは、当業者に周知である。例は、限定せずに、以下を包含する:滅菌水;注射用水(USP);生理食塩溶液;グルコース溶液;これらに限定されないが、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、デキストロース注射、デキストロースと塩化ナトリウムとの注射、および乳酸加リンガー注射などの、水性ビヒクル;これらに限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの、水混和性ビヒクル;ならびに、これらに限定されないが、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどの、非水性ビヒクル。
側面のいずれかのいくつかの態様において、本明細書に記載されるのは、制御放出もしくは遅延放出の手段によって対象へ投与される剤または医薬組成物である。理想的には、最適にデザインされた制御放出用調製物の、医学的処置における使用は、最短の時間内に疾病を治癒または制御するよう採用される最少量の原体によって特徴付けられる。制御放出製剤の利点は以下を包含する:1)薬物の延長された活性;2)低減された投薬頻度;3)増大した罹患個体コンプライアンス;4)総薬物量のより少ない利用;5)局所副作用または全身性副作用の低減;6)薬物蓄積の最少化;7)血液レベル変動の低減;8)処置の効き目の改善;9)薬物活性の増強作用(potentiation)または喪失の低減;および10)疾患または疾病の制御スピードの改善。(Kim,Cherng-ju,Controlled Release Dosage Form Design,2(Technomic Publishing,Lancaster,Pa.:2000))。制御放出製剤は、式(I)で表される化合物の作用の発現、作用の期間、治療濃度域内の血漿レベル、およびピーク血液レベルを制御するのに使用され得る。とりわけ、制御放出もしくは延長放出する剤形または製剤は、剤の最大限の有効性が潜在的な弊害および安全性への懸念(これらは、薬物の過少投薬(すなわち、最小治療レベルを下回る)と、薬物に係る毒性レベルの超過との両方から生じ得る)を最小化しつつ達成されることを確保するために使用され得る。
知られているさまざまな制御放出または延長放出する剤形、製剤、およびデバイスは、本明細書に記載のいずれかの剤との使用に適応され得る。例は、これらに限定されないが、米国特許第:3,845,770号;3,916,899号;3,536,809号;3,598,123号;4,008,719号;5674,533号;5,059,595号;5,591,767号;5,120,548号;5,073,543号;5,639,476号;5,354,556号;5,733,566号;および6,365,185号(これらの各々は、それら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されるものを包含する。これらの剤形は、例えば、種々の割合で所望される放出プロファイルを提供するヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧系(OROS(登録商標)(Alza Corporation, Mountain View,Calif.USA)など)、多層コーティング、マイクロ粒子、リポソーム、もしくはミクロスフェア、またはそれらの組み合わせを使用して、1以上の活性成分の遅延放出あるいは制御放出を提供するのに使用され得る。加えて、イオン交換材料も、固定化され吸着した塩形態の開示化合物を調製するために使用され得、よって薬物の制御送達を生じさせる。特定のイオン交換体の例は、これらに限定されないが、DUOLITE(登録商標)A568およびDUOLITE(登録商標)AP143(Rohm&Haas,Spring House,Pa.USA)を包含する。
効き目
本明細書に記載の剤、例として、疾患の処置のための前記剤の効き目は、当業者によって決定され得る。しかしながら、処置は、前記用語が本明細書に使用されるとき、糖尿病、肥満、胃腸疾患、がん、もしくは炎症性疾患の兆候または症状の1以上を、有益なやり方で変えた場合、臨床的に認められた他の症状を改善、または回復さえもさせた場合、あるいは所望される応答を、本明細書に記載の方法に従う処置の後に、例として、少なくとも10％まで誘導した場合に、「有効な処置」と見なされる。効き目は、例えば、本明細書に記載の方法に従って処置される疾病のマーカー、指針、症状、および/または発生率、あるいは他のいずれかの適切な測定可能なパラメータ(例として、グルコースレベルまたはグルコース耐性)を測定することによって査定され得る。効き目はまた、入院または医学的介入のニーズによって査定されるとおりに悪化(すなわち、症状の進行)した個体の不具合さ(failure)によっても測定され得る。これらの指針を測定する方法は、当業者に知られているか、および/または本明細書に記載されている。
効き目は、場合によっては、本明細書に記載の疾病の動物モデル(例えば、本明細書に提供される疾患のマウスモデルまたは適切な動物モデル)において査定され得る。実験動物モデルを使用したとき、処置の効き目は、マーカーの統計的に有意な変化(例として、糖尿病のモデルにおいて低減した血液グルコースレベル)が観察されたときに明らかとなる。
本開示が、本明細書に提供される具体的な方法論、プロトコル、および試薬等々に限定されず、かつそれ自体変動し得ることは、理解されるはずである。本明細書に使用される専門用語は、具体的な態様を記載する目的しかなく、もっぱらクレームによって定義される本開示の範囲を限定することは意図しない。
ある態様において、本明細書に提供されるのは、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、およびリウマチ性関節炎)の処置を、これを必要とする対象においてする方法である。
ある態様において、本明細書に提供されるのは、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、およびリウマチ性関節炎)の予防を、これを必要とする対象においてする方法である。
本開示はまた、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、およびリウマチ性関節炎)の処置における使用のための、式(I)～(XVIII)で表される化合物、またはその薬学的許容し得る塩も提供する。
本開示はまた、代謝障害(例として、糖尿病、肥満)、胃腸疾患(例として、胃腸感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患(例として、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症);胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがん)、がん(例として、消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓または腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌、胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがん)、または炎症性疾患(例として、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、肝炎、虫垂炎、胃炎、憩室炎、セリアック病、食物不耐性、腸炎、潰瘍、および胃食道逆流症(GERD)、乾癬性関節炎、乾癬、およびリウマチ性関節炎)の処置のための医薬の製造における使用のための、式(I)～(XVIII)で表される化合物、またはその薬学的許容し得る塩も提供する。
ある態様において、疾患は、代謝障害である。ある態様において、代謝障害は、糖尿病である。ある態様において、糖尿病は、I型糖尿病である。ある態様において、糖尿病は、II型糖尿病である。ある態様において、代謝障害は、肥満である。
ある態様において、疾患は、炎症性疾患である。ある態様において、炎症性疾患は、クローン病である。ある態様において、炎症性疾患は、炎症性腸疾患である。ある態様において、炎症性疾患は、潰瘍性大腸炎である。ある態様において、炎症性疾患は、膵炎、肝炎である。ある態様において、炎症性疾患は、虫垂炎である。ある態様において、炎症性疾患は、胃炎、憩室炎である。ある態様において、炎症性疾患は、セリアック病である。ある態様において、炎症性疾患は、食物不耐性である。ある態様において、炎症性疾患は、腸炎、潰瘍、胃食道逆流症(GERD)である。ある態様において、炎症性疾患は、乾癬性関節炎である。ある態様において、炎症性疾患は、乾癬である。ある態様において、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎である。
ある態様において、本開示の方法は、有効量の、式(I)～(XVIII)で表される化合物、またはその薬学的許容し得る塩を対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、有効量は、治療的に有効な量である。いくつかの態様において、有効量は、予防的に有効な量である。
本明細書に記載のある方法は、本明細書に記載の化合物と組み合わせて、1以上の追加の医薬品(単数または複数)を投与することを含んでもよい。追加の医薬品(単数または複数)は、式(I)～(XVIII)で表される化合物と同じ時間にて、または式(I)～(XVII)で表される化合物とは異なる時間にて、投与されてもよい。例えば、式(I)～(XVIII)で表される化合物およびいずれかの追加の医薬品(単数または複数)は、同じ投薬スケジュールまたは異なる投薬スケジュールにあってもよい。すべての用量またはいくつかの用量の式(I)～(XVIII)で表される化合物は、すべての用量またはいくつかの用量の追加の医薬品の投与前に、すべての用量またはいくつかの用量の追加の医薬品の投与後に、追加の医薬品の投薬スケジュール内に、投与されてもよく、またはこれら投与の組み合わせで投与されてもよい。式(I)～(XVIII)で表される化合物および追加の医薬品の投与のタイミングは、種々の追加の医薬品ごとに異なることもある。
例
アッセイプロトコル
細菌の培養。
すべての菌株を、Cullen-Haiser Gut(CHG)培地(これは、1％BBLビタミンK1-ヘミン溶液(BD)、1％微量鉱物(trace minerals)溶液(ATCC)、1％微量ビタミン溶液(ATCC)、5％ウシ胎仔血清(Hyclone)、1g/Lセロビオース、1g/Lマルトース、および1g/Lフルクトースで補充された、脳心臓注入培地(Bacto(商標)BHI,BD)からなる)中、またはBHI+(5mg/Lヘミンおよび2.5uL/LビタミンK1で補充された、Bacto(商標)BHI,BD)中、37℃にて培養した。すべての株を、嫌気性条件下、嫌気性チャンバー(Coy Lab Products Airlock)中、5％水素と20％二酸化炭素窒素との混合ガス(gas mix)で成長させた。Escherichia coliを、pET21bプラスミドについて選択するためにアンピシリンで補充されたLB培地中、好気的に37℃にて成長させた。
UPLC-MS分析。
UPLC-MSによる胆汁酸プロファイリングを、公開された方法を使用して実施した16。抽出効率に係る補正因子を使用し、緩衝剤または細菌培地からの、知られた濃度の関連胆汁酸の抽出と、標準曲線との比較とによって決定した。個々の胆汁酸に係る検出限界を、1:1 MeOH/水に可溶化された市販の標準/合成化合物を使用して決定した。前記検出限界は以下のとおりである:βMCA、0.03ピコモル/μL;TβMCA、0.01ピコモル/μL;CA、0.04ピコモル/μL;TCA、0.01ピコモル/μL;UDCA、0.04ピコモル/μL;TUDCA、0.01ピコモル/μL;DCA、0.04ピコモル/μL;TDCA、0.05ピコモル/μL;GCDCA-d4、0.1ピコモル/μL;CDCA-d4、0.1ピコモル/μL;7-オキソ-CA、0.5ピコモル/μL;7、1.0ピコモル/μL;GR-7、0.05ピコモル/μL。
タンパク質の発現および精製。
B.thetaiotaomicron rBSH。
BT_2086(リーダー配列なし)をコードする遺伝子を、E.coliについてコドン最適化し、C末His6タグを含有するpET-21b(+)ベクター中へクローニングした(プライマーについては表2を参照)。次いで、発現プラスミドをアンピシリン選択下、BL21(DE3)pLysS Escherichia coli(New England Biolabs)細胞中へ形質転換した。アンピシリン(50μg/mL)ありのLB培地中で終夜成長させた培養物を、アンピシリンありの新たなLB培地中1:1000に希釈し37℃にて成長させた。発現を0.6～0.7のOD600にて、1mMイソプロピル-1-チオ-D-ガラクトピラノシド(IPTG)の添加によって誘導し、さらに18℃にて終夜インキュベートした。細胞を、7,000gにて20分間4℃にて遠心分離することによってペレット化した。次いで、ペレット化細胞を、20mMイミダゾール、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、および0.25mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)を含有するPBS緩衝剤(5％グリセロールあり)に再懸濁した。再懸濁された細胞を超音波処理し、16,000gにて20分間4℃にて遠心分離することによってペレット化した。次いで、上清を、予め形成させられたNi-NTAとともに45分間4℃にて混合した。ニッケル結合タンパク質を、PBS緩衝剤(0.25mM TCEPおよび5％グリセロールあり)中の徐々に漸増する濃度のイミダゾールで溶出させた。収集された画分を純度について、SDS-PAGEによって試験した。純粋な画分を合わせて濃縮し、これに続き、保管用緩衝剤(0.25mM TCEPおよび5％グリセロールありのpH7.5でのPBS)を使用して透析した。
結晶化させる目的上、タンパク質を、300mM NaCl、0.25mM TCEP、および5％グリセロールありのpH7.5での50mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤中、BioRad FPLC上、S200サイズ排除カラム(GEから)を使用してさらに精製した。
B.longum rBSH。
B.longum SBT2928からの組換えBSHを、タンパク質発現について0.25mM IPTGを使用し、かつタンパク質精製について1mM TCEPを使用した以外は上のとおりに発現、精製した。
酵素反応速度論。
酵素を、修飾BSH活性アッセイを使用して特徴付けた26。144.8μL PBS緩衝剤(10mM TCEPおよび5％グリセロールを含有)へ、35.2μLのrBSHを加えることで、B.theta BSHおよびB.longum BSHについて夫々、6.2μMおよび7.0μMの最終濃度を供与した。この溶液を水浴中37℃まで予め加熱した。DMSO中、適切な濃度にて抱合された20μLの胆汁酸を、水浴中37℃まで予め加熱し、上の溶液へ加えた。時間間隔毎に、15μLの混合物を15μLの15％トリクロロ酢酸でクエンチした。濁った溶液を4,200gにて15分間遠心分離した。10μLの上清を、190μLのニンヒドリンミックス(15mLの0.5Mクエン酸ナトリウム(pH5.5)、36mLグリセロール、および6mL 0.5Mクエン酸ナトリウム緩衝剤(pH5.5)中、1％[wt/vol]ニンヒドリン)へ加え、混合物をBioRadサーモサイクラー中18分間、100℃まで加熱した。得られた溶液を4℃にて20分間冷却し、吸光度を、分光光度計(Molecular Devices)を使用し570nmにて測定した。
rBSHを使用するインヒビターのスクリーニング。
200nM rBSHを、pH7.5にて0.25mM TCEPおよび5％グリセロールを含有する3mL PBS緩衝剤中37℃にて30分間、100μMインヒビターとともにインキュベートした。胆汁酸プール(100μM)を上の溶液へ加え、37℃にてインキュベートした。それら時点の合間にて、1mLの上の緩衝溶液を、6M HClを使用してpH=1まで酸性化し、1mL酢酸エチルで2度抽出した。次いで、合わせた有機層を、Biotage TurboVap LVを使用して乾燥させた。乾燥抽出物を1:1のメタノール:水に再懸濁し、質量分析計(mass spec)バイアルへ移した。試料を「UPLC-MS分析」に記載された方法のとおりに分析した。得られた胆汁酸の濃度を使用して％脱抱合を決定した。
％脱抱合を算出するための方程式。
％脱抱合＝検出された、脱抱合された胆汁酸の濃度/(検出された、脱抱合された胆汁酸の濃度＋検出された、抱合された胆汁酸の濃度)*100。
化合物7の速度論研究。
アッセイはPBS緩衝剤(0.25mM TCEPおよび5％グリセロールを含有)中で行い、すべての反応物は反応開始時前37℃にてインキュベートした。B.theta BSH(200nM)を、100μM胆汁酸プールと100μM 7とのプールへ加えた。500μLアリコートを、指し示された時点にて除去し、液体窒素中で急速冷凍した。解凍後に溶液を、6M HClを使用しpH=1まで酸性化させ、次いで「rBSHを使用するインヒビターのスクリーニング」に記載される方法のとおりに処理した。手順を8.2mM TUDCAで繰り返した。
組換えタンパク質に対する化合物7のIC50値の決定。
200nM rBSHを、1mL PBS緩衝剤(pH7.5にて0.25mM TCEPおよび5％グリセロールを含有)中37℃にて1h、漸増する濃度の7とともにインキュベートした。100μM胆汁酸(B.theta BSHについてはTUDCA、B.longum BSHについてはTDCA)を上の溶液へ加え、37℃にて2hインキュベートした。溶液を、6M HClを使用してpH=1まで酸性化し、次いで「rBSHを使用するインヒビターのスクリーニング」に記載される方法のとおりに処理した。
細菌におけるインヒビターのスクリーニング。
細菌培養物を、4mL BHI+(100μMタウリン抱合胆汁酸プール、100μMインヒビターを含有)中、0.1のOD600まで希釈した。次いで、これらの培養物を37℃にて嫌気的に成長させた。21h後、段階希釈物をBHI+寒天上に播種することで、細胞生存率(CFU/mL)を決定した。1mLの全細菌培養物を、6M HClを使用してpH=1まで酸性化し、これに続き2mL酢酸エチルを添加してボルテックスした(vortexed)。培養物を2,500gで5分間の遠心分離においてスピンダウンすることで、より良好な分離が得られた。次いで有機層を除去し、水性層を、2mLの酢酸エチルを使用して再度抽出した。乾燥有機抽出物を1:1のメタノール:水に再懸濁し、質量分析計バイアルへ移し、「UPLC-MS分析」に記載される方法のとおりに分析した。得られた胆汁酸の濃縮物を使用して％脱抱合を決定した。
細菌培養物中の化合物7のIC50値の決定。
B.longumの遅い成長に起因し、B.adolescentisを成長過程にある細菌の研究に使用したことに留意されたい。B.thetaおよびB.adolescentisの終夜培養物を、100μM TUDCAまたはTDCAを夫々と漸増する濃度でのインヒビター7とを含有する2mLの新たなCHG培地(「細菌の培養」を参照)中、0.1のOD600まで希釈した。B.thetaおよびB.adolescentisは夫々、細菌アッセイのインヒビターのスクリーニングにおいて、抱合されたいずれかの基質であるTUDCAおよびTDCAを最大限脱抱合した。したがって、これらの基質を使用してIC50値を決定した。次いで、培養物を37℃にて、24h(B.adolescentis)または48h(B.theta)、嫌気的に成長させた。B.thetaは、より長いインキュベーション時間を要するが、なぜならこの細菌は、有意なBSH活性が定常期の間にしか観察されなかったからである。培養物を、「細菌におけるインヒビターのスクリーニング」に記載される方法のとおりに抽出、分析した。
従来のマウス糞におけるインヒビターのスクリーニング。
糞ペレットにおけるBSH活性を、公開された方法の修飾バージョンを使用して定量化した45。糞ペレット(およそ10～20mg)を、緩衝剤(10％PBS、90％酢酸ナトリウム(pH5.2))中、細かい粒子になるまで砕き、1mg/mLの濃度が得られた。指し示された濃度のインヒビターを糞スラリーへ加え、混合物を37℃にて30分間インキュベートした。100μMグリコケノデオキシコール酸-d4(GCDCA-d4)を混合物へ加えて、37℃にて18hインキュベートした。次いで、管をドライアイス中5分間冷凍し、解凍の際、等しい体積のメタノールで希釈した。スラリーを12,500gにて10分間遠心分離した。上清を除いてきれいな(clean)エッペンドルフ管中へ入れ、再度遠心分離した。上清をMSバイアルへ移し、試料を「UPLC-MS分析」に記載される方法のとおりに分析した。これらのアッセイから検出された産物の濃度を直接報告した。
結晶化、データ収集、および構造決定。
BSHの結晶および7と複合体化したBSHの結晶を、24ウェル型(format)中、室温にて懸滴(hanging drops)成長させた。BSH結晶(5.0mg/mL)が、42％タクシマート(tacimate)、100mM Tris(pH7.4)中、3日後にミクロシーディング(micro seeding)から成長した。BSH-7複合体(5.0mg/mL)結晶は、21％PEG 3350および100mM Xクエン酸三ナトリウム二水和物(X Sodium citrate tribasic dihydrate)(pH5.0)中、5d後に成長した。結晶を、母液を10％ 2-メチル-2,4-ペンタンジオール(v/v)で補充することによって、凍結から防止した(cryoprotected)。データ収集を、0.979Aの波長を使用し100KでのAdvanced Photon Source NE-CATビームライン24 ID-Cにて実施した。回折画像を、XDSを使用して処理、縮尺した(scaled)。アポBSH構造に係る相を得るため、分子置き換えを、3HBCを検索モデルとして使用するPhaser46とともにPhenixにおいて実施した。反復モデルのビルディングおよび逆格子空間の精密化(refinement)を夫々、COOTおよびphenix.refine47において実施した。BSH-7構造は、検索モデルとしてのアポBSHとの分子置き換えを使用して段階的に行った(phased)。BSH-7に係る反復モデルのビルディングおよび精密化によって、原子のB因子がグループ化され、kh -lという適用双晶則が使用された。両構造に係るモデル品質を、複合物オミット密度マップ(composite omit density maps)を使用して評価した。。モデルビルディングの最終サイクルにおいて、NCSの拘束(restraints)を除去した。最終的なモデル品質を、MolProbity48を使用して査定した。6UFYについて、97％の残基はラマチャンドランプロットの好ましい領域中にあり、3％は許容領域中にあり、外れ値の領域中には何もなかった;6UH4について、89.3％の残基は好ましい領域中にあり、10.3％は許容領域中にあり、0.4％は外れ値であった。すべての結晶学的データ処理、精密化、および分析ソフトウェアは、SBGrid Consortium49によって集められ、サポートされた。図は、Pymol(Schroedinger)を使用して作成した。
BSH上の標識化残基を同定するための質量分析。
BSHタンパク質を、DMSOまたは10倍モル過剰のインヒビター7とともに室温にて2hインキュベートした。次いで、反応物を、LTQイオントラップ質量分析計(ThermoFisherer Scientific,San Jose,CA)へ相互接続されたShimadzu LCおよびオートサンプラー系(Shimadzu,Marlborough,MA)を使用するLC-MSによって分析した。
修飾部位を決定するため、化合物7によって修飾されたタンパク質を、LC系がOrbitrap Lumos Mass Spectrometer(ThermoFisherer Scientific)へ相互接続された以外は上に記載のとおりに分析した。質量分析計を、1MS走査(m/z 300～2000、プロファイルモード、電子倍増検出)、これに続く、化合物7によって修飾されたタンパク質の+41電荷状態前駆体を標的にするETD MS/MS走査(ETD試薬標的=200ms、60K分解能での画像電流検出、標的値=2E6、ETD反応時間=100msまたは200ms)からなる連続サイクルを実施するようプログラムした。イオンの割り当てを、mzStudioソフトウェア50を使用して実施した。
FXRに対する7の効果。
LanthaScreen TR-FRET Coactivator Assay(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して、製造業者の指示に従い、FXRに対する7の効果を試験した。知られているFXRアゴニストGW4064(Sigma,G5172)を、陽性対照として使用するか(アゴニズムアッセイ)、またはそのEC50(50.3nM、このアッセイにおいて測定された)にて加えた(アンタゴニズムアッセイ)。室温での1hインキュベーションの後、520/495 TR-FRET比率を、以下のフィルターセット:励起340nm、放射495nm、および放射520nmを使用するPerkinElmer Envision蛍光プレートリーダーで測定した。100μsec遅延(delay)時間、これに続く200μsec積分時間を使用して、時間分解シグナルを収集した。
細胞培養。
Caco-2細胞およびNCI-H716細胞は、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から得た。Caco-2細胞は、GlutaMAXおよびEarle's Saltで補充された最小必須培地(MEM)中に維持し、一方NCI-H76細胞は、Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培地(Gibco,Life Technologies,UK)中に維持した。すべての細胞培養培地を、10％ウシ胎仔血清(FBS)、100単位/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン(GenClone)で補充した。細胞を、FBSと抗生物質とで補充された「完全」培地中、37℃にて5％CO2の雰囲気中で成長させた。
プラスミドおよび一過的なトランスフェクション。
ルシフェラーゼレポーターアッセイのため、ヒトレポーター構築物を発現するベクターを使用した。TGR5活性化を夫々研究するためpGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]プラスミド(Promega Corporation)を各2μg/ml培地の濃度にて、Caco-2細胞中に一過的にトランスフェクトした。pGL4.74[hRluc/CMV]プラスミド(Promega Corporation)を0.05μg/ml培地の濃度にて、トランスフェクション効率対照として使用した。すべてのプラスミドを、Opti-MEM(Gibco)およびLipofectamine 2000(Invitrogen,Life Technologies,Grand Island,NY,USA)を使用し、製造業者の指示に従ってトランスフェクトした。プラスミドのトランスフェクションを抗生物質フリーのMEM培地(10％FBSあり)中で実施した。終夜インキュベーション後、7および/または胆汁酸を完全培地中に加えた。7および/または胆汁酸をDMSO中に希釈し、DMSOの濃度を一定に保った。TGR5アンタゴニズムを研究するため10μMのLCAを7と一緒に加え、終夜インキュベートした。翌日、細胞をルシフェラーゼアッセイのために回収した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ。
発光を、二重(Dual-)ルシフェラーゼレポーターアッセイ系(Promega Corporation)を使用し、製造業者の指示に従って測定した。細胞をPBSで穏やかに洗浄し、キットからのPLB中で溶解させた(lysed)。発光を、HMSでのICCB-Longwood Screening FacilityにてSpectraMax M5プレートリーダー(Molecular Devices,San Jose,CA)を使用し測定した。発光をRenillaルシフェラーゼ活性に対し正規化し、相対発光のパーセンテージをDMSO対照と比較して算出した。
細胞生存率アッセイ。
Caco-2細胞およびNCI-H716細胞を夫々、指し示された化合物で処置し、完全MEM培地および完全RPMI培地中のDMSOに希釈した。DMSOの濃度を一定に保ち、陰性対照として使用した。細胞を、化合物とともに5％CO2の雰囲気中37℃にて終夜インキュベートした。翌日、細胞をHBSS(GenClone)中0.25％トリプシンで37℃にて10分間処置した。細胞生存率をCountess II自動細胞計数器(Invitrogen)中で測定した。相対生存率のパーセンテージをDMSO対照と比較して算出した。
上皮透過性アッセイ。
未分化のCaco-2細胞を、24ウェルプレートトランスウェル(0.4uM孔サイズ,Costar)中、1トランスウェルにつき200,000細胞にて撒いた。培地を、Caco-2細胞をin vitroで分化させるため第4、8、12、16および18日に取り換えた51。第21日に、完全に分化、極性化した細胞を、FITC-デキストラン透過性アッセイに使用した。手短に言えば、7およびGR-7を、PBS中、指し示された濃度にて、分化したCaco-2細胞を含有するトランスウェルの頂部(apical)チャンバーへ加え、6hまたは12hインキュベートした。トランスウェルの頂部チャンバーは、100ul体積のPBSを化合物またはDMSO対照とともに含有していた一方、側底チャンバーは500uLのPBSを含有していた。Caco-2上皮の完全性を、頂部チャンバーへ5uMの濃度にて加えられた4kDa FITC-デキストラン(Sigma Aldrich)の受動拡散を測定することによってアッセイした。頂部から側底側までの拡散を、HMSでのICCB-Longwood Screening FacilityにてSpectraMax M5プレートリーダー(Molecular Devices,San Jose,CA)を使用して、トランスウェル系の側底側上のPBS中蛍光を読み取ることによって測定した。蛍光読取をDMSO対照に対して正規化した。
B.adolescentisにおいて7-N3を使用した標的の検証およびオフターゲットプロファイリング。
7-N3を用いた予備研究を、B.adolescentis(グラム陽性)およびB.theta(グラム陰性)を使用して実施した。我々は、B.adolescentisを使用することを、ゲル中蛍光によって検出される総蛍光シグナルがより強いことに起因して選んだ。B.adolescentis培養物を、100μMタウリン抱合胆汁酸プールを含有する6mLの新たなCHG培地に、0.1のOD600まで希釈した。培養物を、37℃にて21h、嫌気的に成長させることができた。次いで、10μM 7-N3(DMSO中10mMストック)または6μL DMSO(対照管へ)を培養物へ加え、37℃にて1h、嫌気的にインキュベートした。培養物を4℃にて15分間、2,500gにて遠心分離した。培地を捨て、細胞を、1mM TCEPおよび1mM PMSFを含有するPBSに再懸濁し、4℃にて15分間4,200rpmの遠心分離をした。緩衝剤を捨て、細胞を300μLの新たな緩衝剤に懸濁し、ホモジナイズ管(homogenizing tubes)( Precellys lysing kit tough micro-organism lysing VK05 tubes)へ、セラミックビーズとともに移した。次いで、懸濁液をホモジナイズし(5000スピードで90s*2、6500スピードで60s)、4℃にて20分間15,000gにてスピンダウンした。上清を除去し、ライセート中のタンパク質濃度をBradfordアッセイによって定量化した。次いで、ライセートを、蛍光画像化のための「ゲル中蛍光画像化に係るクリックケミストリー」ならびに質量分光光度計をベースとした定量化および同定のための「細菌ライセートへのMS/MSに係るクリックケミストリー」のとおりにクリック反応へ供した。
7と7-N3との競合を介したB.adolescentisにおけるBSHの用量依存的標識化。
B.adolescentis培養物を、100μMタウリン抱合胆汁酸プールを含有する6mLの新たなCHGに、0.1のOD600まで希釈した。培養物を37℃にて21h、嫌気的に成長させることができた。逓減する濃度の7を種々の管へ加え、培養物を37℃にて1h、嫌気的にインキュベートした。次いで、10μM 7-N3を培養物へ加え、37℃にてさらに1時間、嫌気的にインキュベートした。培養物を、「B.adolescentisにおいて7-N3を使用した標的の検証およびオフターゲットプロファイリング」および「ゲル中蛍光画像化に係るクリックケミストリー」において報告された方法のとおりにさらに処理した。
哺乳動物の細胞において7-N3を使用したオフターゲットプロファイリング。
ヒト上皮細胞株NCI-H716を、哺乳動物タンパク質との相互作用を研究するのに使用した。10μM 7-N3(DMSO中10mMストック)または1uL DMSO(対照のため)を1ml DPBS(HiMedia)中の～8×106細胞へ加え、1hインキュベートした。細胞を15ml Falcon管中に収集し、15ml DBPS中2回、500gにて5分間の遠心分離によって洗浄した。遠心分離による3回目の洗浄を、DPBS中cOmplete(商標)Protease Inhibitor Cocktail(Roche,Switzerland)の1mM溶液において実施した。細胞を250ulのDPBSに、1mM cOmplete(商標)Protease Inhibitor Cocktailとともに再懸濁し、50％振幅にて2秒間の超音波処理、これに続く氷上30秒を3サイクル行った。ライセートを4℃にて15分間、15,000gにて遠心分離した。上清を除去し、タンパク質濃度をBradfordアッセイによって測定した。次いで、ライセートを、ゲル中蛍光のための「ゲル中蛍光画像化に係るクリックケミストリー」ならびに質量分光光度計をベースとした定量化および同定のための「哺乳動物ライセートへのMS/MSに係るクリックケミストリー」のとおりにクリック反応へ供した。
ゲル中蛍光画像化に係るクリックケミストリー。
クリック反応を25μLの規模で実施した。10μM 化合物7-N3で予め処置されたライセート(細菌細胞と哺乳動物細胞との両方について、1.5mg/mLに対して正規化された)を、100μM fluor 488-アルキン(DMSO中10mMストック)、100μM CuBr(DMSO中5mMストック)、および100μM Tris[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(4:1のt-BuOH:DMSO中5mMストック)とともに、暗中37℃にて1hインキュベートした。10μLの2×レムリ(Laemmli)緩衝剤(5％β-メルカプトエタノールを含有)を反応物へ加え、管を95℃にて10分間加熱した。次いで15μLのタンパク質試料を10％SDS-PAGEによって分割した。ラダーを100倍に希釈し、10μLをロードした(loaded)。ゲルを、40％メタノール、50％酢酸、10％水を使用して30分間脱染し、Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging Systemを使用して視覚化した。ゲルをクマシーブルー(Coomassie blue)中20分間染色し、画像化に先立ち2h脱染した。
細菌ライセートへのMS/MSに係るクリックケミストリー。
クリック反応を100μLの規模で実施した。10μM 化合物7-N3で予め処置されたライセート(1.3mg/mLに対して正規化された)を、100μMデスチオビオチン-PEG4-アルキン(DMSO中10mMストック)、1mM CuBr(DMSO中50mMストック)、および1mM Tris[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(4:1のt-BuOH:DMSO中50mMストック)とともに、37℃にて1hインキュベートした。次いで、試料を、「クリック-タグ付けされたタンパク質のプロテオーム分析」のとおりにさらなる分析のために処理した。
哺乳動物ライセートへのMS/MSに係るクリックケミストリー。
クリック反応を100μLの規模で実施した。10μM 化合物7-N3で予め処置されたライセート(哺乳動物細胞について1.5mg/mL)を、100μMデスチオビオチン-PEG4-アルキン(DMSO中10mMストック)、100μM CuBr(DMSO中5mMストック)、および100μM Tris[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(4:1のt-BuOH:DMSO中5mMストック)とともに、37℃にて1hインキュベートした。次いで、試料を、「クリック-タグ付けされたタンパク質のプロテオーム分析」のとおりにさらなる分析のために処理した。
クリック-タグ付けされたタンパク質のプロテオーム分析。
デスチオビオチン化タンパク質のプルダウンおよびビーズ上(on bead)消化を、これまでに記載されたプロトコル52と同様に実施した。トリプシンペプチドを5％アセトニトリル(0.1％ギ酸あり)に再懸濁後、ペプチドをナノフロー(nanoflow)LC-MS/MSによって記載のとおりに53分析した。生データをmultiplierz54を使用し.mgfへ変換し、ヒトタンパク質またはbifidobacterium adolescentisタンパク質のいずれかの前方反転(forward reversed)データベース(uniprot)に対してMascot 2.6.2を使用し検索した。検索結果をMascotからダウンロードし、xlsへ変換して、multiplierzスクリプトを使用し1％FDRに対してフィルターを掛けた。正規化スペクトル存在因子(Normalized spectral abundance factors)を、記載のとおりに導出した55。データを、7-N3で処置された試料について5より多くのスペクトルカウント(生物学的に三重に行ったものにわたって平均した)をもつタンパク質についてフィルターを掛けた。別々の実験において、クリックされた細菌ライセートタンパク質をアビジン富化(enrichment)へ供し、上に記載のとおりに洗浄した。次いで、タンパク質をLDSローディング緩衝剤で溶出し、SDS-PAGEおよび銀染色へ供した。指し示されたバンドを切り出し、ゲル中消化へ供し、抽出ペプチドをナノフローLC-MS/MSによって記載のとおりに53分析した。
動物研究。
Jackson laboratoriesから得られたC57BL/6マウスを、厳重な12h/12h明/暗サイクルおよび一定温度(21±1℃)および湿度(55～65％)の下で維持した。すべての実験を8～9週齢(week old)オスマウスに対し行った。
7の単一強制飼養。
in vitroアッセイにおける10μM～100μMでの7の効き目に基づき、
我々の7のin vivoでの目標濃度は、～50uM:(0.00005M)×(～10mL体積/1マウスGI管)×(1mmol化合物7/408mg)=0.2mg/マウス×(1マウス/～0.02kg)=10mg/kgであった。
マウスを、実験期間中、標準的な固形飼料(chow diet)(LabDiet,catalog no.5053)で維持した。マウスを各4マウスの2群に分けて、5％DMSOを含有する200μLのトウモロコシ油(ビヒクル群)または7を1.25mg/mLの濃度にて含有する200μLのトウモロコシ油(実験群)のいずれかで強制飼養した。糞ペレット収集のため、各マウスを、マウスが排便するまで数分間、一時的にボール紙製のケージへ移した。
固形飼料(Chow)中GR-7の1日給餌。
マウスに実験期間中、粉末状の標準的な固形飼料(LabDiet,catalog no.5053)を給餌した。マウスを各10マウスの2群に分けて、粉末状の固形飼料(対照群)で維持したか、または0.09％(w/w)GR-7を含有する粉末状の固形飼料(実験群)を給餌した。これらのマウスからの糞を上に記載のとおり8hにて収集した。マウスを、GR-7の有無にかかわらず粉末状の固形飼料へのアクセスから30時間後に、二酸化炭素を使用して安楽死させた。血液試料を心穿刺によって収集し、EDTAでコーティングされた氷上の管中に置いた。次いで、肝臓および盲腸内容物を各マウスから収集し、液体窒素中で急速凍結させ、さらなる分析まで-80℃にて保管した。次いで、血液試料を4℃にて15分間、2500gにて遠心分離した。その結果得られた上清(血漿)を収集し、分析まで-80℃にて保管した。
糞中のBSH活性。
糞ペレット中のBSH活性を、公開された方法の修飾バージョンを使用して定量化した45。糞ペレット(およそ10～20mg)を、100μM(GCDCA-d4)を含有する緩衝剤(10％PBS、90％酢酸ナトリウム(pH5.2))に懸濁することで、20mg/mLの濃度が得られた。糞ペレットを砕いて細かい粒子にし、混合物を37℃にて25分間インキュベートした。試料を「従来のマウス糞におけるインヒビターのスクリーニン」に記載される方法のとおりに処理し分析した。これらのアッセイから検出された産物の濃度を直接報告した。
組織中および血漿中の胆汁酸の定量化。
マウス実験から収集された組織および血漿からの胆汁酸を、これまでに公開された方法を使用して抽出した16。
播種による微生物バイオマスの決定。
冷凍された糞ペレットを使用して、コロニー形成単位(CFU/g)を決定した。糞を嫌気性チャンバー中のPBS緩衝剤に懸濁した。段階希釈したものをCHG寒天プレート上に播種し(「細菌の培養」を参照)、37℃にてインキュベートした。
糞細菌の微生物叢の単離および16S rRNA遺伝子配列決定分析。
マウス糞の微生物叢DNAを、ZymoBIOMICS 96 DNA Kit(ZymoBIOMICS(商標))を使用し、製造業者の指示に従って単離した。16S rRNA遺伝子の可変領域4を、プライマー:フォワード5'-TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'を使用して増幅した。
リバース5'-AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR産物を、Quant-IT dsDNA高感度アッセイ(Invitrogen)を使用し、製造業者の指示に従って定量化した。ゲル電気泳動を使用して、PCR増幅が成功したかチェックした。PCR産物の濃度をQuan-IT dsDNA高感度アッセイによって測定した。各PCR産物のDNAの～120ngを一緒にプールすることで、下流の処理のために集合(aggregated)ライブラリを生成した。300～500bp間のPCR DNAアンプリコンを、標的化サイズ選択プラットホーム(Sage Sciencesからのピッピンプレップ(pippin prep)1.5％アガロースカセット)上の集合ライブラリから、製造業者の指示に従って選択した。DNAアンプリコンのサイズをAgilent Technologies 2100バイオアナライザートレース(bioanalyzer trace)上で特徴付けた。集合ライブラリのDNA濃度をQuant-IT dsDNA高感度アッセイによって測定した。ライブラリ中のDNAをNaOHによって変性させ、Illuminaキット中に提供されるHT緩衝剤で7.5pMまで希釈した。20％phiXスパイクイン(spike-in)(120ul、7.5pMのphiX)した、変性かつ希釈された600ulのライブラリを、MiSeq V2試薬カートリッジ(Illumina)上へロードし、上に記載のカスタムプライマーを使用し、ペアエンドの(paired-end)250bp読取で配列決定した。MiSeqを行った後、デマルチプレックスの(demultiplexed)fastqファイルを、デフォルトパラメータを使用するIllumina MiSeq制御ソフトウェアによって生成し、品質管理をMassachusetts Host-Microbiome Centerでのパイプライン(pipeline)によって行った。次いで、その結果得られたFASTQ配列を、以下のQIIME_mothur_DADA256～59によって品質でフィルターを掛けて分析した。操作的分類単位(OTU)を97％配列類似性で精選した。各OTUの系統的所属(phylogenetic affiliation)を、Greengenes参照データベースおよび99％IDに対してアラインした。
細菌の16S rDNAコピー数の定量化。
細菌のDNAを、AllPrep Bact.DNA/RNA/Protein Kit(QIAGEN)を使用してマウス盲腸内容物から単離した。次いで16S rDNAを、10μMの以下のプライマー対:フォワード5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、リバース5'-CTGCTGCCTYCCGTA-3'を使用して増幅した。増幅を、QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System上LightCycler 480 SYBR Green I Masterを使用し、提供されるqPCRプロトコルに従って実施した。各試料のサイクル閾値を、B.thetaゲノムDNAの段階希釈から得られた標準曲線と比較した60。
例1．腸内細菌の胆汁塩ヒドロラーゼの、広範囲の共有結合性インヒビターの開発
腸内細菌の胆汁塩ヒドロラーゼの、広範囲の共有結合性インヒビターの開発
本明細書に記載されるのは、腸内細菌BSHの、広範囲の共有結合性インヒビターの開発である。合理的なデザインストラテジーを使用して、潜在的なBSHインヒビターの小さなライブラリを生成した。これらの化合物を、腸内細菌の、精製されたBSHタンパク質および成長過程にある培養物に対して試験することによって、アルファ-フルオロメチルケトンウォーヘッドを担持する、リード(lead)インヒビターを同定した。グラム陰性腸内細菌の成長を阻害する別のBSHインヒビター、コーヒー酸フェネチルエステル(CAPE)を決定したが、本明細書に記載の他のBSHインヒビターと同じ広範囲な活性を欠いていた。質量分析およびX線結晶学によって、インヒビターによる触媒システイン残基でのタンパク質の共有結合の単一標識化が確認された。リードインヒビターは、際立って、従来のマウス糞中のBSH活性を完全に無効にした。単回用量のリードインヒビターで強制飼養された従来のマウスは、糞中BSH活性の喪失および脱抱合された胆汁酸の減少を顕した。概して、これらの研究は、胆汁酸組成物をin vivoでモジュレートする化学的ツールとして作用する、共有結合性BSHインヒビターの潜在力を実証する。
導入
ヒト関連細菌は、健康状態および疾患において欠かせない役割を果たしている。微生物の不均衡は、炎症性腸疾患1、がん2、自閉症3、および肥満4を包含する広範な病状へ繋がる。しかしながら、細菌性の寄生体(guests)がいかにしてヒト宿主に分子レベルにて影響を及ぼすのかは、ほとんど理解されていない。細菌の単一株、複数株、または規定の群集を定着させた無菌マウスの研究によって、宿主プロセス(代謝5、免疫機能6,7、および神経学的応答8を包含する)に影響を及ぼす腸内細菌の能力が明らかにされた。無菌マウスは有用なツールではあるものの、それらは、従来の動物と比較して、エネルギーのための食糧の変わった処理9、免疫細胞の均衡における(とくに腸における)欠陥10,11、および変わったストレス応答挙動12を包含する、生理学的な差を顕す。これらの差は、無菌動物において観察される効果が従来の動物およびヒトに対して外挿され得るかどうかの決定を複雑化させ得る。特定細菌の代謝体およびタンパク質のレベルを選択的に変化させる化学的ツールによって、研究者らは、これらの細菌産物が、複雑な微生物群集を保有する完全成熟動物において宿主の生理学に如何にして影響を及ぼすかを調査できるようになり得る。化学的ツールとしての小分子の使用はまた、治療的好機も提示し得る。実際、腸内細菌のベータ-グルクロニダーゼの小分子インヒビターは、結腸がん化学治療剤CPT-11によって引き起こされるマウスの用量制限下痢(dose-limiting diarrhea)を低減することが示されている13。近年の研究において、腸内細菌酵素cutCの小分子インヒビターは、血栓形成促進性の代謝体トリメチルアミンN-オキシド(TMAO)のレベルをin vivoで低減することが示されている14。これらの研究は、宿主の生理学を有益に変化させる特定の細菌酵素を標的にする非殺菌剤の力(power)を実証する。
GI管中の細菌は、飼料化合物と宿主の代謝産物との両方を包含する宿主からの分子に満ちている。次いで、細菌は、これらの化合物を化学的に修飾することで、新しい代謝体のクラスを産生し、次いでこれらは、細菌と宿主との間でシグナリング分子として作用し得る15。宿主によって産生されて細菌によって修飾されたシグナリング分子類の重要な一例は、胆汁酸である16。一次胆汁酸は、肝臓中コレステロールから産生され、タウリンまたはグリシンへ抱合されることで、抱合された一次胆汁酸が産生される(図1A)。次いで、これらの分子は胆嚢に保管され、食糧摂取の際に十二指腸中へ放出されるが、ここでこれらは、脂質および脂溶性ビタミンの吸収を補助する。胆汁酸の95％超は、回腸において再吸収されて肝臓へ再循環される。残りの～5％は、大多数の腸内細菌が存在する結腸へ入る。次いで、腸内細菌は、これらの一次胆汁酸を酵素的に修飾し、二次胆汁酸と呼ばれる一群の分子を産生する(図1A)。50種ほどの二次胆汁酸がヒト糞中から検出されている。小腸中へ放出された高濃度の胆汁酸に起因し、より下の腸(lower gut)において、結果として生じたこれら分子の濃度は、依然として低ミリモルの範囲にある17。結果として、それほど豊富でない二次胆汁酸でさえも、生理的に適切な(physiologically relevant)濃度にて存在する。
胆汁酸は、それらの洗剤特性に起因し、初めに研究されたが、これらの化合物は、宿主受容体(核ホルモン受容体(NhR)およびGタンパク質共役受容体(GPCR)を包含する)へ結合することによってシグナリング分子として作用し得ることが後に認識された(図1B)。一次および二次胆汁酸は、ファルネソイドX受容体(FXR)、肝臓X受容体(LXR)、プレグナンX受容体(PXR)、Gタンパク質共役胆汁酸受容体1(GPBAR1、またTGR5としても知られている)、ムスカリン受容体2および3、ならびにスフィンゴシン1ホスファート受容体2を包含する、これら受容体に対し、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用することによって宿主の処理に影響を及ぼす18～22。とりわけ、胆汁酸は、宿主の受容体にはめ込まれることによって、エネルギー消費ならびにグルコースおよび脂質のホメオスタシス18,23、ならびに宿主の免疫応答(先天免疫と適応免疫との両方を包含する)24,25を包含する、宿主の代謝を調節する。加えて、胆汁酸は、それら自身の生合成を、FXRによって制御される負のフィードバックループを通して緊密に調節する23。胆汁酸ホメオスタシスの不均衡は、高コレステロール血症、肥満、糖尿病、がん、胃腸疾患、および胆石の形成18,26,27を包含する疾患の病態生理学において因果的役割を果たすと考えられており、これら代謝体の生物学的な重要性をさらに強調する。
重要なことに、個々の一次胆汁酸および二次胆汁酸は、宿主受容体に対して異なる結合親和性を保有しており、これによってin vivo胆汁酸プールの特定の組成が宿主の下流シグナリング事象を決定することが示唆される18,28。一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換において要となる反応は、抱合された一次胆汁酸のC24-アミド結合の加水分解である(図1A)。この反応は、腸内細菌の胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)酵素によって実施される16。BSH(EC 3.5.1.24)は、広範囲のヒト腸内細菌にある。近年の研究によって、2つの支配的な腸内の門(dominant gut phyla)、BacteroidetesおよびFirmicutes、ならびにActinobacteriaおよびProteobacteriaを包含する、117属および12門からの腸内種においてBSHが同定された29。その上、この研究によって、タンザニアの先住民を包含する、6大陸を越えて11の異なる集団からのヒトマイクロバイオームにおいてBSHが同定された。これらの結果から、BSH活性が、ヒト腸内メタゲノムの保存された機能であることが示唆される。よって、腸内細菌BSHの、広範囲の非毒性小分子インヒビターは、これら細菌の成長に有意な影響を及ぼさずに、様々なグラム陰性とグラム陽性との両株にわたるBSH活性を限定し得る。さらに、かかるインヒビターのin vivoでの使用は、胆汁酸プールの、抱合された胆汁酸へ向かうシフト、かつ脱抱合された胆汁酸および二次胆汁酸から離れるシフトをもたらし得る(図1A)。本明細書に記載のとおりのこれら化合物は、細菌によって産生された二次胆汁酸が、完全に定着された宿主の生理学に如何にして影響を及ぼすかを研究するのに使用され得る。
細菌BSHの、広範囲の共有結合性インヒビターの開発が本明細書に記載されており、合理的デザインアプローチを使用することによって決定された。重要なことに、本明細書に記載の化合物は、従来のマウス糞中のBSH活性を有意に阻害し得るが、これはそれらの活性をBSHの広範囲インヒビターとして実証する。
実験結果
胆汁塩ヒドロラーゼの共有結合性小分子インヒビターの合理的デザインおよび合成
BSHの強力かつ長期にわたるインヒビターを生成するという目標を達成するために、これら腸内細菌酵素の共有結合性インヒビターを開発し、本明細書に記載した。共有結合性インヒビターは、高濃度のネイティブな基質の存在下であっても効能および選択性が高いそれらのタンパク質標的の不活性化能に起因し、創薬の分野において広範囲の関心を得ている30。BSHの基質である、抱合された胆汁酸は、結腸中、高濃度で見出されるが(1～10mM)17、これは共有結合性の阻害が、これらの酵素を標的にするのに有効なストラテジーであり得ることを示唆する。加えて、近年開発された、細菌のcutCのインヒビターは、不可逆性であって、トリメチルアミンのin vivoでの産生をブロックするとともに、最小限のオフターゲット効果を顕す14。この研究は、細菌酵素の共有結合性インヒビターが腸内において有効であり得ることを実証し、よって本アプローチをさらに検証する。
腸内株にわたるBSHタンパク質配列には有意な多様性があるが、すべてのBSHは、5個のアミノ酸:システイン2(Cys2)、アルギニン18(Arg18)、アスパラギン酸21(Asp21)、アスパラギン175(Asn175)、およびアルギニン228(Arg228)から構成される、保存された活性部位を保有する16,29。Cys2は、基質カルボニル上への求核攻撃を実施し、アミド結合の切断をもたらす(図2A)。高度に保存されたこのCys残基を標的にした化合物をデザインすることによって、広範囲のBSHインヒビターが開発された。グラム陽性種Clostridium perfringensからの構造データおよび生化学的情報がデザイン計画に役立った。C.perfringens BSHと基質タウロデオキシコール酸(TDCA)との共結晶構造によって、疎水性相互作用が胆汁酸コアを適所に留めつつ、かつアミド結合を保存されたシステインへ向けて正しい方向に置きつつ、そのアミノ酸が溶媒に晒されることが示された(図2B)31。さらにまた、精製されたC.perfringens BSHは、ばらつきが大きいアミノ酸側鎖(より長い鎖の抱合体を包含する)を忍容する32。これらの結果は、胆汁酸D環側鎖が、求電子基のインヒビター中への組み込みのためのあり得る部位であったことを示唆する。
次に、BSHを選択標的にするための胆汁酸コアモチーフと、酵素へのインヒビターに不可逆的に結合するためのペンダント(pendant)求電子ウォーヘッドとの両方を含有する、潜在的インヒビターの小さなライブラリをデザインした(図2C)。先の文献によって、BSHが、ステロイドのコアを問わず、抱合されたすべての胆汁酸のアミド結合切断を加水分解することが示唆されたものの16,26、豊富なグラム陰性腸内細菌の門Bacteroidetesからの種が、C12=HであってC12=OHではない一次胆汁酸を切断することが近年決定された(図1A)33。目標がグラム陰性とグラム陽性との両株を標的にするBSHインヒビターを開発することであるところ、ヒト一次胆汁酸ケノデオキシコール酸(CDCA、C12=H)のステロイド部分を、本明細書に記載のインヒビターのための骨格として使用した(図2C)。
求電子的に捕捉する基について、選択的かつ強力なプロテアーゼおよびキナーゼのインヒビターの開発において、成功裏に配置されたウォーヘッドを選択したが34,35、これらはイソチオシアナート(1)36～38、シアノアクリラート(2)39,40、α,β-不飽和系(3および4)41、アクリルアミド(5)42、およびニトリル(6)43,44を包含する。ライブラリ中、α-フルオロメチルケトンウォーヘッド(FMK)(7)をもつインヒビターを選んだ。このウォーヘッドをもつ共有結合性インヒビターは、高い効能および選択性を顕すことが示されている45～47。より求電子性のα-ヨード-、α-ブロモ-、およびα-クロロメチルケトンウォーヘッドとは対照的に、フッ素の弱い脱離基能は、FMKウォーヘッドの反応性を小さくさせ、ゆえにより選択的にさせる45,47,48。結果として、FMKをベースとしたインヒビターは、最小限のオフターゲット効果を惹起することが示されている45,49。
ライブラリ中の化合物のすべてが、市販の胆汁酸ケノデオキシコール酸(CDCA、12)(スキーム1)から、3～9ステップで利用可能であった。イソチオシアナート(1)およびアクリルアミド(5)を、CDCAから、C23-置換の一級アミンを組み入れるワンポットの修飾クルチウス転位50を利用して、3ステップにわたり合成した(スキームS1)。シアノアクリラート(2)、α,β-不飽和系(3および4)、およびニトリル(6)化合物の合成を、ビス-メトキシメチルエーテル(MOM)から2～3ステップで迅速に進め、グリニャール付加反応または縮合反応のいずれかを介してC24-アルデヒドCDCAを保護した(スキームS1)。化合物7を利用可能とするため、ビス-MOM保護CDCA(13)をマグネシウムベンジルフルオロマロナートとカップリングさせ、β-ケト-α-フルオロベンジルエステル産物14を66％収率で提供した51。水素化、これに続く脱保護によって、標的化合物7が供与された。
Figure 2022533069000061
スキーム1:α-フルオロメチルケトンウォーヘッドをケノデオキシコール酸コア上に含有する化合物7の合成。略語:SOCl2、塩化チオニル;DIPEA、N,N-ジイソプロピルエチルアミン;MOMCl、メトキシメチル塩化物;THF、テトラヒドロフラン;CDI、1,1'-カルボニルジイミダゾール;Pd/C、炭素上パラジウム;R=メトキシメチルエーテル。
BSHの生化学的特徴付け
インヒビター1～9を手にした次の目標は、グラム陰性BSHとグラム陽性BSHとの両方に対して生化学的にこれらの化合物の活性を評価することであった。とりわけ、これらの化合物を選択的Bacteroides BSHに対して試験したが、この酵素のより限定的な基質範囲によって標的化がより困難になり得ることが推察される。今日まで、生化学的特徴付けは、属Lactobacillus53、Bifidobacterium54、Clostridium31、およびEnterococcus55を包含するグラム陽性細菌からのBSHに大きく限定されていた16,26,52。グラム陰性細菌のうち、Bacteroides vulgatusおよびBacteroides fragilishaveからのBSHのみが生化学的に特徴付けられているが、対応する遺伝子は同定されなかった56,57。その上、これらの株は、選択的なBSHの選択性を保有していない33近年、BT2086が、腸内細菌Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482(B.theta)において選択的なBSH活性を担う遺伝子として同定された33。この選択的なBSHに対して化合物を試験するため、BT2086によってコードされる異種発現される精製酵素を、分子的にクローニングした。この酵素はこれまでに特徴付けられてこなかったため、速度論的パラメータを、ニンヒドリンをベースとしたアッセイ58を使用して、抱合された一次および二次胆汁酸(一次、タウロコール酸、TCA、およびタウロケノデオキシコール酸、TCDCA;二次、タウロウルソデオキシコール酸、TUDCA、およびタウロデオキシコール酸、TDCA)のその酵素の加水分解について確立した。グリコ-胆汁酸はマウスにはほとんど存在しないが、タウリン抱合体はマウスとヒトとの両方に存在するところ28、タウリンに抱合された基質を選んだ。B.theta培養物からの先の結果と一致し、精製されたB.theta BSHは、TDCAの脱抱合を優先することを顕したが、TCAの脱抱合はしなかった(表1)33。これらの結果は、B.thetaの細胞培養全体において酵素選択的に観察されたことが、輸送の差でも酵素への基質利用可能性の差でもなく、BSH固有の生化学的特性に起因したことを示唆する。
グラム陽性BSHに対するインヒビターの効能を試験するため、知られているBifidobacterium longum SBT2928 BSH54をクローニングし発現させて、この酵素の速度論的パラメータを、タウリンに抱合された胆汁酸基質と同じ一団(表1)を使用して決定した。注目すべきことに、認識される基質のすべてに係るKm値は、これら胆汁酸のおよその腸内濃度である低ミリモル範囲にある。ここで確立されたB.longumに係るKm値は、これまでに報告されたものより高い54。この差は、アッセイが実施された条件、つまり、先の研究における活性に最適化されたpH(6)に対する、この研究における生理学的なpH(7.5)の結果であり得る。概して、両酵素は、これまでに特徴付けられたBSHの速度論的パラメータ53,54,56に匹敵する速度論的パラメータを顕した。
表1:グラム陰性Bactereroides thetaiotaomicron(B.theta)BSHおよびグラム陽性Bifidobacterium longum(B.longum)BSHの速度論的な特徴付け。
Figure 2022533069000062
aニンヒドリン試薬を使用して特徴付けを実施し、実験をPBS緩衝剤中pH7.5および37℃にて実施した。
b基質として使用された、抱合された一次および二次胆汁酸は、タウロコール酸(TCA)、タウロウルソデオキシコール酸(TUDCA)、タウロデオキシコール酸(TDCA)、タウロケノデオキシコール酸(TCDCA)であった。
生化学的評価によってα-FMK化合物7がリードインヒビターとして同定される
次に、ライブラリ中化合物の、B.thetaおよびB.longum BSHの阻害能を評価した。リボフラビン(10)およびコーヒー酸フェネチルエステル(CAPE、11)の2つの追加化合物をアッセイに包含させた(図2E)。これらの分子は、ニワトリ腸内単離物Lactobacillus salivariusからのBSHに対するハイスループットスクリーニングを通して、BSHインヒビターとしてこれまでに同定されていた59。これら化合物のBSH阻害活性を決定するため、B.theta BSHを各インヒビター(100μM)とともに30分間インキュベートし、次いで、等モル量の4種の抱合された胆汁酸(TβMCA、TCA、TUDCA、およびTDCA、全100μM)を加えた。
抱合された胆汁酸から脱抱合された胆汁酸への変換を、計21時間にわたり超高速(Ultra Performance)液体クロマトグラフィー-質量分析(UPLC-MS)によって監視した(図3)。合成インヒビターのうち、イソチオシアナート(1)は、実験の過程にわたって穏やかな阻害を顕した。マイケル(Michael)アクセプターウォーヘッドを含有する他の化合物(インヒビター2～6)は、脱抱合を阻害しなかった(図3A)。対照的に、α-フルオロメチルケトンをベースとしたインヒビター7とのインキュベーションは、21時間の、B.theta BSH活性のほとんど完全な阻害をもたらした(＞98％、図3A)。化合物7の阻害活性が脱離基としてのフッ素の存在に起因したことを検証するため、フッ素原子を欠くメチルケトン類似体を合成した(8)49。この類似体はBSH阻害を顕さなかったが、これはα-フッ素基が活性に必要であったことを指し示している。これまでに同定されたBSHインヒビターであるリボフラビンは、いかなる阻害活性も顕さなかった一方、CAPEは、B.theta BSHの中程度の阻害のみを提供した。
次に、B.theta BSHに対する最も強力な2種のインヒビターの活性を評価した。化合物1および7、ならびにCAPEを、グラム陽性種B.longumからのBSHに対して試験した(図3B)。これらの化合物は、B.longum BSHに対し、B.theta BSHに対して観察されたのと同じ差次的(differential)有効性を顕した。化合物7は、2h、5h、および21hの時点にて、最も強力なインヒビターであり、化合物1は、穏やかな阻害を顕し、CAPEは、すべての時点にて、B.longum BSHによる脱抱合を阻害するのに有効ではなかった。これらのデータから、化合物7は、グラム陰性菌株とグラム陽性菌株との両方からの精製BSHタンパク質の強力なインヒビターであることが指し示される。加えて、Lactobacillus以外の属に対するCAPEおよびリボフラビンの活性が決定されていないことから59、これらの結果は、これらの分子が広範囲の有効なインヒビターではない可能性があることを示唆する。
化合物7は、腸内細菌の成長過程にある培養物中のBSH活性を阻害する
化合物7がB.thetaおよびB.longumからの精製BSHに対して活性を顕したことを考慮すると、成長過程にある細菌培養物中のこのインヒビターの効能を評価した。BSH阻害の範囲を試験するため、BSH活性を保有することが知られているヒト腸内細菌の3種のグラム陰性株および3種のグラム陽性株(グラム陰性、B.theta、Bacteroides fragilis ATCC 25285、およびBacteroides vulgatus ATCC 8482;グラム陽性、Lactobacillus plantarum WCFS1、Clostridium perfringens ATCC 13124、およびBifidobacterium adolescentis L2-32)をこのスクリーニングにおいて試験した16,33。
細菌培養物を対数期前に希釈し、インヒビター(100μM)と、抱合された胆汁酸(最終濃度100μM;TCA、TβMCA、TDCA、およびTUDCA)の混合物との両方を、同時に加えた。脱抱合を、UPLC-MSを使用して24時間にわたり監視した。際立つことに、ビヒクル対照の存在下では6菌株すべてが胆汁酸を脱抱合した一方、化合物7の存在下で成長した培養物のいずれにおいても、検出可能な脱抱合はほとんど観察されなかった。これらの結果は、化合物7がグラム陰性細菌とグラム陽性細菌との両方の強力なBSH阻害を顕すことを示唆する(図4A)。化合物7は、試験された株のいずれの成長にも有意に影響を与えなかったが(図4B)、これは観察されたBSH阻害が静菌活性に起因しなかったことを指し示す。化合物7の効能を定量化するため、グラム陰性株B.thetaおよびグラム陽性株B.adolescentisに対するこのインヒビターのIC50値を夫々決定し、913nMおよび227nMであった(図4C)。まとめると、これらの結果は、化合物7が、BSHの強力な広範囲インヒビターであることを指し示している。
対照的に、CAPE(100μM)の存在下で成長した6菌株のうち5種において、脱抱合の阻害は21時間にわたって観察されなかった(図4A)。CAPEは、L.plantarumにおいて脱抱合を阻害することが見出されたが、この結果は、この化合物はLactobacilliからのBSHは阻害するが広範囲のBSHインヒビターではないという仮説と一致する。その上、インヒビター7とは対照的に、CAPEは、試験された3種すべてのグラム陰性菌株の成長を阻害した(図4B)。これらの結果は、グラム陰性細菌に対するCAPEの支配的な効果は、BSHの阻害活性ではなく、むしろ成長の阻害であることを示唆する。
C12=OH化合物が有効なインヒビターで広範囲のインヒビターではないという仮説を評価するため、それらがB.theta BSH活性を阻害しないであろうことから、最も強力なインヒビターの化合物7からのα-フルオロメチルケトンウォーヘッドをC12=OH胆汁酸コアのコール酸へ付け加えたインヒビターを合成した(化合物9、図2D)。次に、B.thetaの成長過程にある培養物を、化合物9(1μMまたは10μM)および抱合された胆汁酸基質(GUDCA、100μM)とともにインキュベートし、UPLC-MSを使用して脱抱合を監視した。10μMの化合物7とのインキュベーションが、脱抱合の大体完全な阻害をもたらした一方、有意な脱抱合は、同じ濃度の化合物9の存在下では観察された(図4D)。これらの結果は、胆汁酸コア構造、具体的に言うとC12置換体は、プローブの、広範囲のインヒビターとしての作用能に影響を及ぼすという仮説を支持する。加えて、これらの結果は、α-フルオロメチルケトンウォーヘッドが、広く反応性が高いのではなく、むしろ活性部位内の好適な位置付けに要されることを示唆するが、これは質量分析および結晶学の研究を使用してさらに試験できる。
化合物7は、BSHの触媒システイン残基へ共有結合的に結合する
化合物7の効能を定めた上、その阻害の機序を調べた。化合物7が共有結合性インヒビターであって、触媒システイン残基Cys2を修飾することを確認するため、質量分析実験を実施した。B.theta BSHは、2つのシステイン残基、Cys2およびCys67を含有する。この酵素のアポ結晶構造の分析によって、両システイン残基は活性部位に向かうことが明らかにされたが、これはいずれかの残基が化合物7の潜在的な結合部位になり得ることを指し示している(PDB 3HBC)。B.theta BSHの化合物7との再インキュベーションによって、388質量単位分の無傷塊タンパク質のシフトがもたらされたことを発見した。この質量シフトは、単一当量のインヒビターのタンパク質への付加と一致する(図5A)。トリプシンまたはLys-Cでの消化が、標識されるペプチドを同定しなかった一方、トップダウンアプローチは、c3イオンによって指し示されるとおり、修飾された残基としてCys2を明らかにした(図5B)。
結合ポケット中のインヒビターの空間配置を理解して、さらなるインヒビターデザインを手引きするため、化合物7へ共有結合的に結合したB.theta BSHの共結晶構造を3.4A分解能にて決定した。質量分析データと一致して、共結晶構造によって、Cys2は胆汁酸構造のC25-メチレンへ結合していたこと、およびフッ素原子は取り除かれていたことが、明らかにされた。まとめると、これらのデータは、化合物7が、B.theta BSHを、タンパク質の活性部位中の求核システイン残基にて選択的に標識することを指し示す。さらにまた、共結晶構造から、C3-ヒドロキシル基が溶媒にさらされていたことが明らかにされたが、これはこの部位がさらなる修飾を受け入れる可能性があることを示唆する。
化合物7は最小限のオフターゲット効果を顕す
共有結合性インヒビターが高度に強力であることが示された一方、これら化合物の非特異的反応性が急性毒性をもたらし得るという懸念が生じる30。本明細書に記載のインヒビターを、これらの化合物のBSHへの選択性を増大させるために胆汁酸コアを含有するようデザインした。しかしながら、胆汁酸は、宿主の核ホルモン受容体(NhR)およびGタンパク質共役受容体(GPCR)のリガンドであることが知られている18。次いで、リードインヒビターは、宿主において、これらの受容体へ結合してオフターゲット効果を誘導し得ることが起こり得る。とりわけ、ある胆汁酸のFXRおよびGPBAR1/TGR5への結合は、コアとなる宿主の代謝および免疫プロセスに影響を及ぼす18。化合物7がFXRのリガンドとして作用し得るかどうかを決定するため、in vitroでのコアクチベーター動員アッセイを実施した(図6A)28。このアッセイは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)シグナルの増加によって測定されるとおり、化合物の、組換えFXRリガンド-結合ドメイン(LBD)のコアクチベーターペプチド(SRC2-2)への増強能を測定する。知られているFXRアゴニストGW4064が、SRC2-2のFXRへの結合における明確な用量依存的増加を示した一方(EC50=50nM)、SRC2-2のFXRへの結合は、化合物7の存在下では増加しなかったが、これはこのインヒビターがFXRを活性化しないことを示唆する。GW4064の、そのEC50濃度での存在下、化合物7は、用量依存的な曲線を顕さなかったが、これは化合物7が生理的に適切な濃度にてFXRアンタゴニスト活性を保有していないことを指し示している。次に、化合物7のTGR5活性化に対する効果をヒト腸細胞株(Caco-2)において評価した。化合物7は、試験された濃度範囲にわたってTGR5を作動させなかった。加えて、化合物7は、知られているTGR5アゴニストLCA(10μM)の存在下、TGR5に拮抗しなかった(図6B)。これらの結果から、インヒビター7は、宿主のこれら不可欠な受容体のいずれかへの結合を介してオフターゲット効果を誘導しないであろうことが示唆される。
宿主の受容体に対するそれらの効果に加えて、胆汁酸は、それらの洗剤特性に起因して、細胞へ毒性があることが知られている16,60。インヒビター7が作用するin vivoでの予想エリアが、より下の腸内にあることから、ヒト腸細胞(Caco-2)に対するこの化合物の毒性を試験した。これらの細胞を最大50μMまでの化合物7とインキュベートしたとき、結果として生じた毒性は何ら観察されなかった(図6C)。細菌BSHに対する化合物7のIC50値が227nMから913nMまでであったところ、これらの結果は、有効なin vivo用量を腸細胞へ毒性をもたらさないであろう濃度にて獲得することがあり得るはずであることを示唆する。まとめると、これらの結果は、インヒビター7が、宿主の潜在的な標的よりも細菌BSHに対して非毒性かつ選択的であることを示唆する。
化合物7は従来のマウス糞中のBSH活性を阻害する
実験結果がインヒビター7の効能を、腸内細菌の異なる6株の成長過程にある培養物に対して実証する一方、ヒト腸内には数百もの細菌種が存在する61。先の文献は、マウス糞において有意なBSH活性を報告した62。化合物7が広範囲のBSHインヒビターであるという知見をさらに強化するため、従来の(すなわち、完全に定着された)マウスからの再懸濁した糞中の化合物7の活性を試験した。化合物1、7、およびCAPE(20μM)を緩衝剤中糞懸濁液へ加えた。30分後に重水素化基質GCDCA-d4を加え、脱抱合を、UPLC-MSを使用して18時間後のCDCA-d4の形成を定量化することによって決定した(図7A)。際立つことに、化合物1とのインキュベーションが、減少した脱抱合をもたらした一方、化合物7とのインキュベーションは、糞中のBSH活性を完全に阻害したことが観察された(図7B)。in vitroでの結果と一致して、CAPEは、従来のマウス糞中のBSHの阻害を何ら提供しなかった。これらの結果はさらに、リードインヒビターの化合物7が腸内細菌BSH活性の強力な広範囲インヒビターであることを実証する。
単回用量の化合物7は従来のマウスにおいてBSH活性を阻害する
化合物7のin vitroでの効能を定めたが、このインヒビターの活性を従来のマウスにおいて評価した。C57Bl/6マウスを1用量の化合物7(10mg/kg)またはビヒクル対照のいずれかで強制飼養し、BSH活性を、強制飼養から2.5日後まで半日単位で(in half-daily increments)監視した(図7C)。具体的な理論によって縛られないが、化合物7がin vivoで活性があった場合、最初にBSH活性の減少が観察され、これに続きBSH活性が再生されることが企図された。この予想される効果が観察された。
強制飼養から1日後および1.5日後に、糞中BSH活性が有意に減少したことに気付いた一方、これに続く時点(強制飼養から2日後および2.5日後)にて、活性の再生が観察された(図7D)。最初の仮説(図1A)に基づき、かつ具体的な理論に縛られずに、BSH阻害の後に胆汁酸プールの変化が観察されるはずであることが企図された。強制飼養から1日後に、抱合された胆汁酸の有意な減少および脱抱合された胆汁酸の有意な増加が観察された。注目すべきことに、脱抱合された二次胆汁酸デオキシコール酸(DCA)の減少がこの時点にて観察された(図7E)。
細菌培養物の結果から、化合物7が細菌成長を有意に阻害しなかったことが指し示された。この結果と一致して、最初の強制飼養の後の細菌バイオマスの有意な減少は、いずれの時点でも観察されなかった(図7F)。まとめると、これらの結果は、化合物7がマウスGI管中in vivoでの腸内細菌のBSH活性を阻害する一方、腸内細菌群集の全体的な成長を有意には阻害しなかったことを示唆する。
BSHインヒビターの腸内への送達を制限する化合物7の誘導体、3-硫酸化-リトコール酸-フルオロメチルケトン(3S-LCA-FMK)を生成した(図8A)。従来のC57Bl/6マウス(オス)に、通常の固形飼料または固形飼料中3S-LCA-FMK(0.03％重量/重量)を7日間不断給餌した。糞を、飼料を変える前と、強制飼養から3日後、4日後および7日後とに収集した。群につきn=5マウス(図8B)。BSH活性が、固形飼料中3S-LCA-FMKを給餌されたマウスの糞において有意に低減されたこと、および3S-LCA-FMKは、第4日に循環血漿から検出不能であったことを発見した(図8C～8D)。まとめると、これらの結果から、3S-LCA-FMK化合物は腸内に制限されたこと、および動物モデルにおいて胆汁酸脱抱合の阻害を維持することが確認される。3S-LCA-FMKはまた、ビヒクルが投薬されたマウスと比較して、従来のマウスにおいて食糧摂取を低減することも示された(群につきn=8マウス)。3S-LCA-FMKが投薬されたマウスは、阻害されたBSH活性および食糧消費の有意な減少を顕した(図31)。
概要
本明細書に記載されるのは、かかる化学ツール、腸内細菌BSHの強力で選択的な広範囲インヒビターの開発である。精製BSHタンパク質による脱抱合、BSHを含有するグラム陰性ヒト腸内株とグラム陽性ヒト腸内株との両方の成長過程にある培養物、および再懸濁した従来のマウス糞を有効に阻害するリードインヒビター、化合物7を同定した。従来のマウスへ投与された単回用量の化合物7がBSH活性を低減し、予想どおりにin vivoでの胆汁酸プールをシフトさせることもまた示された。重要なことに、化合物7は、これら細菌の成長に有意に影響を及ぼさない。
これらの結果から、化合物7またはその誘導体は、完全に定着された動物において一次および二次胆汁酸の生物学的効果を研究するツールとして使用され得ることが示唆される。例えば、先の調査は、細菌のBSH活性が宿主の代謝に影響を及ぼすことを示唆した。しかしながら、in vivoでBSH活性を変化させることが如何にして宿主の代謝応答に影響を及ぼすかについては、報告が矛盾している。
ある研究によって、L.salivarius BSHを発現するよう改変されたE.coli株の導入を介して従来のマウスのBSH活性を増大させることが、体重増加の低減と、血清および肝臓の脂質レベルの低下とをもたらしたが見出された63。外来性菌株(異なる細菌供給源からのタンパク質を過剰発現する)の腸内への導入は、自然の生態系を有意に撹乱するものであるところ、BSHが如何にして本来の(native)系で機能するかについての解釈は複雑になる。別の研究によって、従来のマウスを抗酸化化合物TEMPOL(4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル)で処置すると、Lactobacillus BSH活性の減少および体重増加の低減がもたらされたことが見出された62。しかしながら、TEMPOLは、BSHインヒビターとして直接作用することは示されておらず、これはBSHに依存しない機序を介して代謝効果を発揮する可能性がある。
さらにまた、近年の研究において、グラム陰性の腸内片利共生株B.thetaからBSHコード遺伝子を欠失させたら、この細菌が定着したマウスにおいて、B.theta野生型株と比較して体重増加の減少、肝臓および血液の脂質レベルの低下、ならびに呼吸交換率の減少がもたらされたことが示された33。しかしながら、これらの実験は、単一菌が定着した(monocolonized)無菌マウスにおいて実施されたものであって、すべてのBSHの活性を限定することが如何にして従来の動物の代謝に影響を及ぼすかを明らかにしていない。具体的な理論によって縛られないよう、B.theta BSHノックアウト(KO)が定着したマウスにおいて体重増加という表現型の低減は、食糧摂取の低減に起因すると仮定を立てた。化合物7などの化学的インヒビターの、代謝ケージ中のマウスへの投与は、単一菌が定着したマウス中の個々のBSHと従来のマウス中のすべてのBSHとの両方を阻害する代謝効果の起源を決定し得る。
宿主の代謝に対する胆汁酸の効果の研究を容易にすることに加えて、選択的なBSHインヒビターはまた、一次および二次胆汁酸が如何にして宿主の(具体的に言うと、肝臓がんという文脈における)免疫応答に影響を及ぼすかについての調査も可能にさせ得る。近年の研究は、細菌の胆汁酸代謝(とりわけ、一次胆汁酸の二次胆汁酸への変換)と、肝臓の腫瘍抑制性環境の減少との間に因果関係があることを提案する64。胆汁酸の供給(feeding)、抗生物質での処置、およびマウスの胆汁酸代謝細菌の定着を通して、これらの研究者らは、二次胆汁酸が、一次胆汁酸によって促進された、有益なNKT細胞の集積および肝臓腫瘍の成長阻害を逆転するモデルについて裏付けを集めた。肝臓がんのマウスモデルにおけるBSHインヒビターの使用は、腸肝系および微生物群集を有意に撹乱せずに、内在性in vivo胆汁酸プールを一次胆汁酸へ向かってシフトさせることによって、この仮説をさらに試験し得る。胆汁酸プールのかかるシフトが肝臓腫瘍成長を限定する場合、細菌のBSHインヒビターは、新規がん治療剤として開発され得る。
最終的に、BSHインヒビターを開発しつつ、ニワトリ腸内単離物Lactobacillus salivariusからハイスループットスクリーニングを通してBSHのインヒビターとしてこれまでに同定されたリボフラビンおよびCAPEの2分子もまた、評価した59。化合物7とは対照的に、リボフラビンもCAPEも、腸内細菌のグラム陰性株のいずれに対しても、および腸内細菌のグラム陽性株3種のうち1種(これもまた属Lactobacillusからであった)のみに対しても、有意な阻害活性を顕さなかった。加えて、化合物7(20μM)は、再懸濁マウス糞中のBSH活性をほとんど完全に阻害した一方、CAPEはこのアッセイにおいて、20μMまたは100μMのいずれかの濃度でも脱抱合を著しくは低減しなかった。CAPEは、試験されたグラム陰性腸内細菌株の成長を有意に阻害した。マウスにおいてBSHを阻害するCAPEの使用、およびそれによる、よりFXRに拮抗する胆汁酸プールへ向かうシフトが如何にして宿主の代謝(とりわけ、肝の糖新生)に影響を及ぼすかの研究が報告されている65。これらの結果、とくに、CAPEが抗生物質の性質を保有するという知見に照らすと、CAPEを使用して得られた先のin vivo結果の結論は、再検討すべきであるか、または少なくとも注意して見るべきである66。化合物7などの選択的なBSHインヒビターの使用によって、細菌の胆汁酸代謝および宿主生理学に対する効果の評価が可能になる。
共有結合性インヒビターは、高(large)濃度のネイティブな基質の存在下でさえも、効能および選択性が高い程度で、それらのタンパク質標的を不活性化させ得る11。BSHの基質である、抱合された胆汁酸は、結腸中、高濃度で見出される(1～10mM)4。加えて、近年の研究は、細菌酵素の不可逆性インヒビターが腸内で有効であり得ることを実証する12。
腸内株にわたるBSHタンパク質配列には有意な多様性があるが、すべてのBSHは、触媒システイン(Cys2)を包含する、保存された活性部位を保有する(図9b)1,10。よって、この保存された残基を標的にした化合物は、有効な汎(pan-)BSHインヒビターであり得る。Clostridium perfringens BSHと基質タウロデオキシコール酸との共結晶構造によって、疎水性相互作用が胆汁酸コアを適所に留めつつ、かつアミドをCys2へ向けて正しい方向に置きつつ、そのアミノ酸が溶媒に晒されることが示された(図9c)13。さらにまた、C.perfringens BSHは、ばらつきが大きいアミノ酸側鎖(より長い鎖の抱合体を包含する)を忍容する14。
胆汁酸コアモチーフと、ペンダント求電子ウォーヘッドとの両方を含有する、潜在的インヒビターの小さなライブラリを開発した(図9d)。いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、先の文献は、抱合されたアミノ酸の同一性が、BSH特異性を大きく推進させ得る一方1、ステロールコア立体配置がまた、BSHの反応性にも影響を及ぼすことを指し示した15。加えて、いくつかのBacteroidetes種は、C12=Hの一次胆汁酸を切断するが、C12=OHの一次胆汁酸は切断しない(図9a)16。
求電子的に捕捉する基を数個選んだが17、これらはイソチオシアナート(1)18、シアノアクリラート(2)19、α,β-不飽和系(3および4)20、アクリルアミド(5)21、およびニトリル(6)22を包含する。α-フルオロメチルケトンウォーヘッド(FMK)(7)をもつインヒビターもまた、合成した。より求電子性のα-ヨード-、α-ブロモ-、およびα-クロロメチルケトンウォーヘッドとは対照的に、フッ素の弱い脱離基能は、FMKウォーヘッドの反応性を小さくさせ、ゆえにより選択的にさせる23,24。FMKをベースとしたインヒビターは、最小限のオフターゲット効果をもたらすことが示されている23,25。
例2．BSHの生化学的特徴付け
次いで、グラム陰性BSHとグラム陽性BSHとの両方に対するインヒビター1～9の活性を、インヒビター最適化に選択的なBacteroides BSHを使用して評価した。結果的に、選択的なBSH(BT_2086)を異種発現させておよび精製した(表2および図14)16。
表2．BSH遺伝子増幅のためのプライマー。
Figure 2022533069000063
速度論的パラメータを、ニンヒドリンベースのアッセイを使用して決定した26。精製されたB.theta BSHは、タウロ-ウルソデオキシコール酸(TUDCA)の脱抱合を優先することを顕したが、タウロ-コール酸(TCA)の脱抱合はしなかった(表3および図14)16。
表3:Bactereroides thetaiotaomicron (B.theta)およびBifidobacterium longum(B.longum)からのBSHの速度論的パラメータ。
Figure 2022533069000064
 aニンヒドリン試薬を使用して特徴付けを実施し、実験をPBS緩衝剤中pH7.5および37℃にて実施した。b基質として使用された、抱合された一次および二次胆汁酸は、タウロコール酸(TCA)、タウロウルソデオキシコール酸(TUDCA)、タウロデオキシコール酸(TDCA)、タウロケノデオキシコール酸(TCDCA)であった。cB.thetaは、TCAを脱抱合しなかった。n=3は条件につき生物学的に再現する。すべてのデータを平均値±SEMとして提示する。
グラム陽性株Bifidobacterium lonbum SBT2928 BSH27からのBSHもまたクローニングし、発現させて、速度論的パラメータを決定した(表3および図14)。認識される基質のすべてに係るKm値は、これら胆汁酸のおよその腸内濃度である低ミリモル範囲にある。kcat値は、Lactobacillus salivarius BSHについて報告されたkcatより低い一方で、これらの酵素に係るKm値は、これまでに特徴付けられたBSHに係る前記値と同様である27～29。
例3．リードインヒビターとしてのα-FMK化合物7は組換えBSHを阻害する
我々のライブラリ中の化合物の、B.theta BSHおよびB.longum BSHの阻害能もまた、評価した。ニワトリ腸内単離物Lactobacillus salivariusからのBSHの阻害についてのハイスループットスクリーニングにおいてこれまでに同定された化合物、リボフラビン(10)およびコーヒー酸フェネチルエステル(CAPE、11)もまた、試験した(図14)30。BSH阻害活性を、予めB.theta BSHを各インヒビター(100μM)とともに30分間インキュベートし、次いで抱合された胆汁酸(最終濃度100μM)の混合物を加えることによって、決定した。BSHは、種々の抱合胆汁酸への反応性が様々であることを顕すので、従来のマウスの胆嚢および小腸において優勢な、2種の一次抱合胆汁酸と2種の二次抱合胆汁酸との等モル濃度の組み合わせを、我々の基質混合物(タウロ-β-ムリコール酸(TβMC)、TCA、TUDCA、およびタウロ-デオキシコール酸(TDCA))として使用した31。胆汁酸の脱抱合を、21時間にわたり超高速液体クロマトグラフィー-質量分析(UPLC-MS)によって監視した。合成インヒビターのうち、イソチオシアナート(1)は穏やかな阻害を顕した。マイケルアクセプターウォーヘッドを含有する他の化合物(2～6)は、脱抱合を阻害しなかった。対照的に、α- FMKをベースとした7とのインキュベーションは、21時間の、B.theta BSH活性のほとんど完全な阻害をもたらした(＞98％、図10a、15、16、および表4)。
表4．4種のタウロ抱合胆汁酸のプールを用いた実験において決定された各胆汁酸の％脱抱合。
Figure 2022533069000065
表4．(つづき)
Figure 2022533069000066
7の阻害活性が脱離基としてのフッ素の存在に起因したことを検証するため、メチルケトン類似体(8)を合成した25。この類似体は、組換えタンパク質またはB.theta培養物のいずれに対してもBSH阻害を顕さなかったが、これはα-フルオロ基が活性に必要であったことを指し示している(図10a、図17、および表4)。リボフラビンは、いかなる阻害活性も顕さなかった一方、CAPEは、B.theta BSHの中程度の阻害のみを提供した。
B.longumからのBSHに対する化合物1、7、およびCAPEの活性もまた評価した。化合物7は、やはり最も活性のあるインヒビターであった一方、CAPEは、すべての時点にてB.longum BSHを阻害するのに無効であった(図10b、15～16、および表3)。化合物7は、用量依存的な様式で、B.theta BSHとB.longum BSHとの両方を阻害した(IC50値は夫々、427nMおよび108nM、図18)。まとめると、これらのデータは、化合物7が、グラム陰性菌株とグラム陽性菌株との両方からの精製BSHタンパク質の強力なインヒビターであることを指し示している。
化合物7は、2種の酵素のうち(表2)、より触媒効率の高いB.theta BSHを、インヒビターの酵素とのいずれのプレインキュベーションもせず、基質と等モル濃度にて15秒以内に完全に阻害した(図19)。大過剰(～80倍)の基質の存在下、7は、これらの条件下での産物形成にとって最も早い測定可能な時点である15分以内に、B.theta BSH活性を全面的に阻害した。これらの結果は、7が、速度論的に効率的なBSH活性のインヒビターであることを指し示している。
例4．化合物7は腸内細菌の培養物中のBSHを阻害する
成長過程にある細菌培養物中の7の効能もまた、評価した。BSH阻害の範囲を試験するため、BSH含有ヒト腸内細菌の3種のグラム陰性株および3種のグラム陽性株(グラム陰性、B.theta、Bacteroides fragilis ATCC 25285、およびBacteroides vulgatus ATCC 8482;グラム陽性、Lactobacillus plantarum WCFS1、Clostridium perfringens ATCC 13124、およびBifidobacterium adolescentis L2-32)を使用した1,16。
細菌培養物を対数期前に希釈し、インヒビター(100μM)と、抱合された胆汁酸(最終濃度100μM)の混合物との両方を、同時に加えた。脱抱合を、UPLC-MSを使用して21時間にわたり監視した。際立つことに、ビヒクル対照の存在下では6菌株すべてが胆汁酸を脱抱合した一方、7の存在下で成長した培養物のいずれにおいても、脱抱合はほとんど観察されなかった(図10c、20、および表3)。次いで、同質遺伝子系統(Isogenic)BSH欠失B.theta株16を、DMSO、7、またはCAPEのいずれかとともにインキュベートした。3つすべての条件下で、タウリンに抱合された胆汁酸は代謝されずに再生した(図21)。これらの結果は、7によるBSH阻害が、他の胆汁酸を利用するプロセスに対するこのインヒビターの効果には起因しないことを示唆する。化合物7は、大多数の試験された株の細胞生存率に有意に影響を及ぼさなかったが(図10d)、これは観察されたBSH阻害が静菌活性には起因しなかったことを指し示している。B.thetaおよびB.adolescentisに対するこのインヒビターのIC50値を決定したら、夫々1070nMおよび237nMであった(図22)。これらの結果は、7がBSHの強力な広範囲インヒビターであることを指し示す。
CAPEの存在下で成長した6菌株のうち5菌株においてBSH阻害は何ら観察されなかった(図10c)。その上、CAPEは、試験された3種すべてのグラム陰性菌株の細胞生存率を阻害した(図10d)。これらの結果は、グラム陰性細菌に対するCAPEの支配的な効果が、BSHの阻害活性ではなくむしろ成長の阻害であることを示唆する。
最終的に、C12=OH化合物が有効な広範囲インヒビターでないかどうかを評価するため、α-FMKウォーヘッドがC12=OH胆汁酸コア、コール酸へ付け加えられた化合物を合成した(化合物9、図9d)。化合物9は、7と比較して、B.theta培養物中BSH脱抱合の阻害能の有意な低減を顕した(図17)。よって、胆汁酸コア構造、具体的に言うとC12置換体は、我々のプローブのBSH選択的阻害能に影響を及ぼす。加えて、これらの結果は、α-FMKウォーヘッドが、広く反応性が高いのではなく、むしろ活性部位内の好適な位置付けに要されることを示唆する。
例5．化合物7はマウス糞中のBSH活性を阻害する
先の文献は、マウス糞中の有意なBSH活性を報告している32。7がBSHの汎インヒビターであるかどうかをさらに査定するため、従来のマウスからの再懸濁糞中のその活性を試験した。この糞スラリーは、遠位結腸の大体全ての細菌群集からのBSHを含有しているはずである。化合物1、7、およびCAPE(20μM)を緩衝剤中の糞懸濁液へ加えた。30分後に重水素化基質グリコケノデオキシコール酸-d4(GCDCA-d4)を加え、脱抱合された産物の形成を、UPLC-MSを使用して18時間後に定量化した。際立つことに、7とのインキュベーションは、糞中BSH活性を完全に阻害した(図10e)。CAPEは、糞中BSHの阻害活性を何ら提供しなかった。これらの結果は、7がBSH活性の強力な汎インヒビターであることを実証する。
例6．化合物7は触媒Cys2残基を共有結合的に修飾する。
7の阻害機序。
B.theta BSHは、2個のシステイン残基、Cys2およびCys67を含有しており、これもまた調べた。この酵素のアポ結晶構造の分析によって、両システイン残基は活性部位に向かうことが明らかにされた(PDB 3HBC)。7が、Cys2を修飾する共有結合性インヒビターであることを確認するため、精製されたB.theta BSHを、過剰なこの分子とともにインキュベートした。質量分析による分析から、質量シフトが単一分子の7の付加と一致することが明らかにされ、共有結合の形成が確認された(図23)。これに続くトップダウン質量分析によって、Cys2が修飾残基として同定された(図23)。
次いで、B.theta BSHの構造を決定したが、最初にそのアポ形態を(～2.7A分解能)、次いで7へ共有結合された形態を(～3.5A分解能)を決定した(表5)(夫々、PDB 6UFYおよび6UH4)。
表5．データ収集および精密化統計学(分子の置き換え)
Figure 2022533069000067
Figure 2022533069000068
*最高分解能シェル(Highest-resolution shell)を括弧内に示す。各データセットは単結晶を使用して収集した。
BSH-インヒビター複合体の構造は、不斉単位中4コピーのタンパク質を含有する。電子密度マップは、4サブユニットのうち2つにおいて最良の分解能を示し、電子密度は、Cys2へ共有結合的に付着されたこれらのサブユニットのうち1つにおいてインヒビターを明確に可視化する(図3aおよび図3b)。アポ構造との比較はまた、ループ(残基127～138)が、溶媒に晒されたチャネル中の活性部位においてインヒビターを抱えるよう再度位置付けられることも示唆する(図24)。
これらのデータは、7がB.theta BSHをCys2にて選択的に標識することを指し示している。さらにまた、共結晶構造からC3-ヒドロキシル基は溶媒を利用可能であることが明らかにされ、これはこの部位がさらなる修飾を受け入れる可能性があることを示唆する(図11b)。
例7．化合物7は最小限のオフターゲット効果を顕す
共有結合性インヒビターの非特異的な反応性が急性毒性をもたらし得るという懸念が生じる11。胆汁酸は、ファルネソイドX受容体(FXR)およびGタンパク質共役胆汁酸受容体1(TGR5)のリガンドである2。in vitroコアクチベーター動員アッセイによって、7は、生理的に適切な濃度でのFXRへのアゴニストでもアンタゴニストでもないことが示された(図25)31。次に、TGR5活性化に対する化合物7の効果をヒト腸細胞株(Caco-2)において評価した。化合物7は、試験された濃度範囲にわたって、TGR5を作動も拮抗もしなかった(図25)。これらの結果は、7が、宿主のこれら不可欠な受容体のいずれにもオフターゲット効果を誘導しないことを示唆する。
胆汁酸はまた、それらの洗剤特性に起因する毒性があることも知られている1,33。この化合物のヒト腸細胞(Caco-2およびNCI-H716)に対する毒性もまた試験した。これらの細胞を最大50μMまたは100μMまでの化合物7夫々とともにインキュベートしたとき、結果として生じた毒性は何ら観察されなかった(図25)。7のIC50値が237nMから1070nMまでに及ぶところ、これらの結果から、有効で非毒性なin vivo用量を達成することがあり得るはずであることが示唆される。上皮の完全性に対する化合物7の効果を試験するため、Caco-2細胞をトランスウェルインサート中で分化させて、細胞間接合が緊密な極性単層とした34。化合物7をトランスウェルの頂部チャンバー中でインキュベートし、上皮の完全性を4kDa FITC-デキストランの受動拡散によって測定した。7で処置された細胞において、対照で処置された細胞と比較された蛍光の有意な増加は何ら観察されなかったが、これは7が上皮単層の完全性を損なわなかったことを指し示す(図26)。
7のプロテオームワイドな(proteome-wide)反応性を理解することは重要である35。化合物7の標的へのはめ込み(target engagement)およびオフターゲット相互作用を査定するため、このインヒビターの「クリックできる」バージョンを、α-アジド部分36を溶媒に晒されるC3位置にて7へ付け加えることによって合成し7-N3(化合物12、図26a)を生成した。7と同じく、7-N3も、マウス糞中のBSH活性を強力に阻害した(図26b)。これらの結果は、アジド置換が、この分子のBSH阻害活性を有意に撹乱しなかったことを実証する。細菌性細胞においてオン-およびオフターゲット効果を研究するため、B.adolescentis L2-32の培養物を、10μM(7が細菌培養物中のBSHを阻害した濃度)の7-N3を用いて1時間試験した(図17)。次いで、溶解された(Lysed)細菌上清を、銅触媒アジド-アルキン環付加条件下でFluor 488-アルキンと反応させ、タンパク質をゲル中蛍光によって視覚化した。1つの蛍光バンドのみが、～35kDaの質量(注釈付きB.adolescentis BSHの予測された質量)にて可視化された(図12cおよび27)。このタンパク質を同定するため、浄化(clarified)ライセートをデスチオビオチン-アルキンでクリックし、ストレプトアビジンプルダウンを実施した。対照試料および処置された試料からの結合されたタンパク質をSDS-PAGEによって分解し、銀染色によって視覚化した(図12dおよび27)。単一の銀染色バンドが、BSHの予測された分子量(～35kDa)にて観察された。このバンドを対照レーンの対応する領域と併せて切り出し、両方ともトリプシンで消化してLC-MS/MSを実施した。BSHをゲルバンド中、強く確信して同定し、これらのデータの半定量分析から、ビヒクルで処置された細菌培養物に対し7-N3が4.5倍富化されていたことが指し示された。
細菌プロテオームにわたってオフターゲット結合を査定するため、処置および対照の細菌培養物から単離されたストレプトアビジンビーズ結合タンパク質を消化した。標識がないLC-MS/MS分析からBSHを同定したが、これはプローブで処置された培養物中3.6倍富化されていた。生物学的な三重実験にわたって、他のタンパク質に2倍富化閾値を超えたものはなかった。7の7-N3との競合によって、注釈付きB.adolescentis BSHの用量依存的な標識化が示され(図12eおよび27)、さらに7のオンターゲット活性を確認した。
哺乳動物腸細胞(NCI-H716)において、化合物7のオフターゲット効果をプロファイルした。これらの細胞もまた7-N3で処置し、細菌性細胞と同じやり方で処理した。Fluor 488-アルキンとのクリック反応から、ゲル中蛍光による、いずれのバンドの富化は何ら示されなかった(図12fおよび28)。プローブで処置されたライセート中、標識がないLC-MS/MS分析に基づき富化された(≧2倍)タンパク質はなかった。合わせて、我々のデータは、腸細胞中の他の細菌タンパク質または哺乳動物タンパク質に対して、7のオンターゲットBSH結合および限定的なオフターゲット活性を実証する。
例8．単回用量の7はBSH活性をin vivoで阻害する
C57BL/6マウスを単回用量の7(10mg/kg、用量算出のためのOnline Methodsを参照)またはビヒクル対照のいずれかで強制飼養し、糞中BSH活性を半日単位で経時的に監視した(図13a)。強制飼養から1日後および1.5日後に、糞中BSH活性の有意な減少が観察された一方、これに続く時点にてBSH活性が再生し(図13b)、ならびに強制飼養から1日後に、糞中の抱合された胆汁酸の有意な増加および脱抱合された胆汁酸の減少が観察された(図13c)。16S rDNA配列決定およびこれらマウスからの糞試料の播種によって、化合物7は、腸内細菌のOTU、バイオマス、または群集組成に有意に影響を及ぼさなかったことが指し示された(図13dおよび28)。まとめると、我々の結果は、1用量の7が、腸内細菌のBSH活性を阻害し得、かつ胆汁酸プールをin vivoでモジュレートし得る一方、腸内細菌の群集に有意に影響を及ぼさないことを指し示している。
例9．7の腸内制限の概念実証
7がオフターゲット効果を誘導するであろう可能性をさらに最小化するには、理想的にはこの分子をGI管に留める。3-硫酸化バリアント(腸内制限7またはGR-7、化合物13、図11b、13e)を合成した。
マウス糞中のGR-7の評価から、GR-7は強力な汎BSHインヒビターを保持することが明らかにされた(図29)。C57BL/6マウスに、1日あたり0.09％GR-7(w/w)を含有する粉末状固形飼料または粉末状固形飼料単独のいずれかを給餌した(図13f)。有意なBSHの阻害活性が、試料を変えて8時間後に、インヒビターで処置されたマウスの糞中で観察された(図13g)。8hにて収集された糞においてGR-7が検出されたが、これはインヒビターが、マウス結腸通過時間と一致する速度にて排出されていたことを実証する38。盲腸内容物において(～20μM)のこの化合物、20ピコモル/mg湿塊(wet mass)を検出した(平均値、図13h)。この濃度は、マウス糞アッセイにおけるBSH阻害には有効であり、7に係る100μMの毒性閾値より低かった(図24および29)。その上、GR-7(60μM)は、Caco-2細胞の上皮性関門の完全性に影響を及ぼさなかったが、これはこの化合物が相対的に非毒性であることを示唆する(図25)。GR-7もまた、微生物バイオマスに影響を及ぼさなかった(図29)。GR-7は、インヒビターで処置されたマウスの血清および肝臓において検出されなかった(図5h)。合わせて、これらの結果は、7が吸収を最小化するよう化学修飾され得、および固形飼料で給餌されたとき腸内制限7誘導体がBSH活性を阻害し得るという概念実証を提供する。
例10．化合物合成
一般:
すべての無水反応は、アルゴンまたは窒素の陽圧下で行った。無水塩化メチレン(DCM)およびテトラヒドロフラン(THF)は、Sigma Aldrichから購入した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、60Aシリカゲル(230～400メッシュ)を使用して実施した。CDCl3中で記録されたNMRスペクトルは、残留クロロホルムまたはTMSを内部標準として使用した。
Figure 2022533069000069
 スキーム2．化合物1および5の合成。
化合物1
ステップ1.
4.3mL無水THF中のケノデオキシコール酸(0.5g、1.27mmol)、アジ化ナトリウム(0.29g、4.44mmol)、テトラブチルアンモニウム臭化物(61.0mg、0.19mmol)、および亜鉛トリフルオロメタンスルホナート(18.0mg、0.05mmol)の溶液へ、40℃にてジ-tert-ブチルジカーボネート(0.3g、1.40mmol)を加え、混合物を終夜加熱した。混合物を室温(rt)まで冷却して10mLの10％亜硝酸ナトリウムでクエンチし、次いで10mL酢酸エチルで希釈した。有機相を分離し、水層を酢酸エチル(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥して濾過し、ロータリーエバポレーター(rotovap)上で濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(80％酢酸エチル/20％ヘキサン)によって精製することで、化合物15(0.11g、19％)が白色泡として提供された。
ステップ2.
4mL THF中Bocアミン15(0.97g、2.09mmol)へ、1mLの6M HClを加え、混合物を45分間還流した。次いで混合物をrtまで冷却し、ロータリーエバポレーター上で濃縮した。次いで水溶液を10mL酢酸エチルに再懸濁し、1M水酸化ナトリウムでpH10まで塩基性化した。有機相を分離し、水層を酢酸エチル(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮することで遊離アミン(0.51g、67％)が提供されたが、これをさらなる精製はせずにこれに続くステップに使用した。
ステップ3.
合成の最終ステップについて、文献に報告されているプロトコルに倣った(Tetrahedron Lett.,2008,49,3117-3119)。
手短に言えば、2mLエタノール中アミン(0.24g、0.66mmol)へ、二硫化炭素(0.40ml、6.6mmol)およびトリメチルアミン(0.1mL、0.66mmol)を加え、混合物をrtにて1h撹拌した。次いで溶液を0℃まで冷却し、ジ-tert-ブチルジカーボネート(0.14g、0.66mmol)およびDMAP(4.0mg、0.03mmol)を加え、その結果得られた混合物を0℃にて10分間撹拌した。次いで混合物をrtまで加温して10分間撹拌し、この後にこれをロータリーエバポレーター上で濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(75％酢酸エチル/25％ヘキサン)によって精製することで、化合物1(20.0mg、20％)が透明油として提供された。
化合物1．TLC(酢酸エチル:ヘキサン、85:15 v/v):Rf=0.5;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.83(s,1H),3.57-3.41(m,3H),2.18(q,J=12.4Hz,1H),1.99-1.79(m,7H),1.71-1.64(m,3H),1.57-1.11(m,14H),1.00-0.81(m,7H),0.67(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ71.97,68.50,68.42,55.85,50.44,42.80,42.75,41.44,39.88,39.60,39.38,36.13,35.30,35.03,34.69,33.49,32.82,30.66,28.25,23.67,22.75,20.56,18.20,11.73;HRMS(m/z):[M-2H2O+H]+をC24H39NO2Sについて算出すると370.2568;見出されたのは370.2543。
化合物5
ステップ1.
遊離アミンを、化合物1に係るステップ2の条件のとおりに合成した。
ステップ2.
酸(12.0mg、0.16mmol)を1.65mL無水DCMに溶解し(dissolved)、これに続きカップリング剤N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(42.0mg、0.20mmol)およびトリメチルアミン(76μL、0.55mmol)を加えた。混合物をrtにて30分間撹拌し、次いで1.4mL DCMに溶解された遊離アミン(50.0mg、0.14mmol)を上の混合物へ加えた。その結果得られた溶液をrtにて3h撹拌した。次いで混合物を、5mLの1M HClおよび5mL DCMを使用して分配した。有機相を分離し、水層をDCM(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(90％酢酸エチル/10％ヘキサン)によって精製することで、化合物5(20.0mg、33％)が透明油として提供された。
化合物5．TLC(酢酸エチル:ヘキサン、80:20 v/v):Rf=0.12;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.27(dd,J=16.8,1.2Hz,1H),6.07(dd,J=16.8,10.4Hz,1H),5.62(dd,J=10.4,1.2Hz,1H),5.45(br s,1H),3.85-3.84(m,1H),3.50-3.37(m,2H),3.31-3.22(m,1H),2.20(q,J=12.8Hz,1H),2.01-1.79(m,5H),1.73-1.10(m,19H),1.01-0.94(m,4H),0.90(s,3H),0.66(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ155.54,130.95,126.14,72.00,68.51,55.97,50.45,42.73,41.46,39.91,39.61,39.42,37.24,35.76,35.30,35.03,34.61,34.07,32.83,30.68,28.35,23.69,22.75,20.55,18.67,11.73;HRMS(m/z):[M-2H2O+H]+をC26H43NO3について算出すると382.3110;見出されたのは382.3082。
Figure 2022533069000070
 スキーム3．一般的なC-24アルデヒド中間体17の合成。
ステップ1.
100mLメタノールに0℃にて懸濁されたケノデオキシコール酸(20.0g、50.8mmol)へ、塩化チオニル(4.0mL、55.9mmol)を滴加した。反応物をrtまで加温させて3h撹拌した。反応物を100mL飽和重炭酸ナトリウムの添加によってクエンチした。次いで、その結果得られた混合物をロータリーエバポレーター上で濃縮した。残渣を水層と50mL酢酸エチルとの間で分配した。有機相を分離し、水層を酢酸エチル(2×50mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させて濾過し、ロータリーエバポレーター上で濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(60％酢酸エチル/40％ヘキサン)によって精製することで、メチルエステル(20.6g、quant.)が白色泡として提供された。
ステップ2.
メチルエステル(1.6g、3.93mmol)を8mLの無水DCMに溶解し、窒素下0℃まで冷却した。この溶液へ、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.4mL、11.79mmol)を加え、これに続き塩化メトキシメチル(1.2mL、11.79mmol)をゆっくり加えた。次いで反応混合物をrtまで加温させて3h撹拌した。反応物を10mL飽和重炭酸ナトリウムの添加でクエンチした。有機相を分離し、水層をDCM(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(25％酢酸エチル/75％ヘキサン)によって精製することで、純粋な産物16(1.26g、65％)が白色泡として提供された。
ステップ3.
保護されたメチルエステル16(1.73g、3.49mmol)を14mL無水ジエチルエーテルに溶解し、窒素下0℃まで冷却した。LiAlH4(0.27、6.99mmol)を上の溶液へ分けて(in portions)加えた。混合物を0℃にて2h撹拌させて、次いで14mLのロッシェル塩のゆっくりとした添加によってクエンチした。有機相を分離し、水層を酢酸エチル(2×15mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(30％酢酸エチル/70％ヘキサン)によって精製することで、純粋なC-24アルコール(0.80g、50％)が透明油として提供された。
ステップ4.
8mL DCM中のクロロクロム酸ピリジニウム(1.42g、6.57mmol)およびシリカゲル(1.42g)の懸濁液へ0℃にて、別の8mL DCMに溶解されたC-24アルコール(1.9g、4.06mmol)をゆっくり加えた。次いで、その結果得られた溶液をrtにて2h撹拌した。次いで反応混合物をセライトのベッドに通して濾過し、残渣を濃縮することで粗アルデヒドS4が提供された。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(20％酢酸エチル/80％ヘキサン)によって精製することで、純粋なアルデヒド17(1.39g、74％)が透明油として提供された。
Figure 2022533069000071
 スキーム4．化合物2～4および6の合成。
化合物2.
ステップ1.
合成のこのステップについて、文献に報告されているプロトコルに倣った(J.Med.Chem.,2005,48,3026-3035)。アルデヒド17(0.12g、0.28mmol)およびエチル2-シアノアクリラート(35.0mg、0.30mmol)へ0℃にて、酢酸(17μL、0.28mmol)およびピペリジン(28μL、0.28mmol)を加えた。次いで混合物をrtにて終夜撹拌した。次いで残渣を5mL DCMで希釈し、5mLの1M HClで洗浄した。有機相を分離し、水層をDCM(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(30％酢酸エチル/70％ヘキサン)によって精製することで、中間体(40.0mg、29％)が透明油として提供された。
ステップ2.
1mL DCM中の凝縮産物(50.0mg、0.09mmol)へ、0.2mLトリフルオロ酢酸を加え、反応混合物を0℃にて1h撹拌した。次いで混合物をrtまで冷却して5mL DCMで希釈し、5mL重炭酸ナトリウム飽和溶液でゆっくりクエンチした。有機相を分離し、水層をDCM(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(60％酢酸エチル/40％ヘキサン)によって精製することで、標的化合物2(10.0mg、24％)がジアステレオマーの混合物として提供されたが、これをさらなる精製はせずにスクリーニングに使用した。
化合物2．TLC(酢酸エチル:ヘキサン、70:30 v/v):Rf=0.43;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.64(t,J=8.0Hz,1H),4.31(q,J=7.2Hz,2H),3.85(s,1H),3.50-3.44(m,1H),2.63-2.43(m,2H),2.20(q,J=12.8Hz,1H),1.99-1.11(m,26H),1.02-0.98(m,4H),0.91(s,4H),0.66(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3):この化合物は、ジアステレオマーの混合物として単離されたことから、C13ピーク指定を実施しなかった。HRMS(m/z):[M+Na]+をC29H45NO4について算出すると494.3246;見出されたのは494.3233。
化合物3.
ステップ1.
火力乾燥(flame dried)フラスコ中、アルデヒド17(0.50g、1.07mmol)を窒素下で4.3mLジエチルエーテルに溶解した。次いで臭化ビニルマグネシウム(1.6mL、1.60mmol)を0℃にて、上の溶液へゆっくり加えた。混合物をrtにて終夜撹拌した。反応を5mL 1M HClの添加によってクエンチし、10mL酢酸エチルで希釈した。
有機相を分離し、水層を酢酸エチル(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(30％酢酸エチル/70％ヘキサン)によって精製することで、アルコールがジアステレオマーの混合物として提供された(0.40g、77％)。
ステップ2および3.
化合物3を、化合物4に係る上に記載のとおりのステップ2および3に倣って合成した。全収率は反応スキーム上で報告する。
化合物3．TLC(酢酸エチル:ヘキサン、60:40 v/v):Rf=0.34;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.35(dd,J=18.0,10.8Hz,1H),6.21(dd,J=17.6,1.2Hz,1H),5.89(dd,J=10.4,0.8Hz,1H),3.86-3.85(m,1H),3.50-3.43(m,1H),2.65-2.57(m,1H),2.54-2.46(m,1H),2.20(q,J=12.8Hz,1H),2.01-1.11(m,22H),1.02-0.91(m,9H),0.66(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ201.43,136.57,127.77,72.01,68.53,55.78,50.46,42.70,41.47,39.91,39.62,39.42,36.51,35.35,35.31,35.04,34.60,32.84,30.67,30.02,28.15,23.71,22.75,20.57,18.47,11.77;HRMS(m/z):[M-2H2O+H]+をC26H42O3について算出すると367.3001;見出されたのは367.2985。
化合物4.
ステップ1.
火力乾燥フラスコ中、アルデヒド17(0.20g、0.65mmol)を窒素下で1.5mLジエチルエーテルに溶解した。次いでエチニルマグネシウム臭化物(1.2mL、0.97mmol)を0℃にて、上の溶液へゆっくり加えた。混合物をrtにて終夜撹拌した。反応を2mL 1M HClの添加によってクエンチし、10mL酢酸エチルで希釈した。有機相を分離し、水層を酢酸エチル(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(30％酢酸エチル/70％ヘキサン)によって精製することで、アルコールがジアステレオマーの混合物として提供された(0.12g、57％)。
ステップ2.
2.5mL無水DCM中アルコール(0.12g、0.24mmol)へ0℃にて、デス・マーチン・ペルヨージナン(1.1mL、0.37mmol)をゆっくり加えた。次いで反応混合物を、反応がTLCによって完結するまでrtにて撹拌した。出発材料が消費されたら、反応を3mLチオ硫酸ナトリウム飽和溶液および3mL重炭酸ナトリウム飽和溶液の添加によってクエンチした。有機相を分離し、水層をDCM(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をによって精製することで、産物(60.0mg、50％)が透明油として提供された。
ステップ3.
1.0mL DCM中の保護された化合物(20.0mg、0.04mmol)へ、トリフルオロ酢酸(12μL、0.15mmol)を加え、反応混合物を0℃にて1h撹拌した。次いで混合物をrtまで冷却して5mL DCMで希釈し、5mL重炭酸ナトリウム飽和溶液でゆっくりクエンチした。有機相を分離し、水層をDCM(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(50％酢酸エチル/50％ヘキサン)によって精製することで、標的化合物4(5.5mg、34％)が透明油として提供された。
化合物4．TLC(酢酸エチル:ヘキサン、60:40 v/v):Rf=0.28;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.86-3.85(m,1H),3.50-3.43(m,1H),3.20(s,1H),2.66-2.48(m,2H),2.20(q,J=12.8Hz,1H),2.02-1.80(m,6H),1.73-1.11(m,18H),1.02-0.91(m,7H),0.66(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ187.87,78.23,72.00,68.52,55.71,50.46,42.72,42.44,41.46,39.91,39.60,39.42,35.30,35.14,35.03,35.02,34.63,32.83,30.67,29.73,28.11,23.69,22.75,20.56,18.33,11.76;HRMS(m/z):[M-2H2O+H]+をC26H40O3について算出すると365.2844;見出されたのは365.2827。
化合物6.
ステップ1.
4mL無水ピリジン中アルデヒド17(0.50g、1.07mmol)へ、ヒドロキシルアミン塩酸塩(0.37g、5.37mmol)を加え、反応混合物をrtにて4h撹拌した。次いで混合物を20mL DCMで希釈し、20mL 1M HClで洗浄した。有機相を分離し、水層をDCM(2×20mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ濾過し濃縮することで、粗オキシムが提供されたが、これをさらなる精製はせずにこれに続くステップにおいて使用した。
ステップ2.
4mLピリジン中オキシム(0.38g、0.79mmol)へ、メタン塩化スルホニル(92μL、1.19mmol)を0℃にて加えた。反応混合物をrtまで加温して18h撹拌し、この後に混合物を20mL DCMで希釈して20mL 1M HClで洗浄した。有機相を分離し、水層をDCM(2×20mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ濾過し、濃縮することで粗オキシムが提供されたが、これを、シリカゲルクロマトグラフィー(20％酢酸エチル/80％ヘキサン)を使用して精製することで、純粋なビス-MOMで保護されたニトリルが提供された(0.16g、2ステップにわたり44％収率)。
ステップ3.
1.5mLテトラヒドロフラン(THF)中の保護されたニトリル(70.0mg、0.15mmol)へ、50％HBr(100μL、0.61mmol)を加え、反応混合物を50℃にて1h加熱した。次いで混合物をrtまで冷却して5mL酢酸エチルで希釈し、次いで5mL重炭酸ナトリウム飽和溶液でゆっくりクエンチした。有機相を分離し、水層を酢酸エチル(2×20mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製することで、標的化合物6(40.0mg、71％)が白色固体として提供された。
化合物6．TLC(酢酸エチル:ヘキサン、60:40 v/v):Rf=0.2;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.843-3.836(m,1H),3.49-3.41(m,1H),2.40-2.15(m,3H),2.00-1.80(m,6H),1.72-1.63(m,3H),1.55-1.11(m,15H),1.01-0.90(m,7H),0.67(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ120.17,71.94,68.42,55.54,50.42,42.77,41.44,39.86,39.59,39.36,35.30,35.17,35.02,34.71,32.81,31.51,30.65,28.15,23.65,22.74,20.55,17.86,14.25,11.77;HRMS(m/z):[M-2H2O+H]+をC24H39NO2について算出すると338.2848;見出されたのは338.2828。マグネシウムベンジルフルオロマロナートカップリング試薬を、報告されたプロトコル:James T Palmer.Process for Forming a Fluoromethyl Ketone.5,210,272,May 11,1993に従って合成した。
ステップ1.
26mLメタノール中の保護されたメチルエステル 16(6.4g、12.95mmol)へ、28mL 1M NaOHを加え、その結果得られた溶液を60℃まで終夜加熱した。次いで混合物をロータリーエバポレーター上で濃縮し、1M HClおよびDCMの各々30mLに再懸濁した。有機相を分離し、水層をDCM(2×30mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ濾過し濃縮することで、酸18(5.7g、91％)が白色泡として提供されたが、これをさらなる精製はせずにこれに続く反応に使用した。
ステップ2.
6.5mLの無水THF中C-24酸18(1.60g、3.33mmol)へ、1'-カルボニルジイミダゾール(CDI)(0.7g、4.33mmol)を加え、rtにて1h撹拌した。マグネシウムベンジルフルオロマロナート(1.20g、2.68mmol)を6.5mL無水THFに懸濁し、上の溶液を滴加して、その結果得られた混合物をrtにて18h撹拌した。反応を10mLの1M HClの添加によってクエンチし、ロータリーエバポレーター上で濃縮した。次いで残渣を、10mL DCMおよび10mL水を使用して分配した。有機相を分離し、水層をDCM(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(20％酢酸エチル/80％ヘキサン)によって精製することで、純粋な化合物19(1.36g、66％)が白色泡として提供された。
ステップ3.
化合物19(1.0g、1.63mmol)および炭素上パラジウム (8.6mg、0.08mmol)を82mLメタノールに懸濁した。フラスコを真空にして、水素バルーンで置き換えた。反応混合物をrtにて3h撹拌した。次いで溶液をセライトベッドに通して濾過し、濾過物を濃縮することでビス-MOMで保護されたフルオロメチルケトン(0.74g、96％)が提供された。
ステップ4.
15.6mL THFに溶解されたビス-MOMフルオロメチルケトン化合物(0.74g、1.56mmol)へ、48％HBr(1.10mL、6.24mmol)を加え、その結果得られた溶液を50℃にて1h加熱した。混合物をrtまで冷却し、次いで20mL重炭酸ナトリウム飽和溶液の添加によってゆっくりクエンチした。次いで二相の溶液をロータリーエバポレーター上で濃縮し、その結果得られた残渣を、20mL DCMおよび20mL水を使用して分配した。有機相を分離し、水層をDCM(2×20mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(40％酢酸エチル/60％ヘキサン～60％酢酸エチル/40％ヘキサン)によって精製することで、純粋な化合物7(0.18g、29％)が白色泡として提供された。
化合物7．TLC(酢酸エチル:ヘキサン、70:30 v/v):Rf=0.36;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.79(d,J=48.0Hz,1H),3.85(s,1H),3.50-3.44(m,1H),2.60-2.44(m,2H),2.20(q.J=13.2Hz,1H),2.00-1.11(m,26H),1.02-0.88(m,6H),0.66(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ207.62(d,J=19.2Hz),84.91(d,J=184.2),71.98,68.49,55.70,50.45,42.69,41.47,39.88,39.61,39.41,35.31,35.24,35.11,35.03,34.63,32.83,30.66,28.67(d,J=1.7Hz),28.12,23.68,22.74,20.56,18.38,11.76;HRMS(m/z):[M-2H2O+H]+をC25H41FO3について算出すると373.2907;見出されたのは373.2888。
Figure 2022533069000072
 スキーム5．化合物9の合成。
化合物7に係る上に記載の手順のとおりに化合物9をコール酸(20)から合成した。化合物9の合成にかかる収率を上のスキーム中に挙げる。
化合物9．TLC(100％酢酸エチル):Rf=0.12;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.80(d,J=47.6Hz,1H),3.96(s,1H),3.85(s,1H),3.48-3.41(m,1H),2.63-2.43(m,2H),2.27-1.25(m,24H),1.17-1.07(m,1H),1.02-0.94(m,4H),0.89(s,3H),0.68(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ207.61(d,J=19.0Hz),84.92(d,J=184.2Hz),72.98,71.92,68.41,46.97,46.47,41.82,41.43,39.65,39.53,35.21,35.12,35.07,34.70,34.63,30.47,28.60(d,J=1.5Hz),28.29,27.43,26.52,23.18,22.48,17.44,12.50;HRMS(m/z):[M-2H2O+H]+をC25H41FO4について算出すると371.2750;見出されたのは371.2725。
Figure 2022533069000073
 スキーム6．化合物8の合成。
ステップ1.
火力乾燥フラスコ中、C-24酸18(0.36g、0.75mmol)を7.5mL無水THFに溶解し、-5℃まで冷却した。次いでメチルリチウム(1.35mL、2.24mmol)を滴加し、反応物を-5℃にて1h撹拌した。反応を8mL水でクエンチし、ロータリーエバポレーター上で濃縮した。次いで残渣を、酢酸エチルおよび水を使用して分配した。有機相を分離し、水層を酢酸エチル(2×10mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(30％酢酸エチル/70％ヘキサン)によって精製することで、純粋な化合物(0.15g、42％)が白色泡として提供された。
ステップ2.
化合物8を、化合物4に係る上に記載のとおりのステップ3に倣って合成した。全収率は反応スキーム上で報告する。
化合物8．TLC(酢酸エチル:ヘキサン、30:70 v/v):Rf=0.1;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.844-3.837(m,1H),3.49-3.41(m,1H),2.49-2.13(m,5H),2.00-1.59(m,9H),1.52-1.05(m,16H),1.01-0.90(m,7H),0.65(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ209.66,71.99,68.50,55.78,50.45,42.67,41.47,40.58,39.88,39.41,35.31,35.25,35.03,34.62,32.83,30.65,29.87,29.77,28.15,23.69,22.75,20.56,18.41,11.76(1つの炭素がCDCl3と重複している);HRMS(m/z):[M-2H2O+H]+をC25H42O3について算出すると355.3001;見出されたのは355.2980。
Figure 2022533069000074
 スキーム7．化合物7-N3(12)の合成。
ステップ1.
1mL無水DCM中の化合物7(20.0mg、0.05mmol)へ、トリフェニルホスフィン(16.0mg、0.06mmol)および四臭化炭素(21.0mg、0.06mmol)を加え、反応物をrtにて18h撹拌した。反応物をロータリーエバポレーター上で濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(20％酢酸エチル/80％ヘキサン)によって精製することで、純粋な臭化物(15.0mg、65％)が白色粉末として提供された。
ステップ2.
C-3ブロモ化合物(15.0mg、0.03mmol)を0.5mL DMFに溶解し、これに続きアジ化ナトリウム(4.1mg、0.06mmol)を加えた。反応混合物を100℃にて1h加熱した。混合物をロータリーエバポレーター上で濃縮し、重炭酸ナトリウムおよび酢酸エチルの飽和溶液(各5mL)を使用して分配した。有機相を分離し、水層を酢酸エチル(2×5mL)で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(20％酢酸エチル/80％ヘキサン)によって精製することで、純粋な化合物7-N3(6.0mg、44％)が白色粉末として提供された。全収率は反応スキーム上で報告する。
化合物7-N3(12)．TLC(酢酸エチル:ヘキサン、30:70 v/v):Rf=0.56;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.81(d,J=38.4Hz,2H),3.87(s,1H),3.20-3.13(m,1H),2.63-2.45(m,2H),2.37(q,J=10.4Hz,1H),2.06-1.62(m,9H),1.53-1.14(m,14H),1.04-0.90(m,7H),0.69-0.65(m,3H);13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ209.29(d,J=15.0Hz),87.90(d,J=178.8Hz),69.15,63.79,58.48,53.07,45.04,44.50,43.56,38.15,38.11,37.90,37.80,37.58,36.88,35.36,31.46,30.83,29.57,26.21,25.74,23.35,21.44,14.80(1つの炭素シグナルがDMSOと重複している可能性がある);HRMS(m/z):[M+Na]+をC25H40FN3O2について算出すると456.3002;見出されたのは456.2985。
Figure 2022533069000075
 スキーム8．腸内制限7の合成。
4mLピリジンに溶解された化合物7(60.0mg、0.15mmol)へ、SO3-ピリジン(70.1g、0.44mmol)を加え、その結果得られた溶液をrtにて18h撹拌した。反応混合物をロータリーエバポレーター上で濃縮した。その結果得られたスラリーを10:1 ジクロロメタン:メタノール(10mL)に再懸濁し、10mL重炭酸ナトリウムの飽和溶液で洗浄した。有機相を分離し、水層を10:1 ジクロロメタン:メタノール(10mL)で抽出した。合わせた有機層を上の抽出プロセスへ再度供した。得られた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して濃縮した。次いで粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー(80％ジクロロメタン/20％メタノール)によって精製することで、純粋なGR-7(69.0mg、96％)が白色粉末として提供された。
GR-7(化合物13)．TLC(ジクロロメタン:メタノール、80:20 v/v):Rf=0.39;1H NMR(400MHz,CD3OD):δ4.91(d,J=47.6Hz,2H),4.17-4.10(m,1H),3.78(d,J=1.2Hz,1H),2.79(br s,0.4H),2.59-2.37(m,3H),2.00-1.70(m,9H),1.56-0.93(m,20H),0.69(s,3H);13C NMR(100MHz,CD3OD):δ207.69(d,J=16.9Hz),84.50(d,J=181.0Hz),79.30,67.56,55.74,50.06,42.22,41.85,39.56,39.31,36.32,35.24,35.03,34.71,34.38,34.01,32.57,28.57,27.776,27.64,23.18,21.84,20.35,17.48,10.70;HRMS(m/z):[M-H]-をC25H40FO6Sについて算出すると487.2535;見出されたのは487.2532。

参考文献
Figure 2022533069000076
Figure 2022533069000077
Figure 2022533069000078
Figure 2022533069000079
Figure 2022533069000080
Figure 2022533069000081
Figure 2022533069000082
等価物および範囲
同定されたすべての特許および他の刊行物は、例えば、本開示に関係して使用されてもよいかかる刊行物に記載の方法論を記載および開示する目的上、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物はもっぱら、本出願の出願日に先立ちそれらに開示されたものを提供する。この点に関し、本発明者らには、先の開示によりまたはいずれか他の理由から、かかる開示を先取りする(antedate)権利が与えられないとの自白として解釈されるべきものは何もない。これらの文書の日付に関するすべての陳述またはその内容に関する表現は、本出願人にとって入手可能な情報に基づくものであって、これらの文書の日付または内容の正しさに関し、いずれの自白も構成しない。
単数形の用語「a」、「an」、および「the」は、文脈上明確にそう指し示されない限り、複数形の指示対象を包含する。同様に、語「または」は、文脈上明確にそう指し示されない限り、「および」を包含することを意図する。本明細書に提供される方法および材料と同様または等価な方法および材料は、本開示の実践または試験に使用され得るが、好適な方法および材料は下に記載される。略語「例として」はラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書中、非限定例を指し示すのに使用される。よって、略語「例として」は、用語「例えば」と同義である。
さらに、文脈によってそう要されない限り、単数形の用語は複数形を包含するものとし、複数形の用語は単数形を包含するものとする。
操作例以外、または別様に指し示された場合以外、本明細書に使用される成分の分量または反応条件を表現するすべての数は、すべての場合において用語「約」によって修飾されるものと理解されるべきである。用語「約」は、パーセンテージに関連して使用されたとき、±1％を意味し得る。
別様に説明されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
クレームにおいて、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、1または1より多いことを意味してもよいが、それと反する指示がないか、またはそれとは別に、文脈から明らかでない場合に限る。ある群の1以上のメンバー間に「または」を包含するクレームまたは記載は、その群のメンバーのうち、1つ、1つより多いか、または、すべてが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係があるか、を満たすと考えるが、それと反する指示がないか、またはそれとは別に、文脈から明らかでない場合に限る。本開示は、その群のうち、正確に1つのメンバーが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係がある態様を包含する。本開示は、その群のメンバーのうち、1つより多いかまたはすべてが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係がある態様を包含する。
しかも、本発明は、列挙されたクレームの1以上からの1以上の限定、要素、節、および記述用語(descriptive terms)が、別のクレーム中へ導入される、すべての変動、組み合わせ、および順列を網羅する。例えば、別のクレームに従属するいずれのクレームも、同じ基本クレームに従属するいずれか他のクレーム中に見出される1以上の限定を包含するように修飾され得る。要素が、例として、マーカッシュ群形式において列挙されたものとして提示されている場合、要素の各下位群もまた開示されており、いずれの要素(単数または複数)も群から除去され得る。一般に、本開示、または本開示の側面が、特定の要素および/または特長を含むとして見なされる場合、本開示のある態様または本開示のある側面は、かかる要素および/または特長からなるか、または実質的にそれからなると理解されるべきである。簡潔さを目的として、それらの態様は、本明細書中、inhaec verbaで具体的に表明されていない。用語「含むこと(comprising)」および「含有すること(containing)」が、オープンであることを意図し、追加の要素またはステップの包含を容認することにもまた留意する。範囲が与えられるとき、エンドポイントも包含される。しかも、別段の指示がないか、またはそれとは別に、文脈および当業者の理解から明らかでない場合に限り、範囲として表現された値は、いずれか具体的な値、または本開示の異なる態様において述べられた範囲内の部分範囲を、文脈が明確に別段の指図をしない限り範囲の下限の単位の10倍まで、想定し得る。
本出願は、種々の発行済み特許、公開特許出願、雑誌記事、および他の公刊物を参照し、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる。組み込まれる参照のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合、本明細書がコントロールする(control)ものとする。加えて、先行技術に属する本開示のいずれか特定の態様は、クレームのいずれかの1以上からはっきりと除外され得る。かかる態様は当業者に知られていると思われるので、それらは、除外が本明細書においてはっきりと表明されていない場合であっても、除外され得る。本発明のいずれか特定の態様は、先行技術の存在に関するか否かにかかわらず、いずれかのクレームから、いずれかの理由で除外され得る。
当業者は、本明細書に記載の具体的な態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜいルーチンな実験法を使用して確かめる能力があるであろう。本明細書に記載の本態様の範囲は、上の記載に限定されることを意図せず、むしろ添付のクレームに表明されているとおりである。当業者は、以下のクレームにおいて定義されるとおり、本発明の精神または範囲から逸脱せずに、この記載への種々の変化および修飾がなされてもよいことを解するであろう。

Claims (61)

  1. 式(I):
    Figure 2022533069000083
    式中:
    nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である;
    mは、1、2、3または4である;
    Xは、求電子基である;
    R1、R2、R3、R4、R6、R7、R11、R12、R15、R16およびR17は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、OR18、N(R18)2、SR18、ハロゲン、CN、-CHO、-CO2H、-CO2R18、-NO2、-ONO2、-SO2Cl、-SO3 -、-OSO3 -、-NR18SO3 -、-PO3 2-、-OPO3 2-、-OSO2R18、-SO2N(R18)2、-OSO2N(R18)2、-NR18SO2R18、-SO2N(R18)2、-NHNH2、-ONH2、または-NHC(O)NHNH2である;
    各R18は、独立して、H、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである;
    で表される化合物、あるいはその薬学的許容し得る塩。
  2. Xが、チオール反応性の求電子基である、請求項1に記載の化合物。
  3. Xが、-C(O)R19、-NCS、-NHC(O)R19、-CH=C(CN)CO2R20、または-CNであって、ここでR19は、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、およびR20は、アルキルである、請求項1または2に記載の化合物。
  4. Xが、-C(O)R19または-NCSであって、ここでR19は、ハロアルキルである、請求項1～3のいずれか一項に記載の化合物。
  5. Xが、-C(O)CH2Fまたは-NCSである、請求項1～4のいずれか一項に記載の化合物。
  6. R3が、OR18または-OSO3 -である;R7が、OR18である;およびR12が、HまたはOR18である、請求項1～5のいずれか一項に記載の化合物。
  7. R3およびR7が、OHであり、およびR12が、HまたはOHである、請求項1～6のいずれか一項に記載の化合物。
  8. R3が、-OSO3 -である;R7が、OHである;およびR12が、Hである、請求項1～6のいずれか一項に記載の化合物。
  9. R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16のすべてが、Hである、請求項1～8のいずれか一項に記載の化合物。
  10. mが、1である、請求項1～9のいずれか一項に記載の化合物。
  11. nが、2である、請求項1～10のいずれか一項に記載の化合物。
  12. 化合物が、式(XVI):
    Figure 2022533069000084
    式中R19は、ハロアルキルである、
    で表される、請求項1～11のいずれか一項に記載の化合物。
  13. 化合物が、式(XVII):
    Figure 2022533069000085
    式中:
    R19は、ハロアルキルである、
    で表される、請求項1～12のいずれか一項に記載の化合物。
  14. 化合物が、式(XVIII):
    Figure 2022533069000086
    式中R19は、ハロアルキルである、
    で表される、請求項1～13のいずれか一項に記載の化合物。
  15. mが、1である;nが、2である;Xが、-C(O)CH2F、-NCS、-C(O)CH=CH2、-C(O)C=CH、-NHC(O)CH=CH2、-CN、-CH=C(CN)CO2Et、または-C(O)CH3である;R1、R2、R4、R16、R11、R15およびR16が、Hである;R3およびR7が、OHである;ならびにR12が、HまたはOHである、請求項1に記載の化合物。
  16. Xが、-C(O)CH2Fまたは-NCSである、請求項15に記載の化合物。
  17. 式(I-a):
    Figure 2022533069000087
    式中Xは、求電子基である、
    で表される化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  18. Xが、-C(O)R19、-NCS、-NHC(O)R19、-CH=C(CN)CO2R20、または-CNであって、ここでR19が、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、およびR20が、アルキルである、請求項17に記載の化合物。
  19. Xが、-C(O)R19であって、ここでR19が、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、請求項17または18に記載の化合物。
  20. R19が、アルキルである、請求項18または19に記載の化合物。
  21. R19が、ハロアルキルである、請求項18～20のいずれか一項に記載の化合物。
  22. R19が、CH2Fである、請求項18～20のいずれか一項に記載の化合物。
  23. 式:
    Figure 2022533069000088
    Figure 2022533069000089
    で表される、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  24. 式:
    Figure 2022533069000090
    で表される、先行する請求項のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  25. 化合物が、式(I-e'):
    Figure 2022533069000091
    式中:
    R3aおよびR7aは、独立して、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである、
    で表される、請求項1～3のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  26. 式(I-e''):
    Figure 2022533069000092
    で表される、請求項25に記載の化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  27. 式:
    Figure 2022533069000093
    で表される、請求項26もしくは27に記載の化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  28. 化合物が、式(I-f'):
    Figure 2022533069000094
    式中:
    R3aは、-OR18、-SO3R18、-OSO3R18、-PO3H2、-OPO3H2、-OSO2R18、および-SO2N(R18)2からなる群から選択されるが、ここで各R18は、独立して、H、または置換もしくは非置換のアルキルである、
    で表される、請求項1～3のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  29. 式(I-f''):
    Figure 2022533069000095
    で表される、請求項28に記載の化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  30. 式(I-f'''):
    Figure 2022533069000096
    で表される、請求項28に記載の化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  31. Xが、-C(O)R19、-NCS、-NHC(O)R19、-CH=C(CN)CO2R20、または-CNであって、ここでR19が、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、およびR20が、アルキルである、請求項25、26または28～30のいずれか一項に記載の化合物。
  32. Xが、-C(O)R19であって、ここでR19が、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、またはアルキニルである、請求項25、26または28～31のいずれか一項に記載の化合物。
  33. Xが、
    Figure 2022533069000097
    からなる群から選択される求電子基である、請求項1、6～15、17、25または27～31のいずれか一項に記載の化合物。
  34. 化合物が、式:
    Figure 2022533069000098
    で表される、請求項28～33のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的許容し得る塩。
  35. 請求項1～34のいずれか一項に記載の化合物、および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
  36. 担体または賦形剤が、化合物の胃腸管への送達を制限する、請求項35に記載の医薬組成物。
  37. 胆汁塩ヒドロラーゼ(BSH)を阻害するための方法であって、方法が、BSHを、請求項1～34のいずれか一項に記載の化合物または請求項35もしくは36に記載の医薬組成物と接触させることを含む、前記方法。
  38. 該接触させることが、in vitroまたはin vivoである、請求項37に記載の方法。
  39. 該接触させることが、対象である、請求項36～38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 対象における胆汁酸脱抱合を阻害する方法であって、方法が、以下:治療的に有効な量の、請求項1～34のいずれか一項に記載の化合物または請求項35もしくは36に記載の医薬組成物を対象へ投与することを含む、前記方法。
  41. 対象における胆汁酸抱合を促進する方法であって、方法が、以下:治療的に有効な量の、請求項1～34のいずれか一項に記載の化合物または請求項35もしくは36に記載の医薬組成物を対象へ投与することを含む、前記方法。
  42. 対象が、がん、胃腸疾患、肥満、または炎症性疾患への処置を必要とする、請求項37～41のいずれか一項に記載の方法。
  43. 対象において胆汁酸をモジュレートする方法であって、方法が、以下:治療的に有効な量の、請求項1～34のいずれか一項に記載の化合物または請求項35もしくは36に記載の医薬組成物を、これを必要とする対象へ投与することを含む、前記方法。
  44. 対象が、哺乳動物である、請求項37～43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 対象が、ヒトである、請求項37～44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 対象が、がんを有するリスクがあるか、またはがんを有する、請求項37～45のいずれか一項に記載の方法。
  47. 対象が、胃腸疾患を有するリスクがあるか、または胃腸疾患を有する、請求項37～46のいずれか一項に記載の方法。
  48. 対象が、肥満を有するリスクがあるか、または肥満を有する、請求項37～47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 対象が、炎症性疾患を有するリスクがあるか、または炎症性疾患を有する、請求項35～45のいずれか一項に記載の方法。
  50. がんが、以下:消化器系のがん;肝癌;肝臓がん;結腸がん;食道がん;胃部のがん;肝がん;腎臓がんまたは腎がん;口腔がん;膵臓がん;前立腺がん;直腸がん;胃がん;基底細胞癌;胆道がん;肺がん;膀胱がん;子宮頸がん;子宮内膜がん;子宮がん;および泌尿器系のがんからなる群から選択される、請求項44に記載の方法。
  51. がんが、肝臓がんである、請求項44または48に記載の方法。
  52. 胃腸疾患が、以下:感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患;胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがんからなる群から選択される、請求項47に記載の方法。
  53. 炎症性疾患が、以下:感染症;クローン病;炎症性腸疾患;潰瘍性大腸炎;膵炎;肝炎;肝疾患;胆道閉鎖;虫垂炎;胃炎;憩室炎;セリアック病;食物不耐性;腸炎;潰瘍;胃食道逆流症(GERD);乾癬性関節炎;乾癬;およびリウマチ性関節炎からなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
  54. 感染症が、以下:Staphylococcus;Helicobacter pylori;Escherichia coli;Salmonella;Campylobacter;Yersinia enterocolitica;Shingella;Clostridium;Bacteroides;Lactobacillus;Parabacteroides;Bifidobacterium;Listeria;およびStreptococcusからなる群から選択される細菌によって引き起こされる、請求項52に記載の方法。
  55. 肝疾患が、以下:非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症からなる群から選択される、請求項52または53に記載の方法。
  56. 請求項1～34のいずれか一項に記載の化合物、もしくはその薬学的許容し得る塩、または請求項35もしくは36に記載の医薬組成物;および
    前記の化合物、もしくその薬学的許容し得る塩、または医薬組成物を使用するための指示
    を含む、キット。
  57. 指示が、肝臓がんの処置を、これを必要とする対象においてするためのものである、請求項56に記載のキット。
  58. 指示が、感染症;炎症性腸疾患(IBD);虫垂炎;クローン病(CD);潰瘍性大腸炎(UC);胃炎;腸炎;食道炎;膵炎;糖尿病;肝炎;肝疾患;胃食道逆流症(GERD);セリアック病;憩室炎;食物不耐性;潰瘍;感染性大腸炎;過敏性腸症候群;腸管壁侵漏;およびがんから選択される胃腸疾患を処置するためのものである、請求項56に記載のキット。
  59. 指示が、以下:感染症;クローン病;炎症性腸疾患;潰瘍性大腸炎;膵炎;肝炎;肝疾患;胆道閉鎖;虫垂炎;胃炎;憩室炎;セリアック病;食物不耐性;腸炎;潰瘍;胃食道逆流症(GERD);乾癬性関節炎;乾癬;およびリウマチ性関節炎からなる群から選択される炎症性疾患を処置するためのものである、請求項56に記載のキット。
  60. 指示が、以下:非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD);非アルコール性脂肪性肝炎(NASH);A型肝炎;B型肝炎;C型肝炎;自己免疫性肝炎;および肝臓の硬変症からなる群から選択される肝疾患を処置するためのものである、請求項56に記載のキット。
  61. 指示が、BSH活性の阻害を、これを必要とする対象においてする方法のためのであって、方法が、治療的に有効な量の、請求項1～32のいずれか一項に記載の化合物もしくはその薬学的許容し得る塩または請求項33～34のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象へ投与することを含む、請求項56に記載のキット。
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