JP2022528368A - 抗ｅｇｆｒｖｉｉｉ抗体及びその抗原結合断片 - Google Patents

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Abstract

上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）等の抗原結合剤が提供される。ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗体又はその抗原結合断片、ＣＡＲ及びＢｉＴＥは、癌の治療のために使用され得る。ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞を標的とする抗体薬物コンジュゲートが特に企図されている。【選択図】 図６－２

Description

本開示は、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）等の抗原結合剤を提供する。本開示のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗体又はその抗原結合断片、ＣＡＲ、又はＢｉＴＥは、例えば、癌の治療のために使用され得る。ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞を標的とする抗体薬物コンジュゲートが特に企図されている。
上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）の２５～６４％において増幅され、高度に発現され存在する。留意すべきことに、異なる検出方法が一貫性のない結果をもたらしたものの、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現は、乳房の癌腫のサブセット並びに頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ）において、複数の相補的技術を使用して検出されている（Ｇａｎら、２０１３に概説）。上皮、間葉及びニューロン由来の組織において発現され、増殖、分化及び発達等の正常な細胞プロセスにおいて主要な役割を果たす野生型（ｗｔ）の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とは異なって、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、正常な組織において発現しない。
ＥＧＦＲｖＩＩＩバリアントは、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２～７のインフレーム欠失に由来し、細胞外ドメインの２６７個のアミノ酸残基をコードする配列の除去をもたらす。新たに形成されたスプライスジャンクションは、野生型ヒトＥＧＦＲにおいて対応する残基を有しないグリシン残基をコードし、したがって、ネオエピトープを形成する。さらに、多数の研究が、正常な組織がＥＧＦＲｖＩＩＩを有しないことを示している。したがって、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、抗体標的療法のために利用し得る新たな腫瘍特異的細胞表面エピトープを含む。しかしながら、ＥＧＦＲｖＩＩＩネオエピトープは、ヒト配列の残りの部分と比較して、あまり免疫原性がなく、これまでに生成された抗体の多くは、ＥＧＦＲｖＩＩＩを特異的に認識すると示されてはいない（Ｇａｎら、２０１３に概説）。
稀な例で、ＥＧＦＲｖＩＩＩネオエピトープに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が記載されてきた。その中には、抗体１３．１．２（米国特許第７，７３６，６４４号を参照）が含まれ、この抗体は、Ａｍｇｅｎによって、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）としても開発されている（ＡＭＧ５９５：Ｈａｍｂｌｅｔｔ Ｋ．Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１４巻（７）、第１６１４～２４頁、２０１５）。また米国特許第９，５６２，１０２号は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、並びにＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞上の増幅ＥＧＦＲのサブセットに結合する、Ａｂｂｖｉｅによって開発された８０６抗体（ＡＢＴ－８０６、ＡＢＴ－４１４）を記載している（Ｃｌｅａｒｙ，ＪＭら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ、３３（３）、第６７１～８頁、２０１５；Ｒｅｉｌｌｙ、ＥＢ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１４巻（５）、第１１４１～５１頁、２０１５）。この抗体は、前臨床モデルにおいて腫瘍ＥＧＦＲに優先的に結合することが示されているが、ヒト皮膚に存在するｗｔ ＥＧＦＲにこの抗体が結合することが、一部の患者においてＡＢＴ－８０６が示す皮膚毒性の主要因であることが示されている（Ｃｌｅａｒｙら、２０１５）。
ＥＧＦＲ発現細胞において存在しないか又はＥＧＦＲ発現細胞においてアクセス可能でないＥＧＦＲｖＩＩＩのエピトープを特異的に標的とする抗体又はその抗原結合断片は、癌患者の治療に有益であろう。
上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）等の抗原結合剤が提供される。
以下により詳細に記載されるように、いくつかの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片は、癌細胞（例えば、膠芽腫細胞）の表面でＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し得る。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、癌細胞上に発現されるＥＧＦＲに有意に結合しない（例えば、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲ ＷＴ）。
本開示の抗体又はその抗原結合断片は、癌細胞によって内在化されてもよく、したがって、その一態様において、カーゴ分子の送達のために使用されてもよい。治療部分とコンジュゲートされている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片が特に企図されている。本明細書に記載される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用され得る。
本開示のいくつかの実施形態において、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片は、天然ＥＧＦＲｖＩＩＩ（例えば、天然組換えＥＧＦＲｖＩＩＩ）及び変性ＥＧＦＲｖＩＩＩ（例えば、変性組換えＥＧＦＲｖＩＩＩ）の両方に存在するエピトープに結合可能であり得る。
一般的に、本開示の抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号１１９）のアミノ酸残基１～７６からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むペプチドに結合可能であり得る。抗体又はその抗原結合断片のサブセットは、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～１８（配列番号１２５）に結合可能であり、抗体の別のサブセットは、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～３７（配列番号６）に結合可能である。
より詳細に、本開示は、図４Ａ及び／又は図４Ｂに示されるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片のうちの１つ又は複数に結合可能であり得る抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本開示に包含される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片の実施形態には、例えば、
ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～１８（配列番号１２５）からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むペプチドに結合可能な抗体；
ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基３～１８（配列番号１２９）からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むペプチドに結合可能な抗体；
ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～３７（配列番号６）からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むペプチドに結合可能な抗体、又は
ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１９－３７（配列番号１４２）からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むペプチドに結合可能な抗体
が含まれる。
本開示に包含されるいくつかの特定の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片には、結合のためにＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１－２の存在を必要としない抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片が含まれる。特に企図されるのは、断片１９－７６（配列番号１３８）、断片１９－６２（配列番号１３９）、断片１９－４９（配列番号１４０）、断片１９－４５（配列番号１４１）、断片２８－４５（配列番号１４３）、断片２８－３７（配列番号１４４）、断片１９－３７（配列番号１４２）、断片３－４５（配列番号１２７）、断片３－４９（配列番号１２６）、断片３－３７（配列番号１２８）、断片６－４９（配列番号１３０）、断片６－４５（配列番号１３１）、断片６－３７（配列番号１３２）、断片１０－４９（配列番号１３３）、断片１０－４５（配列番号１３４）、断片１０－３７（配列番号１３５）、断片１５－４９（配列番号１３６）、断片１５－４５（配列番号１３７）、又は断片１５－３７（配列番号６）のうちの１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩ断片に結合することができる抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片である。
本明細書で提供される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又は抗原結合断片は、例えば、Ｆ２６０－５Ｇ６（本明細書において５Ｇ６とも称する）、Ｆ２６３－１Ａ８（本明細書において１Ａ８とも称する）、Ｆ２６３－４Ｂ３（本明細書において４Ｂ３とも称する）、Ｆ２６３－４Ｅ１１（本明細書において４Ｅ１１とも称する）、Ｆ２６３－５Ｄ８（本明細書において５Ｄ８とも称する）、及びＦ２６５－９Ｃ９（本明細書において９Ｃ９とも称する）抗体等の、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基３～３７（配列番号１２８）からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むペプチドに結合可能な抗体又は抗原結合断片を含む。
本明細書で提供される他の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又は抗原結合断片には、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～３３（配列番号１２４）からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むペプチドに結合可能な抗体又は抗原結合断片が含まれる。
本開示の例示的な抗体又はその抗原結合断片としては、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号５）に特異的に結合し、かつ、
ａ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～３７（配列番号６）からなる断片；
ｂ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～７６（配列番号１１９）からなる断片；
ｃ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～６２（配列番号１２０）からなる断片；
ｄ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～４９（配列番号１２１）からなる断片；
ｅ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～４５（配列番号１２２）からなる断片；
ｆ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～３７（配列番号１２３）からなる断片；
ｇ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基３～４９（配列番号１２６）からなる断片；
ｈ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基３～４５（配列番号１２７）からなる断片；
ｉ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基３～３７（配列番号１２８）からなる断片；
ｊ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基６～４９（配列番号１３０）からなる断片；
ｋ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基６～４５（配列番号１３１）からなる断片；
ｌ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基６～３７（配列番号１３２）からなる断片；
ｍ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１０～４９（配列番号１３３）からなる断片；
ｎ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１０～４５（配列番号１３４）からなる断片；
ｏ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１０～３７（配列番号１３５）からなる断片；
ｐ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～４９（配列番号１３６）からなる断片；
ｑ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～４５（配列番号１３７）からなる断片；
ｒ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１９～７６（配列番号１３８）からなる断片；
ｓ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１９～６２（配列番号１３９）からなる断片；
ｔ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１９～４９（配列番号１４０）からなる断片；
ｕ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１９～４５（配列番号１４１）からなる断片；
ｖ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１９～３７（配列番号１４２）からなる断片、及び
ｗ．上記断片の任意の組合せ
からなる群から選択されるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片に結合可能な抗体又はその抗原結合断片であって、
配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドに結合することができない抗体又はその抗原結合断片が挙げられる。
本開示の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５及びこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドに結合可能であり得る。
また、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１６０に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドに結合可能であり得る。
本開示の他の例示的な実施形態としては、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号５）に特異的に結合し、かつ：
ａ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～３７（配列番号６）からなる断片；
ｂ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～７６（配列番号１１９）からなる断片；
ｃ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～４９（配列番号１２１）からなる断片；
ｄ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～３７（配列番号１２３）からなる断片；
ｅ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基３～３７（配列番号１２８）からなる断片；及び
ｆ．上記断片の任意の組合せ、
からなる群から選択されるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片に結合可能である抗体又はその抗原結合断片であって、
配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドに結合することができない抗体又はその抗原結合断片が挙げられる。
本開示の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５及びこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドに結合可能であり得る。また、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドに結合可能であり得る。また、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５９に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドに結合可能であり得る。
本開示のさらなる他の例示的な実施形態としては、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号５）に特異的に結合し、かつ
ａ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～３７（配列番号６）からなる断片；
ｂ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～７６（配列番号１１９）からなる断片；
ｃ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～６２（配列番号１２０）からなる断片；
ｄ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～４９（配列番号１２１）からなる断片；
ｅ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～４５（配列番号１２２）からなる断片；
ｆ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１～３７（配列番号１２３）からなる断片；
ｇ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基３～４９（配列番号１２６）からなる断片；
ｈ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基３～４５（配列番号１２７）からなる断片；
ｉ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基３～３７（配列番号１２８）からなる断片；
ｊ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基６～４９（配列番号１３０）からなる断片；
ｋ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基６～４５（配列番号１３１）からなる断片；
ｌ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基６～３７（配列番号１３２）からなる断片；
ｍ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１０～４９（配列番号１３３）からなる断片；
ｎ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１０～４５（配列番号１３４）からなる断片；
ｏ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１０～３７（配列番号１３５）からなる断片；
ｐ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～４９（配列番号１３６）からなる断片；
ｑ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～４５（配列番号１３７）からなる断片；及び
ｒ．上記断片の任意の組合せ
からなる群から選択されるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片に結合可能である抗体又はその抗原結合断片が挙げられる。
また、抗体又はその抗原結合断片は：
ａ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１９～４９（配列番号１４０）からなる断片；
ｂ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１９～３７（配列番号１４２）からなる断片；
ｃ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基２８～４５（配列番号１４３）からなる断片；
ｄ．ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基２８～３７（配列番号１４４）からなる断片；又は
上記断片の任意の組合せ
に結合し得る。
抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６５及びこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドにも結合可能であり得る。また、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４９に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドに結合可能であり得る。
前記ペプチド内のアミノ酸残基Ｃｙｓ２０を含むか又はそれに関与するエピトープに結合可能な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片も提供される。これらには、例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及び／又は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むペプチドに結合するが、アミノ酸配列ＳＣＶＲＡＡＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣＫＫ（配列番号１４９）を含むか又はそれからなるペプチドに結合できない抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又は抗原結合断片が含まれる。かかる抗体又は抗原結合断片は、例えば、４Ｂ３抗体、５Ｄ８抗体及び４Ｅ１１抗体を包含する。
また詳細に、前記ペプチド内のアミノ酸残基Ｃｙｓ３５を含むか又はそれに関与するエピトープに結合可能な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片も、本開示に包含される。これらには、例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及び／又は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むペプチドに結合するが、アミノ酸配列ＳＣＶＲＡＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＡＫＫ（配列番号１６３）を含むか又はそれからなるペプチドに結合できない抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又は抗原結合断片が含まれる。かかる抗体又は抗原結合断片は、例えば、４Ｂ３抗体、５Ｄ８抗体、９Ｃ９抗体及び４Ｅ１１抗体を包含する。
前記ペプチド内のアミノ酸残基Ｃｙｓ２０及びＣｙｓ３５を含むか又はそれらに関与するペプチド内のエピトープに結合可能な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片が、本開示にさらに包含される。これらには、例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及び／又は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むか又はそれからなるペプチドに結合するが、ＳＣＶＲＡＡＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣＫＫ（配列番号１４９）又はＳＣＶＲＡＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＡＫＫ（配列番号１６３）から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドに結合できない抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又は抗原結合断片が含まれる。かかる抗体又は抗原結合断片は、例えば、４Ｂ３抗体、５Ｄ８抗体及び４Ｅ１１抗体を包含する。
アミノ酸残基Ｃｙｓ２０及び／又はＣｙｓ３５に加えて、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片が結合するか又はその結合に関与するエピトープは、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ３０、Ｇｌｙ３１及び／又はＡｒｇ３３をさらに含み得る。エピトープは、Ａｓｐ２３及び／又はＶａｌ３２をさらに含んでもよい。
例えば、本開示に包含される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片は：
Ｃｙｓ２０、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ３０、Ｇｌｙ３１、Ａｒｇ３３及びＣｙｓ３５、又は
Ｃｙｓ２０、Ａｓｐ２３、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ３０、Ｇｌｙ３１、Ｖａｌ３２、Ａｒｇ３３及びＣｙｓ３５
を含むか又はそれに関与するエピトープに結合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む。
アミノ酸残基Ｃｙｓ２０及び／又はＣｙｓ３５に加えて、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片が結合するか又はその結合に関与するエピトープは、Ａｒｇ１８及び／又はＧｌｙ２１をさらに含んでもよい。エピトープは、Ｇｌｕ２６及び／又はＧｌｙ３１をさらに含んでもよい。
例えば、本開示に包含される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片は、
Ａｒｇ１８、Ｃｙｓ２０、Ｇｌｙ２１、及びＣｙｓ３５、又は、
Ａｒｇ１８、Ｃｙｓ２０、Ｇｌｙ２１、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｙ３１及びＣｙｓ３５
を含むか又はそれに関与するエピトープに結合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む。
本開示に包含されるさらなる抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片は、
Ｃｙｓ１６、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｙ３１、Ｖａｌ３２、Ａｒｇ３３、Ｌｙｓ３４、Ｃｙｓ３５及びＬｙｓ３６、又は、
Ｃｙｓ１６、Ｃｙｓ２０、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ３０、Ｇｌｙ３１、Ｖａｌ３２、Ａｒｇ３３、Ｌｙｓ３４、Ｃｙｓ３５及びＬｙｓ３６
を含むか又はそれに関与するエピトープに結合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む。
本開示の実施形態は、特に、４Ｅ１１抗体又はその抗原結合断片と競合可能であるか、又は４Ｅ１１抗体のＣＤＲを含む抗体又はその抗原結合断片と競合可能である抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む。
本開示の他の実施形態は、５Ｇ６抗体又はその抗原結合断片と競合可能であるか、又は５Ｇ６抗体のＣＤＲを含む抗体又はその抗原結合断片と競合可能である抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む。
本開示のさらなる実施形態は、９Ｃ９抗体又はその抗原結合断片と競合可能であるか、又は９Ｃ９抗体のＣＤＲを含む抗体又はその抗原結合断片と競合可能である抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む。
本開示に包含される特定の実施形態は、４Ｅ１１抗体のＣＤＲを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片に関する。
本開示は、以下：
４Ｅ１１抗体のＣＤＲＬ１（配列番号３８）、ＣＤＲＬ２（配列番号３９）、ＣＤＲＬ３（配列番号４０）、ＣＤＲＨ１（配列番号４３）、ＣＤＲＨ２（配列番号４４）、及びＣＤＲＨ３（配列番号４５）を含む抗体又はその断片、
５Ｇ６抗体のＣＤＲＬ１（配列番号８）、ＣＤＲＬ２（配列番号９）、ＣＤＲ Ｌ３（配列番号１０）、ＣＤＲＨ１（配列番号１３）、ＣＤＲＨ２（配列番号１４）、及びＣＤＲＨ３（配列番号１５）を含む抗体又はその断片、
１Ａ８抗体のＣＤＲＬ１（配列番号１８）、ＣＤＲＬ２（配列番号１９）、ＣＤＲＬ３（配列番号２０）、ＣＤＲＨ１（配列番号２３）、ＣＤＲＨ２（配列番号２４）及びＣＤＲＨ３（配列番号２５）を含む抗体又はその断片、
４Ｂ３抗体のＣＤＲＬ１（配列番号２８）、ＣＤＲＬ２（配列番号２９）、ＣＤＲＬ３（配列番号３０）、ＣＤＲＨ１（配列番号３３）、ＣＤＲＨ２（配列番号３４）及びＣＤＲＨ３（配列番号３５）を含む抗体又はその断片、
５Ｄ８抗体のＣＤＲＬ１（配列番号４８）、ＣＤＲＬ２（配列番号４９）、ＣＤＲＬ３（配列番号５０）、ＣＤＲＨ１（配列番号５３）、ＣＤＲＨ２（配列番号５４）及びＣＤＲＨ３（配列番号５５）を含む抗体又はその断片、
９Ｃ９抗体のＣＤＲＬ１（配列番号５８）、ＣＤＲＬ２（配列番号５９）、ＣＤＲＬ３（配列番号６０）、ＣＤＲＨ１（配列番号６３）、ＣＤＲＨ２（配列番号６４）、ＣＤＲＨ３（配列番号６５）を含む抗体又はその断片、並びに
Ｆ２６６－１１Ｂ１（本明細書において１１Ｂ１と称する）、Ｆ２６６－１１Ｃ８（本明細書において１１Ｃ８と称する）、Ｆ２６６－１１Ｈ５（本明細書において１１Ｈ５と称する）、及び／又はＦ２６６－１１Ｈ３（本明細書において１１Ｈ３と称する）抗体のＣＤＲＬ１（配列番号６８又は７３）、ＣＤＲＬ２（配列番号６９又は７４）、ＣＤＲＬ３（配列番号７０又は７５）、ＣＤＲＨ１（配列番号７８）、ＣＤＲＨ２（配列番号７９）及びＣＤＲＨ３（配列番号８０）を含む抗体又はその断片
からなる群から選択される配列を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又は抗原結合断片を提供する。
本開示に包含される実施形態は、５Ｇ６抗体のＣＤＲを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片に関する。
本開示に包含される別の実施形態は、１Ａ８抗体のＣＤＲを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片に関する。
本開示に包含されるさらなる実施形態は、４Ｂ３抗体のＣＤＲを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片に関する。
本開示に包含される別の実施形態は、５Ｄ８抗体のＣＤＲを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片に関する。
本開示に包含されるさらなる実施形態は、９Ｃ９抗体のＣＤＲを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片に関する。
本開示に包含される別の実施形態は、１１Ｂ１抗体又は１１Ｃ８抗体のＣＤＲを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片に関する。
本開示は、以下：
ＣＤＲＬ１（配列番号８）、ＣＤＲＬ２（配列番号９）、ＣＤＲＬ３（配列番号１０）、ＣＤＲＨ１（配列番号１３）、ＣＤＲＨ２（配列番号１４）、ＣＤＲＨ３（配列番号１５）からなるＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合断片、
ＣＤＲＬ１（配列番号１８）、ＣＤＲＬ２（配列番号１９）、ＣＤＲＬ３（配列番号２０）、ＣＤＲＨ１（配列番号２３）、ＣＤＲＨ２（配列番号２４）、ＣＤＲＨ３（配列番号２５）からなるＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合断片、
ＣＤＲＬ１（配列番号２８）、ＣＤＲＬ２（配列番号２９）、ＣＤＲＬ３（配列番号３０）、ＣＤＲＨ１（配列番号３３）、ＣＤＲＨ２（配列番号３４）、ＣＤＲＨ３（配列番号３５）からなるＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合断片、
ＣＤＲＬ１（配列番号３８）、ＣＤＲＬ２（配列番号３９）、ＣＤＲＬ３（配列番号４０）、ＣＤＲＨ１（配列番号４３）、ＣＤＲＨ２（配列番号４４）、ＣＤＲＨ３（配列番号４５）からなるＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合断片、
ＣＤＲＬ１（配列番号４８）、ＣＤＲＬ２（配列番号４９）、ＣＤＲＬ３（配列番号５０）、ＣＤＲＨ１（配列番号５３）、ＣＤＲＨ２（配列番号５４）、ＣＤＲＨ３（配列番号５５）からなるＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合断片、
ＣＤＲＬ１（配列番号５８）、ＣＤＲＬ２（配列番号５９）、ＣＤＲＬ３（配列番号６０）、ＣＤＲＨ１（配列番号６３）、ＣＤＲＨ２（配列番号６４）、ＣＤＲＨ３（配列番号６５）からなるＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合断片、
ＣＤＲＬ１（配列番号６８）、ＣＤＲＬ２（配列番号６９）、ＣＤＲＬ３（配列番号７０）、ＣＤＲＨ１（配列番号７８）、ＣＤＲＨ２（配列番号７９）、ＣＤＲＨ３（配列番号８０）からなるＣＤＲ配列を含む抗体又はその断片、及び
ＣＤＲＬ１（配列番号７３）、ＣＤＲＬ２（配列番号７４）、ＣＤＲＬ３（配列番号７５）、ＣＤＲＨ１（配列番号７８）、ＣＤＲＨ２（配列番号７９）、ＣＤＲＨ３（配列番号８０）からなるＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合断片
からなる群から選択される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又は抗原結合断片を提供する。
本開示は、いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、例えば、以下：
ａ．配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域、並びに配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域、
ｂ．配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域、並びに配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域、
ｃ．配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域、並びに配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域；
ｄ．配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域、並びに配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域；
ｅ．配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域、並びに配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域、
ｆ．配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域、並びに配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域；
ｇ．配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域、並びに配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号８０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域、又は
ｈ．配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域、並びに配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号８０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域
を含み得る抗体又はその抗原結合断片、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ等の抗原結合剤を提供する。
本開示は、追加の実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、以下：
ａ．配列番号１１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１１８と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び／又は配列番号１１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１１６と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ｂ．配列番号１１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１１５と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１１６と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
ｃ．配列番号１１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１１８と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号６２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含み得る抗体又はその抗原結合断片、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ等の抗原結合剤を提供する。
その一態様において、配列番号１１５又は配列番号１１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は実質的に同一である軽鎖を有する抗原結合剤は、それぞれ配列番号１１５又は配列番号１１８のものと同一のＣＤＲを有し得る。
その一態様において、配列番号６２又は配列番号１１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は実質的に同一である重鎖を有する抗原結合剤は、それぞれ配列番号６２又は配列番号１１６のものと同一のＣＤＲを有し得る。
本開示は、さらなる実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、以下：
ａ．配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域；
ｂ．配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号２２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域；
ｃ．配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号２７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号３２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域；
ｄ．配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号３７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号４２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域；
ｅ．配列番号４７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号４７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号５２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ｆ．配列番号５７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号５７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号６２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域；
ｇ．配列番号６７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号６７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、及び配列番号７７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号７７と実質的に同一であるアミノ酸配列、配列番号９２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号９２と実質的に同一であるアミノ酸配列、又は配列番号１０２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１０２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域：又は、
ｈ．配列番号７２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号７２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、及び配列番号７７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号７７と実質的に同一であるアミノ酸配列、又は配列番号９２に示されるアミノ酸と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号９２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域
を含み得る抗体又はその抗原結合断片、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ等の抗原結合剤を提供する。
所与の抗体のものと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、軽鎖、重鎖可変領域又は重鎖は、その抗体と同一のＣＤＲを有し得る。本開示の一実施形態において、本開示で提供される抗体及び抗原結合断片のＶＬ配列及びＶＨ配列は、本明細書で提供されるＶＬ配列及びＶＨ配列と実質的に同一である配列を含んでもよく、又は少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含んでもよく、ここで配列のバリエーションは、好ましくは、提供されるＶＬ配列及びＶＨ配列のＣＤＲの外側にある。
さらに本開示は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、以下：
ａ．配列番号１０８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１０８と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖、及び配列番号１０７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号１０７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖；又は
ｂ．配列番号１１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１１０と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖、及び配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１０９と実質的に同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖
を含み得る抗体又はその抗原結合断片、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ等の抗原結合剤を提供する。
本開示は、特に、以下：
ａ．配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、
ｂ．配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、又は同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、又は同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域；
ｃ．配列番号１０８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、又は同一であるアミノ酸配列を含み得る軽鎖、及び配列番号１０７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか、少なくとも８５％同一であるか、少なくとも９０％同一であるか、少なくとも９５％同一であるか、又は同一であるアミノ酸配列を含み得る重鎖
を含み得る抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ等の抗原結合剤を特に提供する。
本開示によれば、項目ｂ又はｃの抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３８、３９、４０、４３、４４及び４５に示されるものと同一又は実質的に同一であるＣＤＲを有し得る。
本開示によれば、抗体又はその抗原結合断片は、例えば、１００ｎＭ未満の親和性、例えば、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下等の親和性を有し得る。
本開示の例示的な実施形態としては、ヒトＩｇＧ定常領域を含み得る抗体又はその抗原結合断片が挙げられる。本開示の抗体又は抗原結合断片は、例えば、限定されないが、ヒトＩｇＧ１定常領域又はヒトＩｇＧ２定常領域を含み得る。
例示的な実施形態において、本明細書に開示される抗原結合剤は、ヒト化フレームワーク領域を含み得る。
本開示によれば、抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、又は多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）であり得る。
本開示の二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、第１のヒトＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープに特異的に結合する第１のアームと、第２の（重複しない）ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープに特異的に結合する第２のアームとを含み得る、二重特異性抗体又はその抗原結合断片（例えば、バイパラトピック抗体）を含む。
本開示の二重特異性抗体又はその抗原結合断片のさらなる実施形態は、第１のヒトＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープに特異的に結合する第１のアームと、別の抗原に特異的に結合する第２のアームとを含み得る、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含む。
本開示の二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する第１のアームと、ＣＤ３に特異的に結合する第２のアームとを含むもの等の、二重特異性免疫細胞エンゲージャーを含む。
本開示によれば、抗原結合断片は、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又は（Ｆａｂ’）２を含む。
さらなる態様において、本開示は、カーゴ分子に連結していてもよい抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本開示によれば、カーゴ分子は、例えば、細胞毒性剤、細胞分裂阻害剤、抗癌剤又は放射線療法剤等の治療部分を含み得る。本開示の特定の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、細胞毒性剤を含み得る。本開示の別の特定の実施形態は、放射線療法剤を含む抗体薬物コンジュゲートに関する。
本開示によれば、カーゴ分子は、検出可能部分を含み得る。
本開示の抗体又はその抗原結合断片は、医薬組成物の形態で提供され得る。医薬組成物は、例えば、薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含み得る。
本開示はさらに、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。
本開示の核酸分子の例示的な実施形態としては、以下が挙げられる：
ａ．配列番号１１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号１６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号７及び／若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｂ．配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号２６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号１７及び／若しくは配列番号２２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｃ．配列番号３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号３６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号２７及び／若しくは配列番号３２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｄ．配列番号４１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号４６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号３７及び／若しくは配列番号４２に示される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｅ．配列番号５１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号５６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号４７及び／若しくは配列番号５２に示される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｆ．配列番号６１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号６６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号５７及び／若しくは配列番号６２に示される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｇ．配列番号７１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号８１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号６７及び／若しくは配列番号７７に示される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｈ．配列番号７６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号８１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号７２及び／若しくは配列番号７７に示される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｉ．配列番号８６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号９６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号８２及び／若しくは配列番号９２に示される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｊ．配列番号９１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号９６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号８７及び／若しくは配列番号９２に示される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子；
ｋ．配列番号１０１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含み得る核酸分子、及び／又は配列番号１０６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列、又は配列番号９７及び／若しくは配列番号１０２に示される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る核酸分子
が挙げられる。
さらなる態様において、本開示は、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片のうちの少なくとも１つを含むキットを提供する。
本開示のさらなる態様は、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードする核酸を含み得るベクター又はベクターのセットに関する。軽鎖可変領域又は軽鎖及び重鎖可変領域又は重鎖をコードする核酸は、同じベクターで提供されてもよく、又は別個のベクターで提供されてもよい。
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載のベクター又はベクターのセットを含む、単離された細胞に関する。単離された細胞は、抗体又はその抗原結合断片を発現、アセンブリ、及び／又は分泌することができる。
本開示の他の態様は、本開示の抗体若しくはその抗原結合断片の軽鎖をコードする核酸又はベクターを含む第１のバイアルと、抗体又はその抗原結合断片の重鎖をコードする核酸又はベクターを含む第２のバイアルとを含むキットに関する。
本開示のさらなる態様は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を含む癌を治療する方法に関する。本方法は、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片を、必要とする対象に投与するステップを含み得る。治療部分とコンジュゲートされている抗体又は抗原結合断片（ＡＤＣ）が、治療方法において特に企図されている。
本開示はさらに、癌の治療における本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用に関する。
本開示はさらに、癌の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用に関する。
本開示によれば、抗体又はその抗原結合断片は、化学療法剤と組み合わせて使用されてもよい。
本開示によれば、必要とする対象は、多形性膠芽腫を有するか又は有する疑いがある。
さらに、本開示によれば、必要とする対象は、癌腫を有するか又は有する疑いがある。
本開示のさらなる態様は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを検出する方法に関する。本方法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むか又は含む疑いがある試料を、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片と接触させるステップを含み得る。
本開示のさらなる態様は、本開示の抗体又はその抗原結合断片が産生されるように、抗体又は抗原結合断片をコードする核酸又はベクターを含む細胞を培養するステップによる、本開示の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法に関する。したがって、抗体又はその抗原結合断片は、単離及び／又は精製されてもよい。
本方法は、抗体又はその抗原結合断片を、例えば、治療部分等のカーゴ分子とコンジュゲートするステップをさらに含んでもよい。
本開示のさらなる範囲、適用性、及び利点は、以下に示す非限定的な詳細な説明から明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明は、添付の図面を参照して、本開示の例示的な実施形態を示す一方で、例としてのみ与えられていることが理解されるべきである。
図１Ａ及びＢ。野生型ヒトＥＧＦＲ（Ｕ８７ＷＴ）又はＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を過剰発現するＵ８７ＭＧ細胞株の選択されたハイブリドーマの上清のフローサイトメトリーを使用して得られたヒストグラムを示す。 図１Ｃ及びＤ。野生型ヒトＥＧＦＲ（Ｕ８７ＷＴ）又はＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を過剰発現するＵ８７ＭＧ細胞株の選択されたハイブリドーマの上清のフローサイトメトリーを使用して得られたヒストグラムを示す。 図１Ｅ及びＦ。野生型ヒトＥＧＦＲ（Ｕ８７ＷＴ）又はＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を過剰発現するＵ８７ＭＧ細胞株の選択されたハイブリドーマの上清のフローサイトメトリーを使用して得られたヒストグラムを示す。 図１Ｇ及びＨ。野生型ヒトＥＧＦＲ（Ｕ８７ＷＴ）又はＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を過剰発現するＵ８７ＭＧ細胞株の選択されたハイブリドーマの上清のフローサイトメトリーを使用して得られたヒストグラムを示す。 図１Ｉ及びＪ。野生型ヒトＥＧＦＲ（Ｕ８７ＷＴ）又はＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を過剰発現するＵ８７ＭＧ細胞株の選択されたハイブリドーマの上清のフローサイトメトリーを使用して得られたヒストグラムを示す。 図１Ｋ。野生型ヒトＥＧＦＲ（Ｕ８７ＷＴ）又はＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を過剰発現するＵ８７ＭＧ細胞株の選択されたハイブリドーマの上清のフローサイトメトリーを使用して得られたヒストグラムを示す。 図２Ａ及びＢ。ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ（Ｕ８７ＭＧ ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）又は野生型ＥＧＦＲ（Ｕ８７ＭＧ ＥＧＦＲ ｗｔ）を過剰発現するＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞株の精製モノクローナル抗体のフローサイトメトリーデータから得られた用量応答結合曲線を示す。 図２Ｃ及びＤ。ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ（Ｕ８７ＭＧ ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）又は野生型ＥＧＦＲ（Ｕ８７ＭＧ ＥＧＦＲ ｗｔ）を過剰発現するＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞株の精製モノクローナル抗体のフローサイトメトリーデータから得られた用量応答結合曲線を示す。 図３は、野生型ヒトＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメインのアミノ酸配列間のアラインメントである。同一のアミノ酸には下線が引かれている。 酵母細胞上に提示されるＥＧＦＲｖＩＩＩの様々な断片に対する抗ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂの結合特性の結果を示す（＋＋＋は、高親和性の陽性抗体結合によって特徴付けられる９５％＋／－５％の陽性酵母細胞を表し；＋＋は、中程度の親和性の陽性抗体結合によって特徴付けられる７０％＋／－２０％の陽性酵母細胞を表し；＋は、低親和性の陽性抗体結合によって特徴付けられる３０％＋／－２０％の陽性酵母細胞を表し；（＋）は、非常に低い親和性の陽性抗体結合によって特徴付けられる５～９％の陽性酵母細胞を表し；－／＋は、明瞭でない抗体結合によって特徴付けられる５％未満の陽性酵母細胞を表し；－は、結合がないことによって特徴付けられる０％の陽性酵母細胞を表す；ｎｔ＝試験されていない。 酵母細胞上に提示されるＥＧＦＲｖＩＩＩの様々な断片に対する抗ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂの結合特性の結果を示す（＋＋＋は、高親和性の陽性抗体結合によって特徴付けられる９５％＋／－５％の陽性酵母細胞を表し；＋＋は、中程度の親和性の陽性抗体結合によって特徴付けられる７０％＋／－２０％の陽性酵母細胞を表し；＋は、低親和性の陽性抗体結合によって特徴付けられる３０％＋／－２０％の陽性酵母細胞を表し；（＋）は、非常に低い親和性の陽性抗体結合によって特徴付けられる５～９％の陽性酵母細胞を表し；－／＋は、明瞭でない抗体結合によって特徴付けられる５％未満の陽性酵母細胞を表し；－は、結合がないことによって特徴付けられる０％の陽性酵母細胞を表す；ｎｔ＝試験されていない。 図５Ａは、１１Ｂ１（配列番号７７）、１１Ｃ８（配列番号９２）、及び１１Ｈ３（配列番号１０２）の重鎖可変領域のアミノ酸配列間のアラインメントであり、ここで、「＊」は、その欄内の残基が、アラインメントにおける全ての配列において同一であることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されることを意味する（Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１年１０月１１日、７：５３９）。 図５Ｂは、４Ｂ３（配列番号２７）及び５Ｄ８（配列番号４７）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列間のアラインメントである。ここで、「＊」は、その欄内の残基が、アラインメントにおける全ての配列において同一であることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されることを意味し、「．」は、半保存的置換が観察されることを意味する。 図５Ｃは、４Ｂ３（配列番号３２）及び５Ｄ８（配列番号５２）の重鎖可変領域のアミノ酸配列間のアラインメントである。 図５Ｄは、４Ｂ３（配列番号２７）、５Ｄ８（配列番号４７）、及び９Ｃ９（配列番号５７）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列間のアラインメントであり、ここで、「＊」は、その欄内の残基が、アラインメントにおける全ての配列において同一であることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されることを意味し、「．」は、半保存的置換が観察されることを意味する。 図６Ａ、Ｂ及びＣ。野生型ＥＧＦＲ（Ｕ８７ ｗｔ）又はＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７ ＥＧＦＲｖＩＩＩ若しくはＤＫＭＧ ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を発現する膠芽腫細胞における細胞生存率に対するＤＭ１コンジュゲート（Ａ、Ｂ及びＣ）としての抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の効果の結果を示す。 図６Ｄ、Ｅ及びＦ。野生型ＥＧＦＲ（Ｕ８７ ｗｔ）又はＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ８７ ＥＧＦＲｖＩＩＩ若しくはＤＫＭＧ ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を発現する膠芽腫細胞における細胞生存率に対するＭＭＡＥコンジュゲート（Ｄ、Ｅ及びＦ）としての抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の効果の結果を示す。 図７は、ＤＡＲ＝３に基づいて、５ｍｇ／ｋｇの選択したＡＤＣで２回（０日目及び４日目）処置したＵ８７ＭＧ ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍担持マウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。腫瘍体積（ｍｍ３）を、３日ごとに記録した。各データ点は、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝８）。 図８Ａは、ＤＡＲ＝３に基づいて、３ｍｇ／ｋｇの選択したＤＭ１－ＡＤＣで２回（０日目及び４日目）処置したＵ８７ＭＧ ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍担持マウスの腫瘍成長阻害を示すグラフである。腫瘍体積（ｍｍ３）を３日ごとに記録した。各データ点は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１２）を表す。 図８Ｂは、ＤＡＲ＝３に基づいて、３ｍｇ／ｋｇの選択したＭＭＡＥ－ＡＤＣで２回（０日目及び４日目）処置したＵ８７ＭＧ ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍担持マウスの腫瘍成長阻害を示すグラフである。腫瘍体積（ｍｍ３）を３日ごとに記録した。各データ点は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１２）を表す。 図９は、合成キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物における５Ｇ６又は４Ｅ１１抗原結合ドメインの合成アセンブリ及び配列を示す概略図である。 図１０は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ－Ｔ構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能性を示すグラフである。様々なＣＡＲ構築物（ＥＧＦＲｖＩＩＩ ５Ｇ６ ＣＡＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ４Ｅ１１ ＣＡＲ、又は対照ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３ ＣＡＲ）でエレクトロポレーションしたＪｕｒｋａｔ細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的発現あり（Ｕ８７ｖＩＩＩ）又はＥＧＦＲｖＩＩＩ標的発現なし（Ｕ８７、ＯＶＣＡＲ３及びＡ２０）の標的細胞に２４時間曝露した。細胞活性化のレベルを、フローサイトメトリーによってＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ４５陽性）上のＣＤ６９の表面発現を定量化することによって測定した。 図１１は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞／標的細胞共培養物における標的細胞増殖の抑制を示すグラフである。ヒト初代末梢血由来Ｔ細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲレンチウイルス（４Ｅ１１－ＣＡＲ－Ｔ又は５Ｇ６－ＣＡＲ－Ｔ）、ＣＤ１９特異的ＣＡＲレンチウイルス（ＦＭＣ６３）を用いて形質導入したか又はレンチウイルスの非存在下で同様に処理し（Ｍｏｃｋ）、数日間培養して増殖させた。次いで、ＣＡＲ形質導入又は非形質導入Ｔ細胞を、核局在ｍＫａｔｅ２蛍光タンパク質を発現するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原発現標的細胞（Ｕ８７ｖＩＩＩ）と共培養した。次いで、ライブ蛍光顕微鏡（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（商標）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して細胞を調べた。グラフは、ｍＫａｔｅ２＋細胞の自動カウントを介して測定した６日間にわたる相対的な標的細胞増殖を示す。 図１２は、腫瘍担持ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγ－ヌル（ＮＳＧ）マウスの腫瘍成長（左パネル）及び生存（右パネル）を示すグラフである。ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する１×１０６個のＵ８７ｖＩＩＩヒト膠芽腫細胞を皮下注射した。腫瘍細胞注射後７日目に、マウスにＥＧＦＲｖＩＩＩ－４Ｅ１１ ＣＡＲで形質導入された初代ヒトＴ細胞を与えるか又はマウスを未処置のままにした。次いで、腫瘍成長を、キャリパー測定によってモニターした（図１２Ａ）。腫瘍サイズ（長さ及び幅）を、デジタルバーニアキャリパーを使用して測定した。腫瘍体積は以下の式を用いて計算した：腫瘍体積＝（０．４）（ａｂ２）、式中、ａ＝大直径、及びｂ＝小直径。 生存は、ＣＡＲ－Ｔ処置有り又は無しで、人道的エンドポイント（２０００ｍｍ３を超える腫瘍体積として定義）までの時間として定義される（図１２Ｂ）。 図１３は、潜在的な二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー及び二重特異性キラー細胞エンゲージャーを示す概略図である。 図１４は、ＯＫＴ３ヒトＣＤ３特異的ｓｃＦＶに連結された４Ｅ１１－ｓｃＦＶ配列を含有するＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的構築物を用いた二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー活性のスクリーニングを示すグラフである。４Ｅ１１－ＯＫＴ３二重特異性エンゲージャー構築物を一過性に発現するヒト胚性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞からの上清を、Ｊｕｒｋａｔ細胞及び様々な用量の抗原発現標的細胞（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を含有するウェルに移した。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの存在下又は非存在下における標的誘導活性化を、ヒトＣＤ６９特異的抗体染色及びフローサイトメトリーを用いて、ＣＤ６９発現レベルを調べることによって測定した。様々な用量の標的細胞にわたる、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー有り又は無しのＣＤ６９発現の倍率変化を示す。 図１５は、ＯＫＴ３ヒトＣＤ３特異的ｓｃＦＶに結合した４Ｅ１１－ｓｃＦＶ配列を含有する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー構築物の存在下における、Ｔ細胞／標的細胞共培養物における標的細胞成長の抑制を示すグラフである。ＯＫＴ３に結合したヒト－ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖから構成される対照二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを比較のために示す。４Ｅ１１－ＯＫＴ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー構築物又はＣＤ１９－ＯＫＴ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー構築物を一過性に発現するヒト胚性腎臓細胞からの上清を、初代血液由来Ｔ細胞及び核局在ｍＫａｔｅ２蛍光タンパク質（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を発現するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原発現標的細胞を含有するウェルに移した。次いで、ライブ蛍光顕微鏡（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（商標）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＵＳＡ）を使用して細胞を調べた。グラフは、ｍＫａｔｅ２＋細胞の自動カウントを介して測定した７２時間にわたる相対的な標的細胞増殖を示す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩを指す。用語「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」及び「ｖＩＩＩ」は、互換的に使用される。
本明細書で使用されるとき、用語「ＥＧＦＲ」は、ヒトの上皮成長因子受容体を指す。用語「ｗｔ ＥＧＦＲ」、「ＷＴ ＥＧＦＲ」、「ＥＧＦＲ ＷＴ」又は「ＥＧＦＲ ｗｔ」は互換的に使用され、野生型ＥＧＦＲを指す。
用語「１つ（種）の（ａ）」及び「１つ（種）の（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」並びに本開示を記載する文脈（特に特許請求の範囲の文脈）で使用される同様の参照は、本明細書で他に言及されない限り又は内容に明確に矛盾が生じない限り、単数形及び複数形のいずれも包含すると解釈される。
本明細書で使用されるとき、具体的に示されていない限り又は文脈から明らかでない限り、用語「又は」は包括的であると理解され、「又は」と「及び」の両方を包含する。
用語「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、他方を伴う又は伴わない特定の特徴又は構成要素のそれぞれの具体的な開示として理解されるべきである。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別途注記されていない限り、限定されない用語として解釈されるべきである（つまり、「含むが、それらに限定されない」を意味する）。用語「からなる」は、閉鎖的に解釈されるべきである。
本明細書で使用されるとき、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はＥＧＦＲなどのタンパク質に関して「天然の」という用語は、タンパク質の天然の立体構造を指し、適切に折り畳まれた及び／又は機能的であるタンパク質を含む。
本明細書で使用されるとき、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はＥＧＦＲなどのタンパク質に関して「変性した」という用語は、その天然の立体構造を失い、例えば、三次構造及び二次構造の消失を伴い得るタンパク質を指す。
本明細書で使用されるとき、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を含むか又はそれからなるペプチド」という表現は、ペプチドがＥＧＦＲｖＩＩＩ断片以外の部分を含んでもよいか、又はペプチドがＥＧＦＲｖＩＩＩ断片からなることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸残基を含むエピトープに結合する」は、アミノ酸残基がエピトープの一部であるか、又は抗体の結合に必要であることを意味する。
本明細書で使用されるとき、ペプチド又はタンパク質に「結合することができない」という用語は、抗体又は抗原結合断片が、ａ）組換え的に又は細胞内で発現したときに、ペプチド又はタンパク質に有意に結合せず、ｂ）検出可能な結合が観察されず、ｃ）陰性対照抗体と同様の結合特性を有し、ｄ）特異的に結合せず、又はｅ）実施例１０で行われたフローサイトメトリー実験によって決定される０％～１５％の値で結合することを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「自家」は、同一個体由来の材料を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「抗原結合ドメイン」は、抗原への特異的結合を可能にする抗体又は抗原結合断片のドメインを指す。
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、ナノボディ、又は任意のラクダ若しくはラマ単一ドメイン抗体）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）等を包含する。「抗体」という用語は、天然に存在するもの（例えば、ヒトＩｇＧ等）と同様の形式を有する分子を包含する。「抗体」という用語は、当該技術分野において「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも称され、本明細書で使用されるとき、対の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドから構築されるタンパク質を指し、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む様々なＩｇアイソタイプが存在する。抗体が正しく折り畳まれると、各鎖は、比較的に直線的なポリペプチド配列によって結合された、いくつかの異なる球状ドメインに折り畳まれる。例えば、免疫グロブリンの軽鎖は、可変（ＶＬ）ドメイン及び定常（ＣＬ）ドメインに折り畳まれ、一方、重鎖は、可変（ＶＨ）ドメイン及び３つの定常（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインに折り畳まれる。重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）の相互作用により、抗原結合領域（Ｆｖ）が形成される。各ドメインは、当業者によく知られている確立された構造を有する。
典型的には、抗体は、２本の軽鎖と２本の重鎖との対合から構成される。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む、異なる抗体アイソタイプが存在する。ヒトＩｇＧは、さらに４つの異なるサブグループ、つまり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割される。治療抗体は、一般に、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２として開発されている。
例示的な一実施形態では、本開示の抗体又は抗原結合断片は、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域又はその断片を含み得る。別の例示的な実施形態では、本開示の抗体又は抗原結合断片は、例えば、ヒトＩｇＧ２定常領域又はその断片を含み得る。他の抗体サブタイプの定常領域も企図されている。
ヒト抗体ＩｇＧアイソタイプの軽鎖及び重鎖は、それぞれ、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた３つの超可変領域を有する可変領域を含む。軽鎖ＣＤＲは、本明細書において、ＣＤＲＬ１若しくはＬ１、ＣＤＲＬ２若しくはＬ２、及びＣＤＲＬ３若しくはＬ３として特定される。重鎖ＣＤＲは、本明細書において、ＣＤＲＨ１若しくはＨ１、ＣＤＲＨ２若しくはＨ２、及びＣＤＲＨ３若しくはＨ３として特定される。相補性決定領域は、以下の順序でフレームワーク領域（ＦＲ）に隣接している：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、標的抗原の結合に関与し、したがって、抗体間の顕著な配列多様性を示すことができる。定常領域は、より少ない配列多様性を示し、いくつかの天然タンパク質に結合して重要な生化学的事象を誘発する役割を担う。抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、したがって、抗体の標的抗原に対する特異性を決定する。大部分の配列可変性は、ＣＤＲで生じ、これが組み合わさって抗原結合部位を形成し、抗原決定基の結合及び認識に寄与する。フレームワーク領域は、最適な抗原結合のためにＣＤＲの３次元での適切な位置決め及びアラインメントにおいて役割を果たし得る。抗体の抗原に対する特異性及び親和性は、超可変領域の構造、並びにそれらが抗原に提示する表面の大きさ、形状、及び化学的性質によって決定される。超可変性の領域を特定するための様々なスキームが存在し、２つの最も一般的なものは、Ｋａｂａｔ、並びにＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋのものである。Ｋａｂａｔら（１９９１）は、ＶＨ及びＶＬドメインの抗原結合領域における配列可変性に基づいて「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を定義する。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）は、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン内の構造ループ領域の位置に基づき、「超可変ループ」（Ｈ又はＬ）を定義する。これらの個々のスキームは、隣接又は重複するＣＤＲ及び超可変ループ領域を定義し、抗体分野における当業者は、しばしば「ＣＤＲ」及び「超可変ループ」という用語を互換的に利用し、それらは本明細書でも同様に使用され得る。ＣＤＲ／ループは、本明細書において、Ｋａｂａｔスキームに従って特定される。
組換えＤＮＡ技術は、本開示に包含される一本鎖抗体（例えば、単一ドメイン）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ等の様々な抗体フォーマットの設計を可能にする。
本明細書で言及される「抗原結合断片」は、当該技術分野で公知の任意の好適な抗原結合断片を含み得る。抗原結合断片は、天然に存在する断片であってもよく、又は天然に存在する抗体の操作によって、又は組換え方法を使用して得られてもよい。例えば、抗体断片としては、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；ペプチドリンカーと連結されたＶＬ及びＶＨからなる分子）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；単一のＶＬ又はＶＨから構成される断片）、及びこれらのうちのいずれかを多価提示する断片が挙げられ得るが、これらに限定されない。先に記載されたような抗体断片は、断片の異なる部分を連結するために、リンカー配列、ジスルフィド結合、又は他の種類の共有結合を必要とし得る；当業者は、異なる種類の断片及び様々なアプローチの要件、並びにそれらの構築のための様々なアプローチに精通している。
本開示のその抗原結合断片は、抗原に特異的結合を付与するアミノ酸残基を含む抗原結合部位（例えば、１つ又は複数のＣＤＲ）を有する分子を包含する。
したがって、抗原結合断片開示の例示的な実施形態は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＶＨ ＣＤＲ３を含むが、これらに限定されない。
抗原結合断片の具体的な実施形態は、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又は（Ｆａｂ’）２を含み得る。
「ヒト化抗体」という用語は、完全にヒト化された抗体（つまり、フレームワークが１００％ヒト化されている）及び部分的にヒト化された抗体（例えば、少なくとも１つの可変領域が、ヒト抗体由来の１つ又は複数のアミノ酸を含み、他のアミノ酸が非ヒト親抗体のアミノ酸である）を包含する。典型的には、「ヒト化抗体」は、非ヒト親抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類等）のＣＤＲと、天然ヒト抗体又はヒト抗体コンセンサスのものと同一であるフレームワークとを含む。そのような場合、それらの「ヒト化抗体」は、完全にヒト化されていると特徴付けられる。「ヒト化抗体」は、ヒト抗体又はヒト抗体コンセンサスのアミノ酸に対応物がない１つ又は複数のアミノ酸置換を含んでもよい。そのような置換としては、例えば、抗体特性（例えば、親和性、特異性等）を保持し得る逆突然変異（例えば、非ヒトアミノ酸の再導入）が挙げられる。そのような置換は、通常、フレームワーク領域内にある。「ヒト化抗体」は、通常、ヒト抗体のものである定常領域（Ｆｃ）も含む。典型的には、「ヒト化抗体」の定常領域は、ヒト抗体の定常領域と同一である。ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティングによって得ることができる（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら、２００５；Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｔｅｍｐｅｓｔら、１９９１；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；Ｑｕｅｅｎら、１９８９）。そのような抗体は、完全にヒト化されていると考えられる。
「キメラ抗体」という用語は、親抗体とは異なる起源からの定常領域を有する抗体を指す。「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域を有する抗体を包含する。典型的には、「キメラ抗体」は、マウス抗体に由来する可変領域及びヒト定常領域から構成される。
「ハイブリッド抗体」という用語は、特定の種類の抗体（例えば、ヒト化）からのその重鎖若しくは軽鎖可変領域（その重鎖若しくは軽鎖）の１つを含み、一方で、重鎖若しくは軽鎖可変領域（重鎖若しくは軽鎖）の他方は、別の種類（例えば、マウス、キメラ）からのものである、抗体を指す。
本開示の抗体及び／又は抗原結合断片は、例えば、マウス、ラット、又は任意の他の哺乳動物に由来し得るか、又は組換えＤＮＡ技術などの他の供給源に由来し得る。本開示の抗体又は抗原結合断片は、例えば、合成抗体、非天然抗体、非ヒト哺乳動物の免疫化後に得られた抗体等を含み得る。
本開示の抗体又はその抗原結合断片は、単離されていてもよく、及び／又は実質的に精製されていてもよい。
抗原結合剤バリアント
本開示は、本明細書に記載の抗原結合剤のバリアントも包含する。
より具体的には、本開示は、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片、ＣＡＲ及びＢｉＴＥのバリアントを包含する。バリアント（例えば、抗体又は抗原結合断片、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ等）には、それらのアミノ酸配列、例えば、１つ又は複数のＣＤＲ、１つ又は複数のフレームワーク領域、及び／又は定常領域に変異を有するものが含まれる。本開示に含まれるバリアント（例えば、抗体又は抗原結合断片、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ等）は、例えば、元の抗体又は抗原結合断片と比較して、同様の又は改善された結合親和性を有するものである。
本開示に包含されるバリアントは、挿入、欠失、又はアミノ酸置換（保存的又は非保存的）を含み得るバリアントである。これらのバリアントは、そのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が、除去されていてもよく、異なる残基がその位置に挿入されていてもよい。
より具体的には、本開示に包含されるバリアントには、本明細書に開示される抗体又は抗原結合バリアントの軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を有するものが含まれる。バリアント抗体のＣＤＲは、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片のＣＤＲと同一であってもよい。
本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片のものと同一であるＣＤＲアミノ酸残基と、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片のものと少なくとも８０％同一である配列であるフレームワーク領域とを有するバリアントも本開示に包含される。
保存的置換は、以下に列挙される群（第１～６群）のうちの１つから（ＣＤＲ、可変鎖、フレームワーク領域、又は定常領域等の）アミノ酸残基を、同じ群の別のアミノ酸と交換することによって行われ得る。
保存的置換の他の例示的な実施形態を下記の表に示す。
（第１群）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）
（第２群）中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）
（第３群）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）
（第４群）塩基性：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）
（第５群）鎖の配向に影響を与える残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、及び
（第６群）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
非保存的置換は、これらの群のうちの１つのメンバーを別の群のメンバーと交換することを伴う。
Figure 2022528368000002
同一性パーセントは、元のペプチドと比較して同一であり、同じ又は類似の位置を占め得るアミノ酸の指標である。類似性パーセントは、同じ又は類似の位置にある元のペプチドと比較して、同一であるアミノ酸及び保存的アミノ酸置換で置き換えられているアミノ酸の指標となろう。
全体的に、可変鎖間の類似性及び同一性の程度は、デフォルト設定、つまり、ｂｌａｓｔｐプログラム、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（オープンギャップ １１、及び伸長ギャップペナルティ １；ｇａｐｘ ドロップオフ ５０、期待値 １０．０、ワードサイズ ３）及び活性化フィルターを用い、Ｂｌａｓｔ２配列プログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｕｓｏｖａ、Ｔｈｏｍａｓ Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），「Ｂｌａｓｔ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ－ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７－２５０）を使用して、本明細書で決定されている。
「実質的に同一である」配列は、生物学的に機能的な活性が維持されることを可能にする１つ又は複数の保存的アミノ酸変異又はアミノ酸欠失を含み得る。参照配列に対する１つ又は複数の保存的アミノ酸変異が、参照配列と比較して生理学的、化学的、物理化学的、又は機能的特性に実質的な変化を有しないバリアントペプチドを生じ得ることは当該技術分野において公知であり、そのような場合、参照配列及びバリアント配列は、「実質的に同一」のポリペプチドと考えられるであろう。
したがって、本開示のバリアントは、元の配列又は元の配列の一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得るものを含む。
核酸、ベクター、及び細胞
抗体は、通常、軽鎖及び／又は重鎖をコードする核酸配列を含むベクター（複数可）から発現される軽鎖及び重鎖の発現を可能にする細胞において作製される。
したがって、本開示は、本明細書に記載のＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、重鎖のいずれかをコードすることができる核酸を包含する。
本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを指す。
遺伝子コードの固有の縮重により、同じアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を生成し、本開示の抗体又はその抗原結合断片を発現するために使用してもよい。ヌクレオチド配列は、クローニング、プロセシング、及び／又は遺伝子産物の発現の変更を含むがこれらに限定されない様々な目的のためにヌクレオチド配列を改変するために、当該技術分野で一般的に知られた方法を使用して操作されてよい。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダム断片化及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを使用して、ヌクレオチド配列を操作してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性部位特異的変異誘発を使用して、新しい制限部位を生成する変異を導入し、グリコシル化パターンを変更し、コドン選好を変更し、スプライスバリアント等を作製してもよい。
さらに別の態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むベクターに関する。
本開示によれば、ベクターは、発現ベクターであってもよい。
発現ベクターは、通常、特定の宿主における挿入されたコード配列の転写及び翻訳制御のためのエレメントを含有する。これらのエレメントは、エンハンサー、構成的及び誘導性プロモーター、並びに５’及び３’非翻訳領域などの調節配列を含み得る。当業者に周知の方法を使用して、そのような発現ベクターを構築してもよい。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。
抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、同じ核酸分子（例えば、同じベクター）によって、又は別個の分子（例えば、別個のベクター）によってコードされてもよい。
したがって、本開示は、ベクターのセットであって、ベクターの１つが、軽鎖又は軽鎖可変領域を発現することができ、他のベクターが、重鎖又は重鎖可変領域を発現することができる、セットを提供する。
本開示のさらなる態様は、本開示の抗体又はその抗原結合断片の軽鎖又は軽鎖可変領域をコードする核酸又はベクターを含む第１のバイアルと、抗体又はその抗原結合断片の重鎖又は重鎖可変領域をコードする核酸又はベクターを含む第２のバイアルとを含むキットに関する。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸、ベクター、抗体、又は抗原結合断片を含み得る、単離された細胞に関する。
単離された細胞は、軽鎖可変領域をコードする核酸と重鎖可変領域をコードする核酸とを、別個のベクターに又は同じベクターに含み得る。また単離された細胞は、軽鎖をコードする核酸と重鎖をコードする核酸とを、別個のベクターに又は同じベクターに含み得る。
本開示によれば、細胞は、抗体又はその抗原結合断片を発現、アセンブリ、及び／又は分泌することができる。
また、本開示によれば、細胞は、本明細書に記載の抗体を含み得る、及び／又は発現し得る。
さらに、本開示によれば、細胞は、軽鎖可変領域をコードする核酸及び重鎖可変領域をコードする核酸を含み得る。
細胞における抗体又は抗原結合断片の産生
本明細書に開示される抗体は、ハイブリドーマの方法論又は組換えＤＮＡ法を含む、当業者によく知られた様々な方法によって作製することができる。
慣用のハイブリドーマ技術は、げっ歯類を抗原で免疫化し、脾細胞を単離し、ＨＧＰＲＴ発現を欠く骨髄腫細胞と融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミン（ＨＡＴ）を含有する培地によってハイブリッド細胞を選択することを伴う。ハイブリドーマをスクリーニングして、所与の抗原に特異的な抗体を産生するものを特定する。ハイブリドーマは、拡張され、クローニングされる。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の核酸配列は、標準的な配列決定方法によって得られ、抗体の軽鎖及び重鎖核酸配列を含む発現ベクターが生成される。
抗体の組換え発現のために、宿主細胞は、抗体又はその抗原結合断片の軽鎖及び重鎖の核酸配列を（同じベクター又は別個のベクターに）含むベクター又はベクターのセットを用いて形質転換される。
哺乳動物系における組換えタンパク質の長期的な産生のために、タンパク質を安定的に発現する細胞株を得てもよい。例えば、本明細書に記載される免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコードすることができるヌクレオチド配列を、ウイルス複製起点及び／又は内因性発現エレメント並びに選択又は可視マーカー遺伝子を同じベクター又は別個のベクターに含み得る発現ベクターを使用して、細胞株に形質転換してもよい。本開示は、用いられるベクター又は宿主細胞によって限定されない。本開示のある特定の実施形態において、本明細書に記載の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコードすることができるヌクレオチド配列を、それぞれ、別個の発現ベクター及び別個に発現される各鎖にライゲーションしてもよい。別の実施形態において、本明細書に記載される免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のいずれか１つをコードすることができる軽鎖及び重鎖の両方を、単一の発現ベクターにライゲーションし、同時に発現させてもよい。
ポリペプチドの発現を検出及び測定するための免疫学的方法は、当該技術分野において公知である。かかる技術の例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、又はフローサイトメトリーが挙げられる。当業者は、これらの方法論を本開示に容易に適応させることができる。
翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的なメカニズムを有する様々な宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、及びＷＩ－３８）が市販されており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能であり、発現されたポリペプチドの正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択され得る。
典型的には、抗体又はその抗原結合断片は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞において産生される。
本開示は、抗体又はその抗原結合断片の作製方法であって、本開示の抗体又は抗原結合断片の軽鎖及び重鎖を培養細胞で発現するステップを含む方法に関する。
本方法は、本開示の抗体又は抗原結合断片を精製又は単離するステップをさらに含み得る。本方法は、本開示の抗体又は抗原結合断片を、治療部分又は検出可能部分等のカーゴ分子にコンジュゲートするステップをさらに含み得る。
抗体コンジュゲート
本開示の抗体又はその抗原結合断片は、カーゴ分子に連結されてもよい。カーゴ分子の例示的な実施形態としては、治療部分、検出可能部分、ポリペプチド（例えば、ペプチド、酵素、成長因子）、ポリヌクレオチド、リポソーム、ナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、量子ドット等が挙げられるが、これらに限定されない。
より詳細には、本開示の抗体又はその抗原結合断片は、治療部分とコンジュゲートされてもよい。治療部分は、通常、切断可能な又は切断可能でないリンカーを介して抗体に結合される。
治療部分を列挙すると、細胞毒性剤、細胞分裂阻害剤、抗癌剤（化学療法剤）、及び放射線療法剤（例えば、放射性同位体）が挙げられる。
細胞毒性剤の例示的な実施形態としては、限定されないが、α－アマニチン、クリプトフィシン、デュオカルマジン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、デルクステカン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ドラスタチン、シュードモナスエンドトキシン、リシン、オーリスタチン（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦ）、メイタンシノイド（例えば、メルタンシン）、ピロロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）及び類似体が挙げられる。
放射線療法剤の例示的な実施形態としては、限定されないが、イットリウム－９０、スカンジウム－４７、レニウム－１８６、ヨウ素－１３１、ヨウ素－１２５、及び当業者によって認識される多くの他のもの（例えば、ルテチウム（例えば、Ｌｕ１７７）、ビスマス（例えば、Ｂｉ２１３）、銅（例えば、Ｃｕ６７）、アスタチン－２１１（２１１Ａｔ）、アクチニウム２２５（Ａｃ－２２５）等）が挙げられる。
化学療法剤の例示的な実施形態としては、限定されないが、５－フルオロウラシル、アドリアマイシン、イリノテカン、タキサン、カルボプラチン、シスプラチン等が挙げられる。
本開示の抗体又は抗原結合断片は、検出可能部分と（つまり、検出又は診断目的のために）コンジュゲートされてもよい。
「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、及び／又は他の物理的手段によって検出可能な薬剤を含む。検出可能部分は、当該技術分野で周知の方法を使用して、本開示の抗体及びその抗原結合断片に、直接的及び／又は間接的に（例えば、限定されないが、ＤＯＴＡ又はＮＨＳ結合等の結合を介して）連結され得る。多種多様な検出可能部分を、必要とされる感度、コンジュゲーションの容易性、安定性要件、及び利用可能な計測に応じて選択して、使用することができる。好適な検出可能部分としては、蛍光標識、放射性標識（例えば、限定されないが、１２５Ｉ、Ｉｎ１１１、Ｔｃ９９、Ｉ１３１、及びＰＥＴスキャナ等のための陽電子放出同位体を含む）、核磁気共鳴活性標識、発光標識、化学発光標識、発色団標識、酵素標識（例えば、限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、量子ドット、及び／又はナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能部分は、検出可能なシグナルを誘発及び／又は生成し、それにより、検出可能部分からのシグナルを検出することを可能にする。
キメラ抗原受容体及び他の免疫療法剤
本開示の抗体及びその抗原結合断片の配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、又は他の免疫療法剤、例えば、限定されないが、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）、又は任意の免疫療法化合物を生成するために使用され得る。
本開示のＣＡＲは、例えば、ａ）上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン、ｂ）必要に応じてスペーサー、ｃ）膜貫通ドメイン、ｄ）必要に応じて少なくとも１つの共刺激ドメイン、及びｅ）少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよい。
キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメインを接続するヒンジ領域又はスペーサーを含んでもよい。スペーサーは、細胞の表面における抗原結合ドメインのより良い提示を可能にし得る。
本開示によれば、スペーサーは、任意選択であり得る。代替的に、スペーサーは、例えば、１～２００個のアミノ酸残基、典型的には１０～１００個のアミノ酸残基、より典型的には２５～５０個のアミノ酸残基を含み得る。スペーサーは、ヒトタンパク質に由来するものでもよい。
本開示によれば、スペーサー又はヒンジ領域は、例えば、限定されないが、ＣＤ８ヒンジ（例えば、マウス、ヒトＣＤ８）又はＩｇＧヒンジ（ヒト免疫グロブリンヒンジ）又はそれらの組合せであり得る。
膜貫通ドメインの例示的な実施形態としては、例えば、限定されないが、Ｔ細胞受容体複合体のアルファ、ベータ、又はＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４が挙げられる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８），４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４，２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃの少なくとも膜貫通領域（複数可）を含み得る。
膜貫通ドメインの特定の実施形態は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインである。
共刺激ドメインは、例えば、限定されないが、ＣＤ２８、ＣＤ２７，４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４，２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、Ｎｋｐ４６、及びＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの組合せからのものであり得る。
細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、限定されないが、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲＩＧ）、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲｌｌａ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２からのものであり得る。
分泌経路を標的とするために、キメラ抗原受容体は、シグナルペプチド、例えば、ＣＤ２８のシグナルペプチド又は免疫細胞に好適な任意の他のシグナルペプチドなどを含んでもよい。シグナルペプチドは切断される（切断可能である）。
ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、並びにＴ細胞特異的分子（例えば、ＣＤ３）及びＮＫ細胞表面分子（例えば、ＣＤ１６）を含むが、これらに限定されない、特異的免疫細胞に結合する別のドメイン（ｓｃＦｖ）を含み得る。これらは一般に、可撓性リンカーによってタンデムに連結された複数のｓｃＦｖを含む。
医薬組成物
本開示はまた、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片（コンジュゲートされているもの又はコンジュゲートされていないもの）を含む医薬組成物に関する。
活性成分に加えて、医薬組成物は、限定されないが、水、ＰＢＳ、塩溶液、ゼラチン、油、アルコール、並びに活性化合物の薬学的に使用され得る製剤への処理を容易にする他の賦形剤及び補助剤を含む、薬学的に許容できる担体を含んでもよい。他の例において、そのような調製物は、滅菌されてもよい。
本明細書において、「医薬組成物」は、薬学的に許容できる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体と一緒になった治療有効量の薬剤を意味する。本明細書で使用されるとき、「治療有効量」とは、所与の状態及び投与レジメンに対して治療効果をもたらす量を指す。かかる組成物は、液体、又は、凍結乾燥若しくは他の方法で乾燥された製剤であり、種々のバッファー成分（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ．、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防止するためのアルブミン又はゼラチン等の添加剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）を含む。可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、充填物質又は張度調整剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコール等のポリマーのタンパク質への共有結合、金属イオンとの錯体化、又はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等のポリマー化合物の粒子状調製物中への若しくはその上への又はリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層小胞、赤血球ゴースト、若しくはスフェロプラスト中への若しくはその上への材料の組込み。このような製剤は、物理的状態、溶解度、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、ｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼし得る。制御放出組成物又は徐放性組成物としては、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中の製剤が挙げられる。ポリマー（例えば、ポロキサマー又はポロキサミン）でコーティングされた粒子状組成物も本開示に包含される。本開示の組成物の他の実施形態は、非経口、肺、鼻、口腔、膣、直腸経路を含む様々な投与経路のための、粒子状形態保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤、又は透過促進剤を組み込む。一実施形態では、医薬組成物は、非経口的に、癌近傍（ｐａｒａｃａｎｃｅｒａｌｌｙ）に、経粘膜で、経皮で、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、及び腫瘍内に投与される。
さらに、本明細書で使用される「薬学的に許容できる担体」又は「薬学的担体」は、当該技術分野において公知であり、限定されないが、０．０１～０．１Ｍ又は０．０５Ｍのリン酸バッファー又は０．８％の生理食塩水が挙げられる。加えて、かかる薬学的に許容できる担体は、水性又は非水性の溶液、懸濁液、及びエマルジョンであり得る。非水性溶媒としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びエチルオレエートなど注射用有機エステルが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン、又は懸濁液、例えば生理食塩水及び緩衝化媒体が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補給液、電解質補給液、例えばリンゲルデキストロースベースの補給液などが挙げられる。保存剤及びその他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、コレーティング剤（ｃｏｌｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、及び不活性ガスなどが存在してもよい。
任意の化合物について、治療有効量は、初めに細胞培養アッセイにおいて又はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、若しくはブタなどの動物モデルにおいて推定され得る。また動物モデルを用いて適切な濃度範囲及び投与経路が決定され得る。次いで、そのような情報を用いて、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路が決定され得る。これらの技術は当業者にとって周知であり、治療有効量は、症状又は状態を改善する活性成分の量を指す。治療有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な量）統計及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）統計を計算し、対比させることによって決定され得る。任意の上述の治療組成物は、かかる治療を必要とする、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及びヒトなどの哺乳動物を含むがこれらに限定されない、任意の対象に適用され得る。
本開示で利用される医薬組成物は、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、又は直腸手段を含む任意の数の経路によって投与され得る。
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載の１つ又は複数の抗体又は抗原結合断片又は抗体薬物コンジュゲートを含有するバイアルを含み得るキットに関する。
使用方法
本開示の態様は、抗体又はその抗原結合断片、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ、又はＴｒｉＫＥ分子を、必要とする対象に投与することを含む。
本開示の他の態様は、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ、又はＴｒｉＫＥ分子を発現するように操作された免疫細胞を、必要とする対象に投与することを含む。
本開示のＣＡＲ、ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ又はＴｒｉＫＥ構築物は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍に向けて、遺伝子操作された免疫細胞を再標的化するために使用され得る。
遺伝子操作された免疫細胞は、必要とする対象に投与され得る。
本開示の一態様によれば、免疫細胞は、対象から単離され、ＣＡＲ、ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ又はＴｒｉＫＥ構築物を発現するように操作され、同じ対象に再投与される。
本開示の抗体又はその抗原結合断片は、癌の治療において、非コンジュゲート形態で、又は治療部分とコンジュゲートされて、使用され得る。
より詳細には、本開示の抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用されてもよい。抗体薬物コンジュゲート及び放射免疫コンジュゲートが、かかる目的のために特に企図されている。
本開示は、より具体的には、癌を有するか又は有する疑いがある対象を、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合断片又は抗体薬物コンジュゲートを投与することによって、治療する方法に関する。
抗体又はその抗原結合断片又は抗体薬物コンジュゲートは、医薬組成物として、単独で、又は他の抗癌剤と組み合わせて投与されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、ヒト、及び、動物、例えば非ヒト霊長類、ウシ、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ、鳥類などを包含する。「対象」という用語は、特に、ヒトを包含する。
治療から利益を受けるであろう、必要がある対象は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍細胞を有するヒトを含む。より具体的には、抗体又はその抗原結合断片又は抗体薬物コンジュゲートは、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を有する疑いがある対象に投与され得る。必要とする対象は、癌腫、例えば、乳房、頭頚部、又は口腔由来の癌腫等を有するか又は有する疑いがある対象も包含する。
本開示の目的のための「治療」という用語は、治療的処置と防御的又は予防的処置との両方を指し、目的は、標的とする病理学的状態又は障害を減速させる（減少させる）ことである。治療を必要とする対象には、既に障害を有する対象、障害を有する傾向にある対象、又は障害を予防すべき対象が含まれる。特に、必要とする対象には、１つ又は複数の癌マーカーのレベルが上昇した対象が含まれる。
或いは、本開示の方法を実施するために及び当該技術分野において知られているように、本開示の抗体又は抗原結合断片（コンジュゲートされたもの又はコンジュゲートされていないもの）は、本開示の抗体又は抗原結合断片に特異的に結合することが可能であり、所望の検出可能部分、診断部分又は治療部分を担持し得る第２の分子（例えば、二次抗体等）と組み合わせて使用してもよい。
本開示の抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩの検出を伴うアッセイ又は方法において、非コンジュゲート形態で、又は検出可能部分とコンジュゲートされて、使用されてもよい。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現に関連する癌を有する対象を治療する方法が特に企図されている。かかる方法は、本明細書に開示の抗原結合剤又はかかる抗原結合剤を発現する細胞を投与するステップを含み得る。
例示的な実施形態では、本方法は、抗体－薬物コンジュゲートを投与するステップを含み得る。
別の例示的な実施形態では、本方法は、キメラ抗原受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、二重特異性キラー細胞エンゲージャー、又は三重特異性キラー細胞エンゲージャーを発現する細胞を投与するステップを含み得る。
本開示の別の態様は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを検出するための方法に関し、該方法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞、又はＥＧＦＲｖＩＩＩを含むか又は含む疑いがある試料（生検、血清、血漿、尿等の体液）を、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片と接触させるステップ、及び結合を測定するステップを含み得る。試料は、癌（例えば、多形性膠芽腫又は癌腫）を有し得るか又はかかる癌を有する疑いがある哺乳動物（例えば、ヒト）に由来し得る。試料は、哺乳動物から得られた組織試料又は細胞培養上清であってよい。
本開示によれば、試料は、哺乳動物から得られた血清試料、血漿試料、血液試料、又は腹水であり得る。
本開示のさらなる範囲、適用性、及び利点は、以下に示す非限定的な詳細な説明から明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明は、添付の図面を参照して、本開示の例示的な実施形態を示す一方で、例としてのみ与えられていることが理解されるべきである。
実施例１：ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的モノクローナル抗体の生成
ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、組換えタンパク質の細胞外ドメインを用いてマウスを免疫化することによって生成した。
免疫化
マウスを出血させ（免疫前血清）、０日目にＴＩＴＥＲＭＡＸ（商標）アジュバント（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）中、及び２２日目にＰＢＳ中にアジュバント無しで乳化した１００μｇの組換えＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を、腹腔内及び皮下に注射した。２９日目にマイクロベットＣＢ３００Ｚ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ）で血液を収集し、さらなる使用まで－２０℃で血清を保管した。
ＥＬＩＳＡ（血清価測定）
動物の免疫前及び免疫後の血清価を、組換えＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に対するＥＬＩＳＡによって評価した。特に明記しない限り、全てのインキュベーションは室温で実施した。簡潔に述べると、ハーフエリア９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３６９０）を、１ウェル当たり２５μｌのＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの免疫原でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。マイクロプレートをＰＢＳ中で３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ａ７０３０）を含むＰＢＳで３０分間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを除去し、２５μｌの血清試料の連続希釈液を添加した。２時間のインキュベーション後、マイクロプレートを０，０５％のＰＢＳ－ＴＷＥＥＮ（商標）２０で４回洗浄し、２５μｌのブロッキングバッファー中１／５，０００希釈アルカリホスファターゼコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ、＃１１５－０５６－０６２、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）を添加した。１時間のインキュベーション後、マイクロプレートを４回洗浄し、２５μｌのｐＨ９．６の炭酸バッファー中１ｍｇ／ｍＬのｐ－ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｃｏ．、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）を添加し、さらに３０分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ ＰＣプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、４０５ｎｍで吸光度を読み取った。全ての免疫前出血は陰性であり、全ての免疫後出血は、組換えタンパク質に対して非常に強力（力価が１／５１２００を上回る）であった。
ハイブリドーマの生成
マウスに１００μｇの組換えＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の最終ブーストを受けさせ、その脾臓を３～４日後に採取した。全ての操作は、無菌条件下で行った。脾臓細胞を、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＩＭＤＭ、Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．＃３１９８０－０３０）中に採取し、電気融合プロトコルを使用してＮＳ０骨髄腫細胞株に融合した。
脾細胞及び骨髄腫細胞をＩＭＤＭ中で別々に洗浄した。細胞を、等浸透圧バッファー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃａｔ＃４３０８０７０５３６）、次いで細胞融合培地Ｃ（ＢＴＸ ｃａｔ＃４７－０００１）で洗浄した。骨髄腫及びリンパ球を１：１の比率で混合し、製造業者の指示に従ってＥＣＭ２００１細胞融合システム（ＢＴＸ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を使用して融合した。
融合後、細胞を、ＨＡＴ選択培地（２０％熱不活性化ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ｐ７５３９）、１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃５７５７０６）、ＨＡＴ培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ｈ０２６２）及びＬ－グルタミン（Ｈｙ－Ｃｌｏｎｅ Ｃａｔ＃ＳＨ３００３４．０１）を含有するＩＭＤＭ）中１ｍＬ当たり２～４×１０５インプット骨髄腫細胞の濃度で懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。翌日、ハイブリドーマ細胞を洗浄し、５％熱不活性化ＦＢＳ、１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－６、及び１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ－Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃガンマ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＃１１５－０９６－０７１）を補足した半固体培地Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ．＃０３８０４）中１ｍｌ当たり２～５×１０５インプット骨髄腫細胞の濃度で懸濁した。細胞混合物をＯｍｎｉｔｒａｙディッシュ（Ｎｕｎｃ ｃａｔ＃２４２８１１）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で６～７日間さらにインキュベートした。次いで、蛍光分泌クローンを、哺乳動物細胞クローンピッカー（ＣｌｏｎｅｐｉｘＦＬ（商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、２０％熱不活性化ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、１ｎｇ／ｍＬマウスＩＬ－６、ＨＴ培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ ＃ Ｈ０１３７）及びＬ－グルタミンが補足された２００μＬのＩＭＤＭを含有する滅菌９６－ｗプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３５９５）に移し、３７℃、５％ＣＯ２で２～３日間インキュベートした。
７回の融合実験からの５，０００ハイブリドーマの上清を、組換えＥＧＦＲｖＩＩＩ又はＥＧＦＲ野生型タンパク質を使用してＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、特異的結合剤を検出した。この目的のために、ハーフエリア９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６９０）を、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌで１ウェル当たり２５μｌの免疫原でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。マイクロプレートをＰＢＳ中で３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ａ７０３０）を含むＰＢＳで３０分間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを除去し、２５μｌのハイブリドーマ上清を添加した。２時間のインキュベーション後、マイクロプレートを０，０５％のＰＢＳ－ＴＷＥＥＮ（商標）２０で４回洗浄し、２５μｌの１／５，０００希釈アルカリホスファターゼコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的、＃１１５－０５６－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）を添加した。１時間のインキュベーション後、マイクロプレートを４回洗浄し、２５μｌのｐＨ９．６の炭酸バッファー中１ｍｇ／ｍＬのｐ－ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｃｏ．、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）を添加し、３７℃で１時間さらにインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ 、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、４０５ｎｍで吸光度を読み取った。
ＥＬＩＳＡ陽性抗体を選択し、ｗｔ ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するＵ８７ＭＧ細胞に対するフローサイトメトリーによってさらに特性決定して、それらの特異性を確認した。この目的のために、各陽性クローンから１５ｍｌの上清を作製した。
実施例２：フローサイトメトリーによる細胞表面結合
野生型ＥＧＦＲ（Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲ ｗｔ又はＵ８７ ＷＴ）を過剰発現するヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ、及びＥＧＦＲｖＩＩＩ変異を過剰発現するＵ８７ＭＧ（ＥＧＦＲのΔ２～７欠失変異；Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はＵ８７ｖＩＩＩ）に対するフローサイトメトリーによって、実施例１で選択した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体の結合特性を評価した。
簡単に述べると、全長ｗｔ ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現する細胞を、Ｗ． Ｃａｖａｎｅｅの研究所（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から入手した。細胞を、１０％ＦＢＳ及び４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ高グルコース培地中で増殖させた。分析に先立ち、細胞を、分析日に８０％コンフルエントを超えないようにして播種し、ＰＢＳ中で洗浄し、細胞解離バッファー（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって回収した。遠心分離後、細胞を２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で完全培地中に再懸濁した。５０μＬ／ウェルの細胞をポリプロピレンｖ底９６ウェルプレート中に分布させ、等体積のハイブリドーマ上清を添加し、２時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって２回洗浄し、ＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウス抗体（Ｆｃ特異的、＃１１５－０９６－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）と共にさらに１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウムを含有する培地中に再懸濁して、分析から死細胞を除外した。試料を、６０μｍのナイロンメッシュフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｒｅｌａｎｄ）に通して濾過し、細胞凝集塊を除去した。フローサイトメトリー分析は、製造業者の指示に従って、ＢＤ－ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）取得ソフトウェアを使用した標準フィルターセットを用いて、前方散乱パラメータ、側方散乱パラメータ及びヨウ化プロピジウム色素除外でゲートされた２，０００個の生存単細胞事象に対して実施した。
細胞を、陰性対照抗ＧＦＰ ３Ｅ６ ｍＡｂ上清（白抜きヒストグラム）又は試験したハイブリドーマ上清（灰色ヒストグラム）のいずれかで染色した。特異的結合は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＵ８７細胞には結合するが、ｗｔ ＥＧＦＲを発現する細胞には結合しない抗体の平均蛍光強度の増加によって反映した。
７つの独立した融合実験からの結合抗体に基づく３６個の陽性細胞のうち、ＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現Ｕ８７ＭＧ細胞に対して結合が特異的であることが見出された５Ｇ６（図１Ａ）、１Ａ８（図１Ｂ）、４Ｂ３（図１Ｃ）、４Ｅ１１（図１Ｄ）、５Ｄ８（図１Ｅ）、９Ｃ９（図１Ｆ）、１１Ｂ１（図１Ｇ）、１１Ｃ８（図１Ｈ）及び１１Ｈ３（図１Ｉ）を含む９つのハイブリドーマ上清を、さらに研究するために選択した。図１Ｊに示すように、ＥＧＦＲ ＷＴ及びＥＧＦＲ ｖＩＩＩの両方に結合することができる２２５ｍＡｂ（ＡＴＣＣ ＨＢ－８５０８）を陽性対照ｍＡｂに使用した。図１Ｋに示すように、ｖＩＩＩアイソフォームに特異的に結合する陽性対照組換えｍＡｂとして、１３．１．２抗体を作製して使用した。
実施例３：精製された変性抗原に対する結合の評価
モノクローナル抗体が立体構造エピトープに結合するかどうかを評価するために、天然及び変性組換え体である、ヒト野生型ＥＧＦＲタンパク質及びＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に対してＥＬＩＳＡ分析を行った。対照として、ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異に特異的である１３．１．２抗体（Ｈａｍｂｌｅｔｔ Ｋ．Ｊら、２０１５、米国特許第７，７３６，６４４号）、及びｗｔ ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を認識するマウスｍＡｂである２２５抗体を使用した（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ Ｊら、２０１５、米国特許第４，９４３，５３３号、Ｓａｔｏ Ｊ．Ｄ．ら、１９８３）。
１～２ｍｇ／ｍＬの抗原を、終濃度４０ｍＭのＤＴＴを含有するＰＢＳ中、９５℃で５分間インキュベートした。次いで、それらを氷上で５分間インキュベートし、ＥＬＩＳＡ目的のために最終コーティング濃度で希釈した。
ｍＡｂを、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ＨＰ １ｍＬカラムＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃａｔ＃１７－０４０４－０１を使用して精製し、ＰＢＳ中で予め平衡化したＺｅｂａ－ｓｐｉｎ脱塩カラム５ｍＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して脱塩し、０．２２μＭ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してフィルター滅菌した。抗体溶液の終濃度を、ＩｇＧを試料型として用いて、Ｎａｎｏ－ｄｒｏｐ２０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。ＥＬＩＳＡは、２５μｌのｍＡｂ上清を使用して（実験１）又は精製されたｍＡｂを１μｇ／ｍｌで使用して（実験２）、上記のように行った（血清価測定）。
表１に、天然条件又は変性条件下で組換えＥＧＦＲｖＩＩＩ又はｗｔ ＥＧＦＲに対して評価した異なるｍＡｂクローンのＥＬＩＳＡ結果（ｎ＝２）を示す。予想されるように、２２５抗体は、天然条件下でのみｗｔ ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの両方に結合する。１３．１．２抗体は、天然及び変性コンフォメーションのＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するが、天然又は変性されたＥＧＦＲ野生型には結合しない。本発明者らの免疫スキームによって生成されたモノクローナル抗体は、天然及び変性コンフォメーションのＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。留意すべきことに、本発明者らの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体のいくつか（４Ｂ３、４Ｅ１１、５Ｄ８及び９Ｃ９）は、ｗｔ ＥＧＦＲ天然抗原に対して陽性であったが、これらは、実施例２で実証されるように、ｗｔ ＥＧＦＲを過剰発現するＵ８７ＭＧには結合しなかった。
Figure 2022528368000003
実施例４：内在化のための抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂの評価
精製した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体を、抗マウスＦｃ二次抗体がｐＨｒｏｄｏ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたサロゲートアッセイを用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に内在化する能力について評価した。これらのｐＨ感受性色素を使用して、エンドソーム及びリソソームの低ｐＨ環境での増強された蛍光により、生細胞内のエンドサイトーシスを特異的に検出することができる。
その趣旨で、ヒトＥＧＦＲ ＷＴ又はＥＧＦＲ ｖＩＩＩ変異を過剰発現する膠芽腫Ｕ８７－ＭＧ細胞を用いた。全体的に、細胞は、週に１回又は２回継代し、全ての実験について４～６週間以内に使用した。Ｕ８７ＭＧ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３７２１）に１２，５００細胞／ウェルの密度で１００μｌ培地中に播種した。翌日、２０ｎＭでの一次マウス抗体（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体）を、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と化学的にコンジュゲートした３０ｎＭの抗マウス二次抗体と共に３０分間プレインキュベートした。ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄは、ｐＨ感受性色素であり、中性ｐＨではほとんど非蛍光性であり、内在化されると酸性環境で明るく蛍光する。細胞培養培地を５０μｌの新鮮な培地に置き換え、５０μｌの抗体複合体を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後に、その蛍光を測定した。一次抗体無し（二次抗体単独）での又は無関係な一次抗体（対照マウスＩｇＧ若しくは抗ＧＦＰ ｍＡｂ）を用いたインキュベーションを使用して、非標的内在化を評価した。マイクロプレートをＥｘｃ５６０ｎｍ／Ｅｍ５９０ｎｍ（５ｎｍの帯域幅）で読み取り、データをブランク減算した。
表２は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ型又は野生型ＥＧＦＲ過剰発現Ｕ８７ＭＧ細胞における抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体のサロゲート抗体内在化の結果を示す。結果は、式Ｉに従って計算した、２２５抗体陽性対照（ｗｔ ＥＧＦＲ抗原とＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原の両方に結合することができる野生型ＥＧＦＲ内在化ｍＡｂ）と比較した、相対的蛍光単位（ＲＦＵ）のパーセンテージとして表される：
％内在化＝ＲＦＵ試験ｍＡｂ／ＲＦＵ２２５ｍＡｂ×１００（式Ｉ）
ｍＡｂの選択されたパネルは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現Ｕ８７ＭＧ細胞と共にインキュベートしたとき有意な内在化を示したが、ｗｔ ＥＧＦＲ過剰発現細胞における内在化は示さなかった。
Figure 2022528368000004
さらなる分析のために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現細胞における二次コンジュゲートｐＨｒｏｄｏベースの内在化スクリーニングにおいて内在化能を示すが、ＥＧＦＲ－ＷＴ過剰発現細胞においては示さない抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体を選択した。
実施例５：抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）ポテンシャルの機能的特性決定
精製した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体を、抗マウスＦｃ二次抗体が非切断性リンカーを介してＤＭ１メイタンシン薬物に連結されたサロゲートアッセイを使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞における増殖阻害を引き起こす能力について評価した。内在化されると、リソソーム内のリンカー異化反応により、微小管を不安定化して、増殖阻害を引き起こす活性ＤＭ１薬物が放出される。ｗｔ ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞株を使用した。全体的に、細胞は、週に１回又は２回継代し、全ての実験について４～６週間以内に使用した。
Ｕ８７ＭＧ細胞（ＥＧＦＲ ＷＴ又はＥＧＦＲｖＩＩＩ）を前日に２，０００細胞／１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３９１７）に播種した。１ｎＭの一次マウス抗体（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体）を、細胞死を引き起こすために内在化される必要があるチューブリン阻害剤のメイタンシン（ＤＭ１）と化学的にコンジュゲートした１．５ｎＭの抗マウス二次抗体と共に３０分間プレインキュベートした。次に、抗体複合体を、示された細胞に添加し、３７℃で５日間インキュベートした後、細胞生存率に対するそれらの効果を測定した。一次抗体無し（二次抗体単独）での又は無関係な一次抗体（対照マウスＩｇＧ若しくは３Ｅ６抗ＧＦＰ ｍＡｂ）を用いたインキュベーションを使用して、非標的化細胞毒性を評価した。代謝活性細胞の存在をシグナルで示す、各ウェルに存在するＡＴＰの定量に基づいて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、細胞生存率を測定した。シグナル出力を、０．１秒の積分時間で設定された発光プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。積分時間は、高ＡＴＰ濃度でのシグナル飽和を最小化するように調節する。
相対発光単位（ＲＬＵ）として表されるデータは、マウスＩｇＧ対照ウェルに対して正規化され、式ＩＩに従って計算される、マウスＩｇＧと比較した生存％として表される：
生存％＝ＲＬＵ ｍＡｂ／ＲＬＵマウスＩｇＧ×１００（式ＩＩ）
ＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現細胞における二次コンジュゲートＤＭ１ベースの細胞毒性スクリーニングにおいて高い効力を示すが、ＥＧＦＲ－ＷＴ過剰発現細胞においては示さないｍＡｂを選択した。
表３は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はｗｔ ＥＧＦＲ過剰発現Ｕ８７ＭＧ細胞における抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体のＡＤＣサロゲートスクリーニングアッセイの結果を示す。結果は、非特異的マウスＩｇＧ対照の生存パーセンテージ（１００％に設定）と比較した生存パーセンテージとして表す。試験した抗体は、ＥＧＦＲ野生型過剰発現細胞と比較して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現細胞における生存の有意な低下（＞１５％）を引き起こすことが示された。予想されるように、２２５抗体陽性対照は、両方の細胞株において細胞毒性を引き起こす。
Figure 2022528368000005
試験した３６個の一次マウスｍＡｂの中から選択したこれらの抗体に関連する細胞毒性の程度は、これらの抗体が、ＤＭ１又はＭＭＡＥ薬物の活性化を達成するために高い程度の内在化及び適切な細胞内経路を示すことを実証し、これらの抗体がＡＤＣの開発に適していることを示す。したがって、サロゲートＡＤＣアッセイにおいて細胞毒性を示したｍＡｂを、ＤＭ１又はＭＭＡＥへの直接コンジュゲーションのために選択した。
選択されたハイブリドーマを、希釈を制限することによって再クローニングして、それらの単クローン性を確保した。
実施例６：マウスモノクローナルｍＡｂのＤＭ１コンジュゲーション及びＡＤＣ試験
実施例３で精製した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体を、リジン残基を介して、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－メイタンシン（ＤＭ１）に結合したスクシンイミジルｔｒａｎｓ－４－［マレイミジルメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）に、又は還元された鎖間システイン残基を介して、カテプシン切断可能リンカー（バリン－シトルリン）モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）にコンジュゲートした。生成物の純度及び薬物：抗体比を、ＵＰＬＣベースのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した。
コンジュゲーションのために、予め平衡化したスピン脱塩カラムを使用して、精製した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体（５Ｇ６ １Ａ８、４Ｂ３、４Ｅ１１、５Ｄ８、９Ｃ９、１１Ｂ１、１１Ｃ８、１１Ｈ３；実施例３）を、コンジュゲーションバッファー（１００ｍＭのホスフェートナトリウム、２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ７．２）にバッファー交換した。各モノクローナル抗体の濃度をコンジュゲーションバッファーで２ｍｇ／ｍＬに調整し、それぞれの合計２００μｇをコンジュゲーションに使用した。ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中でＳＭＣＣ－ＤＭ１のストック溶液を調製した。ＤＭＡストック溶液からのＳＭＣＣ－ＤＭ１を各モノクローナル抗体に添加して、ＳＭＣＣ－ＤＭ１：ｍＡｂモル比１０．０を達成した。溶液を完全に混合し、３７℃で３時間インキュベートした。０．０２％ ｗ／ｖのポリソルベート－２０を添加したコンジュゲーションバッファーで平衡化させた２つのスピン脱塩カラムに反応混合物を通すことによって、反応を停止させた。
ＡＤＣを、適切な薬物－抗体比（ＤＡＲ）範囲（概して３～５の薬物／抗体）及びモノマー純度（分析ＳＥＣを使用して＞９５％のモノマー含有量）について選択した。ＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムから２８０ｎｍ及び２５２ｎｍの両方で単量体ピークを積分し、これらを非コンジュゲート抗体及び遊離薬物の同一波長における吸光係数の比と比較することによって、ＤＡＲを決定した。クロマトグラムで観察されたモノマー種、高分子量種及び低分子量種の合計積分面積から、モノマーの割合％を測定した。これらのＤＭ－１コンジュゲートＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖阻害効力結果を、表４に示す。具体的には、ＥＧＦＲ ＷＴ又はＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するＵ８７ＭＧ細胞の生存能に対する、上記で調製した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣの効果について試験した。５日間の曝露後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ試薬を使用して細胞増殖／生存率を評価し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０ソフトウェアからのｌｏｇ（阻害剤）対応答－変数勾配（４パラメータ）モデルを使用して、それらの効力（ＩＣ５０）及び有効性（％最大阻害）を測定する用量応答曲線を生成した。
試験したＤＭ１コンジュゲート抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は全て、非標的化無関係抗ＧＦＰマウスＩｇＧ－ＤＭ１コンジュゲート陰性対照と比較して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現Ｕ８７ＭＧ細胞に対する良好な有効性（最大増殖阻害率７６～９７％）及び強力な効力（（ＩＣ５０＜０．３７～４．１ｎＭ）を示した（表４）。さらに、この効果は、ＥＧＦＲｗｔ Ｕ８７ＭＧ発現細胞（ＩＣ５０範囲＝１５～３０ｎＭ）で見られた活性と無関係ＡＤＣ対照（ＩＣ５０～２５ｎＭ）で見られた活性とに有意差がなかったため、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に特異的であった。
Figure 2022528368000006
実施例７：フローサイトメトリーによる見かけの親和性の評価
精製された抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体を、ｖＩＩＩ又はｗｔ ＥＧＦＲを過剰発現するＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞株を用いて、用量依存性結合曲線におけるフローサイトメトリーによって結合活性を評価した。
分析に先立ち、細胞を、分析日に８０％コンフルエントを超えないように播種した。特に明記しない限り、全ての培地は４℃で維持し、全てのインキュベーションは湿った氷上で実施する。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、細胞解離バッファー（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって回収し、遠心分離し、細胞密度２×１０６細胞／ｍＬで完全培地中に再懸濁した。５０μＬ／ウェルの細胞をポリプロピレンｖ底９６ウェルプレート中に分布させ、１００ｎＭから始まる精製ｍＡｂの１／３段階希釈物を添加し、２時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって２回洗浄し、ＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウス抗体（Ｆｃ特異的、＃１１５－０９６－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）と共にさらに１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウムを含有する培地中に再懸濁して、分析から死細胞を除外した。試料を６０μｍのナイロンメッシュフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｒｅｌａｎｄ）に通して濾過し、細胞凝集塊を除去した。フローサイトメトリー分析は、製造業者の指示に従って、ＢＤ－ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）取得ソフトウェアを使用した標準フィルターセットを用いて、前方散乱パラメータ、側方散乱パラメータ及びヨウ化プロピジウム色素除外でゲートされた２，０００個の生存単細胞事象に対して実施した。
抗体結合の特異的検出は、マウスＩｇＧ対照の結合の平均蛍光強度のバックグラウンドレベル減算後の各一次抗体への結合の平均蛍光強度として計算した。試験した各ｍＡｂについて、Ｂｍａｘ（最大特異的結合）及びＫｄａｐｐ（平衡での半数最大結合（ｈａｌｆ－ｍａｘｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ）を達成するために必要な濃度）を決定するために、Ｈｉｌｌ勾配非線形回帰曲線適合モデルとの一部位特異的結合を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０ソフトウェアでデータを分析した。使用したモデルは、式ＩＩＩに従った：
Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘｈ／（Ｋｄｈ＋Ｘｈ）（式ＩＩＩ）
Ｂｍａｘは、Ｙと同じ単位で、最大特異的結合である。
Ｋｄは、Ｘと同じ単位で表される、平衡での半数最大結合を達成するために必要なリガンド濃度である。
変数「ｈ」は、ｈｉｌｌ勾配である。
図２は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体の細胞表面発現ＥＧＦＲｖＩＩＩ（図２Ａ及び図２Ｃ）又はｗｔ ＥＧＦＲ（図２Ｂ及び図２Ｄ）への結合特性を決定するフローサイトメトリー実験の結果を示す。２２５は、野生型及びｖＩＩＩ変異体ＥＧＦＲの両方に結合するマウスｍＡｂであり、両方の細胞株の陽性対照として使用される。全ての抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂは、ＥＧＦＲｖＩＩＩバリアントを過剰発現する細胞への強力かつ同等の結合を示し（図２Ａ及び図２Ｃ）、野生型ＥＧＦＲを過剰発現する細胞への検出可能な結合（ｎｄｂ）は示さなかった（図２Ｂ及び図２Ｄ）。９Ｃ９（データ示さず）を除いて、全てのモノクローナル抗体は、フローサイトメトリー分析においてＥＧＦＲ ｖＩＩＩバリアントを過剰発現する細胞に対して、低ｎＭ親和性で結合する（表５）。
Figure 2022528368000007
実施例８．フローサイトメトリー競合によるエピトープビニング
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体が同じエピトープ領域に結合するかどうかを評価するために、Ｕ８７ＭＧ－ｖＩＩＩ細胞に対してフローサイトメトリー競合実験を行った。
その趣旨で、精製したモノクローナル抗体４Ｅ１１及び１３．１．２を、製造業者の説明書に従って、ＮＨＳエステル誘導体を使用してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光色素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）にコンジュゲートした。
固定濃度の標識ｍＡｂ（１～１０ｎＭ）を、増加した濃度（又は１０倍濃度）の本発明者らの非標識モノクローナル抗体と共にインキュベートし、非標識ｍＡｂの存在下でそれらの結合能力が損なわれるかどうかを評価した。
表６に示される結果から、選択された抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体は、２つのプロトタイプ抗体の結合によって分類される２つの主要なエピトープ領域に該当することが分かる：１）ビン１抗体は、抗体５Ｇ６、１Ａ８、１１Ｂ１、１１Ｃ８及び１１Ｈ３を含む標識１３．１．２と競合することが見出され、２）ビン２抗体は、抗体４Ｂ３及び５Ｄ８を含む標識４Ｅ１１抗体と競合することが見出された。抗体９Ｃ９の親和性は低く、この実験では標識ｍＡｂのいずれとも競合しなかった。
Figure 2022528368000008
実施例９．酵母表面ディスプレイによるエピトープマッピング
酵母表面ディスプレイ法（Ｆｅｌｄｈａｕｓ ＭＪら、２００３ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｆｅｂ；２１（２）：１６３－７０）を使用して、本発明者らの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体のエピトープをマッピングした。この技術は、選択したクローニングされたタンパク質又はペプチドを発現させ、細胞壁への共有結合を介して細胞表面にディスプレイすることを可能にする。ディスプレイされたタンパク質／ペプチドは、抗体結合について調べることができる。
１０～４１４アミノ酸残基の様々なサイズの合計３６種の異なるｈＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を、ｐＰＮＬ６ベクター（Ｔｈｅ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡから入手）にクローニングして融合タンパク質として発現させ、Ａｇａ２－ＨＡ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＹＣとしてディスプレイさせた。ディスプレイされたｈＥＧＦＲｖＩＩＩ断片を使用して、各抗ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂの結合に必要な最小断片を特定した。
酵母細胞表面に発現した融合タンパク質への抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂの結合の評価は、フローサイトメトリー分析によって行った。簡潔に述べると、酵母細胞を、抗ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂ及びニワトリ抗Ｍｙｃ抗体の両方で標識し、後者を使用して融合タンパク質の発現レベルをモニターした。洗浄ステップに続いて、一次抗体の結合を、マウス抗体及びニワトリ抗体にそれぞれ特異的な二次抗体を使用した二色間接蛍光標識によってプローブする。
抗ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂは、全長ｈＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質及び同じタンパク質の小さなペプチドの両方、並びに天然及び熱変性酵母提示抗原断片の両方に同様のシグナル強度で結合し、これらのｍＡｂのエピトープが連続ペプチド断片（線状）内に含まれることが示唆された。
図４Ａ及び図４Ｂは、酵母細胞上に表示されるｈＥＧＦＲｖＩＩＩ及びｗｔ ＥＧＦＲタンパク質の種々の断片に対する、抗ｈＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体の結合特性の結果を示す。
表７は、それぞれの抗ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂ結合に必要な最小断片（ペプチド）を示す。４つの異なるエピトープビンが同定された：１）１１Ｂ１，１１Ｃ８（Ｈ５）及び１１Ｈ３並びに１３．１．２対照ｍＡｂによって認識されるａａ１－１８、２）５Ｇ６及び１Ａ８によって認識されるａａ３－１８、３）４Ｂ３、５Ｄ８及び９Ｃ９によって認識されるａａ１５－３７、並びに４）４Ｅ１１によって認識されるａａ１９－３７。Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲ ＷＴ発現細胞に対する結合がないにもかかわらず、４Ｅ１１は、ＥＧＦＲ ＷＴ断片２６６－４８２及び１－６２３を発現するように操作された酵母細胞に結合した（図４Ａ及び図４Ｂ）。
Figure 2022528368000009
実施例１０．酵母表面ディスプレイを使用した精密なエピトープ
ＥＧＦＲｖＩＩＩ １５－３７領域内のｍＡｂエピトープをさらに特性決定するために、この領域のアラニンスキャンを行い、修飾断片を酵母の表面で発現させた。配列番号６のアミノ酸は、ＥＧＦＲｖＩＩＩの元のＡｌａ１９及びＡｌａ２２に対応するアミノ酸残基５及び８を除き、全てアラニンに変異させた。得られたペプチドを酵母の表面で発現させ、各抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＡｂを、フローサイトメトリー分析によって、対応する酵母変異株に対して試験した。したがって、このアッセイは、モノクローナル抗体結合における各アミノ酸（複数可）の寄与を決定した。表８は、４Ｂ３、５Ｄ８、９Ｃ９及び４Ｅ１１のモノクローナル抗体についてのフローサイトメトリー分析で得られた結果を示す。得られた結果は、表７に示される先の結果と一致しており、つまり、ビン１５～３７におけるｍＡｂの結合は、１５位と１９位との間の１つのＡＡの変異によって強く阻害される。
ｍＡｂ ４Ｂ３及びｍＡｂ ５Ｄ８の結合はいずれも、アミノ酸残基Ａｒｇ１８、Ｃｙｓ２０、Ｇｌｙ２１、又はＣｙｓ３５のいずれかの変異によって消失し、Ｇｌｙ３１のアラニンへの変異によって弱められる。ｍＡｂ ５Ｄ８の結合は、Ｇｌｕ２６のアラニンへの変異によって弱められる。９Ｃ９結合は、Ｃｙｓ１６、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｙ３１、Ｖａｌ３２、Ａｒｇ３３、Ｌｙｓ３４、Ｃｙｓ３５又はＬｙｓ３６のいずれかの変異によって損なわれ、Ｃｙｓ２０又はＡｓｐ３０のアラニンへの変異によって弱められる。４Ｅ１１結合は、Ｃｙｓ２０、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ３０、Ｇｌｙ３１、Ａｒｇ３３又はＣｙｓ３５のいずれかの変異によって強く阻害され、Ａｓｐ２３又はＶａｌ３２のアラニンへの変異によって弱められる。これらの結果に基づくと、アミノ酸残基Ｃｙｓ２０及びＣｙｓ３５は、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸残基１５～３７を標的とする抗体の結合にとって重要であると思われる。
Figure 2022528368000010
Figure 2022528368000011
説明
０％～１５％の値：結合無し
１６％～５９％の値：部分的な結合
６０％以上の値：完全な結合
実施例１１：抗体配列決定
実施例２～５の１３個の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインの配列を分析した。
簡潔に述べると、総ＲＮＡをハイブリドーマクローン（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮＥａｓｙ）から抽出し、ｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に逆転写した。ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡを、ＦＲ１でアニーリングする縮重フォワードプライマー及びＣＨ１でアニーリングする単一リバースプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ カタログ番号６９８３１－３）の混合物を使用してＰＣＲ増幅した（Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ又は同等物）。得られたアンプリコンを、ＡＢＩ ３７３０ｘｌ機器上でＳａｎｇｅｒ法を用いて配列決定するか、又はＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器上で２×２５０ｂｐリードを使用して決定した。
ＶＨドメイン及びＶＬドメイン並びにＣＤＲ領域の配列を配列表に示す。ＣＤＲは軽鎖可変領域又は重鎖可変領域アミノ酸配列において、全体的に太字で示している。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ１～３領域のコンセンサス結合配列についての配列の分析を、Ｋａｂａｔ付番スキームを用いて行った（Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００４）。結果は、１１Ｂ１、１１Ｃ８及び１１Ｈ３モノクローナル抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域の両方のＣＤＲ領域が同一であることを示した。１１Ｂ１と１１Ｃ８の間にはＶＨに１個のアミノ酸の違いがあり（ＦＲ２領域）、１１Ｃ８と１１Ｈ３の間にはＶＨに１個のアミノ酸の違いがあり（ＦＲ３領域）、１１Ｂ１と１１Ｈ３の間には２個のアミノ酸の違いがある（ＦＲ２及びＦＲ３）。これらの抗体は一緒にクラスター化され、断片１～１８内の共通の線状エピトープを認識する（表７）。
１１Ｂ１（配列番号７７）、１１Ｃ８（配列番号９２）、及び１１Ｈ３（配列番号１０２）の重鎖可変領域間のアラインメントを図５Ａに示す。このアラインメントから得られたコンセンサスを、配列番号１１７に示す。１１Ｂ１（配列番号６７）、１１Ｃ８（配列番号８２）、及び１１Ｈ３（配列番号９７）の軽鎖は同一である。
４Ｂ３及び５Ｄ８は、同一のＶＬ ＣＤＲを有し、ＦＲ１において２個のアミノ酸の違いがあり、ＦＲ４において１個のアミノ酸の違いがある。これらは、同様のＶＨ ＣＤＲを有し、ＣＤＲＨ１に１つのアミノ酸の違い、ＣＤＲＨ２に１つのアミノ酸の違い、並びにＦＲ１及びＦＲ３のそれぞれに１つのアミノ酸の違いを有する。これらは共に、表８に示されるように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ上の同じエピトープに結合する。
４Ｂ３（配列番号２７）軽鎖可変領域と５Ｄ８（配列番号４７）軽鎖可変領域との間のアラインメントを、図５Ｂに示す。このアラインメントから得られたコンセンサスを、配列番号１１５に示す。４Ｂ３（配列番号３２）重鎖可変領域と５Ｄ８（配列番号５２）重鎖可変領域とのアラインメントを、図５Ｃに示す。このアラインメントから得られたコンセンサスを、配列番号１１６に示す。
９Ｃ９は、４Ｂ３及び５Ｄ８と同様のＶＬ（ＣＤＲＨ１において１個のアミノ酸の違い、ＦＲ３及びＦＲ４において４個の他のアミノ酸の違い）及び特有のＶＨを有し、特有のエピトープに結合する（表８）。
４Ｂ３（配列番号２７）、５Ｄ８（配列番号４７）、及び９Ｃ９（配列番号５７）の軽鎖可変領域間のアラインメントを、図５Ｄに示す。このアラインメントから得られたコンセンサスを、配列番号１１８に示す。
配列分析により、クローン１１Ｂ１が、ドミナントであるもの（配列番号６７に示される可変領域）と、低い存在量の転写産物（配列番号７２）との２つの軽鎖を発現することも明らかになった。同様に、クローン１１Ｃ８は、ドミナント（配列番号８２）と、低い存在量の転写産物（配列番号８７）との２つの軽鎖を発現する。クローン１１Ｇ８及び１１Ｈ５も、これら２つの転写産物を発現する（データ示さず）。
配列分析により、クローン５Ｇ６、１Ａ８及び４Ｅ１１が特有のＶＨ ＣＤＲ及びＶＬ ＣＤＲを有することが明らかになった。
実施例１２：抗体の作製と精製
大規模な抗体産生、及び産生間の一貫性を促進するために、実施例１１で特定した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体を、ＣＨＯ細胞内で組換えて産生した。
ＶＨ領域及びＶＬ領域を、ヒトＩｇＧ１定常領域（それぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ軽鎖）との融合物としてｐＴＴ５ベクター内にクローニングし、それによってキメラ抗体を生成した。
キメラ抗体ｈＦＣ－５Ｇ６、ｈＦＣ－４Ｅ１１及びｈＦＣ－１３．１．２のアミノ酸配列を、配列表に示す。全ての軽鎖配列は、Ｎ末端にシグナル配列ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧ（配列番号１１３）を含み、一方、重鎖配列は、Ｎ末端にシグナル配列ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＴＨＡ（配列番号１１４）を含む。
キメラ抗体の発現は、２ｍＬの発現スカウトを介して検証した。簡潔に述べると、ＣＨＯ細胞を、ＶＬ及びＶＨ含有構築物（１：１比）で一過性にトランスフェクトし、７日目に条件培地（ＣＭ）を採取し、キメラ抗体発現レベルをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価した（データ示さず）。キメラ抗体は良好に発現し、同じ構築比でＣＨＯ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって、小規模産生（５０ｍＬ）を開始した。７日目に条件培地（ＣＭ）を採取し、キメラ抗体を精製し（ＰｒｏｔＡ）、定量化し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価した。データは、４つ全てのキメラ抗体が、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞によって良好に発現されたことを示した。
組換え発現キメラ抗体がハイブリドーマ発現モノクローナル抗体と同様に挙動することを確認するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現Ｕ８７ＭＧに対するフローサイトメトリー結合実験を行い、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合が損なわれていないことを確かめた。さらに、結合及びＡＤＣ活性を、Ｃｅｌｌｔｈｅｒ Ｐｏｌｓｋａ（カタログ番号ＣＬ０１００８－ＣＬＴＨ）から入手したＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現する膠芽腫細胞株を使用して試験した。これらの細胞を、標準培養条件を使用して、ＲＰＭＩ及び１０％ウシ胎児血清中で増殖させた。
二次ＡＦ４８８標識Ｆ（ａｂ’）２ロバ抗ヒト抗体（Ｆｃ特異的、＃７０９－５４６－０９８ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）を使用して一次抗体結合を検出したことを除いて、見かけの親和性の評価を、実施例７に記載のようにフローサイトメトリー分析によって行った。
全てのキメラ抗体は、フローサイトメトリー分析において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異を過剰発現する膠芽腫細胞に対して、特異性及び同様の親和性を有して結合する（表９）。重要なことに、全てのキメラ抗体（ベンチマーク１３．１．２を含む）は、ｗｔＥＧＦＲを過剰発現するＵ８７細胞上の細胞表面結合の欠如によって見られるように、ｗｔ ＥＧＦＲに結合することができない。この特異性は、ＡＢＴ－８０６で見られた、Ｕ８７ＭＧ ＥＧＦＲｗｔ細胞への有意な結合を示し（Ｐａｎｏｕｓｉｓら、２００５）、正常組織におけるｗｔ ＥＧＦＲ発現による毒性の主要因でありうる特異性とは異なる。
Figure 2022528368000012
実施例１３：組換え発現キメラｍＡｂのＤＭ１及びＭＭＡＥコンジュゲーション、並びにＡＤＣ試験
実施例１２で作製したキメラ抗体をＤＭ１又はＭＭＡＥとコンジュゲートし、実施例６に記載のようにｗｔ ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を過剰発現する膠芽腫細胞に対して試験した。ペプチド切断可能なバリン－シトルリン・リンカーに結合したモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）薬物に対する、ＥＧＦＲｖＩＩＩの還元された鎖間システインへの抗体又は対照ｍＡｂのコンジュゲーションは、以下の方法論を使用して行った。凍結乾燥したＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥをジメチルアセトアミド中に可溶化し、終濃度を１０ｍＭにする。このストックを等分して、使用するまで－２０℃で保存する。コンジュゲーションの前に、各タンパク質試料は、その表面のアクセス可能なジスルフィド結合を還元させて反応性の遊離チオールを生成する必要がある。ＤＡＲのレベルは、還元剤の濃度を高めることによってジスルフィド結合の還元の程度を調節することで制御される。所望の特定のＤＡＲを達成するために、抗体の終濃度が１０μＭの３つの異なる濃度のＴＣＥＰ（２４μＭ、４０μＭ、及び５５μＭ）を使用した３点スカウティング実験を行う。還元は、２５倍ワーキングストックからのＴＣＥＰを、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのＮａＣｌ，２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２のバッファー中の抗体溶液に添加することによって開始する。混合物を３７℃で３時間インキュベートする。１０倍モル過剰（１００μＭ）のＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを、ＤＭＡ中の２０倍の作業ストックから反応混合物に添加する。反応中の共溶媒の終濃度は５％ｖ／ｖである。反応物を２５℃で１時間インキュベートする。このインキュベーションの間、標準製剤バッファー（２０ｍＭのスクシネート、０．０２％ ｗ／ｖのポリソルベート－２０、ｐＨ６．０）中で、３×０．５ｍＬの７Ｋ ＭＷＣＯ Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎカラムを予備平衡化させる。反応が完了した後、ポリソルベート－２０を終濃度０．０２％ ｗ／ｖまで添加した後、反応混合物を連続して予備平衡化Ｚｅｂａカラムに通す。溶出液に、１／５体積の３６％トレハロース溶液（製剤バッファー中）を添加する。コンジュゲートの２４８ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度測定を使用して、ＤＡＲを計算し、試料をＨＰＬＣ－Ｓｕｐｅｒｄｅｘサイズ－排除クロマトグラフィーによってモノマー純度について測定する。３つのＴＣＥＰ濃度のそれぞれについてのＤＡＲを、ＤＡＲに対してプロットし、線形関係の傾きを使用して、所望のＤＡＲに到達するための最適濃度を決定する。次いで、これらの最適条件を指定されたスケールで使用して、上記手順を繰り返す。コンジュゲートについて報告される終濃度は、結合した薬物からの２８０ｎｍでの寄与を相殺するように調整される。
コンジュゲーションの前に、タンパク質（抗体）試料（２μＬ）の吸光度スキャンを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００機器で測定する。２４８／２８０ｎｍにおける吸光度の比率を決定し、この比率を用いて、２５２ｎｍ（ＭＣＣ－ＤＭ１コンジュゲートについて）又は２４８ｎｍ（ｖａｌ－ｃｉｔ ＭＭＡＥコンジュゲートについて）でコンジュゲートされている抗体の吸光係数を計算する。この値を使用して、生成されたコンジュゲートについての薬物：抗体比（ＤＡＲ）を決定する。
薬物（ＤＭ１－及びＭＭＡＥ－）コンジュゲート抗体を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はｗｔ ＥＧＦＲを発現する膠芽腫細胞株（Ｕ８７及び／又はＤＫＭＧ）に対する増殖阻害活性について試験した。典型的な結果を図６に示し、平均を表１０及び表１１に示す。
ＤＭ１コンジュゲートキメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、分析したＥＧＦＲｖＩＩＩ発現Ｕ８７細胞株において、使用されたベンチマークｍＡｂ（ｈＦｃ１３．１．２－ＤＭ１、ＩＣ５０＝９．３ｎＭ）と比較して、良好な有効性（最大増殖阻害率７７～８０％から）及び強力な効力（ＩＣ５０範囲０．９～３．９ｎＭ）を示した。さらに、両方の試験抗体、特にｈＦｃ－４Ｅ１１－ＤＭ１、の活性は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に対して非常に強力であるようであり、つまり、ＥＧＦＲｗｔ発現細胞に対して見られる活性よりも１８倍強力であり、非標的化無関係対照ＡＤＣであるＤＭ１コンジュゲートパリビズマブで見られる活性よりも２５倍強力であった（表１０）。同様の結果が、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＤＫＭＧ細胞においても見られた。
表１０は、キメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＤＭ１－ＡＤＣ試験の結果を示す。
ＤＡＲ：薬物－抗体比
％ｍａｘ ｉｎｈ＝最大阻害パーセント
Figure 2022528368000013
試験したとき、ＭＭＡＥコンジュゲートキメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ベンチマーク１３．１．２（１．９～２．５のＩＣ５０）又は非標的化無関係キメラパリビズマブコンジュゲート陰性対照と比較して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現細胞株において、良好な有効性（最大増殖阻害率７５～９５％から）及び強力な効力（ＩＣ５０＜０．２－０．４ｎＭ）を示した（表１１）。
Figure 2022528368000014
注目されることに、ＤＭ１及びＭＭＡＥコンジュゲートｈＦｃ－４Ｅ１１及びｈＦｃ－５Ｇ６の両方が、ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現する細胞に対して、対応するベンチマーク１３．１．２抗体コンジュゲートよりも最大１０倍強力であるという点で、優れた機能活性を示す。全ての場合で、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞に対する非標的化無関係ＡＤＣ対照の活性よりも有意に高い活性が示された。さらに、この効果は、ＥＧＦＲｗｔ Ｕ８７ＭＧ発現細胞で見られた活性と、対応する無関係ＡＤＣ対照で見られた活性とに有意差がなかったことから、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に対して特異的であった。
実施例１４：Ｕ８７ＭＧ－ｖＩＩＩ腫瘍異種移植マウスモデルにおけるＡＤＣによるｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害
ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性をさらに評価するために、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する異種移植モデルにおける腫瘍増殖を阻害する能力について評価した。
ＡＤＣを膠芽腫皮下異種移植モデルで試験した（試験番号ＳＰ．０３：５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ及び試験番号ＳＰ．０６：３ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ）。
簡潔に述べると、実施例２に記載されるように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現Ｕ８７ＭＧ細胞を培養した。細胞は、週に２回継代し、解凍後４～６週間以内に使用した。これらを、トリプシン処理（０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ、Ｇｉｂｃｏ１５０９０－０４６）によって回収し、続いて冷リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で洗浄し、トリパンブルー色素を除外する能力によって生存率を評価した。マウスにおける異種移植片としての増殖について全ての細胞集団が、少なくとも９８％生存可能であった。
６週齢の２５グラムの雄ＣＤ１アルビノマウス（対照：ＣＤ１－Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ（Ｓｔ－Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から入手した。動物は、カナダ動物飼育評議会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ、ＣＣＡＣ）のガイドラインに従って飼育し、使用した。
細胞を、イソフルラン麻酔ヌードマウス（ｎ＝１２）の左脇腹に、滅菌条件下で皮下接種した（１注射部位あたり０．１ｍＬのＰＢＳ又はＨＢＳＳの体積中５×１０６細胞）。腫瘍を体積で８０～１００ｍｍ３のサイズに成長させ、その後、各コホートが様々な腫瘍サイズを有する動物を含むことを確実にするために、投与日の１日前に動物をランダム化した。
処置後２９日間、又は倫理的理由（人道的エンドポイント）、つまり１）４８時間以内に体重回復することなく１０％を超える体重減少；２）２５００ｍｍ３を超える腫瘍体積；３）腫瘍潰瘍；４）不動性及びグルーミングの低下等の苦痛の明確な徴候、のために安楽死させるまで、腫瘍成長を、３日ごとにキャリパー測定によってモニターした。
腫瘍体積は、式ＩＶに従って計算した：
推定腫瘍体積［ｍｍ３］＝π／６（長さ［ｍｍ］）×（幅［ｍｍ］×（高さ［ｍｍ］））（式ＩＶ）
試験試料をＡＤＣバッファー中で調製し、（ＨＰＬＣ－ＳＥＣによって）凝集物５％未満及びエンドトキシン１ＥＵ／ｍｇ未満含有であることが示された。０日目及び４日目（９６時間間隔）にＤＡＲ３に基づいて、５ｍｇ／ｋｇ（試験ＳＰ．０３）又は３ｍｇ／ｋｇ（試験ＳＰ．０６）で、尾静脈を介して試験試料をマウスに静脈内（静脈内）注射した。対照群はＡＤＣバッファーで処置した。
全ての動物を、死亡率及び病気の徴候について１日１回観察した。処置日及びその後３日ごとに、動物の個々の体重及び腫瘍サイズを測定し、記録した。
各群の腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして示し、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞接種後の測定時間の関数としてプロットする。腫瘍体積データの群比較は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０を使用して、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を伴った二元配置分散分析を使用して行った。処置群と対照群との間の差は、ｐ＜０．０５で、統計学的に有意であった。
図７は、試験ＳＰ．０３の結果を表し、腫瘍体積として評価される、腫瘍成長に対するマウス抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣの効果を示す。
腫瘍成長に対する統計的に有意な（ｐ＜０．０５）効果が、５ｍｇ／ｋｇの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＤＭ１処置群とＡＤＣバッファー処置群との間で４日目から２０日目まで観察された。マウス抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ処置群の平均腫瘍体積成長は、２０日目に、約９０ｍｍ３から１６２０ｍｍ３へ腫瘍成長した対照群と比較して、約９０ｍｍ３から１９５～２８７ｍｍ３への腫瘍成長であった。５ｍｇ／ｋｇでの異なる抗ＡＤＣ間で、腫瘍成長阻害の統計的有意差は観察されなかった（表１２）。この顕著な腫瘍体積の違いは、本発明者らのマウス抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣが膠芽腫腫瘍モデルにおける腫瘍成長を大幅に阻害することができることを示す。
体重を、オフターゲット潜在毒性の指標として測定した。対照動物（ＡＤＣバッファー群）とＡＤＣで処置した動物との間で、体重に有意差は認められなかった。実験期間中、両群のマウスの体重は約５～１０％増加した。
Figure 2022528368000015
２０～５０％の腫瘍体積減少の顕著な腫瘍成長阻害は、抗ＧＦＰ－ＤＭ１無関係ＡＤＣ対照と比較して、５Ｇ６－ＤＭ１、４Ｅ１１－ＤＭ１及びベンチマーク１３．１．２－ＤＭ１群に加えて、３Ｅ６－ＤＭ１、１１Ｈ３－ＤＭ１、１Ａ８－ＤＭ１を含む２ｍｇ／ｋｇのマウス抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣで処置した動物においても観察された（データ示さず）。
図８Ａ及び図８Ｂは、試験ＳＰ．０６の結果を表し、それぞれ、腫瘍体積として評価される腫瘍成長に対するキメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＤＭ１－ＡＤＣ又はＭＭＡＥ－ＡＤＣの効果を示す。ＡＤＣバッファー（対照）又は３ｍｇ／ｋｇのＡＤＣのいずれかで２回（０日目及び４日目）処置したＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍担持マウスにおける腫瘍増殖曲線であって、腫瘍体積（ｍｍ３）は３日ごとに１７日間記録した。各データポイントは、ＡＤＣバッファー群（丸）、ｈＦｃ－５Ｇ６－ＤＭ１群（菱形）、ｈＦｃ－４Ｅ１１－ＤＭ１群（白丸）、ベンチマークｈＦｃ－１３．１．２－ＤＭ１群（三角形）、及び陰性対照パリビズマブ－ＤＭ１群（正方形）についての平均±ＳＥＭを表す。パリビズマブは、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するヒト化ｍＡｂである。
パリビズマブ－ＤＭ１（図８Ａ）及びパリビズマブ－ＭＭＡＥ（図８Ｂ）で処置した動物の両方とも、１７日目に、それぞれ、３１．０％及び２２．８％の腫瘍減少を有し、ＡＤＣバッファー処置群と比較して、腫瘍成長の有意な減少（ｐ＜０．０５）を示した（表１３）。しかしながら、キメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣ処置動物は、１１日目から１７日目までのバッファー処置群と比較して、腫瘍成長においてより有意な（ｐ＜０．０５）減少を示し、１７日目の腫瘍体積減少は３７．２～６０．０％であった。異なるキメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣ間で、腫瘍成長阻害の統計的有意差は観察されなかった。対応するＤＭ１コンジュゲートとＭＭＡＥコンジュゲートとの間に、統計的有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。実験期間中、Ｕ８７ＭＧｖＩＩＩ異種移植腫瘍は潰瘍化する傾向があった。対照群及びＡＤＣ処置群の両方とも、５０％を超える潰瘍率を示したが、唯一の例外として、ｈＦｃ－４Ｅ１１－ＤＭ１処置動物は、著しく低い潰瘍率を示した（約１６．７％、データ示さず）。
Figure 2022528368000016
要約すると、キメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣ処置動物は、試験の経過中、バッファー処置群と比較して、腫瘍成長においてより有意な減少（ｐ＜０．０５）を示し、ＭＭＡＥ又はＤＭ１コンジュゲートとして評価した場合、それぞれ、１３．１．２ベンチマークと同等又はより強力であることが示された。留意すべきことに、１７日目において、ベンチマーク１３．１．２－ＤＭ１は、４Ｅ１１－ＤＭ１と比較して、Ｕ８７ＭＧｖＩＩＩモデルにおいて有意に低い腫瘍成長阻害を誘導した（ｐ＜０．０５）。
実施例１５：キメラ抗原受容体Ｔ細胞機能試験
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の関連において、新規のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的一本鎖可変断片の活性を実証するために、様々な実験を行った。簡単に述べると、可撓性リンカー配列及び制限鎖部位（例えば、ＧＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶ（配列番号１７１）であるが、当該技術分野で公知の任意の好適なリンカーを、本明細書で提供されるｓｃＦｖ構築物において使用してもよい）を用いて連結された、５Ｇ６の重鎖及び軽鎖（それぞれ、配列番号１２及び配列番号７、例えば、配列番号１６６のｓｃＦｖと同様）配列又は４Ｅ１１の重鎖及び軽鎖（それぞれ、配列番号４２及び配列番号３７、例えば、配列番号１６７のｓｃＦｖで提供されるもの）配列からなる一本鎖可変断片を、標準的なＣＡＲ構築物と組み合わせた。試験に使用したＣＡＲ構築物は、ヒトＣＤ２８－シグナルペプチド、直ぐ上で説明したｓｃＦｖ配列、マウスＣＤ８－ヒンジドメイン、ヒトＣＤ２８－膜貫通ドメイン、ＣＤ２８－細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン（５Ｇ６－ＣＡＲ配列番号１６８、４Ｅ１１－ＣＡＲ配列番号１６９）のうちの１つを含んだ。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能性は、出願人によって開発された、一部の事例でＣＡＲ－Ｊアッセイと称される、新規のフローサイトメトリーベースのハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して試験した。簡潔に述べると、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的（すぐ上に記載）又は対照（ＣＤ１９標的化）ＣＡＲプラスミドを、ＪｕｒｋａｔヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞株にエレクトロポレーションした。次いで、ＣＡＲを発現する細胞を、様々な用量で、様々な標的細胞株（ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を伴う又は伴わない）に曝露し、標準的な培養条件下で維持した。標的細胞との２４時間の共インキュベーションの後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９の表面発現を介したフローサイトメトリーによって、細胞活性化について調べた。各ＣＡＲに関連する自己活性化（トニックシグナル伝達）のレベルも、非刺激ＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞、又は無関係標的細胞とインキュベートしたＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ６９発現レベルの定量化によって調べた（図１０）。
初代ヒト免疫細胞の関連において、ヒト初代末梢血由来Ｔ細胞を使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化４Ｅ１１又は５Ｇ６ ＣＡＲ構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ活性を確認した。簡潔に述べると、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＡＲ又は対照（ヒトＣＤ１９標的化ＦＭＣ６３－ＣＡＲ）レンチウイルスを、ＨＥＫ２９３における標準的な産生プロトコルを使用して生成し、超遠心分離を使用して濃縮した。磁気分離を用いて初代Ｔ細胞をドナー血液試料から単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化した。次いで、ＣＡＲレンチウイルスを用いて初代Ｔ細胞に形質導入し、培養して数日間拡張させた。
初代ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ導入Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能性を、ライブ蛍光顕微鏡アプローチを用いて評価した。簡潔に述べると、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞、又は同様の条件下で処理した細胞にレンチウイルス構築物を導入しなかったｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞を、直前に記載したように作製した。次いで、細胞を、核局在形態のｍＫａｔｅ２蛍光タンパク質も発現するように改変したＥＧＦＲｖＩＩＩ発現標的細胞と共培養した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（商標）自動ライブ蛍光顕微鏡装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＵＳＡ）を使用して、６日間にわたって共培養物を常時モニターした。次いで、標的細胞の相対的増殖を、ｍＫａｔｅ２＋細胞の自動カウントを用いて評価した（図１１）。データは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を過剰発現するＵ８７ＭＧの増殖が、対照ＣＡＲ－Ｔ（ＦＭＣ６３）又はｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞と比較して、４Ｅ１１又は５Ｇ６ ＣＡＲ－Ｔによって効率的に抑制されたことを示した。
またＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化初代ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能性を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現Ｕ８７ｖＩＩＩ腫瘍を担持するＮｏｄ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２γＲ２－／－（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を使用して試験した。簡潔に述べると、マウスに１×１０６個の蛍光標識Ｕ８７－ｖＩＩＩ細胞を皮下注射した。腫瘍細胞注射の８日後、凍結保存したＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、ＰＢＳで洗浄し、合計１×１０７個のＴ細胞（ＣＡＲ形質導入率２０～２５％）を直ちに腫瘍内に送達し、群間の腫瘍サイズの均等な分布を確実にした。腫瘍成長を、具体的な処置群について盲検化された訓練された動物技術者によって、キャリパーを使用して、週に３回評価した（図１２Ａ）。主要エンドポイントは、２０００ｍｍ３を超える腫瘍サイズであり、副次エンドポイントは、全体的な動物の健康及び健全状態（ｗｅｌｌ－ｂｅｉｎｇ）によって決定した（図１２Ｂ）。腫瘍体積は以下の式：腫瘍体積＝（０．４）（ａｂ２）、式中、ａ＝大直径、及びｂ＝小直径を用いて計算した。
この実験において、標的特異的４Ｅ１１初代ＣＡＲ－Ｔを投与された動物において、腫瘍成長のより良好な制御及び生存期間の延長が、それぞれ、未処置の対照動物と比較して見られた（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。
実施例１６：二重特異性免疫細胞エンゲージャー機能試験
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの関連において、新規のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的一本鎖可変断片の活性を実証するために、様々な実験を行った。合成ＤＮＡを使用して、構築物を作製し、４Ｅ１１ ｓｃＦＶ配列（配列番号１６７）を、先に実証されているＣＤ３エンゲージングｓｃＦｖ配列（ＯＫＴ３）に連結して、二重特異性エンゲージャー分子（配列番号１７０）を形成した。例示的な二重特異性免疫細胞エンゲージャーの概略図を示す（図１３）。この二重特異性構築物を発現するプラスミドを、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）にトランスフェクトし、培養２～４日後に上清を回収した。ＨＥＫ２９３Ｔからの上清を、Ｊｕｒｋａｔ細胞及び様々な用量の抗原発現標的細胞（Ｕ８７ｖＩＩＩ）を含有するウェルに移した。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの存在下又は非存在下における標的誘導活性化を、ヒトＣＤ６９特異的抗体染色及びフローサイトメトリーを用いて、ＣＤ６９発現レベルを調べることによって測定した（図１４）。データは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化４Ｅ１１二重特異性構築物のみが、対照二重特異性分子と比較して高い標的特異的Ｔ細胞活性化応答を誘導することができることを示した。
初代ヒトＴ細胞と相互作用する初代ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的二重特異性免疫細胞エンゲージャーのｉｎ ｖｉｔｒｏ機能性を、ライブ蛍光顕微鏡アプローチを用いて評価した。簡潔に述べると、培養物中で数週間にわたって休止状態に戻すことができたポリクローナル拡張ヒトＴ細胞を、核局在形態のｍＫａｔｅ２蛍光タンパク質も発現するように改変したＥＧＦＲｖＩＩＩ発現標的細胞と共培養した。種々の用量の、ＨＥＫ２９３Ｔ上清、又は細胞が対照ＣＤ１９－ＣＤ３標的又はＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的４Ｅ１１－ＣＤ３標的二重特異性免疫細胞エンゲージャーを分泌していた上清を、Ｔ細胞標的細胞共培養物に移した。次いで、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（商標）自動ライブ蛍光顕微鏡装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＵＳＡ）を使用して、６日間にわたって共培養物を常時モニターした。次いで、標的細胞の相対的増殖を、ｍＫａｔｅ２＋細胞の自動カウントを用いて評価した（図１５）。結果は、４Ｅ１１－ＣＤ３二重特異性免疫細胞エンゲージャーが、二重特異性ＣＤ１９－ＣＤ３対照分子又はｍｏｃｋ上清と比較して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍細胞成長のＴ細胞媒介性抑制を能動的に誘導することができることを示す。
本明細書に記載される実施形態及び実施例は、例示的なものであって、特許請求される本開示の範囲を限定することを意図するものではない。前述の実施形態の代替形態、修飾形態、及び均等物を含む変形形態は、特許請求の範囲に包含されることが、本発明者によって意図されている。本出願に列挙された引用は、参照により本明細書に組み込まれる。
参考文献
本出願を通じて言及された全ての特許、特許出願及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
いくつかの配列において、ＣＤＲは、下線が引かれ、太字で示されている。
Figure 2022528368000017
Figure 2022528368000018

Figure 2022528368000019

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Figure 2022528368000021

Figure 2022528368000022

Figure 2022528368000023

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Claims (50)

  1. 上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む抗原結合剤であって、前記抗原結合ドメインが、
    ａ．配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号１０のＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号１３のＣＤＲＨ１配列、配列番号１４のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号１５のＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域；
    ｂ．配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｃ．配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｄ．配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｅ．配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｆ．配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｇ．配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号８０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
    ｈ．配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号８０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域
    を含む、抗原結合剤。
  2. 以下：
    ａ．配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号７と実質的に同一である配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１２と実質的に同一である配列を含む重鎖可変領域；
    ｂ．配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号２２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｃ．配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号２７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号３２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｄ．配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号３７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号４２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｅ．配列番号４７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号４７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号５２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｆ．配列番号５７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号５７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号６２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｇ．配列番号６７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号６７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号７７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号７７と実質的に同一であるアミノ酸配列、配列番号９２に示される若しくは配列番号９２と実質的に同一であるアミノ酸配列、又は配列番号１０２に示される若しくは配列番号１０２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
    ｈ．配列番号７２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号７２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号７７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号７７と実質的に同一であるアミノ酸配列、又は配列番号９２に示される若しくは配列番号９２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項１に記載の抗原結合剤。
  3. 抗体又はその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、二重特異性キラー細胞エンゲージャー、三重特異性キラー細胞エンゲージャー、又は任意の免疫療法化合物である、請求項１又は２に記載の抗原結合剤。
  4. ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、以下：
    ａ．配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号１０のＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号１３のＣＤＲＨ１配列、配列番号１４のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号１５のＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域；
    ｂ．配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｃ．配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｄ．配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｅ．配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｆ．配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；
    ｇ．配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号８０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；並びに
    ｈ．配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号８０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域
    を含む抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、又は多重特異性抗体である、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、以下：
    ａ．配列番号１１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１１８と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１１６と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｂ．配列番号１１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１１５と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１１６と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
    ｃ．配列番号１１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１１８と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号６２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む抗体又はその抗原結合断片。
  7. ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、以下：
    ａ．配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号７と実質的に同一である配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１２と実質的に同一である配列を含む重鎖可変領域；
    ｂ．配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号２２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｃ．配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号２７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号３２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｄ．配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号３７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号４２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｅ．配列番号４７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号４７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号５２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｆ．配列番号５７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号５７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号６２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｇ．配列番号６７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号６７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号７７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号７７と実質的に同一であるアミノ酸配列、配列番号９２に示される若しくは配列番号９２と実質的に同一であるアミノ酸配列、又は配列番号１０２に示される若しくは配列番号１０２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
    ｈ．配列番号７２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号７２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号７７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか若しくは配列番号７７と実質的に同一であるアミノ酸配列、又は配列番号９２に示される若しくは配列番号９２と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む抗体又はその抗原結合断片。
  8. ヒトＩｇＧ１定常領域を含む、請求項４～７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  9. ヒトＩｇＧ２定常領域を含む、請求項４～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  10. ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、以下：
    ａ．配列番号１０８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１０８と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１０７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１０７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖；並びに
    ｂ．配列番号１１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１１０と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号１０９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるか又は配列番号１０９と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む重鎖
    からなる群から選択される配列を含む抗体又はその抗原結合断片。
  11. 前記抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又は（Ｆａｂ’）２を含む、請求項４～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  12. カーゴ分子に連結されている、請求項４～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  13. 前記カーゴ分子が治療部分を含む、請求項１２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  14. 前記治療部分が、細胞毒性剤、細胞分裂阻害剤、抗癌剤、又は放射線療法剤を含む、請求項１３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  15. 検出可能部分とコンジュゲートされている、請求項１３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗原結合剤又は抗体若しくは抗原結合断片と、薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物。
  17. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗原結合剤又は抗体若しくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコードする核酸分子。
  18. 前記核酸が、
    ａ．配列番号１１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号１６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子；
    ｂ．配列番号２１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号２６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子；
    ｃ．配列番号３１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号３６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子；
    ｄ．配列番号４１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号４６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子；
    ｅ．配列番号５１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号５６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子；
    ｆ．配列番号６１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号６６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子；
    ｇ．配列番号７１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号８１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸；
    ｈ．配列番号７６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号８１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子；
    ｉ．配列番号８６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号９６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子；
    ｊ．配列番号９１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号９６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子；又は
    ｋ．配列番号１０１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子、及び／又は配列番号１０６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である配列を含む核酸分子
    からなる群より選択される、請求項１７に記載の核酸分子。
  19. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗原結合剤又は抗体若しくはその抗原結合断片のうちの少なくとも１つを含むキット。
  20. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗原結合剤又は抗体若しくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードする核酸配列を含むベクター又はベクターのセット。
  21. 請求項２０に記載のベクター又はベクターのセットを含む、単離された細胞。
  22. 前記細胞が、抗体又はその抗原結合断片を発現、アセンブリ、及び／又は分泌することができる、請求項２１に記載の単離された細胞。
  23. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗原結合剤又は抗体若しくはその抗原結合断片の軽鎖をコードするヌクレオチド又はベクターを含む第１のバイアルと、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の重鎖をコードするヌクレオチド又はベクターを含む第２のバイアルとを含むキット。
  24. ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞を含む癌を治療する方法であって、必要とする対象に、請求項４～１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
  25. 前記抗体が、化学療法剤と組み合わせて使用される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記必要とする対象が、多形性膠芽腫を有するか又は有する疑いがある、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 前記必要とする対象が、癌腫を有するか又は有する疑いがある、請求項２４又は２５に記載の方法。
  28. 前記癌腫が、乳癌腫又はＨＮＳＣＣを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. ＥＧＦＲｖＩＩＩを検出する方法であって、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むか又は含む疑いがある試料を、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
  30. 請求項４～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、前記抗体又はその抗原結合断片が産生されるように、前記抗体又は抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を培養するステップを含む方法。
  31. 前記抗体又はその抗原結合断片を、カーゴ分子とコンジュゲートするステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記カーゴ分子が治療部分を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記カーゴ分子が検出可能部分を含む、請求項３１に記載の方法。
  34. ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を伴う癌を有する対象を治療する方法であって、前記方法が、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合剤を発現する細胞を投与するステップを含み、前記抗原結合剤が、キメラ抗原受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、二重特異性キラー細胞エンゲージャー、又は三重特異性キラー細胞エンゲージャーである、方法。
  35. 前記対象が、神経膠腫を有するか又は有する疑いがある、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記神経膠腫が、多形性膠芽腫である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記対象が、癌腫を有するか又は有する疑いがある、請求項３４に記載の方法。
  38. 前記癌腫が、乳癌腫、口腔癌腫、又はＨＮＳＣＣを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記細胞がＴ細胞である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記細胞がＮＫ細胞である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記細胞が、前記対象にとって自家の免疫細胞である、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合剤を発現するように操作された、単離された細胞集団。
  43. ヒト由来である、請求項４２に記載の単離された細胞集団。
  44. Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞毒性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、及びそれらの組合せを含む、請求項４２又は４３に記載の単離された細胞集団。
  45. Ｔ細胞を含む、請求項４４に記載の単離された細胞集団。
  46. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、又はそれらの組合せを含む、請求項４５に記載の単離された細胞集団。
  47. ＮＫ細胞を含む、請求項４４に記載の単離された細胞集団。
  48. 同じ標的又は異なる標的の別の抗原に対する親和性を有する別のキメラ抗原受容体を発現するように操作されている、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の単離された細胞集団。
  49. 宿主の免疫細胞を含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の単離された細胞集団。
  50. 請求項４２～４９のいずれか一項に記載の単離された細胞集団と、薬学的に許容できるバッファー又は賦形剤とを含む医薬組成物。
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