KR20230069955A - 항-4-1bb-항-pd-l1 이중특이적 항체, 이의 약제학적 조성물 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-4-1BB-항-PD-L1 이중특이적 항체, 약제학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 4-1BB를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역과 PD-L1 또는 PD-1을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역을 포함하는 이중특이적 항체로서, 상기 제1 단백질 기능 영역은 4-1BB에 대한 단일 도메인 항체이고; 상기 제2 단백질 기능 영역은 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체 또는 항-HER-2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편인, 이중특이적 항체에 관한 것이다. 본 이중특이적 항체는 PD-L1이 수용체인 PD-1에 결합하는 것을 차단하는 기능을 가지고 있고, 면역세포 상의 4-1BB와 결합해 종양 미세환경에서 면역 세포 활성을 활성화시켜 종양의 발생과 발달을 억제하는 효과를 보다 효과적으로 개선한다.

Description

항-4-1BB-항-PD-L1 이중특이적 항체, 이의 약제학적 조성물 및 용도
본 발명은 생물의학 분야에 속하는 것으로, 항-4-1BB-항-PD-L1 이중특이적 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
CD137 또는 TNFRF9로도 알려진 종양 괴사 인자 수용체 초계열 구성원인 4-1BB는 TNF 수용체 계열의 구성원이다. 4-1BB는 255개의 아미노산을 갖는 I형 막관통 단백질 (NCBI: NP_001552)로, 17개의 아미노산을 포함하는 N-말단 신호 펩타이드, 169개의 아미노산으로 구성된 세포외 영역, 27개의 아미노산으로 구성된 막관통 영역 및 42개의 아미노산으로 구성된 C-말단 세포내 영역으로 이루어져 있다. 4-1BB는 주로 활성화된 T 세포, NK 세포, 조절성 T 세포, 수지상 세포, 단핵구, 호중구 및 호산구에서 발현되며, 종양 혈관의 내피 세포에서도 4-1BB를 발현하는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 종양과 일부 자가면역 질환의 치료에서, 4-1BB도 잠재적인 표적이다. 구체적으로, 대장암, 폐암, 유방암 및 흑색종과 같은 임상전 동물 모델에서, 4-1BB를 표적으로 하는 작용제 분자는 단일 약물로서 또는 추가의 항체, 예컨대 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-HER-2와 병용하여 상당한 항종양 활성을 나타낸다 (Etxeberria I, et al. ESMO Open 2020;4:e000733.).
CD274로도 알려진 예정된 세포사 1 리간드 1 (Programmed death 1 ligand 1: PD-L1)은 B7 계열의 구성원이며, PD-1의 리간드이다. PD-L1은 IgV 유사 영역, IgC 유사 영역, 막관통 소수성 영역, 및 30개의 아미노산으로 이루어진 세포내 영역을 포함하는 총 290개의 아미노산을 갖는 I형 막관통 단백질이다. 다른 B7 계열 분자들과 달리, PD-L1은 면역 반응을 음성적으로 조절한다. 연구에 따르면, PD-L1은 주로 활성화된 T 세포, B 세포, 대식세포, 및 수지상 세포에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. PD-L1은, 림프구 외에도, 흉선, 심장, 태반 등과 같은 다른 많은 조직의 내피 세포, 및 흑색종, 간암, 위암, 신장 세포 암종, 난소암, 결장암, 유방암, 식도암, 두경부암 등과 같은 다양한 비림프계에서도 발현된다 (Akintunde Akinleye & Zoaib Rasool, Journal of Hematology & Oncology volume 12, Article number: 92 (2019)). PD-L1은 일반적으로 자가반응성 T 및 B 세포와 면역 내성을 조절하는데 어느 정도 관여하고 있으며, 말초 조직 T 및 B 세포 반응에도 역할을 한다. 종양 세포에서 PD-L1의 높은 발현은 암 환자의 좋지 않은 예후와 관련이 있다.
현재 시판되고 있는 대부분의 항체 의약품들은 단일클론 항체이다. 치료용 단일클론 항체는 암, 자가면역 질환, 염증 및 기타 질병을 치료하는데 사용되어 왔으며, 이들 대부분은 하나의 표적에 특이적이다. 그러나, 환자들은 단일클론 항체 치료에 내성이 생기거나 반응하지 않게 될 수 있다. 그리고 어떤 질병의 경우에는 서로 다른 신호전달 경로, 사이토카인과 수용체들의 서로 다른 조절 기전 등을 비롯한 신체의 여러가지 요인들에 의해 영향을 받으므로, 단일 표적 면역치료로는 암세포를 파괴하기에 충분치 않은 것으로 보인다. 따라서, 다중특이적 항체를 이용하는 다양한 약물 또는 다수의 표적 전략들을 조합하여 면역치료 효과를 달성해야될 필요가 있다.
이작용성 항체는 항체 의약품 개발에서의 방향과 일치하지만, 임상전 평가 모델, 낮은 발현, 낮은 안정성, 복잡한 과정, 및 품질 관리에서의 큰 변화와 같은 여러가지 문제에 직면해 있다. 따라서, 이작용성 항체의 개발에는 항상 어려움이 따랐다.
따라서, PD-L1과 4-1BB에 대해 특이성이 우수하고, 치료 효과가 우수하며, 제조가 용이한 이중특이적 항체의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 심도있는 연구와 독창적인 작업 끝에, 항-4-1BB-항-PD-L1 이중특이적 항체 (이하, 항-PD-L1/4-1BB 이중특이적 항체 또는 항-4-1BB/PD-L1 이중특이적 항체라고도 표현함)를 얻었다. 놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명의 이중특이적 항체가 PD-L1이 수용체인 PD-1에 결합하는 것을 차단하는 기능을 가지면서; 동시에, 본 이중특이적 항체는 면역 세포 상의 4-1BB에도 결합할 수 있어, 종양 미세환경에서 면역 세포들을 활성화시킴으로써, 종양의 발생과 발달을 억제하는 효과를 보다 효과적으로 개선할 수 있기 때문에, 월등한 항종양 활성과 우수한 안전성을 가진다. 따라서, 하기의 발명이 제공된다:
본 발명의 한 양태는 이중특이적 항체에 관한 것으로서,
4-1BB를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역, 및
PD-L1 또는 PD-1을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역을 포함하고;
이때,
상기 제1 단백질 기능 영역은 항-4-1BB 단일 도메인 항체이고;
상기 제2 단백질 기능 영역은 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체 또는 항-HER-2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 상기 항-4-1BB 단일 도메인 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하며;
바람직하게는, 상기 항-4-1BB 단일 도메인 항체는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 제2 단백질 기능 영역은 항-PD-L1 단일클론 항체, 항-PD-1 단일클론 항체, 항-CTLA-4 단일클론 항체 또는 항-HER-2 단일클론 항체이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 제2 단백질 기능 영역은 항-PD-L1 단일 사슬 항체, 항-PD-1 단일 사슬 항체, 항-CTLA-4 단일 사슬항체 또는 항-HER-2 단일 사슬 항체이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 제2 단백질 기능 영역은 항-PD-L1 단일 도메인 항체, 항-PD-1 단일 도메인 항체, 항-CTLA-4 단일 도메인 항체 또는 항-HER-2 단일 도메인 항체이고;
바람직하게는, 항-PD-L1 단일 도메인 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하며;
바람직하게는, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에서, 항-4-1BB 단일 도메인 항체와 항-PD-L1 단일 도메인 항체의 CDR은 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의되며, 문헌 [Ehrenmann F, Kaas Q, Lefranc M P. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF [J]. Nucleic acids research,2009; 38 (suppl_1): D301-D307]을 참조한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체에서,
항-4-1BB 단일 도메인 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하며,
항-PD-L1 단일 도메인 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 이중특이적 항체에서,
항-4-1BB 단일 도메인 항체는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지며,
항-PD-L1 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 본 이중특이적 항체는 IgG의 하나 이상 (예컨대, 2개 또는 3개)의 Fc 단편, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 단편을 추가로 포함하거나;
또는, 상기 이중특이적 항체는 IgG의 하나 이상 (예컨대, 2개 또는 3개)의 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고;
바람직하게는, IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 불변 영역은 제1 단백질 기능 영역과 제2 단백질 기능 영역 사이에 위치한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 본 이중특이적 항체는 제1 단백질 기능 영역, 제2 단백질 기능 영역, IgG의 Fc 단편 및 선택적인 링커로 이루어져 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 본 이중특이적 항체는 제1 단백질 기능 영역, 제2 단백질 기능 영역, IgG1의 Fc 단편 및 선택적인 링커로 이루어져 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 IgG1의 하나의 Fc 단편을 포함하고, IgG1의 Fc 단편은 제1 단백질 기능 영역과 제2 단백질 기능 영역 사이에 위치한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역은 제1 단백질 기능 영역의 C-말단에 연결되고/연결되거나, 제2 단백질 기능 영역의 C-말단에 연결되고;
IgG의 Fc단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역은 제1 단백질 기능 영역에 직접적으로 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되며; IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역은 제2 단백질 기능 영역에 직접적으로 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되고;
바람직하게는, 상기 링커는 서열번호 5 및 서열번호 22로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, IgG의 Fc 단편은 제1 단백질 기능 영역의 C-말단에 연결되고/연결되거나, 제2 단백질 기능 영역의 C-말단에 연결되고;
IgG1의 Fc단편은 제1 단백질 기능 영역에 직접적으로 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되며; IgG1의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역은 제2 단백질 기능 영역에 직접적으로 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되고;
바람직하게는, 연결 단편의 아미노산 서열은 서열번호 5 및 서열번호 22로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, EU 넘버링 시스템에 따라, 상기 IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역은 L234A 돌연변이 및 L235A 돌연변이를 포함하고; 선택적으로, IgG의 Fc 단편은 G237A 돌연변이도 포함하며;
바람직하게는, IgG의 Fc 단편은 L234A 돌연변이 및 L235A 돌연변이를 포함하는 IgG1의 Fc 단편이고; 선택적으로, IgG1의 Fc 단편은 G237A 돌연변이를 추가로 포함하며; 바람직하게는, IgG1의 Fc 단편은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지고;
바람직하게는, IgG의 Fc 단편은 놉-인-홀 (Knob-in-hole) 돌연변이를 추가로 포함하며;
바람직하게는, IgG1의 Fc 단편은 놉-인-홀 돌연변이를 추가로 포함하고; 바람직하게는, IgG1의 Fc 단편은 서열번호 8 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 이중특이적 항체는 하기 제1 펩타이드 사슬을 포함한다:
제1 단백질 기능 영역, IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역, 선택적인 링커 및 제2 단백질 기능 영역을 N-말단에서 C-말단으로 순차적으로 포함하거나; 또는 제2 단백질 기능 영역; IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역, 선택적인 링커 및 제1 단백질 기능 영역을 포함하는, 제1 펩타이드 사슬. 바람직하게는, 상기 링커는 서열번호 5 및 서열번호 22로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 이중특이적 항체는 하기 제1 펩타이드 사슬을 포함한다:
제1 단백질 기능 영역, IgG1의 Fc 단편 또는 IgG1의 중쇄 불변 영역, 선택적인 링커 및 제2 단백질 기능 영역을 N-말단에서 C-말단으로 순차적으로 포함하거나; 또는 제2 단백질 기능 영역; IgG1의 Fc 단편 또는 IgG1의 중쇄 불변 영역, 선택적인 링커 및 제1 단백질 기능 영역을 포함하는, 제1 펩타이드 사슬. 바람직하게는, 상기 링커는 서열번호 5 및 서열번호 22로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, IgG의 Fc 단편은 L234A 돌연변이 및 L235A 돌연변이 (줄여서 "LaLa 돌연변이"라 칭함)를 포함하는 IgG1의 Fc 단편이고; 선택적으로, IgG1의 Fc 단편은 G237A 돌연변이를 추가로 포함하며; 바람직하게는, IgG1의 Fc 단편은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, IgG1의 Fc 단편은 놉-인-홀 돌연변이를 포함하고; 바람직하게는, EU 넘버링 시스템에 따르면, "놉"은 Fc가 S354C 및 T366W 돌연변이를 겪음을 의미하고; "홀"은 Fc가 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 겪음을 의미한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, IgG1의 Fc 단편은 L234A 돌연변이, L235A 돌연변이 및 놉-인-홀 돌연변이를 포함하고; 바람직하게는, IgG1의 Fc 단편은 서열번호 8 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 제1 펩타이드 사슬은 서열번호 1 또는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 2개의 제1 펩타이드 사슬로 형성된 이량체, 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 6에 기재된 제1 펩타이드 사슬로 형성된 이량체이고;
바람직하게는, 상기 2개의 제1 펩타이드 사슬은 2쌍 또는 3쌍의 이황화 결합으로 연결되어 있으며;
선택적으로, 상기 2개의 제1 펩타이드 사슬은 놉-인-홀 돌연변이도 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 2개의 제1 펩타이드 사슬 중 하나는 놉 돌연변이를 포함하고, 다른 하나는 홀 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 서열번호 1에 기재된 제1 펩타이드 사슬 2개로 형성된 이량체이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 서열번호 6에 기재된 제1 펩타이드 사슬 2개로 형성된 이량체이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 서열번호 1에 기재된 제1 펩타이드 사슬 1개와 서열번호 6에 기재된 제1 펩타이드 사슬 1개로 형성된 이량체이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 하기 제2 펩타이드 사슬을 추가로 포함한다:
IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역을 포함하는 제2 펩타이드 사슬로서; 바람직하게는, 제2 펩타이드 사슬의 N-말단 및/또는 C-말단이 제1 단백질 기능 영역 및/또는 제2 단백질 기능 영역에 직접적으로 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되는 것인, 제2 펩타이드 사슬.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 하기 제2 펩타이드 사슬을 추가로 포함한다:
IgG1의 Fc 단편 또는 IgG1의 중쇄 불변 영역을 포함하는 제2 펩타이드 사슬로서; 바람직하게는, 제2 펩타이드 사슬의 N-말단 및/또는 C-말단이 제1 단백질 기능 영역 및/또는 제2 단백질 기능 영역에 직접적으로 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되는 것인, 제2 펩타이드 사슬.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 제2 펩타이드 사슬은 서열번호 9 또는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 제1 펩타이드 사슬과 제2 펩타이드 사슬은 이량체를 형성하고;
바람직하게는, 제1 펩타이드 사슬과 제2 펩타이드 사슬은 2쌍 또는 3쌍의 이황화 결합으로 연결되어 있으며;
바람직하게는, 제1 펩타이드 사슬과 제2 펩타이드 사슬은 놉-인-홀 돌연변이를 추가로 포함하고;
바람직하게는, 제1 펩타이드 사슬은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지며, 제2 펩타이드 사슬은 서열번호 9 또는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 제1 펩타이드 사슬은 놉 돌연변이를 포함하고, 제2 펩타이드 사슬은 홀 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체에서, 제1 펩타이드 사슬은 홀 돌연변이를 포함하고, 제2 펩타이드 사슬은 놉 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 항목들 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자, 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터 이중특이적 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항목들 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 이중특이적 항체 및 커플링 모이어티 (coupling moiety)를 포함하는 접합체로서, 상기 이중특이적 항체가 본 발명의 항목들 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체이고, 상기 커플링 모이어티가 검출가능한 표지이며; 바람직하게는, 상기 커플링 모이어티가 방사성 동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 유색 물질 또는 효소인 것인, 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 항목들 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체를 포함하거나, 또는 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 키트에 관한 것이며;
바람직하게는, 상기 키트는 이중특이적 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체를 추가로 포함하고; 선택적으로, 상기 2차 항체는 방사성 동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 유색 물질, 또는 효소와 같은 검출가능한 표지를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 샘플에서 4-1BB 및/또는 PD-L1의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 키트의 제조에 있어서 본 발명의 항목들 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 항목들 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체, 또는 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 약제학적 조성물로서; 선택적으로 상기 약제학적 조성물에는 약제학적으로 허용가능한 부형제가 추가로 포함되는 것인, 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 악성 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 항목들 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체, 또는 본 발명에 다른 접합체의 용도에 관한 것으로; 바람직하게는, 상기 악성 종양은 직장암, 결장암, 폐암, 흑색종, 간암, 위암, 신장 세포 암종, 난소암, 식도암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태는 악성 종양의 예방 및/또는 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 항목들 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체, 또는 본 발명에 다른 접합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 악성 종양의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로; 바람직하게는, 상기 악성 종양은 직장암, 결장암, 폐암, 흑색종, 간암, 위암, 신장 세포 암종, 난소암, 식도암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 방법에서, 본 발명의 항목들 중 어느 하나에 기재된 이중특이적 항체의 유효량을 악성 종양의 예방 및/또는 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계는 수술적 처치 전이나 후이고/이거나 방사선 치료 전이나 후이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 방법에서,
본 발명의 이중특이적 항체는 체중 1kg당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 4.8 내지 24 mg 또는 1 내지 10 mg의 단일 용량으로 투여하거나; 또는 본 발명의 이중특이적 항체는 10 내지 1000 mg, 바람직하게는 50 내지 500 mg, 100 내지 400 mg, 150 내지 300 mg, 150 내지 250 mg, 또는 200 mg의 단일 용량으로 투여하고;
바람직하게는, 상기 투여는 매 3일, 4일, 5일, 6일, 10일, 1주, 2주 또는 3주마다 1회 수행하며;
바람직하게는, 상기 투여는 정맥내 점적 주입 또는 정맥내 주사에 의해 수행한다.
본 발명의 항목들 중 어느 하나에 따른 이중특이적 항체 또는 접합체는 악성 종양의 치료 및/또는 예방에 사용되며; 바람직하게는, 상기 악성 종양은 직장암, 결장암, 폐암, 흑색종, 간암, 위암, 신세포암, 난소암, 식도암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 일반적으로 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 면역글로불린 분자를 의미하며, 각각의 쌍에는 하나의 "경쇄"(L) 사슬과 하나의 "중쇄"(H) 사슬이 있다. 항체 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류될 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 또는 ε으로 분류될 수 있으며, 항체의 이소형 (isotype)은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 약 3개 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 영역을 추가로 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. 항체 불변 영역은 면역계의 다양한 세포들(예를 들어, 이펙터 세포들), 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개한다. VH 및 VL 영역들은 가변성이 높은 영역들(상보성 결정 영역(CDR)들이라고 함)로도 세분될 수 있으며, 이들 사이에 프레임워크 영역(FR)들이라고 하는 보다 보존된 영역들이 산재되어 있다. 각 VH 및 VL은 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역들(VH 및 VL)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 영역 또는 도메인에 대한 아미노산의 지정은 문헌 [Bethesda M.d., Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, (1987 and 1991)] 또는 [Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 1987;196:901-917]; [Chothia et al. Nature 1989;342:878-883]의 정의를 따르거나, 또는 IMGT 넘버링 시스템 (문헌 [Ehrenmann F, Kaas Q, Lefranc M P. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF[J]. Nucleic acids research, 2009;38(suppl_1):D301-D307]의 정의 참조)을 따른다.
"항체"라는 용어는 임의의 특정 항체 제조 방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 항체는 재조합 항체, 단일클론 항체, 및 다중클론 항체를 포함한다. 상기 항체는 상이한 이소형의 항체, 예를 들어, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "mAb" 및 "단일클론 항체"는 고도로 상동성인 항체 분자 그룹, 즉 자발적으로 발생할 수 있는 천연 돌연변이를 제외하고는 동일한 항체 분자 그룹으로부터 유래된 항체 또는 항체 단편을 의미한다. mAb는 항원 상의 단일 에피토프에 매우 특이적이다. 단일클론 항체와 비교할 때, 다중클론 항체는 일반적으로 적어도 두 개 이상의 다른 항체들을 포함하며, 이러한 다른 항체들은 일반적으로 항원 상의 다른 에피토프들을 인식한다. 단일클론 항체는 일반적으로 Kohler 등(문헌 [Koehler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity [J], nature, 1975; 256(5517):495])에 의해 처음 보고된 하이브리도마 기술을 사용하여 얻을 수 있으며, 또한, 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻을 수도 있다(예를 들어, 미국 특허 4,816,567호 참조).
본 명세서에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 인간 면역글로불린(수용체 항체)의 CDR 영역 전부 또는 일부를 비인간 항체(공여자 항체)의 CDR 영역으로 대체함으로써 획득한 항체 또는 항체 단편을 의미하며, 이때 상기 공여자 항체는 원하는 특이성, 친화성, 또는 반응성을 갖는 비인간(예를 들어, 마우스, 랫트, 또는 토끼) 항체일 수 있다. 또한, 수용체 항체의 프레임워크 영역(FR) 내의 일부 아미노산 잔기들은 비인간 항체의 대응하는 아미노산 잔기들, 또는 다른 항체들의 아미노산 잔기들로 대체되어 항체의 성능을 추가로 개선하거나 최적화할 수 있다. 인간화 항체에 대한 보다 자세한 내용은, 예를 들어, 문헌 [Jones et al., Nature 1986; 321:522 525]; [Reichmann et al., Nature, 1988; 332:323329; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992; 2:593-596]; 및 [Clark, Immunol. Today 2000; 21: 397-402]을 참조한다. 어떤 경우에, 항체의 항원 결합 단편은 이중항체인데, 이때 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에서 발현되지만, 사용된 링커는 너무 짧아서 동일한 사슬의 두 도메인들 사이의 쌍형성을 허용하지 않으며, 따라서 도메인이 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 하고, 2개의 항원 결합 부위들을 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:6444 6448] 및 [Poljak R. J. et al., Structure 1994; 2:1121-1123]을 참조한다).
본 명세서에 기재된 융합 단백질은 DNA 재조합을 통해 2개의 유전자들에 의해 공발현된 단백질 산물이다. 항체 및 항원 결합 단편을 제조 및 정제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Cold Spring Harbor's Antibody Laboratory Technique Guide, Chapters 5-8 and Chapter 15).
본 명세서에서 사용되는 용어 "분리" 또는 "분리된"은 천연 상태로부터 인공적인 수단에 의해 획득되는 것을 의미한다. "분리된" 물질 또는 성분이 자연에서 발생하는 경우라면, 그 물질이 존재하는 자연 환경이 변경되었거나, 그 물질이 자연 환경으로 분리되었거나, 양자 모두가 나타난 것이다. 예를 들어, 분리되지 않은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 경우, 이러한 천연 상태로부터 분리된 고순도의 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 분리된 것이라고 한다. "분리" 또는 "분리된"이라는 용어는 인공 또는 합성 물질의 혼합물이나 물질 활성에 영향을 미치지 않는 기타 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 전달 비히클을 의미한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질의 발현을 달성할 수 있는 경우, 벡터를 발현 벡터라고 한다. 벡터는 형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 또는 형질감염(transfection)에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있으므로, 벡터가 운반하는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome: YAC), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC), 또는 P1 유래 인공 염색체(P1-derived artificial chromosome: PAC)와 같은 인공 염색체; λ 파지 또는 M13 파지와 같은 파지, 및 동물 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 벡터가 당업자에게 잘 알려져 있다. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 파포바바이러스(예를 들어, SV40)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선별 요소, 및 리포터 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 발현을 제어하는 다양한 요소들을 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 원점을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 벡터를 도입하기 위해 사용될 수 있는 세포를 의미하며, 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 세포; 효모 세포 또는 아스퍼길러스(Aspergillus)와 같은 진균 세포; S2 드로소필라(S2 Drosophila) 세포 또는 Sf9와 같은 곤충 세포; 또는 섬유아세포, CHO 세포, GS 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK293 세포, 또는 인간 세포와 같은 동물 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 대상체 및 활성 성분과 약리학적으로 및/또는 생리학적으로 상용되는 담체 및/또는 부형제를 의미하는 것으로, 이는 당업계에 잘 알려져 있으며(예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995] 참조), pH 조절제, 계면활성제, 보조제, 및 이온 강도 증강제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 인산염 완충액을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 계면활성제는 Tween-80과 같은 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며; 이온 강도 증강제는 염화나트륨을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 예를 들어, 질병(예를 들어, 종양)을 예방하기 위한 유효량은 질병(예를 들어, 종양)의 발생을 예방, 정지, 또는 지연시키기에 충분한 양을 의미하며; 질병을 치료하기 위한 유효량은 질병을 앓는 환자에게서 질병 및 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 예방하기에 충분한 양을 의미한다. 이러한 유효량을 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, 치료적 사용을 위한 유효량은 치료할 질병의 중증도, 환자 자신의 면역 체계의 일반적인 상태, 연령, 체중 및 성별과 같은 환자의 일반적인 상태, 약물의 투여 방식, 병용 투여되는 기타 요법, 등에 따라 달라질 것이다.
본 발명에서는, 특별한 설명이 없는 한, "제1"(예를 들어, 제1 단백질 기능영역) 및 "제2"(예를 들어, 제2 단백질 기능 영역)는 참조상의 구별이나 표현의 명료성을 목적으로 사용되며, 일반적인 순차적 의미를 갖지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 항목들 1 내지 10 중 어느 하나에 관한 것이다:
1. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중특이적 항체:
(a) 항-PD-L1 단일 도메인 항체; 및
(b) 항-4-1BB 단일 도메인 항체.
2. 분리된 폴리뉴클레오타이드로서, 항목 1에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
3. 벡터로서, 항목 2에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
4. 숙주 세포로서, 항목 3에 따른 벡터를 포함하거나, 또는 항목 2에 따른 폴리뉴클레오타이드가 상기 숙주 세포의 게놈에 통합되거나;
또는, 상기 숙주 세포가 항목 1에 따른 이중특이적 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
5. 항목 1에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 하기 단계들을 포함하는, 방법:
(a) 적절한 조건 하에서, 항목 4에 따른 숙주 세포를 배양하여, 이중특이적 항체를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 얻은 배양물을 정제 및/또는 분리하여 이중특이적 항체를 얻는 단계.
6. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역접합체:
(a) 항목 1에 따른 이중특이적 항체; 및
(b) 검출가능한 표지, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성핵종, 또는 효소, 금 나노입자/나노막대, 나노자성 입자, 바이러스 외피 단백질, 또는 VLP, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 커플링 모이어티.
7. 약제, 시약, 검출 플레이트 또는 키트의 제조에 있어서 항목 1에 따른 이중특이적 항체, 또는 항목 6에 따른 면역접합체의 용도로서, 상기 시약, 검출 플레이트 또는 키트가 샘플에서 PD-L1 및/또는 4-1BB를 검출하기 위해 사용되고; 상기 약제가 PD-L1을 발현하는 (즉, PD-L1 양성) 종양을 치료 또는 예방하기 위해 사용되는 것인, 용도.
8. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물:
(i) 항목 1에 따른 이중특이적 항체, 또는 항목 6에 따른 면역접합체; 및
(ii) 약제학적으로 허용가능한 담체.
9. 하기를 포함하는, 하기 군으로부터 선택된 항목에 따른 이중특이적 항체의 하나 이상의 용도:
(i) 인간 PD-L1 분자 및/또는 4-1BB 분자를 검출하기 위한 용도; (ii) 흐름 검출을 위한 용도; (iii) 세포 면역형광 검출을 위한 용도; (iv) 종양 치료를 위한 용도; (v) 종양의 진단을 위한 용도; (vi) PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하기 위한 용도; 및 (vii) 4-1BB에 결합하여 면역 세포를 활성화시키기 위한 용도.
10. 재조합 단백질로서, (i) 항목 1에 따른 이중특이적 항체; 및 (ii) 발현 및/또는 정제를 보조하는 선택적인 태그 서열을 포함하는 것인, 재조합 단백질.
추가로, 본 발명은 하기 제1 양태 내지 제14 양태 중 어느 하나에 관한 것이다:
본 발명의 제1 양태에서, 하기를 포함하는 이중특이적 항체가 제공된다:
(a) 항-PD-L1 단일 도메인 항체; 및
(b) 항-4-1BB 단일 도메인 항체.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 1 내지 3개의 항-PD-L1 단일 도메인 항체를 포함하고, 바람직하게는, 1 또는 2개의 항-PD-L1 단일 도메인 항체를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, PD-L1 단일 도메인 항체는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 1 내지 3개의 항-4-1BB 단일 도메인 항체를 포함하고, 바람직하게는, 1 또는 2개의 항-4-1BB 단일 도메인 항체를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 4-1BB 단일 도메인 항체는 면역 세포를 활성화시킬 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 인간 면역글로불린으로부터 유도된 Fc 영역을 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 인간 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는 IgG1이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체의 Fc 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: CH1+CL1 도메인, 인간 IgG 도메인 또는 이들의 조합.
다른 바람직한 실시형태에서, Fc 영역은 조작된 돌연변이, 바람직하게는 LALA 돌연변이이고, 놉-인-홀 돌연변이를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 펩타이드 사슬 i 및 펩타이드 사슬 ii로 구성된 이량체이고, 상기 펩타이드 사슬 i과 펩타이드 사슬 ii는 각각 화학식 I과 화학식 II에 나타낸 구조를 가진다.
A-L1-Fc1-L2-B (화학식 I)
A-L3-Fc2-L4-B (화학식 II)
상기 화학식 I 및 II에서,
A 및 B는 독립적으로 부재하거나, 항-PD-L1 단일 도메인 항체이거나, 또는 항-4-1BB 단일 도메인 항체이고;
L1, L2, 및 L3은 각각 독립적으로 부재하거나 연결 요소이며;
L4는 연결 요소이고;
Fc1 및 Fc2는 각각 독립적으로 인간 면역글로불린의 Fc 영역 (바람직하게는 LALA 돌연변이)이며;
"-"는 펩타이드 결합이고;
상기 이중특이적 항체는 적어도 하나의 항-PD-L1 단일 도메인 항체 및 적어도 하나의 항-4-1BB 단일 도메인 항체를 포함하며;
이 경우, 화학식 I로 나타낸 폴리펩타이드와 화학식 II로 나타낸 폴리펩타이드는 디설파이드 결합 상호작용 및 놉-인-홀 구조를 통해 이종이량체를 형성한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 동종이량체 또는 이종이량체이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, Fc 영역은 LALA 돌연변이 Fc이고, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, Fc1 및 Fc2는 각각 놉 돌연변이 및 홀 돌연변이를 갖는다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, Fc1의 아미노산 서열에서, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 기초하면, 132번째 위치에 S132C 돌연변이가 있고, 144번째 위치에 T144W 돌연변이가 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, Fc2의 아미노산 서열에서, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 기초하면, 127번째 위치에 Y127C 돌연변이가 있고, 144번째 위치에 T144S 돌연변이가 있으며, 146번째 위치에 L146A 돌연변이가 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, Fc1은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 8에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, Fc2는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 9에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 항-4-1BB 단일 도메인 항체는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 2에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 항-PD-L1 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 4에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 링커 서열은 (G4S)n (여기서, n은 양의 정수 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)이고, 바람직하게는 n은 2 또는 4임)이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 링커는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 5에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 이황화 결합을 통해 2개의 동일한 펩타이드 사슬에 의해 형성되는 동종이량체로서, 상기 펩타이드 사슬은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 (즉, Bi-400)을 갖거나, 또는 서열번호 1에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 이황화 결합을 통해 2개의 동일한 펩타이드 사슬에 의해 형성되는 동종이량체로서, 상기 펩타이드 사슬은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열 (즉, Bi-088)을 갖거나, 또는 서열번호 6에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 놉-인-홀 상호작용 (Knob-in-hole)을 통해 펩타이드 사슬 i과 펩타이드 사슬 ii에 의해 형성되는 이종이량체로서; 상기 펩타이드 사슬 i는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 7에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가지며; 상기 펩타이드 사슬 ii는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 9에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다 (즉, Bi-401-091).
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 놉-인-홀 상호작용 (Knob-in-hole)을 통해 펩타이드 사슬 i과 펩타이드 사슬 ii에 의해 형성되는 이종이량체로서; 상기 펩타이드 사슬 i는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 7에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가지며; 상기 펩타이드 사슬 ii는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 10에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다 (즉, Bi-061-091).
본 발명의 제2 양태에서는, 본 발명의 제1 양태에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 항체가 이종이량체인 경우, 폴리뉴클레오타이드에서, 펩타이드 사슬 i를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 펩타이드 사슬 ii를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 1:1의 비율로 존재한다.
본 발명의 제3 양태에서는, 본 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 벡터는 DNA, RNA, 바이러스 벡터, 플라스미드, 트랜스포존, 기타 유전자 전달 시스템, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; 바람직하게는, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스, 아데노바이러스, AAV 바이러스, 레트로바이러스, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 제4 양태에서는, 숙주 세포가 제공되는데, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터를 포함하거나, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오타이드가 이의 게놈에 통합되거나;
또는, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제1 양태에 따른 이중특이적 항체를 발현한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 에쉐리키아 콜라이, 효모 세포 및 포유류 세포.
본 발명의 제5 양태에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 본 발명의 제1 양태에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법이 제공된다:
(a) 본 발명의 제4 양태에 따른 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하여 이중특이적 항체를 함유하는 배양물을 얻는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 얻은 배양물을 정제 및/또는 분리하여 이중특이적 항체를 얻는 단계.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 정제는 단백질 A 친화성 컬럼 정제 및 분리를 통해 표적 항체에 수행할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 정제된 표적 항체의 순도는 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 바람직하게는 100%이다.
본 발명의 제6 양태에서는, 하기를 포함하는 면역접합체가 제공된다:
(a) 본 발명의 제1 양태에 따른 이중특이적 항체; 및
(b) 검출가능한 표지, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성핵종, 또는 효소, 금 나노입자/나노막대, 나노자성 입자, 바이러스 외피 단백질, 또는 VLP, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 커플링 모이어티.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 방사성핵종은 하기를 포함한다:
(i) Tc-99m, Ga-68, F-18, I-123, I-125, I-131, In-111, Ga-67, Cu-64, Zr-89, C-11, Lu-177, Re-188, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 진단용 동위원소; 및/또는
(ii) Lu-177, Y-90, Ac-225, As-211, Bi-212, Bi-213, Cs-137, Cr-51, Co-60, Dy-165, Er-169, Fm-255, Au-198, Ho-166, I-125, I-131, Ir-192, Fe-59, Pb-212, Mo-99, Pd- 103, P-32, K-42, Re-186, Re-188, Sm-153, Ra223, Ru-106, Na24, Sr89, Tb-149, Th-227, Xe-133 Yb-169, Yb-177, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료용 동위원소.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 커플링 모이어티는 약물 또는 독소이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 약물은 세포독성 약물이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 세포독성 약물은 항튜불린 약물(anti-tubulin drug), DNA 작은 홈 결합제(DNA minor groove binding agent), DNA 복제 억제제, 알킬화제, 항생제, 엽산 길항제, 항대사물질, 화학요법 A 증감제, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히 유용한 세포독성 약물 부류의 예로는, 예를 들어, DNA 작은 홈 결합제, DNA 알킬화제, 및 튜불린 억제제가 포함된다. 통상적인 세포독성 약물은, 예를 들어, 아우리스타틴(auristatin), 캄프토테신(camptothecin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 에토포사이드(etoposide), 메이탄신(maytansine), 및 메이탄시노이드(maytansinoid)(예를 들어, DM1 및 DM4), 탁산, 벤조디아제핀, 또는 벤조디아제핀 함유 약물(예를 들어, 피롤로[1,4]벤조디아제핀(PBD), 인돌리노벤조디아제핀, 및 옥사졸리디노벤조디아제핀), 빈카 알칼로이드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 독소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
아우리스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 F, MMAE, 및 MMAF), 아우레오마이신(aureomycin), 메이탄시노이드, 리신, 리신 A-쇄(ricin A-chain), 콤브레타스타틴(combretastatin), 듀오카르마이신, 돌라스타틴(dolastatin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), cc1065, 브롬화에티듐(ethidium bromide), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드, 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicine), 디하이드록시안트라신디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin: PE) A, PE40, 아브린(abrin), 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄(modeccin A chain), α-사르시나(α-Sarcina), 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레트스트릭토신(retstrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 쿠리신(curicin), 크로틴(crotin), 칼리케아미신(calicheamicin), 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 및 이들의 조합.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 커플링 모이어티는 검출가능한 표지이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 접합체는 형광 또는 발광 표지, 방사성 표지, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(컴퓨터 X선 단층촬영) 조영제(contrast agent), 또는 검출가능한 생성물을 생산할 수 있는 효소, 방사성핵종, 생물독소(biotoxin), 사이토카인(예를 들어, IL-2), 항체, 항체 Fc 단편, 항체 scFv 단편, 금 나노입자/나노막대, 바이러스 입자, 리포솜, 나노자성 입자, 전구약물 활성화 효소(예를 들어, DT-디아포라제(DT-diaphorase: DTD) 또는 비페닐하이드롤라제 유사 단백질(biphenylhydrolase-like protein: BPHL)), 및 화학요법제(예를 들어, 시스플라틴)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 면역접합체는 본 발명의 제1 양태에 기재된 바와 같은 다가 (예를 들어, 2가)의 이중특이적 항체를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 다가라고 하면, 상기 면역접합체가 본 발명의 제1 양태에 따른 이중특이적 항체의 다수의 반복부들을 포함하는 아미노산 서열들을 가진다는 것을 의미한다.
본 발명의 제7 양태에서는, 약제, 시약, 검출 플레이트 또는 키트의 제조에 있어서 본 발명의 제1 양태에 기재된 이중특이적 항체, 또는 본 발명의 제6 양태에 기재된 면역접합체의 용도가 제공되는데; 이때 상기 시약, 검출 플레이트 또는 키트는 샘플에서 PD-L1 및/또는 4-1BB를 검출하는데 사용되며; 상기 약제는 PD-L1을 발현하는 종양 (즉, PD-L1 양성)을 치료 또는 예방하는데 사용된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 면역접합체의 커플링 모이어티는 진단용 동위원소이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 시약은 동위원소 추적자(isotopic tracer), 조영제, 흐름 검출 시약(flow detection reagent), 세포 면역형광 검출 시약, 자성 나노입자, 및 영상화제(imaging agent)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시약이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 샘플 내 PD-L1 및/또는 4-1BB를 검출하기 위한 시약은 PD-L1 및/또는 4-1BB 분자 (생체내)를 검출하기 위한 조영제이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 검출은 생체내 검출 또는 시험관내 검출이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 검출은 흐름 검출 및 세포 면역형광 검출을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 제제는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단함과 동시에, 4-1BB에 결합하여 면역 세포를 활성화시키는데 사용된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 종양은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수병증, 비호지킨 림프종, 결장직장암, 유방암, 결장직장암, 위암, 간암, 백혈병, 신장 종양, 폐암, 소장암, 골암, 전립선암, 전립선암, 자궁경부암, 림프종, 부신 종양, 방광 종양 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 제8 양태에서는, 하기를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다:
(i) 본 발명의 제1 양태에 기재된 이중특이적 항체, 또는 본 발명의 제6 양태에 기재된 면역접합체; 및
(ii) 약제학적으로 허용가능한 담체.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 면역접합체의 커플링 모이어티는 약물, 독소, 및/또는 치료용 동위원소이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 세포독성 약물과 같은 종양 치료를 위한 추가 약물을 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 추가의 종양 치료용 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 악시티닙(axitinib), 렌바티닙(lenvatinib), 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 PD-L1 단백질을 발현하는 종양 (즉, PD-L1 양성)을 치료하는데 사용된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 주사제 형태이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 종양을 예방 및 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다.
본 발명의 제9 양태에서는, 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 본 발명의 제1 양태에 따른 이중특이적 항체의 하나 이상의 용도가 제공된다:
(i) 인간 PD-L1 분자 및/또는 4-1BB 분자를 검출하기 위한 용도; (ii) 흐름 검출을 위한 용도; (iii) 세포 면역형광 검출을 위한 용도; (iv) 종양 치료를 위한 용도; (v) 종양의 진단을 위한 용도; (vi) PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하기 위한 용도; 및 (vii) 4-1BB에 결합하여 면역 세포를 활성화시키기 위한 용도.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 종양은 PD-L1 단백질을 발현하는 종양 (즉, PD-L1 양성)이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 용도는 비진단적 용도 및 비치료적 용도이다.
본 발명의 제10 양태에서는, 재조합 단백질로서, (i) 본 발명의 제1 양태에 따른 이중특이적 항체; 및 (ii) 선택적으로, 발현 및/또는 정제를 보조하기 위한 태그 서열을 갖는, 재조합 단백질이 제공된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 태그 서열은 6His 태그, HA 태그, 및 Fc 태그를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 재조합 단백질은 PD-L1 및/또는 4-1BB에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 제11 양태에서는, 하기 단계들을 포함하는, 샘플에서 PD-L1 및/또는 4-1BB를 검출하는 방법이 제공된다: (1) 샘플을 본 발명의 제1 양태에 기재된 이중특이적 항체와 접촉시키는 단계; (2) 항원-항체 복합체가 형성되었는지의 여부를 검출하는 단계 - 이때, 복합체의 형성은 샘플에서 PD-L1 및/또는 4-1BB의 존재를 의미함 -.
본 발명의 제12 양태에서는, 질병을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 제1 양태에 기재된 이중특이적 항체, 또는 본 발명의 제6 양태에 기재된 면역접합체, 또는 본 발명의 제8 양태에 기재된 약제학적 조성물을, 상기 질병의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함한다.
본 발명의 제13 양태에서는, PD-L1 및/또는 4-1BB 검출 시약으로서, 상기 검출 시약이 본 발명의 제6 양태에 기술된 면역접합체 및 검출에 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출 시약이 제공된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 면역접합체의 커플링 모이어티는 진단용 동위원소이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출에 허용가능한 담체는 무독성의 불활성 수성 담체 매질이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출 시약은 동위원소 추적자, 조영제, 흐름 검출 시약, 세포 면역형광 검출 시약, 자성 나노입자, 및 영상화제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시약이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출 시약은 생체내 검출에 사용된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출 시약의 제형은 액체 또는 분말 (예를 들어, 수용액, 주사제, 동결 건조 분말, 정제, 협측 제제, 에어로졸)이다.
본 발명의 제14 양태에서는, PD-L1 및/또는 4-1BB를 검출하기 위한 키트로서, 상기 키트가 본 발명의 제6 양태에 기재된 면역접합체, 또는 본 발명의 제13 양태에 기재된 검출 시약, 및 설명서를 포함하는 것인, 키트가 제공된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 설명서는 키트가 대상체에서 PD-L1 및/또는 4-1BB 발현의 비침습적 검출에 사용되는 것으로 설명하고 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 키트는 PD-L1 단백질을 발현하는 종양 (즉, PD-L1 양성)의 검출에 사용된다.
용어
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 특정 용어들을 먼저 정의한다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 달리 명시하지 않는 한, 하기 용어들은 각각 아래에 주어진 의미를 갖는다. 다른 정의들은 본 출원 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 통상의 기술자에 의해 측정된 특정 값 또는 조성의 경우에 허용가능한 오차 범위 내의 값 또는 조성을 지칭할 수 있으며, 이는 해당 값 또는 조성이 측정 또는 결정된 방법에 부분적으로 좌우될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "~을 제공하다" 및 "~을 투여하다"는 서로 교환하여 사용되는 것으로, 본 발명의 생성물을 당업자에게 공지된 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입을 사용하여 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 가리킨다.
이중특이적 항체
본 명세서에서 사용된 용어 "본 발명의 이중특이적 항체", "본 발명의 이중 항체", 및 "항-PD-L1/4-1BB 이중특이적 항체"는 동일한 의미를 가지며, 이들은 모두 PD-L1과 4-1BB를 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 지칭한다.
본 발명은 항-PD-L1 단일 도메인 항체, 및 항-4-1BB 단일 도메인 항체를 포함하는 항-PD-L1/4-1BB 이중특이적 항체를 제공한다.
바람직하게는, 이중특이적 항체는 펩타이드 사슬 i 및 펩타이드 사슬 ii로 구성된 이량체이고, 상기 펩타이드 사슬 i과 펩타이드 사슬 ii의 구조는 각각 화학식 I과 화학식 II에 나타내었다:
A-L1-Fc1-L2-B (화학식 I)
A-L3-Fc2-L4-B (화학식 II)
상기 화학식 I 및 II에서,
A 및 B는 독립적으로 부재하거나, 항-PD-L1 단일 도메인 항체이거나, 또는 항-4-1BB 단일 도메인 항체이고;
L1, L2, 및 L3은 각각 독립적으로 부재하거나 링커이며;
L4는 링커이고;
Fc1 및 Fc2는 각각 독립적으로 인간 면역글로불린의 Fc 영역 (바람직하게는 LALA 돌연변이)이며;
"-"는 펩타이드 결합이고;
상기 이중특이적 항체는 적어도 하나의 항-PD-L1 단일 도메인 항체 및 적어도 하나의 항-4-1BB 단일 도메인 항체를 포함하며;
이 경우, 화학식 I로 나타낸 폴리펩타이드와 화학식 II로 나타낸 폴리펩타이드는 디설파이드 결합 상호작용 및 놉-인-홀 구조 (Knob-in-hole)를 통해 이종이량체를 형성한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 동종이량체 또는 이종이량체이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, Fc 영역은 LALA 돌연변이 Fc이고, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
다른 실시형태에서, Fc1 및 Fc2는 각각 놉 돌연변이와 홀 돌연변이를 가진다. 여기서, 놉 돌연변이는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 기초하여, 132번 위치에 S132C 돌연변이가 있고, 144번 위치에 T144W 돌연변이가 있음을 의미한다. 홀 돌연변이는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에 기초하여, 127번 위치에 Y127C 돌연변이가 있고, 144번 위치에 T144S 돌연변이가 있으며, 146번 위치에 L146A 돌연변이가 있음을 의미한다.
바람직하게는, Fc1은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 8에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가지고; Fc2는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 9에 기재된 서열과 ≥85% (바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%)의 서열 동일성을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일 도메인 항체", "나노항체 VHH", 및 "나노항체"는 동일한 의미를 가지며, 항체 중쇄 가변 영역을 클로닝하여 구축된 하나의 중쇄 가변 영역만으로 이루어진 나노항체 (VHH)를 의미하며, 이는 완전한 기능을 갖는 가장 작은 항원 결합 단편이다. 보통, 경쇄 및 중쇄 불변 영역 1 (CH1)이 선천적으로 결핍되어 있는 항체를 수득한 후, 항체 중쇄 가변 영역을 클로닝하여 하나의 중쇄 가변 영역만으로 이루어진 나노항체 (VHH)를 구축한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "가변"이라는 것은, 항체 가변 영역의 특정 부분이 서열상 서로 다름을 의미하며, 이 부분이 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합과 특이성의 원인이 된다. 하지만, 가변성은 항체 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지는 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 영역에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라고 하는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 보존된 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 대략적으로 접힌 입체형태로 존재하고, 연결 루프(joining loop)를 형성하는 3개의 CDR들에 의해 연결되는 4개의 FR 영역들을 포함하는데, 이는 경우에 따라서 부분적으로 접힌 구조를 형성할 수도 있다. 각 사슬의 CDR들은 FR 영역들에 의해 근접하게 되고, 다른 사슬의 CDR들과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다(Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pp. 647-669 (1991) 참조). 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 예를 들어, 항체의 항체 의존성 세포독성에 관여하는 것과 같이 서로 다른 이펙터 기능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프레임워크 영역"(FR)은 CDR들 사이에 삽입된 아미노산 서열, 즉, 단일 종의 상이한 면역글로불린들 중에서 상대적으로 보존적인 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역들의 일부를 의미한다. 각각의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 각각 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, 및 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H로 지칭되는 4개의 FR들을 갖는다. 따라서, 경쇄 가변 도메인은 (FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)- (CDR3-L)-(FR4-L)로 지칭될 수 있으며, 중쇄 가변 도메인은 (FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)로 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 FR은 인간 항체 FR 또는 이의 유도체이며, 상기 인간 항체 FR 유도체는 천연 발생 인간 항체 FR과 실질적으로 동일하고, 즉, 서열 동일성이 85%, 90%, 95%, 또는 96%, 97%, 98%, 또는 99%에 이른다.
CDR의 아미노산 서열을 알면, 당업자라면 누구나 프레임워크 영역 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L 및/또는 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H를 쉽게 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 프레임워크 영역"은 천연 발생 인간 항체 프레임워크 영역과 실질적으로(약 85% 이상, 구체적으로는 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일한 프레임워크 영역이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "친화성"은 이론적으로 온전한 항체와 항원 사이의 평형 결합으로 정의된다. 본 발명의 이중특이적 항체의 친화성은 KD 값(해리 상수) 또는 다른 측정 방법에 의해 평가 또는 결정될 수 있으며, 예를 들어, FortebioRed96 기기를 사용하여 생물층 간섭계(BLI)로 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "링커"는 경쇄 및 중쇄의 도메인들이 이중 가변 영역들이 교환된 면역글로불린으로 접힐 수 있게 충분한 이동성을 제공하도록, 면역글로불린 도메인에 삽입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 의미한다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 면역접합체 및 융합 발현 산물은 약물, 독소, 사이토카인, 방사성핵종, 효소, 및 기타 진단 또는 치료 분자를 본 발명의 항체 또는 이의 단편에 결합시켜 형성된 접합체를 포함한다. 또한, 본 발명은 PD-L1/4-1BB 이중특이적 항체 또는 이의 단편에 결합하는 세포 표면 마커 또는 항원을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "가변 영역" 및 "상보성 결정 영역(CDR)"은 서로 혼용되어 사용된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체의 중쇄 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역인, CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체의 중쇄는 상기 언급된 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명에서, "본 발명의 항체", "본 발명의 단백질", 또는 "본 발명의 폴리펩타이드"라는 용어는 서로 혼용되어 사용되며, 모두 PD-L1 및/또는 4-1BB 단백질, 예를 들어, 중쇄 가변 영역들을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 가리킨다. 이는 개시 메티오닌을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체를 갖는 다른 단백질 또는 융합 발현 산물을 추가로 제공한다. 구체적으로, 본 발명은, 가변 영역이 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역과 동일하거나 적어도 90% 상동성, 바람직하게는 적어도 95% 상동성인 한, 가변 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 임의의 단백질 또는 단백질 접합체, 및 융합 발현 산물(즉, 면역접합체 및 융합 발현 산물)을 포함한다.
일반적으로, 항체의 항원 결합 특성은 중쇄 가변 영역에 위치한 3개의 특정 영역들로 설명될 수 있는데, 이들을 CDR들이라고 하며, 세그먼트를 4개의 프레임워크 영역(FR)들로 구분하고, 4개의 FR들의 아미노산 서열은 상대적으로 보존적이며, 결합 반응에 직접 참여하지 않는다. 이들 CDR들은 고리 구조를 형성하며, 이들 사이에 있는 FR들에 의해 형성된 β 접힘은 공간 구조에서 서로 가깝게 위치하고, 중쇄의 CDR들과 경쇄의 상응하는 CDR들이 항체의 항원 결합 부위를 구성한다. 동일한 유형의 항체들의 아미노산 서열들을 비교함으로써, 어떤 아미노산들이 FR 또는 CDR 영역들을 구성하는지 확인할 수 있다.
본 발명의 항체의 중쇄들의 가변 영역들은 적어도 이들 중 일부가 항원과의 결합에 관여하기 때문에 특히 중요하다. 따라서, 본 발명은, CDR이 본 명세서에서 식별된 CDR과 90% 이상(바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상) 상동성이기만 하면, CDR을 갖는 항체 중쇄 가변 영역을 갖는 분자를 포함한다.
본 발명은 온전한 항체뿐만 아니라 면역 활성을 갖는 항체 단편, 또는 항체와 다른 서열로 형성된 융합 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명은 항체의 단편, 유도체, 및 유사체를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단편", "유도체", 및 "유사체"는 본 발명의 항체와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드 단편, 유도체, 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 치환된 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)를 갖는 폴리펩타이드 - 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화되거나 암호화되지 않을 수 있음 -, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에 치환기를 갖는 폴리펩타이드, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩타이드를 다른 화합물(예를 들어, 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 화합물, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)에 융합시켜 형성된 폴리펩타이드, 또는 (iv) 추가적인 아미노산 서열을 폴리펩타이드 서열에 융합시켜 형성된 폴리펩타이드(예를 들어, 리더 서열 또는 분비 서열 또는 폴리펩타이드를 정제하기 위한 서열 또는 프로단백질(proprotein) 서열, 또는 6His 태그에 의해 형성된 융합 단백질)일 수 있다. 본 명세서의 교시에 비추어 볼 때, 이러한 단편, 유도체, 및 유사체는 당업자의 이해 범위 내에 있다.
본 발명의 항체는 PD-L1 및/또는 4-1BB 단백질에 결합하는 활성을 갖는 이중 항체를 의미한다. 이 용어는 또한, 본 발명의 항체와 동일한 CDR 영역들을 포함하고, 본 발명의 항체와 동일한 기능을 갖는 폴리펩타이드 변이체를 의미한다. 이러한 변이체 형태는 하나 이상(보통 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 바람직하게는 1 내지 20개, 가장 바람직하게는 1 내지 10개)의 아미노산 결실, 삽입, 및/또는 치환, 및 C-말단 및/또는 N-말단에서 1개 또는 수 개(보통 20개 이내, 바람직하게는 10개 이내, 보다 바람직하게는 5개 이내)의 아미노산 첨가를 포함한다(하지만 이에 제한되지 않음). 예를 들어, 당업계에서, 근접하거나 유사한 성질을 갖는 아미노산의 치환은 일반적으로 단백질의 기능을 변화시키지 않는다. 또 다른 예로서, C-말단 및/또는 N-말단에 1개 또는 수 개의 아미노산을 첨가하는 것은 일반적으로 단백질의 기능을 변화시키지 않는다. 이 용어는 또한 본 발명의 항체의 활성 단편 및 활성 유도체도 의미한다.
폴리펩타이드의 변이체는 다음을 포함한다: 상동성 서열, 보존적 변이체, 대립형질 변이체, 천연 돌연변이체, 유도된 돌연변이체, 높은 또는 낮은 엄격성 조건 하에서 본 발명의 항체의 DNA에 혼성화될 수 있는 DNA에 의해 암호화된 단백질, 및 본 발명의 항체에 대한 항혈청을 사용하여 얻은 폴리펩타이드 또는 단백질.
본 발명은 단일 도메인 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질과 같은 다른 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 본 발명은, 실질적으로 전장 폴리펩타이드 외에도, 본 발명의 단일 도메인 항체의 단편들을 추가로 포함한다. 통상적으로, 상기 단편은 본 발명의 항체의 적어도 약 50개의 연속 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 50개의 연속 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 80개의 연속 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속 아미노산을 갖는다.
본 발명에서 "본 발명의 항체의 보존적 변이체"는 최대 10개, 바람직하게는 최대 8개, 보다 바람직하게는 최대 5개, 가장 바람직하게는 최대 3개의 아미노산 서열을 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 비교하여 유사하거나 근접한 성질을 갖는 아미노산으로 치환하여 형성된 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 보존적 변이체 폴리펩타이드는 바람직하게는 표 A에 따른 아미노산 치환에 의해 생성된다.
Figure pct00001
본 발명은 또한, 상기 언급된 항체 또는 이의 단편, 또는 이의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA 형태는 cDNA, 게놈 DNA, 또는 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 암호화 가닥 또는 비암호화 가닥일 수 있다.
본 발명의 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 다음을 포함한다: 성숙한 폴리펩타이드만을 암호화하는 암호화 서열; 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열, 및 다양한 추가 암호화 서열; 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열(및 선택적인 추가 암호화 서열), 및 비암호화 서열.
용어 "폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드"는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 추가 암호화 및/또는 비암호화 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한, 상기 언급된 서열에 혼성화되고, 두 서열들 사이에 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 엄격한 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명에서 "엄격한 조건"은 다음을 의미한다: (1) 보다 낮은 이온 강도 및 보다 높은 온도, 예를 들어, 0.2×SSC, 0.1% SDS, 60℃에서의 혼성화 및 용리; 또는 (2) 변성제, 예를 들어, 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소 혈청/0.1% Ficoll, 42℃ 등의 존재 하에 혼성화; 또는 (3) 두 서열들 간의 동일성이 적어도 90%, 바람직하게는 95% 초과인 경우에만 발생하는 혼성화. 또한, 혼성화 가능한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드는 성숙한 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능 및 활성을 갖는다.
본 발명의 항체의 전장 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편은 일반적으로 PCR 증폭, 재조합, 또는 인공 합성에 의해 얻을 수 있다. 실행 가능한 방법은, 특히 단편 길이가 짧은 경우, 인공 합성을 사용하여 관련 서열들을 합성하는 것이다. 일반적으로, 서열이 매우 긴 단편은 여러 개의 작은 단편들을 합성한 다음 이들을 연결하여 얻는다. 또한, 중쇄의 암호화 서열을 발현 태그(예를 들어, 6His)와 융합하여 융합 단백질을 형성할 수도 있다.
일단 관련된 서열이 얻어지면, 재조합 방법을 사용하여 관련된 서열들을 대량으로 얻을 수 있다. 일반적으로, 이를 벡터에 클로닝한 다음, 세포에 형질전환시킨 후, 증식된 숙주 세포로부터 통상적인 방법에 의해 관련된 서열을 분리한다. 본 발명에 관여하는 생체분자 (핵산, 및 단백질 등)는 분리된 형태의 생체분자를 포함한다.
현재, 본 발명의 단백질(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 암호화하는 DNA 서열은 화학적 합성을 통해 완전히 얻을 수 있다. 이어서, DNA 서열은 당업계에 공지된 다양한 기존 DNA 분자들(예를 들어, 벡터들) 및 세포들에 도입될 수 있다. 또한, 화학적 합성에 의해 본 발명의 단백질 서열에 돌연변이를 도입할 수도 있다.
본 발명은 또한, 상기 언급된 적절한 DNA 서열, 및 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터들은 적절한 숙주 세포들로 형질전환되어 이들이 단백질을 발현하도록 하는데 사용될 수 있다.
숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예는 다음과 같다: 에쉐케리키아 콜라이, 스트렙토마이세스; 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)과 같은 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 드로소필라 S2 또는 Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS7, 293 세포, 등과 같은 동물 세포.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 숙주가 에쉐케리키아 콜라이와 같은 원핵 유기체인 경우, DNA를 흡수할 수 있는 컴피턴트 세포(competent cell)는 지수 증식기 후에 수집되어 당업계에 잘 알려진 절차를 사용하여 CaCl2로 처리될 수 있다. 또 다른 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 필요한 경우, 전기천공법을 사용하여 형질전환을 수행할 수도 있다. 숙주가 진핵 유기체인 경우, 다음과 같은 DNA 형질감염 방법을 사용할 수 있다: 인산칼슘 공침법, 및 미세주입, 전기천공법, 및 리포솜 패키징 등과 같은 통상적인 기계적 방법.
획득된 형질전환체는 본 발명의 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 통상적인 방법에 의해 배양될 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 사용되는 숙주 세포에 따라 다양한 통상적인 배지 중에서 선택될 수 있다. 상기 배양은 숙주 세포의 성장에 적합한 조건에서 수행된다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장한 후, 적절한 방법(예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 선택된 프로모터가 유도되고, 세포를 추가 시간 동안 배양한다.
상기 방법에서 재조합 폴리펩타이드는 세포 내부 또는 세포막에서 발현되거나 세포 외부로 분비될 수 있다. 재조합 단백질은, 필요한 경우, 이의 물리적, 화학적, 및 기타 특성을 이용하여 다양한 분리 방법들을 통해 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법들의 예로는 통상적인 복원(renaturation) 처리, 단백질 침전제 처리(염석법(salting out method)), 원심분리, 삼투압 파괴, 초처리(supertreatment), 초원심분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 다양한 기타 액체 크로마토그래피 기술, 및 이러한 방법들의 조합이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체는 단독으로 사용되거나, 검출가능한 표지(진단 목적), 치료제, PK(단백질 키나제) 변형 모이어티, 또는 이들 물질들 중 어느 것의 조합과 조합되거나 접합될 수 있다.
진단 목적을 위한 검출가능한 표지는 형광 또는 발광 표지, 방사성 표지, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(컴퓨터 단층촬영) 조영제, 또는 검출가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체와 조합되거나 접합될 수 있는 치료제로는 다음이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 1. 방사성핵종; 2. 생물학적 독성; 3. IL-2 등과 같은 사이토카인; 4. 금 나노입자/나노막대; 5. 바이러스; 6. 리포솜; 7. 나노자성 입자; 8. 전구약물 활성화 효소(예를 들어, DT-디아포라제(DTD) 또는 비페닐하이드롤라제-유사 단백질(BPHL)); 9. 화학요법제(예를 들어, 시스플라틴), 또는 임의의 형태의 나노입자, 등.
약제학적 조성물
본 발명은 조성물도 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 상기 언급된 항체 또는 이의 활성 단편, 또는 이의 융합 단백질, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 일반적으로, 이러한 물질들은 비독성, 불활성, 및 약제학적으로 허용가능한 수성 담체 매질에서 제형화될 수 있으며, 이때 pH 값은 제형화된 물질의 성질 및 처리될 조건에 따라 변할 수 있지만, pH는 보통 약 5 내지 8, 바람직하게는 약 6 내지 8이다. 제조된 약제학적 조성물은 종양내, 복강내, 정맥내, 또는 국소 투여를 포함하는(하지만 이에 제한되지 않는) 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 PD-L1 및/또는 4-1BB 단백질 분자들의 결합에 직접 사용될 수 있으므로 종양 치료에 사용될 수 있다. 또한, 추가 치료제를 병용할 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 안전하고 유효한 양(예를 들어, 0.001 내지 99중량%, 바람직하게는 0.01 내지 90중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 80중량%)의 상기 언급된 본 발명의 단일 도메인 항체(또는 이의 접합체), 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충액, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 약제학적 제형은 투여 방식에 부합되어야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 생리 식염수, 또는 글루코스 및 기타 보조제를 포함하는 수용액을 사용하여 통상적인 방법에 의해 주사제 형태로 제조될 수 있다. 주사제 또는 용액과 같은 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균 조건 하에서 제조된다. 활성 성분은 치료적 유효량, 예를 들어, 하루에 체중 1kg당 약 10㎍ 내지 체중 1kg당 약 50mg으로 투여된다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 추가적인 치료제와 함께 사용될 수도 있다.
약제학적 조성물을 사용하는 경우, 안전하고 유효한 양의 면역접합체가 포유동물에게 투여되며, 이때 상기 안전하고 유효한 양은 일반적으로 체중 1kg당 적어도 약 10㎍이고, 대부분의 경우, 체중 1kg당 약 50mg 이하이며; 바람직하게는, 투여량은 체중 1kg당 약 10㎍ 내지 체중 1kg당 약 10mg이다. 그럼에도 불구하고, 특정 투여량에 대해 투여 경로 및 환자의 건강 상태와 같은 요인들도 고려되어야 하며, 이는 숙련된 의사의 기술 범위 내에 있다.
표지된 항체
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체는 검출가능한 표지를 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 표지는 동위원소, 콜로이드성 금 표지, 유색 표지, 및 형광 표지로 이루어진 군으로부터 선택된다.
콜로이드성 금 표지는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, PD-L1/4-1BB 이중특이적 항체는 콜로이드성 금으로 표지되어 콜로이드성 금 표지된 항체를 얻을 수 있다.
검출 방법
본 발명은 또한 PD-L1 및/또는 4-1BB 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대략 다음 단계들을 포함한다: 세포 및/또는 조직 샘플을 얻는 단계; 샘플을 배지에 용해시키는 단계; 및 용해된 샘플에서 PD-L1 및/또는 4-1BB 단백질 수준을 검출하는 단계.
본 발명의 검출 방법에서 사용된 샘플은 특별히 제한되지 않으며, 대표적인 예로는 세포 보존 용액에 존재하는 세포 함유 샘플이 있다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 항체(또는 이의 단편) 또는 검출 플레이트를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 키트는 용기, 사용 설명서, 완충액 등을 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 PD-L1 및/또는 4-1BB 수준을 검출하기 위한 검출 키트를 제공하는 것으로, 상기 키트는 PD-L1 및/또는 4-1BB 단백질을 인식하기 위한 항체, 샘플을 용해시키기 위한 용해 배지, 및 통상적인 검출 시약 및 완충액, 예를 들어 다양한 완충액, 검출 표지, 및 검출 기질 등을 포함한다. 상기 검출 키트는 체외 진단 장치일 수 있다.
용도
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 단일 도메인 항체는 광범위한 생물학적 및 임상적 적용 가치를 가지며, 이의 용도는 PD-L1 및/또는 4-1BB와 관련된 질병의 진단 및 치료, 기초 의학 연구, 및 생물학 연구 등과 같은 많은 분야를 포함한다. 바람직한 용도는 종양 치료와 같이, PD-L1 및/또는 4-1BB에 대한 임상 진단 및 표적 치료 위한 용도이다.
본 발명의 유익한 효과
본 발명은 다음과 같은 기술적 효과들 중 하나 이상을 달성한다:
1) 본 발명의 나노항체는 정확한 공간 구조로 인간 PD-L1 단백질 및 4-1BB 단백질에 대해 매우 특이적이다.
2) 본 발명의 이중특이적 항체는 친화성이 강하다.
3) 본 발명의 이중특이적 항체의 제조는 간단하고 편리하다.
4) 본 발명의 이중특이적 항체는 PD-L1이 수용체 PD-1에 결합하는 것을 차단하는 기능을 갖는다. 이와 동시에, 이중특이적 항체는 면역세포의 4-1BB에도 결합하여, 종양 미세환경에서 면역 세포의 활성을 활성화시키고, 종양의 발생과 발달을 억제하는 효과를 보다 효과적으로 개선할 수 있다.
5) 이중특이적 항체는 안정성이 우수하고 반감기가 길다.
6) 간독성이 적고 안전성이 우수하다.
7) 본 발명의 이중특이적 항체의 제1 단백질 기능 영역과 제2 단백질 기능 영역 사이에 시너지 효과가 있을 가능성은 매우 높다. 예를 들어: PD-L1과 PD-1의 결합을 차단하는 이의 능력은 대조군 항체의 능력보다 훨씬 우수하고; 인간 4-1BB 및 인간 PD-L1 단백질에 대한 결합 수준이 대조군 항체의 결합 수준보다 훨씬 우수하며; 혼합 림프구의 IL-2 분비 유도 등의 관점에서도 대조군 항체보다 우수한데, 이는 본 발명의 이중특이적 항체가 T 세포 등을 더 잘 활성화시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
도 1a 내지 도 1d는 각각의 이중특이적 항체 Bi-400, Bi-088, Bi-401-091 및 Bi-061-091의 구조에 대한 개략도를 나타낸 것이다. 각 모듈의 의미는 다음과 같다:
Figure pct00002

도 2a는 CHO-S 세포 표면에서 과발현된 인간 PD-L1 단백질에 본 발명의 이중특이적 항체가 결합한 것을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 CHO-S 세포 표면에서 과발현된 사이노몰구스 원숭이 PD-L1 단백질에 본 발명의 이중특이적 항체가 결합한 것을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 CHO-S 세포 표면에서 과발현된 인간 4-1BB 단백질에 본 발명의 이중특이적 항체가 결합한 것을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 2d는 CHO-S 세포 표면에서 과발현된 사이노몰구스 원숭이 4-1BB 단백질에 본 발명의 이중특이적 항체가 결합한 것을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 2e는 본 발명의 이중특이적 항체가 CHO-S 세포에 결합한 것을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 이중특이적 항체가 CHO-S 세포 표면에서 과발현된 인간 PD-1 단백질에 대한 PD-L1 단백질의 결합을 차단하는 것을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명의 이중특이적 항체가 인간 4-1BB를 과발현하는 CHO-S 세포와 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-S 세포에 동시에 결합하는 것을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 인간 4-1BB 및 인간 PD-L1 단백질에 동시에 결합하는 본 발명의 이중특이적 항체의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 인간 4-1BB 주르캇 (Jurkat) NF-AT 루시퍼라제 리포터 유전자를 과발현하는 세포와 CHO-S 세포의 공동 항온배양 시스템에서 본 발명의 이중특이적 항체의 형광 신호 활성화 활성을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-S 세포와 인간 4-1BB 주르캇 NF-AT 루시퍼라제 리포터 유전자를 과발현하는 세포의 공동 항온배양 시스템에서 본 발명의 이중특이적 항체의 형광 신호 활성화를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 인간 PD-L1을 과발현하는 CT-26 세포와 인간 4-1BB 주르캇 NF-AT 루시퍼라제 리포터 유전자를 과발현하는 세포의 공동 항온배양 시스템에서 본 발명의 이중특이적 항체의 형광 신호 활성화를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 CHO-S 세포와 인간 1차 T 세포의 공동 항온배양 시스템에서 본 발명의 이중특이적 항체의 T 세포 활성화를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 PD-L1 CHO-S 세포와 인간 1차 T 세포의 공동 항온배양 시스템에서 T 세포를 활성화시켜 IL-2를 분비하는 본 발명의 이중특이적 항체를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 혼합 림프구 반응 시스템에서 T 세포를 활성화시키는 본 발명의 이중특이적 항체를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 마우스에서 본 발명의 이중특이적 항체의 반감기를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 인간 PD-L1 CT-26 세포를 접종한 PD-L1/PD-1/4-1BB 삼중 유전자이식 마우스 모델에서 본 발명의 이중특이적 항체의 약학적 효과를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 인간 PD-L1 MC38 세포를 접종한 인간 PD-L1/4-1BB 이중 유전자이식 마우스 모델에서 본 발명의 이중특이적 항체의 약학적 효과를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 인간 4-1BB 마우스 독성 시험에서 본 발명의 이중특이적 항체에 대한 간조직 HE 염색 결과를 나타낸 것이다. 가로 방향의 각 그룹은 각각 마우스 4마리에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 인간 4-1BB 마우스 독성 시험에서 본 발명의 이중특이적 항체에 대한 간조직 CD8 IHC 염색 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에 관련된 일부 서열들을 하기 표 B에 나타내었다.
Figure pct00003

Figure pct00004

Figure pct00005

Figure pct00006

Figure pct00007

본 발명을 수행하기 위한 구체적인 모델
본 발명을 하기에서 구체적인 실시예와 함께 추가로 설명한다. 이들 실시예들은 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용된 것일 뿐이지, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 없음을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 특정 조건이 부여되지 않은 실험 방법은 일반적으로 문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 조건과 같은 통상적인 조건에 따라, 또는 제조업체가 권장하는 조건에 따라 수행된다. 달리 명시하지 않는 한, 백분율(percentage) 및 부(part)는 중량 기준이다.
명시하지 않은 경우라면, 실시예 2 내지 실시예 12에 사용된 HZ-L-Yr-13&14-16-01 및 C-Ye-18-5의 C-말단을 IgG1 Fc (LALA 돌연변이)에 직접 연결시켰다.
실시예 1: 이중특이적 항체의 클로닝 및 발현
1.1 항체 작제물의 구조
본 실시예에서는, 하기의 항-4-1BB/PD-L1 이중특이적 항체를 구축하였다:
Bi-400: 이것은 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬로 구성되었으며 (2개의 펩타이드 사슬은 그 사이에 2쌍의 이황화 결합으로 연결됨), 그 구조에 대한 도해를 도 1a에 도시되어 있다. 상기 펩타이드 사슬은 항-4-1BB 나노항체 HZ-L-Yr-13&14-16-01의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 포함하는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가졌고, 항-4-1BB 나노항체 아미노산 서열의 C-말단은 인간 IgG1 Fc 아미노산 서열 (LALA 돌연변이가 도입됨, 서열번호 3, IgG1 Fc (LALA)로 명명됨)에 직접 연결되었으며, 항-PD-L1 나노항체 C-Ye-18-5 (공보 번호: CN 112480253A) (서열번호 4)의 N-말단은 21개의 아미노산 잔기들로 된 링커 (G4S)4 (서열번호 5)를 통해 IgG1 Fc (LALA)의 C-말단에 연결되었다.
Bi-088: 이것은 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬로 구성되었으며, 그 구조에 대한 개략도는 도 1b에 도시되어 있고, 상기 펩타이드 사슬은 항-PD-L1 나노항체 C-Ye-18-5 (공보 번호: CN 112480253A)를 포함하는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 가졌고, 상기 나노항체 아미노산 서열의 C-말단은 인간 IgG1 Fc 아미노산 서열 (LALA 돌연변이가 도입됨, 서열번호 3)에 직접 연결되었으며, 항-4-1BB 나노항체 HZ-L-Yr-13&14-16-01의 아미노산 서열 (서열번호 2)의 N-말단은 21개의 아미노산 잔기들로 된 링커 (G4S)4 (서열번호 5)를 통해 IgG1 Fc (LALA)의 C-말단에 연결되어 있다.
Bi-401-091: 이것은 2개의 폴리펩타이드 사슬로 구성되었으며, 이들의 구조에 대한 도해는 도 1c에 도시되어 있고, 여기서 펩타이드 사슬 #1은 항-PD-L1 나노항체 C-Ye-18-5 (공보 번호: CN 112480253A)를 포함하는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가졌고, 상기 나노항체 아미노산 서열의 C-말단은 인간 IgG1 Fc 아미노산 서열 (LALA 돌연변이가 도입되고, 놉-인-홀 돌연변이가 도입됨, 서열번호 8)에 직접 연결되었으며, 항-4-1BB 나노항체 HZ-L-Yr-13&14-16-01 (서열번호 2)의 N-말단은 21개의 아미노산 잔기들로 된 링커 (G4S)4 (서열번호 5)를 통해 Fc의 C-말단에 연결되었고, 펩타이드 사슬 #2는 인간 IgG1 Fc 아미노산 서열 (LALA 돌연변이가 도입되고, 놉-인-홀 돌연변이가 도입됨, 서열번호 9)이었던 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가졌다.
Bi-061-091: 이것은 2개의 폴리펩타이드 사슬로 구성되었으며, 이들의 구조에 대한 도해는 도 1d에 도시되어 있고, 여기서 펩타이드 사슬 #1은 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가졌고, 펩타이드 사슬 #2는 항-PD-L1 나노항체 C-Ye-18-5 (공보 번호: CN 112480253A) (서열번호 4)를 포함하는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 가졌으며, 상기 나노항체 아미노산 서열의 C-말단은 인간 IgG1 Fc 아미노산 서열 (LALA 돌연변이를 도입하여 Fc 기능을 감소시켰고, 놉-인-홀 돌연변이를 도입하여 이종이량체를 형성함, 서열번호 9)에 직접 연결되어 있다.
1.2 유전자 클로닝 및 단백질 제조
표 B의 서열들을 참조하여, 상응하는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 단편들을 pCDNA3.1 벡터 내로 구축하였다. Bi-401-091 및 Bi-061-091의 펩타이드 사슬 #1과 펩타이드 사슬 #2의 경우, 이들 두 서열들은 일시적인 형질감염 동안 2개의 서로 다른 플라스미드에서 발현되었고, 세포 발현 과정 동안 이황화 결합이 자동으로 형성되었다.
ExpiCHO™ 발현 시스템 키트 (Thermo에서 구입)를 사용하여, 플라스미드를 Expi-CHO 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 방법은 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다. 세포들을 5일간 배양한 후, 상청액을 수집하고, 단백질 A 자성 비드(GenScript에서 구입)를 사용하는 분리 방법을 거쳐 표적 단백질을 정제하였다. 자성 비드를 적절한 부피의 결합 완충액 (PBS+0.1% Tween 20, pH 7.4) (자성 비드 부피의 1-4배)으로 재현탁시킨 후, 정제할 샘플에 첨가하고, 부드럽게 흔들면서 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 샘플을 자성 스탠드 (Beaver에서 구입)에 놓고, 상청액을 버린 후, 자성 비드를 결합 완충액으로 3회 세척했다. 자성 비드 부피의 3-5배에 따라 용리 완충액 (0.1M 시트르산나트륨, pH 3.2)을 첨가하고, 실온에서 5-10분간 진탕한 후, 자성 스탠드에 놓고, 상기 용리 완충액을 모아서 중화 완충액 (1M Tris, pH 8.54)을 첨가했던 수집 튜브로 옮겨 잘 혼합하였다. 상기 제조된 이중특이적 항체 샘플들은 후속 실험에서 사용하였다.
실시예 2: 이중특이적 항체의 세포 기반 결합
인간 또는 사이노몰구스 4-1BB (PD-L1)를 과발현하는 CHO 세포는 MCS (다중 클로닝 부위)에 클로닝된 인간 또는 사이노몰구스 원숭이 4-1BB (PD-L1) cDNA를 암호화하는 pCHO1.0 벡터 (Invitrogen에서 구입)의 형질감염에 의해 생성하였다 (이론적으로, 이 방법은 형질감염과 가혹 조건 하의 스크리닝 (stressed screening)을 통해 과발현된 세포들을 얻을 수 있었으며, 이들은 차후 유세포 분석으로 확인하게 된다). 상기 과발현 세포들을 증식 배양하여 세포 밀도를 2×106 개의 세포/㎖가 되도록 조절한 후, 96-웰 플로우 플레이트 (flow plate)에 100 ㎕/웰로 첨가하고 차후 사용을 위해 원심분리하였다. 정제된 4-1BB 항체를 PBS로 400 nM부터 시작하여 3배 희석도로 희석하여 총 12개의 지점을 얻었다. 상기 희석된 샘플들을 세포들이 있는 상기 96-웰 플로우 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하고, 4℃에서 30분간 항온배양한 후, PBS로 2회 세척하였다. PBS로 100배 희석한 염소 F(ab')2 항-인간 IgG-Fc (PE) (Abcam에서 구입)를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 4℃에서 30분간 항온배양한 후, PBS로 2회 세척하였다. PBS를 100 ㎕/웰로 첨가하여 세포를 재현탁시키고, CytoFlex (Bechman) 유세포 분석기에서 검출을 수행하여 해당 MFI를 계산하였다. INBRX-105-1B (단 하나의 펩타이드 사슬만 있고, 아미노산 서열은 서열번호 11에 기재되어 있음. WO2017123650A2 참조)를 이중특이적 항체 양성 대조군 (Inhibrx의 항-PD-L1/4-1BB 이중특이적 항체)으로 사용하였으며; 나노항체 HZ-L-Yr-13&14-16-01은 항-4-1BB 양성 대조군으로서 인간 IgG1 Fc (LALA 돌연변이) (서열번호3)에 연결시켰고; 나노항체 C-Ye-18-5 (서열번호 5)는 항-PD-L1 양성 대조군으로서 인간 IgG1 Fc (LALA 돌연변이) (서열번호 3)에 연결시켰다. 또한, 2종의 항-4-1BB 단일클론 항체 우토밀루맙 (특허번호: US20120237498) (이의 중쇄 및 경쇄 서열은 서열번호 12와 서열번호 13에 각각 기재되어 있음) 및 우렐루맙 (의약 물질에 대한 국제 일반명: 104, 이의 중쇄 및 경쇄 서열은 서열번호 14와 서열번호 15에 각각 기재되어 있음)을 항-4-1BB 양성 대조군으로 사용하였다.
실험 결과를 도 2a 내지 도 2e에 나타내었다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 서로 다른 구조를 갖는 이중특이적 항체들은 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO 세포에 대해 서로 다른 결합 활성을 나타냈고, 일부 이중특이적 항체의 결합 활성은 대조군 항체의 결합 활성과 유사하였으며; 도 2b에 도시된 바와 같이, 서로 다른 구조를 갖는 이중특이적 항체들은 사이노몰구스 원숭이 PD-L1을 과발현하는 CHO 세포에 대해 서로 다른 결합 활성을 나타냈고, 일부 이중특이적 항체의 결합 활성은 대조군 항체의 결합 활성과 유사하였으며; 도 2c에 도시된 바와 같이, 서로 다른 구조를 갖는 이중특이적 항체들은 인간 4-1BB를 과발현하는 CHO 세포에 대해 서로 다른 결합 활성을 나타냈고, 일부 이중특이적 항체의 결합 활성은 대조군 항체의 결합 활성과 유사하였으며; 도 2d에 도시된 바와 같이, 서로 다른 구조를 갖는 이중특이적 항체들은 사이노몰구스 원숭이 4-1BB를 과발현하는 CHO 세포에 대해 서로 다른 결합 활성을 나타냈고, 일부 이중특이적 항체의 결합 활성은 대조군 항체의 결합 활성과 유사하였으며; 도 2e에 도시된 바와 같이, 서로 다른 구조를 갖는 이중특이적 항체들은 CHO-S 세포에 대한 명백한 비특이적 결합을 나타내지는 않았다.
실시예 3: PD-L1의 PD-1 CHO 세포에 대한 결합을 차단하는 이중특이적 항체
본 실시예에서, 증식 배양된 (인간 PD-1을 과발현하는) CHO-hPD-1 세포들의 세포 밀도를 2×106 개의 세포/㎖로 조정하였고, 96-웰 플로우 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가한 후, 차후 사용을 위해 원심분리하였다. 정제된 이중특이적 항체를 PBS로 400 nM에서부터 3배 희석하여 총 12 지점을 얻은 후, 상기 희석된 샘플들을 96-웰 샘플 희석 플레이트에 60 ㎕/웰로 첨가하였다. 동시에, 비오틴 표지된 인간 PD-L1 단백질 (AcroBiosystems에서 구입)을 60 ㎕/웰로 첨가하여 최종 농도가 500 ng/㎖가 되도록 한 후, 4℃에서 30분간 항온배양하였다. 공동 항온배양 샘플을 상기 언급한 세포들이 있는 96-웰 플로우 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하고 4℃에서 30분간 항온배양한 뒤, PBS로 2회 세척하였다. PBS로 100배 희석한 APC 염소 항-마우스 IgG 항체 (Biolegend에서 구입)를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 4℃에서 30분간 항온배양한 후, PBS로 2회 세척하였다. PBS를 100 ㎕/웰로 첨가하여 세포를 재현탁시키고, CytoFlex (Bechman) 유세포 분석기에서 검출을 수행하여 해당 MFI를 계산하였다.
결과를 도 3에 나타내었다. 본 발명의 서로 다른 구조를 갖는 이중특이적 항체들은 모두 PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 차단할 수 있었으며, 그 차단 수준은 구조에 따라 달랐는데, Bi-088 분자의 차단 활성은 대조군 항체의 차단 활성과 유사하거나 그 보다 훨씬 월등하였다.
실시예 4: 이중특이적 항체 세포 기반 공동결합에 대한 검출
본 실시예에서는, 인간 4-1BB를 과발현하는 CHO 세포를 CFSE (Thermo로부터 구입)로 표지하고, 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO 세포를 CTV (Thermo로부터 구입)로 표지하였다. T 세포들을 PBS에 재현탁시켜 세포 밀도를 각각 4×106 개의 세포/㎖로 조정하였고, 두 세포 현탁액을 동일한 비율로 혼합하여 96-웰 U-바닥 플레이트 (Thermo에서 구입)에 50 ㎕/웰로 첨가함과 동시에, 이중특이적 항체 또는 대조군 항체를 50 ㎕/웰로 첨가하고, 이를 100 nM의 최종 농도에서 시작하여 3배 희석에 의해 PBS로 구배 희석하여 총 12개 지점을 얻고, 37℃에서 2시간 동안 항온배양한 뒤, CytoFlex (Bechman) 유세포 분석기에서 검출을 수행하여 이중 양성 세포의 비율을 계산하였다.
결과를 도 4a에 나타내었다. 상기 이중특이적 항체는 인간 4-1BB를 과발현하는 CHO 세포와 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO 세포에 동시에 결합할 수 있었으며, 그 결합 활성은 이중특이적 항체의 구조에 따라 달랐는데, Bi-088, Bi-400 및 Bi-401-091 분자의 결합 활성은 대조군 항체와 유사하거나 훨씬 더 우수하였다.
실시예 5: 이중특이적 항체 단백질 기반의 공동결합 분석
인간 4-1BB 단백질 (ACRO에서 구입)을 설명서에 따라 용해시키고, ELISA 코팅 용액 (Shanghai Sangon에서 구입)으로 1 ㎍/㎖로 희석한 후, ELISA 플레이트에 100 ㎕/웰로 코팅하고, 4℃에서 밤새 정치시킨 뒤, PBST로 3회 세척하고, 5% BSA (Shanghai, Sangon에서 구입)를 200 ㎕/웰로 첨가하여 실온에서 1시간 동안 차단을 수행하였다. 차단 용액을 버리고, 이중특이적 항체 또는 대조군 항체를 1% BSA로 최종 농도 100 nM에서부터 시작하여 3배 희석으로 총 12개 지점을 얻고, 100 ㎕/웰로 첨가하여 실온에서 2시간 동안 항온배양하였다. PBST로 3회 세척한 후, 1% BSA로 희석한 비오틴 표지된 PD-L1 단백질 (Kactus에서 구입)을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 상기 희석된 단백질 샘플의 농도를 1 ug/㎖로 하여 실온에서 1시간 동안 항온배양을 수행하였다. PBST로 3회 세척한 후, 1% BSA로 희석한 (1:10000) SA-HRP (abcam에서 구입)를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 0.5시간 동안 항온배양하였다. PBST로 3회 세척한 후, ELISA 발색 용액 (Solarbio에서 구입)을 100 ㎕/웰로 첨가하여 실온에서 3분간 반응시킨 후, ELISA 중지 용액 (Solarbio에서 구입)을 50 ㎕/웰로 첨가하여 450 nm에서의 흡광도값을 판독하였다.
결과를 도 4b에 나타내었다. 상기 이중특이적 항체는 인간 4-1BB와 인간 PD-L1 단백질에 동시에 결합할 수 있었으며, 결합 활성은 분자 구조에 따라 달랐다. 그 중에서도, Bi-088 분자의 결합 활성은 대조군 항체와 유사하거나 훨씬 월등하였다.
실시예 6: 이중특이적 항체 활성의 검출 (루시퍼라제 리포터 세포 기반 분석)
인간 4-1BB를 암호화하는 플라스미드와 NF-κB 루시퍼라제 리포터 유전자를 암호화하는 플라스미드 (Promega로부터 구입)를 주르캇 세포에 공동 형질감염시켜 hu4-1BB 주르캇-NF-κB 세포를 얻었다. 상기 hu4-1BB 주르캇-NF-κB 세포를 증식 배양시킨 후, 세포들을 1640 완전 배지 중에서 4×106 개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-S 세포, CHO-S 세포, 및 인간 PD-L1을 과발현하는 CT-26 세포를 1640 완전 배지로 4×105 개의 세포/㎖로 희석하였다. 상기 3종의 세포 현탁액을 각각 hu4-1BB 주르캇-NF-κB 세포와 1:1의 비율로 개별적으로 혼합한 후, 멸균 96-웰 흰색 바닥 플레이트 (Nunc에서 구입)에 50 ㎕/웰로 첨가하고, 200 nM의 최종 샘플 농도에서 시작하여 3배 희석으로 1640 완전 배지로 단계 희석시켜 총 12개 지점을 얻은 이중특이적 항체 샘플을 첨가하였다. 항온배양을 37℃, 5% CO2에서 16시간 동안 수행하였고, 루시퍼라제 신호를 검출하였다.
그 결과를 도 5a, 5b 및 5c에 나타내었다. hu4-1BB 주르캇-NF-κB 세포와 CHO-S 세포의 공동 항온배양 시스템의 이중특이적 항체 샘플에서는 명백한 신호 활성화가 관찰되지는 않았다. 인간 PD-L1을 과발현하는 hu4-1BB 주르캇-NF-κB 세포 및 CHO-S 세포 또는 인간 PD-L1을 과발현하는 CT-26 세포의 공동 항온배양 시스템에서는 상당한 신호 활성화 활성이 관찰되었다. 이것은 PD-L1에 의한 가교결합 영향 때문인데, 이러한 가교결합이 항체의 다른쪽 말단에 결합된 주르캇 세포의 4-1BB들을 함께 모아서 다운스트림 NF-κB 경로를 활성화시켰던 것이다. 이는 인체에서 이중특이적 항체가 PD-L1 가교결합 효과 하에 인간 T 세포의 NF-κB 경로를 활성화하고, 나아가 T 세포를 활성화시켜서 종양을 사멸시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 그 중에서도, Bi-088, Bi-400 및 Bi-401-091의 활성화 활성은 대조군 항체와 유사하거나 더 우수하였다.
실시예 7: 이중특이적 항체 활성의 검출 (1차 T 세포 활성화 분석)
인간 PD-L1을 과발현하는 CHO-S 또는 CHO 세포를 미토마이신으로 4시간 동안 처리한 후, 세포 밀도를 X-VIVO15 배지를 사용하여 2×106 개의 세포/㎖로 조정하였다. OKT-3 항체 (Biolegend에서 구입)를 멸균 PBS (Hyclone에서 구입)로 1 ㎍/㎖로 희석하고, 96-웰 세포 배양용 평판 바닥 플레이트 (Thermo에서 구입)에 100 ㎕/웰로 코팅한 뒤, 37℃에서 2시간 동안 항온배양하였다. 냉동시킨 인간 PBMC (Shanghai Saili에서 구입)를 소생시키고, 인간 T 세포 분리 및 정제 키트 (Stemcell에서 구입)로 분리하여 T 세포를 얻은 후, 상기 T 세포들을 X-VIVO15 배지 (LONZA에서 구입)로 재현탁시켜 세포 밀도를 2×106 개의 세포/㎖로 조정하고, 미토마이신 처리된 CHO-S 세포 또는 인간 PD-L1을 과발현하는 CHO 세포와 동일한 비율로 혼합하였다. 항체 코팅을 완료한 후, 코팅 용액을 버리고, PBS로 2회 세척한 후, PBS를 버리고, 상기 세포 혼합 용액을 100 ㎕/웰로 첨가함과 동시에 X-VIVO15로 단계 희석시킨 이중특이적 항체 샘플을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 샘플 또는 조합 그룹의 최종 농도에 HZ-L-Yr-13&14-16-1-IgG1Fc(LALA) + C-Ye-18-5-IgG1Fc(LALA)를 첨가하였고, 최종 농도는 50, 10, 2 nM이었다. 3일간 37℃, 5% CO2에서 항온배양을 수행하고, 상청액을 수거하여 IL-2 함량을 검출하였다.
실험 결과를 도 6a와 도 6b에 나타내었다. T 세포 및 CHO-S 세포의 공동 항온배양 시스템에서 이중특이적 항체 샘플에 대한 명백한 신호 활성화는 없었으나, T 세포 및 CHO-S 세포의 공동 항온배양 시스템에서 상당한 T 세포 활성화와 IL-2 방출이 있었는데, 이때 Bi-088, Bi-400 및 Bi-401-091 분자의 활성은 대조군 항체의 활성과 유사하거나 훨씬 우수하였다.
실시예 8: 혼합 림프구 반응 분석에서 이중특이적 항체의 활성
PBMC (SAILY BIO에서 구입, SLB-HPB)를 소생시키고, 원심분리한 후, 상기 PBMC 세포들을 10 ㎖의 X-VIVO-15 배지 (LONZA에서 구입)로 재현탁시키고, 세포 배양 인큐베이터에서 37℃로 2시간 동안 배양한 후, 부착된 세포들을 흡입으로 제거하였다. 10 ㎖의 DC 배지를 첨가하였다: X-VIVO-15 배지에 10 ng/㎖의 GM-CSF (R&D에서 구입)와 20 ng/㎖의 IL-4 (R&D에서 구입)를 첨가하여 3일간 배양한 후, DC 배지 5 ㎖를 보충하였고, 상기 배양을 6일째까지 지속한 다음, DC 성숙 배지를 첨가하여 2일간 배양하였는데, 이때 상기 DC 성숙 배지는 X-VIVO-15 배지에 1000 U/㎖의 TNF-α (R&D에서 구입), 10 ng/㎖의 IL-6 (R&D에서 구입), 5 ng/㎖의 IL-1β (R&D에서 구입) 및 1 μM의 PGE2 (Tocris에서 구입)를 첨가하여 제조하였다. 상기 성숙된 DC 세포를 수집하고, X-VIVO-15 배지로 세포 밀도를 2×105 개의 세포/㎖로 조정하였다.
다른 공여자의 PBMC (SAILY BIO에서 구입, SLB-HPB)를 소생시키고, 원심분리한 후, 상기 PBMC를 10 ㎖의 X-VIVO-15 배지로 재현탁하였다. T 세포 분류 키트 (Stemcell에서 구입)를 사용하여 T 세포들을 풍부하게 하고, 상기 T 세포들을 X-VIVO-15 중에 재현탁시킨 후, 세포 밀도를 2×106 개의 세포/㎖로 조정하고, 상기 수거한 성숙한 DC 세포와 1:1의 비율로 혼합하여 96-웰 U-바닥 플레이트에 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 그와 동시에, X-VIVO-15 배지로 희석시킨 이중특이적 항체 샘플을 100 ㎕/웰로 첨가하여 (최종 농도가 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016 nM이었음) 3일간 배양한 후, 상청액을 수집하여 ELISA (eBioscience에서 구입)로 IL-2 발현 수준을 검출하였다.
실험 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 이중특이적 항체 샘플은 T 세포를 활성화시켜 혼합 림프구 반응 시스템에서 IL-2를 방출할 수 있었고, Bi-088 및 Bi-400의 활성화 수준은 대조군 항체와 유사하였다.
실시예 9: 마우스에서 이중특이적 항체의 반감기
Balb/c 마우스를 본 실험에 사용하였는데, 수컷 반과 암컷 반, 각 채혈 시점당 6마리, 12/12시간으로 명/암 조절, 온도 24±2℃, 습도 40 내지 70%로 하고, 물과 식이에 자유롭게 접근할 수 있도록 해주었다. 실험 당일에, Balb/c 마우스의 꼬리 정맥에 이중특이적 항체 분자 Bi-088을 1회 주사하였고, 주사 용량은 10 mg/kg이었다.
채혈 시점: 투여 후 5분, 0.5시간, 2시간, 6시간, 24시간, 48시간, 96시간, 168시간, 336시간 및 504시간째에, 마우스 안와에서 채혈하였다. 전혈 샘플을 2-8℃에서 30분간 둔 후, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 혈청을 수집한 다음, 상기 혈청을 2-8℃에서 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 이를 -80℃로 보관하고, 혈청 중의 이중특이적 항체 분자의 함량을 ELISA로 검출하여 그 평균값을 계산하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었고, 마우스에서 본 발명의 이중특이적 항체 분자의 반감기는 약 174시간이었다.
실시예 10: 마우스에서 이중특이적 항체의 약학적 효과
본 실험에서는, 인간 PD-L1을 발현하는 마우스 결장직장암 CT-26 세포 (h-PD-L1 KI CT-26)를 인간 4-1BB/PD-L1/PD-1 유전자이식 마우스 (GemPharmatech에서 구입)에 이식하여 이중특이적 항체의 항종양 효과를 측정하였다. 먼저, h-PD-L1 KI CT-26 종양 함유 마우스 모델을 피하 접종으로 확립한 후, 각 마우스에 0.6×106 개의 세포를 접종하고, 평균 종양 부피가 100-200 mm3가 되면 그룹화 (각 그룹에 6마리의 마우스)를 수행하였다. 치료는 서로 다른 항체를 서로 다른 용량으로 복강내 주사하여 시행하였고, 각 그룹 마우스의 종양 부피와 체중의 변화를 2-3일에 한번의 빈도로 모니터링하였으며, 상기 모니터링은 2-3주간 지속하였다. 투여 용량과 모델을 표 1에 나타내었다.
Figure pct00008

결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과, 상기 이중특이적 항체는 h-PD-L1 KI CT-26 세포의 성장을 유의하게 억제할 수 있었으며, 그 억제 활성은 조합 약물군보다 현저히 우수하였고, Bi-088의 억제 활성은 대조군 항체 INBRX-105-1B과 유사하거나 그보다 우수하였다.
실시예 11: huPD-L1 MC-38 세포가 이식된 인간 PD-L1/4-1BB 이중 유전자이식 마우스의 약력학적 모델
본 실험에서는, 인간 PD-L1을 발현하는 MC-38 세포 (huPD-L1 MC-38)를 사용하여 인간 PD-L1/4-1BB 유전자이식 마우스 (Biocytogen Biotechnology Co., Ltd.에서 구입)에서 Bi-088의 항종양 효과를 측정하였다. 먼저, huPD-L1 MC-38 종양 함유 마우스 모델을 피하 접종으로 확립한 후, 각 마우스에 1×106 개의 세포를 접종하고, 평균 종양 부피가 80-120 mm3가 되면 그룹화를 수행하였다. 각 그룹의 6마리 마우스를 복강내 주사에 의해 서로 다른 용량의 서로 다른 항체로 처리하였고, 그 용량과 투여 방법은 하기 표 2에 나타내었다. 마우스 종양이 완전히 퇴행된 후, 새로운 회차의 huPD-L1 MC-38 세포를 마우스의 반대측에 접종하고, 각 그룹에서 마우스의 종양 부피와 체중의 변화를 모니터링하였다. 모니터링 빈도는 2-3일에 한번, 총 8주로 하였다.
Figure pct00009

결과를 표 3과 도 10에 나타내었다.
Figure pct00010

그 결과, huPD-L1 MC-38 세포 접종 후, 음성 대조군의 종양 부피는 계속 증가하였던 반면, Bi-088 그룹 마우스 6마리의 종양은 치료 후 완전히 퇴행되었고, 마지막 투여 후 31일째에는, 심지어 huPD-L1 MC-38 세포를 반대측에 다시 접종했음에도, 종양 세포가 잘 성장하지 않았던 것으로 나타났다.
실시예 12: 인간 4-1BB 유전자이식 마우스의 간독성 시험
본 실험에서는, 각 그룹당 4마리씩, 인간 4-1BB 유전자이식 마우스 (Biocytogen Biotechnology Co., Ltd.에서 구입)에서 Bi-088의 간독성을 측정하였다. Bi-088 분자와 대조군 분자를 하기 표 4에 나타낸 방식으로 복강내 투여하였다. 최초 투여 후 20일째에, 마우스를 안락사시키고 간 조직을 채취하여 포매 및 고정하고, 절편화하여 HE 염색 및 CD8 양성 세포 염색을 수행하였다.
Figure pct00011

그 결과를 도 11과 도 12에 나타내었다.
그 결과, 우렐루맙 그룹의 마우스들은 간에서 명백한 단핵구 침윤과 CD8 세포의 양성 염색을 나타냈고, INBRX-105-1B 그룹에서 일부 마우스들도 간에서 명백한 단핵구 침윤과 CD8 세포의 양성 염색을 보였으나, Bi-088 그룹의 마우스들은 마우스의 간에서 명백한 단핵구 침윤과 CD8 세포의 양성 염색을 나타내지 않았다.
이상에서 본 발명의 구체적인 실시형태들을 상세하게 설명하였으나, 통상의 기술자라면 누구나 개시된 모든 교시내용을 바탕으로 세부 내용들에 다양한 변형과 치환을 가할 수 있고, 이러한 변형들도 모두 본 발명의 범위 내에 속한다는 사실을 이해할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구항 및 그의 균등물에 의해 주어진다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOTHEUS INC. <120> Anti-4-1BB-anti-PD-L1 bispecific antibody, and pharmaceutical composition and use thereof <130> IEC210272PCT <150> CN202010983606.7 <151> 2020-09-17 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide chain of bispecific antibody Bi-400 <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ile Val 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ile Thr Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Tyr Ala Arg Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Leu Met Gly His Glu Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr His Thr 115 120 125 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 145 150 155 160 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 165 170 175 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 180 185 190 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 195 200 205 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 210 215 220 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 225 230 235 240 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 245 250 255 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 260 265 270 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 275 280 285 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 290 295 300 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 305 310 315 320 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 325 330 335 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly 340 345 350 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 355 360 365 Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 370 375 380 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 385 390 395 400 Tyr Trp Met Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 405 410 415 Val Ser Ser Ile Asn Ser Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser 420 425 430 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu 435 440 445 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 450 455 460 Cys Ala Lys Asp Pro Gly Gly Tyr Ala Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val 465 470 475 480 Thr Val Ser Ser <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti 4-1BB nanobody HZ-L-Yr-13&14-16-01 <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ile Val 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ile 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5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-Ye-18-5 HCDR3 <400> 21 Ala Lys Asp Pro Gly Gly Tyr Ala 1 5 <210> 22 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)4G linker <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly 20

Claims (31)

  1. 이중특이적 항체로서,
    4-1BB를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역, 및
    PD-L1 또는 PD-1을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역을 포함하고;
    이때,
    상기 제1 단백질 기능 영역이 항-4-1BB 단일 도메인 항체이고;
    상기 제2 단백질 기능 영역이 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체 또는 항-HER-2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편인 것인, 이중특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-4-1BB 단일 도메인 항체가 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하며;
    바람직하게는, 상기 항-4-1BB 단일 도메인 항체가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, 이중특이적 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 단백질 기능 영역이 항-PD-L1 단일 도메인 항체, 항-PD-1 단일 도메인 항체, 항-CTLA-4 단일 도메인 항체 또는 항-HER-2 단일 도메인 항체이고;
    바람직하게는, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체가 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하며;
    바람직하게는, 상기 항-PD-L1 단일 도메인 항체가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, 이중특이적 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 IgG의 하나 이상 (예컨대, 2개 또는 3개)의 Fc 단편, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 단편을 추가로 포함하거나;
    또는, 상기 이중특이적 항체가 IgG의 하나 이상 (예컨대, 2개 또는 3개)의 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 상기 IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 불변 영역이 제1 단백질 기능 영역과 제2 단백질 기능 영역 사이에 위치하는 것인, 이중특이적 항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역이 제1 단백질 기능 영역의 C-말단에 연결되고/연결되거나, 제2 단백질 기능 영역의 C-말단에 연결되고;
    상기 IgG의 Fc단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역이 제1 단백질 기능 영역에 직접적으로 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되며; 상기 IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역이 제2 단백질 기능 영역에 직접적으로 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되고;
    바람직하게는, 상기 링커가 서열번호 5 및 서열번호 22로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 이중특이적 항체.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, EU 넘버링 시스템에 따라, 상기 IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역이 L234A 돌연변이 및 L235A 돌연변이를 포함하고; 선택적으로, 상기 IgG의 Fc 단편이 G237A 돌연변이를 추가로 포함하며;
    바람직하게는, 상기 IgG의 Fc 단편이 L234A 돌연변이 및 L235A 돌연변이를 포함하는 IgG1의 Fc 단편이고; 바람직하게는, 상기 IgG1의 Fc 단편이 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지며;
    바람직하게는, 상기 IgG의 Fc 단편이 놉-인-홀 (Knob-in-hole) 돌연변이를 추가로 포함하며;
    바람직하게는, 상기 IgG1의 Fc 단편이 놉-인-홀 돌연변이를 추가로 포함하고; 바람직하게는, 상기 IgG1의 Fc 단편이 서열번호 8 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, 이중특이적 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 하기 제1 펩타이드 사슬:
    제1 단백질 기능 영역, IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역, 링커 및 제2 단백질 기능 영역을 N-말단에서 C-말단으로 순차적으로 포함하거나; 또는 제2 단백질 기능 영역; IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역, 링커 및 제1 단백질 기능 영역을 포함하는, 제1 펩타이드 사슬을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 제1 펩타이드 사슬이 서열번호 1 또는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, 이중특이적 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 2개의 제1 펩타이드 사슬로 형성된 이량체, 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 6에 기재된 제1 펩타이드 사슬로 형성된 이량체이고;
    바람직하게는, 상기 2개의 제1 펩타이드 사슬이 2쌍 또는 3쌍의 이황화 결합으로 연결되어 있으며;
    선택적으로, 상기 2개의 제1 펩타이드 사슬이 놉-인-홀 돌연변이를 추가로 포함하는 것인, 이중특이적 항체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 하기 제2 펩타이드 사슬:
    IgG의 Fc 단편 또는 IgG의 중쇄 불변 영역을 포함하는 제2 펩타이드 사슬로서; 바람직하게는, 제2 펩타이드 사슬의 N-말단 및/또는 C-말단이 제1 단백질 기능 영역 및/또는 제2 단백질 기능 영역에 직접적으로 연결되거나 또는 링커를 통해 연결되는 것인, 제2 펩타이드 사슬을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 상기 제2 펩타이드 사슬이 서열번호 9 또는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, 이중특이적 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 사슬과 제2 펩타이드 사슬이 이량체를 형성하고;
    바람직하게는, 제1 펩타이드 사슬과 제2 펩타이드 사슬이 2쌍 또는 3쌍의 이황화 결합으로 연결되어 있으며;
    바람직하게는, 제1 펩타이드 사슬과 제2 펩타이드 사슬이 놉-인-홀 돌연변이를 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 제1 펩타이드 사슬이 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가지며, 제2 펩타이드 사슬이 서열번호 9 또는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, 이중특이적 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  12. 제11항에 따른 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  13. 제11항에 따른 분리된 핵산 분자, 또는 제12항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 제13항에 따른 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터 상기 이중특이적 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 이중특이적 항체 및 커플링 모이어티를 포함하는 접합체로서, 상기 이중특이적 항체가 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체이고, 상기 커플링 모이어티가 검출가능한 표지이며; 바람직하게는, 상기 커플링 모이어티가 방사성 동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 유색 물질, 또는 효소인 것인, 접합체.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 또는 제15항에 따른 접합체를 포함하는 키트로서,
    바람직하게는, 상기 키트가 상기 이중특이적 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체를 추가로 포함하고; 선택적으로, 상기 2차 항체가 방사성 동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 유색 물질, 또는 효소와 같은 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 것인, 키트.
  17. 샘플에서 4-1BB 및/또는 PD-L1의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 키트의 제조에 있어서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 용도.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 또는 제17항에 따른 접합체를 포함하고; 선택적으로, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  19. 악성 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 또는 제15항에 따른 접합체의 용도로서, 바람직하게는, 상기 악성 종양이 직장암, 결장암, 폐암, 흑색종, 간암, 위암, 신장 세포 암종, 난소암, 식도암, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 용도.
  20. 악성 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 또는 제15항에 따른 접합체의 유효량을, 상기 악성 종양의 치료 및/또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고; 바람직하게는, 상기 악성 종양이 직장암, 결장암, 폐암, 흑색종, 간암, 위암, 신장 세포 암종, 난소암, 식도암, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  21. 악성 종양의 치료 및/또는 예방을 위해 사용되는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 또는 제15항에 따른 접합체로서, 바람직하게는, 상기 악성 종양이 직장암, 결장암, 폐암, 흑색종, 간암, 위암, 신장 세포 암종, 난소암, 식도암, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 또는 제15항에 따른 접합체.
  22. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중특이적 항체:
    (a) 항-PD-L1 단일 도메인 항체; 및
    (b) 항-4-1BB 단일 도메인 항체.
  23. 분리된 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 제22항에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  24. 벡터로서, 상기 벡터가 제23항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
  25. 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포가 제24항에 따른 벡터를 포함하거나, 또는 제23항의 폴리뉴클레오타이드가 이의 게놈에 통합되거나;
    또는, 상기 숙주 세포가 제22항에 따른 이중특이적 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
  26. 제22항에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 하기 단계들을 포함하는, 방법:
    (a) 제25항에 따른 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하여 상기 이중특이적 항체를 함유하는 배양물을 얻는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 얻은 배양물을 정제 및/또는 분리하여 상기 이중특이적 항체를 얻는 단계.
  27. 면역접합체로서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역접합체:
    (a) 제22항에 따른 이중특이적 항체; 및
    (b) 검출가능한 표지, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성핵종, 또는 효소, 금 나노입자/나노막대, 나노자성 입자, 바이러스 외피 단백질, 또는 VLP, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 커플링 모이어티.
  28. 약제, 시약, 검출 플레이트 또는 키트의 제조에 있어서 제22항에 따른 이중특이적 항체, 또는 제27항에 따른 면역접합체의 용도로서, 상기 시약, 검출 플레이트 또는 키트가 샘플에서 PD-L1 및/또는 4-1BB를 검출하기 위해 사용되며; 상기 약제가 PD-L1을 발현하는 (즉, PD-L1 양성) 종양을 치료 또는 예방하기 위해 사용되는 것인, 용도.
  29. 약제학적 조성물로서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물:
    (i) 제22항에 따른 이중특이적 항체, 또는 제27항에 따른 면역접합체; 및
    (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체.
  30. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 제22항에 따른 이중특이적 항체의 하나 이상의 용도:
    (i) 인간 PD-L1 분자 및/또는 4-1BB 분자를 검출하기 위한 용도; (ii) 흐름 검출을 위한 용도; (iii) 세포 면역형광 검출을 위한 용도; (iv) 종양 치료를 위한 용도; (v) 종양의 진단을 위한 용도; (vi) PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하기 위한 용도; 및 (vii) 4-1BB에 결합하여 면역 세포를 활성화시키기 위한 용도.
  31. 재조합 단백질로서, (i) 제22항에 따른 이중특이적 항체; 및 (ii) 발현 및/또는 정제를 보조하는 선택적인 태그 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질.
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