JP2022526297A - タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性を明らかにするためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓドロップアウトスクリーニングプラットフォーム - Google Patents

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Abstract

Ｃａｓタンパク質対応タウバイオセンサー細胞、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウ凝集に関連する遺伝的脆弱性をスクリーニングするためにそのような細胞を作製および使用する方法が提供される。【選択図】図１０Ｂ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年３月１８日に出願された米国出願第６２／８２０，１０１号の利益を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル５４４６４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記述された配列表は、７５．７キロバイトであり、２０２０年３月１６日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
タンパク質の異常な凝集または線維化は、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）などのいくつかの神経変性疾患を含む、多くの疾患の決定的な特徴である。これらの疾患の多くでは、ある特定のタンパク質の不溶性凝集体への線維化は、疾患の特徴であるだけでなく、神経毒性の原因因子としても関係している。さらに、これらの疾患は、ステレオタイプのパターンに従って中枢神経系を介する凝集の病状の伝播によって特徴付けられ、このプロセスは疾患の進行と相関している。したがって、異常なタンパク質凝集のプロセス、または凝集体の細胞間増殖を変更する遺伝子および遺伝子経路の同定は、神経変性疾患の病因をよりよく理解する上で、ならびに治療的介入のための戦略を考案する上で大いに価値がある。
タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性をスクリーニングする方法が本明細書に提供される。Ｃａｓ－タウバイオセンサー細胞またはそのような細胞集団、ならびにＣａｓ－タウバイオセンサー細胞および培養培地のインビトロ培養物もまた本明細書に提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）－タウバイオセンサー細胞またはそのような細胞集団、ならびにＳＡＭ－タウバイオセンサー細胞および培養培地のインビトロ培養物もまた本明細書に提供される。
一態様では、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性をスクリーニングする方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することであって、各細胞集団が、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含み、凝集陽性細胞集団において、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在し、凝集陰性細胞集団において、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在しない、提供することと、（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することであって、複数の固有のガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質が、複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらす、導入することと、（ｃ）各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することとを含み、凝集陰性細胞集団ではないが凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇、または凝集陰性細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより劇的な枯渇パターンは、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であるかまたはタウ凝集に関連する候補遺伝的脆弱性である（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）ことを示す。そのような遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、Ａｇｇ［＋］細胞において選択的な細胞死を引き起こすが、Ａｇｇ［－］細胞においては引き起こさない。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１を含む。任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞集団において安定して発現される。いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような方法では、細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、１００個以上の遺伝子、１０００個以上の遺伝子、または１００００個以上の遺伝子を標的とする。いくつかのそのような方法では、ライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。いくつかのそのような方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、少なくとも３個の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３～約６個の標的配列（例えば、約３、約４、または約６個）は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。
いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、構成的エクソンを標的とする。任意に、各ガイドＲＮＡは、５’構成的エクソンを標的とする。いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、ウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にある。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。いくつかのそのような方法では、細胞集団は、約０．３未満の感染多重度で感染する。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、選択マーカーとともに細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む。任意に、選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ブラストサイジンＳデアミナーゼ、およびブレオマイシン耐性タンパク質から選択される。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｂ）において複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は各々、固有のガイドＲＮＡあたり約５００個を超える細胞を含む。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の時間経過は、約１週間超である。任意に、ステップ（ｃ）の時間経過は、約２週間超である。いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の時間経過は、約１０～約１５の細胞倍加を含む。いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の複数の時点は、少なくとも３つの時点を含む。任意に、ステップ（ｃ）の複数の時点は、約４つの時点または約６つの時点を含む。いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の各時点の間は、約１日超である。任意に、ステップ（ｃ）の各時点の間は、約２日超である。任意に、ステップ（ｃ）の各時点の間は、約３～約４日である。
いくつかのそのような方法では、遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団では枯渇していない場合、遺伝子はステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。任意に、遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、凝集陰性細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において時間経過にわたってより劇的な枯渇パターンを有する場合、遺伝子はステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。
いくつかのそのような方法では、各時点でのガイドＲＮＡの存在量が以前の時点でのガイドＲＮＡの存在量以下である場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされる。いくつかのそのような方法では、第２の時点の後の各時点でのガイドＲＮＡの存在量が２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされる。
いくつかのそのような方法では、遺伝子を標的とするライブラリ内のガイドＲＮＡの約３０％超が、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子はステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。任意に、遺伝子は、以下の状況：（１）ライブラリ内に遺伝子を標的とする１つのガイドＲＮＡが存在し、１つのガイドＲＮＡが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（２）ライブラリ内に遺伝子を標的とする２つのガイドＲＮＡが存在し、２つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（３）ライブラリ内に遺伝子を標的とする３つのガイドＲＮＡが存在し、３つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（４）ライブラリ内に遺伝子を標的とする４つのガイドＲＮＡが存在し、４つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（５）ライブラリ内に遺伝子を標的とする５つのガイドＲＮＡが存在し、５つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、および（６）ライブラリ内に遺伝子を標的とする６つのガイドＲＮＡが存在し、６つのガイドＲＮＡの少なくとも３つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、のうちのいずれか１つにおいて、ステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。
いくつかのそのような方法では、方法は、少なくとも３つの異なる実験で少なくとも３回繰り返され、遺伝子は、少なくとも３つの異なる実験の約５０％超でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる場合、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の時間経過は、約２週間超であり、ステップ（ｃ）の複数の時点は、約６つの時点を含み、ステップ（ｃ）の各時点の間は約３～約４日であり、第２の時点の後の各時点でのガイドＲＮＡの存在量が、２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされ、遺伝子を標的とするライブラリ内のガイドＲＮＡの約３０％超が、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子はステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。
他のそのような方法は、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ））ガイドＲＮＡライブラリを利用する。いくつかのそのような方法は、（ａ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することであって、各細胞集団が、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質（すなわち、触媒不活性Ｃａｓタンパク質）を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインとを含み、凝集陽性細胞集団において、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在し、凝集陰性細胞集団において、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在しない、提供することと、（ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することであって、複数の固有のガイドＲＮＡが、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、複合体が、複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらす、導入することと、（ｃ）各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することとを含み、凝集陰性細胞集団ではないが凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇、または凝集陰性細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより劇的な枯渇パターンは、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の活性化が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であるかまたはタウ凝集に関連する候補遺伝的脆弱性である（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）ことを示す。
いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような方法では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような方法では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む。いくつかのそのような方法では、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３６を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる。いくつかのそのような方法では、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３７を含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞集団において安定して発現される。いくつかのそのような方法では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような方法では、細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、１００個以上の遺伝子、１０００個以上の遺伝子、または１００００個以上の遺伝子を標的とする。いくつかのそのような方法では、ライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。いくつかのそのような方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、少なくとも３個の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３～約６個の標的配列（例えば、約３、約４、または約６個）は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。任意に、約３個の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。
いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする。いくつかのそのような方法では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含む。任意に、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含む。任意に、第１のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。任意に、アダプター結合エレメントは、配列番号３３に示される配列を含む。任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一ガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基５３～５６に対応するステムループ２である。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、ウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。任意に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にある。いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。いくつかのそのような方法では、細胞集団は、約０．３未満の感染多重度で感染する。
いくつかのそのような方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、選択マーカーとともに細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む。任意に、選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される。任意に、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ブラストサイジンＳデアミナーゼ、およびブレオマイシン耐性タンパク質から選択される。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｂ）において複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は各々、固有のガイドＲＮＡあたり約５００個を超える細胞を含む。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の時間経過は、約１週間超である。任意に、ステップ（ｃ）の時間経過は、約２週間超である。いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の時間経過は、約１０～約１５の細胞倍加を含む。いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の複数の時点は、少なくとも３つの時点を含む。任意に、ステップ（ｃ）の複数の時点が、約４つの時点または約６つの時点を含む。いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の各時点の間は、約１日超である。任意に、ステップ（ｃ）の各時点の間は、約２日超である。任意に、ステップ（ｃ）の各時点の間は、約３～約４日である。
いくつかのそのような方法では、遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団では枯渇していない場合、遺伝子はステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。任意に、遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、凝集陰性細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団において時間経過にわたってより劇的な枯渇パターンを有する場合、遺伝子はステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。
いくつかのそのような方法では、各時点でのガイドＲＮＡの存在量が以前の時点でのガイドＲＮＡの存在量以下である場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされる。いくつかのそのような方法では、第２の時点の後の各時点でのガイドＲＮＡの存在量が２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされる。
いくつかのそのような方法では、遺伝子を標的とするライブラリ内のガイドＲＮＡの約３０％超が、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子はステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。任意に、遺伝子は、以下の状況：（１）ライブラリ内に遺伝子を標的とする１つのガイドＲＮＡが存在し、１つのガイドＲＮＡが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（２）ライブラリ内に遺伝子を標的とする２つのガイドＲＮＡが存在し、２つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（３）ライブラリ内に遺伝子を標的とする３つのガイドＲＮＡが存在し、３つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（４）ライブラリ内に遺伝子を標的とする４つのガイドＲＮＡが存在し、４つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（５）ライブラリ内に遺伝子を標的とする５つのガイドＲＮＡが存在し、５つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、および（６）ライブラリ内に遺伝子を標的とする６つのガイドＲＮＡが存在し、６つのガイドＲＮＡの少なくとも３つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、のうちのいずれか１つにおいて、ステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。
いくつかのそのような方法では、方法は、少なくとも３つの異なる実験で少なくとも３回繰り返され、遺伝子は、少なくとも３つの異なる実験の約５０％超でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる場合、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）の時間経過は、約２週間超であり、ステップ（ｃ）の複数の時点は、約６つの時点を含み、ステップ（ｃ）の各時点の間は約３～約４日であり、第２の時点の後の各時点でのガイドＲＮＡの存在量が、２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされ、遺伝子を標的とするライブラリ内のガイドＲＮＡの約３０％超が、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子はステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。
別の態様では、Ｃａｓ－タウバイオセンサー細胞、ならびにＣａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む１つ以上の細胞集団などのそのような細胞集団が提供される。
いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような細胞では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１を含む。任意に、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような細胞では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞において安定して発現される。いくつかのそのような細胞では、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。任意に、細胞は、インビトロである。
いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在していない。いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在する。
別の態様では、ＳＡＭ－タウバイオセンサー細胞、ならびに１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質（すなわち、触媒不活性Ｃａｓタンパク質）を含むキメラＣａｓタンパク質、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む１つ以上の細胞集団などのそのような細胞集団が提供される。
いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、ヒトタウリピートドメインである。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、凝集促進変異を含む。任意に、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウＰ３０１Ｓ変異を含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１を含む。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じである。いくつかのそのような細胞では、第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む。
いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光タンパク質である。任意に、第１のレポーターおよび第２のレポーターは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。任意に、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
いくつかのそのような細胞では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかのそのような細胞では、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む。いくつかのそのような細胞では、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む。いくつかのそのような細胞では、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３６を含み、任意に、キメラＣａｓタンパク質は、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる。いくつかのそのような細胞では、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３７を含み、任意に、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような細胞では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、細胞において安定して発現される。いくつかのそのような細胞では、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、細胞においてゲノム的に組み込まれる。
いくつかのそのような細胞は、真核細胞である。任意に、細胞は、哺乳動物細胞である。任意に、細胞は、ヒト細胞である。任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。任意に、細胞は、インビトロである。
いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在していない。いくつかのそのような細胞では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在する。
別の態様では、上記の細胞集団のうちのいずれか、または本明細書に開示される細胞のうちのいずれか、および培養培地を含むインビトロ培養物が提供される。
（原寸に比例していない）タウアイソフォーム２Ｎ４Ｒの概略図を示す。タウバイオセンサー株は、完全な２Ｎ４Ｒではなく、導入遺伝子としてタウ４ＲＤ－ＹＦＰおよびタウ４ＲＤ－ＣＦＰのみを含む。 タウバイオセンサー細胞株において、凝集体形成が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってどのように監視されるかについての概略図を示す。タウ４ＲＤ－ＣＦＰタンパク質は紫色の光で励起され、青色の光を発する。タウ４ＲＤ－ＹＦＰ融合タンパク質は青色の光で励起され、黄色の光を発する。凝集がない場合、紫色の光による励起はＦＲＥＴをもたらさない。タウ凝集がある場合、紫色の光による励起はＦＲＥＴおよび黄色の発光をもたらす。 以前に単離された期待以下の対照Ｃａｓ９－発現ＴＣＹクローンである、クローンＣａｓ９Ｈ１に対してレンチウイルスＣａｓ９発現構築物を形質導入したタウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）バイオセンサー細胞クローンにおける相対Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ発現を示す。 ＰＥＲＫおよびＳＮＣＡをそれぞれ標的とするｓｇＲＮＡを形質導入してから３日後および７日後のＣａｓ９ ＴＣＹクローンにおけるＰＥＲＫ遺伝子座およびＳＮＣＡ遺伝子座での切断効率を示す。 ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡライブラリを使用して、Ｃａｓ９ ＴＣＹバイオセンサー細胞内の標的遺伝子を破壊するための戦略の概略図を示す。 安定して増殖するタウ凝集体を含むタウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ／Ｃａｓ９ Ａｇｇ［＋］サブクローンの誘導を示す概略図である。タウ凝集体を含むサブクローンを示すＦＲＥＴ顕微鏡画像も示される。 タウ凝集によって摂動された遺伝子を評価するための実験の概略図である。 Ａｇｇ［＋］クローン試料およびＡｇｇ［－］クローン試料が、凝集状態によって異なることを示す教師なしクラスタリングの結果を示す（クラスタリング手順：キロベース百万あたりの読み取りのｌｏｇ変換（ＲＰＫＭ）；距離メトリック：１－ピアソン相関係数の絶対値；階層的クラスタリング）。 タウＡｇｇ［＋］細胞における凝集によって著しく摂動された遺伝子（倍率変化≧１．５（上または下のいずれか）およびｐ値≦０．０１として定義される著しく摂動された遺伝子）を示す。 タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性を明らかにするために、プールされたゲノムワイドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）スクリーニングの一般的な概略図を示す。 必須遺伝子（Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］の両方が枯渇している遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ）の同定の一般的な概略図を示す。 合成致死性遺伝子（Ａｇｇ［＋］では枯渇しているが、Ａｇｇ［－］では枯渇していない遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ）の同定の一般的な概略図を示す。 経時的にｓｇＲＮＡの枯渇パターンが存在する遺伝子を同定するための全時間経過のアプローチの概略図を示す。 Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］試料におけるｓｇＲＮＡが枯渇した遺伝子の数を示す。 他の公表された報告と比較した、タウバイオセンサースクリーニングで同定された必須遺伝子の重複を示すグラフである。 ３回の繰り返し実験におけるＡｇｇ［－］試料と比較して、Ａｇｇ［＋］試料の３日目と比較した経時的な独自に枯渇したｓｇＲＮＡを有する７１個の遺伝子の同定を示すグラフである。 ３個の候補必須遺伝子（必須遺伝子６、８、および９（ＥＧ６、ＥＧ８、およびＥＧ９）、図１５Ａ）および３個の候補合成致死性遺伝子（標的遺伝子１、５、および６（ＴＧ１、ＴＧ５、およびＴＧ６）、図１５Ｂ）を標的とするｓｇＲＮＡについて、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞における３日目に対する経時的な倍率変化（ｓｇＲＮＡ枯渇）を示す。 同上。 ７１個の推定合成致死性遺伝子（一次スクリーニングでＡｇｇ［＋］細胞においてｓｇＲＮＡが選択的に枯渇した）および１０個の推定必須遺伝子（一次スクリーニングでＡｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞の両方においてｓｇＲＮＡが枯渇した）を標的とする４６２個の固有の標的化ｓｇＲＮＡからなるカスタムｓｇＲＮＡライブラリの読み取りカウント分布を示す。 ５００個の固有の非標的化対照ｓｇＲＮＡ（一次スクリーニングで経時的に改変されなかった非特異的ｓｇＲＮＡ）からなるｓｇＲＮＡライブラリの読み取りカウント分布を示す。 カスタムｓｇＲＮＡライブラリを使用して７１個の推定合成致死性遺伝子および１０個の推定必須遺伝子を検証するための、二次スクリーニングの一般的な概略図を示す。 二次スクリーニングにおいて、１０個の候補必須遺伝子候補（ＥＧ１～ＥＧ１０）を標的とするｓｇＲＮＡについて、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞における３日目に対する経時的な倍率変化（ｓｇＲＮＡ枯渇）を示す。 同上。 同上。 Ａｇｇ［＋］細胞とＡｇｇ［－］細胞との間のｓｇＲＮＡの識別可能な枯渇パターン（すなわち、Ａｇｇ［＋］細胞におけるより劇的な枯渇）を示すグラフの例を示す。 すべての実験（１０日目＜３日目、１４日目＜７日日目、および１７日目＜１０日目）における有意な時間経過のｐ値および枯渇パターンの両方を示すｓｇＲＮＡを同定することにより、二次スクリーニングで合成致死性遺伝子を同定するための一般的な概略図を示す。 標的遺伝子１（ＴＧ１）を標的とする６つのｓｇＲＮＡおよび６つのｓｇＲＮＡ標的遺伝子２（ＴＧ２）について、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞における経時的な倍率変化（ｓｇＲＮＡ枯渇）を示す。 標的遺伝子３（ＴＧ３）を標的とする６つのｓｇＲＮＡおよび６つのｓｇＲＮＡ標的遺伝子４（ＴＧ４）について、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞における経時的な倍率変化（ｓｇＲＮＡ枯渇）を示す。 すべての実験（１０日目＜３日目、１４日目＜７日日目、および１７日目＜１０日目）における有意な時間経過のｐ値および枯渇パターンの両方を示すＣＲＩＳＰＲａ ｓｇＲＮＡを同定することにより、二次スクリーニングで合成致死性遺伝子を同定するための一般的な概略図を示す。 標的遺伝子７～１５（ＴＧ７～ＴＧ１５）を標的とするｓｇＲＮＡについて、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞における経時的な倍率変化（ｓｇＲＮＡ枯渇）を示す。 同上。 標的遺伝子１、２、および４を標的とするｓｇＲＮＡを送達するレンチウイルスベクターの形質導入後のＡｇｇ［＋］細胞およびＡｇｇ［－］細胞の細胞生存率および細胞死を定量化するために、フローサイトメトリーを使用した、標的遺伝子１、２、および４をさらに検証するための概略図を示す。 標的遺伝子１、２、および４を標的とするｓｇＲＮＡを送達するレンチウイルスベクターの形質導入後のＡｇｇ［＋］細胞およびＡｇｇ［－］細胞の細胞生存率および細胞死を示す。
定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われている。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端されたタンパク質またはポリペプチドの開始部に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）によって終端されたアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端部に関する。
本明細書で互換的に使用される、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向で、その隣の３’酸素に結合する手法でオリゴヌクレオチドを作製するように、モノヌクレオチドが反応するため、核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するとしても、５’および３’末端を有するとも言われ得る。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個のエレメントは、「上流」または「下流」の５’もしくは３’エレメントであると呼ばれる。
「ゲノム的に組み込まれる」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルを使用してよい。
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入され得る組換え核酸を指す。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、かつウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、またはそれを許容するエレメントを含む、組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、エクスビボまたはインビボのいずれかで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を細胞に移す目的で利用され得る。ウイルスベクターの多くの形態が既知である。
「野生型」という用語は、（変異型、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
「内因性配列」という用語は、細胞または生物内で自然に発生する核酸配列を指す。例えば、細胞または生物の内因性ＭＡＰＴ配列は、細胞または生物のＭＡＰＴ遺伝子座で自然に発生するネイティブＭＡＰＴ配列を指す。
「外因性」分子または配列には、その形態の細胞には通常存在しない分子または配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子または配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子または配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列を含む。
核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、同じ分子内で一緒に自然に発生しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界で互いに同じ関係（例えば、一緒に結合）で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内の、または別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、自然界の他のペプチド分子（例えば、融合タンパク質、またはタグ付きタンパク質）に関連して見出されない、別のペプチド分子内にあるか、またはそれに結合しているアミノ酸のセグメントである。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌または局在化配列を含み得る。
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、または生物のゲノムの染色体上の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の特定の位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を指す。例えば、「ＭＡＰＴ遺伝子座」は、ＭＡＰＴ遺伝子の特定の位置、ＭＡＰＴ ＤＮＡ配列、微小管関連タンパク質タウコード配列、またはそのような配列がどこに存するかに関して同定された生物のゲノムの染色体上のＭＡＰＴ位置を指し得る。「ＭＡＰＴ遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせを含む、ＭＡＰＴ遺伝子の調節エレメントを含み得る。
「遺伝子」という用語は、生成物（例えば、ＲＮＡ生成物および／またはポリペプチド生成物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指し、遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（５’および３’非翻訳配列を含む）に対応するように、５’および３’末端の両方で、非コードイントロンで中断されたコード領域およびコード領域に隣接して位置する配列を含む。「遺伝子」という用語はまた、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位、サイレンサー、絶縁配列、およびマトリックス結合領域を含む他の非コード配列を含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近い場合（例えば、１０ｋｂ以内）または離れた部位にある場合があり、それらは遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは速度に影響する。
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアント形態を指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合として、および２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合として記載されている。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、ヒト細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が互いに近接していること、またはトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
「バリアント」という用語は、集団において最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、または集団において最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。
「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、完全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、完全長核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片であり得る。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合に、保存的置換は、０～１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。別段の定めがない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の完全長である。
別段の記載がない限り、配列同一性／類似性の値は、次のパラメータ：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、またはグリシンとセリンとの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリシンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類を以下で要約する。
Figure 2022526297000002
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一であるか、または実質的に同様である配列を含む。相同配列は、例えば、オルソログ配列およびパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は典型的には、種分化事象（オルソログ遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソログ」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オルソログは典型的には、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管または単離された細胞もしくは細胞株）内で生じるプロセスまたは反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。「エクスビボ」という用語は、個体の身体から除去された細胞、およびそのような細胞内で生じるプロセスまたは反応を含む。
「レポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（または含むように作製され得る）細胞に導入された場合に容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子生成物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例には、これらに限定されないが、ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
本明細書で使用される「蛍光レポータータンパク質」という用語は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、蛍光は、レポータータンパク質から直接、レポータータンパク質の蛍光発生基質上の活性、または蛍光タグ付き化合物への結合に親和性のあるタンパク質のいずれかからのものであり得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、およびフローサイトメトリー方法により細胞内の存在を検出することができる任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答する修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路（相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ））による生じる。Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ＆Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介された標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝的情報の交換の任意のプロセスを含み得る。
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝的情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得る核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝的情報の伝達をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、そのような伝達は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーが標的の一部となる遺伝的情報を再合成するために使用される合成依存性鎖アニーリング、および／または関連するプロセスを含み得る。いくつかの場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＮＨＥＪには、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を相互に、または外因性配列に直接ライゲーションすることによる、核酸における二本鎖切断の修復が含まれる。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位の近くで欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすることにより、外因性ドナー核酸の標的化組み込みをもたらすことができる（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介標的化組み込みは、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用することができない場合（例えば、非分裂細胞、一次細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に好ましい場合がある。さらに、相同性指向修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益であり得る。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列においてヌクレアーゼ剤によって生成されたものに適合するオーバーハングに隣接する外因性ドナー核酸を使用する粘着末端（すなわち、５’または３’オーバーハングを有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。平滑末端がライゲーションされている場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの生成領域のために、標的および／またはドナーの切除が必要になる場合があり、これにより、標的配列に望ましくない改変が生じ得る。
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含み得る。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が、特許請求の範囲に記載された特定の要素、および特許請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響をしない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。
「任意の」または「任意に」は、後に記載された事象または状況が生じ得るかどうかを意味し、その記載が、その事象または状況が生じる場合の例およびそれが生じない場合の例を含むことを意味する。
値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。
文脈から別段に明確ではない限り、「約」という用語は、規定の値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
「および／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替物（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。
「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」または「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含み得る。
統計的に有意とは、ｐ≦０．０５を意味する。
［発明を実施するための形態］
Ｉ．概要
Ｃａｓタンパク質対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウ凝集に関連する遺伝的脆弱性をスクリーニングするためにそのような細胞を作製および使用する方法が提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）対応タウバイオセンサー細胞、ならびにタウ凝集に関連する遺伝的脆弱性をスクリーニングするためにそのような細胞を作製および使用する方法もまた提供される。
疾患関連タンパク質凝集体との合成致死性を呈する遺伝子および経路を同定するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）ｓｇＲＮＡライブラリを用いてゲノムワイドスクリーニングを行うためのプラットフォームが開発された。プラットフォームは、破壊されたときに、特に異常なタンパク質凝集の状況で細胞死を引き起こす遺伝子を同定する。疾患関連タンパク質凝集体との合成致死性を呈する遺伝子および経路をさらに同定するために、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）ｓｇＲＮＡライブラリを用いてゲノムワイドスクリーニングを行うためのプラットフォームが開発された。プラットフォームは、活性化されたときに、特に異常なタンパク質凝集の状況で細胞死を引き起こす遺伝子を同定する。そのような遺伝子の同定は、神経変性疾患の状況において凝集体関連神経毒性のメカニズム、およびニューロンの死を促進する遺伝的経路を解明し得る。
スクリーニングは、凝集したときに検出可能なシグナルを生成する細胞内バイオセンサーとして一緒に作用し得る固有のレポーターに連結された、病原性変異（例えば、Ｐ３０１Ｓ病原性変異）を有するタウリピートドメイン（例えば、タウ４リピートドメイン、ｔａｕ＿４ＲＤ）を安定して発現する細胞からなるタウバイオセンサー細胞株（例えば、ヒト細胞株、またはＨＥＫ２９３Ｔ）を用いる。非限定的な一例では、細胞株は、蛍光タンパク質ＣＦＰ（例えば、ｅＣＦＰ）または蛍光タンパク質ＹＦＰ（例えば、ｅＹＦＰ）に融合した疾患関連タンパク質バリアントを安定して発現する２つの導入遺伝子：タウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）を含み、タウリピートドメイン（４ＲＤ）は、Ｐ３０１Ｓ病原性変異を含む。これらのバイオセンサー株では、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰタンパク質の凝集により、ドナーＣＦＰからアクセプターＹＦＰへの蛍光エネルギーの移動の結果である蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナルが生成される。本明細書で使用される場合のＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）という用語は、ｅＣＦＰ（増強されたシアン蛍光タンパク質）を含み、本明細書で使用される場合のＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）という用語は、ｅＹＦＰ（増強された黄色蛍光タンパク質）を含む。タウ凝集体を含むＦＲＥＴ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって選別および単離され得る。ベースラインでは、刺激されていない細胞は、最小限のＦＲＥＴシグナルで安定した可溶性状態でレポーターを発現する。刺激（例えば、種粒子のリポソームトランスフェクション）により、レポータータンパク質は凝集体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。凝集体含有細胞はＦＡＣＳによって単離され得る。安定して増殖する凝集体含有細胞株Ａｇｇ［＋］は、Ａｇｇ［－］細胞株のクローン連続希釈によって単離され得る。
このタウバイオセンサー細胞株には、ＣＲＩＳＰＲｎライブラリを使用する遺伝子スクリーニングに役立つようにいくつかの修飾がなされた。最初に、これらのタウバイオセンサー細胞は、ＣＲＩＳＰＲｎスクリーニングで使用するためにＣａｓ発現導入遺伝子（例えば、Ｃａｓ９またはＳｐＣａｓ９）を導入することによって修飾された。次に、これらのＣａｓ発現タウバイオセンサー株のサブクローンが誘導され、タウタンパク質は非凝集（デフォルト状態）（Ａｇｇ［－］）または凝集状態（Ａｇｇ［＋］）のいずれかで安定して存在する。
凝集体あり（Ａｇｇ［＋］）または凝集体なし（Ａｇｇ［－］）のいずれかのＣａｓ発現タウバイオセンサー細胞にＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡライブラリを形質導入し、各標的遺伝子にノックアウト変異を導入するスクリーニング方法を開発するために、これらの細胞株を使用した。次に、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞株の両方で標的化ｓｇＲＮＡが経時的に枯渇する遺伝子からなる必須遺伝子だけでなく、標的化ｓｇＲＮＡがＡｇｇ［－］細胞株と比較してＡｇｇ［＋］では優先的に経時的に枯渇する遺伝子からなる合成致死性遺伝子も同定するためにスクリーニングを行った。枯渇プロファイルを、新たに定義された時間経過分析を使用して評価し、この分析では、初期の時点から最後の時点まで読み取りが減少する一貫したパターンを有するガイドＲＮＡが枯渇するとみなされた。これは、エンドポイント細胞収集の読み取りを最初の継代と単純に比較するより従来のアプローチと比較して、ガイドＲＮＡの枯渇を評価するための新しい分析アプローチである。
同様に、このタウバイオセンサー細胞株にいくつかの修飾を行い、ＣＲＩＳＰＲａライブラリを使用した遺伝子スクリーニングに役立つようにした（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ相乗活性化メディエーター（ＳＡＭ）系で使用するため）。例示的なＳＡＭ系では、いくつかの活性化ドメインが相互作用して、任意の１つの因子のみによって誘導され得るよりも大きな転写活性化を引き起こす。例えば、例示的なＳＡＭ系は、１つ以上の転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質、および１つ以上の転写活性化ドメインに融合された（例えば、ｐ６５およびＨＳＦ１に融合された）アダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ））を含むキメラアダプタータンパク質を含む。ＭＣＰは、ＭＳ２ステムループに自然に結合する。例示的なＳＡＭ系では、ＭＣＰは、ＣＲＩＳＰＲ関連ｓｇＲＮＡに操作されたＭＳ２ステムループと相互作用し、それにより、結合した転写因子を適切なゲノム位置にシャトルする。
最初に、これらのタウバイオセンサー細胞は、１つ以上の転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合した（例えば、ｐ６５およびＨＳＦ１に融合した）アダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ））を含むキメラアダプタータンパク質とを発現する１つ以上の導入遺伝子を導入することによって修飾された。ＳＡＭ系が本明細書に記載されているが、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質などの他のＣＲＩＳＰＲａ系も使用することができ、そのような系はまたキメラアダプタータンパク質を含まない。そのような場合、タウバイオセンサー細胞は、キメラＣａｓタンパク質を発現する導入遺伝子を導入することによって修飾されるであろう。
次に、これらのＳＡＭ発現（すなわち、キメラＣａｓ発現およびキメラアダプター発現）タウバイオセンサー株のサブクローンが誘導され、タウタンパク質は非凝集（デフォルト状態）（Ａｇｇ［－］）または凝集状態（Ａｇｇ［＋］）のいずれかで安定して存在する。
凝集体あり（Ａｇｇ［＋］）または凝集体なし（Ａｇｇ［－］）のいずれかのＳＡＭ発現タウバイオセンサー細胞にＣＲＩＳＰＲａガイドＲＮＡライブラリを形質導入し、各標的遺伝子を転写活性化するスクリーニング方法を開発するために、これらの細胞株を使用した。次いで、活性化されたときに合成致死効果を有する遺伝子を同定するためにスクリーニングを行った。具体的には、Ａｇｇ［＋］細胞株で特異的に枯渇しているが、Ａｇｇ［－］細胞株では枯渇していないか、またはあまり枯渇していないｓｇＲＮＡは、特定の標的遺伝子の活性化が細胞死を誘導するための細胞におけるタウ凝集体の存在と組み合わされる合成致死効果を示し得る。枯渇プロファイルを、新たに定義された時間経過分析を使用して評価し、この分析では、初期の時点から最後の時点まで読み取りが減少する一貫したパターンを有するガイドＲＮＡが枯渇するとみなされた。これは、エンドポイント細胞収集の読み取りを最初の継代と単純に比較するより従来のアプローチと比較して、ガイドＲＮＡの枯渇を評価するための新しい分析アプローチである。これらの合成致死性遺伝子は、タウ関連細胞毒性の潜在的な修飾因子として興味深いものである。
ＩＩ．Ｃａｓ／タウバイオセンサーおよびＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞株ならびに生成方法
Ａ．Ｃａｓ／Ｔａｕバイオセンサー細胞およびＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞
第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン（例えば、タウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む）および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを発現するだけでなく、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質も発現する細胞が本明細書に開示される。第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン（例えば、タウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む）および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを発現するだけでなく、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質、および１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質も発現する細胞もまた本明細書に開示される。第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインは、安定して発現され得、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、安定して発現され得る。例えば、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインをコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができ、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができる。同様に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞において安定して発現され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができる。同様に、キメラＣａｓタンパク質および／またはキメラアダプタータンパク質は、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞において安定して発現され得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができ、かつ／またはキメラアダプタータンパク質をコードするＤＮＡは、ゲノム的に組み込むことができる。
１．レポーターに連結されたタウおよびタウリピートドメイン
微小管関連タンパク質タウは、微小管の集合および安定性を促進するタンパク質であり、主にニューロンにおいて発現される。タウは、ニューロンの微小管を安定させ、したがって軸索伸長を促進する役割を果たす。アルツハイマー病（ＡＤ）およびタウオパチーと呼ばれる関連する神経変性疾患のファミリーでは、タウタンパク質は、異常に過剰リン酸化され、神経原線維変化として現れるフィラメントの束（対らせん状フィラメント）に凝集する。タウオパチーは、脳内の異常なタウ沈着を特徴とする不均一な神経変性状態のグループである。
タウリピートドメインは、ヒト、マウス、またはラットなどの任意の動物または哺乳動物からのタウタンパク質に由来し得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインは、ヒトタウタンパク質に由来する。例示的なヒトタウタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１０６３６が割り当てられている。タウタンパク質は、ヒトではＭＡＰＴ（微小管関連タンパク質タウ）と呼ばれる単一遺伝子からの選択的スプライシングの生成物である。タウリピートドメインは、凝集に関与する配列モチーフを運ぶ（すなわち、それはタウからの凝集しやすいドメインである）。スプライシングに応じて、タウタンパク質のリピートドメインは、タンパク質の凝集しやすいコアを構成する３つまたは４つのリピート領域のいずれかを有し、これは多くの場合、リピートドメイン（ＲＤ）と呼ばれる。具体的には、タウのリピートドメインは、微小管結合領域のコアを表し、タウ凝集に関与するＲ２およびＲ３のヘキサペプチドモチーフを内包する。ヒトの脳には、３５２～４４１アミノ酸長の範囲の６つのタウアイソフォームがある。これらのアイソフォームは、アミノ末端での１つまたは２つの挿入ドメインの存在または非存在に加えて、３つのリピートドメインまたは４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）のいずれかの存在に従ってカルボキシル末端で変化する。タウのカルボキシル末端の半分に位置するリピートドメインは、微小管結合、ならびにタウオパチーに見られる神経原線維変化のコア構成要素である対らせん状フィラメント（ＰＨＦ）へのタウの病理学的凝集に重要であると考えられている。４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）の例示的な配列は、それぞれ、配列番号１～４に提供される。４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）の例示的なコード配列は、配列番号５～８に提供される。タウ４リピートドメインの例示的な配列は、配列番号９に提供される。タウ４リピートドメインの例示的なコード配列は、配列番号１０に提供される。Ｐ３０１Ｓ変異を有するタウ４リピートドメインの例示的な配列は、配列番号１１に提供される。Ｐ３０１Ｓ変異を有するタウ４リピートドメインの例示的なコード配列は、配列番号１２に提供される。
Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞またはＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞で使用されるタウリピートドメインは、タウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含み得る。Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞またはＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞で使用されるタウリピートドメインは、４つのリピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）のうちの１つ以上またはすべてを含み得る。例えば、タウリピートドメインは、配列番号１、２、３、および４のうちの１つ以上もしくはすべて、または配列番号１、２、３、および４と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインは、いくつかのタウアイソフォームに見られるタウ４リピートドメイン（Ｒ１～Ｒ４）である。例えば、タウリピートドメインは、配列番号９もしくは配列番号１１、または配列番号９もしくは配列番号１１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインをコードする核酸は、配列番号１２または配列番号１２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号１１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。別の特定の例では、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインをコードする核酸は、配列番号１０または配列番号１０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号９を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。本明細書に開示される細胞における第１および第２のタウリピートドメインは、同じであるか、類似であるか、または異なり得る。
第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの一方または両方は、細胞において安定して発現され得る。例えば、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインの一方または両方をコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。
本明細書に開示される細胞において使用されるタウリピートドメインはまた、凝集促進変異などのタウ病原性変異を含み得る。そのような変異は、例えば、タウオパチーに関連する（例えば、分離する）か、またはタウオパチーを引き起こす変異であり得る。一例として、変異は、タウを播種に感作するが、タウがそれ自体で容易に凝集することをもたらさない凝集感作変異であり得る。例えば、変異は、疾患関連Ｐ３０１Ｓ変異であり得る。Ｐ３０１Ｓ変異とは、ヒトタウＰ３０１Ｓ変異、またはヒトタウタンパク質と最適にアラインされた場合の別のタウタンパク質の対応する変異を意味する。タウのＰ３０１Ｓ変異は、播種に高い感受性を呈するが、それ自体では容易に凝集しない。したがって、ベースラインでは、Ｐ３０１Ｓ変異を含むタウレポータータンパク質は、細胞内に安定した可溶性の形態で存在するが、外因性のタウ種への曝露はタウレポータータンパク質の凝集を引き起こす。他のタウ変異には、例えば、Ｋ２８０ｄｅｌ、Ｐ３０１Ｌ、Ｖ３３７Ｍ、Ｐ３０１Ｌ／Ｖ３３７Ｍ、およびＫ２８０ｄｅｌ／Ｉ２２７Ｐ／Ｉ３０８Ｐが含まれる。
任意の手段によって、第１のタウリピートドメインは、第１のレポーターに連結され得、第２のタウリピートドメインは、第２のレポーターに連結され得る。例えば、レポーターは、タウリピートドメインに融合され得る（例えば、融合タンパク質の一部として）。
第１のレポーターおよび第２のレポーターは、第１および第２のタンパク質が凝集したときに検出可能なシグナルを生成する細胞内バイオセンサーとして一緒に作用し得る固有のレポーターの対であり得る。一例として、レポーターは、蛍光タンパク質であり得、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用してタンパク質凝集を測定することができる。具体的には、第１および第２のレポーターは、ＦＲＥＴ対であり得る。ＦＲＥＴ対（ドナーおよびアクセプターフルオロフォア）の例は周知である。例えば、Ｂａｊａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１６（９）：１４８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。典型的な蛍光顕微鏡技術は、ある波長の光のフルオロフォアによる吸収（励起）、それに続くより長い波長の二次蛍光のその後の発光に依存する。蛍光共鳴エネルギー移動のメカニズムは、励起された電子状態のドナーフルオロフォアを含み、これは、その励起エネルギーを、長距離双極子－双極子相互作用を介して非放射様式で近くのアクセプター発色団に移動させ得る。例えば、ＦＲＥＴエネルギードナーは、第１のレポーターであり得、ＦＲＥＴエネルギーアクセプターは、第２のレポーターであり得る。あるいは、ＦＲＥＴエネルギードナーは、第２のレポーターであり得、ＦＲＥＴエネルギーアクセプターは、第１のレポーターであり得る。特定の例では、第１および第２のレポーターは、ＣＦＰおよびＹＦＰである。ＣＦＰの例示的なタンパク質およびコード配列は、例えば、それぞれ配列番号１３および１４に提供される。ＹＦＰの例示的なタンパク質およびコード配列は、例えば、それぞれ配列番号１５および１６に提供される。特定の例として、ＣＦＰは、配列番号１３または配列番号１３と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。別の特定の例として、ＹＦＰは、配列番号１５または配列番号１５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
別の例として、タンパク質断片相補戦略を使用して、凝集を検出することができる。例えば、スプリットルシフェラーゼを使用して基質から生物発光を生成することができ、第１および第２のレポーターは、ルシフェラーゼのアミノ－（ＮＬｕｃ）およびカルボキシ－（ＣＬｕｃ）末端断片であり得る。ルシフェラーゼの例には、レニラ、ホタル、コメツキムシ、およびメトリディアルシフェラーゼが挙げられる。
１つの非限定的な例では、本明細書に開示されるバイオセンサー細胞は、それぞれ、蛍光タンパク質ＣＦＰまたは蛍光タンパク質ＹＦＰに融合した疾患関連タウタンパク質バリアントを安定して発現する２つの導入遺伝子（タウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ））を含み、タウ４リピートドメイン（４ＲＤ）は、Ｐ３０１Ｓ病原性変異を含む。これらのバイオセンサー株では、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰタンパク質の凝集により、ドナーＣＦＰからアクセプターＹＦＰへの蛍光エネルギーの移動の結果であるＦＲＥＴシグナルが生成される。タウ凝集体を含むＦＲＥＴ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって選別および単離され得る。ベースラインでは、刺激されていない細胞は、最小限のＦＲＥＴシグナルで安定した可溶性状態でレポーターを発現する。刺激（例えば、種粒子のリポソームトランスフェクション）により、レポータータンパク質は凝集体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する凝集陽性（Ａｇｇ［＋］）細胞であり得、タウリピートドメインが、すべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代することを意味する。あるいは、本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、凝集陰性（Ａｇｇ［－］）であり得る。
２．Ｃａｓタンパク質およびキメラＣａｓタンパク質
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞はまた、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。任意に、Ｃａｓタンパク質は、安定して発現される。任意に、細胞は、ゲノム的に組み込まれたＣａｓコード配列を含む。同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞はまた、１つ以上の転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）も含む。任意に、キメラＣａｓタンパク質は、安定して発現される。任意に、細胞は、ゲノム的に組み込まれたキメラＣａｓコード配列を含む。
Ｃａｓタンパク質は、クラスター化された規則的に散在した短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系の一部である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、またはその活性を指示する転写産物および他のエレメントが含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ系、またはタイプＶ系（例えば、サブタイプＶ－ＡまたはサブタイプＶ－Ｂ）であり得る。本明細書に開示される方法および組成物は、核酸の部位特異的結合または切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることができる。
本明細書に開示される組成物および方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、非天然発生型であり得る。「非天然発生型」系には、自然発生状態から改変もしくは変異されているか、それらが本質的に自然に関連付けられている少なくとも１つの他の構成要素から少なくとも実質的に自由であるか、またはそれらが自然に関連付けられていない少なくとも１つの他の構成要素に関連付けられている、系の１つ以上の構成要素など、人間の助けの関与を示すものが含まれる。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に発生しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を一緒に含む非天然発生型ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いるか、天然に発生しないＣａｓタンパク質を用いるか、または天然に発生しないｇＲＮＡを用いる。
Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡと相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含み得る。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、ネイティブのＣａｓタンパク質に由来し得る。他のそのようなドメインを追加して、修飾されたＣａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断に対する触媒活性を有する。切断は、平滑末端または千鳥状の末端を生成することができ、それは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、平滑切断生成物を生成する。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例、ＦｎＣｐｆ１）は、５ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む切断生成物をもたらすことができ、切断は、非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後および標的化鎖の２３番目の塩基後に発生する。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を作成することができるか（例えば、平滑末端を含む二本鎖切断）、またはそれは標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を作成するニッカーゼであり得る。
Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらの相同体または修飾バージョンが挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するものであり、典型的には、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。例示的なＳｐＣａｓ９タンパク質およびコード配列は、それぞれ、配列番号２１および２２に示されている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．８：１４５００を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＳａＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）由来のＣａｓ９は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｅｄｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７３（４）：７１４－７２６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座（Ｓｔ１Ｃａｓ９）によってコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座（Ｓｔ３Ｃａｓ９）由来のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）または代替ＰＡＭを認識するＲＨＡ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９バリアント（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これらおよび他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１または配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。別の特定の例として、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質および１つ以上の転写活性化ドメインを含むキメラＣａｓタンパク質は、配列番号３６または配列番号３６と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富むクラスターの対応物とともに含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長い挿入を含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列において隣接している。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２が割り当てられている）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、本質的に発生するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または修飾Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性なバリアントまたは断片であり得る。触媒活性に関する活性バリアントまたは断片は、野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質またはその一部と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を含み得、活性バリアントは、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがって、二本鎖切断誘導活性を保持する。二本鎖切断誘導活性のアッセイは既知であり、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
修飾Ｃａｓタンパク質の一例は、修飾ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、これは、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された改変を内包するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の忠実度の高いバリアント（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された修飾ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のＳｐＣａｓ９バリアントには、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが含まれる。これらおよび他の修飾Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓ９タンパク質の別の例は、ｘＣａｓ９であり、これは拡大された範囲のＰＡＭ配列を認識することができるＳｐＣａｓ９バリアントである。例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７－６３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つ以上を増加または減少させるように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性など、タンパク質の任意の他の活性または特性を変更するように修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するために、またはＣａｓタンパク質の活性または特性を最適化（例えば、増強または低減）するために切り詰めることができる。別の例として、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインは、修飾、削除、または不活性化され得る（例えば、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞で使用するため）。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配座で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインは各々、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を行うことができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレアーゼドメインの１つ以上またはすべては、削除または変異され得、それによりそれらが機能しなくなるか、または低減されたヌクレアーゼ活性を有する。例えば、Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインの１つが削除または変異されている場合、得られたＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと称され、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成することができるが、二本鎖切断では生成することができない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、両方を切断することはできない）。ヌクレアーゼドメインの両方が削除または変異された場合、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒活性を伴わないＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））を切断する能力が低減される。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でのアスパラギン酸塩からアラニンへ）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにあるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位でのヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位でのヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位でのアスパラギンからアラニンへ）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９への対応する変異が挙げられる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２１）：９２７５－９２８２およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような変異は、部位特異的変異導入、ＰＣＲを介した変異導入、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成され得る。ニッカーゼを生成する他の変異の例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができ、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレアーゼドメインのすべてがＣａｓタンパク質で削除または変異された場合（例えば、ヌクレアーゼドメインの両方がＣａｓ９タンパク質で削除または変異された場合）、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を切断する能力が低減される。１つの特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。
ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例は、ＳｐＣａｓ９について上に記載されるものと同じである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を生成するために、Ｎ５８０位での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）およびＤ１０位での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み得る。例えば、ＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ１６ＡおよびＨ５８８Ａの組み合わせ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、およびＮ６２２Ａの組み合わせ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ１０ＡおよびＮ８７０Ａの組み合わせ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ８ＡおよびＨ５５９Ａの組み合わせ）。ＦｎＣａｓ９およびＲＨＡ ＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｎ９９５Ａ）。
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質に関して、そのような変異には、ＡｓＣｐｆ１の９０８、９９３、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置、あるいはＬｂＣｐｆ１の８３２、９２５、９４７、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置での変異が含まれ得る。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異のうちの１つ以上を含み得る。例えば、ＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写リプレッサードメインに融合され得る。ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞で使用するために、転写活性化ドメインに作動可能に連結または融合され得る。転写活性化ドメインの例には、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体）、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ならびにＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）活性化ドメインが挙げられる。他の例には、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、ＳＰ１、ＡＰ－２、ＣＴＦ１、Ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＥＲＦ－２、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、ＡＲＦ－６、ＡＲＦ－７、ＡＲＦ－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、ＴＲＡＢ１ＰＣ４、およびＨＳＦ１由来の活性化ドメインが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０２３７４５６、ＥＰ３０４５５３７、およびＷＯ２０１１／１４６１２１を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。いくつかの場合では、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と対になったｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質を含む転写活性化系を使用することができる。そのような系のガイドＲＮＡは、二量体化ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質に結合するように設計されたｓｇＲＮＡテトラループおよびステムループ２に付加されたアプタマー配列を用いて設計され得る。例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５１７（７５３６）：５８３－５８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。転写リプレッサードメインの例には、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ΙκΒリプレッサー、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。他の例には、Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＧ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｒｂ、ＲＯＭ２由来の転写リプレッサードメインが挙げられる。例えば、ＥＰ３０４５５３７およびＷＯ２０１１／１４６１２１を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合され得る。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質の内部に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合され得る。そのような異種ポリペプチドには、例えば、核を標的とするための単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＳＶ４０ ＮＬＳおよび／または双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）アルファ－インポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどが含まれ得る。例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１－５１０５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、単節型配列または双節型配列であり得る。任意に、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含み得る。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳおよび／またはＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含み得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインまたはタンパク質導入ドメインに作動可能に連結され得る。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスからのＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体化したＣａｓタンパク質として提供され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然発生型ポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、任意の他の目的の宿主細胞において、より高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性および／または免疫原性の特性の改善のために修飾され得る。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行われ得る。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学修飾の例には、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、および５－メチル－シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップされポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義コドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾され得る。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。１つの特定の例では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号２２または配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号２１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。別の特定の例では、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質および１つ以上の転写活性化ドメインを含むキメラＣａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号３８または配列番号３８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３６を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、かつそのような目的の核酸配列を標的細胞に移すことができる任意の核酸構築物を含む。発現構築物において使用され得るプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発達的に制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。
３．キメラアダプタータンパク質
本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、１つ以上の転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）だけでなく、任意に、１つ以上の転写活性化ドメインに融合された（例えば、ｐ６５およびＨＳＦ１に融合された）アダプタータンパク質（例えば、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ））を含むキメラアダプタータンパク質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）も含み得る。任意に、キメラＣａｓタンパク質および／またはキメラアダプタータンパク質は、安定して発現される。任意に、細胞は、ゲノム的に組み込まれたキメラＣａｓタンパク質コード配列および／またはゲノム的に組み込まれたキメラアダプタータンパク質コード配列を含む。
そのようなキメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡ内のアダプター結合エレメントに特異的に結合するアダプター（すなわち、アダプタードメインまたはアダプタータンパク質）、および（ｂ）１つ以上の異種転写活性化ドメインを含む。例えば、そのような融合タンパク質は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の転写活性化ドメイン（例えば、２つ以上の異種転写活性化ドメインまたは３つ以上の異種転写活性化ドメイン）を含み得る。一例では、そのようなキメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡのアダプター結合エレメントに特異的に結合するアダプター（すなわち、アダプタードメインまたはアダプタータンパク質）、および（ｂ）２つ以上の転写活性化ドメインを含み得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、（ａ）ガイドＲＮＡの１つ以上のＭＳ２アプタマー（例えば、ガイドＲＮＡの別々の位置にある２つのＭＳ２アプタマー）に特異的に結合するＭＳ２コートタンパク質アダプター、および（ｂ）１つ以上（例えば、２つ以上の転写活性化ドメイン）を含み得る。例えば、２つの転写活性化ドメインは、ｐ６５およびＨＳＦ１転写活性化ドメインまたはそれらの機能的断片もしくはバリアントであり得る。しかしながら、転写活性化ドメインが他の転写活性化ドメインまたはその機能的断片もしくはバリアントを含むキメラアダプタータンパク質もまた提供される。
１つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターに直接融合され得る。あるいは、１つ以上の転写活性化ドメインは、リンカーもしくはリンカーの組み合わせを介して、または１つ以上の追加のドメインを介してアダプターに連結され得る。同様に、２つ以上の転写活性化ドメインが存在する場合、それらは互いに直接融合され得るか、またはリンカーもしくはリンカーの組み合わせを介して、または１つ以上の追加のドメインを介して互いに連結され得る。これらの融合タンパク質で使用され得るリンカーには、融合タンパク質の機能を干渉しない任意の配列を含み得る。例示的なリンカーは短く（例えば、２～２０アミノ酸）、典型的には、柔軟である（例えば、グリシン、アラニン、およびセリンなどの自由度の高いアミノ酸を含む）。
１つ以上の転写活性化ドメインおよびアダプターは、キメラアダプタータンパク質内で任意の順序であり得る。１つの選択肢として、１つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターのＣ末端であり得、アダプターは、１つ以上の転写活性化ドメインのＮ末端であり得る。例えば、１つ以上の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にあり得、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあり得る。しかしながら、１つ以上の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端になくても、アダプターのＣ末端であり得る（例えば、核局在化シグナルがキメラアダプタータンパク質のＣ末端にある場合）。同様に、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端になくても、１つ以上の転写活性化ドメインのＮ末端であり得る（例えば、核局在化シグナルがキメラアダプタータンパク質のＮ末端にある場合）。別の選択肢として、１つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターのＮ末端であり得、アダプターは、１つ以上の転写活性化ドメインのＣ末端であり得る。例えば、１つ以上の転写活性化ドメインは、キメラアダプタータンパク質のＮ末端にあり得、アダプターは、キメラアダプタータンパク質のＣ末端にあり得る。さらに別の選択肢として、キメラアダプタータンパク質が２つ以上の転写活性化ドメインを含む場合、２つ以上の転写活性化ドメインは、アダプターに隣接し得る。
キメラアダプタータンパク質はまた、追加の異種ポリペプチドに作動可能に連結または融合され得る。融合または連結された異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはキメラアダプタータンパク質の内部の任意の場所に位置し得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、核局在化シグナルをさらに含み得る。そのようなタンパク質の特定の例は、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）のｐ６５転写活性化ドメインのＣ末端、およびｐ６５転写活性化ドメインのＨＳＦ１転写活性化ドメインのＣ末端に（直接またはＮＬＳを介してのいずれかで）連結されたＭＳ２コートタンパク質（アダプター）を含む。そのようなタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＣＰ、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、配列番号３７に示されるＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１キメラアダプタータンパク質配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。同様に、キメラアダプタータンパク質をコードする核酸は、配列番号３９に示されるＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１キメラアダプタータンパク質コード配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
アダプター（すなわち、アダプタードメインまたはアダプタータンパク質）は、別個の配列を特異的に認識および結合する（例えば、配列特異的様式でのアプタマーなどの別個のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列に結合する）核酸結合ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメインおよび／またはＲＮＡ結合ドメイン）である。アプタマーには、特定の三次元立体配座を採用する能力を通じて、高い親和性および特異性で標的分子に結合し得る核酸が含まれる。そのようなアダプターは、例えば、特定のＲＮＡ配列および二次構造に結合し得る。これらの配列（すなわち、アダプター結合エレメント）は、ガイドＲＮＡに操作され得る。例えば、ＭＳ２アプタマーは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）に特異的に結合するようにガイドＲＮＡに操作され得る。例えば、アダプターは、配列番号４０に示されるＭＣＰ配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。同様に、アダプターをコードする核酸は、配列番号４１に示されるＭＣＰコード配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。アダプターおよび標的の特定の例には、例えば、バクテリオファージコートタンパク質の多様性の中に存在するＲＮＡ結合タンパク質／アプタマーの組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１９－０２８４５７２およびＷＯ２０１９／１８３１２３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるキメラアダプタータンパク質は、１つ以上の転写活性化ドメインを含む。そのような転写活性化ドメインは、天然発生型転写活性化ドメインであり得るか、天然発生型転写活性化ドメインの機能的断片もしくは機能的バリアントであり得るか、または操作もしくは合成転写活性化ドメインであり得る。使用され得る転写活性化ドメインには、例えば、ＵＳ２０１９－０２８４５７２およびＷＯ２０１９／１８３１２３に記載されているものが含まれ、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
４．細胞型
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、任意の細胞型であり得、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞株または細胞集団は、モノクローナル細胞株または細胞集団であり得る。同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、任意の細胞型であり得、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞株または細胞集団は、モノクローナル細胞株または細胞集団であり得る。細胞は、任意の供給源からのものであり得る。例えば、細胞は、真核細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌（例えば、酵母）細胞であり得る。そのような細胞は、魚細胞もしくは鳥細胞であり得るか、またはそのような細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、もしくはラット細胞などの哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、ヒツジ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ギニアブタ）、家畜（例えば、雌牛および去勢雄牛などのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥には、例えば、鶏、七面鳥、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。家畜および農業動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除外する。特定の例では、Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞は、ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）である。同様に、特定の例では、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）である。
細胞は、例えば、全能性細胞または多能性細胞（例えば、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）であり得る。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、複数の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発達中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性または多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来するものであり得、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のうちのいずれかの細胞に分化することができる。
細胞はまた、一次体細胞、または一次体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれ得る。細胞はまた、一次細胞であり得る。一次細胞には、生物、器官、または組織から直接単離された細胞または細胞の培養物が含まれる。一次細胞には、形質転換も不死化もされていない細胞が含まれる。それらには、以前に組織培養で継代されなかったか、または以前に組織培養で継代されたが、組織培養で無限に継代することができない生物、器官、または組織から得られた任意の細胞が含まれる。そのような細胞は、従来の技術によって単離することができ、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉系細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、単球、単核細胞、脂肪細胞、脂肪前駆細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、および平滑筋細胞が含まれる。例えば、一次細胞は、結合組織、筋肉組織、神経系組織、または上皮組織に由来し得る。
そのような細胞には、通常は無限に増殖することはないが、変異または改変に起因して、正常な細胞老化を回避し、代わりに分裂を続けることができるものも含まれる。そのような変異または改変は、自然に発生し得るか、または意図的に誘導され得る。不死化細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、およびマウス胎児線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が挙げられる。多くの種類の不死化細胞が周知である。不死化細胞または一次細胞には、典型的には、組換え遺伝子またはタンパク質の培養または発現に使用される細胞が含まれる。
細胞はまた、神経細胞（例えば、ヒト神経細胞）などの分化細胞であり得る。
Ｂ．Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞およびＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を生成する方法
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、任意の既知の手段によって生成され得る。第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメイン、およびＣａｓタンパク質は、任意の既知の手段によって任意の形態（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）で細胞に導入され得る。同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、任意の既知の手段によって生成され得る。第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメイン、キメラＣａｓタンパク質、およびキメラアダプタータンパク質は、任意の既知の手段によって任意の形態（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）で細胞に導入され得る。「導入すること」は、配列が細胞の内部にアクセスできるように、核酸またはタンパク質を細胞に提示することを含む。本明細書で提供される方法は、核酸またはタンパク質を細胞に導入するための特定の方法に依存せず、核酸またはタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部にアクセスできることのみに依存する。核酸およびタンパク質を様々な細胞型に導入するための方法は既知であり、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、およびウイルス媒介法が含まれる。任意に、標的化ベクターを使用することができる。
トランスフェクションプロトコル、ならびに核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのプロトコルは異なり得る。非限定的なトランスフェクション法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（４）：１５９０－４、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学物質ベースのトランスフェクション法が含まれる。非化学的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション、および光トランスフェクションが含まれる。粒子ベースのトランスフェクションには、遺伝子銃の使用、またはマグネットアシストトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）が含まれる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。
細胞への核酸またはタンパク質の導入はまた、電気穿孔法、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、またはヌクレオフェクションによって媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核に送達することを可能にする改善された電気穿孔法技術である。さらに、本明細書に開示される方法でのヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常の電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常の電気穿孔法による７００万に対してわずか約２００万）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。
細胞への核酸またはタンパク質の導入は、マイクロインジェクションによっても達成され得る。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは細胞質へ（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）のものであるが、一方で、タンパク質またはタンパク質をコードするＤＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは、核へのものである。あるいは、マイクロインジェクションは、核および細胞質の両方への注射によって実施することができ、針を最初に核に導入し、最初の量を注射することができ、細胞から針を取り除きながら、２番目の量を細胞質に注射することができる。マイクロインジェクションを実施する方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１５０２２－１５０２６、およびＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：９３５４－９３５９を参照されたい。
核酸またはタンパク質を細胞に導入するための他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エクソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、または埋め込み型デバイス媒介配達が含まれ得る。インビボで細胞を修飾するために対象に核酸またはタンパク質を投与する方法は、本明細書の他の場所に開示されている。
一例では、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメイン、およびＣａｓタンパク質は、レンチウイルス形質導入などのウイルス形質導入を介して導入され得る。
第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメイン、およびＣａｓタンパク質を含む細胞のスクリーニングは、任意の既知の手段によって行われ得る。
一例として、レポーター遺伝子は、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、または第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを有する細胞をスクリーニングするために使用され得る。例示的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびアルカリホスファターゼをコードするものが含まれる。例えば、第１のレポーターおよび第２のレポーターが蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰおよびＹＦＰ）である場合、これらのレポーターを含む細胞は、二重陽性細胞を選択するためにフローサイトメトリーによって選択され得る。次いで、二重陽性細胞を組み合わせて、ポリクローナル統を生成するか、またはモノクローナル株は、単一の二重陽性細胞から生成され得る。
別の例として、選択マーカーは、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、または第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを有する細胞をスクリーニングするために使用され得る。例示的な選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）が含まれる。別の例示的な選択マーカーは、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン遺伝子）によってコードされるブレオマイシン耐性タンパク質であり、これは、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）耐性を付与する。
タウリピートドメインが凝集状態で安定して存在する、つまりタウリピートドメインが、すべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代することを意味する、凝集陽性（Ａｇｇ［＋］）細胞は、例えば、タウ凝集体を播種することによって、生成され得る。例えば、本明細書に開示されるナイーブ凝集陰性（Ａｇｇ［－］）Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞は、組換え線維化タウ（例えば、組換え線維化タウリピートドメイン）で処理されて、これらの細胞によって安定して発現されるタウリピートドメインタンパク質の凝集を播種することができる。同様に、本明細書に開示されるナイーブ凝集陰性（Ａｇｇ［－］）ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、組換え線維化タウ（例えば、組換え線維化タウリピートドメイン）で処理されて、これらの細胞によって安定して発現されるタウリピートドメインタンパク質の凝集を播種することができる。線維化タウリピートドメインは、細胞によって安定して発現されるタウリピートドメインと同じであるか、類似しているか、または異なり得る。任意に、組換え線維化タウは、リポフェクタミン試薬と混合され得る。次いで、播種した細胞を連続希釈して、単一細胞由来のクローンを得ることができ、タウリピートドメイン凝集体がすべての細胞において安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代するクローン細胞株を同定することができる。
Ｃ．インビトロ培養物
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞およびそれらの細胞を培養するための培地を含むインビトロ培養物または組成物もまた、本明細書に開示される。細胞は、Ａｇｇ［－］細胞またはＡｇｇ［＋］細胞であり得る。
ＩＩＩ．ガイドＲＮＡノックアウトライブラリ
本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲｎスクリーニング方法は、ゲノムワイドｇＲＮＡノックアウトライブラリなどのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ノックアウトライブラリを利用する。Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼは、特定の標的配列を標的とするように設計されたｇＲＮＡを介して、特定のゲノム遺伝子座で二本鎖切断を誘導するようにプログラムされ得る。Ｃａｓタンパク質の標的化特異性は短いｇＲＮＡによって付与されるため、プールされたゲノムスケールの機能的スクリーニングが可能である。そのようなライブラリは、ｍＲＮＡを標的化することによりタンパク質発現を低減するｓｈＲＮＡライブラリなどのライブラリに比べていくつかの利点を有する。対照的に、ｇＲＮＡライブラリは、遺伝子のゲノムコード領域に導入されたフレームシフト変異を介してノックアウトを達成する。
本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲａスクリーニング方法は、ゲノムワイドｇＲＮＡ転写活性化トライブラリなどのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）転写活性化ライブラリを利用する。ＳＡＭシステムは、特定の標的配列を標的とするように設計されたｇＲＮＡを介して、特定のゲノム遺伝子座で遺伝子の転写を活性化するようにプログラムされ得る。Ｃａｓタンパク質の標的化特異性は短いｇＲＮＡによって付与されるため、プールされたゲノムスケールの機能的スクリーニングが可能である。
ライブラリのｇＲＮＡは、任意の数の遺伝子を標的とすることができる。例えば、ｇＲＮＡは、約５０個以上の遺伝子、約１００個以上の遺伝子、約２００個以上の遺伝子、約３００個以上の遺伝子、約４００個以上の遺伝子、約５００個以上の遺伝子、約１０００個以上の遺伝子、約２０００個以上の遺伝子、約３０００個以上の遺伝子、約４０００個以上の遺伝子、約５０００個以上の遺伝子、約１００００個以上の遺伝子、または約２００００個以上の遺伝子を標的とすることができる。一部のライブラリでは、ｇＲＮＡは、特定のシグナル伝達経路の遺伝子を標的とするように選択され得る。一部のライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
ゲノムワイドライブラリには、ゲノム内の各遺伝子を標的化する１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）が含まれる。標的化されているゲノムは、あらゆるタイプのゲノムであり得る。例えば、ゲノムは、真核生物ゲノム、哺乳動物ゲノム、非ヒト哺乳動物ゲノム、げっ歯類ゲノム、マウスゲノム、ラットゲノム、またはヒトゲノムであり得る。一例では、標的化ゲノムは、ヒトゲノムである。
ｇＲＮＡは、各個々の標的化遺伝子内の任意の数の配列を標的とすることができる。一部のライブラリでは、複数の標的配列は、標的とされる複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約２～約１０、約２～約９、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、または約２～３個の固有の標的配列が標的化され得る。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、または少なくとも約６個の固有の標的配列が標的化され得る。特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約６個の標的配列が標的化され得る。別の特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約３～約６または約４～約６個の標的配列が標的化される。
例えば、ライブラリは、遺伝子あたり約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０のｇＲＮＡの平均カバレッジで遺伝子を標的とすることができる。特定の例では、ライブラリは、遺伝子あたり約３～４のｇＲＮＡ、または遺伝子あたり約６のｇＲＮＡの平均カバレッジで遺伝子を標的とすることができる。
ｇＲＮＡは、標的遺伝子内の任意の所望の位置を標的とすることができる。ＣＲＩＳＰＲｎ ｇＲＮＡは、対応するＣａｓタンパク質による切断が、機能喪失対立遺伝子をもたらすフレームシフト挿入／欠失（インデル）変異をもたらすように、遺伝子のコード領域を標的とするように設計され得る。より具体的には、フレームシフト変異は、標的化ＤＮＡ二本鎖切断、およびそれに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した変異原性修復によって達成することができ、これにより、切断部位にインデルが生成される。ＤＳＢに導入されているインデルはランダムであり、一部のインデルは遺伝子の早期終了を引き起こすフレームシフト変異をもたらす。
一部のＣＲＩＳＰＲｎライブラリでは、可能な場合、各ｇＲＮＡは構成的エクソンを標的とする。一部のＣＲＩＳＰＲｎライブラリでは、可能な場合、各ｇＲＮＡは５’構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、各ｇＲＮＡは、可能な場合、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソン（遺伝子の５’末端から）を標的とする。
一例として、ＣＲＩＳＰＲｎライブラリのｇＲＮＡは、構成的エクソンを標的とすることができる。構成的エクソンは、スプライシング後に一貫して保存されているエクソンである。すべての組織にわたって発現されるエクソンは、ｇＲＮＡ標的化の構成的エクソンとみなされ得る。ライブラリのｇＲＮＡは、各遺伝子の５’末端近くの構成的エクソンを標的とすることができる。任意に、各遺伝子の最初および最後のエクソンは、潜在的な標的として除外され得る。任意に、選択的スプライシング部位を含む任意のエクソンは、潜在的な標的として除外され得る。任意に、上記の基準を満たす最も早い２つのエクソンは、潜在的な標的として選択される。任意に、エクソン２および３は、潜在的な標的として選択される（例えば、構成的エクソンが同定されない場合）。さらに、ライブラリ内のｇＲＮＡは、オフターゲット効果を最小化するように選択および設計され得る。
特定の例では、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲｎ ｇＲＮＡライブラリは、ヒトゲノム内の＞１８，０００の遺伝子の５’構成的エクソンを標的化するｓｇＲＮＡを含み、遺伝子あたりの平均カバレッジは約６のｓｇＲＮＡであり、各標的部位はオフターゲット修飾を最小化するように選択された。
ＣＲＩＳＰＲａ ｇＲＮＡは、遺伝子の転写開始部位に隣接する配列を標的とするように設計され得る。例えば、標的配列は、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、または１塩基対の転写開始部位内にあり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲａライブラリの各ｇＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内の配列を標的とすることができる。任意に、標的配列は、転写開始部位の上流の２００塩基対上流および転写開始部位の１塩基対下流（－２００～＋１）の領域内にある。
ゲノムワイドライブラリのｇＲＮＡは、任意の形態であり得る。例えば、ｇＲＮＡライブラリは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターにパッケージングすることができる。特定の例では、ｇＲＮＡライブラリは、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。ベクターは、ベクターを受け取る細胞の選択を容易にするために、レポーター遺伝子または選択マーカーをさらに含み得る。そのようなレポーター遺伝子および選択マーカーの例は、本明細書の他の場所に開示されている。一例として、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼなどの薬物に対する耐性を付与するものであり得る。別の例示的な選択マーカーは、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン遺伝子）によってコードされるブレオマイシン耐性タンパク質であり、これは、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）耐性を付与する。例えば、細胞は、ガイドＲＮＡ構築物で形質導入された細胞のみがスクリーニングを実施するために使用するために保存されるように、薬物（例えば、ピューロマイシン）で選択され得る。
Ａ．ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、かつＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントを含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続したストレッチなどの、分子のセクションまたは領域を含む。Ｃａｓ９のものなど、いくつかのｇＲＮＡは、「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）の２つの別個のＲＮＡ分子を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これはまた「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれ得る。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｃａｓ９の場合、単一ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含み得る（例えば、リンカーを介して）。例えば、Ｃｐｆ１の場合、標的配列への結合を達成するためにｃｒＲＮＡのみが必要とされる。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）、およびｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチの両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２３）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、配列番号２３の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それをハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われ得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号２４）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の他の例は、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２８）、またはＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２９）のいずれか１つを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要とされる系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要とされる系では、ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡであり得る。ｃｒＲＮＡはさらに、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。細胞内での修飾に使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計され得る。例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７－２２９、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９、およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補鎖上の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変化してもよく、ｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。目的のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾され得る。天然発生型ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物によって異なるが、２１～４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接する、２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含むことが多い（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、それをハイブリダイズし、それは順にＣａｓタンパク質と結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、または約１２～約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、または約１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド）であり得る。例えば、ＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、または１７～２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長さである。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、および様々な長さであり得る。それらには、一次転写物または処理された形態が含まれ得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、または２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれ以上のヌクレオチド）のすべてまたは一部を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドのバージョンが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７、ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例には、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５のバージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。ＵＳ８，６９７，３５９を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。一例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある１４個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であり得、残りの部分にわたって０％まで低くなり得る。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチド長であるとみなされ得る。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある７個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であり得、残りの部分にわたって０％まで低くなり得る。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、７ヌクレオチド長であるとみなされ得る。いくつかのガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドは、標的ＤＮＡの相補鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、２０ヌクレオチド長であり得、標的ＤＮＡの相補鎖との１、２、または３つのミスマッチを含み得る。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９塩基対離れている）。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つのストレッチを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。目的のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に配向する。
単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよび足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を含み得る。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、３’足場配列に結合された５’ＤＮＡ標的化セグメントを有することができる。例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１；配列番号１７）、ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２；配列番号１８）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３；配列番号１９）、およびＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４；配列番号２０）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。他の例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５；配列番号：３０）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６；配列番号３１）、またはＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７；配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡ標的配列のうちのいずれかを標的化するガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のうちのいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端のＤＮＡ標的化セグメントを含み得る。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのうちのいずれかは、上記の足場配列のうちのいずれか１つの５’末端に結合して、単一ガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。
ガイドＲＮＡは、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性；細胞内標的化；蛍光標識による追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾または配列を含み得る。そのような修飾の例には、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス可能性を可能にするため）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する修飾または配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への複合体化、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾または配列、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。修飾の他の例には、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の操作されたヘアピン３’、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であり得る。バルジは、二重鎖の片側に、対になっていない５’－ＸＸＸＹ－３’を含むことができ、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、反対側の鎖のヌクレオチドおよび二重鎖の反対側の対になっていないヌクレオチドの領域とゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る。
いくつかの場合では、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と対になったｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合タンパク質を含む転写活性化系を使用することができる。そのような系のガイドＲＮＡは、二量体化ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質に結合するように設計されたｓｇＲＮＡテトラループおよびステムループ２に付加されたアプタマー配列を使用して設計され得る。例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５１７（７５３６）：５８３－５８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
修飾されていない核酸は、分解されやすい場合がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘導し得る。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低減するのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、以下：（１）ホスホジエステル骨格結合において、非結合リン酸酸素の一方または両方および／もしくは結合リン酸酸素の１つ以上の改変または置換、（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの改変または置換などのリボース糖の構成要素の改変または置換、（３）リン酸部分のデホスホリンカーによる置換、（４）天然発生型核酸塩基の修飾または置換、（５）リボース－リン酸骨格の置換または修飾、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分の複合体化）、ならびに（７）糖の修飾のうちの１つ以上を含む修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを含み得る。他の可能なガイドＲＮＡ修飾には、ウラシルまたはポリ－ウラシルトラクトの修飾または置換が含まれる。例えば、ＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様の修飾を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓコード核酸に行うことができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義コドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾され得る。
一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含み得る（例えば、塩基は、ホスホロチオエート基である修飾リン酸基を有し得る）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４つの末端ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４つの末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を含み得る。例えば、ＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２：（９）：２２２７－２２３５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の可能な修飾は、本明細書の他の場所でより詳細に説明されている。特定の例では、ガイドＲＮＡには、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合が含まれる。そのような化学修飾は、例えば、エキソヌクレアーゼからガイドＲＮＡへのより優れた安定性および保護を提供し、それらが修飾されていないガイドＲＮＡよりも長く細胞内に持続することを可能にする。そのような化学修飾はまた、例えば、ＲＮＡを積極的に分解し得るかまたは細胞死につながる免疫カスケードを引き起こし得る自然細胞内免疫応答から保護することもできる。
いくつかのガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ）では、ガイドＲＮＡの少なくとも１つのループ（例えば、２つのループ）は、１つ以上のアダプター（すなわち、アダプタータンパク質またはドメイン）に結合する別個のＲＮＡ配列の挿入によって修飾される。そのようなアダプタータンパク質は、転写活性化ドメインなどの１つ以上の異種機能ドメインをさらに動員するために使用され得る（例えば、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞でのＣＲＩＳＰＲａスクリーニングで使用するため）。そのようなアダプタータンパク質（すなわち、キメラアダプタータンパク質）を含む融合タンパク質の例は、本明細書の他の場所に開示されている。例えば、ＭＳ２結合ループｇｇｃｃＡＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵＣＵＧＣＡＧｇｇｃｃ（配列番号３３）は、ＷＯ２０１６／０４９２５８およびＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５１７（７５３６）：５８３－５８８に記載されているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系について、配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）またはｓｇＲＮＡ骨格に示されるｓｇＲＮＡ足場（骨格）のヌクレオチド＋１３～＋１６およびヌクレオチド＋５３～＋５６を置き換えることができ、参考文献の各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＵＳ２０１９－０２８４５７２およびＷＯ２０１９／１８３１２３もまた参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用されるガイドＲＮＡの番号付けは、ガイドＲＮＡ足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの下流の配列）におけるヌクレオチドの番号付けを指す。例えば、ガイドＲＮＡ足場の最初のヌクレオチドは＋１であり、足場の２番目のヌクレオチドは＋２というようになる。配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）のヌクレオチド＋１３～＋１６に対応する残基は、本明細書ではテトラループと称される領域である、配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）のヌクレオチド＋９～＋２１にまたがる領域のループ配列である。配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）のヌクレオチド＋５３～＋５６に対応する残基は、本明細書ではステムループ２と称される領域である、配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）のヌクレオチド＋４８～＋６１にまたがる領域のループ配列である。配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）にある他のステムループ配列は、ステムループ１（ヌクレオチド＋３３～＋４１）およびステムループ３（ヌクレオチド＋６３～＋７５）を含む。得られる構造は、テトラループおよびステムループ２配列の各々がＭＳ２結合ループにより置き換えられているｓｇＲＮＡ足場である。テトラループおよびステムループ２は、ＭＳ２結合ループを追加することがいかなるＣａｓ９残基にも干渉すべきでないように、Ｃａｓ９タンパク質から突出する。さらに、テトラループおよびステムループ２部位のＤＮＡへの近接は、これらの位置への局在化により、ＤＮＡと転写活性化因子などの任意の動員されたタンパク質との間に高度な相互作用がもたらされ得るあることを示す。したがって、いくつかのｓｇＲＮＡでは、配列番号１７もしくは配列番号１９（または配列番号３０もしくは３１）に示されるガイドＲＮＡ足場の＋１３～＋１６に対応するヌクレオチドおよび／もしくは＋５３～＋５６に対応するヌクレオチド、またはこれらの足場／骨格のいずれかと最適にアラインされた場合の対応する残基は、１つ以上のアダプタータンパク質またはドメインに結合することができる別個のＲＮＡ配列によって置き換えられる。代替的または追加的に、アダプター結合配列は、ガイドＲＮＡの５’末端または３’末端に付加され得る。テトラループおよびステムループ２領域にＭＳ２結合ループを含む例示的なガイドＲＮＡ足場は、配列番号３４に示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。テトラループおよびステムループ２領域にＭＳ２結合ループを含む例示的な一般的な単一ガイドＲＮＡは、配列番号３５に示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供され得る。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてＲＮＡの形態で、および任意にＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別個のＤＮＡ分子として提供され得る。
ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの異種核酸を含むベクター内にあり得る。あるいは、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミドであり得る。そのような発現構築物において使用され得るプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発達的に制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであり得る。好適なプロモーターの特定の例には、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを挙げられる。
あるいは、ｇＲＮＡは、他の様々な方法で調製され得る。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製され得る（例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ガイドＲＮＡはまた、化学的合成によって調製された合成的に生成された分子であり得る。例えば、ガイドＲＮＡは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むように化学的に合成され得る。
ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上のガイドＲＮＡ）およびガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所与の貯蔵条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）で、分解生成物が、出発核酸またはタンパク質の０．５重量％を下回るままであるような、閾値を下回る期間を延長するか、またはインビボで安定性を増加させる）担体を含む組成物中にあり得る。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、および脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。
Ｂ．ガイドＲＮＡ標的配列
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補的鎖」と呼ばれることができ、「相補的鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「テンプレート鎖」と呼ばれることができる。
標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列と非相補鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、具体的には、特に、ガイドＲＮＡが相補鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補鎖上の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列を指す（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流または５’）。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを含む。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ ＰＡＭの上流の配列を指し得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖に対して相補性を有するように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡが本明細書でガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。
標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含むことができ、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子生成物（例えば、タンパク質）をコードする配列もしくは非コード配列（例えば、調節配列）であり得るか、または両方を含み得る。
ＣＲＩＳＰＲａおよびＳＡＭ系システムの場合、標的配列が遺伝子の転写開始部位に隣接していることが好ましい場合がある。例えば、標的配列は、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、または１塩基対の転写開始部位内にあり得る。任意に、標的配列は、転写開始部位の上流の２００塩基対上流および転写開始部位の１塩基対下流（－２００～＋１）の領域内にある。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補鎖との間の塩基対合相補性、および（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補鎖にある、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。任意に、ガイドＲＮＡ標的配列は、３’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃａｓ９の場合）。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流または下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０または約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補鎖上）は、５’－Ｎ１ＧＧ－３’であり得、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の３’のすぐ近くである。したがって、相補鎖上のＰＡＭに対応する（すなわち、逆相補体）配列は、５’－ＣＣＮ２－３’であり、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする配列の５’のすぐ近くである。いくつかのそのような場合、Ｎ１およびＮ２は、相補的であることができ、Ｎ１～Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ、Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ、Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ、またはＮ１＝ＴおよびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。いくつかの場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）では、ＰＡＭ配列は、５’の上流にあり、配列５’－ＴＴＮ－３’を有し得る。
ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列とＰＡＭの２つの例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号２５）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号２６）である。例えば、ＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭの他の例は、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端の２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号２７）が挙げられ得る。例えば、ＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号２５～２７の４～２２ヌクレオチド長を有し得る。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭは、配列番号２５～２７の１４～２０ヌクレオチド長を有し得る。
標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列およびガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の逆相補体）に対応する領域内または領域の近くの標的ＤＮＡの一方または両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内にあり得る（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置に）。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）または二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあり得る。切断部位は、両方の鎖上の同じ位置にあり得るか（平滑末端を生成する；例えば、Ｃａｓ９）、または各鎖上の異なる部位にあり得る（千鳥状の末端を生成する（すなわち、オーバーハング）；例えば、Ｃｐｆ１）。千鳥状の末端は、例えば、各々が異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成され得る。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を作成することができ、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が作成されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を作成することができる。いくつかの場合では、第１の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位は、第２の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対分離されている。
ＩＶ．タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性を明らかにするためのドロップアウトスクリーニングの方法
本明細書に開示されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞株は、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性を明らかにするためのドロップアウトスクリーニングの方法で使用することができる。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるように、Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞の凝集陽性および凝集陰性集団を提供することと、複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各集団に導入することと、各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量（読み取りカウント）を決定することとを含み得る。
一例として、方法は、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することを含み得、各細胞集団は、本明細書の他の場所に開示されるように、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む。凝集陽性細胞集団において、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在するが、凝集陰性細胞集団において、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは。凝集状態で安定して存在しない。次いで、方法は、複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することを含み得る。複数の固有のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質は、複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらす。最後に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量は、各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点で決定され得る。凝集陰性細胞集団ではないが凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であるかまたはタウ凝集に関連する候補遺伝的脆弱性である（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）ことを示すことができ、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される。あるいは、凝集陰性細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより劇的な枯渇パターンは、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であるかまたはタウ凝集に関連する候補遺伝的脆弱性である（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）ことを示すことができ、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の破壊は、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される。より劇的な枯渇パターンは、ガイドＲＮＡが時間経過にわたってより速い速度で枯渇することを意味する（例えば、適合した指数関数的減衰率の微分テストを使用した識別可能な枯渇パターン）。
同様に、本明細書に開示されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞株は、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性を明らかにするためのドロップアウトスクリーニングの方法で使用することができる。そのような方法は、本明細書の他の場所に開示されるように、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の凝集陽性および凝集陰性集団を提供することと、複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各集団に導入することと、各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量（読み取りカウント）を決定することとを含み得る。
一例として、方法は、凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することを含み得、各細胞集団は、本明細書の他の場所に開示されるように、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインとを含む。凝集陽性細胞集団において、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは、凝集状態で安定して存在するが、凝集陰性細胞集団において、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインおよび第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインは。凝集状態で安定して存在しない。次いで、方法は、複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することを含み得る。複数の固有のガイドＲＮＡは、キメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、複合体は、複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらす。最後に、複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量は、各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点で決定され得る。凝集陰性細胞集団ではないが凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇は、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子が、転写活性化されたときに、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であるかまたはタウ凝集に関連する候補遺伝的脆弱性である（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）ことを示すことができ、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される。あるいは、凝集陰性細胞集団に対して、凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより劇的な枯渇パターンは、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子が、転写活性化されたときに、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であるかまたはタウ凝集に関連する候補遺伝的脆弱性である（例えば、二次スクリーニングを介するさらなる試験のための）ことを示すことができ、ガイドＲＮＡによって標的とされた遺伝子の転写活性化は、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される。より劇的な枯渇パターンは、ガイドＲＮＡが時間経過にわたってより速い速度で枯渇することを意味する（例えば、適合した指数関数的減衰率の微分テストを使用した識別可能な枯渇パターン）。
この方法で使用されるＣａｓ／タウバイオセンサー細胞は、本明細書の他の場所に開示されているＣａｓ／タウバイオセンサー細胞のうちのいずれかであり得る。同様に、この方法で使用されるＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞は、本明細書の他の場所に開示されているＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞のうちのいずれかであり得る。第１のタウリピートドメインおよび第２のタウリピートドメインは、異なり得るか、または類似もしくは同じであり得る。タウリピートドメインは、本明細書の他の場所に開示されているタウリピートドメインのうちのいずれかであり得る。例えば、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、野生型タウリピートドメインであり得るか、またはタウＰ３０１Ｓ変異などの凝集促進変異を含み得る。第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、タウ４リピートドメインを含み得る。１つの特定の例として、第１のタウリピートドメインおよび／または第２のタウリピートドメインは、配列番号１１または配列番号１１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。１つの特定の例では、タウリピートドメインをコードする核酸は、配列番号１２または配列番号１２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号１１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
任意の手段によって、第１のタウリピートドメインは、第１のレポーターに連結され得、第２のタウリピートドメインは、第２のレポーターに連結され得る。例えば、レポーターは、タウリピートドメインに融合され得る（例えば、融合タンパク質の一部として）。レポータータンパク質は、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインが、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと凝集したときに検出可能なシグナルを生成するレポータータンパク質の任意の対であり得る。一例として、第１および第２のレポーターは、スプリットルシフェラーゼタンパク質であり得る。別の例として、第１および第２のレポータータンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対であり得る。ＦＲＥＴは、励起状態のドナーフルオロフォアがその励起エネルギーを隣接するアクセプターフルオロフォアに非放射的に伝達し、それによってアクセプターにその特徴的な蛍光を発させる物理的現象である。ＦＲＥＴ対（ドナーおよびアクセプターフルオロフォア）の例は周知である。例えば、Ｂａｊａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１６（９）：１４８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＦＲＥＴ対の１つの特定の例として、第１のレポーターは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり得、第２のレポーターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）であり得る。特定の例として、ＣＦＰは、配列番号１３または配列番号１３と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。別の特定の例として、ＹＦＰは、配列番号１５または配列番号１５と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞の場合、Ｃａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に開示されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２１または配列番号２１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべては、細胞集団において安定して発現され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべてをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ得る。１つの特定の例では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号２２または配列番号２２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号２１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞の場合、Ｃａｓタンパク質は、本明細書の他の場所に開示されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。一例として、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質であり得る。１つの特定の例として、キメラＣａｓタンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、およびＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含み得る。１つの特定の例として、アダプタータンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質であり得、キメラアダプタータンパク質中の１つ以上の転写活性化ドメインは、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。例えば、キメラアダプタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、ｐ６５転写活性化ドメイン、およびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み得る。１つの特定の例では、キメラＣａｓタンパク質をコードする核酸は、配列番号３８または配列番号３８と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３６を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。１つの特定の例では、キメラアダプタータンパク質をコードする核酸は、配列番号３９または配列番号３９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、任意に、核酸は、配列番号３７を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべては、細胞集団において安定して発現され得る。例えば、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインのうちの１つ以上またはすべてをコードする核酸は、細胞集団においてゲノム的に組み込まれ得る。
本明細書の他の場所に開示されているように、細胞は、任意の細胞型であり得る。例えば、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または神経細胞）であり得る。
複数の固有のガイドＲＮＡは、任意の既知の手段によって細胞集団に導入され得る。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは、レトロウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルス形質導入などのウイルス形質導入によって細胞集団に導入される。特定の例では、ガイドＲＮＡは、レンチウイルス形質導入によって導入され得る。複数の固有のガイドＲＮＡの各々は、別個のウイルスベクター内にあり得る。細胞集団は、任意の感染多重度で感染し得る。例えば、感染多重度は、約０．１～約１．０、約０．１～約０．９、約０．１～約０．８、約０．１～約０．７、約０．１～約０．６、約０．１～約０．５、約０．１～約０．４、または約０．１～約０．３であり得る。あるいは、感染多重度は、約１．０未満、約０．９未満、約０．８未満、約０．７未満、約０．６未満、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、または約０．２未満であり得る。特定の例では、感染多重度は、約０．３未満であり得る。
ガイドＲＮＡは、選択マーカーまたはレポーター遺伝子と一緒に細胞集団に導入されて、ガイドＲＮＡを有する細胞を選択することができ、方法は、選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む細胞を選択することをさらに含み得る。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の場所に提供されている。一例として、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼなどの薬物に対する耐性を付与するものであり得る。別の例示的な選択マーカーは、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓブレオマイシン遺伝子）によってコードされるブレオマイシン耐性タンパク質であり、これは、ゼオシン（フレオマイシンＤ１）耐性を付与する。例えば、細胞は、ガイドＲＮＡ構築物で形質導入された細胞のみがスクリーニングを実施するために使用するために保存されるように、薬物（例えば、ピューロマイシン）で選択され得る。例えば、薬物は、ピューロマイシンまたはゼオシン（フレオマイシンＤ１）であり得る。
いくつかの方法では、複数の固有のガイドＲＮＡは、細胞の大部分が固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される。例えば、ガイドＲＮＡがウイルス形質導入によって導入されている場合、細胞は、低い感染多重度で感染し、ほとんどの細胞が高い確率で１つのウイルス構築物のみを受け取ることを確実にすることができる。１つの特定の例として、感染多重度は、約０．３未満であり得る。
複数の固有のガイドＲＮＡが導入される細胞集団は、任意の好適な数の細胞であり得る。例えば、細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約５０を超える、約１００を超える、約２００を超える、約３００を超える、約４００を超える、約５００を超える、約６００を超える、約７００を超える、約８００を超える、約９００を超える、または約１０００を超える細胞を含み得る。特定の例では、細胞集団は、固有のガイドＲＮＡあたり約３００個を超える細胞または約５００個を超える細胞を含む。
複数の固有のガイドＲＮＡは、任意の数の遺伝子を標的とすることができる。例えば、複数の固有のガイドＲＮＡは、約５０個以上の遺伝子、約１００個以上の遺伝子、約２００個以上の遺伝子、約３００個以上の遺伝子、約４００個以上の遺伝子、約５００個以上の遺伝子、約１０００個以上の遺伝子、約２０００個以上の遺伝子、約３０００個以上の遺伝子、約４０００個以上の遺伝子、約５０００個以上の遺伝子、約１００００個以上の遺伝子、または約２００００個以上の遺伝子を標的とすることができる。いくつかの方法では、ガイドＲＮＡは、特定のシグナル伝達経路の遺伝子を標的とするように選択され得る。いくつかの方法では、固有のガイドＲＮＡのライブラリは、ゲノムワイドライブラリである。
複数の固有のガイドＲＮＡは、各個々の標的化遺伝子内の任意の数の配列を標的とすることができる。いくつかの方法では、複数の標的配列は、標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約２～約１０、約２～約９、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、または約２～３個の固有の標的配列が標的化され得る。例えば、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、または少なくとも約６個の固有の標的配列が標的化され得る。特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約６個の標的配列が標的化され得る。別の特定の例として、標的化された複数の遺伝子の各々において、平均して約３～約６または約４～約６個の標的配列が標的化される。
ガイドＲＮＡは、標的遺伝子内の任意の所望の位置を標的とすることができる。Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲｎ方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、５’構成的エクソンを標的とする。いくつかの方法では、各ガイドＲＮＡは、可能な場合、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソン（遺伝子の５’末端から）を標的とする。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、可能な場合、各ガイドＲＮＡは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を使用するいくつかのＣＲＩＳＰＲａ方法では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み得る。一例では、各ガイドＲＮＡは、キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントは、１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にある。例えば、アダプター結合エレメントは、配列番号３３に示される配列を含み得る。特定の例では、１つ以上のガイドＲＮＡの各々は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一ガイドＲＮＡであり、第１のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基１３～１６に対応するテトラループであり、第２のループは、配列番号１７、１９、３０、または３１の残基５３～５６に対応するステムループ２である。
ガイドＲＮＡの存在量は、任意の好適な手段により決定され得る。特定の例では、存在量は、次世代シーケンシングによって決定される。次世代シーケンシングとは、サンガー法に基づかないハイスループットＤＮＡシーケンシング技術を指す。例えば、ガイドＲＮＡの存在量を決定することは、ガイドＲＮＡの読み取りカウントを測定することを含み得る。
ステップ（ｃ）の時間経過は、任意の好適な時間の長さであり得る。例えば、時間経過は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、約１週間超、または約２週間超であり得る。例えば、時間経過は、約６日～約２８日、約９日～約２５日、約１２日～約２２日、約１５日～約１９日、または約１７日であり得る。同様に、ステップ（ｃ）の時間経過は、任意の好適な数の細胞継代または細胞倍加を含み得る。時間経過は、約５～約２０、約６～約１９、約７～約１８、約８～約１７、約９～約１６、約１０～約１５、約１１～約１４、約１２～約１３、または約１２の細胞倍加を含み得る。あるいは、時間経過は、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約３～約５、約３～約６、約３～約７、約３～約８、または約４の細胞継代を含み得る。例えば、約１０～約１５の細胞倍加があり得る。特定の例では、３日目および１７日目の最初の収集の間に約１２の細胞倍加（すなわち、約４の細胞継代）があり得る。いくつかの方法では、ゲノムワイドｇＲＮＡライブラリの良好な掲示を維持するために、細胞は各継代で希釈されすぎない。例えば、細胞は、約１／１０、約１／９、約１／８、約１／７、約１／６、約１／５、約１／４、約１／３、または約１／２で継代され得る。特定の例では、細胞は、約１／５で継代される（例えば、≧２の細胞倍加になるように）。
本明細書に記載されるタウバイオセンサー細胞は、凝集のために準備されている。すなわち、それらは凝集の転換点にある。タウ凝集体が、タウバイオセンサー細胞の転写プロファイルに強力で一貫した変化を引き起こすことを見出した。これらの凝集陽性細胞は、凝集陰性細胞とは異なり、ある特定の遺伝的傷害に対して選択的に脆弱であり得ると仮定した。また、凝集体含有細胞で「特異的な」細胞死を引き起こすＣＲＩＳＰＲｎスクリーニングのあらゆる「変異」もまた、非凝集体含有細胞に対してより少ない有害な影響を有し得ると仮定した。同様に、凝集体含有細胞で「特異的な」細胞死を引き起こすＣＲＩＳＰＲａスクリーニングのあらゆる遺伝子活性化もまた、非凝集体含有細胞に対してより少ない有害な影響を有し得る。複数の時点での評価により、最初の継代と比較して最後の継代だけでなく、経時的なＲＮＡ枯渇プロファイル（ｇＲＮＡ枯渇の枯渇率または急峻さ）を同定することにより、このタイプの標的を同定することができ、この場合、このタイプの標的が逃される。例えば、このタイプの枯渇プロファイルは、標的遺伝子１で観察された。リード標的である標的遺伝子１について、このタイプの枯渇プロファイルを同定した。
ステップ（ｃ）の複数の時点は、任意の好適な数の時点であり得る。例えば、ステップ（ｃ）の複数の時点は、少なくとも約２つの時点、少なくとも約３つの時点、少なくとも約４つの時点、少なくとも約５つの時点、少なくとも約６つの時点、約２つ超の時点、約３つ超の時点、約４つ超の時点、約５つ超の時点、または約６つ超の時点であり得る。例えば、約３～約９つの時点、約４～約８つの時点、約５～約７つの時点、または約６つの時点があり得る。別の例として、約２～約６つの時点、約３～約５つの時点、または約４つの時点があり得る。
各時点は、細胞の継代に対応することができる。連続する各時点の間の期間は、任意の好適な期間であり得る。例えば、各時点の間が少なくとも約１２時間、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、約１２時間超、約１日超、約２日超、または約３日超であり得る。例えば、各連続する時点の間が約１日および約６日、約２日～約５日、または約３日～約４日であり得る。特定の例として、各連続する時点の間（すなわち、細胞の連続する継代の間）が少なくとも約２日または約３日～約４日であり得る。
最初の時点は、ガイドＲＮＡが細胞集団に導入された後の任意の好適な時点であり得る。例えば、Ｃａｓ／タウバイオセンサー細胞を使用するＣＲＩＳＰＲｎスクリーニング方法では、最初の時点は、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質が複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらすのに十分な時間の後であり得る。同様に、ＳＡＭ／タウバイオセンサー細胞を使用するＣＲＩＳＰＲａスクリーニング方法では、最初の時点は、ガイドＲＮＡがキメラＣａｓタンパク質およびキメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、複合体が複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらすのに十分な時間の後であり得る。例えば、最初の時点は、細胞へのガイドＲＮＡの導入後、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、約１日超、約２日超、または約３日超であり得る。あるいは、最初の時点は、細胞へのガイドＲＮＡの導入後、約０日～約６日、約１日～約５日、約２日～約４日、または約３日であり得る。
１つの特定の例では、ガイドＲＮＡの存在量は、０日目にガイドＲＮＡを導入した後、３、６、または７、１０または１１、１３または１４、および１７日目に評価される。例えば、ガイドＲＮＡの存在量は、０日目にガイドＲＮＡを導入した後、３、７、１０、１４、および１７日目に評価され得る。
ガイドＲＮＡが時間経過にわたって枯渇しているとみなされるかどうかには、様々な評価が含まれ得る。一例として、各時点でのガイドＲＮＡの存在量が以前の時点でのガイドＲＮＡの存在量以下である場合、ガイドＲＮＡは枯渇しているとみなされ得る。別の例として、第２の時点の後の各時点でのガイドＲＮＡの存在量が２つの時点前の時点（すなわち、時点１と比較した時点３、時点２と比較した時点４、時点３と比較した時点５などの以前の時点の前の時点）の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡはステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされ得る。１つの特定の例では、ガイドＲＮＡの存在量は、０日目にガイドＲＮＡを導入した後、３、６、または７、１０または１１、１３または１４、および１７日目に評価され、１０日目または１１日目のその存在量が３日目よりも少なく、１３日目または１４日目のその存在量が６日目または７日目よりも少なく、１７日目の存在量が１０日目または１１日目よりも少ない場合に、ガイドＲＮＡは枯渇しているとみなされる。
本明細書に開示される方法における評価はまた、特定の遺伝子を標的とするライブラリ内のすべてのガイドＲＮＡ間の傾向を考慮し得る。例えば、遺伝子を標的とするライブラリ内のガイドＲＮＡの少なくとも約３０％、少なくとも約３３％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約３０％超、約３３％超、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、または約７５％超（例えば、少なくとも約３０％または約３０％超）が、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子はタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされ得る。いくつかの特定の非限定的な例として、遺伝子は、以下の状況：（１）ライブラリ内に遺伝子を標的とする１つのガイドＲＮＡが存在し、１つのガイドＲＮＡが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（２）ライブラリ内に遺伝子を標的とする２つのガイドＲＮＡが存在し、２つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（３）ライブラリ内に遺伝子を標的とする３つのガイドＲＮＡが存在し、３つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（４）ライブラリ内に遺伝子を標的とする４つのガイドＲＮＡが存在し、４つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、（５）ライブラリ内に遺伝子を標的とする５つのガイドＲＮＡが存在し、５つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、および（６）ライブラリ内に遺伝子を標的とする６つのガイドＲＮＡが存在し、６つのガイドＲＮＡの少なくとも３つが、凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、において、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされ得る（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈すると予期される）。
本明細書に開示される方法における評価はまた、複数の実験にわたる特定の遺伝子を標的とするライブラリ内のガイドＲＮＡの傾向を考慮し得る。例えば、方法は、少なくとも約２回、少なくとも約３回、少なくとも約４回、少なくとも約５回、少なくとも約６回、約１回超、約２回超、約３回超、約４回超、約５回超、または約６回超繰り返され得る。例えば、遺伝子は、それがすべての実験の少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約３０％超、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、または約７５％超で選択された場合（すなわち、それはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる場合）、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされ得る。例えば、遺伝子は、それがすべての実験の約５０％超または約６０％超で選択された場合（すなわち、それがタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる場合）、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされ得る。特定の例として、方法は３つの実験で繰り返すことができ、遺伝子は、それが３つの実験のうちの少なくとも２つで選択された場合（すなわち、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる場合）、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされ得る（またはタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈する候補として選択され得る（例えば、二次スクリーニングでのさらなる試験のため））。
上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解の目的に対し図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および改変を実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
Figure 2022526297000003
Figure 2022526297000004
実施例１．タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングプラットフォームの開発
タンパク質の異常な凝集または線維化は、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）などのいくつかの神経変性疾患を含む、多くの疾患の決定的な特徴である。これらの疾患の多くでは、ある特定のタンパク質の不溶性凝集体への線維化は、疾患の特徴であるだけでなく、神経毒性の原因因子としても関係している。さらに、これらの疾患は、ステレオタイプのパターンに従って中枢神経系を介する凝集の病状の伝播によって特徴付けられ、このプロセスは疾患の進行と相関している。したがって、異常なタンパク質凝集のプロセス、または凝集体の細胞間増殖を変更する遺伝子および遺伝子経路の同定は、神経変性疾患の病因をよりよく理解する上で、ならびに治療的介入のための戦略を考案する上で大いに価値がある。
疾患関連タンパク質凝集体との合成致死性を呈する遺伝子および経路を同定するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）ｓｇＲＮＡライブラリを使用してゲノムワイドスクリーニングを行うためのプラットフォームが開発された。プラットフォームは、破壊されたときに、特に異常なタンパク質凝集の状況で細胞死を引き起こす遺伝子を同定する。そのような遺伝子の同定は、神経変性疾患の状況において凝集体関連神経毒性のメカニズム、およびニューロンの死を促進する遺伝的経路を解明し得る。
スクリーニングは、ＣＦＰまたはＹＦＰのいずれかに融合したＰ３０１Ｓ病原性変異を有するタウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む、タウ４リピートドメインであるＴａｕ＿４ＲＤを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなるタウバイオセンサーヒト細胞株を用いた。つまり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、蛍光タンパク質ＣＦＰまたは蛍光タンパク質ＹＦＰに融合した疾患関連タンパク質バリアントを安定して発現する２つの導入遺伝子：タウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）を含み、タウリピートドメイン（４ＲＤ）は、Ｐ３０１Ｓ病原性変異を含む。図１を参照されたい。これらのバイオセンサー株では、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰタンパク質の凝集により、ドナーＣＦＰからアクセプターＹＦＰへの蛍光エネルギーの移動の結果であるＦＲＥＴシグナルが生成される。図２を参照されたい。タウ凝集体を含むＦＲＥＴ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって選別および単離され得る。ベースラインでは、刺激されていない細胞は、最小限のＦＲＥＴシグナルで安定した可溶性状態でレポーターを発現する。刺激（例えば、種粒子のリポソームトランスフェクション）により、レポータータンパク質は凝集体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。凝集体含有細胞はＦＡＣＳによって単離され得る。安定して増殖する凝集体含有細胞株Ａｇｇ［＋］は、Ａｇｇ［－］細胞株のクローン連続希釈によって単離され得る。
このタウバイオセンサー細胞株には、遺伝子スクリーニングに役立つようにいくつかの修飾がなされた。最初に、これらのタウバイオセンサー細胞を、レンチウイルスベクターを介してＣａｓ９発現導入遺伝子を導入することによって修飾した。Ｃａｓ９を発現するクローントランスジェニック細胞株をブラストサイジンで選択し、クローン連続希釈によって単離して、単一細胞由来のクローンを得た。クローンを、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＣａｓ９発現のレベル（図３Ａ）およびデジタルＰＣＲによるＤＮＡ切断活性（図３Ｂ）について評価した。相対Ｃａｓ９発現レベルも表３に示される。
Figure 2022526297000005
具体的には、Ｃａｓ９変異効率を、２つの選択された標的遺伝子に対するｇＲＮＡをコードするレンチウイルスの形質導入の３日後および７日後にデジタルＰＣＲによって評価した。切断効率は、低発現クローンのＣａｓ９レベルによって制限された。最大活性を達成するには、適切なレベルのＣａｓ９発現を伴うクローンが必要であった。Ｃａｓ９発現がより低いいくつかの派生クローンは、標的配列を効率的に切断することはできなかったが、発現がより高いクローン（スクリーニングに使用されたものを含む）は、培養物において３日後に約８０％の効率で、ＰＥＲＫおよびＳＮＣＡ遺伝子における標的配列に変異を生成することができた。効率的な切断は、ｇＲＮＡ形質導入の３日後にすでに観察され、７日後にはわずかな改善しかなかった。クローン７Ｂ１０－Ｃ３を、後続のライブラリスクリーニングで使用する高性能クローンとして選択した。
次に、タウタンパク質が非凝集（デフォルト状態）（Ａｇｇ［－］）または凝集状態（Ａｇｇ［＋］）のいずれかで安定して存在するこれらのＣａｓ９発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）バイオセンサー細胞株のサブクローンを得た。タウタンパク質が凝集状態で安定して持続的に存在する細胞株を得るために、Ｃａｓ９発現細胞を、これらの細胞によってトランスジェニックに発現されたタウタンパク質の凝集を「播種」するためにリポフェクタミン試薬と混合した組換え線維化タウで処理した。図５を参照されたい。次いで、「播種した」細胞を連続希釈して、単一細胞由来のクローを得て、次いでこれらのクローンを拡大して、タウ凝集体がすべての細胞で安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代するクローン細胞株を同定した。
次に、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］サブクローンを分析して、ある特定の遺伝子がタウ凝集によって摂動されたかどうかを判定した。図６を参照されたい。教師なしクラスタリングは、Ａｇｇ［＋］サブクローンおよびＡｇｇ［－］サブクローンが凝集状態によって異なることを示した（クラスタリング手順：キロベース百万あたりの読み取りのｌｏｇ変換（ＲＰＫＭ）；距離メトリック：１－ピアソン相関係数の絶対値；階層的クラスタリング）。図７を参照されたい。教師なしクラスタリングとは、試料に関するいかなる事前の知識がなくても（例えば、試料がどの細胞株からのものであるか（Ａｇｇ［＋］またはＡｇｇ［－］））、試料間のクラスター形成がデータ自体によって完全に駆動されるように試料をクラスタリングすることを指す。手順は次のとおりであった：（１）各試料のすべての遺伝子の発現レベル（単位はＲＰＫＭ）に１を追加する、（２）ＲＰＫＭ＋１値をｌｏｇ２変換する、（３）すべての試料間のペアワイズピアソン相関係数を計算する、（４）ピアソン相関係数の１－絶対値として試料のこれまでのペア間の類似性を計算する、および（５）（４）の値に標準の階層的クラスタリングアルゴリズムを適用する。データは、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞株からの試料が、それらの遺伝子発現プロファイルのみに基づいて明確に分離されたクラスターを形成することを示し、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞株が遺伝子発現レベルで異なることを示唆している。
タウバイオセンサーＡｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］サブクローンのＲＮＡシーケンシングにより、＞１５００個の遺伝子がタウ凝集によって摂動されることが明らかになった。図８を参照されたい。有意に摂動された遺伝子を、いずれかの方向での倍率変化≧１．５およびｐ値≦０．０１を有するものとして定義した。５つのＡｇｇ［＋］サブクローンおよび５つのＡｇｇ［－］サブクローンのＲＮＡｓｅｑは、タウ凝集体の存在が、Ａｇｇ［－］サブクローンと比較してＡｇｇ［＋］サブクローンの転写プロファイルに強く一貫した変化を引き起こすことを示した。したがって、Ａｇｇ［＋］サブクローンは、Ａｇｇ［－］サブクローンとは異なり、ある特定の遺伝的傷害に対して選択的に脆弱であり得る。実施例２に説明されるように、ＣＲＩＳＰＲライブラリを使用してこれらの脆弱性を調査し、ドロップアウトスクリー二ング（ｄｒｏｐｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎ）を行い、タウ凝集体と組み合わせた場合に合成致死性を引き起こすｓｇＲＮＡを同定した。
実施例２．タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニング
実施例１で同定された脆弱性を調査するために、プールされたゲノムワイドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲｎ）スクリーニングを行い、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性を明らかにした。具体的には、凝集体あり（Ａｇｇ［＋］）または凝集体なし（Ａｇｇ［－］）のいずれかのＣａｓ９発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞に、ｓｇＲＮＡあたり５００Ｘ細胞の掲示で各標的遺伝子にノックアウト変異を導入するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、２つのヒトゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリで形質導入した。図４および９を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリは、機能的ノックアウトのために５’構成的エクソンを標的とし、遺伝子あたり平均３～４個のｓｇＲＮＡをカバーする。ｓｇＲＮＡは、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが２つ以下のｓｇＲＮＡを回避することにより、オフターゲット効果を回避するように設計された。ライブラリは、１０００個の非標的化対照ｓｇＲＮＡを有する１９，０５０個のヒト遺伝子および１８６４個のｍｉＲＮＡをカバーする。ライブラリを、感染多重度（ＭＯＩ）＜０．３で、ｓｇＲＮＡあたり＞５００細胞のカバレッジで形質導入した。タウバイオセンサー細胞を、ピューロマイシンの選択の下で増殖させ、細胞ごとに固有のｓｇＲＮＡの組み込みおよび発現を有する細胞を選択した。ピューロマイシンの選択は、１μｇ／ｍＬでの形質導入の２４時間後に開始した。
（Ａｇｇ［＋］）および（Ａｇｇ［－］）細胞の試料を、形質導入後３、６～７、１０～１１、１３～１４、および１７日目の５つの時点で収集した。組み込まれたｓｇＲＮＡ構築物のＤＮＡ単離およびＰＣＲ増幅により、各時点での各細胞株におけるｓｇＲＮＡレパートリーの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による特徴付けが可能になった。スクリーニングは、３回の反復実験で構成された。ＮＧＳデータの分析により、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］細胞株の両方で標的化ｓｇＲＮＡが経時的に枯渇する遺伝子からなる必須遺伝子の同定が可能になった。図１０Ａを参照されたい。さらに重要なことに、このスクリーニング方法により、Ａｇｇ［－］細胞株と比較してＡｇｇ［＋］で優先的に標的化ｓｇＲＮＡが経時的に枯渇する遺伝子からなる合成致死性遺伝子の同定が可能になった。図１０Ｂを参照されたい。
枯渇プロファイルを、新たに定義された時間経過分析を使用して評価し、この分析では、初期の時点（３日目）から最後の時点（１７日目）までＮＧＳ読み取りが減少する一貫したパターンを有するｓｇＲＮＡが枯渇するとみなされた。図１１および表４を参照されたい。
Figure 2022526297000006
これは、エンドポイント細胞収集のＮＧＳ読み取りを最初の継代と単純に比較するより従来のアプローチと比較して、ｓｇＲＮＡの枯渇を評価するための新しい分析アプローチである。比較では、枯渇についての他の公開されたゲノムワイドＣＲＩＳＰＲｎスクリーニングは、最後の収集と早期継代との間の読み取りカウントの比率としてＣＲＩＳＰＲスコアを比較した。対照的に、このアプローチは、経時的にｓｇＲＮＡ枯渇のパターンを呈する遺伝子を同定するために全時間経過を調べることであった。時間経過分析により、３回の繰り返し実験すべてにおいて、Ａｇｇ［－］サブセットよりもＡｇｇ［＋］サブセットで枯渇したより多くの遺伝子ｓｇＲＮＡを同定した。
最初の分析ステップには、品質管理（非標的化ｓｇＲＮＡ）、正規化（試料あたりの合計読み取り数による）、および試料あたりのｓｇＲＮＡあたりの「存在」／「非存在」のフラグ付けと３０読み取りの検出カットオフが含まれていた。最初に、非標的化ｓｇＲＮＡを試験した。１０００個の非標的化対照ｓｇＲＮＡの強力または系統的な摂動または枯渇がないことが確認された。次に、実験を行い、プラスミドｓｇＲＮＡライブラリおよび３日目の試料がｓｇＲＮＡの読み取りカウントに関して非常に類似していることを示した（３日目に有意なｓｇＲＮＡの枯渇は発生しなかった）。これは、３日目を時間経過分析の参照ポイントとして使用するための検証であった。
次いで、枯渇した遺伝子を時間経過分析によって同定した。各繰り返しにおいて、３日目に対して、一時的パターンが増加しない（１０日目≦３日目の読み取りカウント、１４日目≦６日目の読み取りカウント、および１７日目≦１０日目の読み取りカウント）枯渇したｓｇＲＮＡを選択した。３日目にすでに枯渇したｓｇＲＮＡ（すなわち、３日目に検出限界の３０を下回り、残りの時点を通して検出限界を下回ったまま）が維持された。検出限界に近い変動は無視された（すなわち、ｓｇＲＮＡの読み取りカウントが、検出限界を下回るｓｇＲＮＡの読み取りカウントの検出限界＋２＊標準偏差を下回るｓｇＲＮＡの平均読み取りカウント以下の場合、ｓｇＲＮＡは検出されなかったとみなされた）。遺伝子を、それらが十分な数の枯渇したｓｇＲＮＡを有していた場合に選択した（合計１つのｓｇＲＮＡのうち１つ、合計２つのｓｇＲＮＡのうち１つ、合計３つのｓｇＲＮＡのうち１つ、合計４つのｓｇＲＮＡのうち２つ、合計５つのｓｇＲＮＡのうち２つ、または合計６つのｓｇＲＮＡのうち３つ）。３回の反復時間経過実験のうち少なくとも２回で選択された場合、遺伝子を保持した。次に、それらの遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡがＡｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］の両方で枯渇した場合、遺伝子を「必須」として同定した。遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡがＡｇｇ［＋］で枯渇したが、Ａｇｇ［－］では枯渇しなかった場合（Ａｇｇ［＋］と比較してＡｇｇ［－］での枯渇なし、複数の繰り返しおよび手動検査に基づく改善）、遺伝子を「合成致死性」として同定した。改善は、Ａｇｇ［＋］細胞株で３回繰り返される時間経過実験すべてで提示された遺伝子を取得し、次いでＡｇｇ［－］細胞株で少なくとも１つの実験で提示された任意の遺伝子を除外することを意味する。手動検査では、Ａｇｇ［＋］実験の１つで枯渇したことが示されたガイドＲＮＡを確認し、すべてのＡｇｇ［＋］実験で枯渇したが、Ａｇｇ［－］実験では枯渇しなかったかまたは１つのみのＡｇｇ［－］実験で枯渇したガイドＲＮＡを探し、標的を逃していないことを確認することを含んだ。
１０００個の非標的化対照ｓｇＲＮＡには、強力または系統的な摂動はなかった（データには示さず）。具体的には、６日目、７日目、１０日目、１１日目、１３日目、１４日目、および１７日目対３日目の各々について、すべての実験の繰り返しをＡｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］の両方から組み合わせた。読み取りカウントの変化のＰ値（多重検定用に調整）を計算した。どの時点でも、ｐ値が＜０．０５のｇＲＮＡはなかった。
時間経過分析により、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］サブクローンの両方で枯渇の一時的パターンを有するｓｇＲＮＡを有する「必須」遺伝子として９７７個の遺伝子が明らかになった（データには示さず）。「必須」として同定されたこれらの遺伝子は、公開データセットで必須として同定された遺伝子と著しく重複する（例えば、Ｔｚｅｌｅｐｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １７：１１９３－１２０５およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０（６２６４）：１０９６－１１０１を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。図１３および表５を参照されたい。
Figure 2022526297000007
Ａｇｇ［＋］では複数の複製スクリーニングで枯渇のパターンを呈するがＡｇｇ［－］では呈しない複数のｓｇＲＮＡにより標的とされた遺伝子を、「合成致死性」遺伝子として二次スクリーニングでのさらなる検証のために選択した。７１個の遺伝子を、３日目と比較してすべてのＡｇｇ［＋］実験複製で枯渇していると同定したが、いかなるＡｇｇ［－］実験複製でも枯渇していなかった。図１４を参照されたい。３つの標的遺伝子（標的遺伝子１、標的遺伝子５、および標的遺伝子６）のデータを図１５Ｂに示す。
これらの７１個の遺伝子を、３つの複製におけるｓｇＲＮＡの枯渇の分析、複数の時点にわたるｓｇＲＮＡの枯渇、およびデータの目視検査によって同定した。次いで、カスタムＧｅｎＳｃｒｉｐｔミニライブラリを生成した。ライブラリ１には、４６２個の固有の標的化ｓｇＲＮＡが含まれていた（Ａｇｇ［＋］細胞で選択的に枯渇したと同定されたｓｇＲＮＡを有する７１個の推定合成致死性遺伝子、ならびにＡｇｇ［＋］細胞およびＡｇｇ［－］細胞の両方で枯渇したと同定されたｓｇＲＮＡを有する１０個の推定必須遺伝子を標的化し、各々が約６個の固有のｓｇＲＮＡによって標的化された）。ライブラリ２には、時間経過実験で改変しなかった５００個の固有の非標的化対照ｓｇＲＮＡが含まれていた。２つのライブラリの読み取りカウント分布を、それぞれ図１６および図１７に示す。これは、２つのライブラリの掲示が拡大後も維持されていることを示す。ピアソンのｒは、元のライブラリと拡大後との間の統計的相関関係を示す。
次いで、ライブラリを候補標的の二次スクリーニングに使用した。図１８を参照されたい。非標的化対照ｓｇＲＮＡに対する標的化ｓｇＲＮＡの枯渇を、（Ａｇｇ［＋］）および（Ａｇｇ［－］）クローンの１７日間の時間経過アプローチを通じて、ｓｇＲＮＡあたり１０，０００Ｘ細胞の高い掲示で評価した。対照ｓｇＲＮＡに対する標的遺伝子へのｓｇＲＮＡの枯渇を、Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］クローンの両方で時間経過を通して評価した。最初に、読み取りカウントを、非標的化ｓｇＲＮＡの合計によって正規化した。正規化は、各試料にスカラー数を掛けることを含み（異なる試料は異なるスカラー数を有することができる）、正規化後、試料ごとのすべての非標的化ｓｇＲＮＡの合計読み取りカウントが同じになるようにした。このような正規化の後、非標的化ｓｇＲＮＡは期待されるように変化を示さず、多くの標的化ｓｇＲＮＡは時間的な枯渇パターンを示した。非標的化ｓｇＲＮＡの合計による正規化を使用すると、少数の非標的化ｓｇＲＮＡのみが摂動を示した（摂動基準：ｐ値≦０．０１、倍率変化≧１．２）。パターンはランダムであり、大きさは小さかった。非標的化ｓｇＲＮＡに摂動がないことを視覚的に（定性的に）示すことに加えて、これは、少数の非標的化ｓｇＲＮＡのみが摂動された７日目対３日目、１０日目対３日目、１４日目対３日目、および１７日目対３日目の統計分析（ｐ値および倍率変化）によって示された。さらに、ヒートマップがこれらの摂動されたｓｇＲＮＡのいずれか一時的パターンも示さなかったため、（３日目に対して）どの時点でどのｓｇＲＮＡが摂動されたかはかなりランダムであった（データには示さず）。次に、Ａｇｇ［＋］試料およびＡｇｇ［－］試料の両方でｓｇＲＮＡの枯渇を評価することにより、１０個の推定「必須」遺伝子を検証した。１０個の遺伝子のｓｇＲＮＡの複製からの時間経過データを図１９Ａ～１９Ｃに示す。
次に、枯渇のパターンを候補合成致死性遺伝子について評価した。各ｓｇＲＮＡについて、時間因子の有意性（ｐ値）を計算した（２つの実験を時点ごとの繰り返しとして使用した）。標準一般線形回帰モデル（ＧＬＭ）を使用した：ｙ～ベータ＊ｔ（式中、ｙ＝読み取りカウントおよびｔ＝時間）を、データに適用した（５つの時点（３日目から１７日目）で２回の繰り返し実験）。ＧＬＭを解くと、ベータが０からどれだけ離れているか（すなわち、時間因子の有意性）を定義するベータのｐ値が得られた。さらに、各ｓｇＲＮＡを、すべての実験で枯渇パターンがあった場合にマークした（１０日目＜３日目、および１４日目＜７日目、および１７日目＜１０日目）。ｓｇＲＮＡを、有意な時間経過ｐ値（≦１ｅ－３）があり、すべての実験で枯渇パターンがあった場合に選択した。次いで、ｓｇＲＮＡを、Ａｇｇ［＋］とＡｇｇ［－］との間に識別可能な枯渇パターンがあった場合に選択した（適合した指数関数的減衰率の微分テスト）。識別可能な枯渇パターンがあったかどうかを判定するために、次のステップを使用した：（１）Ａｇｇ［＋］細胞およびＡｇｇ［－］細胞の両方で、各ｓｇＲＮＡ Ｘについて、各時点での２回繰り返し実験のその読み取りカウントを平均する、（２）（１）の５つの時点のデータを指数関数的減衰モデル：読み取りカウント＝ｅｘｐ（－速度＊ｔ）に適合させ、速度を推定し、速度の期待値（例えば、速度１）およびそれに関連する標準誤差（例えば、標準誤差１）を得る、ならびに（３）［速度１］／［速度２］≧１．５または≦１／１．５、および（［速度１］－［速度２］）／ｓｑｒｔ（［標準誤差１］２＋［標準誤差２］２）≧１．９６または≦－１．９６の場合、速度１および速度２は統計的に異なる。識別可能な枯渇パターン（すなわち、Ａｇｇ［＋］細胞におけるより劇的またはより鋭い枯渇パターン）の例を図２０に示す。次いで、選択されたｓｇＲＮＡの数（遺伝子を標的とする合計４つのｓｇＲＮＡのうち２つ、または遺伝子を標的とする合計６つのｓｇＲＮＡのうち３つ）に基づいて遺伝子を選択した。
２７個のｓｇＲＮＡを、Ａｇｇ［－］と比較してＡｇｇ［＋］でより鋭い枯渇パターンを有すると同定した。図２１を参照されたい。これらのうち、選択されたｓｇＲＮＡの数（遺伝子を標的とする合計４つのｓｇＲＮＡのうち２つ、または遺伝子を標的とする合計６つのｓｇＲＮＡのうち３つ）に基づいて、４つの標的遺伝子をさらなる検証のために選択した（標的遺伝子１、標的遺伝子２、標的遺伝子３、および標的遺伝子４）。標的遺伝子１および２の検証を、図２２Ａに示し、標的遺伝子３および４の検証を図２２Ｂに示す。１０個の必須遺伝子もまた、二次スクリーニング方法によって検証した（データには示さず）。
さらなる検証のために、凝集体あり（Ａｇｇ［＋］）または凝集体なし（Ａｇｇ［－］）のいずれかのＣａｓ９発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞に、各標的遺伝子にノックアウト変異を導入するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、標的遺伝子１、標的遺伝子２、および標的遺伝子４を標的とするｓｇＲＮＡで形質導入した（図２５）。７日間の選択下での拡大後、細胞生存率および細胞死をフローサイトメトリーによって評価および定量化し（図２６）、標的遺伝子の発現の減少を評価および確認した（データには示さず）。標的遺伝子１、標的遺伝子２、および標的遺伝子４を標的とするｓｇＲＮＡは、Ａｇｇ［＋］細胞において選択的な細胞死を引き起こしたが、Ａｇｇ［－］細胞では引き起こさなかった。
実施例３．転写活性化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ライブラリを使用して細胞生存率に影響するタウの遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングプラットフォームの開発
転写活性化されたときに疾患関連タンパク質凝集体との合成致死性を呈する遺伝子を同定するために、転写活性化（ｈＳＡＭ）ＣＲＩＳＰＲａ ｓｇＲＮＡライブラリを用いてゲノムワイドスクリーニングを行うためのプラットフォームが開発された。プラットフォームは、転写活性化されたときに、特に異常なタンパク質凝集の状況で細胞死を引き起こす遺伝子を同定する。そのような遺伝子の同定は、神経変性疾患の状況において凝集体関連神経毒性のメカニズム、およびニューロンの死を促進する遺伝的経路を解明し得る。
スクリーニングは、ＣＦＰまたはＹＦＰのいずれかに融合したＰ３０１Ｓ病原性変異を有するタウ微小管結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む、タウ４リピートドメインであるＴａｕ＿４ＲＤを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなるタウバイオセンサーヒト細胞株を用いた。つまり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、蛍光タンパク質ＣＦＰまたは蛍光タンパク質ＹＦＰに融合した疾患関連タンパク質バリアントを安定して発現する２つの導入遺伝子：タウ４ＲＤ－ＣＦＰ／タウ４ＲＤ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）を含み、タウリピートドメイン（４ＲＤ）は、Ｐ３０１Ｓ病原性変異を含む。図１を参照されたい。これらのバイオセンサー株では、タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰタンパク質の凝集により、ドナーＣＦＰからアクセプターＹＦＰへの蛍光エネルギーの移動の結果であるＦＲＥＴシグナルが生成される。図２を参照されたい。タウ凝集体を含むＦＲＥＴ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって選別および単離され得る。ベースラインでは、刺激されていない細胞は、最小限のＦＲＥＴシグナルで安定した可溶性状態でレポーターを発現する。刺激（例えば、種粒子のリポソームトランスフェクション）により、レポータータンパク質は凝集体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。凝集体含有細胞はＦＡＣＳによって単離され得る。安定して増殖する凝集体含有細胞株Ａｇｇ［＋］は、Ａｇｇ［－］細胞株のクローン連続希釈によって単離され得る。
このタウバイオセンサー細胞株には、遺伝子スクリーニングに役立つようにいくつかの修飾がなされた。最初に、このバイオセンサー細胞株をさらにトランスジェニックに修飾し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＳＡＭ転写活性化系の構成要素であるｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１を発現させた。レンチウイルスｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１構築物は、それぞれ配列番号４２および４３に提供される。クローンＤＣ１１を、後続のライブラリスクリーニングで使用する高性能クローンとして選択した。このクローンを、選択された標的遺伝子の活性化におけるその有効性について検証した。
次に、タウタンパク質が非凝集（デフォルト状態）（Ａｇｇ［－］）または凝集状態（Ａｇｇ［＋］）のいずれかで安定して存在するこれらのＳＡＭ発現タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰ（ＴＣＹ）バイオセンサー細胞株のサブクローンを得た。タウタンパク質が凝集状態で安定して持続的に存在する細胞株を得るために、ＳＡＭ発現細胞を、これらの細胞によってトランスジェニックに発現されたタウタンパク質の凝集を「播種」するためにリポフェクタミン試薬と混合した組換え線維化タウで処理した。次いで、「播種した」細胞を連続希釈して、単一細胞由来のクローを得て、次いでこれらのクローンを拡大して、タウ凝集体がすべての細胞で安定して持続し、経時的に増殖および複数回継代するクローン細胞株を同定した。これらの凝集陽性Ａｇｇ［＋］安定クローンの１つであるＤＣ１１－Ｂ６を、拡大およびスクリーニングでの使用のために選択した。
実施例４．転写活性化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ライブラリを使用して細胞生存率に影響するタウの遺伝的修飾因子を同定するためのゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングプラットフォーム
プールされたゲノムワイド転写活性化（ｈＳＡＭ）ＣＲＩＳＰＲａスクリーニングを行い、実施例３で開発されたクローン細胞株を使用して細胞生存率に影響するタウの遺伝的修飾因子を明らかにした。具体的には、凝集体あり（Ａｇｇ［＋］）または凝集体なし（Ａｇｇ［－］）のいずれかのＳＡＭ発現（すなわち、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４／ＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１発現）タウ－ＣＦＰ／タウ－ＹＦＰバイオセンサー細胞に、ｓｇＲＮＡあたり５００Ｘ細胞の掲示で各標的遺伝子を転写活性化するためのレンチウイルス送達アプローチを使用して、ヒトゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ ｈＳＡＭ ｓｇＲＮＡライブラリで形質導入した。ＣＲＩＳＰＲ ｈＳＡＭ ｓｇＲＮＡライブラリは、転写開始部位の２００ｂｐ上流内の部位を標的とし、遺伝子あたりの平均カバレッジは３～４のｓｇＲＮＡである。ｓｇＲＮＡは、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが２つ以下のｓｇＲＮＡを回避することにより、オフターゲット効果を回避するように設計された。ライブラリは１８，９４６のヒト遺伝子をカバーする。ライブラリを、感染多重度（ＭＯＩ）＜０．３で、ｓｇＲＮＡあたり＞５００細胞のカバレッジで形質導入した。タウバイオセンサー細胞を、ゼオシンの選択の下で増殖させ、細胞ごとに固有のｓｇＲＮＡの組み込みおよび発現を含む細胞を選択した。
（Ａｇｇ［＋］）および（Ａｇｇ［－］）細胞の試料を、形質導入後３、６、７、１４、および１７日目の５つの時点で収集した。組み込まれたｓｇＲＮＡ構築物のＤＮＡ単離およびＰＣＲ増幅により、各時点での各細胞株におけるｓｇＲＮＡレパートリーの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による特徴付けが可能になった。スクリーニングは、４回の反復実験で構成された。ＮＧＳデータの分析により、転写活性化されたときに細胞死をもたらす遺伝子の同定が可能になった。両方の細胞株で枯渇したｓｇＲＮＡは、細胞生存に不可欠ないくつかの細胞プロセスを破壊する可能性が高いが、一方で、Ａｇｇ［＋］細胞株で特異的に枯渇しているが、Ａｇｇ［－］細胞株では枯渇していないか、またはあまり枯渇していないｓｇＲＮＡは、特定の標的遺伝子の活性化が細胞死を誘導するための細胞におけるタウ凝集体の存在と組み合わされる合成致死効果を示し得る。これらの合成致死性遺伝子は、タウ関連細胞毒性の潜在的な修飾因子として興味深いものである。
データ分析は、実施例２で使用されたアプローチを反映し、異なる時点または３日目と比較して最終時点でのＡｇｇ［－］と比較した、（１）１７日間の時間経過全体にわたる２つの細胞集団Ａｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］でのｓｇＲＮＡプロファイリング、ならびに（２）Ａｇｇ［＋］でのｓｇＲＮＡプロファイリングを含んでいた。データ分析は実施例２で使用されたアプローチを反映しているため、実施例２の詳細のすべてがここで繰り返されるわけではない。
実施例２に説明されるように、これは、エンドポイント細胞収集のＮＧＳ読み取りを最初の継代と単純に比較するより従来のアプローチと比較して、ｓｇＲＮＡの枯渇を評価するための新しい分析アプローチである。比較では、枯渇についての他の公開されたゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングは、最後の収集と早期継代との間の読み取りカウントの比率としてＣＲＩＳＰＲスコアを比較した。対照的に、このアプローチは、経時的にｓｇＲＮＡ枯渇のパターンを呈する遺伝子を同定するために全時間経過を調べることであった。
次いで、枯渇した遺伝子を時間経過分析によって同定した。各繰り返しにおいて、３日目に対して、一時的パターンが増加しない（１０日目≦３日目の読み取りカウント、１４日目≦７日目の読み取りカウント、および１７日目≦１０日目の読み取りカウント）枯渇したｓｇＲＮＡを選択した。３日目にすでに枯渇したｓｇＲＮＡ（すなわち、３日目に検出限界の３０を下回り、残りの時点を通して検出限界を下回ったまま）が維持された。検出限界に近い変動は無視された（すなわち、ｓｇＲＮＡの読み取りカウントが、検出限界を下回るｓｇＲＮＡの読み取りカウントの検出限界＋２＊標準偏差を下回るｓｇＲＮＡの平均読み取りカウント以下の場合、ｓｇＲＮＡは検出されなかったとみなされた）。遺伝子を、それらが十分な数の枯渇したｓｇＲＮＡを有していた場合に選択した（合計１つのｓｇＲＮＡのうち１つ、合計２つのｓｇＲＮＡのうち１つ、合計３つのｓｇＲＮＡのうち１つ、合計４つのｓｇＲＮＡのうち２つ、合計５つのｓｇＲＮＡのうち２つ、または合計６つのｓｇＲＮＡのうち３つ）。次に、それらの遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡがＡｇｇ［＋］およびＡｇｇ［－］の両方で枯渇した場合、遺伝子を「必須」として同定した。遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡがＡｇｇ［＋］で枯渇したが、Ａｇｇ［－］では枯渇しなかった場合（Ａｇｇ［＋］と比較してＡｇｇ［－］での枯渇なし、複数の繰り返しおよび手動検査に基づく改善）、遺伝子を「合成致死性」として同定した。改善は、Ａｇｇ［＋］細胞株で３回繰り返される時間経過実験すべてで提示された遺伝子を取得し、次いでＡｇｇ［－］細胞株で少なくとも１つの実験で提示された任意の遺伝子を除外することを意味する。手動検査では、Ａｇｇ［＋］実験の１つで枯渇したことが示されたガイドＲＮＡを確認し、すべてのＡｇｇ［＋］実験で枯渇したが、Ａｇｇ［－］実験では枯渇しなかったかまたは１つのみのＡｇｇ［－］実験で枯渇したガイドＲＮＡを探し、標的を逃していないことを確認することを含んだ。
Ａｇｇ［＋］では複数の複製スクリーニングで枯渇のパターンを呈するがＡｇｇ［－］では呈しない複数のｓｇＲＮＡにより標的とされた遺伝子を、候補「合成致死性」遺伝子として同定した。次に、枯渇のパターンを候補合成致死性遺伝子について評価した。各ｓｇＲＮＡについて、時間因子の有意性（ｐ値）を計算した（２つの実験を時点ごとの繰り返しとして使用した）。標準一般線形回帰モデル（ＧＬＭ）を使用した：ｙ～ベータ＊ｔ（式中、ｙ＝読み取りカウントおよびｔ＝時間）を、データに適用した（５つの時点（３日目から１７日目）で２回の繰り返し実験）。ＧＬＭを解くと、ベータが０からどれだけ離れているか（すなわち、時間因子の有意性）を定義するベータのｐ値が得られた。さらに、各ｓｇＲＮＡを、すべての実験で枯渇パターンがあった場合にマークした（１０日目＜３日目、および１４日目＜７日目、および１７日目＜１０日目）。ｓｇＲＮＡを、有意な時間経過ｐ値（≦１ｅ－３）があり、すべての実験で枯渇パターンがあった場合に選択した。次いで、ｓｇＲＮＡを、Ａｇｇ［＋］とＡｇｇ［－］との間に識別可能な枯渇パターンがあった場合に選択した（適合した指数関数的減衰率の微分テスト）。識別可能な枯渇パターンがあったかどうかを判定するために、次のステップを使用した：（１）Ａｇｇ［＋］細胞およびＡｇｇ［－］細胞の両方で、各ｓｇＲＮＡ Ｘについて、各時点での２回繰り返し実験のその読み取りカウントを平均する、（２）（１）の５つの時点のデータを指数関数的減衰モデル：読み取りカウント＝ｅｘｐ（－速度＊ｔ）に適合させ、速度を推定し、速度の期待値（例えば、速度１）およびそれに関連する標準誤差（例えば、標準誤差１）を得る、ならびに（３）［速度１］／［速度２］≧１．５または≦１／１．５、および（［速度１］－［速度２］）／ｓｑｒｔ（［標準誤差１］２＋［標準誤差２］２）≧１．９６または≦－１．９６の場合、速度１および速度２は統計的に異なる。識別可能な枯渇パターン（すなわち、Ａｇｇ［＋］細胞におけるより劇的またはより鋭い枯渇パターン）の例を図２０に示す。
９つの標的遺伝子（標的遺伝子７～１５）を表す１３個のｓｇＲＮＡは、Ａｇｇ［－］と比較してＡｇｇ［＋］でより鋭い枯渇パターンを有すると同定された。図２３を参照されたい。標的遺伝子７～１５の検証を図２４Ａ～２４Ｂに示す。

Claims (97)

  1. タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することであって、各細胞集団が、Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含み、
    前記凝集陽性細胞集団において、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在し、
    前記凝集陰性細胞集団において、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在しない、提供することと、
    （ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質が、前記複数の遺伝子を切断して遺伝子機能のノックアウトをもたらす、導入することと、
    （ｃ）各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
    前記凝集陰性細胞集団ではないが前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇、または前記凝集陰性細胞集団に対して、前記凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより劇的な枯渇パターンが、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であることを示す、方法。
  2. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２１を含み、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  6. 前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  7. 各ガイドＲＮＡが、構成的エクソンを標的とする、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  8. 各ガイドＲＮＡが、５’構成的エクソンを標的とする、請求項７に記載の方法。
  9. 各ガイドＲＮＡが、第１のエクソン、第２のエクソン、または第３のエクソンを標的とする、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  10. タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）凝集陽性細胞集団および凝集陰性細胞集団を提供することであって、各細胞集団が、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含み、
    前記凝集陽性細胞集団において、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在し、
    前記凝集陰性細胞集団において、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在しない、提供することと、
    （ｂ）複数の遺伝子を標的とする複数の固有のガイドＲＮＡを含むライブラリを各細胞集団に導入することであって、前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記キメラＣａｓタンパク質および前記キメラアダプタータンパク質と複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の遺伝子の転写を活性化して遺伝子発現の増加をもたらす、導入することと、
    （ｃ）各細胞集団における時間経過にわたる複数の時点での前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々の存在量を決定することと、を含み、
    前記凝集陰性細胞集団ではないが前記凝集陽性細胞集団におけるガイドＲＮＡの枯渇、または前記凝集陰性細胞集団に対して、前記凝集陽性細胞集団における時間経過にわたるガイドＲＮＡのより劇的な枯渇パターンが、前記ガイドＲＮＡによって標的とされた前記遺伝子の活性化が、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈し、タウ凝集に関連する遺伝的脆弱性であることを示す、方法。
  11. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞集団において安定して発現される、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞集団においてゲノム的に組み込まれる、請求項１０～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 各ガイドＲＮＡが、転写開始部位の２００ｂｐ上流内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、請求項１０～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる１つ以上のアダプター結合エレメントを含み、任意に、各ガイドＲＮＡが、前記キメラアダプタータンパク質が特異的に結合することができる２つのアダプター結合エレメントを含み、任意に、第１のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第１のループ内にあり、第２のアダプター結合エレメントが、前記１つ以上のガイドＲＮＡの各々の第２のループ内にあり、任意に、前記アダプター結合エレメントが、配列番号３３に示される配列を含み、
    任意に、１つ以上のガイドＲＮＡの各々が、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分に融合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分を含む単一ガイドＲＮＡであり、前記第１のループが、配列番号１７の残基１３～１６に対応するテトラループであり、前記第２のループが、配列番号１７の残基５３～５６に対応するステムループ２である、請求項１０～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  22. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  23. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  25. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、配列番号１１を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  26. 前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  27. 前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  28. 前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光タンパク質である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  29. 前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記第１のレポーターが、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、前記第２のレポーターが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記細胞が、真核細胞である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  32. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記複数の固有のガイドＲＮＡが、前記細胞の大部分が前記固有のガイドＲＮＡのうちの１つのみを受け取るように選択された濃度で導入される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  36. 前記複数の固有のガイドＲＮＡが、１００個以上の遺伝子、１０００個以上の遺伝子、または１００００個以上の遺伝子を標的とする、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  37. 前記ライブラリが、ゲノムワイドライブラリである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  38. 複数の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  39. 少なくとも３個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、請求項３８に記載の方法。
  40. 約３～約６個の標的配列が、前記標的化された複数の遺伝子の各々において平均して標的化される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記複数の固有のガイドＲＮＡが、ウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  42. 前記複数の固有のガイドＲＮＡの各々が、別個のウイルスベクター内にある、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記複数の固有のガイドＲＮＡが、レンチウイルス形質導入によって前記細胞集団に導入される、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記細胞集団が、約０．３未満の感染多重度で感染する、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記複数の固有のガイドＲＮＡが、選択マーカーとともに前記細胞集団に導入され、ステップ（ｂ）が、前記選択マーカーを含む細胞を選択することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  46. 前記選択マーカーが、薬物に対する耐性を付与し、任意に、前記選択マーカーが、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、およびブラストサイジンＳデアミナーゼから選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. ステップ（ｂ）において前記複数の固有のガイドＲＮＡが導入される前記細胞集団が各々、固有のガイドＲＮＡあたり約５００個を超える細胞を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  49. ステップ（ｃ）の前記時間経過が、約１週間超である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  50. ステップ（ｃ）の前記時間経過が、約２週間超である、請求項４９に記載の方法。
  51. ステップ（ｃ）の前記時間経過が、約１０～約１５の細胞倍加を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  52. ステップ（ｃ）の前記複数の時点が、少なくとも３つの時点を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  53. ステップ（ｃ）の前記複数の時点が、約４つの時点または約６つの時点を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. ステップ（ｃ）の各時点の間が約１日超である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  55. ステップ（ｃ）の各時点の間が約２日超である、請求項５４に記載の方法。
  56. ステップ（ｃ）の各時点の間が約３～約４日である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  58. 前記遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが、前記凝集陰性細胞集団に対して、前記凝集陽性細胞集団において前記時間経過にわたってより劇的な枯渇パターンを有する場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、請求項５７に記載の方法。
  59. 各時点での前記ガイドＲＮＡの存在量が以前の時点での前記ガイドＲＮＡの存在量以下である場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  60. 前記第２の時点の後の各時点での前記ガイドＲＮＡの存在量が２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  61. 前記遺伝子を標的とする前記ライブラリ内の前記ガイドＲＮＡの約３０％超が、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  62. 遺伝子が、以下の状況：
    （１）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする１つのガイドＲＮＡが存在し、前記１つのガイドＲＮＡが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
    （２）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする２つのガイドＲＮＡが存在し、前記２つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
    （３）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする３つのガイドＲＮＡが存在し、前記３つのガイドＲＮＡの少なくとも１つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
    （４）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする４つのガイドＲＮＡが存在し、前記４つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、
    （５）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする５つのガイドＲＮＡが存在し、前記５つのガイドＲＮＡの少なくとも２つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、および
    （６）前記ライブラリ内に前記遺伝子を標的とする６つのガイドＲＮＡが存在し、前記６つのガイドＲＮＡの少なくとも３つが、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない、のうちのいずれか１つにおいて、ステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記方法が、少なくとも３つの異なる実験で少なくとも３回繰り返され、遺伝子が、前記少なくとも３つの異なる実験の約５０％超でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる場合、タウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  64. ステップ（ｃ）の前記時間経過が、約２週間超であり、
    ステップ（ｃ）の前記複数の時点が、約６つの時点を含み、
    ステップ（ｃ）の各時点の間が約３～約４日であり、
    前記第２の時点の後の各時点での前記ガイドＲＮＡの存在量が２つの時点前の時点の存在量以下である場合、ガイドＲＮＡがステップ（ｃ）で枯渇しているとみなされ、
    前記遺伝子を標的とする前記ライブラリ内の前記ガイドＲＮＡの約３０％超が、前記凝集陽性細胞集団において枯渇しているが、前記凝集陰性細胞集団においては枯渇していない場合、遺伝子がステップ（ｃ）でタウタンパク質凝集体との合成致死性を呈するとみなされる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  65. Ｃａｓタンパク質、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメイン、および第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインを含む、１つ以上の細胞集団。
  66. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項６５に記載の細胞集団。
  67. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、請求項６６に記載の細胞集団。
  68. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２１を含み、任意に、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２２に示される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項６７に記載の細胞集団。
  69. 前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞において安定して発現される、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の細胞集団。
  70. 前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞においてゲノム的に組み込まれる、請求項６５～６９のいずれか一項に記載の細胞集団。
  71. １つ以上の転写活性化ドメインに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含むキメラＣａｓタンパク質と、１つ以上の転写活性化ドメインに融合したアダプタータンパク質を含むキメラアダプタータンパク質と、第１のレポーターに連結された第１のタウリピートドメインと、第２のレポーターに連結された第２のタウリピートドメインと、を含む、１つ以上の細胞集団。
  72. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項７１に記載の細胞集団。
  73. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、請求項７２に記載の細胞集団。
  74. 前記キメラＣａｓタンパク質が、ＶＰ６４転写活性化ドメインに融合した前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、核局在化シグナル、および前記ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを含む、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の細胞集団。
  75. 前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質であり、前記キメラアダプタータンパク質中の前記１つ以上の転写活性化ドメインが、ｐ６５転写活性化ドメインおよびＨＳＦ１転写活性化ドメインを含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ＭＳ２コートタンパク質、核局在化シグナル、前記ｐ６５転写活性化ドメイン、および前記ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む、請求項７１～７４のいずれか一項に記載の細胞集団。
  76. 前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３６を含み、任意に、前記キメラＣａｓタンパク質が、配列番号３８に示される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の細胞集団。
  77. 前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３７を含み、任意に、前記キメラアダプタータンパク質が、配列番号３９に示される配列を含むコード配列によってコードされる、請求項７１～７６のいずれか一項に記載の細胞集団。
  78. 前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、前記細胞において安定して発現される、請求項７１～７７のいずれか一項に記載の細胞集団。
  79. 前記キメラＣａｓタンパク質、前記キメラアダプタータンパク質、前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメイン、および前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインをコードする核酸が、前記細胞においてゲノム的に組み込まれる、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の細胞集団。
  80. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、ヒトタウリピートドメインである、請求項６５～７９のいずれか一項に記載の細胞集団。
  81. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、凝集促進変異を含む、請求項６５～８０のいずれか一項に記載の細胞集団。
  82. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウＰ３０１Ｓ変異を含む、請求項８１に記載の細胞集団。
  83. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、タウ４リピートドメインを含む、請求項６５～８２のいずれか一項に記載の細胞集団。
  84. 前記第１のタウリピートドメインおよび／または前記第２のタウリピートドメインが、配列番号１１を含む、請求項６５～８３のいずれか一項に記載の細胞集団。
  85. 前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じである、請求項６５～８４のいずれか一項に記載の細胞集団。
  86. 前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のタウリピートドメインが、同じであり、各々が、タウＰ３０１Ｓ変異を含むタウ４リピートドメインを含む、請求項６５～８５のいずれか一項に記載の細胞集団。
  87. 前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光タンパク質である、請求項６５～８６のいずれか一項に記載の細胞集団。
  88. 前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、請求項８７に記載の細胞集団。
  89. 前記第１のレポーターが、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）であり、前記第２のレポーターが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、請求項８８に記載の細胞集団。
  90. 前記細胞が、真核細胞である、請求項６５～８９のいずれか一項に記載の細胞集団。
  91. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項９０に記載の細胞集団。
  92. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項９１に記載の細胞集団。
  93. 前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項９２に記載の細胞集団。
  94. 前記細胞が、インビトロである、請求項６５～９３のいずれか一項に記載の細胞集団。
  95. 前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在していない、請求項６５～９４のいずれか一項に記載の細胞集団。
  96. 前記第１のレポーターに連結された前記第１のタウリピートドメインおよび前記第２のレポーターに連結された前記第２のタウリピートドメインが、凝集状態で安定して存在する、請求項６５～９５のいずれか一項に記載の細胞集団。
  97. 請求項６５～９６のいずれか一項に記載の細胞集団および培養培地を含む、インビトロ培養物。
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