JP2022514959A - 胃腸疾患の免疫機序及び治療薬 - Google Patents

Abstract

胃腸疾患を治療する医薬品の製造におけるジピリダモールの使用であって、前記胃腸疾患は結腸炎及び炎症性腸疾患を含み、患者は好ましくは児童である。【選択図】なし

Description

本発明は胃腸疾患（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｓｅｓａｓｅ）、例えば感染性又は非感染性胃腸疾患（Ｎｏｎ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、特に児童の非感染性胃腸疾患を含む非感染性胃腸疾患の免疫機序、及び胃腸疾患、例えば非感染性胃腸疾患の治療におけるＰＤＥ阻害剤及び／又は抗血小板薬の新しい使用に関する。

胃腸疾患、例えば、非感染性胃腸疾患は、多種の消化管炎症性疾患の総称であり、異なる分類によって、例えば炎症性胃腸疾患（例えば炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＩＢＤと略称することがある））、アレルギー性胃腸疾患（例えば食物アレルギー性）や機能性胃腸疾患などを含み、各年齢段階の人に影響を与える。乳幼児にも特によく見られ、児童の健康や成長に影響する重大な医学問題である。臨床症状は繰り返した腹痛や腹部膨満、吐血や下血、下痢や便秘、食欲低下、栄養不良、及び各種の全身合併症であり、深刻な場合には死亡の発生を招く。胃腸疾患、例えば非感染性胃腸疾患の発症機序は現在まだ明確ではなく、これは疾患サブタイプの命名が発症機序ではなく、主に罹患部位、臨床表現、誘発要素、又はある細胞型の存在数によって行われることから明らかになる。社会経済の発展に従って、胃腸疾患、特に炎症性腸疾患、例えば未分化結腸炎（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＣＤと略称することがある）、及び潰瘍性結腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ、以ＵＣと略称することがある）の発症率は世界中年々上昇し、中国でも臨床でよく見られる疾患である。現在、胃腸疾患の治療は可能な誘因に応じて治療を施し、方法はアレルゲン回避、腸内栄養、グルココルチコイド、免疫抑制剤又は生物製剤などの使用による炎症反応の抑制を含む。これらの医薬品を長期間服用すると、臓器の機能に影響を与える毒性又は副作用が起こり、感染リスクが高まり、リンパ腫などの悪性腫瘍を誘発する恐れがある。特に児童患者にとって、これらのリスクは成長発育期にある児童に特に顕著な影響を与える。

このうち、アレルギー性胃腸疾患については、ここ２０年以来、食物アレルギーの発症率は年々増加しているが、その免疫反応機序はまだ完全に解明されていないため、信頼できる診断方法がなく、それによる胃腸疾患、例えば食物蛋白誘導性小腸結腸炎症候群、食物蛋白誘導性腸疾患、好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎などの多くの疾患はしばしば診断が遅延したり、誤診したり、誤って治療されたりする。このような児童患者の管理は、個別化されたアレルゲン回避、アレルギー性食品による急性・慢性症状の予防又は回避、十分でバランスのとれた食事の提供に依存している。しかし、このような児童患者の飲食又は回避の管理は困難であり、管理の厳格さが過不足であると繰り返した急性アレルギー反応又は持続的な胃腸炎症を引き起こし、栄養の消化や吸収に直接影響する可能性がある。

さらに、機能性胃腸疾患については、ここ１０年以来、脳腸相関異常による児童機能性胃腸疾患はますます注目され、症状の発生は胃腸動力の乱れ、内臓の高敏感性、粘膜及び免疫機能の異常、腸内細菌叢のバランスの崩れや中枢神経系の処理異常などの要素と関係がある。病因と発症機序に対する理解が不足しているため、児童機能性胃腸疾患の治療には特異的な治療方法がなかった。

胃腸疾患、例えば非感染性胃腸疾患は、急性発作及び持続的な慢性亜臨床炎症反応又は疾患の反復発作を招き、多くの患者、特に児童患者の身体の健康又は成長発育に深刻な影響を与え、家庭及び社会にも巨大な経済負担をもたらした。組織由来及び臨床基礎研究の複雑性の制限から、胃腸疾患の発症機序の研究はほとんど患者及び対照群の生検組織の全体トランスクリプトームレベルの差異に限られている。特定の細胞又は遺伝子の疾患における機能の研究は、ほとんど、実験動物モデルに限られている。そのため、胃腸疾患、例えば非感染性胃腸疾患の、免疫細胞及び非免疫細胞を含む粘膜免疫微小環境を系統的に研究することは極めて大きな臨床又は基礎研究の意義がある。

正常の胃腸免疫微小環境と胃腸疾患、例えば非感染性胃腸疾患の場合の胃腸免疫微小環境の差異を細胞及び分子のレベルで詳しく述べることができれば、このような疾患の臨床診療の現状を大幅に改善し、家庭と社会の医療負担を下げ、社会の調和のとれた発展を促進する。

本発明者らは、上記課題を解決するために、胃腸疾患、例えば非感染性胃腸疾患の免疫機序を詳細に検討した。

本発明は、胃腸疾患の代表的な例を選択して、未分化結腸炎、クローン病及び潰瘍性結腸炎を含む炎症性腸疾患に罹患している児童被験者及び健康対照児童被験者の結腸免疫細胞及び非免疫細胞の転写スペクトル特徴を単細胞レベルで解析したところ、ＣＤ３９（ＥＮＴＰＤ１によってコードされる）を発現するＣＤ８及びγδＴ細胞は炎症性腸疾患の患者の上皮内Ｔ細胞（Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｔ ｃｅｌｌ、以下ＩＥＴと略称することがある）で発現が低下し、この結果、結腸粘膜における血小板凝集とセロトニン（以下、５－ヒドロキシトルプタミン（５－Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｐｔａｍｉｎｅ）又は５－ＨＴと呼ぶこともある）の蓄積を引き起こすことが明らかになった。具体的には、本発明は、患者（例えば、未分化結腸炎、クローン病及び潰瘍性結腸炎の患者）並びに健常対照被験者の腸粘膜の単細胞ＲＮＡシークエンシング、免疫表現型解析、動物実験及び臨床実験により、炎症性腸疾患の共通の発症機序を説明した。本発明で実施された上記の種々の解析から明らかなように、環状ＡＭＰ反応（ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、環状アデノシンリン酸反応）及び／又は環状ＧＭＰ反応（ｃＧＭＰ ｒｅｓｐｏｐｎｓｅ、環状グアノシンリン酸反応）経路がＣＤ３９発現を調節し、炎症性腸疾患の患者において、欠陥ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ反応経路に起因する発症機序が存在する。対照被験者と比較して、炎症性腸疾患の患者では、ＰＤＥ４Ｂ及びＴＮＦαを発現するマクロファージが浸潤しており、ＣＤ３９を発現する上皮内Ｔ細胞（以下、ＣＤ３９^＋ＩＥＴ細胞と略称することがある）の存在量が低下し、結腸粘膜における血小板凝集及び５－ヒドロキシトルプタミンの放出が普遍的に存在する。炎症性腸疾患（例えば結腸炎、ＵＣ及びＣＤ）などの患者では、高度炎症性マクロファージの浸潤、ＣＤ３９^＋ＩＥＴ欠乏又は血小板凝集の欠陥が存在し、欠陥ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ反応経路は共通の機序で作用することがわかる。

以上のように、本発明は、胃腸疾患の発症機序を系統的に解明し、胃腸疾患の治療に新たな考え方を提供する。この発症機序を標的とした治療としては、本発明は、前記欠陥ｃＡＭＰ及び／若しくはｃＧＭＰ反応経路を改善することによって免疫機序を改善することができ、並びに／又は、ｃＡＭＰレベル及び／若しくはｃＧＭＰレベルを上昇させ得る医薬品若しくは他の治療方法、例えば、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ経路を標的とするホスホジエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ、以下ＰＤＥと略称することがある）阻害剤、アデニル酸シクラーゼ（Ａｄｅｎｏｃｉｎｅ ｃｙｃｌａｓｅ、以下ＡＣと略称することがある）活性化剤、グアニル酸シクラーゼ（ｇｕａｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ、以下ＧＣと略称することがある）活性化剤などを患者に投与することを含む、血小板凝集を標的とすることにより治療を行うことができる。具体的には、例えば、本発明者らは、ジピリダモール（Ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ）などのホスホジエステラーゼ阻害剤が、マクロファージの浸潤を抑制し、これらのＴＮＦ－αの発現レベルを低下させ、ＩＥＴにおけるＣＤ３９の発現を促進し、結腸粘膜における血小板の凝集を低下させ、炎症性腸疾患の患者の免疫恒常性を回復させることにより臨床症状を改善できることを見出した。これは、炎症性腸疾患、特に結腸炎、ＵＣ又はＣＤなどの胃腸疾患に罹患している患者などに新規な治療薬を提供している。

一方、本発明は、ＣＤ３９^＋ＩＥＴ細胞増加、及び／又は血小板凝集抑制、及び／又は５－ヒドロキシトルプタミンの放出抑制、及び／又はＰＤＥ４Ｂ抑制、及び／又はＴＮＦ－α抑制、及び／又はマクロファージの浸潤抑制から選ばれるいずれか１つの方法又はこれらの組み合わせによって、胃腸疾患を治療するための考え方も提供する。

例えば、本発明者らは、胃腸疾患の患者において、結腸粘膜での血小板凝集が存在することを見出した。本発明は、血小板の凝集を抑制することにより、胃腸疾患を治療することができる。血小板を標的とする治療としては、血小板の凝集を抑制することができる医薬品又は他の治療方法を患者に投与することが含まれる。このような抗血小板薬として知られているジピリダモールなどの医薬品を投与することにより、患者の胃腸疾患を治療することができる。さらに、本発明は、胃腸疾患を治療するために臨床的に採用されているホルモン剤であるメチルプレドニゾロンも血小板凝集抑制作用を有することを見出した。これはまた、本発明で説明された抗血小板凝集薬が胃腸疾患の治療に使用できることをさらにサポートする。

本発明は、局所免疫微小環境の組成及び機能状態を説明することにより、非感染性胃腸疾患などの胃腸疾患の正確なタイピングを大幅に促進し、臨床的に個別化された診断及び治療のレベルを向上させる。

本発明は、結腸炎、ＩＢＤ（ＵＣやＣＤなどを含む）などの胃腸疾患の発症機序を発見し、児童患者に新しい治療方法を提供し、新薬の研究開発又は応用に考え方を提供し、いくつかのすでに発売されている医薬品（例えばジピリダモールなど）に新しい治療用途を提供する。

前記のように、本発明は以下の態様にかかる。
１．胃腸疾患を治療、予防する医薬品の製造におけるｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ促進剤の使用。
２．前記ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ促進剤はホスホジエステラーゼ阻害剤、及びアデニル酸シクラーゼ／グアニル酸シクラーゼ活性化剤から選ばれる、１項に記載の使用。
３．前記ホスホジエステラーゼ阻害剤はＰＤＥ３、及び／又はＰＤＥ４、及び／又はＰＤＥ５阻害剤である、２項に記載の使用。
４．前記ホスホジエステラーゼ阻害剤はジピリダモールである、３項に記載の使用。
５．胃腸疾患を治療、予防する医薬品の製造における抗血小板薬の使用。
６．前記抗血小板薬は、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）阻害剤、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）Ｐ２Ｙ１２受容体拮抗剤、トロンビン受容体拮抗剤、５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）受容体拮抗剤、血小板糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＰ）ＩＩ ｂ／IIIａ受容体阻害剤、及びホスホジエステラーゼ阻害剤から選ばれる、５項に記載の使用。
７．前記抗血小板薬はホスホジエステラーゼ阻害剤である、６項に記載の使用。
８．前記抗血小板薬はジピリダモールである、７項に記載の使用。
９．前記胃腸疾患は炎症性胃腸疾患、アレルギー性胃腸疾患、及び機能性胃腸疾患から選ばれる、前記１～８項のいずれか１項に記載の使用。
１０．前記胃腸疾患は炎症性腸疾患、食物アレルギーに起因する胃腸疾患、及び機能性胃腸疾患から選ばれる、前記１～９項のいずれか１項に記載の使用。
１１．前記胃腸疾患は結腸炎、潰瘍性結腸炎、クローン病、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎から選ばれる、前記１～９項のいずれか１項に記載の使用。
１１．前記胃腸疾患は児童胃腸疾患である、前記１～１０項のいずれか１項に記載の使用。
１２．胃腸疾患を治療する医薬品の製造における抗血小板薬又はｃＡＭＰ及び／若しくはｃＧＭＰ促進剤と他の医薬品の併用の使用。
１３．前記抗血小板薬は、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）阻害剤、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）Ｐ２Ｙ１２受容体拮抗剤、トロンビン受容体拮抗剤、５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）受容体拮抗剤、血小板糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＰ）ＩＩ ｂ／IIIａ受容体阻害剤、及びホスホジエステラーゼ阻害剤から選ばれる、１２項に記載の使用。
１４．前記ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ促進剤はホスホジエステラーゼ阻害剤、及びアデニル酸シクラーゼ／グアニル酸シクラーゼ活性化剤から選ばれる、１２項に記載の使用。
１５．前記抗血小板薬はジピリダモールである、前記１３項に記載の使用。
１６．前記ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ促進剤はＰＤＥ３、及び／又はＰＤＥ４、及び／又はＰＤＥ５阻害剤である、前記１４項に記載の使用。
１７．前記胃腸疾患は、炎症性胃腸疾患、アレルギー性胃腸疾患、及び機能性胃腸疾患から選ばれる、前記１２～１６項のいずれか１項に記載の使用。
１８．前記胃腸疾患は潰瘍性結腸炎、クローン病、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎、結腸炎から選ばれる、前記１２～１７項のいずれか１項に記載の使用。
１９．前記胃腸疾患は児童結腸炎である、前記１２～１８項のいずれか１項に記載の使用。
２０．Ｔ細胞のＣＤ３９発現及び／又は血小板数を検出し、ＣＤ３９発現が低下し、及び／又は血小板数が増加すれば、陽性と判断することを含む、胃腸疾患を診断する方法。
２１．患者又は被験対象の腸粘膜におけるＴ細胞のＣＤ３９発現、及び／又は血小板の凝集、及び／又はＴＮＦ－α及び／又はＰＤＥ４Ｂを発現するマクロファージの浸潤を検出し、ＣＤ３９発現が低下し、及び／又は血小板数が増加し、及び／又はＴＮＦ－αの発現が上昇すれば、陽性と判断することを含む、胃腸疾患を診断する方法。
２２．Ｔ細胞のＣＤ３９発現が低下したか否かを検出する試薬、及び／又は血小板数が低下したか否かを検出する試薬を含む、胃腸疾患を診断するためのキット。
２３．Ｔ細胞のＣＤ３９発現を検出する試薬、及び／又は血小板凝集を検出する試薬、及び／又はＴＮＦ－α及び／又はＰＤＥ４Ｂを発現するマクロファージの浸潤を検出する試薬を含む、胃腸疾患を診断するためのキット。
２４．有効量のｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ促進剤、及び／又は抗血小板薬を患者に投与することを含む、胃腸疾患を予防又は治療する方法。
２５．前記胃腸疾患は炎症性胃腸疾患、アレルギー性胃腸疾患、及び機能性胃腸疾患から選ばれる、前記２０～２４項のいずれか１項に記載の方法又はキット。
２６．前記胃腸疾患は、結腸炎、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎から選ばれる、前記２０～２４項のいずれか１項に記載の方法又はキット。
２７．前記胃腸疾患は非感染性胃腸疾患である、前記２０～２６項のいずれか１項に記載の方法又はキット。
２８．前記胃腸疾患の患者は児童である、前記２０～２７項のいずれか１項に記載の方法又はキット。

単細胞シークエンシング及び生体情報解析である。図（ａ）は結腸炎児童患者（ＩＢＤ（未分化結腸炎、ＵＣ、ＣＤを含む）、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎患者を含む）及び対照児童の結腸粘膜を示している。図（ｂ）は単細胞シークエンシングと生体情報解析で計１７個のＴ及びＮＫサブセットが発見されたことを示している。図（ｃ）は対照群及び結腸炎患者における上皮内Ｔ細胞（ＩＥＴ）の比較を示しており、各群の棒グラフでは左側が対照群、右側が結腸炎群を表す。図（ｄ）は、ＥＮＴＰＤ１－ＣＤ８Ｔ細胞が特定の分化特徴を有する免疫保護性細胞サブタイプであることを示している。図（ｅ）は、ＥＮＴＰＤ１－ＣＤ８Ｔ細胞分化がｃＡＭＰ／ｃＧＭＰセカンドメッセンジャーによって制御されることを示している。ＥＮＴＰＤ１はＣＤ３９をコードする遺伝子である。 結腸炎に罹患している児童におけるＣＤ８及びγδＴ－ＥＮＴＰＤ１細胞の減少率である。図（ａ）～（ｃ）は、血液及び結腸上皮内Ｔ細胞（ＩＥＴ）におけるゲーティング戦略及び表面マーカータンパク質分子の発現を示している。図（ｄ）は対照被験者及び結腸炎に罹患している児童の指定ＩＥＴの割合を示している。結腸炎に罹患している児童では、ＣＤ３９^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞、特にＣＤ３９^＋メモリＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ３９^＋ｍＣＤ８Ｔ）及びＣＤ３９^＋γδＴ細胞（Ｖδ１＋）の割合が有意に低下する。水平線は中央値を表す。Ｐ値はＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により決定し、Ｐｒｉｓｍ ７のＢｅｎｊａｍｉｎｉとＨｏｃｈｂｅｒｇのオリジナルＦＤＲ法を用いて多重比較調整を行う。 ジピリダモールはＴ細胞でのＣＤ３９の発現を回復させ、児童の結腸炎症状を改善する。図（ａ）は、ＣＤ３９^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞と、一晩保存された結腸生検組織から放出されるＡＤＰ及び５－ＨＴとの相関性を示している。Ｐｒｉｓｍ ７を使用して線形回帰によりＰ値を決定する。図（ｂ）は、結腸炎に罹患している児童由来の培養血小板が対照被験者より有意に高い量の５－ＨＴを分泌することを示している。Ｐ値はＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（両側）により計算される。図（ｃ）では、左図は、免疫蛍光染色により対照群及び結腸炎被験者におけるＣＤ３９発現と血小板凝集（ＣＤ４１クラスタ）との間に負の相関（４００ｘ）を示すことを示している。ＣＤ３９（緑色）、ＣＤ４１（赤色）、核染色ＤＡＰＩ（青色）。右図は、対照群（ｎ＝３）及び結腸炎被験者（ｎ＝４）では、ＣＤ４１クラスタ／平方ミリメートルとして４～５領域／結腸生組織検査（画像中の直径が７μｍを超える凝集血小板のみを計算）であることを示している。水平線は中央値を表す。Ｐ値はＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（両側）により計算される。図（ｄ）はジピリダモール治療前後の臨床スコアを示している。Ｐ値は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎマッチドペア符号付き順位検定（両側）により計算される。図（ｅ）は、ジピリダモール治療前後の結腸鏡外観及び臨床スコアを示している。図（ｆ）は、ジピリダモール治療の前後におけるＣＤ３９及びＣＤ４１クラスタの免疫蛍光結果を示している。右図はジピリダモール治療前後の結腸炎児童患者３名のＣＤ４１クラスタ数を示している。Ｐ値はＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（両側）により計算される。図（ｇ）は、代表的な免疫蛍光染色（２００ｘ）ではジピリダモール処理後の結腸粘膜で活性化されたＡＴＦ２とＣＲＥＢ及びＣＤ３９との共発現を示すことを示している。 対照被験者と比較して、結腸炎及びＩＢＤの患者では、高度炎症性マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）が浸潤している。（Ａ）は高度炎症性マクロファージ及びＤＣの部分と対照群の対応部分との発現変動遺伝子（ＤＥＧ）を示している。赤色及び濃紺のドットは、Ｐ値（≦０．０５）及びｌｏｇ２（Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ）（赤色、≧１、濃紺、≦－１）閾値の単一遺伝子を示している。（Ｂ）ジピリダモールをｃＡＭＰレポーター遺伝子ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ－２２Ｆ ｃＡＭＰプラスミドにより安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に適用すると、細胞質ｃＡＭＰ濃度が有意に増加する。アデニル酸シクラーゼの活性化によりｃＡＭＰ濃度が増加したＦｏｒｓｋｏｌｉｎを陽性対照として用いる。データは３つの独立した実験を表し、すべての実験が類似した結果を示している。（Ｃ）免疫蛍光染色は、児童患者のＮＬＲＰ３炎症性小体が活性化されていることを示している。結腸粘膜切片はマクロファージを標識するために抗ＣＤ６８で染色され、ＮＬＲＰ３及びＡＳＣで染色されて炎症性小体に用いる。右図はＣＤ６８^＋ＡＳＣ^＋及びＮＬＲＰ３^＋ＡＳＣ^＋細胞の定量的解析を示し、ここで好酸性結腸炎が青色ドットで示される。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（Ｄ）ヒートマップは、髄様細胞における結腸炎／ＩＢＤリスク遺伝子の相対的発現を示している。 ジピリダモール治療はＤＳＳ誘発急性結腸炎モデルにおいて上皮内Ｔリンパ球中のＣＤ３９の発現を増加させる。（Ａ）上の図は、ＤＳＳ誘発急性結腸炎モデルの治療計画を示している。下の図は対照群、ＤＳＳ結腸炎群、又はＤＳＳ＋ジピリダモール群のマウスの結腸長を表している。（Ｂ）結腸炎上皮内Ｔ細胞サブタイプ及び対照群、ＤＳＳ結腸炎群、ＤＳＳ＋ジピリダモール群のマウスにおけるＣＤ３９発現のゲーティング戦略。（Ｃ）まとめたデータから明らかなように、ジピリダモール腹腔内注射用量として５０ｍｇ／ｋｇで治療すると、ＣＤ４、ＣＤ８、及びγδＴ細胞におけるＣＤ３９の発現を著しく増加させる。５０ｍｇ／ｋｇのジピリダモールはＣＤ４及びγδＴ細胞の相対的存在量を増加できる。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）対照群、ＤＳＳ結腸炎群、又はＤＳＳ＋ジピリダモール群のマウスにおける髄様細胞のゲーティング戦略及びＣＤ３９の発現。（Ｅ）まとめたデータから、対照群、ＤＳＳ結腸炎群、又はＤＳＳ＋ジピリダモール群のマウスの髄様細胞におけるＣＤ３９の発現が示された。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ジピリダモールと比較して、メチルプレドニゾロン及び抗ＴＮＦ－α治療は異なる作用方式を示している。（Ａ）左側図において、ｔＳＮＥ図は主要な細胞クラスタにおけるＥＮＴＰＤ１及びＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）の発現を示している。細胞は、正規化された選択された遺伝子のＵＭＩカウントによって色分けされる。これら２つの遺伝子が濃縮して発現された細胞サブタイプを示している。中間図は、代表的な免疫蛍光染色でジピリダモール治療後の結腸粘膜のＴ細胞、マクロファージ、及びＢ細胞におけるＣＤ３９発現の変化を示している（ｎ＝３）。右側図では、定量的解析により、ジピリダモール治療後のＴ細胞及びマクロファージにおけるＣＤ３９発現が有意に上昇したことが示されている。任意の所定の被験者について、５つの領域で結腸生検をカウントする。ドットの色は異なる群を表す（黒色は対照群を表し、緑色は結腸炎を表す）。水平線は中央値を示している。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（Ｂ）結腸炎又はＩＢＤに罹患している児童のメチルプレドニゾロン投与前後（左）、又は抗ＴＮＦα投与前後（右）の同一結腸部分の代表的な内視鏡像。（Ｃ）代表的な免疫蛍光染色では、結腸炎又はＩＢＤに罹患している児童においてメチルプレドニゾロン投与前後（左、ｎ＝５）又は抗ＴＮＦα投与前後（右、ｎ＝６）におけるＣＤ３９、ＣＤ４１、ＣＤ６８及びＴＮＦ－αの差の変化を示している。定量的解析は右図に示されている。被験者の５つの領域について結腸生検を行う。ドットの色は異なる群を表す（黒色は対照群、緑色は結腸炎、紫は潰瘍性結腸炎（ＵＣ）、赤色はクローン病（ＣＤ））を表す）。水平線は中央値を示す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ジピリダモールは結腸炎の症状を改善する。（Ａ）ＤＳＳ誘発急性結腸炎モデルにおいて、ジピリダモール（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスの体重及び結腸長が有意に増加し（対照群、ｎ＝６；ＤＳＳ＋溶媒、ｎ＝２３；ＤＳＳ＋ジピリダモール、ｎ＝２３）、Ｐ値は対応のないｔ－検定により計算される。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）対照群、ＤＳＳ及びＤＳＳ＋ジピリダモール（ＤＩＰ）群の結腸からの代表的なヘマトキシリン－エジン（ＨＥ）染色切片から、ジピリダモール治療群の上皮完全性及び陰窩構造の改善を示した（各群ｎ＝３）。（Ｃ）免疫蛍光染色から明らかなように、ジピリダモール（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療したＤＳＳ誘発結腸炎マウス（各群ｎ＝３）では、結腸粘膜のＣＤ４１^＋クラスタが減少した。定量的な結果を右図に示す。５つの領域で結腸生検をカウントする。各ドットは１つの領域を表す。水平線は中央値を示す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（Ｄ）ジピリダモールで処理したマウスでは、結腸粘膜でのＴＮＦ－α発現はＤＳＳ群と比較して有意に低下する。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊Ｐ＜０．０５。（Ｅ）左図：ジピリダモール投与前後、同じ結腸部分の内視鏡像である。右の棒グラフはジピリダモール治療前後の９名の児童の血小板数（１０９／Ｌ）、内視鏡検査スコア、及び総臨床スコアを示している。（Ｆ）左図は免疫蛍光染色であり、ジピリダモール治療前後に結腸粘膜で活性化されたＥＲＫ（赤色）、ＡＴＦ１０１０ ２（赤色）、ＣＲＥＢ（赤色）がＣＤ３９（緑色）と共発現することを示している（ｎ＝３）。黄色は重なりを示す。右図は、ジピリダモール治療前（ｎ＝３）及び治療後（ｎ＝３）の結腸粘膜においてＣＤ３９と共発現、活性化されたＥＲＫ、ＡＴＦ２又はＣＲＥＢの細胞数である。５つの領域で結腸生検をカウントする。各ドットは１つの領域を表す。水平線は中央値を示す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｇ）免疫蛍光染色から明らかなように、ジピリダモールで治療した児童では、結腸粘膜におけるＣＤ３９発現は増加し、ＣＤ４１発現は減少する（ｎ＝７）。ドットの色は群を表す（黒色は対照群を表し、緑色は結腸炎を表し、青色は好酸性結腸炎を表し、赤色はＩＢＤＵを表す）。５つの領域で結腸生検をカウントする。各ドットは１つの領域を表す。水平線は中央値を示す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（Ｈ）免疫蛍光染色から明らかなように、ジピリダモールで治療した児童では、結腸粘膜のＣＤ６８＋マクロファージの存在量が低下し、ＴＮＦ－αの高発現が低下する（ｎ＝７）。ドットの色は群を表す（黒色は対照群を表し、緑色は結腸炎を表し、青色は好酸性結腸炎を表し、赤色はＩＢＤＵを表す）。５つの領域で結腸生検をカウントする。各ドットは領域を表す。水平線は中央値を示す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＣＤ３９^＋ＣＤ８Ｔ細胞（上図）及びＣＤ３９^＋Ｖδ１Ｔ細胞（下図）の浸潤頻度を比較した箱形図である。異なる色は異なる群を表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用してＰ値を計算する。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。

本発明に記載の胃腸疾患は、複数の消化管炎症性疾患の総称であり、例えば胃、十二指腸、小腸、結腸などの消化管に関するものであり、非感染性及び感染性胃腸疾患、例えば炎症性、アレルギー性、及び機能性胃腸疾患及び胃腸腫瘍などを含む。胃疾患は、例えば急性慢性胃炎、胃潰瘍、胃ポリープ、びらん性胃炎、消化性潰瘍、胃腫瘍、十二指腸腫瘍、胃間質腫、十二指腸間質腫などである。小腸疾患は、例えば小腸腫瘍、腸間膜リンパ節炎、間質性病変などである。結腸疾患は、例えば結腸炎、潰瘍性結腸炎、クローン病、腸結核、結腸ポリープ、結腸癌などの疾患である。

具体的には、炎症性胃腸疾患、例えば、炎症性腸疾患、結腸炎、未分化結腸炎、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性結腸炎（ＵＣ）、原因不明の炎症性腸疾患（Ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、急性結腸炎、慢性結腸炎、直腸炎など；胃腸炎、例えば、表層性胃炎、潰瘍性胃炎、慢性胃炎、慢性胃腸炎、食道狭窄、食道閉鎖、腸狭窄、腸閉鎖など；アレルギー性胃腸疾患、例えば食物アレルギーに起因する胃腸疾患、例えば好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎、食物蛋白誘導性小腸結腸炎症候群、食物蛋白誘導性腸疾患、食物蛋白誘導性直腸結腸炎、非特異性慢性結腸炎、壊死性小腸結腸炎、巨大結腸関連の術前術後炎症を含む。結腸炎、直腸炎、未分化結腸炎、クローン病、潰瘍性結腸炎、急性結腸炎、慢性結腸炎；機能性胃腸疾患が好ましい。上記胃腸疾患には、いずれも感染性のもの及び非感染性のものが含まれる。本発明では、非感染性胃腸疾患、例えば結腸炎、炎症性腸疾患例えばクローン病（ＣＤ）、潰瘍性結腸炎（ＵＣ）、原因不明の炎症性腸疾患、食物アレルギーに起因する胃腸疾患、例えば好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎、食物蛋白誘導性小腸結腸炎症候群、食物蛋白質誘導性腸疾患、食物蛋白質誘導性直腸結腸炎、非特異性慢性結腸炎、壊死性小腸結腸炎、巨大結腸関連の術前術後炎症が好ましく、炎症性腸疾患、例えば結腸炎（例えば未分化結腸炎）、直腸炎、クローン病、潰瘍性結腸炎、慢性結腸炎、急性結腸炎、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎がより好ましい。本発明では、結腸炎は、様々な形態の結腸炎をカバーすることを意図し、ＩＢＤはクローン病、潰瘍性結腸炎、未分化／原因不明のＩＢＤなどをカバーすることを意図している。

本発明では、胃腸疾患の患者又は被験者はいずれも年齢及び性別の制限がなく、児童、成人、高齢者であってもよい。児童、例えば新生児から１２歳、１～６歳などが好ましい。本発明の胃腸疾患治療薬の使用対象は、サル、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジやヤギなどの他の哺乳動物であってもよい。

本発明の治療には予防も含まれ、例えば、何らかの疾患に関連する要因のために発症のリスクが高いと予想されるが、まだ疾患を形成していない患者、又は疾患を形成しているが、自覚症状を有していない患者に本発明の医薬品を投与するか、又は疾患を治療した後に疾患の再発を恐れている患者に本発明の医薬品を投与する。

本発明者らは、結腸粘膜Ｔ細胞サブタイプを解析したところ、Ｔ細胞のＣＤ３９発現の低下が児童胃腸疾患などの胃腸疾患、例えば非感染性胃腸疾患の発症の重要な機序であることを見出した。本発明では、炎症性腸疾患に罹患している児童の生体組織標本を用いて結腸粘膜の単細胞トランスクリプトームのシーケンシングを行い、粘膜微小環境を構成する免疫細胞の特異的サブセットを説明する。生体情報解析をしたところ、ＣＤ３９^＋ＣＤ８Ｔ、ＣＤ３９^＋γδＴ、ＣＤ３９^＋ＮＫＴ（総称してＣＤ３９^＋ＩＥＴ、又はＣＤ３９^＋ＣＤ３Ｔ）細胞サブセットの減少は、血小板凝集とセロトニン蓄積を引き起こし、胃腸疾患、例えば非感染性胃腸疾患の発生を促進することを見出した。本発明者らは、ｃＡＭＰレベルが低下すると、ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＣＤ３９発現がダウンレギュレーションされ、血小板凝集及びセロトニン蓄積を誘発するという炎症性腸疾患のカスケード発症機序を見出した。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、ホスホジエステラーゼ阻害薬が胃腸疾患の治療に有用であること、例えば、炎症性腸疾患の児童患者などの患者へのこの新たな治療方向及び医薬品の用途を見出した。

さらに、本発明者らは、例えば炎症性腸疾患などの胃腸疾患において、ＴＮＦ－αを発現するマクロファージが結腸粘膜の下に大量で集まり、さらにこれらのマクロファージにＰＤＥ４Ｂが高度に発現することを見出した。ＰＤＥ４Ｂは細胞内ｃＡＭＰレベルを低下させるホスホジエステラーゼであり、ｃＡＭＰ濃度を低下させることによりＴＮＦ－αの発現を上昇させる。したがって、マクロファージにも損傷したｃＡＭＰ－反応経路による発症機序が存在する。

本発明では、ＤＳＳ誘発急性結腸炎モデルマウスにおいて、ホスホジエステラーゼ阻害剤であるジピリダモールを用いて治療を行う。この実験結果から明らかなように、ジピリダモールはｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で単球及びマクロファージにおいて細胞質ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ＴＮＦ－αの発現を抑制できる。さらに、ジピリダモールは腸炎マウスの結腸粘膜における血小板の凝集を効果的に抑制する。この実験結果は、結腸炎、ＩＢＤ、ＵＣ又はＣＤなどの胃腸疾患にジピリダモールを用いた治療が可能であることをサポートした。

具体的には、本発明は、上皮内Ｔ細胞（ＩＥＴ）の表現型を解析し、その結果、結腸炎、ＵＣ又はＣＤに罹患している患者では、ＣＤ３９を発現するＣＤ８Ｔｒｍ及びγδＴ細胞の存在量が減少し、このＣＤ３９^＋ＩＥＴの存在量の減少は、結腸粘膜における血小板凝集及び５－ヒドロキシトルプタミンの放出と関連している。本発明の実験から明らかなように、結腸炎、ＵＣ及びＣＤ児童患者におけるＣＤ３９^＋ＩＥＴの欠乏は、血小板凝集及び５－ヒドロキシトルプタミンの放出を介して結腸炎を悪化させる。この解析から明らかなように、ジピリダモールは、ｃ－ＡＭＰ－ＡＴＦ２－ＣＲＥＢ活性化に関連して、Ｔ細胞及びマクロファージにおけるＣＤ３９の発現を上昇させ、血小板凝集を抑制できる。

さらに、本発明は、ジピリダモールを用いた治療前後の結腸粘膜を比較する臨床試験を行った結果、ジピリダモールが複数の細胞欠陥を同時に標的化し、免疫恒常性を回復させ、臨床症状を改善できる。さらに、比較として、本発明では、現在結腸炎の臨床的治療法として用いられているメチルプレドニゾロン又は抗ＴＮＦ－αを用いた治療を行った患者の治療前後の結腸粘膜についても解析した。本発明では、メチルプレドニゾロンを用いて治療された炎症性腸疾患の患者の一部が、結腸粘膜の血小板凝集を有意に低下させることにより臨床状態を改善することを見出した。しかし、メチルプレドニゾロンによる治療はマクロファージの浸潤又はＴＮＦ－αの発現を変化させないため、一部の患者では薬物依存又は治療無効となっている。一方、抗ＴＮＦ－α抗体生物製剤を用いた治療は臨床症状を改善したが、ジピリダモールのように前記の種々の細胞性免疫不全を回復することはなかった。したがって、本発明のこれらの結果から明らかなように、従来のメチルプレドニゾロン又は抗ＴＮＦ－αのような治療方法では、炎症性腸疾患の患者において多因子免疫不全を回復する能力がなく、一方、本発明のホスホジエステラーゼ阻害剤であるジピリダモールはそのような治療効果が得られる。

よって、本発明は、胃腸疾患を治療するための医薬品（以下、本発明の胃腸疾患を治療するための医薬品と称することがある）及び方法を提供し、具体的には、以下のとおりである。

本発明は、ｃＡＭＰレベル及び／又はｃＧＭＰレベルを上昇させることによって胃腸疾患を治療することができる。例えば、医薬品の投与又はその他の適切な手段又は方法によって治療する。本発明のｃＡＭＰレベル及び／又はｃＧＭＰレベルを上昇させる医薬品及び方法は、ｃＡＭＰレベル及び／又はｃＧＭＰレベルを上昇させることができる限り、特に限定されない。ｃＡＭＰレベル及び／又はｃＧＭＰレベルを上昇させる医薬品（本明細書ではｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ促進剤とも呼ばれる）としては、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤及び／又はグアニル酸シクラーゼ活性化剤（アデニル酸シクラーゼ及び／又はグアニル酸シクラーゼ活性化剤と総称することもある）などが含まれるが、これらに限定されない。

本発明におけるホスホジエステラーゼ阻害剤の意味は、当技術分野において公知である。ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、細胞内のセカンドメッセンジャー（ｃＡＭＰ、環状アデノシンリン酸又はｃＧＭＰ、環状グアノシンリン酸）を加水分解し、細胞内ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを分解して、これらセカンドメッセンジャーによって伝達される生化学的作用を終了させる機能を有することが、当技術分野で知られている。ホスホジエステラーゼファミリーはＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０、ＰＤＥ１１などを含み、それぞれ多種のアイソザイムサブタイプを有し、例えば、ＰＤＥ４はＰＤＥ４Ａ、４Ｂ、４Ｃや４Ｄなどのサブタイプを含む。

本発明のホスホジエステラーゼ阻害剤は、選択的又は非選択的なホスホジエステラーゼ阻害剤を含む、前記ホスホジエステラーゼファミリーのいずれか１種又は複数種類に対して阻害作用を果たす医薬品を含む。ＰＤＥ１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ３阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ６阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤、ＰＤＥ８阻害剤、ＰＤＥ９阻害剤、ＰＤＥ１０阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤、又はファミリー中の複数のホスホジエステラーゼに対して阻害効果を有する阻害剤、及びホスホジエステラーゼファミリーの他のメンバーに対して阻害作用を有する医薬品などを含むが、これらに限定されない。ＰＤＥ３、及び／又はＰＤＥ４、及び／又はＰＤＥ５阻害作用を有する阻害剤などが好ましい。より好ましくは、ＰＤＥ５阻害剤である。

具体的には、本発明におけるホスホジエステラーゼ阻害剤は、ホスホジエステラーゼを阻害する作用を有するものであれば、特別な限定はなく、ニモジピン、ビンポセチン、ＩＣ８６３４０、ＩＣ２２４、ＥＨＮＡ、ＢＡＹ６０－７７５０、ＩＣ９３３、ジピリダモール、シロスタゾール、シロスタミド、ミルリノン、アミノリノン、エノキシモン、シグアゾダン、テオフィリン、ロリプラム、ピクラミラスト、ロフルミラスト、シロミラスト、アプレミラスト、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ザプリナスト、ウデナフィル、ＢＲＬ－５０４８１、ＩＣ２４２及び計算機シミュレーションに基づいて発見されたキナゾリン類及びチアジアゾール類小分子化合物Ｓ１４又はＶＰ１．１５などが知られている。本分野では、ＰＤＥ阻害剤、特にＰＤＥ５阻害剤として、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ザプリナスト、ジピリダモールなどが知られている。

さらに、アデニル酸シクラーゼ活性化剤及び／又はグアニル酸シクラーゼ活性化剤の意味が当技術分野で知られている。アデニル酸シクラーゼ、略してＡＣは内在性膜タンパク質であり、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換し、細胞のシグナル応答を引き起こすことができる。グアニル酸シクラーゼ、略してＧＣはＧＴＰを触媒してｃＧＭＰを産生することができる。アデニル酸シクラーゼ活性化剤及び／又はグアニル酸シクラーゼ活性化剤は、本発明に記載された胃腸疾患の免疫発症機序に関して、ｃＡＭＰレベル及び／又はｃＧＭＰレベルを上昇させ、胃腸疾患を治療することができる。

また、本発明における抗血小板薬は、抗血小板作用を有するものであれば、特に限定はない。例えば、血小板の活性化増幅に影響する医薬品、血小板凝集を抑制する医薬品などを含むが、これらに限定されない。例えば、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）阻害剤、チエノピリジン類及び非チエノピリジン類を含むアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）Ｐ２Ｙ１２受容体拮抗剤、トロンビン受容体拮抗剤、５－ヒドロキシトルプタミン（５－ＨＴ）受容体拮抗剤、血小板糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＰ）ｌＩｂ／ＩＩＩａ受容体阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤類である。具体的には、アスピリン、チクロピジン（Ｔｉｃｌｏｐｉｄｉｎｅ）、クロピドグレル（Ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）、プラスグレル（Ｐｒａｓｕｇｒｅｌ）、テカグレル（Ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒ）、カングレロール（Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ）、チカグレロル（Ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒ）、Ｖｏｒａｐａｘａｒ（ＳＣＨ－５３０３４８）、Ａｔｏｐａｘａｒ（Ｅ５５５５）、サルポグレラート（Ｓａｒｐｏｇｒｅｌａｔｅ）、シタロプラム（Ｃｉｔａｌｏｐｒａｍ）、アブシキシマブ、チロフィバン、ジピリダモール、シロスタゾールなどである。

本発明は、好ましくは、以下の形態である。

本発明では、好ましくは、ジピリダモールは結腸炎、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病などの炎症性胃腸疾患の治療、及びその医薬品の製造に用いられる。

本発明好ましくは、ジピリダモールは、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎などのアレルギー性胃腸疾患の治療、及びその医薬品の製造に用いられる。

本発明では、好ましくは、ＰＤＥ５阻害剤は、結腸炎、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病などの炎症性胃腸疾患の治療、及びその医薬品の製造に用いられる。

本発明では、好ましくは、ＰＤＥ５阻害剤は、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎などのアレルギー性胃腸疾患の治療、及びその医薬品の製造に用いられる。

本発明では、好ましくは、抗血小板薬は、結腸炎、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病などの炎症性胃腸疾患の治療、及びその医薬品の製造に用いられる。

本発明では、好ましくは、抗血小板薬は、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎などのアレルギー性胃腸疾患の治療、及びその医薬品の製造に用いられる。

これらのうち、前記疾患は感染性又は非感染性である。

当業者が理解できるように、本発明に記載の胃腸疾患を治療する個々の医薬品の活性成分の形態は、限定されるものではなく、活性化合物自体、遊離状態、その塩、エステル、異性体、旋光異性体、立体異性体、位置異性体、幾何異性体、水和物、非水和物、溶媒和物又は非溶媒和物、非定型、結晶、薬用共結晶又は共結晶塩、誘導体、前駆体医薬品などの各種形態であってもよい。前駆体医薬品は、生体内に含まれ、生理的条件下で、酵素、胃酸などの反応により前記活性成分に変化することができ、すなわち、酵素による酸化、還元や加水分解などにより活性成分に変化することができる化合物、胃酸などにより加水分解などを通じて活性成分に変換できる化合物である。共結晶又は共結晶塩とは、２種又は複数種類の具体的な物質から構成される結晶性物質を指し、室温では、各物質は固体であり、それぞれ異なる物理的性質（例えば、構造、融点、溶融熱、吸湿性、溶解度、安定性など）を有する。共結晶及び共結晶塩は、公知の共結晶法を用いて製造することができる。

例えば、本発明におけるホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ジピリダモール）の活性成分、活性成分の形態は制限されるものではなく、活性化合物自体、遊離状態、塩、エステル、異性体、旋光異性体、立体異性体、位置異性体、幾何異性体、水和物、非水和物、溶媒和物又は非溶媒和物、非定型、結晶体、薬用共結晶又は共結晶塩、誘導体、前駆体医薬品などの各種形態であってもよい。

本発明では、活性成分が塩である場合、そのような塩の例としては、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが含まれる。金属塩の好ましい例としては、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩など；アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など；アルミニウム塩が含まれる。有機塩基との塩の好ましい例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、メチルピリジン、２,６－ジメチルピリジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミンなどの有機塩基との塩が含まれる。無機酸との塩の好ましい例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が含まれる。有機酸との塩の好ましい例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が含まれる。塩基性アミノ酸との塩の好ましい例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどの塩基性アミノ酸との塩が含まれる。酸性アミノ酸との塩の好ましい例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩が含まれる。

これらのうち、薬学的に許容される塩が好ましい。例えば、活性成分が酸性官能基を含む場合、その例として、無機塩、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩などが含まれ、化合物が塩基性官能基を含む場合、その例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などの無機酸との塩；例えば酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が含まれる。

例えば、本発明のホスホジエステラーゼ阻害剤、抗血小板薬中の活性成分は、遊離形態、塩形態、エステル形態、及び他の様々な誘導体、プロドラッグなどの修飾形態であってもよく、例えば、ジピリダモールの場合、遊離形態、エステル、塩、誘導体、プロドラッグなどの修飾形態であってもよい。

本発明に記載の胃腸疾患を治療する医薬品の活性成分、例えばｃＡＭＰレベル及び／又はｃＧＭＰレベルを上昇させる医薬品、及び抗血小板医薬品の活性成分は、その活性化合物自体、又は活性化合物と薬学的に許容される担体との混合物の形態で投与することができる。

薬学的に許容される担体として、製剤原料としてよく使用されている各種の有機又は無機担体物質を使用することができ、特に限定されるものではなく、固体製剤中の賦形剤、潤滑剤、接着剤、崩壊剤；液体製剤中の溶剤、可溶化剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、鎮痛剤などの形態で配合してもよい。また、必要に応じて防腐剤、酸化防止剤、安定剤、着色剤、甘味料などの製剤添加物を使用することもできる。

本発明の胃腸疾患を治療する医薬品の製剤形態は特に限定されるものではなく、非経口投与用又は経口投与用の医薬品として、例えばリポソーム又はエキソソームで包み込まれた形態で使用することができる。本発明の医薬品は、散剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤などの固形製剤、又はシロップ剤又は乳剤などの液剤のいずれであってもよい。胃腸疾患を治療する医薬品は、以下の形（例えば、静脈内、筋内、皮下、器官内、鼻内、皮内、点滴剤、脳内、直腸内、膣、腹膜内、腫瘍内部、腫瘍近位端、病変部など）で安全に与えることができる：錠剤（糖衣錠、膜コーティング錠剤、舌下錠剤、口腔崩壊錠、頬トローチなどを含む）、丸薬、粉剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、錠剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、放出制御製剤（例えば、即時放出製剤、徐放性製剤、徐放性マイクロカプセル）、エアゾール剤、膜剤（例えば、口腔内崩壊膜剤、口腔粘膜貼付剤）、注射剤（例えば、皮下注射、静脈注射、筋内注射、腹膜内注射）、静脈内輸液、経皮吸収製剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、貼付製剤、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）、薬粒、鼻製剤、肺製剤（例えば、吸入剤）、点眼剤など。

本発明の医薬活性成分の医薬組成物中の含有量は、本発明の化合物の剤形、用量などによって変化する。例えば、含有量は約０．１～１００ｗｔ％の範囲である。

本発明における胃腸疾患例えば非感染性胃腸疾患を治療する医薬品の投与量は、治療有効量である限り、特に限定されない。本明細書において、用語「治療有効量」とは、対象に対して治療効果をもたらす量を意味し、例えば、その量が投与された対象において、その量が投与されていない対象と比較して、疾患の症状又は状態が緩和、軽減、又は除去されたり、疾患の症状又は状態の進行が遅延又は抑制されたりする。治療有効量は医師が対象者の年齢、体重、性別及び症状の重症度などに応じて適切に判定することができる。例えば、児童の場合、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１～５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、３～２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを１日１回から数回投与する。

本発明の胃腸疾患を治療する医薬品は、他の医薬品と併用してもよい。前記他の医薬品は、例えば、抗アテローム性動脈硬化薬、抗血栓薬、抗心不全薬、抗不整脈薬、抗高血圧薬、糖尿病治療薬、糖尿病の合併症を治療する薬、ＨＤＬを高める薬、抗高脂質血症薬、抗肥満薬、利尿剤、消炎剤、抗痛風薬、化学治療薬、免疫治療薬例えば抗ＴＮＦα薬、ホルモン類例えばグルココルチコイド薬、骨粗鬆症薬、抗痴呆薬、勃起機能障害改善薬、尿失禁治療薬や排尿困難治療薬である。これらの他の医薬品は、低分子化合物又は高分子タンパク質、ポリペプチド、抗体、ワクチンなどであってもよい。

本発明の胃腸疾患を治療する医薬品及び前記他の医薬品の投与時間に限定はなく、同時に又は交互に患者に投与することができる。他の医薬品の用量は、臨床状態で使用された用量に基づいて適切に決定することができ、投与患者、投与経路、標的疾患、症状、併用薬などに応じて適切に決定することができる。

本発明は胃腸疾患の診断方法を提供し、該方法は、例えば、Ｔ細胞のＣＤ３９発現及び／又は血小板数を検出し、ＣＤ３９発現が低下し、及び／又は血小板数が増加すれば、陽性と判断することを含む。

本発明は、胃腸疾患の診断方法をさらに提供し、該方法は、例えば、患者又は被験者の腸粘膜におけるＴ細胞のＣＤ３９発現、及び／又は血小板の凝集、及び／又はＴＮＦ－α及び／又はＰＤＥ４Ｂを発現するマクロファージの浸潤を検出し、ＣＤ３９発現が低下し、及び／又は血小板数が増加し、及び／又はＴＮＦ－αの発現が上昇すれば、陽性と判断することを含む。

本発明は、胃腸疾患を診断するためのキットを提供し、該キットは、例えば、Ｔ細胞のＣＤ３９発現が低下したか否かを検出する試薬、及び／又は血小板数が低下したか否かを検出する試薬を含む。

本発明は、胃腸疾患を診断するためのキットを提供し、該キットは、例えば、Ｔ細胞のＣＤ３９発現を検出する試薬、及び／又は血小板凝集を検出する試薬、及び／又はＴＮＦ－α及び／又はＰＤＥ４Ｂを発現するマクロファージの浸潤を検出する試薬を含む。

本発明は、胃腸疾患の予防又は治療方法を提供し、該方法は、有効量のｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ促進剤、及び／又は抗血小板薬を患者に投与することを含む。

本発明の診断、治療方法又はキットに記載の胃腸疾患は、炎症性胃腸疾患、アレルギー性胃腸疾患、及び機能性胃腸疾患から選ばれることが好ましい。

本発明の診断、治療方法又はキットに記載の胃腸疾患は、結腸炎、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病、好酸球性結腸炎、非好酸球性結腸炎から選ばれることが好ましい。

本発明の診断、治療方法又はキットに記載の胃腸疾患は、非感染性胃腸疾患であることが好ましい。

本発明の診断、治療方法又はキットに記載の胃腸疾患の患者は、児童が好ましい。

以下、実施例を参照して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１．結腸炎と対照児童の結腸粘膜の細胞の単細胞シークエンシングと生体情報解析

Ｉ．研究計画：
（１）対照児童と非感染性胃腸疾患の児童の結腸粘膜組織を取得し、単細胞懸濁液を取得する。
（２）表面染色後、フローサイトメーターを用いてＴ、Ｂ、非ＴＢリンパ球、及び非リンパ球の４つのサブセットを選別する。
（３）各細胞サブセットの単細胞トランスクリプトーム解析を行う。
（４）単細胞シークエンシングの結果、免疫細胞サブセットのクラスタ特徴を解析し、結腸粘膜免疫細胞の組成及び転写特徴を確立する。
（５）シグナル経路濃縮解析により、細胞サブセットの特異的な機能特徴を決定する。細胞タイプが特異的に高発現する転写因子を同定し、遺伝子発現レベルとの関連解析により、転写因子制御ネットワークを構築し、非感染性胃腸疾患の感受性遺伝子と、単細胞シークエンシングにより得られた免疫細胞サブタイプの転写特徴とを対応付け、感受性遺伝子の影響を受ける免疫及び非免疫細胞サブタイプを確立する。

II．実験方法
（１）臨床サンプル（結腸粘膜と末梢血）の採取
結腸鏡により非感染性胃腸疾患（非好酸球性結腸炎と好酸球性結腸炎はそれぞれ６７例、２３例）に罹患している児童、及び対照児童２８例の結腸粘膜を採取し、次の表のように群分けした。各群の児童は回盲部、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸及び直腸粘膜からそれぞれ１つの組織片（約１ｍｍ×１ｍｍ×３ｍｍ）を採取した。同時に、当該児童の抗凝固末梢血（約３ｍＬ）を採取して使用に備えた。上述の採取過程はすでに広州市婦人児童医療センターの臨床研究倫理審査に承認された。結腸ポリープ切除を必要とし、腸内視鏡、病理所見ともに正常な児童を対照児童とした。

（２）結腸粘膜単細胞の抽出
結腸粘膜をはさみで細断し、その後、組織を６ｍｌの消化液（１０％ウシ胎児血清アルブミン＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン＋１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ１Ａ＋１０Ｕ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼを含むＲＰＭＩ１６４０）を入れた遠心管に移し、水平に振とうさせ（１８０ＲＰＭ、３０分、３７℃）、７０μｍフィルタでろ過し、遠心分離し（９００×ｇ、５分）、沈殿を収集して使用に備えた。
（３）Ｔ細胞の表現型解析
（２）で処理した細胞を６０μＬフローサイトメトリー抗体溶液に浸してインキュベートし（２０分、氷上）、その後、ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清アルブミン＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１回洗浄し、最終的にＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＰＩ含有）中の細胞を、フローサイトメーターで検出した。
（４）単細胞選別及び５’,３’トランスクリプトームのライブラリー構築
結腸粘膜を採取し、本節の方法（２）に従って結腸粘膜の単細胞を抽出し、抗体（ＣＤ１９－ＡＰＣ、ＣＤ４５－ＡＰＣ－ｃｙ７、ＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－ＢＶ７１１、ＣＤ８α－ＢＶ７８５、ＣＤ８β－ＢＶ５１０、γδＴ－ＰＥ、ＣＤ２５－ＰＥｃｙ７、ＣＤ３９－ＢＶ４２１、ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ６０５、ＰＤ１－ＢＶ６５０）をインキュベートした後、フローサイトメトリーにより選別して、事前にＰＢＳ（５％ＦＢＳ含有）をインキュベートしたＥＰ管に入れて、選別及びライブラリー構築の具体的な手順について以下の表を参照する。

得られた細胞についてトリパンブルーを用いて生細胞カウントを行い、その後、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｈｒｏｉｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’ライブラリー構築キットを用いて単細胞ライブラリーの構築を行った。具体的には、キットの取扱書に従って操作し、単細胞懸濁液をＲＴ－ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘと混合した後、特定の単細胞処理チップにナノスケールの架橋ミクロスフェアと分離油を同時にロードした。次に、特定のタグを付加した個々の単細胞のＲＮＡを逆転写し、生成したｃＤＮＡを精製、増幅、末端修復、そしてＩｌｌｕｍｉｎａの特定のリンカーを付加し、それにより、単細胞トランスクリプトームライブラリーの構築に成功した。また、これに加えて、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｖ（Ｄ）Ｊライブラリーキットを用いてＴＣＲとＢＣＲのライブラリーを増幅した。最終的に、上記のライブラリーはＩｌｌｕｍｉｎａ Ｘ Ｔｅｎを用いてシーケンシングを行った。
（５）上皮内Ｔ細胞表現型の解析及び因子検出
新鮮な結腸粘膜を生理食塩水に一晩放置し、ＡＴＰ、ＡＤＰ又はＡｄｅｎｏｓｉｎｅを検出する検出キット（Ａｂｃａｍ）及びセロトニン検出キット（Ａｂｃａｍ）を用いて上清中の対応する因子の濃度を検出した。結腸粘膜をはさみで細断した後、消化液（５％ウシ胎児血清アルブミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭジチリトール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で１８０ＲＰＭ、３７℃で振とうし、４０分間インキュベートし、その後、７０μｍフィルタを通して単細胞懸濁液を得た。抗体染色（ＣＤ４５－ＡＰＣ－ｃｙ７、ＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ８ａ－ＢＶ７８５、ＣＤ４－ＢＶ７１１、Ｖｄ１－ＰＥ、Ｖｄ２－ＡＰＣ、ＣＤ２５－ＰＥ－ｃｙ７、ＣＤ１２７－ＰＥ^＊Ｄａｚｚｌｅ５９４、Ｄ３９－ＢＶ４２１、ＣＤ６９－ＢＶ５１０、ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ６０５、及びＰＤ１－ＢＶ６５０）及びフローサイトメトリーにより表現型を解析した。
（６）体外血小板放出セロトニン検出実験
結腸炎に罹患している児童又は健康な児童の体内から静脈血４ｍＬを採取し、クエン酸ナトリウムを用いて抗凝固を行った。全血２５０ｇを２５℃で１５分遠心分離して、血小板を豊富に含む層を得て、これを１００ｎＭプロスタグランジンＥ１を含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に入れて更に１５００ｇを５分遠心分離し、血小板沈殿をＨＢＳＳに分取し、濃度を１０^９～１０^１０／ｍＬとし、３７℃と５％ＣＯ２の条件で一晩インキュベートし、遠心分離後、セロトニン検出キットを用いて上清を検出した。
（７）免疫蛍光解析
ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋したパラフィンブロックを利用して、３μｍの組織切片を作製し、脱蝋し、抗体（５％正常なロバや羊血清と０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）でブロックし、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、４Ｃダークウェットボックスで一次抗体（ＣＤ３９、ＣＤ４１、ｐＴ７１－ＡＴＦ２又はｐＳ１３３－ＣＲＥＢ）を一晩インキュベートした。次に、ＰＢＳ洗浄後、室温で二次抗体（ヒツジ抗マウスＩｇＧ１結合ＡＦ４８８及びヒツジ抗ウサギＩｇＧ結合Ｃｙ３）を１時間インキュベートした後、ＤＡＰＩを含有するクエンチ防止剤をインキュベートした。その後、ライカ製全自動倒立蛍光顕微鏡で観察及び撮影（２０×０．７５）を行い、ライカ製Ｘ ｉｍａｇｅ解析ソフトを用いて画像の明るさ、光度、コントラストやカラーバランスの処理を行い、原画像をできるだけ回復させた。観察条件ごとに各粘膜切片から４～５個の領域をランダムに選択して観察し、ライカ製Ｘ ｉｍａｇｅ解析ソフトを用いてＣＤ４１の凝集（蛍光径は７μｍを超える）を測定してカウントした。

ＩＩＩ．試験結果
図１に示すように、この単細胞シークエンシング技術により、結腸炎に罹患している児童及び対照児童の結腸粘膜（ａ）の細胞について単細胞シークエンシング及び生体情報解析をしたところ、合計１７個のＴ及びＮＫサブセット（ｂ）が発見された。このうち、ＥＮＴＰＤ１（タンパク質ＣＤ３９をコードする）を発現するＩＥＴは結腸炎患者で有意に低下した（ｃ）（図ｃでは、各群の棒グラフにおいて、左側は対照群、右側は結腸炎群を表す）。ＥＮＴＰＤ１－ＣＤ８Ｔ細胞は特定の分化特徴を持つ免疫保護性細胞サブタイプ（ｄ）であり、その分化がｃＡＭＰ／ｃＧＭＰのセカンドメッセンジャーによって制御され、ｃＡＭＰ応答経路及びＥＲＫ経路を濃縮した（ｅ）。ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰセカンドメッセンジャー経路の誘導は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤又はＡＭＰ／ＧＭＰシクラーゼ活性化剤によって行うことができる。
さらに、図２に示すように、結腸炎に罹患している児童におけるＣＤ８及びγδＴ－ＥＮＴＰＤ１細胞の減少率を図２に示した。ここで、図（ａ）～（ｃ）は、血液及び結腸上皮内Ｔ細胞（ＩＥＴ）におけるゲーティング戦略及び表面マーカータンパク質分子の発現を示している。図（ｄ）は対照被験者と結腸炎又は好酸球性結腸炎に罹患している児童の指定ＩＥＴの割合を示している。結腸炎に罹患した児童では、ＣＤ３９^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞、特にＣＤ３９^＋メモリＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ３９^＋ｍＣＤ８Ｔ）とＣＤ３９^＋γδＴ細胞（Ｖδ１＋）の割合が有意に低下した。ＥＮＴＰＤ １^＋ＣＤ８及びγδＴ欠損は児童結腸炎の発症機序と関連していることを示唆した。

実施例２．ジピリダモールによる児童結腸炎治療の臨床実験及び評価
実施例１に記載の患者、すなわち非好酸球性結腸炎及び好酸球性結腸炎がそれぞれ６７例及び２３例の児童、並びに、対照児童２８例の結腸粘膜について以下の検討を行った。患者の状況は表３を参照する。

結腸粘膜におけるＣＤ３９発現の低下が、ＡＴＰ及びＡＤＰの蓄積を促進することにより炎症を悪化させるか否かについて検討した。まず、Ｔ細胞でのＣＤ３９の発現と、一夜に保存された結腸生検組織から排出されるＡＴＰ及びＡＤＰとを関連付けた。このような場合、ＡＴＰは検出できなかった。しかし、ＣＤ３９の発現低下はＡＤＰの濃度上昇に対応している（図３ａ）

ＡＤＰは血小板のアゴニストであり、そのセロトニンの蓄積及び分泌はマウスにおける医薬品誘導アレルギー反応の重症度に対応している（Ｂｅｕｔｉｅｒら,２０１８）。結腸炎に罹患している児童の生体組織からの放出物では、ＡＤＰとセロトニンの濃度は正の相関を示した（図３ａ）。結腸炎に罹患している児童の末梢血から分離された血小板は、対照被験者よりもセロトニンを多く分泌した（図３ｂ）。結腸生体組織検査の免疫蛍光染色は、対照及び結腸炎の被験者でＣＤ３９発現及び血小板凝集（ＣＤ４１＋クラスタで測定）が負の相関を示し、結腸炎の児童患者ではＣＤ４１クラスタの数が有意に増加したことを示した（図３ｃ）。

以下、ｃＡＭＰ活性化経路がＴ細胞におけるＣＤ３９の発現を調節するか否かを検討した。試験には、ジピリダモール（ＰＤＥ阻害薬の一種でありながら、一般的な抗血小板薬の一種）を用いた。ジピリダモールは３～５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量で８～１２週間投与した。この臨床試験は広州市女性児童医療センター倫理審査委員会の同意を得て、中国臨床実験登録センターに登録された（ＣｈｉＣＴＲ１８０００１９８０３）。すべての患者又は家族がインフォームド・コンセントに署名した。

ジピリダモールの治療結果を表５に示す。

その結果、ジピリダモールはＣＤ８＋Ｔ細胞活性化期間中のＣＤ３９発現を用量依存的に有意に増加させることが示された。ジピリダモールはｃＡＭＰ反応経路を活性化することによりＣＤ３９発現を回復させることができる。以上の結果から、ジピリダモールはＣＤ３９の発現を標的に上昇させ、血小板活性を低下させることで、児童結腸炎を改善できると推定された。

ジピリダモールで治療したところ、不良反応の報告はなく、臨床重症度スコアは著しく低下し、しかも結腸内壁も著しく改善し（図３ｄ）、さらに、免疫蛍光実験から、ジピリダモールはＣＤ８、ＣＤ４Ｔ細胞及びマクロファージにおけるＣＤ３９の発現を増加させたが、一方、粘膜における血小板凝集は低下したことが示された（図３ｆ）。また、共局在活性化転写因子ＡＴＦ２とＣＲＥＢもＣＤ３９の発現上昇に伴って上昇し（図３ｇ）、この結果はジピリダモールがｃＡＭＰシグナル経路を介してＣＤ３９のアップレギュレーション発現を促進する可能性をサポートした。

本発明者らはまた、内視鏡により確認された結腸炎被験者と原因不明のＩＢＤ（ＩＢＤＵ）の被験者について臨床試験研究を行った（表６）。ジピリダモールの投与量は３～５ｍｇ／ｋｇ／日であり、８～１２週間持続した。明らかな副作用は報告されていない。ジピリダモール使用前後では、内視鏡検査で粘膜の治癒を評価したところ、ジピリダモール治療後、臨床的、内視鏡的、及び組織学的重症度スコアは有意に改善した（図７Ｅ、表６）。免疫蛍光染色により、ジピリダモールがＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞及びマクロファージにおけるＣＤ３９の発現を増加させることが確認された（図６Ａ）。活性化されたＡＴＦ２とＣＲＥＢ及びＣＤ３９との共発現の強化は、ｃＡＭＰ濃度を増加させてＣＤ３９の発現を促進するという考え方と一致している（図７Ｆ）。その結果、ジピリダモールは血小板凝集を有意に低下させた（図７Ｇ）。さらに、治療後、マクロファージ浸潤とＴＮＦ－α発現も有意に低下した（図７Ｈ）。さらに、図４に示すように、対照被験者と比較して、結腸炎患者では、高度炎症性のマクロファージや樹状細胞（ＤＣ）の浸潤が認められた。

表６において、ＰＬＴは血小板数、ＨＧＢはヘモグロビン、ＡＬＢはアルブミンを表す。

実施例３
ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム、ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ）－誘発急性結腸炎モデルにおけるジピリダモールの作用

マウス
６～８週齢の雄マウスとしてＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２０～２２ｇ）を広州中医薬大学から購入した。実験前にマウスに通常の食物と水を与えた。すべての研究で体重がマッチしたマウスを用いた。動物研究は広州医科大学動物保護利用委員会（許可番号：２０１９－４７１）の承認を得ており、機関ガイドラインに従って行われている。

ＤＳＳ－誘発急性結腸炎
マウスを１日２回、ジピリダモール（１０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又は溶媒（２％ＤＭＳＯ、１０％エタノール、８８％コーンオイル）で３日間前処理した後、ＤＳＳ（３６,０００－５０,０００ ＭＷ）、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）をマウスの飲水（３％）に９日間添加した。対照マウスに通常の食物及び水を与えた。マウスを毎日モニタリングし、体重が２０％以上減少すると、安楽死を実施した。
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色では、結腸を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に２４時間固定しパラフィンに包埋した。切片（３μｍ）を用意し染色前に脱ろうした。
結腸切片における血小板凝集を検出するために、組織を４％ＰＦＡで２４時間固定し、３０％ショ糖で４８時間凍結保護（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）した後、最適切断温度（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．）化合物に包埋した。冷凍切片（５μｍ）を洗浄し、１０％ヤギ血清でブロックし、抗マウスＣＤ４１－ＦＩＴＣ（１３３９０３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。
ＰＢＳで洗浄して未結合抗体を除去した後、ＤＡＰＩを有するＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ退色防止固定媒体（Ｈ－１２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、米国）で固定して核染色を行った。前述のとおり免疫蛍光染色及び画像処理を行った。血小板凝集体はＣＤ４１^＋クラスタ（直径＞７μｍ）と定義した。Ｌｅｉｃａ Ｘ画像解析ソフトウェア（ドイツ・ハンブルクのＬｅｉｃａ）とＩｍａｇｅＪソフトウェア（メリーランド州国立衛生研究所）を使用して、ＣＤ４１^＋クラスタ数を平方ミリメートルあたりカウントし、解析した。結腸切片ごとにランダムに選択された５つの領域の血小板凝集を記録した。
サイトカインの発現を解析するために、結腸中の残留腸間膜脂肪を除去し、重量を秤量してＰＢＳ １ｍＬを用いて単細胞懸濁液に分散させた。４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を採取しＥＬＩＳＡによりＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の濃度を測定した。

ＤＳＳ結腸炎モデルにおける免疫細胞のＣＤ３９発現
結腸免疫細胞におけるＣＤ３９発現を測定するために、図５Ａに示すように、溶媒、低用量ジピリダモール（５ｍｇ／ｋｇ）又は高用量ジピリダモール（５０ｍｇ／ｋｇ）でマウスを８日間処理した。治療の翌日から、飲水（２．５％）にＤＳＳを７日間添加した。対照マウスに通常の食物及び水を与えた。
結腸免疫細胞を解析するために、本発明では、結腸を採取して、余分な脂肪を除去した。冷たいＰＢＳで洗浄した後、結腸を約０．３～０．５ｃｍの長さに切断した。解離溶液（Ｃａ／Ｍｇを含まないＨＢＳＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡと２％ＦＢＳを含有）中で３７℃で穏やかに４０分間回転させた後、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）を沈殿させ、洗浄して染色緩衝液（ＰＢＳ２％ＦＢＳ）に再懸濁させた。
残りの未消化の結腸組織サンプルを消化液（２％ＦＢＳ、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ、０．４Ｕ／ｍＬディスパーゼ、及び１μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅを含有するＲＰＭＩ１６４０）中で３７℃で４５分間穏やかに回転させた。固有層リンパ球（ＬＰＬ）を沈殿させ、洗浄して染色緩衝液に再懸濁させた。細胞懸濁液の等分試料をＴ細胞プレート（ＣＤ４５－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ３－ＢＶ７１１、ＣＤ３９ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ８－ＢＶ７８５、γδＴ－ＢＶ４２１、及びＣＤ４－ＡＰＣ）又は髄テンプレート（ＭＨＣ ＩＩ－ＢＶ５５０、ＣＤ１１ｂ－ＢＶ５１０及びＣＤ３９－ＰＥ－Ｃｙ７）を用いて氷上で３０分間染色した後、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＳＯＲＰフローサイトメーター（ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にて解析した。
その結果、ジピリダモールで治療したマウスでは、結腸上皮内ＣＤ４、ＣＤ８及びγδＴ細胞は、ＣＤ３９発現が用量依存的に著しく増加することを見出した（図５参照）。ジピリダモールを用いたマウスは、ＤＳＳのみで処理したマウスと比較して、体重及び結腸長が有意に増加し、上皮の完全性及び構造が改善され、血小板凝集及びＴＮＦ－αの発現が低下した（図７Ａ～Ｄ参照）。

実施例４
メチルプレドニゾロン（Ｍｅｄｒｏｌ）若しくは抗ＴＮＦ－α薬（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）による結腸炎又はＩＢＤの治療
通常の処方療法を受けている児童と比較するために、本発明では、メチルプレドニゾロン（ｎ＝５、１日１～１．５ｍｇ／ｋｇ児童で、２～４週間継続してから、治療を受けて８～１２週間まで継続して投与量を減少させた）又は抗ＴＮＦ－α抗体（ｎ＝６、０、２、及び６週間に５～１０ｍｇ／ｋｇ、それ以降８週間ごとに１回、１～２年間継続）を投与した児童の結腸生検を解析した。メチルプレドニゾロン治療前後４～７カ月、抗ＴＮＦ－α抗体治療前後３～６カ月後に生検を行った。
実験の結果、図６Ｃに示すように、メチルプレドニゾロンは結腸粘膜での血小板凝集を有意に低下させたが、ＣＤ３９又はＴＮＦ－αの発現を変化させなかった。また、血小板凝集に対するメチルプレドニゾロンの効果は、本発明で記載されている、血小板凝集を標的とすると、児童患者における結腸炎又はＩＢＤの症状を軽減できることをサポートしている。
抗ＴＮＦ－α治療に関しては、結腸内視鏡検査では、結腸の外観を改善するが（図６Ｂ）、マクロファージ、Ｔ細胞又は血小板に関する複数の免疫不全の回復には効果がなかった（図６Ｃ）ことが示されている。
以上の実験から明らかなように、ジピリダモールは多種の免疫不全を同時に標的とすることにより、結腸の免疫恒常性を改善することができる。したがって、このようなｃＡＭＰ経路に対する活性を有する医薬品は、結腸炎やＩＢＤなどの胃腸疾患に罹患している児童又は成人に幅広く応用することができる。一方、メチルプレドニゾロン単独又は抗ＴＮＦ－α薬のような医薬品では、本発明に記載のジピリダモールのような作用は得られない。
本発明の様々な実験を総合すると、少なくとも以下の免疫学的な結果が示される。
治療されていない患者に対して、本発明の図１Ｃ、図２Ｄ、図８はＣＤ３９ ＩＥＴの減少を反映しており、図３Ｃ、図３Ｆ、図７Ｃ、図７Ｇは患者中の血小板凝集を反映しており、図４Ａ、図４Ｃ、図７Ｄ、図７Ｈは患者のマクロファージ浸潤、ＰＤＥ４Ｂの高度発現、ＴＮＦの高度発現を反映し、図１Ｃ、図１Ｅ、図４Ａは患者のｃＡＭＰの減少を反映し、
ジピリダモール治療後は、図５、図６Ａ、図７Ｆ、図７Ｇはジピリダモール治療後のＣＤ３９増加を反映し、図７Ｃ、図７Ｇは治療後の血小板低下を反映し、図７Ｈ、図４Ｂは治療後のマクロファージ低下、ＰＤＥ４Ｂ抑制、ＴＮＦ－α抑制を反映し、図４Ｂは治療後のｃＡＭＰの増加を反映し、
メチルプレドニゾロンの効果（図６Ｂ～Ｃ）に関しては、図６Ｃは、ＣＤ３９ＩＥＴ、マクロファージ浸潤、ＰＤＥ４Ｂ、ＴＮＦ－αでは効果はないが、血小板凝集抑制には有効であることを反映し、
抗ＴＮＦ－αの治療効果（図６Ｂ～Ｃ）に関しては、図６Ｃは、ＣＤ３９ＩＥＴ、血小板、マクロファージ浸潤などに効果がないことを反映している。
以上のように、本発明は、ＣＤ３９＋ＩＥＴの欠乏が、結腸炎患者のサブセットにおける血小板凝集及び免疫発症機序に関連しており、児童の非感染性胃腸疾患の診断及び治療のためのバイオマーカーとして有用であることを見出した。ジピリダモールなどのホスホジエステラーゼ阻害剤は、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰレベルを上昇させ、ＣＤ３９＋ＩＥＴを改善し、種々の免疫不全を改善することにより、免疫恒常性を達成することができる。以上の結果からは、ジピリダモールがこの経路を標的として児童結腸炎を改善し、この疾患の治療に新しい考え方を提供することが明らかになる。また、本発明は、抗血小板凝集、例えばジピリダモール、メチルプレドニゾロンの投与により胃腸疾患を治療できることを見出した。

本発明は、本発明の範囲から逸脱しない様々な態様の変更をその範囲に含む。さらに、当業者にとって明らかに発明の変形であると考えられるすべての場合は、発明の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

本発明は胃腸疾患の発症機序を系統的に検討し、胃腸疾患の患者において、高度炎症性マクロファージの浸潤、ＣＤ３９^＋ＩＥＴの欠乏及び血小板凝集の欠陥が存在し、欠陥ｃＡＭＰ反応経路は共通の機序として作用する。この機序の発見は、胃腸疾患の医薬品に新たな考え方を提供する。さらに、本発明は、この機序を標的とし、ＰＤＥ阻害剤であるジピリダモールを用いて胃腸疾患の患者を治療することで、従来の治療薬であるメチルプレドニゾロン又は抗ＴＮＦ－α薬よりも優れた治療効果を得る。

Claims (10)

1. 胃腸疾患を治療する医薬品の製造における抗血小板薬の使用。
2. 前記抗血小板薬は、トロンボキサンＡ２阻害剤、アデノシン二リン酸Ｐ２Ｙ１２受容体拮抗剤、トロンビン受容体拮抗剤、５－ヒドロキシトリプタミン受容体拮抗剤、血小板糖タンパク質ＩＩ ｂ／IIIａ受容体阻害剤、及びホスホジエステラーゼ阻害剤から選ばれる、請求項１に記載の使用。
3. 前記抗血小板薬はジピリダモールである、請求項２に記載の使用。
4. 前記胃腸疾患は結腸炎、炎症性腸疾患である、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記胃腸疾患の患者が児童である、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用。
6. 胃腸疾患を治療する医薬品の製造におけるｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ促進剤の使用。
7. 前記ｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ促進剤はホスホジエステラーゼ阻害剤である、請求項６に記載の使用。
8. 前記ホスホジエステラーゼ阻害剤はジピリダモールである、請求項６又は７のいずれか１項に記載の使用。
9. 前記胃腸疾患は結腸炎、炎症性腸疾患である、請求項６～８のいずれか１項に記載の使用。
10. 前記胃腸疾患の患者が児童である、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用。

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