CN114432451B - 胃肠道疾病的免疫机制及治疗药物 - Google Patents

Abstract

肠道疾病的免疫机制及治疗药物。本发明涉及胃肠道疾病、例如非感染性胃肠道疾病，包括儿童非感染性胃肠道疾病的免疫机制、以及将磷酸二酯酶抑制剂和/或抗血小板药物用于治疗非感染性胃肠道疾病等胃肠道疾病的新用途。

Description

胃肠道疾病的免疫机制及治疗药物

技术领域

本发明涉及胃肠道疾病(gastrointestinal disesase)，例如感染性或非感染性胃肠道疾病(Non-infectious gastrointestinal disease)、特别是非感染性胃肠道疾病、包括儿童的非感染性胃肠道疾病的免疫机制、以及将PDE抑制剂和/或抗血小板药物用于治疗胃肠道疾病、例如非感染性胃肠道疾病的新用途。

背景技术

胃肠道疾病，例如非感染性胃肠道疾病，是多种消化道炎症性疾病的总称，按照不同的分类角度，包括例如炎症性胃肠道疾病(例如炎症性肠病 (inflammatory boweldisease,下文有时简称为IBD))、过敏性胃肠道疾病(例如食物过敏性)、和功能性胃肠道疾病等，可以影响各个年龄阶段的人群。在婴幼儿中也尤其常见，是影响儿童健康成长的重大医学问题。临床表现为反复的腹痛腹胀、呕血便血、腹泻便秘、食欲降低、营养不良、及各种全身并发症，严重时导致死亡的发生。胃肠道疾病，例如非感染性胃肠道疾病的发病机制目前仍不明确，这体现在疾病亚型命名主要依据受累部位、临床表现、诱发因素或某个细胞类型存在的数目而非发病机制来进行。随着社会经济的发展，胃肠道疾病，尤其是炎症性肠病,包括例如未分化结肠炎(undifferentiated colitis)、克罗恩病(Crohn’s disease，下文有时简称为CD) 和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，下文有时简称为UC)的发病率在世界范围内逐年上升，在中国也属于临床常见疾病。胃肠道疾病的治疗目前只是根据可能的诱因不同而对症治疗，方法包括过敏原回避、肠内营养、应用糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等抑制炎症反应。这些药物长期服用，可能导致影响脏器功能的毒副作用，感染风险增加，以及可能诱发如淋巴瘤等恶性肿瘤的风险。特别是对于儿童患者来说，这些风险对处于生长发育期的儿童影响尤其显著。

其中，就过敏性胃肠道疾病而言，近20年来，食物过敏的发病率逐年增多，因为其免疫反应机制尚不完全清楚，由于缺乏可靠的诊断方法，由此导致的胃肠道疾病如食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征，食物蛋白诱导的肠病，嗜酸性粒细胞食管炎，嗜酸性粒细胞性胃肠炎等诸多疾病常常被延迟诊断或误诊误治。此类儿童患者的管理依赖于个体化的过敏原回避，预防或避免过敏性食物引发的急性和慢性症状，提供充足且均衡的饮食。但此类儿童患者的饮食回避管理困难重重，过于宽泛或过于严格可能导致的反复的急性过敏反应或持续的胃肠道炎症直接影响营养的消化和吸收。

此外，就功能性胃肠道疾病而言，近10年以来，脑肠互动异常导致的儿童功能性胃肠道疾病越来越受到关注，症状的产生与胃肠道动力紊乱、内脏的高敏感性、粘膜和免疫功能异常、肠道菌群失衡以及中枢神经系统处理异常等因素有关。由于缺乏对病因和发病机制的了解，儿童功能性胃肠道疾病的治疗缺乏特异性的治疗方法。

胃肠道疾病例如非感染性胃肠道疾病，导致急性发作以及持续的慢性亚临床炎症反应或者疾病的反复发作，严重影响广大患者，尤其是儿童患者的身体健康和生长发育，给家庭和社会也带来了巨大的经济负担。限于组织来源以及临床基础研究的复杂性，胃肠道疾病发病机制研究大多局限于患者与对照组活检组织的整体转录组水平差异。特定细胞或基因在疾病中的功能研究则大多局限于实验动物模型。因此，系统性研究胃肠道疾病例如非感染性胃肠道疾病的、包括免疫细胞和非免疫细胞在内的粘膜免疫微环境，具有极大的临床和基础研究意义。

发明内容

如果能在细胞和分子水平上阐述正常和胃肠道疾病例如非感染性胃肠道疾病的胃肠道免疫微环境差异，将极大的改善该类疾病的临床诊疗现状，降低家庭和社会的医疗负担。

本发明人为了解决上述问题，对胃肠道疾病例如非感染性胃肠道疾病的免疫机制进行了深入研究。

本发明选取了代表性的胃肠道疾病的实例，通过单细胞水平分析了患有炎症性肠病,包括未分化结肠炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎的儿童受试者和健康对照儿童受试者的结肠免疫和非免疫细胞的转录谱特征，证明了表达 CD39(由ENTPD1编码)的CD8和γδT细胞在炎症性肠病患者的上皮内T 细胞(Intraepithelial T cell，以下有时简称为IET)中表达降低，这导致了结肠粘膜中的血小板聚集和血清素(下文中有时称为5-羟色胺 (5-Hydroxytrptamine)或5-HT)积累。具体地，本发明通过对患者(例如未分化结肠炎，克罗恩病和溃疡性结肠炎患者)和健康对照受试者的肠粘膜的单细胞RNA测序、免疫表型分析、动物实验和临床实验，阐述了炎症性肠病的共性发病机制。本发明进行的上述各种分析显示，环AMP反应(cAMP response，环磷酸腺苷反应)和/或环GMP反应(cGMP respopnse，环磷酸鸟苷反应)途径调节CD39表达，炎症性肠病患者中存在由缺陷的cAMP和/ 或cGMP反应途径导致的发病机制。与对照受试者相比，在炎症性肠病患者中，表达PDE4B和TNFα的巨噬细胞浸润；表达CD39的上皮内T细胞(下文有时简称为CD39⁺IET细胞)的丰度降低，并且普遍存在着在结肠粘膜血小板的聚集和5-羟色胺的释放。可见，在炎症性肠病(例如结肠炎、UC和CD)等患者中，存在着高度炎性巨噬细胞的浸润、CD39⁺IET缺乏和血小板聚集的缺陷，而缺陷的cAMP和/或cGMP反应途径是共同的机理起作用。

如上所述，本发明系统阐释了胃肠道疾病的发病机制，为胃肠道疾病的治疗提供了新的思路。作为靶向该发病机制的治疗，本发明可以通过改善所述的缺陷的cAMP和/或cGMP反应途径的方式来改善免疫机制，和/或靶向血小板聚集的方式来进行治疗，包括对患者给予能够提高cAMP水平和/或 cGMP水平的药物或其他治疗方式，例如，靶向cAMP/cGMP途径的磷酸二酯酶(phosphodiesterase，以下有时简称为PDE)抑制剂、腺苷酸环化酶(Adenocine cyclase,以下有时简称为AC)激活剂、鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,以下有时简称为GC)激活剂等。具体地例如，本发明人发现，磷酸二酯酶抑制剂，例如双嘧达莫(Dipyridamole)，可以抑制巨噬细胞的浸润并且降低它们的TNF-α的表达水平，可以促进CD39在IET中的表达，可以降低血小板在结肠粘膜的聚集，通过恢复炎症性肠病患者的免疫稳态而改善临床症状。这对患有胃肠道疾病，例如炎症性肠病，尤其是结肠炎、UC和CD的患者等提供了新型的治疗药物。

另一方面，本发明还提供了通过选自以下任一或组合的方式来治疗胃肠道疾病的思路：提高CD39⁺IET细胞、和/或抑制血小板聚集、和/或抑制5- 羟色胺的释放、和/或抑制PDE4B、和/或抑制TNF-α、和/或抑制巨噬细胞的浸润。

例如，本发明人发现，在胃肠道疾病的患者中存在着结肠粘膜血小板的聚集。本发明可以通过抑制血小板的聚集来治疗胃肠道疾病。作为靶向血小板的治疗，包括对患者给予能够抑制血小板的聚集的药物或其他治疗方式。通过给与这样的药物，已知用来抗血小板的药物，例如双嘧达莫，可以治疗患者的胃肠道疾病。进一步地，本发明还发现，作为治疗胃肠道疾病的一种临床上采用的激素药物甲基泼尼松龙，其也具有抑制血小板聚集的作用。这也进一步支持了本发明所阐释的，抗血小板聚集的药物可以用来治疗胃肠道疾病。

本发明通过阐述局部免疫微环境的组成和功能状态，极大的促进了非感染性胃肠道疾病等胃肠道疾病的精准分型，从而提高了临床个性化诊断和治疗的水平。

本发明发现了结肠炎、IBD(包括UC和CD等)等胃肠道疾病的发病机理，并为儿童患者提供了新的治疗方法，为新药的研发方向和应用提供了思路，并且为一些已上市药物(例如双嘧达莫等)提供了新的治疗用途。

如上所述，本发明涉及以下方面。

1.cAMP和/或cGMP促进剂在制备治疗和预防胃肠道疾病的药物中的用途。

2.如1项所述的用途，其中，所述cAMP和/或cGMP促进剂选自磷酸二酯酶抑制剂、和腺苷酸环化酶/鸟苷酸环化酶激活剂。

3.如2项所述的用途，其中，所述磷酸二酯酶抑制剂为PDE3、和/或 PDE4、和/或PDE5抑制剂。

4.如3项所述的用途，其中，所述磷酸二酯酶抑制剂为双嘧达莫。

5.抗血小板药在制备治疗和预防胃肠道疾病的药物中的用途。

6.如5项所述的用途，其中，所述抗血小板药为选自血栓素A2(TXA2) 抑制剂、二磷酸腺苷(ADP)P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5-羟色胺(5-HT)受体拮抗剂、血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)II b/Ⅲa受体抑制剂、和磷酸二酯酶抑制剂。

7.如6项所述的用途，其中，所述抗血小板药为磷酸二酯酶抑制剂。

8.如7项所述的用途，其中，所述抗血小板药为双嘧达莫。

9.如前述1-8中任一项所述的用途，其中，所述胃肠道疾病选自炎症性胃肠道疾病、过敏性胃肠道疾病，以及功能性胃肠道疾病。

10.如前述1-9中任一项所述的用途，其中，所述胃肠道疾病选自炎症性肠病、食物过敏导致的胃肠道疾病，以及功能性胃肠道疾病。

11.如前述1-9中任一项所述的用途，其中，所述胃肠道疾病为选自结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、嗜酸性粒细胞结肠炎、非嗜酸性粒细胞结肠炎。

11.前述1-10中任一项所述的用途，其中，所述胃肠道疾病为儿童胃肠道疾病。

12.抗血小板药或者cAMP和/或cGMP促进剂与其他药物联合在制备用于治疗胃肠道疾病的药物中的用途。

13.如12所述的用途，其中，所述抗血小板药为选自血栓素A2(TXA2) 抑制剂、二磷酸腺苷(ADP)P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5-羟色胺(5-HT)受体拮抗剂、血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)II b/Ⅲa受体抑制剂、和磷酸二酯酶抑制剂。

14.如12所述的用途，其中，所述cAMP和/或cGMP促进剂选自磷酸二酯酶抑制剂、和腺苷酸环化酶/鸟苷酸环化酶激活剂。

15.前述13所述的用途，其中，所述抗血小板药为双嘧达莫。

16.前述14所述的用途，其中，所述cAMP和/或cGMP促进剂为PDE3、和/或PDE4、和/或PDE5抑制剂。

17.如前述12-16中任一项所述的用途，其中，所述胃肠道疾病选自炎症性胃肠道疾病、过敏性胃肠道疾病，以及功能性胃肠道疾病。

18.前述12-17中任一项所述的用途，其中，所述胃肠道疾病为选自溃疡性结肠炎、克罗恩病、嗜酸性粒细胞结肠炎、非嗜酸性粒细胞结肠炎、结肠炎。

19.前述12-18中任一项所述的用途，其中，所述胃肠道疾病为儿童结肠炎。

20.诊断胃肠道疾病的方法，该方法包括：检测T细胞CD39表达和/ 或血小板的数量，如果CD39表达降低，和/或血小板数量增加，则判断为阳性。

21.诊断胃肠道疾病的方法，该方法包括：检测患者或受试对象的肠粘膜中的T细胞CD39表达、和/或血小板的聚集、和/或表达TNF-α和/或PDE4B 的巨噬细胞的浸润，如果CD39表达降低，和/或血小板数量增加，和/或TNF- α的表达升高，则判断为阳性。

22.用于诊断胃肠道疾病的试剂盒，其包括检测T细胞CD39表达是否降低的试剂，和/或包含检测血小板数量是否降低的试剂。

23.用于诊断胃肠道疾病的试剂盒，其包括：检测T细胞CD39表达的试剂、和/或检测血小板聚集的试剂、和/或检测表达TNF-α和/或PDE4B的巨噬细胞的浸润的试剂。

24.预防或治疗胃肠道疾病的方法，该方法包括给与患者有效量的 cAMP和/或cGMP促进剂，和/或抗血小板药。

25.前述20-24中任一项的方法或试剂盒，其中所述的胃肠道疾病选自炎症性胃肠道疾病、过敏性胃肠道疾病，以及功能性胃肠道疾病。

26.前述20-24中任一项的方法或试剂盒，其中所述的胃肠道疾病选自结肠炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、嗜酸性粒细胞结肠炎、非嗜酸性粒细胞结肠炎。

27.前述20-26中任一项的方法或试剂盒，其中所述的胃肠道疾病为非感染性胃肠道疾病。

28.前述20-27中任一项的方法或试剂盒，其中所述的胃肠道疾病的患者为儿童。

附图说明

图1:单细胞测序和生物信息分析。其中，图(a)表示取结肠炎儿童患者 (包括IBD(包括未分化结肠炎、UC、CD)、嗜酸性粒细胞结肠炎、非嗜酸性粒细胞结肠炎患者)和对照儿童结肠粘膜。图(b)表示单细胞测序和生物信息分析共发现17个T和NK亚群。图(c)表示上皮内T细胞(IET)在对照组和结肠炎患者的比较，其中，每组柱图中，左侧代表对照，右侧代表结肠炎组。图(d)表示ENTPD1-CD8T细胞是具有特定分化特征的免疫保护性细胞亚型。图(e)表示ENTPD1-CD8T细胞分化受到cAMP/cGMP第二信使调控。 ENTPD1是CD39的编码基因。

图2：CD8和γδT-ENTPD1细胞在患有结肠炎的儿童中的降低比例。其中，图(a)～(c)表示血液和结肠上皮内T细胞(IETs)中的门控策略和表面标志蛋白分子表达。图(d)表示对照受试者和患有结肠炎的儿童的指定IET的比例。在患有结肠炎的儿童中，CD39⁺CD3⁺T细胞，尤其是CD39⁺记忆CD8T 细胞(CD39⁺mCD8T)和CD39⁺γδT细胞(Vδ1+)在比例上显著降低。水平线描绘中位数。P值通过Kruskal-Wallis检验确定，并使用Prism 7的Benjamini 和Hochberg的原始FDR方法的进行多重比较调整。

图3：双密达莫恢复CD39在T细胞表达以及改善儿童中的结肠炎症状。其中，图(a)表示CD39⁺CD3⁺T细胞与过夜储存的结肠活检组织中释放的ADP 和5-HT的相关性。使用Prism7通过线性回归确定P值。图(b)表示来自患有结肠炎的儿童的培养血小板比对照受试者分泌显著高量的5-HT。P值通过 Mann-Whitney U检验计算(双侧)。图(c)中，左图表示，免疫荧光染色显示对照组和结肠炎受试者中CD39表达与血小板聚集(CD41簇)之间呈负相关(400x)。CD39(绿色)，CD41(红色)，细胞核染色DAPI(蓝色)。右图表示，在对照组(n＝3)和结肠炎受试者(n＝4)中，CD41簇/平方毫米计数为4-5个区域/结肠活组织检查(仅计算图像中直径>7μm的那些聚集的血小板)。水平线描绘中位数。P值通过Mann-Whitney U检验计算(双侧)。图(d)表示双嘧达莫治疗前后的临床评分。P值由Wilcoxon匹配对符号秩检验(双侧)计算。图(e)表示，双嘧达莫治疗前后的结肠镜外观和临床评分。图(f)表示在双嘧达莫治疗之前和之后，CD39和CD41簇的免疫荧光结果。右图显示了双嘧达莫治疗前后3名结肠炎儿童患者的CD41簇数。P 值通过Mann-Whitney U检验计算(双侧)。图(g)表示代表性的免疫荧光染色(200x)显示双嘧达莫处理后结肠粘膜中活化的ATF2和CREB与CD39 的共表达。

图4：与对照受试者相比，在结肠炎和IBD患者中，高度炎性的巨噬细胞和树突细胞(DC)的浸润。(A)显示了高度炎性的巨噬细胞和DC部分与其对照组的对应部分相比的差异表达基因(DEG)。红色和海军蓝点表示通过 P值(≤0.05)和log2(Fold Change)(红色，≥1；海军蓝，≤-1)阈值的单个基因。(B)当将双嘧达莫应用于经cAMP报告基因GloSensor-22FcAMP质粒稳定转染的HEK 293T细胞时，可显著提高胞浆cAMP浓度。通过激活腺苷酸环化酶而增加cAMP浓度的Forskolin被用作阳性对照。数据代表3 个独立实验，所有实验均显示相似结果。(C)免疫荧光染色显示患者儿童的 NLRP3炎性小体被激活。结肠粘膜切片用抗CD68染色以标记巨噬细胞，以 NLRP3和ASC染色用于炎性小体。右图显示了CD68⁺ASC⁺和NLRP3⁺ASC⁺细胞的定量分析，其中嗜酸性结肠炎以蓝点显示。使用Mann-Whitney U检验计算P值，*,P<0.05****,P<0.0001。(D)热图显示髓样细胞中结肠炎/IBD风险基因的相对表达。

图5：双嘧达莫治疗在DSS诱发的急性结肠炎模型中增加上皮内T淋巴细胞中CD39的表达。(A)上图显示了DSS诱导的急性结肠炎模型的治疗方案。下图代表对照组、DSS结肠炎组、或DSS+双嘧达莫组小鼠的结肠长度。(B)结肠炎上皮内T细胞亚型及其在对照组、DSS结肠炎组、DSS+双嘧达莫组小鼠中CD39的表达的门控策略。(C)汇总数据显示，双嘧达莫腹腔注射剂量为50mg/kg治疗，显著增加在CD4、CD8和γδT细胞中CD39 的表达。50mg/kg的双嘧达莫可增加CD4和γδT细胞的相对丰度。使用 Mann-Whitney U检验计算P值，*,P<0.05.**,P<0.01.***,P<0.001.(D)对照组、DSS结肠炎组、或DSS+双嘧达莫组小鼠中髓样细胞的门控策略及其CD39的表达。(E)汇总数据显示，对照组、DSS结肠炎组或DSS+双嘧达莫组小鼠髓样细胞中CD39的表达。使用Mann-Whitney U检验计算P值， *,P<0.05.**,P<0.01.***,P<0.001.

图6.：与双嘧达莫相比，甲基泼尼松龙和抗TNF-α治疗表现出不同的作用方式。(A)左侧图，tSNE图显示了主要细胞簇中ENTPD1和NT5E(CD73) 的表达。细胞通过归一化的选定基因的UMI计数进行颜色编码。显示出了具有这两个基因富集表达的细胞亚型。中间图，代表性免疫荧光染色显示双嘧达莫治疗后在结肠粘膜的T细胞、巨噬细胞和B细胞中的CD39表达的变化(n＝3)。右侧图，定量分析显示双嘧达莫治疗后在T细胞和巨噬细胞中CD39 表达显著升高。对于任何给定的受试者，在5个区域对结肠活检进行计数。点的颜色代表不同的组(黑色代表对照组；绿色代表结肠炎)。水平线表示中值。使用Mann-Whitney U检验计算P值。****,P<0.0001。(B)对于患有结肠炎或IBD的儿童，在甲基泼尼松龙给药之前和之后(左)，或在抗 TNFα之给药之前和之后(右)，相同结肠段的代表性内窥镜图像。(C)代表性的免疫荧光染色显示，对于患有结肠炎或IBD的儿童在甲基泼尼松龙给药前后(左，n＝5)或抗TNFα给药前后(右，n＝6)，CD39、CD41、CD68 和TNF-α的差异的变化。定量分析显示在右图。对受试者的5个区域进行结肠活检。点颜色代表不同的组(黑色代表对照组，绿色代表结肠炎，紫色代表溃疡性结肠炎(UC)，红色代表克罗恩病(CD))。水平线表示中值。使用Mann-Whitney U检验计算P值。****,P<0.0001。

图7：双嘧达莫改善结肠炎的症状。(A)在DSS诱导的急性结肠炎模型中，用双嘧达莫(10mg/kg)治疗的小鼠体重和结肠长度显着增加(对照组， n＝6；DSS+溶媒，n＝23；DSS+双嘧达莫，n＝23)P值是通过未配对的 t检验计算的。*,P<0.05；**,P<0.01。(B)来自对照组，DSS和DSS+双嘧达莫(DIP)组结肠的代表性苏木精-伊红(HE)染色切片，显示双嘧达莫治疗组的上皮完整性和隐窝结构得到改善(每组n＝3)。(C)免疫荧光染色显示，在双嘧达莫(10mg/kg)治疗的DSS诱导的结肠炎小鼠(每组n＝3) 中，结肠黏膜的CD41⁺簇减少。定量结果显示在右图中。在5个区域对结肠活检进行计数。每个点代表一个区域。水平线表示中值。使用Mann-Whitney U检验计算P值。****,P<0.0001。(D)与DSS组相比，双嘧达莫处理的在小鼠结肠粘膜的TNF-粘表达明显降低。使用Mann-Whitney U检验计算P 值。*,P<0.05。(E)左图：双嘧达莫给药前后，相同结肠段的内镜。右图柱状图为显示双嘧达莫治疗前后9位儿童的血小板计数(10⁹/L)，内窥镜检查得分和总临床得分。(F)左图为免疫荧光染色，显示双嘧达莫治疗之前和之后在结肠粘膜活化的ERK(红色)，ATF1010 2(红色)和CREB(红色) 与CD39(绿色)共表达(n＝3)。黄色表示重叠。右图为，在双嘧达莫治疗之前(n＝3)和之后(n＝3)，结肠粘膜中与CD39共表达活化的ERK， ATF2或CREB的细胞数量。在5个区域对结肠活检进行计数。每个点代表一个区域。水平线表示中值。使用Mann-Whitney U检验计算P值。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。(G)免疫荧光染色显示双嘧达莫治疗后儿童结肠粘膜中CD39表达增加，CD41表达减少(n＝7)。点的颜色表示组(黑色代表对照组；绿色代表结肠炎；蓝色代表嗜酸性结肠炎；红色代表IBDU)。在5个区域对结肠活检进行计数。每个点代表一个区域。水平线表示中值。使用Mann-Whitney U检验计算P值。****,P<0.0001。(H)免疫荧光染色显示双嘧达莫治疗后在儿童结肠粘膜CD68+巨噬细胞丰度降低，TNF-α丰表达降低(n＝7)。点的颜色表示组(黑色代表对照组；绿色代表结肠炎；蓝色代表嗜酸性结肠炎；红色，IBDU)。在5个区域对结肠活检进行计数。每个点代表一个区域。水平线表示中值。使用Mann-Whitney U检验计算 P值。****,P<0.0001。

图8：比较CD39⁺CD8 T细胞(上图)和CD39⁺Vδ1T细胞(下图)的浸润频率的箱形图。不同的颜色表示不同的组。使用Mann-Whitney U检验计算P值。*，P<0.05；**，P＜0.01。

具体实施方式

本发明中所述的胃肠道疾病是多种消化道炎症性疾病的总称，涉及例如胃、十二指肠、小肠、结肠等胃肠道，包括：非感染性和感染性胃肠道疾病，例如炎症性、过敏性、和功能性胃肠道疾病和胃肠道肿瘤等。胃部疾病例如急慢性胃炎、胃溃疡、胃息肉、糜烂性胃炎、消化性溃疡、胃肿瘤、十二指肠肿瘤、胃间质瘤、十二指肠间质瘤等。小肠疾病例如小肠肿瘤、肠系膜淋巴结炎、间质性病变等。结肠疾病例如结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠结核、结肠息肉、结肠癌等疾病。

具体的包括：炎症性胃肠道疾病，例如，炎症性肠病，结肠炎、未分化结肠炎，克罗恩病(CD)，溃疡性结肠炎(UC)，未定义炎症性肠病(Undefined Inflammatory boweldisease)，急性结肠炎、慢性结肠炎、直肠炎、等；胃肠炎，例如，浅表性胃炎，溃疡性胃炎，慢性胃炎,慢性胃肠炎，食管狭窄，食管闭锁，肠狭窄，肠闭锁等；过敏性胃肠道疾病，例如食物过敏引发的胃肠道疾病，流如嗜酸性粒细胞食管炎，嗜酸性粒细胞胃肠炎、嗜酸性粒细胞结肠炎、非嗜酸性粒细胞结肠炎、食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征，食物蛋白诱导的肠病，食物蛋白诱导的直肠结肠炎，非特异性慢性结肠炎，坏死性小肠结肠炎，巨结肠相关术前术后炎症。优选结肠炎、直肠炎、未分化结肠炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、急性结肠炎、慢性结肠炎；功能性胃肠道疾病。上述胃肠道疾病都包括感染性和非感染性的。本发明中，优选非感染性胃肠道疾病，包括结肠炎，炎症性肠病，例如克罗恩病(CD)，溃疡性结肠炎(UC)，未定义炎症性肠病，食物过敏引发的胃肠道疾病，如嗜酸性粒细胞食管炎，嗜酸性粒细胞胃肠炎、嗜酸性粒细胞结肠炎、非嗜酸性粒细胞结肠炎、食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征，食物蛋白诱导的肠病，食物蛋白诱导的直肠结肠炎，非特异性慢性结肠炎，坏死性小肠结肠炎，巨结肠相关术前术后炎症，更优选炎症性肠病，例如结肠炎(例如未分化结肠炎)、直肠炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、慢性结肠炎、急性结肠炎、嗜酸性粒细胞结肠炎、非嗜酸性粒细胞结肠炎。在本发明中，结肠炎意在涵盖各种形式的结肠炎；IBD意在涵盖克罗恩病、溃疡性结肠炎、未分化/未定义IBD等。

本发明中，胃肠道疾病的患者或受试者都没有年龄和性别的限制，可以为儿童、成人、老人。优选为儿童，例如新生儿至12岁，1-6岁等。本发明的治疗胃肠道疾病的药物的使用对象还可以是其他哺乳动物，例如猴子、牛、马、猪、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、羊和山羊等。

本发明的治疗也包括预防，比如由于一些与疾病相关的因素而预计具有发病的高风险但还没有形成疾病的患者，或已经形成疾病但还没有自觉症状的患者，给予本发明的药物，或对于治疗疾病之后害怕疾病复发的患者，给予本发明的药物。

本发明人通过对结肠粘膜T细胞亚型的分析，发现T细胞CD39表达的降低是胃肠道疾病例如儿童胃肠道疾病，例如非感染性胃肠道疾病发病的重要机制。在本发明中，使用患有炎症性肠病的儿童的活组织标本进行了结肠粘膜的单细胞转录组测序，描述了构成粘膜微环境的免疫细胞的独特亚群。生物信息分析发现CD39⁺CD8T,CD39⁺γδT,CD39⁺NKT(统称CD39⁺IET，或者CD39⁺CD3T)细胞亚群的减少，导致血小板聚集和血清素累积，促进胃肠道疾病，例如非感染性胃肠道疾病的发生。本发明人发现了cAMP水平降低，导致CD8⁺T细胞中CD39表达下调，诱发血小板聚集和血清素累积的炎症性肠病的级联发病机制。此外，本发明人令人惊奇地发现磷酸二酯酶抑制剂药物可以用于治疗胃肠道疾病，例如炎症性肠病儿童患者等患者中这一新的治疗方向和药物用途。

此外，本发明人发现，例如，在炎症性肠病等胃肠道疾病中，表达TNF- α的巨噬细胞大量聚集在结肠粘膜下，而且，在这些巨噬细胞上还高度表达 PDE4B。PDE4B是一种磷酸二酯酶，该酶降低细胞内cAMP水平，其通过降低cAMP浓度而提高TNF-α的表达。因此，巨噬细胞中同样存在着受损的cAMP-反应途径所致的发病机制。

本发明在DSS诱导的急性结肠炎模型小鼠中，使用磷酸二酯酶抑制剂双嘧达莫进行了治疗。该实验结果表明，双嘧达莫在体外和体内都可以在单核细胞和巨噬细胞中增加胞浆cAMP浓度并且抑制TNF-α的表达。此外，双嘧达莫有效抑制了血小板在肠炎小鼠结肠黏膜的聚集。该实验结果支持了在结肠炎、IBD、UC或CD等胃肠道疾病中可以使用双嘧达莫进行治疗。

具体地，本发明分析了上皮内T细胞(IET)的表型，分析表明，表达CD39 的CD8Trm和γδT细胞在患有结肠炎、UC或CD的患者中的丰度减少，该 CD39⁺IET的丰度减少，与在结肠粘膜的血小板聚集和5-羟色胺释放是相关的。本发明的实验表明，结肠炎、UC和CD儿童患者中的CD39⁺IET的缺乏，可以通过血小板聚集和5-羟色胺的释放而使得加剧结肠炎症。该分析表明，双嘧达莫可以通过与c-AMP-ATF2-CREB活化相关的方式，提高在T细胞和巨噬细胞中的CD39的表达，从而抑制血小板聚集。

进一步地，本发明进行了临床试验，比较了使用双嘧达莫进行治疗前后的结肠粘膜，结果表明，双嘧达莫可以同时靶向多种细胞缺陷，并且恢复免疫稳态，改善临床症状。此外，作为比较，本发明将使用了甲基泼尼松龙或者抗TNF-α进行了治疗的患者的治疗前后的结肠粘膜也进行了分析，这两种治疗是当前治疗结肠炎临床上使用的方法。本发明发现使用了甲基泼尼松龙治疗的部分炎症性肠病患者，通过显著降低结肠粘膜的血小板聚集，改善了临床状态。但是由于甲基泼尼松龙治疗并没有改变巨噬细胞的侵润，也没有改变TNF-α的表达，致使部分患者产生药物依赖或者治疗无效。另一方面，虽然使用了抗TNF-α抗体生物制剂进行治疗改善了临床症状，但是并没有如双嘧达莫那样恢复所述的多种细胞免疫缺陷。因此，本发明的这些结果表明，现有的甲基泼尼松龙或者抗TNF-α这样的治疗方法，缺乏在炎症性肠病患者中恢复多因子免疫缺陷的能力，而本发明的磷酸二酯酶抑制剂双嘧达莫则可以实现这样的治疗效果。

由此，本发明提供用于治疗胃肠道疾病的药物(以下有时称为本发明的治疗胃肠道疾病的药物)和方式方法，具体如下。

本发明可以通过提高cAMP水平和/或cGMP水平来治疗胃肠道疾病。例如通过给与药物或者其他适宜的手段和方式。本发明的提高cAMP水平和 /或cGMP水平的药物和方式，只要能提高cAMP水平和/或cGMP水平即可，没有特别的限制。作为提高cAMP水平和/或cGMP水平的药物(在本文中也称为cAMP和/或cGMP促进剂)包括但不限于，磷酸二酯酶抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂和/或鸟苷酸环化酶激活剂(有时简统称为腺苷酸环化酶和 /或鸟苷酸环化酶激活剂)等。

本发明中的磷酸二酯酶抑制剂的含义如本领域所知。本领域已知，磷酸二酯酶(PDE)，具有水解细胞内第二信使(cAMP,环磷酸腺苷或cGMP,环磷酸鸟苷)的功能，降解细胞内cAMP或cGMP，从而终结这些第二信使所传导的生化作用。磷酸二酯酶家族包括PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE5、 PDE6、PDE7、PDE8、PDE9、PDE10、PDE11等，各自又具有多种同工酶亚型，例如，PDE4就包括PDE4A、4B、4C和4D等亚型。

本发明的磷酸二酯酶抑制剂包括对所述的磷酸二酯酶家族中的任意一种或多种起到抑制作用的药物，包括选择性的或非选择性磷酸二酯酶抑制剂。包括但不限于PDE1抑制剂、PDE2抑制剂、PDE3抑制剂、PDE4抑制剂、 PDE5抑制剂、PDE6抑制剂、PDE7抑制剂、PDE8抑制剂、PDE9抑制剂、 PDE10抑制剂、PDE11抑制剂、或对家族中的多种具有抑制效果的抑制剂以及对磷酸二酯酶家族其他成员有抑制作用的药物等。优选具有PDE3、和/或 PDE4、和/或PDE5抑制作用的抑制剂等。更优选，PDE5抑制剂。

具体地，本发明中的磷酸二酯酶抑制剂只要是对磷酸二酯酶起到抑制作用，则没有特别的限制，已知有包括尼莫地平、长春西汀、IC86340、IC224、 EHNA、BAY60-7750、IC933、双嘧达莫、西洛他唑、西洛酰胺、米力农、氨力农、依诺昔酮、氰胍佐旦、茶碱、咯利普兰、吡拉米司特、罗氟司特、西洛司特、阿普斯特、西地那非、伐地那非、他达那非、敏喘宁、乌地那非、 BRL-50481、IC242以及基于计算机模拟发现的喹唑啉类和噻二唑类小分子化合物S14和VP1.15等。本领域已知西地那非、伐地那非、他达那非、敏喘宁、双嘧达莫等是PDE抑制剂，特别是PDE5抑制剂。

此外，本领域已知腺苷酸环化酶激活剂和/或鸟苷酸环化酶激活剂的含义。腺苷酸环化酶，简称AC，是膜整合蛋白，能够将ATP转变成cAMP，引起细胞的信号应答。鸟苷酸环化酶，简称GC，可以催化GTP生成cGMP。腺苷酸环化酶激活剂和/或鸟苷酸环化酶激活剂针对本发明所阐述的胃肠道疾病的免疫发病机制，可以提高cAMP水平和/或cGMP水平，治疗胃肠道疾病。

另外，本发明中的抗血小板药物，只要是具有抗血小板的作用，则没有特别的限制。包括但不限于例如影响血小板活化扩增的药物、抑制血小板聚集的药物等。例如，血栓素A2(TXA2)抑制剂、二磷酸腺苷(ADP)P2Y12受体拮抗剂、包括噻吩吡啶类和非噻吩吡啶类、凝血酶受体拮抗剂、5-羟色胺 (5-HT)受体拮抗剂、血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)lIb/Ⅲa受体抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂类。具体可以为阿司匹林、噻氯匹定(Ticlopidine)、氯吡格雷(Clopidogrel)和普拉格雷(Prasugrel)、替卡格雷(Ticagrelor)、坎格雷洛(Cangrelor)、替格瑞洛(Ticagrelor)、Vorapaxar(SCH-530348)、 Atopaxar(E5555)、沙格雷酯(Sarpogrelate)、西酞普兰(Citalopram)、阿西单抗、替罗非班、双嘧达莫、西洛他唑等。

本发明优选以下方面。

本发明优选双嘧达莫用于治疗结肠炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病等炎症性胃肠道疾病，及其制药用途。

本发明优选双嘧达莫用于治疗嗜酸性结肠炎、非嗜酸性结肠炎等过敏性胃肠道疾病，及其制药用途。

本发明优选PDE5抑制剂用于治疗结肠炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病等炎症性胃肠道疾病，及其制药用途。

本发明优选PDE5抑制剂用于治疗嗜酸性结肠炎、非嗜酸性结肠炎等过敏性胃肠道疾病，及其制药用途。

本发明优选抗血小板药用于治疗结肠炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病等炎症性胃肠道疾病，及其制药用途。

本发明优选抗血小板药用于治疗嗜酸性结肠炎、非嗜酸性结肠炎等过敏性胃肠道疾病，及其制药用途。

上述各方面中，所述疾病为感染性或非感染性。

本领域技术人员可以理解，本发明中所述的各个治疗胃肠道疾病的药物中的活性成分的形式并没有限制，可以是活性化合物本身、游离态、其盐、酯、异构体、旋光异构体、立体异构体、区域异构体、几何异构体、水合物、非水合物、溶剂化物或非溶剂化物、无定型、晶体、可药用共晶体或共晶体盐、衍生物、前体药物等各种形式。前体药物包括在生物体中、在生理条件下，由于酶、胃酸等等的反应而能够转变为所述活性成分，也就是说，通过酶致氧化、还原、水解等等而能够转变为活性成分的化合物；由于胃酸而能够通过水解等等转变为活性成分的化合物，等等。共晶体或共晶体盐是指由两种或多种具体物质构成的晶体物质，在室温下，每种物质是固体，各自具有不同的物理性质(例如，结构、熔点、熔融热、吸湿性、溶解度、稳定性，等等)。共晶体和共晶体盐可以利用本来已知的共结晶方法来制备。

例如，本发明中的磷酸二酯酶抑制剂(例如双嘧达莫)中的活性成分，活性成分的形式并没有限制，可以是活性化合物本身、游离态、盐、酯、异构体、旋光异构体、立体异构体、区域异构体、几何异构体、水合物、非水合物、溶剂化物或非溶剂化物、无定型、晶体、可药用共晶体或共晶体盐、衍生物、前体药物等各种形式。

在本发明中，活性成分是盐时，这种盐的例子包括金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或酸性氨基酸形成的盐，等等。金属盐的优选例子包括：碱金属盐，例如，钠盐、钾盐，等等；碱土金属盐，例如，钙盐、镁盐、钡盐，等等；以及铝盐。与有机碱形成的盐的优选例子包括与下列有机碱形成的盐：三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己基胺、N,N'-二苄基乙二胺，等等。与无机酸形成的盐的优选例子包括：与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等等形成的盐。与有机酸形成的盐的优选例子包括与下列有机酸形成的盐：甲酸、乙酸、三氟乙酸、苯二酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、枸橼酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸，等等。与碱性氨基酸形成的盐的优选例子包括与下列碱性氨基酸形成的盐：精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸，等等。与酸性氨基酸形成的盐的优选例子包括与下列酸性氨基酸形成的盐：门冬氨酸、谷氨酸，等等。

这些当中，优选可药用盐。例如，当活性成分包含酸性官能团时，其实例包括无机盐，例如，碱金属盐(例如，钠盐、钾盐，等等)、碱土金属盐(例如，钙盐、镁盐，等等)等等、铵盐等等，当化合物包含碱性官能团时，其实例包括与无机酸形成的盐，例如，盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等等，以及与有机酸形成的盐，例如，乙酸、苯二酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、枸橼酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸，等等。

例如，本发明的磷酸二酯酶抑制剂、抗血小板药中的活性成分可以为游离形式、盐形式、酯形式、以及其他各种衍生物、前药等修饰形式，例如，就双嘧达莫而言，可以是游离形式、酯、盐、衍生物、前药等修饰形式。

本发明中所述的治疗胃肠道疾病的药物的活性成分，例如用于提高 cAMP水平和/或cGMP水平的药物以及抗血小板药物的活性成分，可以以其活性化合物本身或者活性化合物与药学可接受的载体的混合物的形式给药。

作为药学可接受的载体，可使用作为制剂原料常用的各种有机或无机载体物质，没有特别限定，可以以固态制剂中的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂；液态制剂中的溶剂、增溶剂、悬浊化剂、等渗化剂、缓冲剂、去痛剂等形式配合。另外，也可以根据需要而使用防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂、甜味剂等制剂添加物。

本发明的治疗胃肠道疾病的药物的制剂形式没有特别的限定，可以作为非口服给药用或口服给药用的药物，例如以脂质体或者外泌体包裹的形式。本发明的药物可以为散剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂等固态制剂，或糖浆剂或者乳剂等液体剂中的任一种。治疗胃肠道疾病的药物，可以以下列形式安全地给予(例如，静脉内、肌内、皮下、器官内、鼻内、皮内、滴剂、脑内、直肠内、阴道、腹膜内、肿瘤内部、肿瘤近端、病变处，等等)：片剂(包括糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、颊含片，等等)、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊、微囊)、锭剂、糖浆剂、液剂、乳剂、混悬剂、控制释放制剂(例如，立即释放制剂、缓释制剂、缓释微囊)、气雾剂、膜剂(例如，口腔崩解膜剂、口腔粘膜粘附膜剂)、注射剂(例如，皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射)、静脉输液、透皮吸收式的制剂、乳膏剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂)、药粒、鼻制剂、肺制剂(例如，吸入剂)、滴眼液，等等。

本发明的药物活性成分在药物组合物中的含量基于本发明化合物的剂型、剂量等而变化。例如，含量在大约0.1至100wt％的范围。

本发明中的用于治疗胃肠道疾病的药物例如非感染性胃肠道疾病的药物剂量没有特别限定，只要是治疗有效量的。在本说明书中，术语“治疗有效量”是指对于对象带来治疗效果的量，例如：在被给药了该量的对象中，与未给药该量的对象相比，疾病的症状或状态发生缓和、减轻、或消除，或疾病的症状或状态的发展得到延迟或抑制。治疗有效量可以由医生根据对象的年龄、体重、性别及症状的严重程度等而适宜确定。例如为，对于儿童0.1-100mg/kg/day，1-50mg/kg/day，3-20mg/kg/day，每天给药一次至若干次。

本发明的治疗胃肠道疾病药物可以与其他药物联用。所述其他药物例如：抗动脉粥样硬化药物，抗血栓药物，抗心力衰竭药物，抗心律失常药物，抗高血压药物，治疗糖尿病的药物，治疗糖尿病并发症的药物，提高HDL的药物，抗高脂质血症药物，抗肥胖症药物，利尿剂，消炎剂，抗痛风药物，化学治疗剂，免疫治疗剂例如抗TNFα药物、激素类例如糖皮质激素药物，骨质疏松症药物，抗痴呆药物，勃起功能障碍改善药物，治疗尿失禁的药物和治疗排尿困难的药物。这些其他药物可以是低分子化合物或高分子蛋白、多肽、抗体、疫苗等。

对本发明的治疗胃肠道疾病药物和所述其他药物的给药时间没有限制，可以将它们同时或以交错方式给药患者。可以基于临床状况所使用的剂量来恰当地确定所述其他药物的剂量，并且可以根据给药患者、给药途径、靶向疾病、症状、组合药等来恰当地确定。

本发明提供诊断胃肠道疾病的方法，该方法包括：例如检测T细胞CD39 表达和/或血小板的数量，如果CD39表达降低，和/或血小板数量增加，则判断为阳性。

本发明还提供诊断胃肠道疾病的方法，该方法包括：例如检测患者或受试对象的肠粘膜中的T细胞CD39表达、和/或血小板的聚集、和/或表达TNF- α和/或PDE4B的巨噬细胞的浸润，如果CD39表达降低，和/或血小板数量增加，和/或TNF-α的表达升高，则判断为阳性。

本发明提供用于诊断胃肠道疾病的试剂盒，其包括例如检测T细胞 CD39表达是否降低的试剂，和/或包含检测血小板数量是否降低的试剂。

本发明提供用于诊断胃肠道疾病的试剂盒，其包括例如检测T细胞 CD39表达的试剂、和/或检测血小板聚集的试剂、和/或检测表达TNF-α和/ 或PDE4B的巨噬细胞的浸润的试剂。

本发明提供预防或治疗胃肠道疾病的方法，该方法包括给与患者有效量的cAMP和/或cGMP促进剂，和/或抗血小板药。

本发明的诊断、治疗方法或试剂盒所述的胃肠道疾病优选选自炎症性胃肠道疾病、过敏性胃肠道疾病，以及功能性胃肠道疾病。

本发明的诊断、治疗方法或试剂盒所述的胃肠道疾病优选选自结肠炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、嗜酸性粒细胞结肠炎、非嗜酸性粒细胞结肠炎。

本发明的诊断、治疗方法或试剂盒中所述的胃肠道疾病优选为非感染性胃肠道疾病。

本发明的诊断、治疗方法或试剂盒中所述的中所述的胃肠道疾病的患者优选为儿童。

实施例

下面参照实施例进一步具体地解释本发明，但本发明并不限制于此。

实施例1.对结肠炎和对照儿童的结肠粘膜中的细胞进行了单细胞测序和生物信息分析

I.研究方案：

(1)获取对照和非感染性胃肠道疾病儿童结肠粘膜组织，获得单细胞悬液；

(2)经表面染色后，用流式细胞分选T、B、非TB淋巴细胞、以及非淋巴细胞四个亚群；

(3)各细胞亚群进行单细胞转录组分析；

(4)单细胞测序结果，分析免疫细胞亚群的聚类特征，建立结肠粘膜免疫细胞的组成与转录特征；

(5)通过信号通路富集分析，确定细胞亚群特异的功能特征。鉴定细胞类型特异性高表达的转录因子，通过与基因表达水平的关联分析，建立转录因子调控网络；将非感染性胃肠道疾病易感基因与单细胞测序获得的免疫细胞亚型的转录特征对应，确立易感基因影响的免疫和非免疫细胞亚型。

II.实验方法

(1)临床样本(结肠粘膜和外周血)的采集。

通过结肠镜采集患有非感染性胃肠道疾病(非嗜酸性粒细胞结肠炎和嗜酸性粒细胞结肠炎分别为67和23例)的儿童，以及28例对照儿童的结肠粘膜，具体分组方法如下表。每个入组的儿童采集回盲部，升，横，降，乙状结肠和直肠粘膜各一块(大约1mm×1mm×3mm)；同时采集相应儿童的抗凝外周血(大约3mL)待用。上述采集过程已通过广州市妇女儿童医疗中心的临床研究伦理审查。以是需要进行结肠息肉切除的，肠镜和病理表现均正常的儿童作为对照儿童。

表1对照和结肠炎分组方法

(2)结肠粘膜单细胞的提取。

用小剪刀将结肠粘膜剪碎，然后将组织转入装有6ml消化液(RPMI1640 含10％胎牛血清白蛋白+10mM HEPES+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素+1mg/ml胶原酶1A+10U/ml脱氧核糖核酸酶)的离心管中，水平震荡(180RPM，30分钟，37℃)，再利用70μm滤网过滤，离心(900g，5分钟)，收集沉淀待用。

(3)T细胞的表型分析。

经(2)处理后的细胞浸于60μL流式抗体溶液中孵育(20分钟，冰上)，然后用FACSBuffer(PBS+2％胎牛血清白蛋白+1mM EDTA)清洗1次，最终将细胞置于FACS Buffer(含1％PI)中，上流式细胞仪检测。

(4)单细胞分选和5’,3’转录组建库。

拟采集结肠粘膜和按照本节方法(2)提取结肠粘膜的单细胞，并孵育抗体(CD19-APC,CD45-APC-cy7,CD3-FITC,CD4-BV711,CD8α-BV785, CD8β-BV510,γδT-PE,CD25-PEcy7,CD39-BV421,CD45RA-BV605, PD1-BV650)后通过流式细胞仪分选至事先孵育了PBS(含5％FBS)的EP 管中，具体分选和建库测序策略见下表。

表2分选、建库和测序策略

所得细胞采用台盼蓝进行活细胞计数，然后利用10×Genomic Chroimium SingleCell 5’建库试剂盒进行单细胞文库构建。具体而言，根据试剂盒说明书操作，将单细胞悬液与RT-PCR master mix混合，然后同时加载纳米级交联微球和分离油到专门的单细胞处理芯片上。接着，将添加了特定标签的每个单细胞中的RNA进行反转录，并对产生的cDNA进行纯化，扩增，末端修复和并加上Illumina特定的接头，至此成功构建成单细胞转录组文库。同时，在此基础上，利用Chromium Single Cell V(D)J建库试剂盒扩增TCR和BCR的文库。最终，上述文库采用Illumina X Ten进行测序。

(5)上皮内T细胞表型分析和因子检测。

将新鲜的结肠粘膜置于生理盐水过夜，利用检测ATP,ADP或Adenosine 的检测试剂盒(Abcam)和血清素检测试剂盒(Abcam)检测上清中相应因子的浓度。结肠粘膜经剪刀剪碎后，于消化液(PBS含5％胎牛血清白蛋白,10mM HEPES,1mM二硫苏糖醇,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素和10mM EDTA)震荡180RPM，37℃，孵育40分钟，然后通过70μm滤网得到单细胞悬液。通过抗体染色(CD45-APC-cy7，CD3-FITC，CD8a-BV785，CD4-BV711，Vd1-PE，Vd2-APC，CD25-PE-cy7，CD127-PE*Dazzle594， D39-BV421，CD69-BV510，CD45RA-BV605和PD1-BV650)及流式细胞术分析表型。

(6)体外血小板释放血清素检测实验

从患结肠炎或健康儿童体内抽取4mL静脉血，采用柠檬酸钠抗凝。经 250g和25℃离心全血15min后，得到富含血小板层，将其置于含100nM前列腺素E1的HBSS(Hank’sBalanced Salt Solution)中进一步离心1500g和5min，血小板沉淀分装到HBSS中，浓度为10⁹～10¹⁰/mL，并于37℃和5％CO₂的条件过夜孵育，离心后利用血清素检测试剂盒检测上清。

(7)免疫荧光分析。

利用福尔马林固定并用石蜡包埋的石蜡块制备3um的组织切片，经脱蜡，封闭抗体(PBS含5％正常驴或羊血清和0.3％Triton X-100)室温孵育1小时， PBS清洗后与于4C暗湿盒中孵育一抗(CD39，CD41，pT71-ATF2或 pS133-CREB)过夜。接着，经PBS清洗后孵育二抗(羊抗小鼠IgG1结合 AF488和羊抗兔IgG结合Cy3)室温1小时，然后孵育含有DAPI的抗淬灭剂。然后，利用莱卡全自动倒置荧光显微镜进行观察和拍照(20×0.75)，并利用莱卡Ximage分析软件对图像进行亮度，光度，对比度和色彩平衡的处理，尽可能还原图像。针对每个观察条件，随机选择每个粘膜切片中的4-5 个区域观测，采用卡X image分析软件对CD41聚集(荧光直径大于7μm) 进行测量和计数。

III.试验结果

如图1所示，通过所述单细胞测序技术，对结肠炎和对照儿童结肠粘膜 (a)中的细胞进行了单细胞测序和生物信息分析，共发现17个T和NK亚群(b)。其中表达ENTPD1(编码蛋白CD39)的IET在结肠炎患者中显著降低(c)(图c中，每组柱图中，左侧代表对照组，右侧代表结肠炎组)。 ENTPD1-CD8T细胞是一个具有特定分化特征的免疫保护性细胞亚型(d), 其分化受到cAMP/cGMP第二信使调控，富集了cAMP应答通路和ERK通路(e)。cAMP/cGMP第二信使通路诱导可以通过磷酸二酯酶(PDE)抑制剂或者AMP/GMP环化酶激活剂进行。

此外，如图2所示，CD8和γδT-ENTPD1细胞在患有结肠炎的儿童中的降低比例。其中，图(a)～(c)表示血液和结肠上皮内T细胞(IETs)中的门控策略和表面标志蛋白分子表达。图(d)表示对照受试者和患有结肠炎或嗜酸性结肠炎的儿童的指定IET的比例。在患有结肠炎的儿童中，CD39⁺CD3⁺T细胞，尤其是CD39⁺记忆CD8T细胞(CD39⁺mCD8T)和CD39⁺γδT细胞(Vδ1+) 在比例上显著降低。提示ENTPD 1⁺CD8和γδT缺陷与儿童结肠炎发病机制有关。

实施例2.双嘧达莫治疗儿童结肠炎的临床实验与评价

对实施例1中所述的患者，即，非嗜酸性粒细胞结肠炎和嗜酸性粒细胞结肠炎分别为67和23例)的儿童，以及28例对照儿童的结肠粘膜进行以下研究。患者的情况参见表3。

表3.对照和疾病组临床特征

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*P<0.01和**P<0.001是与对照组比较；#P<0.01和##P<0.001是与非嗜酸性粒细胞结肠炎组比较。

针对结肠粘膜中CD39表达的降低是否会通过促进ATP和ADP积累来加剧炎症进行研究。首先，我们将CD39在T细胞的表达与过夜存储的结肠活检组织中排出的ATP和ADP相关联。在这些情况下，ATP无法检测到。然而，CD39的表达降低与ADP的浓度增加相对应(图3a)

ADP是血小板的激动剂，其血清素的积累和分泌与小鼠中药物诱导的过敏反应的严重程度相对应(Beutier等，2018)。在患有结肠炎的儿童的活组织释放物中，ADP和血清素的浓度呈正相关(图3a)。从患结肠炎的儿童的外周血中分离的血小板比对照受试者分泌更多的血清素(图3b)。结肠活组织检查的免疫荧光染色显示对照和结肠炎受试者中CD39表达和血小板聚集(通过CD41+簇测量)呈负相关，并且结肠炎儿童患者中CD41簇的数量显着增加(图3c)。

以下，针对cAMP激活途径是否调节T细胞中的CD39表达进行了研究。使用双嘧达莫(一种PDE抑制剂和常用的抗血小板药物)进行了测试。双嘧达莫采用3-5mg/kg/day的剂量，给药8-12周。该临床试验得到广州市妇女儿童医疗中心伦理审查委员会的同意，并在中国临床实验注册中心注册 (ChiCTR1800019803)。所有患者或家属均签署了知情同意书。

表4双嘧达莫临床治疗评分标准

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备注(1):分为4个身体区域：头部和面部，躯干，上肢和下肢。

双密达莫的治疗结果如下表5所示。

表5.采用双密达莫治疗结果.

P值是通过Wilcoxon匹配对符号秩检验(双尾)计算的。

结果显示，双嘧达莫以剂量依赖性方式显著增加CD8+ T细胞活化期间的CD39表达。双嘧达莫可通过激活cAMP反应途径恢复CD39表达。由上述结果推断双嘧达莫可能靶向提高CD39的表达并降低血小板的活性以改善儿童结肠炎。

经双嘧达莫治疗后，没有不良反应的报告，临床严重性评分显著下降，并且结肠内壁也发生显著改善(图3d)；再者，免疫荧光实验显示双嘧达莫增加了在CD8和CD4 T细胞中以及在巨噬细胞中的CD39的表达，而粘膜中血小板的聚集则降低了(图3f)。同时，共定位的活化转录因子ATF2和 CREB也伴随着CD39的表达提高而提高(图3g)，这一结果支持双嘧达莫可能通过cAMP信号途径促进CD39的上调表达。

本发明人还在经内镜确认的结肠炎受试者和未定义的IBD(IBDU)受试者中进行了临床试验研究(表6)。双嘧达莫的剂量为3-5mg/kg/天，持续8至12周。没有明显的不良反应报道。在使用双嘧达莫之前和之后，通过内镜检查评估了粘膜的愈合情况，双嘧达莫治疗后的临床，内镜和组织学严重程度评分明显改善(图7E，表6)。免疫荧光染色证实双嘧达莫可增加 CD8和CD4 T细胞以及巨噬细胞中CD39的表达(图6A)。激活的ATF2和 CREB与CD39的增强共表达与增加cAMP浓度促进CD39表达的观点一致 (图7F)。结果表明双嘧达莫显著降低了血小板聚集(图7G)。此外，治疗后巨噬细胞浸润和TNF-α表达也显着降低(图7H)。此外，如图4所示，与对照受试者相比，在结肠炎患者中，有高度炎性的巨噬细胞和树突细胞(DC) 的浸润。

表6

表6中，PLT代表血小板计数，HGB代表血红蛋白，ALB代表白蛋白。

实施例3

双嘧达莫在DSS(硫酸葡聚糖钠，dextran sulphate sodium)-诱导的急性结肠炎模型中的作用

小鼠

六至八周大的雄性C57BL/6J小鼠(20-22克)购自广州中医药大学。实验前给小鼠常规食物和水。在所有研究中均采用了体重匹配的小鼠。动物研究得到广州医科大学动物保护与利用委员会的批准(许可号：2019-471)，并根据机构指南进行。

DSS-诱导的急性结肠炎

每天两次用双嘧达莫(10mg/kg体重，Sigma-Aldrich)或溶媒(2％DMSO， 10％乙醇，88％玉米油)预处理小鼠，持续3天，然后进行将DSS (36,000–50,000MW)，MPBiomedicals)添加到它们的饮用水中(3％)，持续9天。给对照小鼠常规食物和水。每天监测小鼠，如果体重减轻超过20％，则对其实施安乐死。

对于苏木精和曙红(H&E)染色，将结肠在4％多聚甲醛(PFA)中固定24小时并包埋在石蜡中。准备切片(3μm)并在染色前脱蜡。

为了检测结肠切片中的血小板聚集，将组织在4％PFA中固定24小时，在30％蔗糖中冷冻保护(cryoprotected)48小时，然后嵌入最佳切割温度 (Optimal CuttingTemperature,O.C.T.)化合物中。洗涤冷冻切片(5μm)，用 10％山羊血清封闭，并与抗小鼠CD41-FITC(133903，BioLegend，CA，USA) 在4℃下孵育过夜。

用PBS洗涤以除去未结合的抗体后，将切片用具有DAPI的 VECTASHIELD抗褪色固定介质(H-1200，Vector Laboratories，CA，美国) 固定，以进行核染色。如上所述进行免疫荧光染色和图像处理。血小板聚集体定义为CD41⁺簇(直径>7μm)。使用Leica X图像分析软件(德国汉堡的Leica)和ImageJ软件(美国马里兰州国立卫生研究院)对每平方毫米的CD41⁺簇数进行计数和分析。对于每个结肠切片，记录了5个随机选择区域的血小板聚集。

为了分析细胞因子的表达，将结肠中的残留肠系膜脂肪去除，称重并用 1mL PBS分散到单细胞悬液中。在4℃以1000×g离心10分钟后，取上清液通过ELISA测定TNF-α，IL-1β和IL-6的浓度。

DSS结肠炎模型中的免疫细胞CD39表达

为了确定结肠免疫细胞中的CD39表达，用溶媒，低剂量双嘧达莫(5mg /kg)或高剂量双嘧达莫(50mg/kg)处理小鼠8天，如图5A所示。从治疗的第二天开始，将DSS添加到饮用水(2.5％)中7天。给对照小鼠常规食物和水。

为了分析结肠免疫细胞，本发明收取了结肠并去除了多余的脂肪。用冰冷的PBS洗涤后，将结肠切成大约0.3-0.5厘米长的碎片。在离解溶液(不含Ca/Mg的HBSS，含5mM EDTA和2％FBS)中于37℃温和旋转40分钟后，沉淀上皮内淋巴细胞(IEL)，洗涤并重悬于染色缓冲液(PBS 2％FBS)。

其余未消化的结肠组织样品在消化液(含2％FBS，2mg/mL胶原酶IV， 0.4U/mL分散酶和1μg/mL DNase的RPMI1640)中于37℃温和旋转45分钟。沉淀固有层淋巴细胞(LPL)，洗涤并重悬在染色缓冲液中。细胞悬浮液的等分试样用T细胞板(CD45-APC-Cy7，CD3-BV711，CD39PE-Cy7，CD8-BV785，γδT-BV421和CD4-APC)或髓样板(MHC II-BV550，CD11b-BV510和CD39-PE-Cy7)在冰上染色30分钟，然后在FACSAria SORP流式细胞仪(BD Science)上进行分析。

结果发现，用双嘧达莫治疗了的小鼠，其结肠上皮内CD4、CD8和γδT 细胞，以剂量依赖方式，具有显著增加的CD39表达(参见图5)。与只用 DSS处理的小鼠相比，采用了双嘧达莫的小鼠，显著增加了体重和结肠长度，改善了上皮完整度和结构，降低了血小板聚集和TNF-α的表达(参见图7A-D)

实施例4

甲基泼尼松龙(Medrol)或抗TNF-α药物(Infliximab)治疗结肠炎和IBD。

为了与接受常规处方治疗的儿童进行比较，本发明分析了接受甲基泼尼松龙(n＝5，每天1–1.5mg/kg的儿童，持续2–4周，然后连续减少剂量直至接受治疗的第8至12周)的结肠活检)或抗TNF-α抗体(n＝6、在第0、 2和6周时5-10mg/kg，随后每8周一次，持续1至2年)。甲基泼尼松龙治疗前后4-7个月和抗TNF-α抗体治疗前后3-6个月后进行活检。

实验结果如图6C所示，甲基泼尼松龙显著降低在结肠粘膜的血小板聚集，但是它并不改变CD39或者TNF-α的表达。甲基泼尼松龙对于血小板聚集的效果，也支持了本发明所指出的，靶向血小板的聚集，可以减轻儿童患者中结肠炎和IBD的症状。

关于抗TNF-α治疗，结肠内窥镜检查显示，该治疗改善了结肠的外观 (图6B)，但是其对于在巨噬细胞、T细胞或血小板方面的多种免疫缺陷的恢复上并没有效果(图6C)。

以上实验表明，双嘧达莫通过同时靶向于多种免疫缺陷，能够改善结肠免疫稳态。因此，具有这样的对于cAMP途径活性的药物，可以在患有结肠炎和IBD等胃肠疾病的儿童和成人中具有广泛的应用。而单独的甲基泼尼松龙或抗TNF-α药这样的药物，并不能达到本发明所示的双嘧达莫这样的作用。

综合本发明的各个实验，至少表明了以下免疫方面的结果：

对于未经治疗的患者，本发明的图1C、图2D、图8反映了CD39 IET减少；图3C、3F、图7C、图7G反映了患者中血小板聚集；图4A、图4C、图7D、图7H反映了患者巨噬细胞浸润，PDE4B高度表达，TNF高度表达；图1C、1E、图4A反映了患者cAMP减少；

而对于用双嘧达莫治疗后，图5、图6A、图7F、图7G反映了双嘧达莫治疗后CD39增加；图7C、7G反映了治疗后血小板降低；图7H、4B反映了治疗后巨噬细胞降低、PDE4B被抑制、TNF-α被抑制；图4B反映治疗后cAMP增加；

关于甲基泼尼松龙的效果(图6B-C)，图6C反映了其在CD39 IET、巨噬细胞侵润、PDE4B、TNF-α方面没有效果，但在抑制血小板聚集方面有效。

关于抗TNF-α的治疗效果(图6B-C)，图6C反映了其在CD39 IET、血小板、巨噬细胞侵润等方面并没有效果。

综上，本发明发现，在免疫机制方面，CD39+IETs的缺乏与结肠炎患者亚组中的血小板聚集和免疫发病机制有关，可作为儿童非感染性胃肠道疾病的诊断和治疗的生物标志物。磷酸二酯酶抑制剂，例如双嘧达莫，可以通过提高cAMP/cGMP的水平，改善CD39+IETs，以及改善多种免疫缺陷，实现免疫稳态。上述结果表明双嘧达莫靶向这一通路改善儿童结肠炎，为该病的治疗提供新思路。同时，本发明发现，通过抗血小板的聚集，例如给药双嘧达莫、甲基泼尼松龙，可以治疗胃肠道疾病。

本发明在其范围中包含各种方式的变化，这些变化并不偏离本发明的范围。此外，所有的对本领域技术人员而言明显地认为是本发明的变形这样的情形，都包括本发明权利要求的范围内。

工业实用性

本发明系统研究了胃肠道疾病的发病机制，在胃肠道疾病患者中，存在着高度炎性巨噬细胞的浸润、CD39⁺IET缺乏和血小板聚集的缺陷，而缺陷的cAMP反应途径作为共同的机理起作用。该机理的发现，为胃肠道疾病的药物提供了新的思路。进一步地，本发明靶向该机理，采用PDE抑制剂双嘧达莫对胃肠道疾病患者进行了治疗，取得了比现有的治疗药物甲基泼尼松龙和抗TNF-α药物更好的治疗效果。

Claims (33)

1.双嘧达莫或其盐在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎、克罗恩病、嗜酸性粒细胞结肠炎的药物中的用途。

2.权利要求1所述的用途，其中，所述药物制备成适用于儿童的剂型。

3.权利要求1所述的用途，其中，所述药物制备成适用于成人的剂型。

4.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述双嘧达莫盐为金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐。

5.权利要求4所述的用途，其中，所述双嘧达莫金属盐包括碱金属盐、碱土金属盐。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述碱金属盐包括钠盐、钾盐。

7.根据权利要求5所述的用途，其中，所述碱土金属盐包括钙盐、镁盐、钡盐。

8.根据权利要求4所述的用途，其中，所述双嘧达莫与有机碱形成的盐包括与下列有机碱形成的盐：三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2 ,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、环己胺、二环己基胺、N ,N '-二苄基乙二胺。

9.根据权利要求4所述的用途，其中，所述双嘧达莫与无机酸形成的盐包括：与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸形成的盐。

10.根据权利要求4所述的用途，其中，所述双嘧达莫与有机酸形成的盐包括与下列有机酸形成的盐：甲酸、乙酸、三氟乙酸、苯二酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、枸橼酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸。

11.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述双嘧达莫盐为双嘧达钠盐或双嘧达莫盐酸盐。

12.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述双嘧达莫或其盐制备成组合物。

13.权利要求12所述的用途，其中，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

14.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述药物制备的剂型选自非口服给药用或口服给药用的药物。

15.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述药物制备的剂型为脂质体、外泌体包裹的剂型、散剂、片剂、糖浆剂、液剂、乳剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、混悬剂、控制释放制剂、气雾剂、膜剂、注射剂、透皮吸收式的制剂、栓剂。

16.权利要求15所述的用途，其中，所述片剂包括糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、颊含片。

17.权利要求15所述的用途，其中，所述胶囊剂包括软胶囊、微囊。

18.权利要求15所述的用途，其中，

所述控制释放制剂包括立即释放制剂、缓释制剂。

19.权利要求18所述的用途，其中，所述缓释制剂包括缓释微囊。

20.权利要求15所述的用途，其中，

所述注射剂包括皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射给药的制剂。

21.权利要求15所述的用途，其中，

所述栓剂包括直肠栓剂。

22.权利要求15所述的用途，其中，

所述膜剂包括口腔崩解膜剂、口腔粘膜粘附膜剂。

23.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述双嘧达莫或其盐通过器官内的方式给药。

24.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述双嘧达莫或其盐通过病变处的方式给药。

25.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述双嘧达莫或其盐通过静脉内、肌内、皮下、鼻内、皮内、直肠内、腹膜内的方式给药。

26.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，双嘧达莫或其盐在药物中的含量在0.1至100wt％的范围。

27.权利要求2所述的用途，其中，所述适用于儿童的剂型能够使得双嘧达莫或其盐的给药剂量为每天0.1-100mg/kg。

28.权利要求2所述的用途，其中，所述适用于儿童的剂型能够使得双嘧达莫或其盐的给药剂量为每天1-50mg/kg。

29.权利要求2所述的用途，其中，所述适用于儿童的剂型能够使得双嘧达莫或其盐的给药剂量为每天3-20mg/kg。

30.权利要求2所述的用途，其中，所述适用于儿童的剂型能够使得双嘧达莫或其盐的给药剂量为每天3-5mg/kg。

31.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述双嘧达莫或其盐的给药频率为每天给药一次至多次。

32.权利要求27至30中任一所述的用途，其中，所述双嘧达莫或其盐的给药频率为每天给药一次至多次。

33.权利要求1至3中任一所述的用途，其中，所述药物与其他药物联用。