JP2022147289A - 炎症性腸疾患治療用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】炎症性腸疾患を治療できる組成物を提供すること、および、炎症性腸疾患を治療
するための物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】リゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質
の機能を抑制する物質を含有する炎症性腸疾患治療用組成物、または、腸粘膜におけるＴ
ｈ１細胞の過剰活性化を抑制するための組成物を提供する。好適なリゾホスファチジルセ
リン受容体はＰ２Ｙ１０であり、Ｐ２Ｙ１０の下流のシグナル伝達経路としてＲｈｏ／Ｒ
ＯＣＫシグナルが挙げられる。Ｔｈ１細胞上のリゾホスファチジルセリン受容体の機能を
抑制する活性を測定する工程を含むスクリーニング方法、または、その下流のシグナル伝
達物質の機能を抑制する活性を測定する工程を含むスクリーニング方法を提供する。
【選択図】図２１

Description

本発明は、炎症性腸疾患の治療に関する。

炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ）は腸
管における免疫の過剰な活性化が関与していると考えられている。腸管に生じる難病であ
るが、患者数が急速に増加しており問題となっている。ＩＢＤに対する治療薬として抗Ｔ
ＮＦ抗体製剤などの免疫抑制機序を持つ新規薬剤が多数登場しており、従来薬と比較して
高い治療効果が見られるが、治療薬の継続使用に伴い効果減弱をきたすなど、治療に難渋
する患者も少なくない。さまざまな研究が行われているが、未だ疾患の発症、増悪のメカ
ニズムが十分に解明されたとは言えず、根治治療法も開発されていない。

Ｔ細胞は、ＩＢＤを含めて、様々な炎症性疾患において重要な役割を果たしている。最近
、Ｔ細胞の代謝状態の再プログラミングが分化と機能に密接に関連することが解明されて
いる（非特許文献１）。エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は
異なる代謝プロファイルを持っている（非特許文献２）。Ｔｈ１とＴｈ１７などのＴｅｆ
ｆはグルコース由来のピルビン酸を乳酸まで変換している解糖系に依存し、Ｔｒｅｇはミ
トコンドリアにおける酸化による代謝に依存している（非特許文献３）。Ｔ細胞の代謝状
態は炎症部位の環境（低酸素、低栄養状態）に順応する必要があると考えられる（非特許
文献４）。

炎症性腸疾患患者では、Ｔ細胞の代謝に変化が生じているという報告がある（非特許文献
５，６）。最近の研究では、炎症性腸疾患患者では、いくつかのリン脂質が炎症メディエ
ーターの働きをすることが明らかにされている。例えば、スフィンゴシンｌ－リン酸（Ｓ
１Ｐ）は１型Ｓ１Ｐ受容体（Ｓ１Ｐ１）を介してリンパ球の遊走を制御している（非特許
文献７）。

本発明者等は、１６種類のホスファチジルセリン（ＰＳ）と１８：０リゾホスファチジル
セリン（ＬｙｓｏＰＳ）の血漿中濃度がクローン病患者では健常人に比較して２倍以上、
上昇していることを報告した（非特許文献８）。ＰＳは細胞膜の脂質二重層の中に豊富に
存在し、ＬｙｓｏＰＳはホスホリパーゼＡ１／Ａ２（ＰＬＡ１／Ａ２）の酵素の作用によ
ってＰＳから発生して脂質メディエーターとして作用すると考えられている（非特許文献
９）。しかし、ＬｙｓｏＰＳの生理学的、病理学的機能は不明である。

現在ＬｙｓｏＰＳ受容体としてＧＰＲ３４（ＬｙＰＳ_１）、Ｐ２Ｙ１０（ＬｙＰＳ_２）、
Ａ６３００３３Ｈ２０Ｒｉｋ（ＬｙＰＳ_２Ｌ、ヒトでは偽遺伝子）およびＧＰＲ１７４（
ＬｙＰＳ_３）が同定されている。ＬｙｓｏＰＳ受容体はＧタンパク質共役型受容体であり
、ＧＰＲ３４（ＬｙＰＳ_１）はＧ_ｉに共役し、Ｐ２Ｙ１０（ＬｙＰＳ_２）、Ａ６３００３
３Ｈ２０Ｒｉｋ（ＬｙＰＳ_２Ｌ）およびＧＰＲ１７４（ＬｙＰＳ_３）はいずれもＧ_{１２／
１３}に共役し、Ｇ_{１２／１３}シグナルはＲｈｏ／ＲＯＣＫパスウェイを促進すると報告さ
れている（非特許文献１０－１２）。

リゾホスファチジルセリン受容体ＬＰＳＲ１と試験物質とを接触させる工程を含むリゾホ
スファチジルセリンアンタゴニストもしくはリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤
をスクリーニングする方法が特許文献１に記載されている。特許文献１中にはＬＰＳＲ１
が肥満細胞の脱顆粒反応の惹起、増強に関わっていることが記載されている。

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本発明は、炎症性腸疾患を治療できる組成物を提供すること、および、炎症性腸疾患を治
療するための物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。

本発明者等は、上記課題を解決すべく研究を行った結果、リゾホスファチジルセリン受容
体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する物質が、上記課題を解決で
きることを見出し本発明を完成した。また、Ｔｈ１細胞上のリゾホスファチジルセリン受
容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能の抑制活性を測定することにより、
炎症性腸疾患を治療するための物質をスクリーニングすることができることを見出し本発
明を完成した。即ち、本発明は以下の態様を含有する。
１．リゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を
抑制する物質を含有する炎症性腸疾患治療用組成物。
２．前記リゾホスファチジルセリン受容体がＰ２Ｙ１０である、前項１に記載の組成物。
３．前記機能を抑制する物質が、Ｐ２Ｙ１０の機能を抑制する物質である、前項２に記載
の組成物。
４．前記機能を抑制する物質が、Ｐ２Ｙ１０の下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑
制する物質である、前項２に記載の組成物。
５．前記細胞内シグナル伝達物質が、Ｒｈｏキナーゼである、前項４に記載の組成物。
６．前記炎症性腸疾患が、Ｔｈ１細胞の過剰活性化を伴う炎症性腸疾患である、前項１～
５のいずれか１に記載の組成物。
７．リゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を
抑制する物質を含有する腸粘膜におけるＴｈ１細胞の過剰活性化を抑制するための組成物
。
８．Ｔｈ１細胞上のリゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝
達物質の機能を抑制する活性を測定する工程を含む、炎症性腸疾患を治療するための物質
のスクリーニング方法。
９．リゾホスファチジルセリン存在下で、試験物質とＴｈ１細胞を接触させる工程を含む
前項８のスクリーニング方法。
１０．リゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能
を抑制する物質を投与することを含む炎症性腸疾患の治療方法。
１１．リゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能
を抑制する物質を投与することを含む腸粘膜におけるＴｈ１細胞の過剰活性化を抑制する
方法。
１２．炎症性腸疾患を治療するための組成物の調製のためのリゾホスファチジルセリン受
容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する物質の使用。
１３．腸粘膜におけるＴｈ１細胞の過剰活性化を抑制するための組成物の調製のためのリ
ゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制す
る物質の使用。

本発明の組成物は、リゾホスファチジルセリン受容体の機能または該受容体の下流のシグ
ナル伝達物質の機能を抑制し、そのシグナル伝達を遮断または減弱させることにより、Ｔ
ｈ１細胞の活性化を抑制し、炎症性腸疾患を治療することができる。リゾホスファチジル
セリン（以下、ＬｙｓｏＰＳともいう）は、リゾホスファチジルセリン受容体（以下、Ｌ
ｙｓｏＰＳ受容体ともいう）を介してＴｈ１細胞の代謝（解糖系）を促進させて、分化と
増殖を促進させ、炎症性サイトカインの発現を活発化させる。本発明の組成物は、Ｌｙｓ
ｏＰＳ受容体の機能、または該受容体の下流のシグナル伝達物質の機能を抑制することに
より、ＬｙｓｏＰＳのこれら作用を遮断または減弱させて炎症性腸疾患を治療することが
できる。本発明の組成物は炎症性腸疾患の原因療法であることから、治療効果に優れ、多
くの患者の治療に多大な貢献をするものである。

また、炎症性腸疾患の発症、増悪に関与するＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流のシグナ
ル伝達物質をターゲットとする薬剤のスクリーニング方法は、炎症性腸疾患の原因療法を
可能にする新規治療薬の開発に多大に貢献する。

図１は、ＴＮＢＳ誘導大腸炎モデルマウスにＬｙｓｏＰＳまたはビークルを４日間腹腔内投与したときの体重の変化を示すグラフである。n = 9, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, Student's t-test 図２は、ＴＮＢＳ誘導大腸炎モデルマウスにＬｙｓｏＰＳまたはビークルを４日間腹腔内投与した後の結腸の長さを示す写真（Ａ）とグラフ（Ｂ）ある。n = 9, **** p < 0.0001, Student's t-test 図３は、ＴＮＢＳ誘導大腸炎モデルマウスにＬｙｓｏＰＳまたはビークルを４日間腹腔内投与した後の結腸の病理組織像（Ｈ＆Ｅ染色）（Ａ）と組織学スコアのグラフ（Ｂ）である。n = 6, ** p < 0.01, Student's t-test 図４は、ＴＮＢＳ誘導大腸炎モデルマウスにＬｙｓｏＰＳまたはビークルを４日間腹腔内投与した後の相対的サイトカイン発現量（結腸の粘膜固有層リンパ球中のサイトカインｍＲＮＡ発現量）を示すグラフである。n = 9, n.s.: not significant, * p < 0.05, Student's t-test 図５は、Ｔ細胞依存的大腸炎モデルマウスにＬｙｓｏＰＳまたはビークルを４日間腹腔内投与したときの体重の変化を示すグラフである。n = 4-5, * p < 0.05, Student's t-test 図６は、Ｔ細胞依存的大腸炎モデルマウスにＬｙｓｏＰＳまたはビークルを４日間腹腔内投与した後の結腸の長さを示す写真（Ａ）とグラフ（Ｂ）である。n = 4-5, ** p < 0.01, Student's t-test 図７は、Ｔ細胞依存的大腸炎モデルマウスにＬｙｓｏＰＳまたはビークルを４日間腹腔内投与した後の結腸の病理組織像（Ｈ＆Ｅ染色）（Ａ）と組織学スコアのグラフ（Ｂ）である。n = 4-5, **** p < 0.0001, Student's t-test 図８は、Ｔ細胞依存的大腸炎モデルマウスにＬｙｓｏＰＳまたはビークルを４日間腹腔内投与した後の結腸の粘膜固有層リンパ球中のＩＦＮ－γ^＋細胞、ＩＦＮ－γ^＋ＩＬ－１７Ａ^＋細胞、ＩＬ－１０^＋細胞、ＩＬ－１７Ａ^＋細胞の数を示すグラフである。n = 4-5, n.s.: not significant, * p < 0.05, Student's t-test 図９は、マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を１８：１ ＬｙｓｏＰＳ存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した後のＩＦＮ－γ産生細胞数とＩＦＮ－γ産生量を示すグラフである。（Ａ）：ＩＦＮ－γ産生細胞数を示す（コントロール（ＬｙｓｏＰＳ不存在）のＩＦＮ－γ産生細胞数を１とする）。n = 3, **** p <0.0001, Student's t-test； （Ｂ）：ＬｙｓｏＰＳ濃度とＩＦＮ－γ産生量の関係を示す。n = 3, n.s.: not significant, ** p <0.01, one-way ANOVA 図１０は、マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を１８：０ ＬｙｓｏＰＳ存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した後のＩＦＮ－γ産生細胞数（コントロール（ＬｙｓｏＰＳ不存在）のＩＦＮ－γ産生細胞数を１とする）を示すグラフである。n = 4, **** p <0.0001, Student's t-test 図１１は、マウス脾細胞から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、１８：０または１８：１ ＬｙｓｏＰＳの存在下または不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した後のＣＤ４^＋Ｔ細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ：ミトコンドリア呼吸の指標）を示すグラフである。（Ａ）：Ｏｌｉｇｏ（ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ）、ＦＣＣＰ（ｆｌｕｏｒｏ－ｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｙａｎｉｄｅ ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、ＲＯＴ／ＡＡ（ｒｏｔｅｎｏｎｅ／ａｎｔｉｍｙｃｉｎ Ａ）をそれぞれ示された時間に注入した。；（Ｂ）：最大ＯＣＲを示す。n = 3-4, *** p <0.001, **** p <0.0001, one-way ANOVA 図１２は、マウス脾細胞から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、１８：０または１８：１ ＬｙｓｏＰＳの存在下または不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した後のＣＤ４^＋Ｔ細胞の細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ：解糖系の指標）を示すグラフである。（Ａ）：Ｏｌｉｇｏ（ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ）、ＦＣＣＰ（ｆｌｕｏｒｏ－ｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｙａｎｉｄｅ ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、ＲＯＴ／ＡＡ（ｒｏｔｅｎｏｎｅ／ａｎｔｉｍｙｃｉｎ Ａ）をそれぞれ示された時間に注入した。；（Ｂ）：最大ＥＣＡＲを示す。n = 3-4, * p <0.05, **** p <0.0001, one-way ANOVA 図１３は、解糖系を抑制する２―デオキシ―Ｄ―グルコース（２ＤＧ）存在下または不存在下、Ｔｈ１誘導条件で、マウス脾臓から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞を培養した後のＩＦＮ－γ産生細胞数の割合を示すグラフである。（Ａ）：マウス脾細胞から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞を培養した後のＩＦＮ－γ産生細胞数の割合を示す。（Ｂ）：ヒトＰＢＭＣから単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞を培養した後のＩＦＮ－γ産生細胞数の割合を示す。Ａ，Ｂいずれも、n = 3, * p <0.05, ** p <0.01, one-way ANOVA 図１４は、マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＲＯＣＫ抑制剤であるファスジル存在下または不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した後のＩＦＮ－γ産生細胞数の割合を示すグラフである。n = 3, n.s.: not significant, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.0001, one-way ANOVA 図１５は、マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＲＯＣＫ抑制剤ファスジル存在下または不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した後の酸素消費速度（ＯＣＲ：ミトコンドリア呼吸の指標）を示すグラフである。（Ａ）：Ｏｌｉｇｏ（ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ）、ＦＣＣＰ（ｆｌｕｏｒｏ－ｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｙａｎｉｄｅ ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、ＲＯＴ／ＡＡ（ｒｏｔｅｎｏｎｅ／ａｎｔｉｍｙｃｉｎ Ａ）をそれぞれ示された時間に注入した。（Ｂ）：最大ＯＣＲを示す。n = 7-9, * p <0.05, ** p <0.01, **** p <0.0001, one-way ANOVA 図１６は、マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＲＯＣＫ抑制剤ファスジル存在下または不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した後の細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ：解糖系の指標）を示すグラフである。（Ａ）：Ｏｌｉｇｏ（ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ）、ＦＣＣＰ（ｆｌｕｏｒｏ－ｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｙａｎｉｄｅ ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）、ＲＯＴ／ＡＡ（ｒｏｔｅｎｏｎｅ／ａｎｔｉｍｙｃｉｎＡ）をそれぞれ示された時間に注入した。（Ｂ）：最大ＥＣＡＲを示す。n = 9, n.s.: not significant, * p <0.05, ** p <0.01, one-way ANOVA 図１７は、Ｐ２Ｙ１０ノックアウト（Ｐ２ｒｙ１０^－／ｙＰ２ｒｙ１０ｂ^－／ｙ）マウスの作成方法を示す図である。（Ａ）：ノックアウト作成の遺伝子図を示す。（Ｂ）：ノックアウト後、プライマーＦＷとＲＶ１またはＦＷとＲＶ２を用いてＰＣＲでノックアウトを確認した電気泳動の写真である。（Ｃ）：遺伝子切断部位の近傍配列を示す。 図１８は、Ｐ２Ｙ１０ノックアウト（Ｐ２ｒｙ１０^－／ｙＰ２ｒｙ１０ｂ^－／ｙ）マウスの結腸または脾臓から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞のサイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。（Ａ）：結腸 n = 6，（Ｂ）：脾臓 n= 3-4， n.s.: not significant, * p <0.05, ** p <0.01, Student's t-test 図１９は、野生型のＣＤ４^＋Ｔ細胞（野生型マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞）またはＰ２Ｙ１０欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｐ２Ｙ１０ノックアウト（Ｐ２ｒｙ１０^－／ｙＰ２ｒｙ１０ｂ^－／ｙ）マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞）が移入されたＲａｇ２欠損マウスの体重変化を示すグラフである。矢印はＬｙｓｏＰＳを腹腔内投与した日である。n = 4-5, # p <0.05 [ＷＴ（ＬｙｓｏＰＳ）ｖｓ ＫＯ（－）]， & p <0.05, && p <0.01 [ＷＴ（ＬｙｓｏＰＳ）ｖｓ ＫＯ（ＬｙｓｏＰＳ）]， * p <0.05 [ＷＴ（－）ｖｓ ＷＴ（ＬｙｓｏＰＳ）], One-way ANOVA 図２０は、野生型のＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＰ２Ｙ１０欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞をマウスに移入した日（ｄａｙ０）から２３日後（ｄａｙ２３）の大腸の病理組織像を示す写真（Ａ）と組織学スコアのグラフ（Ｂ）である。n = 6-8, n.s.: not significant, * p <0.05, ** p <0.01, one-way ANOVA 図２１は、野生型のＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＰ２Ｙ１０欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞をＴｈ１誘導条件で培養した後のＩＦＮ－γ産生細胞の割合（Ａ）とＩＦＮ－γ産生量（Ｂ）を示すグラフである。 n = 5-6, n.s.: not significant, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.0001, one-way ANOVA

本発明の組成物は、リゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝
達物質の機能を抑制する物質を含有する。

本発明の組成物の有効成分であるＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シグナル伝
達物質の機能を抑制する物質には、ＬｙｓｏＰＳ受容体の機能を抑制する物質とＬｙｓｏ
ＰＳ受容体の下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する物質を含む。

本発明におけるＬｙｓｏＰＳ受容体は、リゾホスファチジルセリンの刺激（作用）により
、細胞内にシグナルを伝達する受容体であればよく特に制限されるものではない。Ｌｙｓ
ｏＰＳはリン脂質であり、グリセロール骨格にアシル基、リン酸基、セリンが結合してい
る構造を有している。アシル基の脂肪酸種は多様であり、結合位置はグリセロール骨格の
ｓｎ－１位（１－アシル型）とｓｎ－２位（２－アシル型）の２種類がある。生体内では
、細胞膜の脂質二重層を形成しているホスファチジルセリン（ＰＳ）がホスホリパーゼＡ
１／Ａ２（ＰＬＡ１／Ａ２）の作用によって生成されると考えられている。本明細書にお
いて、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）および／またはホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）
をホスホリパーゼＡ（ＰＬＡ）と総称する。

前記ＬｙｓｏＰＳ受容体の機能を抑制する物質は、ＬｙｓｏＰＳ受容体の受容体としての
機能を抑制する物質であればよく、限定されるものではない。例えばＬｙｓｏＰＳ受容体
に可逆的に結合しＬｙｓｏＰＳと受容体の結合を競合的に阻害する物質、ＬｙｓｏＰＳ受
容体に不可逆的に結合しＬｙｓｏＰＳと受容体の結合を阻害する物質、ＬｙｓｏＰＳ受容
体に結合せずにＬｙｓｏＰＳと受容体の結合を抑制する物質、ＬｙｓｏＰＳ受容体の発現
を抑制する物質が挙げられる。具体的には、ＬｙｓｏＰＳ受容体アンタゴニスト、Ｌｙｓ
ｏＰＳと構造が類似する物質、ＬｙｓｏＰＳ受容体に対する抗体、ＬｙｓｏＰＳ受容体遺
伝子のアンチセンスＲＮＡ、ＬｙｓｏＰＳ生成酵素阻害剤等が挙げられる。

前記ＬｙｓｏＰＳ受容体の下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する物質は、Ｌｙ
ｓｏＰＳ受容体からの細胞内シグナル伝達に関与する物質の機能を抑制する物質であれば
よく、限定されるものではない。ＬｙｓｏＰＳ受容体はＧタンパク質共役型受容体であり
、各ＬｙｓｏＰＳ受容体はそれぞれの三量体Ｇタンパク質と共役し、シグナルを下流に伝
達する。下流のシグナル伝達に関与する物質としては、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ、Ｒａｓ、ＰＩ
３Ｋ等が挙げられる。

ＬｙｓｏＰＳ受容体は、Ｐ２Ｙ１０（ＬｙＰＳ_２）、ＧＰＲ３４（ＬｙＰＳ_１）、ＧＰＲ
１７４（ＬｙＰＳ_３）およびＡ６３００３３Ｈ２０（ＬｙＰＳ_２Ｌ、ヒトでは偽遺伝子）
が同定されている。ヒトＰ２Ｙ１０（ＬｙＰＳ_２）は３３９個のアミノ酸からなり、その
アミノ酸配列を配列番号１に示す。ヒトＧＰＲ３４（ＬｙＰＳ_１）は３８１個のアミノ酸
からなり、そのアミノ酸配列を配列番号２に示す。ヒトＧＰＲ１７４（ＬｙＰＳ_３）は３
３３個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列を配列番号３に示す。マウスＡ６３００３
３Ｈ２０（ＬｙＰＳ_２Ｌ、ヒトでは偽遺伝子）は３３９個のアミノ酸からなり、そのアミ
ノ酸配列を配列番号４に示す。ヒト以外の動物のＬｙｓｏＰＳ受容体も本発明に係るＬｙ
ｓｏＰＳ受容体である。ＬｙｓｏＰＳが結合して細胞内シグナルを伝達する機能を有する
限り、これら受容体のアミノ酸配列は変異を有していてもよい。変異とは、アミノ酸の置
換、欠失、追加等である。例えば、上記アミノ酸配列の３０％に変異があってもよく、好
ましくは２０％に変異があってもよく、さらに好ましくは１０％に変異があってもよく、
さらに好ましくは、５％に変異があってもよい。

本発明におけるＬｙｓｏＰＳ受容体としてはＰ２Ｙ１０（ＬｙＰＳ_２）が好ましい。

本発明におけるＬｙｓｏＰＳ受容体の機能を抑制する物質は、好ましくは、Ｐ２Ｙ１０の
機能を抑制する物質である。Ｐ２Ｙ１０の機能を抑制する物質は、限定されるものではな
い。例えばＰ２Ｙ１０に可逆的に結合しＬｙｓｏＰＳとＰ２Ｙ１０の結合を競合的に阻害
する物質、Ｐ２Ｙ１０に不可逆的に結合しＬｙｓｏＰＳとＰ２Ｙ１０の結合を阻害する物
質、Ｐ２Ｙ１０に結合せずにＬｙｓｏＰＳとＰ２Ｙ１０の結合を抑制する物質、Ｐ２Ｙ１
０の発現を抑制する物質およびＬｙｓｏＰＳの生成を抑制する物質が挙げられる。具体的
には、Ｐ２Ｙ１０アンタゴニスト、ＬｙｓｏＰＳと構造が類似する物質、Ｐ２Ｙ１０に対
する抗体、Ｐ２Ｙ１０遺伝子（Ｐ２ＲＹ１０）のアンチセンスＲＮＡ、ＬｙｓｏＰＳ生成
酵素阻害剤（例えば、ホスホリパーゼＡ阻害剤）等が挙げられる。ホスホリパーゼＡ阻害
剤としては、例えば、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、４－ｂｒｏｍｏｐｈｅｎａ
ｃｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ、ｄａｒａｐｌａｄｉｂ、Ａｎａｇｒｅｌｉｄｅ、ＯＢＡＡ（３
－（４－ｏｃｔａｄｅｃｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＡＣＯＣ
Ｆ３（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ）、ＹＭ２
６７３４、ＬＹ３１５９２０（ｖａｒｅｓｐｌａｄｉｂ ｍｅｔｈｙｌ）が挙げられる。

本発明におけるＬｙｓｏＰＳ受容体の下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する物
質は、好ましくは、Ｐ２Ｙ１０の下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する物質で
ある。Ｐ２Ｙ１０の下流の細胞内シグナル伝達物質は、シグナル伝達に関与する物質であ
ればよく限定されるものではない。好適に挙げられるのは、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫシグナル伝
達経路に関与する物質である。Ｒｈｏ／ＲＯＣＫシグナル伝達経路に関与する物質として
は、Ｒｈｏ、Ｒｏｈキナーゼ（ＲＯＣＫ）等が挙げられる。Ｒｈｏ／ＲＯＣＫシグナル伝
達経路に関与する物質の機能を抑制する物質として、例えば、Ｒｏｈキナーゼ（ＲＯＣＫ
）阻害剤、ＲｈｏによるＲＯＣＫ活性化を阻害する物質、およびＲｈｏ阻害剤等が挙げら
れる。好ましくはＲＯＣＫ阻害剤であり、例えば、ファスジル、Ｙ－２７６３２、ＧＳＫ
４２９２８６Ａ、ＲＫＩ―１４４７およびＡｚａｉｎｄｏｌｅ １が挙げられる。好適に
は、ファスジルが挙げられる。

本明細書において、炎症性腸疾患の治療には、炎症性腸疾患の症状の改善、軽減、増悪抑
制、進行の遅延、および再燃抑制等が含まれる。

本発明における炎症性腸疾患は、腸に炎症を起こす疾患である。本明細書において、炎症
性腸疾患には、クローン病および潰瘍性大腸炎の他に腸管ベーチェット病、非特異性多発
小腸潰瘍、家族性地中海熱関連腸炎等も含まれる。炎症性腸疾患は、慢性的な下痢や血便
、腹痛などの症状を特徴とし、他にも発熱、肛門痛などの症状が含まれる。病理学的検査
では、クローン病では非乾酪性類上皮細胞肉芽腫、潰瘍性大腸炎では陰窩膿瘍が特徴とさ
れる。クローン病と潰瘍性大腸炎は、ともに免疫細胞が関与する難治性腸管炎症性疾患で
あり、本発明の組成物による治療が効果的である。特に好適には、本発明の組成物はクロ
ーン病の治療に用いられ得る。

本発明の組成物は、Ｔｈ１細胞の過剰活性化を伴う炎症性腸疾患の治療に好適に用いられ
得る。

本明細書においてＴｈ１細胞の過剰活性化は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ－γ等の炎症性サ
イトカインの分泌量の上昇を特徴とする。Ｔｈ１細胞の過剰活性化には、細胞あたりの炎
症性サイトカインの分泌量上昇、活性酸素種（ＲＯＳ）産生亢進、炎症性サイトカイン産
生Ｔｈ１細胞数の増加、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化促進、およびＴｈ
１細胞の代謝促進（特に解糖系の促進）を含む。

ＬｙｓｏＰＳ受容体を介するＬｙｓｏＰＳの作用により、Ｔｈ１細胞の過剰活性化が発生
し、炎症性腸疾患の症状が悪化する。本発明の組成物は、このＬｙｓｏＰＳ受容体を介す
るＬｙｓｏＰＳの作用を遮断または減弱して、Ｔｈ１細胞の過剰活性化を抑制することが
でき、炎症性腸疾患を治療することができる。また、Ｔｈ１細胞の過剰活性化を伴う炎症
性腸疾患を好適に治療することができる。

また、本発明の組成物は、ＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質
の機能を抑制する物質を含有する腸粘膜におけるＴｈ１細胞の過剰活性化を抑制するため
の組成物でもある。

該腸粘膜には、すべての腸の粘膜を含む。腸は大きく小腸と大腸に分けられるが、本発明
の組成物は大腸粘膜におけるＴｈ１細胞の過剰活性化を好適に抑制する。結腸粘膜におけ
るＴｈ１細胞の過剰活性化をさらに好適に抑制する。

本発明の組成物は、２種以上の有効成分を含有していてもよい。他の炎症性腸疾患治療薬
を含有していてもよく、また、炎症性腸疾患治療薬以外の薬物を含有していてもよい。本
発明の組成物は他の炎症性腸疾患治療薬と併用されてもよい。

本発明の組成物は、有効成分であるＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シグナル
伝達物質の機能を抑制する物質と、医薬的に許容される担体を含むことができる。

その様な担体としては、賦形剤（例えば、マンニトール、ソルビトールの如き糖誘導体；
トウモロコシデンプン、バレイショデンプンの如きデンプン誘導体；または、結晶セルロ
ースの如きセルロース誘導体等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムの如きス
テアリン酸金属塩；またはタルク等）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース
、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例
えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムの如きセル
ロース誘導体等）、水、防腐剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンの如きパラ
オキシ安息香酸エステル類；またはクロロブタノール、ベンジルアルコールの如きアルコ
ール類等）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸またはリン酸等の無機酸、酢酸、コハク酸
、フマル酸またはリンゴ酸等の有機酸、あるいはこれらの塩等）、ならびに希釈剤（例え
ば、注射用水等）等の通常使用される医薬製剤用担体を、単独または２種以上を混合して
配合することができる。本発明の組成物には有効成分を水に溶解させた液剤を含む。

本発明の有効成分であるＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の
機能を抑制する物質は、必要に応じて上記の担体と混合した後、錠剤、顆粒剤、カプセル
剤、粉末剤、溶液製剤、懸濁液製剤、もしくは乳化液剤等の剤形で経口投与することがで
きる。また、坐剤、注射剤、静脈内点滴剤、経皮剤、経粘膜剤、もしくは吸入剤等の剤形
で非経口投与することができる。

本発明の有効成分は、上記の剤形に製剤化した後、それを必要とする対象、例えばヒトま
たは動物、好ましくはヒトに投与される。

本発明のＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する
物質の投与量および投与回数は、症状の重篤度、患者の年齢、体重、性別、薬物の種類、
剤形、投与経路等の条件によって適宜変化しうる。ヒトに投与する場合、有効成分は、例
えば非経口的には皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または直腸内等に、１回の投与当たり
、約０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ま
しくは約０．３～３ｍｇ／ｋｇ体重、また経口的には約０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重
、好ましくは約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましくは約１～３０ｍｇ／ｋｇ体重
投与される。また、投与回数は、１日当たり１回または複数回、例えば１日当たり１～３
回、１～２回、または１回であってよい。

本発明の有効成分は、公知の方法に従って製造できる。

さらに本願は、Ｔｈ１細胞上のＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達
物質の機能を抑制する活性を測定する工程を含む、炎症性腸疾患を治療するための物質の
スクリーニング方法の発明に関する。

本発明のスクリーニング方法は、例えば化合物ライブラリーの化合物について、Ｔｈ１細
胞上のＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する活
性を測定し、炎症性腸疾患を治療するための物質をスクリーニングする方法である。

Ｔｈ１細胞上のＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑
制する活性には、Ｔｈ１細胞上のＬｙｓｏＰＳ受容体の機能を抑制する活性とＴｈ１細胞
上のＬｙｓｏＰＳ受容体の下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する活性を含む。

前記Ｔｈ１細胞上のＬｙｓｏＰＳ受容体の機能を抑制する活性は、Ｔｈ１細胞上のＬｙｓ
ｏＰＳ受容体の受容体としての機能を抑制する活性であればよく、限定されるものではな
い。例えばＬｙｓｏＰＳ受容体に可逆的に結合しＬｙｓｏＰＳと受容体の結合を競合的に
阻害する活性、ＬｙｓｏＰＳ受容体に不可逆的に結合しＬｙｓｏＰＳと受容体の結合を阻
害する活性、ＬｙｓｏＰＳ受容体に結合せずにＬｙｓｏＰＳと受容体の結合を抑制する活
性、ＬｙｓｏＰＳ受容体の発現を抑制する活性が挙げられる。

前記Ｔｈ１細胞上のＬｙｓｏＰＳ受容体の下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制す
る活性は、Ｔｈ１細胞上のＬｙｓｏＰＳ受容体から細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制
する活性であればよく、限定されるものではない。ＬｙｓｏＰＳ受容体はＧタンパク質共
役型受容体であり、各ＬｙｓｏＰＳ受容体はそれぞれの三量体Ｇタンパク質と共役し、シ
グナルを下流に伝達する。下流のシグナル伝達物質としては、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ、Ｒａｓ
、ＰＩ３Ｋ等が挙げられ、これら物質の機能を抑制する活性が挙げられる。

前記Ｔｈ１細胞上のＬｙｓｏＰＳ受容体としてはＴｈ１細胞上のＰ２Ｙ１０（ＬｙＰＳ_２
）が好ましい。本発明のスクリーニング方法は、好適には、Ｔｈ１細胞上のＰ２Ｙ１０の
受容体としての機能を抑制する活性を測定する工程を含むスクリーニング方法、または、
Ｔｈ１細胞上のＰ２Ｙ１０の下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制する活性を測定
する工程を含むスクリーニング方法である。

Ｔｈ１細胞上のＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑
制する活性は、例えば、サイトカイン発現量、サイトカイン産生細胞数、解糖系の促進の
状態、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫシグナルの活性化状態により測定することができる。

本発明のスクリーニング方法は、好ましくは、リゾホスファチジルセリン存在下で、試験
物質とＴｈ１細胞を接触させる工程を含む。

化合物ライブラリーは、公知のものでも公知でないものでもよい。公知の化合物ライブラ
リーとしては、既に食品（例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ））または医薬品（例えば
、欧州医薬品審査庁（ＥＭＥＡ））の承認を得た化合物を集めた化合物ライブラリー（例
えば、ＰＲＥＳＴＷＩＣＫ ＣＨＥＭＩＣＡＬライブラリー）（これは、特許期間が満了
した化合物を集めたものである）、および未だそれら食品または医薬品の承認を得ていな
い化合物を集めた化合物ライブラリー等が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法は、測定したＬｙｓｏＰＳ受容体またはその下流の細胞内シ
グナル伝達物質の機能を抑制する活性に基づいて、化合物を選別する工程をさらに含んで
もよい。

本発明のスクリーニング方法で得られた化合物は、炎症性腸疾患の治療薬になり得る化合
物である。

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。

試験例１から試験例１１では以下の材料と試験方法を用いた。

＜マウス＞
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのマウスは日本クレア社（東京、日本）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６
Ｊ ＲＡＧ２欠損マウス（Ｒａｇ２^－／－）はTaconic Biosciences, Inc. (Hudson, NY,
USA)から購入した。８-１５週齢の雄のマウスを使用し、すべてのマウスはＳＰＦ（spec
ific pathogen free）環境下で維持した。

＜試薬＞
2、4、6‐トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＴＮＢＳ）、および２‐デオキシ
‐Ｄ‐グルコースはSigma‐Aldrich (St. Louis, MO, USA) から購入した。１８：０ Ｌ
ｙｓｏＰＳ（1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)）、
および１８：１ ＬｙｓｏＰＳ（1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phospho-L-serine (
sodium salt)）はAvanti Polar Lipids, Inc (Alabaster, AL, USA) から購入し、７０％
エタノールに溶解して試験に用いた。ファスジル（Fasudil）は東京化学工業（東京、日
本）から購入した。マウスの麻酔のためのミダゾラム（ドルミカム（登録商標））はアス
テラス（東京、日本）から購入した。酒石酸ブトルファノールは明治製菓ファルマ（東京
、日本）から購入した。塩酸メデトミジン（ドミトール（登録商標））はゼノアック（福
島、日本）から購入した。

＜免疫細胞の単離＞
マウス脾細胞と大腸粘膜固有層単核細胞は、文献（Atarashi, K. et al. Nature 455, 80
8-812 (2008)）に記載の方法にわずかな修正を加えた方法により単離した。マウスナイー
ブＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－ＣＤ４４^－ＣＤ６２Ｌ^＋）は、ＦＡＣＳ
Ａｒｉａ（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）
により、あるいはナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞分離キット（CD4(L3T4) MicroBeads, Miltenyi
Biotech, Bergisch Gladbach, Germany）を用いた磁気ビーズ法により単離した。

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、文献 (Raulf-Heimsoth, M. T, Methods Mol Med 13
8, 17-30, (2008))の方法により単離した。すなわち、ヒト全血を等量の２％ＦＢＳを含
むＰＢＳと混合し、この希釈全血をコニカルチューブ中のフィコール上に積層し遠心分離
した。２つの液体層の間のＰＢＭＣ層を回収し、緩衝液により洗浄しＰＢＭＣとして使用
した。ヒトＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ(商標)フローサイトメーター
によってヒトＰＢＭＣから単離し、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞として使用した。

＜ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞のＴｈ１誘導条件での培養＞
抗ＣＤ３ｍＡｂ（BD Biosciences）を細胞培養プレートにプレコートした。抗ＣＤ３ｍＡ
ｂの濃度は、ＲＮＡシーケンス、および酸素消費速度（ＯＣＲ）と細胞外酸性化速度（Ｅ
ＣＡＲ）を検出する代謝分析のためには５μｇ／ｍｌで、他の分析のためには１０μｇ／
ｍｌでプレコートした。抗ＩＬ－４ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ；eBioscience）、マウス組
み換えＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍｌ；Peprotech）、および抗ＣＤ２８ｍＡｂ（２μｇ／
ｍｌ；BD Biosciences）存在下で、マウスナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を７２ｈ培養した。ヒ
トのナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（細胞：ビーズ＝１：０．５
； Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）、抗ＩＬ－４ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ；eBi
oscience）、および組み換えマウスＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍｌ；Peprotech）存在下で
７２ｈ培養した。ＬｙｓｏＰＳ存在下での培養は、培養開始２４ｈ後に、７０％エタノー
ルに溶解したＬｙｓｏＰＳを、終濃度１０μＭで添加した。ＬｙｓｏＰＳ不存在下での培
養（コントロール）は、ビークル（７０％エタノール）をＬｙｓｏＰＳ溶液と同時期に等
量添加した。この培養方法は、マウスまたはヒトのナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞をインビトロ
でＴｈ１細胞に誘導するための培養方法であり、本明細書では、この培養方法をＴｈ１誘
導条件での培養という。また、特に断りが無い限り、時間、濃度等を同条件とした。

＜フローサイトメトリー＞
Anti-mouse CD4-PerCP/Cy5.5 (GK1.5), anti-mouse IL-10-PE (JES5-16E3), anti-mouse
IFN-γ -FITC (XMG1.2), 7-AAD, anti-human CD4-APC (clone SK3), anti-human CD45RA-
Brilliant Violet 421 (HI100), anti-human CD4-Pacific Blue (RPA-T4), anti-human I
FN-γ (4S.B3)は、BioLegend (San Diego, CA, USA)から購入した。Anti-mouse CD3e-Pe/
Cy7 (145-2C11), anti-mouse IL-17A-Alexa Fluor 647 (TC11-18H10) はBD Biosciences
から購入した。マウスおよびヒトのＣＤ４^＋Ｔ細胞を、GolgiStop (BD Biosciences)存在
下、４ｈ３７℃で、完全ＲＰＭＩ１６４０中５０ｎｇ／ｍｌホルボールミリステートアセ
テート（ＰＭＡ； Sigma-Aldrich）と５μＭイオノマイシン（Sigma-Aldrich）によって
刺激した。細胞表面／細胞内を、Cytofix/Cytoperm Kit Plusを使って染色した。フロー
サイトメトリー分析はFlowJo software (Tree Star, Ashland, OR, USA)を使用したFACSC
anto II flow cytometer (BD Biosciences)によって実行した。

＜定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）＞
マウスサンプルからの全ＲＮＡは、RNeasy Mini Kit （Qiagen, Valencia, CA, USA）を
使用して抽出し、相補的ＤＮＡは、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（東洋紡績、大阪
、日本）を使用して合成した。リアルタイム定量ＰＣＲは、Applied Biosystems （Foste
r City, MA, USA）から得たプライマー、THUNDERBIRD（登録商標） Probe qPCR mix（東
洋紡績、大阪、日本）、および ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied
Biosystems)を使用して実行した。

＜病理組織解析＞
マウスの結腸と回腸のサンプルはホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、４μｍ
の厚さの切片を作製し、ヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）によって染色した。評価に
用いた組織学的スコアは、Iijima, H. et al. J Exp Med 199, 471-482に準じた。

＜統計分析＞
結果は平均と標準偏差で表される。グループ間の平均値の差は、Student's t-test また
は、one-way ANOVA（GraphPad Prism version 8.4.3 (GraphPad Software, San Diego, C
A, USA)）によって検定した。

＜試験例１：クローン病患者の腸内ＬｙｓｏＰＳ濃度＞
クローン病患者（以下、「ＣＤ患者」ともいう）の腸管腔の脂質プロファイルの特徴を確
認した。クローン病患者と健常者からサンプル提供者を募集した。炎症性腸疾患研究の国
際機関によって定められた内視鏡的、放射線学的、組織学的、臨床診断基準に従ってＩＢ
Ｄ患者を診断した。クローン病患者は、ＣＤＡＩスコアが１５０より小さい場合に寛解期
と定義される。研究はヘルシンキ宣言に従って実行され、大阪大学医学部附属病院で倫理
審査委員会によって承認された。研究に参加する前に、すべての参加者に書面によるイン
フォームド・コンセントが行われた。クローン病患者４３人（活動期１９人、寛解期２４
人）と健常者４０人から糞便サンプルを収集し、直ちに凍結した。

凍結した糞便サンプルをメタノール添加のうえホモジナイズし、ＵＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ
／ＭＳによって脂質量を測定したところ、糞便中の脂質組成は健常人とＣＤ患者の間で明
確に相違していた。血漿中リン脂質濃度に類似して、全ＬｙｓｏＰＳ、１８：０ Ｌｙｓ
ｏＰＳ、および１８：１ ＬｙｓｏＰＳの濃度は、健常者よりＣＤ患者で高かった。これ
は、ＬｙｓｏＰＳ産生がＣＤ患者の腸の中でアップレギュレートされていることを示す。

＜試験例２：ＬｙｓｏＰＳによる大腸炎の増悪＞
ＬｙｓｏＰＳレベル上昇が腸炎の重症度に与える影響を２種類の大腸炎モデルマウスを用
いて解析した。

Ａ．ＴＮＢＳ誘導大腸炎モデルマウス（クローン病モデルマウス）
ＴＮＢＳ誘導大腸炎モデルマウスを以前報告した方法（Iijima, H. et al. J Exp Med 19
9, 471-482, (2004)） にわずかな修正を加えて作製した。すなわち、野生型Ｃ５７ＢＬ
／６Ｊマウス（雄、８－１０週齢）をｄａｙ１に５０％のエタノール中３．７５％ＴＮＢ
Ｓ溶液１５０μｌを背皮膚へ塗布することにより感作した。ｄａｙ８に、５０％エタノー
ル中２％ＴＮＢＳ溶液１５０μｌを経肛門投与した。ｄａｙ８からｄａｙ１１まで毎日１
回１８:１ ＬｙｓｏＰＳを２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内投与し、ｄａｙ１２にマ
ウスを解析に用いた。コントロールマウスにはビークル（７０％エタノール）を投与した
。

ＬｙｓｏＰＳ投与マウスでは、コントロールマウスと比較して、体重減少と結腸の短縮が
観察され（図１、図２）、病理組織解析においても悪化は明らかであった（図３）。結腸
の粘膜固有層リンパ球中のサイトカインｍＲＮＡ発現量をｑＲＴ－ＰＣＲを用いて測定し
たところ、ＬｙｓｏＰＳ投与マウスでは、コントロールマウスに比較して、ＩｆｎｇとＩ
ｌ１７ａの発現量が高かったが、Ｉｌ１０、Ｉｌ１２ｂ、およびＩｌ２３ａの発現量に有
意差はなかった（図４）。

Ｂ．Ｔ細胞依存的大腸炎モデルマウス（クローン病モデルマウス）
ＣＤ４^＋Ｔ細胞依存的大腸炎モデルマウスを文献（Ostanin, D. V. et al. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol 296, G135-146, (2009)）に記載の方法にわずかな修正を
加えて作製した。単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で終濃度
１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈して、５００μｌ（５×１０^５ｃｅｌｌｓ）をＲａｇ
２^－/－マウス（雄、８－１５週齢）に腹腔内投与した。ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を投与
した１７日後、連続４日間１８：１ ＬｙｓｏＰＳ（２．５ｍｇ／ｋｇ）またはビークル
（７０％エタノール）を腹腔内に投与した。

ＬｙｓｏＰＳ投与マウスで、結腸の短縮、体重減少が観察された（図５、図６）。さらに
、病理組織解析ではＬｙｓｏＰＳによる大腸組織病変の顕著な増悪が観察された（図７）
。結腸の病理組織による重症度の評価は、Liu, Z. et al. J Immunol 164, 6005-6014に
記載の方法に準じて行った。大腸の粘膜固有層のＣＤ４^＋Ｔ細胞中のサイトカイン産生細
胞数をフローサイトメトリー法で解析したところ、コントロールマウスと比較して、Ｌｙ
ｓｏＰＳ投与マウスでは大腸炎の増悪に伴いＩＦＮ－γ^＋細胞およびＩＦＮ－γ^＋ＩＬ－
１７Ａ^＋細胞が増加したが、ＩＬ－１７Ａ^＋細胞およびＩＬ－１０^＋細胞は増加しなかっ
た（図８）。

これら結果は、ＬｙｓｏＰＳが粘膜固有層において免疫病理学的なＴｈ１応答を呼び起す
ことによって大腸炎を悪化させることを示す。すなわち、ＬｙｓｏＰＳは腸粘膜において
Ｔｈ１細胞の過剰活性化を引き起こして炎症性腸疾患を悪化させる。

＜試験例３：ＬｙｓｏＰＳの分化促進作用＞

マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、１８：１ ＬｙｓｏＰＳ存在下また
は不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した。ＩＦＮ－γ産生細胞数をフローサイトメトリー
法により測定したところ、ＬｙｓｏＰＳ添加（１０μＭ）によりＩＦＮ－γ産生細胞数は
２倍以上に増加した（図９Ａ）。ＬｙｓｏＰＳ添加濃度を０．１μＭ、１μＭおよび１０
μＭに設定した以外は同様の方法で培養した後、ＥＬＩＳＡ法（IFN gamma Mouse Uncoat
ed ELISA Kit (eBioscience, San Diego, CA, USA)）によりＩＦＮ－γ産生量を測定した
。ＩＦＮ－γ産生量はＬｙｓｏＰＳ添加量に依存して増加した（図９Ｂ）。

マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、１８：０ ＬｙｓｏＰＳ存在下また
は不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した。ＩＦＮ－γ産生細胞数をフローサイトメトリー
法により測定したところ、ＬｙｓｏＰＳによりＩＦＮ－γ産生細胞数は増加した（図１０
）。

これらの結果は、ＬｙｓｏＰＳが直接ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞のエフェクター機能を活性
化しＴｈ１細胞に誘導することを示す。すなわち、ＬｙｓｏＰＳが直接ナイーブＣＤ４^＋
Ｔ細胞の分化を促進する。

＜試験例４：ＬｙｓｏＰＳにより誘導されたＴｈ１細胞内の遺伝子発現プロファイル＞
ＬｙｓｏＰＳのＴ細胞のエフェクター機能の活性化作用を明らかにするために、インビト
ロで生成されたマウスＴｈ１細胞中の遺伝子発現プロファイルをＲＮＡシーケンス（ＲＮ
Ａ－ｓｅｑ）分析により分析した。

Ａ．ＲＮＡシーケンシング
マウス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を１８：１ ＬｙｓｏＰＳ存在下または
不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した。培養後にＰＭＡとイオノマイシンを添加し、その
９０分後に細胞を回収しＲＮＡシーケンシングを行った。ライブラリーの作製は、TruSeq
stranded mRNA sample prep kit （Illumina, San Diego, CA, USA）を使用して実行し
た。シーケンシングは、75-base single-end modeでIllumina HiSeq 2500 platformで実
行した。シーケンスリードはBowtie2 ver. 2.2.3 と SAMtools ver. 0.1.19を組み合わせ
て、TopHat v2.0.13を使用してマウス参照ゲノム配列（ｍｍ１０）にマップした。100万
のマッピングされた分子あたりのエクソン１０００塩基あたりの分子はCufflinks versio
n 2.2.1 (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/)を用いて計算された。増加
する遺伝子とパスウェイはBioJupies (https://amp.pharm.mssm.edu/biojupies/)を用い
て同定された。この研究に関連する生データはGene Expression Omnibus に提出する。

Ｂ．１８：１ ＬｙｓｏＰＳにより発現が促進された遺伝子
ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析により、Ｔｈ１に誘導された細胞内では、５２
１個の遺伝子の発現が増加していたことが明らかになった。さらに、ＢｉｏＪｕｐｉｅｓ
プラットフォームでのpathway enrichment分析により、ＬｙｓｏＰＳによりＴｈ１に誘導
された細胞の中でアップレギュレートされたパスウェイが明らかになった。アップレギュ
レートされたパスウェイトップ１０の中の６パスウェイは、脂質とリポタンパク質の代謝
、解糖、および糖新生の代謝並びに炭素代謝を含めて、代謝プロセスと関連していた。こ
れら結果から、ＬｙｓｏＰＳが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のエフェクター活性を駆動するために、
細胞内代謝を促進させる可能性が高いと考えられた。

＜試験例５：ＬｙｓｏＰＳによるＣＤ４^＋Ｔ細胞内の代謝促進＞
酸素消費速度（ＯＣＲ：ミトコンドリア呼吸の指標）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ：解
糖系の指標）を測定して、マウス脾細胞から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞の代謝を解
析した。

マウスナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を１８：０または１８：１ ＬｙｓｏＰＳの存在下または
不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した。培養後回収した細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ：ミ
トコンドリア呼吸の指標）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ：解糖系の指標）を、Seahorse
XF Cell Mito Stress test Kit と XFe96 Extracellular Flux Analyzer （Seahorse Bi
oscience, North Billerica, MA, USA）を使用して測定した。すなわち、回収した細胞を
１０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭ ｐｙｒｕｖａｔｅ、および２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍ
ｉｎｅを含んでいるＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ ＲＰＭＩ培地中、ＸＦｅ９６細胞培養プレ
ート上に各ウェルあたり２×１０^５ｃｅｌｌｓで播種した。ベースライン値を測定した後
に、１．５μＭ ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ、２μＭ ｆｌｕｏｒｏ－ｃａｒｂｏｎｙｌ ｃ
ｙａｎｉｄｅ ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ（ＦＣＣＰ）、および０．５μＭ ｒｏ
ｔｅｎｏｎｅ／ａｎｔｉｍｙｃｉｎ Ａ を各ウェルに自動的に注入し、各時点のＯＣＲ
とＥＣＡＲを測定した。

ＬｙｓｏＰＳ存在下で培養されたマウスＴｈ１細胞はＬｙｓｏＰＳ不存在下で培養された
細胞より、高いＯＣＲと高いＥＣＡＲが計測された。（図１１、図１２）。ＬｙｓｏＰＳ
により、ＣＤ４^＋Ｔ細胞中でミトコンドリア呼吸と解糖系の代謝が促進されていることが
明らかになった。

＜試験例６：解糖系阻害によるＬｙｓｏＰＳ刺激Ｔｈ１細胞誘導の抑制＞
次に、ＬｙｓｏＰＳが解糖のアップレギュレーションを通してエフェクター機能を活性化
するかどうかを、解糖系を抑制するグルコースアナログである２―デオキシ―Ｄ―グルコ
ース（２ＤＧ）を用いて解析した。マウス脾細胞から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞またはヒト
ＰＢＭＣから単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞を１８：１ ＬｙｓｏＰＳ存在下または不存在下、
Ｔｈ１誘導条件で培養した。培養開始から２４時間後に、２ＤＧ添加群には２ＤＧ（３５
０μＭ）を添加し、２ＤＧ非添加群には、ビークル（ＰＢＳ）を添加した。培養後に細胞
を回収してフローサイトメトリー法によりＩＦＮ―γ産生細胞数の割合を解析した（図１
３）。マウスおよびヒトのＣＤ４^＋Ｔ細胞をＬｙｓｏＰＳにより刺激するとＩＦＮ－γ産
生細胞数が増大するが、その増大は２ＤＧにより阻害された。これら結果は、ＬｙｓｏＰ
Ｓ依存的なＴｈ１細胞の誘導は解糖系阻害により抑制されることを示している。すなわち
ＬｙｓｏＰＳ刺激によるＴｈ１過剰活性化は解糖系阻害により抑制されることが示された
。

＜試験例７：ＬｙｓｏＰＳ受容体＞
マウスナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞をＴｈ１誘導条件またはＴｈ０条件（抗ＩＦＮ－γ抗体、
抗ＩＬ－４抗体存在下で培養）で７２ｈ、１８：１ ＬｙｓｏＰＳの存在下（１０μＭ）
で培養し、ＬｙｓｏＰＳ受容体として同定されているＧｐｒ３４、Ｇｐｒ１７４、Ｐ２Ｙ
１０（遺伝子はＰ２ｒｙ１０）の発現量をＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析によ
り調べた。ＬｙｓｏＰＳは培養開始後２４時間後に添加した。培養条件にかかわらず他の
受容体と比較してＰ２Ｙ１０の発現量が高いことが確認された。

＜試験例８：Ｒｈｏ／ＲＯＣＫシグナル抑制＞
Ｐ２Ｙ１０の下流のＲｈｏ／ＲＯＣＫシグナルを抑制することにより、ＬｙｓｏＰＳによ
って誘導されるＴｈ１の過剰活性化（Ｔｈ１のエフェクター機能の活性化）が抑制される
か否かについて解析した。マウスナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、１８：１ ＬｙｓｏＰＳの
存在下または不存在下、Ｔｈ１誘導条件で培養した。培養開始から２４ｈ後に、ＲＯＣＫ
抑制剤であるファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）添加群には、ファスジル（０．３３μＭ）を
添加し、ファスジル非添加群には、ビークル（ＤＭＳＯ）を添加した。ＩＦＮ－γ産生細
胞の割合をフローサイトメトリー法によって測定したところ、ＬｙｓｏＰＳ刺激によるＩ
ＦＮ－γ産生細胞の増加はファスジルによって抑制された（図１４）。酸素消費速度（Ｏ
ＣＲ）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を上記試験例５と同様の方法で測定したところ、
ＬｙｓｏＰＳ添加によりベースライン値および最大値とも上昇するが、ファスジルはこれ
らの上昇を阻害した（図１５、図１６）。これらの結果は、ＬｙｓｏＰＳのＴｈ１の過剰
活性化（エフェクター機能の活性化）は、Ｐ２Ｙ１０の下流のＲｈｏ／ＲＯＣＫシグナル
の活性化を介することを示す。また、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫシグナル抑制剤により、Ｌｙｓｏ
ＰＳによるＴｈ１の過剰活性化（エフェクター機能活性化）が抑制され、大腸炎等の炎症
性腸疾患を治療できることを示す。

＜試験例９：Ｐ２Ｙ１０ノックアウトマウス＞
Ｐ２Ｙ１０ノックアウトマウスを作製した。Ｐ２Ｙ１０の遺伝子Ｐ２ｒｙ１０は、マウス
染色体Ｘ上にあり、その染色体Ｘの近い位置に高いホモロジーを示すＰ２ｒｙ１０ｂがあ
ることが知られている。よって、Ｐ２ｒｙ１０とＰ２ｒｙ１０ｂ両方を欠くノックアウト
マウス（Ｐ２ｒｙ１０^－／ｙＰ２ｒｙ１０ｂ^－／ｙマウス）を作製した（図１７Ａ）。CR
ISPR RNA (crRNA)/trans-activating crRNA/Cas9 ribonucleoprotein solution (Sigma-A
ldrich, St. Louis, MO, USA)をエレクトロポレーター（Nepagene、千葉、日本）を用い
て受精卵（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）に導入することによって標的遺伝子欠損マウスを作製した
。受精卵は２０時間ＫＳＯＭ（アーク・リソース、熊本、日本）で培養した。培養後、受
精卵を、３種の麻酔薬の混合溶液（０．００３％塩酸メデトミジン、０．０４％のミダゾ
ラム、０．０５％の酒石酸ブトルファノール）２５０μｌの腹腔内投与で麻酔をかけられ
た偽妊娠の雌の卵管に移入した。ｇＲＮＡとオフターゲット配列を検索するために、CRIS
PRdirect software (https://crispr.dbcls.jp/) と Benchling (https://www.benchlin
g.com/crispr/) を使用した。Ｐ２ｒｙ１０／Ｐ２ｒｙ１０ｂ二重欠損マウスを作製する
ためのｇＲＮＡのターゲット配列は、５’－ＡＣＴＡＴＴＡＴＡＴＣＡＡＴＣＧＴＣＡＣ
－３’（＃１）（配列番号５）と ５’－ＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＡＧＧＴＡＣＧＡＴＧ－
３’（＃２）（配列番号６）であった。得られた変異マウスのスクリーニングはゲノムＰ
ＣＲに続いてダイレクトシーケンスをすることによって行った（図１７Ｂ，Ｃ）。ゲノム
ＰＣＲのプライマーの配列を以下に示す。
ＦＷ：ＴＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡＡＴＡＴＴＣＡＡ（配列番号７）
ＲＶ１：ＧＧＴＧＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧ（配列番号
８）
ＲＶ２：ＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＧ（配列番号９）
図１７ＣにＷｉｌｄ－ｔｙｐｅのＰ２ｒｙ１０内切断部位の近傍配列（配列番号１０）お
よびそれに対応するノックアウト後の配列（配列番号１１）、ならびに、Ｗｉｌｄ－ｔｙ
ｐｅのＰ２ｒｙ１０ｂ内切断部位の近傍配列（配列番号１２）およびそれに対応するノッ
クアウト後の配列（配列番号１３）を示す。ジャームライン・トランスミッション（germ
line transmission）は、得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させる
ことによって確認した。

得られたノックアウトマウス（Ｐ２ｒｙ１０^－／ｙＰ２ｒｙ１０ｂ^－／ｙマウス）の結腸
粘膜固有層と脾臓からナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を単離して、サイトカイン産生細胞の割合
をフローサイトメトリー法により測定し、野生型マウスと比較した。ノックアウトマウス
の結腸粘膜のＣＤ４^＋Ｔ細胞は、野生型と比較してＩＦＮ－γ産生細胞およびＩＬ－１７
産生細胞の割合が減少していた。一方、脾臓のＣＤ４^＋Ｔ細胞は、野生型と比較してサイ
トカイン産生細胞割合に差は認められなかった（図１８）。

＜試験例１０：Ｐ２Ｙ１０欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞移入Ｒａｇ２^－／－マウスの体重変化と病
理組織像＞
試験例２のＴ細胞依存的大腸炎モデルマウスの作製方法と同様の方法により、野生型マウ
ス脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞（以下「野生型のＣＤ４^＋Ｔ細胞」という）
をＲａｇ２^－／－マウスに移入した。同様に、ノックアウトマウス（Ｐ２ｒｙ１０^－／ｙ
Ｐ２ｒｙ１０ｂ^－／ｙマウス）脾臓から単離したナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞（以下「Ｐ２Ｙ
１０欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞」という）をＲａｇ２^－／－マウスに移入した。細胞移入の日を
ｄａｙ０としてｄａｙ２０からｄａｙ２２の３日間に毎日１回、１８：１ ＬｙｓｏＰＳ
（２．５ｍｇ／ｋｇ）またはビークル（エタノール７０％）を腹腔内投与し、ｄａｙ２３
に解析した。野生型のＣＤ４^＋Ｔ細胞移入マウスはＬｙｓｏＰＳ投与により大幅に体重が
減少し、大腸の病理組織像に粘膜下層への広範囲の炎症細胞浸潤など病変が観察された。
一方Ｐ２Ｙ１０欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞移入マウスは、ＬｙｓｏＰＳが投与されても体重減少
は抑制され、病理組織像に病変は観察されなかった（図１９、図２０）。この結果は、受
容体Ｐ２Ｙ１０の機能を遮断または抑制することにより、ＬｙｓｏＰＳによる炎症性腸疾
患の増悪が抑制されることを示す。

＜試験例１１：Ｐ２Ｙ１０欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ産生＞
野生型のＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＰ２Ｙ１０欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞を１８：１ ＬｙｓｏＰＳ
存在下または不存在下でＴｈ１誘導条件で培養し、フローサイトメトリー法によりＩＦＮ
－γ産生細胞の割合を測定し、ＣＢＡアッセイ法（Mouse IFN-γ Flex Set (BD Bioscien
ces) ）によりＩＦＮ－γ産生量を測定した。ＩＦＮ産生細胞数とこれら細胞のＩＦＮ―
γ産生量は、ＬｙｓｏＰＳ不存在では、Ｐ２Ｙ１０欠損ＣＤ４^＋Ｔ細胞と野生型のＣＤ４
^＋Ｔ細胞の間に差はなかった。すなわち、ＬｙｓｏＰＳ不存在では、Ｐ２Ｙ１０欠損はＩ
ＦＮ－γ産生に影響しなかった。一方、野生型のＣＤ４^＋Ｔ細胞では、ＬｙｓｏＰＳ添加
によりＩＦＮ－γ産生細胞数およびＩＦＮ－γ産生量が顕著に増大した。Ｐ２Ｙ１０欠損
ＣＤ４^＋Ｔ細胞では、野生型でみられたＩＦＮ－γ産生細胞数およびＩＦＮ－γ産生量の
増大が顕著に抑制された（図２１）。この結果は、ＬｙｓｏＰＳはＰ２Ｙ１０受容体を介
してＴｈ１の過剰活性化（Ｔｈ１エフェクター機能誘導）を促進して、炎症性腸疾患の増
悪に関与することを示している。すなわち、受容体Ｐ２Ｙ１０の機能を抑制することによ
り、Ｔｈ１細胞の過剰活性化（Ｔｈ１のエフェクター機能誘導）が抑制されることを示す
。

本発明は、炎症性腸疾患の治療に貢献する。

Claims (9)

1. リゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制
   する物質を含有する炎症性腸疾患治療用組成物。
2. 前記リゾホスファチジルセリン受容体がＰ２Ｙ１０である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記機能を抑制する物質が、Ｐ２Ｙ１０の機能を抑制する物質である、請求項２に記載の
   組成物。
4. 前記機能を抑制する物質が、Ｐ２Ｙ１０の下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制す
   る物質である、請求項２に記載の組成物。
5. 前記細胞内シグナル伝達物質が、Ｒｈｏキナーゼである、請求項４に記載の組成物。
6. 前記炎症性腸疾患が、Ｔｈ１細胞の過剰活性化を伴う炎症性腸疾患である、請求項１～５
   のいずれか１に記載の組成物。
7. リゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物質の機能を抑制
   する物質を含有する腸粘膜におけるＴｈ１細胞の過剰活性化を抑制するための組成物。
8. Ｔｈ１細胞上のリゾホスファチジルセリン受容体またはその下流の細胞内シグナル伝達物
   質の機能を抑制する活性を測定する工程を含む、炎症性腸疾患を治療するための物質のス
   クリーニング方法。
9. リゾホスファチジルセリン存在下で、試験物質とＴｈ１細胞を接触させる工程を含む請求
   項８のスクリーニング方法。
   
   
   

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