JP2022513384A - 抗ｃｔｌａ４抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用 - Google Patents

抗ｃｔｌａ４抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2022513384A
JP2022513384A JP2021547665A JP2021547665A JP2022513384A JP 2022513384 A JP2022513384 A JP 2022513384A JP 2021547665 A JP2021547665 A JP 2021547665A JP 2021547665 A JP2021547665 A JP 2021547665A JP 2022513384 A JP2022513384 A JP 2022513384A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
ctla4
antibodies
cancer
antibody fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2021547665A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7445995B2 (ja
JPWO2020092155A5 (ja
Inventor
ジェイ エム ショート
ガーハード フレイ
フウェイ ウェン チャング
Original Assignee
バイオアトラ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バイオアトラ インコーポレイテッド filed Critical バイオアトラ インコーポレイテッド
Publication of JP2022513384A publication Critical patent/JP2022513384A/ja
Publication of JPWO2020092155A5 publication Critical patent/JPWO2020092155A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7445995B2 publication Critical patent/JP7445995B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70521—CD28, CD152

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

ＣＴＬＡ４タンパク質に特異的に結合する重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を有するポリペプチド、ならびにＣＴＬＡ４タンパク質に結合する重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む抗体および抗体断片。また、そのポリペプチド、またはそのポリペプチドを含む抗体および抗体断片を含む、医薬組成物およびキットも提供される。【選択図】図３Ａ

Description

本開示は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗体断片、ならびにかかる抗体および抗体断片の免疫コンジュゲート、ならびに診断および治療の方法における抗体、抗体断片および免疫コンジュゲートの使用に関する。
脊椎動物の免疫系は、最適な免疫活性化を達成するために複数のシグナルを必要とする。例えば、Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｏｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５４：１－１４（１９８９）；Ｐａｕｌ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．，ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９８）、特に、ページ１２、１３および４１１～４７８を参照されたい。Ｔリンパ球（Ｔ細胞）と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の相互作用は、免疫活性化に不可欠である。Ｔ細胞およびＡＰＣ上に見出される多くの凝集分子のレベルは、免疫活性化中に増加する（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２２３－２５２（１９８７）、Ｓｈａｗ ａｎｄ Ｓｈｉｍｕｚｕ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｋｉｎｄｔ ａｎｄ Ｌｏｎｇ．１：９２－９７（１９８８））、およびＨｅｍｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，９：１０９－１１３（１９８８））。これらの分子のレベルの増加は、活性化されたＡＰＣが、抗原特異的にＴ細胞の増殖を刺激する上で、安静時のＡＰＣよりも効果的である理由を説明するのに役立ち得る（Ｋａｉｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：１０９－１１４（１９８３）、Ｋｒｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２９３７－２９４５（１９８５）、ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１：２９０７－２９１１（１９８８）、およびＨａｗｒｙｌｏｗｉｃｚ ａｎｄ Ｕｎａｎｕｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１：４０８３－４０８８（１９８８））。
Ｔ細胞免疫応答は、細胞と細胞の相互作用、特に、Ｔ細胞とＡＰＣなどの補助細胞との間の相互作用（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．，５：２２３－２５２（１９８７））、ならびに可溶性の免疫媒介物（サイトカインまたはリンホカイン）の産生（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊｏｕｒ： Ｍｅｄ．，３１７：９４０－９４５（１９８７）、Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１１０９－１１１８（１９９７））を伴う複雑なプロセスである。免疫応答は、Ｔ細胞受容体複合体を含むいくつかのＴ細胞表面受容体（Ｗｅｉｓｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：５９３－６１９（１９８６））、および他の「補助」表面分子（Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：４１４－４１９（１９９４）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９８７）、上記参照）によって調節される。これらの補助分子の多くは、細胞の表面上のモノクローナル抗体の反応性によって定義される、天然に存在する細胞表面の分化抗原である（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｅｄ．，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｉｐｉｎｇ ＩＩＩ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．（１９８７））。
ＣＴＬＡ４は、もともとマウス細胞溶解性Ｔ細胞のｃＤＮＡライブラリの差分スクリーニングによって特定されたＴ細胞表面分子である（Ｂｒｕｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：２６７－２７０（１９８７））。ＣＴＬＡ４は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーでもある。ＣＴＬＡ４は、単一の細胞外Ｉｇドメインを含む。ＣＴＬＡ４転写産物は、細胞傷害性活性を有するＴ細胞集団で見出されており、ＣＴＬＡ４が細胞溶解性応答において機能し得ることが見出されている（Ｂｒｕｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）；Ｂｒｕｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１０３：２１－３６（１９８８））。研究者らは、ＣＴＬＡ４のヒト対応物について、遺伝子のクローニング、およびＣＤ２８と同じ染色体領域（２ｄ、３３－３４）へのマッピングを報告した（Ｄａｒｉａｖａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ： Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．，１８：１９０１－１９０５（１９８８））、ＣＤ２８（Ｌａｆａｇｅ－Ｐｏｃｈｉｔａｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３１：１９８－２０１（１９９０））。このヒトＣＴＬＡ４のＤＮＡとＣＤ２８タンパク質をコードするＤＮＡとの間の配列比較により、著しい配列の相同性が明らかになり、膜近傍領域および細胞質領域において最大程度の相同性を有する（Ｂｒｕｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８（上記参照）、Ｄａｒｉａｖａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８（上記参照））。
いくつかの研究では、ＣＴＬＡ４が二次共刺激因子として類似の機能を有することが示唆されている（Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１５９５－１６０４（１９９２）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５：１３２７－１３３５（１９９７）、および米国特許第５，９７７，３１８号、同第５，９６８，５１０号、同第５，８８５，７９６号、および同第５，８８５．５７９号）。しかしながら、他者は、ＣＴＬＡ４がＴ細胞活性化の抑制因子として反対の役割を有することを報告している（Ｋｒｕｍｍｅｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２：４５９－４６５（１９９５）、Ｋｒｕｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：５１９－５２３（１９９６）、Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７：８８５－８９５（１９９７））。ＣＴＬＡ４欠損マウスが大規模なリンパ増殖を被ることが報告されている（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、上記参照）。また、ＣＴＬＡ４の遮断は、インビトロ（Ｗａｌｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：４０５－４１３（１９９４））およびインビボ（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１０３２－１０３６（１９９５））で、Ｔ細胞応答を増強し、抗腫瘍免疫を悪化させ（Ｌｅａｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１７３４－１７３６（１９９６））、誘発性自己免疫疾患を増強する（Ｌｕｈｄｅｒ，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：４２７－４３２（１９９８））ことも報告されている。ＣＴＬＡ４はまた、Ｔ細胞免疫応答の初期特徴に代替的または追加的な影響を与えることも報告されている（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：３９６－４０４（１９９７）、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１９８９－１９９３（１９９７）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７：４４５－４５０（１９９７））。これは、一部の自己免疫患者が、ＣＴＬＡ４に対する自己抗体を有するという観察と一致している。ＣＴＬＡ４の遮断抗体は、これらの患者において、病原性の役割を有する可能性がある（Ｍａｔｓｕｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：４３２８－４３３５（１９９９））。
ＣＴＬＡ４は、内因性および外因性メカニズムの両方を介して、免疫活性化を負に調節することが示されている。Ｇｒｏｓｓｏ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：５（２０１３）を参照されたい。具体的には、（ｉ）ＡＰＣ上のＣＤ８０およびＣＤ８６を介したリバースシグナル伝達が、Ｔ細胞応答を抑制するおよび／またはナイーブＴ細胞のＴｒｅｇへの転換を促進する、（ｉｉ）ＣＴＬＡ３を介したシグナル伝達が、ＴＧＦ－βなどの調節性サイトカインの産生を刺激し、ＡＰＣによる抗原提示の阻害およびＴ細胞機能の阻害をもたらす、（ｉｉｉ）ＣＴＬＡ４がＣＤ８０／ＣＤ８６に結合すると、ＣＤ２８による結合のためのリガンドの利用可用性が減少する、（ｉｖ）ＣＴＬＡ４がＣＤ８０／ＣＤ８６に結合すると、それらのトランスエンドサイトーシスを引き起こし、ＡＰＣがＴ細胞を活性化する能力を減少させる、（ｖ）ＣＴＬＡ４が、ＰＰ２ＡおよびＰＴＰＮ１１などの阻害タンパク質をＴ細胞シナプスに動員し、ＣＤ２８およびＴＣＲを介したシグナル伝達を阻害する、（ｖｉ）ＣＴＬＡ４が、ＣＤ８０／８６を占有する高親和性競合因子として作用し、それによってＣＤ２８による結合が阻止される、（ｖｉｉ）ＣＴＬＡ４の可溶性スプライスバリアントが、Ｔ細胞活性化を阻害することが可能な場合がある、（ｖｉｉｉ）ＣＴＬＡ４が、ＡＰＣによるＴ細胞の活性化に重要なＴ細胞の停止シグナルを阻害する。
したがって、ＣＴＬＡ４の阻害は、適応免疫応答およびＴ細胞活性化の刺激を促進することが示されている。ＣＴＬＡ４遮断抗体は、癌のマウスモデルにおいて有効であることが示されており、イピリムマブ（ＷＯ２００１／０１４４２４）およびトレメリムマブなどの抗ＣＴＬＡ４抗体は、癌における抗腫瘍免疫を促進するための戦略として研究されている。ＣＴＬＡ４の遮断は、慢性ウイルス感染などのＴ細胞の枯渇に関連する障害のための有望な治療戦略でもある。
ＣＴＬＡ４に対する抗体は、以前に開発されている。米国特許第９，７５８，５８３号は、癌の治療のための組成物に製剤化され得るヒトおよびマウスＣＴＬＡ４の一方または両方に結合すると言われる抗体または抗体断片を開示している。抗体または抗体断片のいくつかはまた、任意選択的に、ヒトＣＴＬＡ４とヒトＣＤ８０もしくはＣＤ８６との間、またはマウスＣＴＬＡ４とマウスＣＤ８０もしくはＣＤ８６との間の相互作用もしくは機能的会合を、阻害もしくは防止するとも言われている。ＣＴＬＡ４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用または機能的会合のかかる阻害または予防は、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ４シグナル伝達、またはＣＤ８６／ＣＴＬＡ４シグナル伝達の、ＣＤ８０またはＣＤ８６媒介性活性化を阻害または防止する可能性がある。
また、ＵＳ２００９／０２５２７４１は、ヒトＣＴＬＡ４に結合するモノクローナル抗体も開示している。これらの抗ＣＴＬＡ４抗体は、癌に対する保護を誘導し、いくつかの自己免疫性副作用も示すとも言われている。癌に対する最も強い保護を誘導した抗体はまた、最小の自己免疫性副作用を誘導した。ＵＳ２００９／０２５２７４１はまた、癌保護と自己免疫性副作用との間の最も望ましいバランスを有する最適な抗ＣＴＬＡ４抗体または他の治療剤を選択するための方法を提供する。
ＵＳ２０１６／０２３７１５４は、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片に関する、またはそれに由来する組成物および方法を開示している。抗ＣＴＬＡ４抗体および抗体断片は、ヒトＣＴＬＡ４がヒトＢ７に結合することを遮断することができ、したがって、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、または乳癌、病原性感染症、中枢神経系に関連する疾患、例えば、アルツハイマー病を含むアミロイド原性疾患、ならびに移植片対宿主病、宿主対移植片病、アレルギー、自己免疫疾患、および他の炎症性疾患などの炎症性またはアレルギー成分を有する疾患の治療に好適であると言われる。
ＣＴＬＡ４に対する抗体は既知であり、市販されているが、低減された副作用または最小限の副作用を有する癌療法に好適な改善された抗ＣＴＬＡ４抗体を見出すことが望ましい。本発明は、特に、癌の診断および治療のための、治療上および診断上の使用に好適な抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を提供する。これらの抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片のいくつかは、正常組織中に存在するＣＴＬＡ４と比較して、腫瘍中のＣＴＬＡ４に対して、より高い結合親和性を有し得る。これらの抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、典型的には、既知の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片と少なくとも同等の有効性を有する。加えて、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、当該技術分野で既知のモノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体と比較して、低減された副作用を示し得る。これらの利点は、腫瘍中のＣＴＬＡ４のより選択的な治療を提供することができ、腫瘍中のＣＴＬＡ４に対する選択性の結果として、より高い用量のこれらの抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片の使用が可能になる可能性があり、それによって、望ましくない副作用が対応して増加することなく、より効果的な治療処置が実現され得る。
一態様では、本発明は、ＣＴＬＡ４タンパク質と特異的に結合する単離された重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｈ１配列は、ＧＦＴＦＳＨＹＴＭＨ（配列番号１）であり、
Ｈ２配列は、ＦＩＸ1ＹＸ2ＧＮＸ3ＫＸ4Ｘ5ＡＸ6ＳＸ7ＫＧ（配列番号２）であり、
Ｈ３配列は、ＴＧＷＬＧＰＦＤＸ8（配列番号３）であり、
式中、Ｘ1が、ＳまたはＤであり、Ｘ2が、Ｄ、ＨまたはＩであり、Ｘ3が、ＮまたはＹであり、Ｘ4が、ＹまたはＩであり、Ｘ5が、ＹまたはＥであり、Ｘ6が、ＤまたはＫであり、Ｘ7が、ＶまたはＭであり、Ｘ8が、ＹまたはＩである。
別の態様では、本発明は、上に記載の単離された重鎖可変領域ポリペプチドのうちのいずれかと、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有する３つの相補性決定領域を含む単離された軽鎖可変領域ポリペプチドから選択される単離された軽鎖可変領域ポリペプチドとの組み合わせによって形成される生成物を含み、
Ｌ１配列は、ＲＸ9ＳＱＸ10Ｘ11ＧＳＳＹＬＡ（配列番号４）であり、
Ｌ２配列は、ＧＡＦＳＲＡＴＧＸ12（配列番号５）であり、
Ｌ３配列は、ＱＱＤＧＳＳＰＷＴ（配列番号６）であり、
式中、Ｘ9が、ＡまたはＩであり、Ｘ10が、Ｙ、ＳまたはＨであり、Ｘ11が、ＶまたはＧであり、Ｘ12が、ＶまたはＩである。
前述の実施形態の各々において、Ｈ２配列は、ＦＩＤＹＨＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＤＧＮＮＫＩＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＤＧＮＹＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＤＧＮＹＫＹＹＡＫＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＨＧＮＮＫＹＥＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＨＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＩＧＮＹＫＹＹＡＤＳＭＫＧ、およびＦＩＳＹＩＧＮＹＫＹＹＡＤＳＶＫＧから選択され得る。
前述の実施形態の各々において、Ｈ３配列は、ＴＧＷＬＧＰＦＤＹおよびＴＧＷＬＧＰＦＤＩから選択され得る。
前述の実施形態の各々において、Ｌ１配列は、ＲＡＳＱＨＶＧＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＹＧＧＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＹＶＧＳＳＹＬＡ、およびＲＩＳＱＹＶＧＳＳＹＬＡから選択され得る。
前述の実施形態の各々において、Ｌ２配列は、ＧＡＦＳＲＡＴＧＩおよびＧＡＦＳＲＡＴＧＶから選択され得る。
一部の実施形態では、単離された重鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８から選択される配列を有し得る。これらの実施形態の各々において、単離された軽鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７から選択される配列を有し得る。
一実施形態では、抗体は、軽鎖可変領域ポリペプチドと、重鎖可変領域ポリペプチドと、を含み、以下の対から選択される一対の配列を有する：配列番号７および８、配列番号９および１０、配列番号１１および１２、配列番号１３および１４、配列番号１５および１６、配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、配列番号２３および２４、配列番号２５および２６、配列番号２７および２８、配列番号２９および３０、配列番号３１および３２、配列番号３３および３４、配列番号３５および３６、ならびに配列番号３７および３８。
さらに別の態様では、本発明は、上に記載の本発明の単離された重鎖可変領域ポリペプチドのうちのいずれかを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、上に記載の本発明の単離された重鎖可変領域ポリペプチドのうちのいずれかと、上に記載の本発明の単離された軽鎖可変領域ポリペプチドのうちのいずれか１つとの組み合わせを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、上に記載の本発明の抗体または抗体断片のうちのいずれかを含む、免疫コンジュゲートを提供する。免疫コンジュゲートでは、抗体または抗体断片は、化学療法剤、放射性原子、細胞分裂阻害剤、および細胞傷害性剤から選択される薬剤にコンジュゲートされ得る。
さらに別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体とともに、上に記載の本発明のポリペプチド、抗体、抗体断片、および免疫コンジュゲートのうちのいずれかを含む、医薬組成物を提供する。医薬組成物の単回用量は、約１３５ｍｇ、約２３５ｍｇ、約３３５ｍｇ、約４３５ｍｇ、約５３５ｍｇ、約６３５ｍｇ、約７３５ｍｇ、約８３５ｍｇ、約９３５ｍｇ、約１０３５ｍｇ、約１１３５ｍｇ、約１２３５ｍｇ、または約１３８７ｍｇの量のポリペプチド、抗体、抗体断片、または免疫コンジュゲートを含んでもよい。
医薬組成物の単回用量は、１３５～１３８７ｍｇ、１３５～２３５ｍｇ、２３５～３３５ｍｇ、３３５～４３５ｍｇ、４３５～５３５ｍｇ、５３５～６３５ｍｇ、６３５～７３５ｍｇ、７３５～８３５ｍｇ、８３５～９３５ｍｇ、９３５～１０３５ｍｇ、１０３５～１１３５ｍｇ、１１３５～１２３５ｍｇ、または１２３５～１３８７ｍｇの範囲の量のポリペプチド、抗体、抗体断片、または免疫コンジュゲートを含んでもよい。
前述の医薬組成物の各々は、ポリペプチドまたは抗体もしくは抗体断片とは異なる免疫チェックポイント阻害剤分子をさらに含み得る。免疫チェックポイント阻害剤分子は、免疫チェックポイントに対する抗体または抗体断片であり得る。免疫チェックポイントは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＤＲ３、およびＩＣＯＳから選択され得るか、あるいは免疫チェックポイントは、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１であり得る。
前述の医薬組成物の各々は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＣＤ３、ＨＥＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＲＯＲ１、ＳＦＲＰ４、およびＷＮＴタンパク質から選択される抗原に対する抗体または抗体断片をさらに含み得る。ＷＮＴタンパク質は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、およびＷＮＴ１６から選択され得る。
さらに別の態様では、本発明は、診断または治療のためのキットを提供し、キットは、上に記載の本発明のポリペプチド、抗体、抗体断片、または免疫コンジュゲートのうちのいずれかを含む。
さらに別の態様では、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＣＴＬＡ４抗体を提供し、重鎖可変領域は、配列番号３９～４１のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号４２～４４のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域を含む。
前述の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有し得、軽鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列を有し得る。
本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体の例示的な重鎖可変領域の配列整列を示す。 本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体の例示的な軽鎖可変領域の配列整列を示す。 酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定された、ｐＨ６．０における、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体（Ｉｐｉ類似体）に対する、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体のうちの２つのヒトＣＴＬＡ４への結合活性の比較を示す。 ＥＬＩＳＡによって測定された、ｐＨ７．４における、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体（Ｉｐｉ類似体）に対する、図３Ａの本発明の２つの抗ＣＴＬＡ４抗体のヒトＣＴＬＡ４への結合活性の比較を示す。 ＥＬＩＳＡによって測定された、ｐＨ６．０における、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体（Ｉｐｉ類似体）に対する、図３Ａの本発明の２つの抗ＣＴＬＡ４抗体のカニクイザルＣＴＬＡ４への結合活性の比較を示す。 ＥＬＩＳＡによって測定した、ｐＨ７．４における、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体（Ｉｐｉ類似体）に対する、図３Ａの本発明の２つの抗ＣＴＬＡ４抗体のカニクイザルＣＴＬＡ４への結合活性の比較を示す。 イピリムマブおよびイピリムマブ類似体（Ｉｐｉ類似体）に対する、図３Ａの本発明の２つの抗ＣＴＬＡ４抗体のヒトＣＴＬＡ４へのｐＨ依存的結合活性の比較を示す。 ＣＨＯ細胞を使用して蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定された、ｐＨ６．０における、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体（Ｉｐｉ類似体）に対する、図３Ａの本発明の２つの抗ＣＴＬＡ４抗体のヒトＣＴＬＡ４への、半最大有効濃度（ＥＣ50）および結合活性の比較を示す。 ＣＨＯ細胞を使用してＦＡＣＳによって測定された、ｐＨ７．４における、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体（Ｉｐｉ類似体）に対する、図３Ａの本発明の２つの抗ＣＴＬＡ４抗体のヒトＣＴＬＡ４への、ＥＣ50および結合活性の比較を示す。 ＣＨＯ細胞を使用して蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定された、ｐＨ６．０における、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体（Ｉｐｉ類似体）に対する、図３Ａの本発明の２つの抗ＣＴＬＡ４抗体のカニクイザルＣＴＬＡ４への、ＥＣ50および結合活性の比較を示す。 ＣＨＯ細胞を使用してＦＡＣＳによって測定された、ｐＨ７．４における、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体（ｉｐｉ類似体）に対する、図３Ａの本発明の２つの抗ＣＴＬＡ４抗体のカニクイザルＣＴＬＡ４への、ＥＣ50および結合活性の比較を示す。 ＦＡＣＳによって測定された、ｐＨ７．４における、イピリムマブ類似体に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体による、ヒトＣＴＬＡ４のＥＣ50および飽和の比較を示す。 ＦＡＣＳによって測定された、ｐＨ７．４における、イピリムマブ類似体に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体による、カニクイザルＣＴＬＡ４のＥＣ50および飽和の比較を示す。 ＥＬＩＳＡによって測定された、異なる緩衝液の存在下での、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４、ならびにｐＨ６．０またはｐＨ７．４における、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体のヒトＣＴＬＡ４への結合活性を示す。 ＦＡＣＳによって測定された、異なる緩衝液の存在下での、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４、ならびにｐＨ６．０またはｐＨ７．４における、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体のヒトＣＴＬＡ４への結合活性を示す。 ｐＨ６．２における、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養中のＩＬ２の分泌を遮断する、イピリムマブ、イピリムマブ類似体（ｉｐｉ類似体）、ＩｇＧ対照、およびニボルマブ（Ｎｉｖｏ）類似体に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体の活性の比較を示す。 ｐＨ７．４における、ＰＢＭＣ培養中のＩＬ２の分泌を遮断する、イピリムマブ、イピリムマブ類似体（ｉｐｉ類似体）、ＩｇＧ対照、およびニボルマブ類似体に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体の活性の比較を示す。 ｐＨ６．０における、ＣＴＬＡ４とそのリガンドとの間の相互作用を遮断する、イピリムマブ、イピリムマブ類似体（ｉｐｉ類似体）、およびＩｇＧ対照に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体のＥＣ50および活性の比較を示す。 ｐＨ７．４における、ＣＴＬＡ４とそのリガンドとの間の相互作用を遮断する、イピリムマブ、イピリムマブ類似体（ｉｐｉ類似体）、およびＩｇＧ対照に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体のＥＣ50および活性の比較を示す。 ＦＡＣＳによって測定された、ヒトＣＴＬＡ４への競合的結合における、イピリムマブ、イピリムマブ類似体（ｉｐｉ類似体）、およびＩｇＧ対照に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体のＥＣ50および活性の比較を、ＣＴＬＡ４のリガンドｈＢ７－１（ｈＣＤ８０）の濃度の関数として示す。 ＦＡＣＳによって測定された、ヒトＣＴＬＡ４への競合的結合における、イピリムマブ、イピリムマブ類似体（ｉｐｉ類似体）、およびＩｇＧ対照に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体のＥＣ50および活性の比較を、ＣＴＬＡ４のリガンドｈＢ７－２（ｈＣＤ８６）の濃度の関数として示す。 ＦＡＣＳによって測定された、ＣＴＬＡ４のリガンドｈＢ７－１の固定された濃度でのヒトＣＴＬＡ４への競合的結合における、イピリムマブ、イピリムマブ類似体（ｉｐｉ類似体）、およびＩｇＧ対照に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体の活性の比較を、抗体濃度の関数として示す。 ＦＡＣＳによって測定された、ＣＴＬＡ４のリガンドｈＢ７－２の固定された濃度でのヒトＣＴＬＡ４への競合的結合における、イピリムマブ、イピリムマブ類似体（ｉｐｉ類似体）、およびＩｇＧ対照に対する、図３Ａの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体の活性の比較を、抗体濃度の関数として示す。
定義
本明細書に提供される実施例の理解を容易にするために、特定の頻繁に現れる用語をここに定義する。
測定された量に関連して、本明細書で使用される「約」という用語は、測定を行い、測定の目的および使用される測定装置の精度に見合った注意を払う当業者によって予測されるであろう測定量の通常の変動を指す。別段の指示がない限り、「約」は、提供された値の＋／－１０％の変動を指す。
本明細書で使用される「親和性」という用語は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態は、以下に記載されている。
本明細書で使用される「親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒｅｄ）」抗体という用語は、１つ以上の相補性決定領域において１つ以上の改変を有する抗体を指し、かかる改変を有しない親抗体と比較して、かかる改変は抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、アミノ基（－ＮＨ２）およびカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を含む任意の有機化合物を指し、好ましくは、遊離基として、または代替的にペプチド結合の一部として縮合した後のいずれかである。「２０個の天然にコードされたポリペプチドを形成するα－アミノ酸」は当該技術分野で理解され、アラニン（ａｌａまたはＡ）、アルギニン（ａｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ａｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ａｓｐまたはＤ）、システイン（ｃｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ｇｌｕまたはＥ）、グルタミン（ｇｉｎまたはＱ）、グリシン（ｇｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ｈｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ｉｌｅまたはＩ）、ロイシン（ｌｅｕまたはＬ）、リジン（ｌｙｓまたはＫ）、メチオニン（ｍｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ｐｈｅまたはＦ）、プロリン（ｐｒｏまたはＰ）、セリン（ｓｅｒまたはＳ）、スレオニン（ｔｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ｔｉｐまたはＷ）、チロシン（ｔｙｒまたはＹ）、およびバリン（ｖａｌまたはＶ）を指す。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子、ならびに抗原のエピトープに結合することができる免疫グロブリン分子の断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、およびＳＣＡ断片を指す。それらが由来する抗体の抗原（例えば、ポリペプチド抗原）に選択的に結合する一部の能力を保持するこれらの抗体断片は、当該技術分野で良く知られた方法を使用して作製することができ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（上記）を参照されたい）、以下のようにさらに説明される。抗体を使用して、免疫親和性クロマトグラフィーによって分取量の抗原を単離することができる。かかる抗体の様々な他の使用は、疾患（例えば、腫瘍形成）の診断および／または病期分類、ならびに疾患（例えば、腫瘍形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心血管疾患、感染症など）を治療するための治療用途のためである。キメラ抗体、ヒト様抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体は、ヒト患者への投与に特に有用である。
Ｆａｂ断片は、抗体分子の一価の抗原結合断片からなり、酵素のパパインで抗体分子全体を消化することによって産生され、無傷の軽鎖および重鎖の一部からなる断片を得ることができる。
抗体分子のＦａｂ’断片は、抗体分子全体をペプシンで処理し、続いて還元することによって得られ、無傷の軽鎖および重鎖の一部からなる分子を得ることができる。この様式で、処理された抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる。
抗体の（Ｆａｂ’）２断片は、その後の還元なしに、酵素のペプシンで抗体分子全体を処理することによって得ることができる。（Ｆａｂ’）２断片は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持されている２つのＦａｂ’断片の二量体である。
Ｆｖ断片は、軽鎖の可変領域と、２つの鎖として発現される重鎖の可変領域とを含む遺伝子操作断片として定義される。
本明細書で使用される「抗体断片」という用語は、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体の一部を含む無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。
本明細書で使用される「抗ＣＴＬＡ４抗体」、「ＣＴＬＡ４抗体」、および「ＣＴＬＡ４に結合する抗体」という用語は、抗体がＣＴＬＡ４を標的とする際に診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＣＴＬＡ４に結合することができる抗体を指す。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体の、関連していない非ＣＴＬＡ４タンパク質への結合の程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）によって測定した場合、ＣＴＬＡ４への抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０-8Ｍ以下、例えば、１０-8Ｍ～１０-13Ｍ、例えば、１０-9Ｍ～１０-13Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、異なる種由来のＣＴＬＡ４間で保存されているＣＴＬＡ４のエピトープに結合する。
本明細書で使用される「結合」という用語は、抗原上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に応じた相互作用を有する、抗体の可変領域またはＦｖと抗原との相互作用を指す。例えば、抗体の可変領域またはＦｖは、一般的にタンパク質というよりも、特定のタンパク質の構造を認識して、それに結合する。本明細書で使用される場合、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的に結合する（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」という用語は、抗体可変領域またはＦｖが、他のタンパク質とよりも特定の抗原と、頻繁に、迅速に、長い持続時間、および／または高い親和性で、結合または会合することを意味する。例えば、抗体の可変領域またはＦｖは、他の抗原に結合するよりも高い親和性で、結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）で、容易に、および／または長い持続時間、その抗原と特異的に結合する。別の例では、抗体の可変領域またはＦｖは、多反応性の天然抗体によって（すなわち、ヒトで天然に見られる様々な抗原に結合することが知られている天然の抗体によって）一般に認識される関連タンパク質または他の細胞表面タンパク質、あるいは抗原に対する親和性よりも実質的に高い親和性で、細胞表面タンパク質（抗原）に結合する。しかしながら、「特異的に結合する」は、別の抗原の排他的な結合または検出不可能な結合を必ずしも必要とせず、これは、「選択的結合」という用語によって意味される。一例では、抗体の可変領域またはＦｖ（または、他の結合領域）の「特異的結合」は、抗体の可変領域またはＦｖが、１００ｎＭ以下、例えば５０ｎＭ以下、例えば、２０ｎＭ以下、例えば、１５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合することを意味する。
本明細書で使用される「癌」および「癌性」という用語は、典型的には、無調節の細胞増殖／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、白血病および他のリンパ増殖性障害、ならびに様々なタイプの頭頸部癌が挙げられる。
本明細書で使用される「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は、癌である。
本明細書で使用される「化学療法剤」という用語は、癌の治療に有用な化学物質を指す。化学療法剤の例としては、チオテパおよびシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、ウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９－アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４）を参照されたい）；経口アルファ－４インテグリン阻害剤のＣＤＰ３２３；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ－９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグリル化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシンおよびアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、アンギジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、およびカルボプラチンなどの白金剤；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））などのチューブリン重合による微小管の形成を防ぐビンカ；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦ（登録商標））；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含むレチノイン酸などのレチノイド；クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））などのビスホスホネート）、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）などの異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ、Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ－１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ－７７９；ティピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））などのＢｃｌ－２阻害剤；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（以下の定義を参照）；ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））などのセリン・スレオニンキナーゼ阻害剤；ロナファルニブ（ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））などのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語）などの上記の２つ以上の組み合わせ；ならびにＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））による治療レジメンの略語）が挙げられる。
本明細書で定義される化学療法剤としては、癌の増殖を促進し得るホルモンの効果を調節、低減、遮断、または阻害するように作用する「抗ホルモン剤」または「内分泌治療剤」が挙げられる。それらは、それら自体がホルモンであってもよく、限定されないが、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４－ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）、トリオキシフェン、ケオキシフェン、およびＳＥＲＭ３などの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、を含む混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））およびＥＭ８００（エストロゲン受容体（ＥＲ）の二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、かつ／またはＥＲレベルを抑制し得る薬剤など）のアゴニスト特性のない純粋な抗エストロゲン；ホルメスタンおよびエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などのステロイド性アロマターゼ阻害剤を含むアロマターゼ阻害剤、ならびにアナストラゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、ならびにボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、および４（５）－イミダゾールを含む他のアロマターゼ阻害剤；リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプトレリンを含む黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト；酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロールおよびプレマリンなどのエストロゲン、フルオキシメステロンド、全トランスレチオン酸、ならびにフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイドを含む性ステロイド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミド、およびビカルタミドなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組み合わせ、が含まれる。
本明細書で使用される「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
本明細書で使用される抗体の「クラス」という用語は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、およびＩｇＡ2にさらに分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
本明細書で使用される「条件的に活性な抗体」という用語は、非腫瘍微小環境の条件下と比較して、腫瘍微小環境の条件下でより活性である抗体を指す。腫瘍微小環境における条件としては、非腫瘍微小環境と比較して、より低いｐＨ、より高い濃度の乳酸およびピルビン酸、低酸素、より低い濃度のグルコース、およびわずかに高い温度が挙げられる。例えば、条件的に活性な抗体は、通常の体温では事実上不活性であるが、腫瘍微小環境においてより高い温度で活性である。さらに別の態様では、条件的に活性な抗体は、正常な酸素化された血液中では活性が低いが、腫瘍中に存在する低酸素化の環境下では、より活性が高い。さらに別の態様では、条件的に活性な抗体は、正常な生理学的ｐＨ７．２～７．８において活性が低いが、腫瘍微小環境に存在する酸性ｐＨ５．８～７．０、または６．０～６．８の下でより活性である。腫瘍微小環境には、当業者に既知の他の条件が存在し、本発明における条件としても使用することができ、その下では、抗ＣＴＬＡ４抗体がＣＴＬＡ４に対して異なる結合親和性を有する。
本明細書で使用される「構成的」という用語は、例えば、ＣＴＬＡ４の活性に適用されるように、リガンドまたは他の活性化分子の存在に依存しない受容体キナーゼの持続的なシグナル伝達活性を指す。受容体キナーゼの性質に応じて、全ての活性が構成的であってもよく、または受容体の活性が、他の分子（例えば、リガンド）の結合によってさらに活性化されてもよい。受容体キナーゼの活性化をもたらす細胞事象は、当業者によく知れられている。例えば、活性化は、より高次の受容体複合体へのオリゴマー化、例えば、二量体化、三量体化などを含み得る。複合体は、単一の種類のタンパク質、すなわち、ホモマー複合体を含んでもよい。あるいは、複合体は、少なくとも２つの異なる種類のタンパク質、すなわち、ヘテロマー複合体を含んでもよい。複合体形成は、例えば、細胞の表面上の受容体の正常形態または変異体形態の過剰発現によって引き起こされ得る。複合体形成はまた、受容体における特定の変異または変異によって引き起こされ得る。
本明細書で使用される「細胞分裂阻害剤」という用語は、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞の増殖を停止させる化合物または組成物を指す。したがって、細胞分裂阻害剤は、Ｓ期の細胞の割合を著しく低減するものであり得る。細胞分裂阻害剤のさらなる例としては、Ｇ０／Ｇ１停止またはＭ期停止を誘導することによって、細胞周期進行を遮断する薬剤が挙げられる。ヒト化抗Ｈｅｒ２抗体であるトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））がＧ０／Ｇ１停止を誘導する細胞分裂阻害剤の一例である。古典的なＭ期遮断剤としては、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなど）が挙げられる。Ｇ１を停止する特定の薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、およびａｒａ－ＣなどのＤＮＡアルキル化剤も、Ｓ期停止に溢流する。さらなる情報は、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ編、「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ」第１節、Ｍｕｒａｋａｍｉらによる表題「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、例えば１３頁、に見出すことができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、両方ともイチイ樹に由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイ由来のドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセルの半合成類似体（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の構築を促進し、脱重合を妨げることによって微小管を安定化させ、細胞内の有糸分裂の阻害をもたらす。
本明細書で使用される「細胞傷害性剤」という用語は、細胞機能を阻害もしくは阻止する、かつ／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤としては、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）、増殖阻害剤、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素で、その断片および／またはバリアントを含む、ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が挙げられる。
本明細書で使用される「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶH－ＶL）の軽鎖可変ドメイン（ＶL）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対合し、２つの抗原結合部位を生成するよう強制される。
本明細書で使用される「検出可能に標識する」という用語は、物理的または化学的な手段によって、いずれか直接的にまたは間接的に、その検出または測定が、試料中のＣＴＣの存在を示す任意の物質を指す。有用な検出可能な標識の代表的な例としては、限定されないが、以下が挙げられる：光吸収性、蛍光、反射率、光散乱、リン光、または発光特性に基づいて直接または間接的に検出可能な分子またはイオン；それらの放射性特性によって検出可能な分子またはイオン；それらの核磁気共鳴または常磁性特性によって検出可能な分子またはイオン。例えば、光吸収性または蛍光に基づいて間接的に検出可能な分子群の中には、適切な基質を、例えば、非光吸収性分子から光吸収性分子に、または非蛍光性分子から蛍光性分子に変換させる様々な酵素が含まれる。
本明細書で使用される「診断」という用語は、対象の疾患または障害に対する感受性の判定、対象が現在疾患または障害を罹患しているかどうかの判定、疾患または障害を罹患している対象の予後（例えば、転移前または転移性癌状態の特定、癌の段階、または治療に対する癌の応答性）、および治療法（例えば、治療の効果または有効性に関する情報を提供するために対象の状態をモニタリングする）を指す。一部の実施形態では、本発明の診断方法は、早期癌の検出において特に有用である。
本明細書で使用される「診断剤」という用語は、直接的または間接的に検出することができ、診断目的で使用される分子を指す。診断剤は、対象または試料に投与されてもよい。診断剤は、それ自体が提供され得るか、または条件的に活性な抗体などのビヒクルにコンジュゲートされ得る。
本明細書で使用される「エフェクター機能」という用語は、抗体のアイソタイプによって異なる抗体のＦｃ領域に起因する、それらの生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、およびＢ細胞活性化が挙げられる。
本明細書で使用される薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」という用語は、所望の治療的または予防的な結果を達成するのに必要な投与量および期間について有効な量を指す。
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列のＦｃ領域およびバリアントのＦｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシ末端まで伸びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもしなくてもよい。本明細書で特に明記しない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１に記載されているように、ＥＵ付番システム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従っている。
本明細書で使用される「フレームワーク」または「ＦＲ」という用語は、超可変領域（重鎖ではＨＶＲまたはＨ１－３、軽鎖ではＬ１－３）の残基以外の可変ドメインの残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列およびＦＲ配列は、ＶH（またはＶL）において、一般に、以下の順序で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
「完全長抗体」、「無傷抗体」、または「全抗体」という用語は、抗原結合可変領域（ＶHまたはＶL）、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含む抗体を指す。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、完全長抗体を、異なる「クラス」に割り当てることができる。完全長抗体には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分割され得る。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構成は、よく知られている。
本明細書で使用される「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞（かかる細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、継代回数にかかわらず、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有物が親細胞と完全に同一ではなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が本明細書に含まれる。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはヒト抗体のレパートリーもしくは他のヒト抗体のコード配列を利用する非ヒト源に由来するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
本明細書で使用される「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶLまたはＶHフレームワーク配列の選択において、最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶLまたはＶH配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。一実施形態では、ＶLに関して、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）にあるようなサブグループκＩである。一実施形態では、ＶHに関して、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）にあるようなサブグループＩＩＩである。
本明細書で使用される「ヒト化」抗体という用語は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体の定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を経た抗体を指す。
本明細書で使用される「超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）」または「ＨＶＲ」という用語は、配列において超可変である、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体の可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、ＶH（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つあり、ＶL（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つある。ＨＶＲは、概して、超可変ループおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、配列の可変性が最も高く、かつ／または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６－１０１（Ｈ３）で生じる（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１９６，ｐｐ．９０１－９１７ １９８７）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４～３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０～５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９～９７、Ｈ１のアミノ酸残基３１～３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０～６５、およびＨ３のアミノ酸残基９５～１０２で生じる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９９１）。ＶHのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは概して、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、ＣＤＲの領域内に含まれ、短縮型ＣＤＲ（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ－ＣＤＲ）、またはａ－ＣＤＲと呼ばれる。例示的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、およびａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１～３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０～５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９～９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１～３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０～５８、およびＨ３のアミノ酸残基９５～１０２で生じる（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１６１９－１６３３，２００８を参照されたい）。別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメインの他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）に従って、本明細書で番号付けられる。
本明細書で使用される場合、「免疫コンジュゲート」という用語は、限定されないが、細胞傷害性剤、化学療法剤、放射性原子、または細胞分裂阻害剤を含む、１つ以上の異種分子（複数可）にコンジュゲートされる抗体または抗体断片である。
本明細書で使用される「個体」または「対象」という用語は、哺乳動物を指す。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
本明細書で使用される「細胞増殖または増殖の阻害」という用語は、細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少させることを意味し、細胞死を誘導することを含む。
本明細書で使用される「単離された」抗体という用語は、その天然の環境の成分から分離されたものである。一部の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））によって決定した場合、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価方法の概説としては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，ｖｏｌ．８４８，ｐｐ．７９－８７，２００７を参照されたい。
本明細書で使用される「単離された」核酸という用語は、その天然の環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常、核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
本明細書で使用される「抗ＣＴＬＡ４抗体をコードする単離核酸」という用語は、単一のベクターまたは別個のベクターにおけるかかる核酸分子（複数可）、および宿主細胞内の１つ以上の場所に存在するかかる核酸分子（複数可）を含む、抗体の重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指す。
本明細書で使用される「リガンド非依存性」という用語は、例えば、受容体シグナル伝達活性に適用されるとき、リガンドの存在に依存しないシグナル伝達活性を指す。リガンド非依存性キナーゼ活性を有する受容体は、その受容体へのリガンドの結合を必ずしも妨げず、キナーゼ活性のさらなる活性化をもたらす。
本明細書で使用される「転移」という用語は、癌細胞が原発腫瘍から分散し、リンパ管および／または血管に浸透し、血流を通して循環し、身体内の他の場所の正常な組織中の遠位の病巣（転移）で増殖することを支持する全てのＣＴＬＡ４が関与するプロセスを指す。特に、ＣＴＬＡ４の非触媒的または触媒的活性（好ましくは、ＣＴＬＡ４リン酸化および／またはＣＴＬＡ４媒介性シグナル伝達を含む）によって刺激または媒介され、転移の基礎をなす、増殖、移行、足場非依存性、アポトーシスの回避、または血管新生因子の分泌などの腫瘍細胞の細胞事象を指す。
本明細書で使用される「微小環境」という用語は、組織または身体の他の領域とは、不変的または一時的、物理的または化学的な違いを有する組織または身体の任意の部分または領域を意味する。腫瘍の場合、本明細書で使用される「腫瘍微小環境」という用語は、腫瘍が存在する環境を指し、腫瘍内の非細胞領域、および腫瘍組織の直外であるが癌細胞自体の細胞内区画には関係しない領域である。腫瘍および腫瘍微小環境は、密接に関連し、常に相互作用する。腫瘍はその微小環境を変化させることができ、微小環境は腫瘍の増殖および拡散に影響を及ぼし得る。典型的には、腫瘍微小環境は、低いｐＨを有し、５．０～７．０の範囲内、または５．０～６．８の範囲内、または５．８～６．８の範囲内、または６．２～６．８の範囲内である。他方、正常な生理学的ｐＨは、７．２～７．８の範囲である。腫瘍微小環境はまた、血漿と比較して、グルコースおよび他の栄養素の濃度が低いが、乳酸の濃度が高いことも知られている。さらに、腫瘍微小環境は、通常の生理学的温度よりも、０．３～１℃高い温度を有し得る。腫瘍微小環境は、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，“ＭＲＩ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．４３０－４５０，２００２で考察されており、その全体が参照により本明細書に援用される。「非腫瘍微小環境」という用語は、腫瘍以外の部位における微小環境を指す。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のあるバリアント抗体は除外され、かかるバリアントは概して少量存在している。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して特異的な異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して特異的である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、様々な技術によって作製することができ、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含み、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法および他の例示的な方法が、本明細書に記載される。
本明細書で使用される「裸抗体（ｎａｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。裸抗体は、医薬製剤に存在してもよい。
本明細書で使用される「天然抗体」という用語は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合された２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶH）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶL）、続いて定常軽鎖（ＣL）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
本明細書で使用される「添付文書」という用語は、治療製品の市販のパッケージに習慣的に含まれる説明書を指し、かかる治療製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与法、併用療法、禁忌、および／または警告についての情報を含む。
本明細書で使用される参照ポリペプチド配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、配列を整列させ、必要に応じて最大のパーセント配列同一性を達成するようにギャップを導入し、任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮せず、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的の場合、アミノ酸配列同一性のパーセント値は、配列比較のコンピュータプログラムであるＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）にユーザ文書とともに提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７のもとで登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するには、コンパイルする必要がある。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変化しない。
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂと、それとの、またはそれに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、それとの、またはそれに対する、特定のアミノ酸配列同一性％を有する、またはそれを含む所与のアミノ酸配列Ａ、と表現することもできる）は、以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢの整列において同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるであろう。特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、前項に記載されているように得られる。
本明細書で使用される「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、製剤が投与される対象に対して許容されない毒性のある追加の成分を含まない製剤を指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、対象に対して無毒である活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられる。
本明細書で使用される「精製された」および「単離された」という用語は、本発明による抗体またはヌクレオチド配列を指し、示された分子が、同じ種類の他の生体高分子の実質的な不在下で、存在することを指す。本明細書で使用される「精製された」という用語は、好ましくは、同じ種類の生体高分子の少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは、少なくとも９５重量％、最も好ましくは、少なくとも９８重量％が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指すが、分子は、組成物の基本的特徴に有害な影響を与えないいくつかの追加の塩基または部分を含み得る。
本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞によって発現される抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体、またはその抗原結合断片）を指す。組換え抗体を産生するための「宿主細胞」の例としては、（１）哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（Ｙ０細胞およびＮＳ０細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、Ｈｅｌａ細胞およびＶｅｒｏ細胞、（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１およびＴｎ５、（３）植物細胞、例えば、ニコチアナ属に属する植物（例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）；（４）酵母細胞、例えば、サッカロマイセス属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはアスペルギルス属（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に属するもの、（５）細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ細胞またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞など、が挙げられる。
本明細書で使用される「ＣＴＬＡ４」という用語は、米国特許第５，４３４，１３１号、同第５，８４４，０９５号、および同第５，８５１，７９５号に記載されているアミノ酸配列、またはその任意の部分もしくは誘導体を有し、それが、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４（例えば、内在性ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４）への結合を遮断するように、Ｂ７を認識し結合するか、またはＢ７を妨害する、免疫チェックポイントを指す。特定の実施形態では、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、位置＋１のメチオニンで始まり、位置＋１２４のアスパラギン酸で終わるか、または野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、位置－１のアラニンで始まり、位置＋１２４のアスパラギン酸で終わる。野生型ＣＴＬＡ４は、Ｎ末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＣ末端細胞質ドメインを有する細胞表面タンパク質である。細胞外ドメインは、標的分子、例えば、Ｂ７分子に結合する。細胞において、天然に存在する野生型ＣＴＬＡ４タンパク質は、Ｎ末端にシグナルペプチドを含む未成熟ポリペプチドとして翻訳される。未成熟ポリペプチドは、シグナルペプチドの切断および除去を含む翻訳後処理を受け、未成熟形態のＮ末端とは異なる新たに生成されたＮ末端を有するＣＴＬＡ４切断生成物を生成する。当業者は、ＣＴＬＡ４切断生成物の新たに生成されたＮ末端から、１つ以上のアミノ酸を除去する追加の翻訳後処理が生じ得ることを理解するであろう。あるいは、シグナルペプチドは完全に除去されず、一般的な開始アミノ酸であるメチオニンの前から開始する分子を生成し得る。したがって、成熟ＣＴＬＡ４タンパク質は、位置＋１のメチオニンまたは位置－１のアラニンで開始する場合がある。ＣＴＬＡ４分子の成熟形態は、細胞外ドメインまたはその任意の部分を含む。
用語「治療有効量」の本発明の抗体は、任意の医学的処置に適用可能な合理的なベネフィット・リスク比で、当該癌を治療するのに十分な量の抗体を意味する。しかしながら、本発明の抗体および組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する特定の治療有効用量のレベルは、様々な要因に依存し、治療される障害および障害の重症度、使用される特定の抗体の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食生活、使用される特定の抗体の投与時間、投与経路、および排泄率、治療期間、使用される特定の抗体と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医療分野で既知の同様の要因が含まれるであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることは、当該技術分野で既知である。
本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」）という用語は、共有結合されたＶH：：ＶLヘテロ二量体であり、これは通常、ペプチドでコードされたリンカーによって連結された遺伝子をコードする、ＶHおよびＶLを含む遺伝子融合から発現される。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶH：：ＶLヘテロ二量体である。二価および多価の抗体断片は、一価ｓｃＦｖの会合によって自発的に形成され得るか、またはペプチドリンカーで一価ｓｃＦｖを結合することによって生成され得る（二価ｓｃ（Ｆｖ）２など）。
「治療」、「治療する」、または「治療すること」という用語は、本明細書で使用される場合、治療される個体の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程でのいずれかで行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の低減、疾患状態の寛解または緩和、ならびに寛解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅らせるために使用される。
本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、悪性または良性に関わらず、全ての腫瘍細胞増殖および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性細胞および組織を指す。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、および「腫瘍」という用語は、本明細書で言及されるように互いに排他的ではない。
本明細書で使用される「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶHおよびＶL）は、概して類似の構造を有し、各ドメインが、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい）。単一のＶHまたはＶLドメインは、抗原結合の特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、抗原に結合する抗体からのＶHまたはＶLドメインを使用して、特定の抗原に結合する抗体を単離して、それぞれ、相補的なＶLまたはＶHドメインのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５０，ｐｐ．８８０－８８７，１９９３、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３５２，ｐｐ．６２４－６２８，１９９１を参照されたい。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
例示的な目的で、本発明の原理が、様々な例示的な実施形態を参照することによって説明される。本発明の特定の実施形態が本明細書に具体的に説明されるが、当業者は、同じ原理が他のシステムおよび方法に同等に適用可能であり、それに使用され得ることを容易に理解するであろう。本発明の開示される実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、示される任意の特定の実施形態の詳細に限定されないことを理解されたい。加えて、本明細書で使用される専門用語は、説明を目的とし、限定を目的とするものではない。さらに、ある特定の方法は、特定の順序で本明細書に提示されるステップを参照して説明されるが、多くの場合、これらのステップは、当業者によって理解され得るように任意の順序で実行することができ、したがって、新規の方法は、本明細書に開示されるステップの特定の配置に限定されない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。さらに、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、および「から構築される（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ）」という用語も互換的に使用され得る。
別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などの特性、パーセント、比率、反応条件などを表す全ての数は、「約」という用語が存在するか否かにかかわらず、全ての事例において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、そうでないと指示されない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本開示によって取得されようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲への均等論の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数に照らして、かつ通常の丸め手法を適用することによって、解釈されるべきである。本開示の広範な範囲を述べた数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体例に示された数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、それぞれの試験測定で見出された標準偏差から必然的に起因する特定の誤差を本質的に含んでいる。
本明細書に開示される各成分、化合物、置換基、またはパラメータは、単独での使用、または本明細書に開示される各々の他の成分、化合物、置換基、またはパラメータのうちの１つ以上と組み合わせての使用について開示されているものとして解釈されるべきであることを理解されたい。
また、本明細書に開示される各成分、化合物、置換基、またはパラメータの各量／値または各量／値の範囲は、本明細書に開示される任意の他の成分（複数可）、化合物（複数可）、置換基、またはパラメータ（複数可）について開示される各量／値または各量／値の範囲と組み合わせて開示されているものとして解釈されるべきであり、したがって、本説明の目的のために、本明細書に開示される２つ以上の成分（複数可）、化合物（複数可）、置換基（複数可）、またはパラメータについての量／値または量／値の範囲の任意の組み合わせも、互いに組み合わせて開示されていることを理解されたい。
本明細書に開示される各範囲の各下限は、同じ成分、化合物、置換基、またはパラメータについて本明細書に開示される各範囲の各上限と組み合わせて開示されるものと解釈されるべきであることがさらに理解される。したがって、２つの範囲の開示は、各範囲の各下限を各範囲の各上限と組み合わせることによって導かれる４つの範囲の開示として解釈されるべきである。３つの範囲の開示は、各範囲の各下限を各範囲の各上限などと組み合わせることによって導かれる９つの範囲の開示として解釈されるべきである。さらに、説明または例で開示される構成要素、化合物、置換基、またはパラメータの特定の量／値は、範囲の下限または上限のいずれかの開示として解釈されるべきであり、したがって、本出願の他箇所で開示される同じ構成要素、化合物、置換基、またはパラメータの範囲の任意の他の下限または上限あるいは特定の量／値と組み合わせて、その構成要素、化合物、置換基、またはパラメータの範囲を形成することができる。
Ａ．抗ＣＴＬＡ４抗体
一態様では、本発明は、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質に特異的に結合する単離された重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。単離された重鎖可変領域ポリペプチドは、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｈ１配列は、ＧＦＴＦＳＨＹＴＭＨ（配列番号１）であり、
Ｈ２配列は、ＦＩＸ1ＹＸ2ＧＮＸ3ＫＸ4Ｘ5ＡＸ6ＳＸ7ＫＧ（配列番号２）であり、
Ｈ３配列は、ＴＧＷＬＧＰＦＤＸ8（配列番号３）であり、
式中、Ｘ1が、ＳまたはＤであり、Ｘ2が、Ｄ、ＨまたはＩであり、Ｘ3が、ＮまたはＹであり、Ｘ4が、ＹまたはＩであり、Ｘ5が、ＹまたはＥであり、Ｘ6が、ＤまたはＫであり、Ｘ7が、ＶまたはＭであり、Ｘ8が、ＹまたはＩである。
図１は、本発明の例示的な単離された重鎖可変領域の整列を示し、相補性決定領域Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３が枠で囲まれている。
別の態様では、本発明は、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質に特異的に結合する単離された軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。単離された軽鎖可変領域ポリペプチドは、配列Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｌ１配列は、ＲＸ9ＳＱＸ10Ｘ11ＧＳＳＹＬＡ（配列番号４）であり、
Ｌ２配列は、ＧＡＦＳＲＡＴＧＸ12（配列番号５）であり、
Ｌ３配列はＱＱＤＧＳＳＰＷＴ（配列番号６）であり、
式中、Ｘ9が、ＡまたはＩであり、Ｘ10が、Ｙ、ＳまたはＨであり、Ｘ11が、ＶまたはＧであり、Ｘ12が、ＶまたはＩである。
図２は、本発明の例示的な単離された軽鎖可変領域の整列を示し、相補性決定領域Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を枠で囲んでいる。
本発明の単離された重鎖可変領域ポリペプチドおよび単離された軽鎖可変領域ポリペプチドは、それぞれ、米国特許第８，７０９，７５５号に開示されている方法を使用して、親抗体から得られた。単離された重鎖可変領域ポリペプチドおよび単離された軽鎖可変領域ポリペプチドの生成方法、ならびに抗体および抗体断片の生成方法は、米国特許第８，７０９，７５５号に開示されており、これによって、参照により本明細書に援用される。
別の態様では、本発明は、図１に示される重鎖可変領域および図２に示される軽鎖可変領域を含む。図１の１６個の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８に示される。図１の１６個の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７に示される。これらの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体および抗体断片は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合することができる。これらの重鎖可変領域のうちの１つと、これらの軽鎖可変領域のうちの１つとの組み合わせを含む抗体または抗体断片は、腫瘍微小環境のｐＨ（例えば、ｐＨ６．０～６．２）において、非腫瘍微小環境のｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）においてよりも高いＣＴＬＡ４に対する結合親和性を有することが見出されている。その結果、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、正常な組織微小環境におけるＣＴＬＡ４に対するそれらの結合親和性と比較して、腫瘍微小環境におけるＣＴＬＡ４に対して、より高い結合親和性を有する。
したがって、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、正常な組織微小環境におけるそれらの低下したＣＴＬＡ４への結合親和性から、当該技術分野で既知のモノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体と比較して、低減された副作用を有し、ならびに同等の有効性を有する。これらの特徴は、より高い用量のこれらの抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を、患者に送達することを可能にし、したがって、より効果的な治療オプションを提供する。
本発明は、図１～２に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびに配列番号７～３８のアミノ酸配列を有するものを含むが、本発明は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合することができるそのバリアントも含む。一部の実施形態では、これらのバリアントは、異なるＨ２、Ｈ３、Ｉ１およびＩ２配列を有する。他の実施形態では、相補性決定領域の外側の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、本出願で考察される置換、挿入および欠失の原理に従って変異され得る。なおさらなる実施形態では、定常領域は、バリアントを提供するように修飾され得る。
これらのバリアントを誘導する際、本明細書に記載のプロセスが案内役となる。重鎖可変領域および軽鎖可変領域のバリアントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または残基への挿入、および／または残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って、本発明の抗体または抗体断片に到達することができるが、前提として、それらが所望の特徴、例えば、ヒトＣＴＬＡ４への抗原結合および／または条件的な活性を有する。
置換、挿入、および欠失バリアント
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体または抗体断片バリアントが提供される。置換変異誘発の目的の部位としては、ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換は、表１に、「保存的置換」の見出しの下で示されている。より実質的な変化は、表１に、「例示的な置換」の見出しの下で提供され、アミノ酸側鎖のクラスに関しては、以下でさらに説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体または抗体断片に導入されてもよく、生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、または免疫原性の低下についてスクリーニングされてもよい。
Figure 2022513384000002
アミノ酸は、一般的な側鎖の特性に従ってグループ化され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
１つの種類の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される得られたバリアント（複数可）は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性（例えば、増加した親和性、低減された免疫原性）における修飾（例えば、改善）を有し、かつ／または実質的に保持された親抗体の特定の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載されるものなど、ファージディスプレイに基づく親和性成熟の技術を使用して、好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＣＤＲ残基を変異させ、バリアント抗体をファージ上に呈示し、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
例えば、抗体親和性を改善するために、ＣＤＲにおいて改変（例えば、置換）を行ってもよい。かかる改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２０７，ｐｐ．１７９－１９６，２００８を参照）、および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において行うことができ、得られたバリアントＶＨまたはＶＬを、結合親和性について試験する。二次ライブラリを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７８，ｐｐ．１－３７，２００１に記載されている。親和性成熟の一部の実施形態では、多様性は、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、ライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを特定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、１回あたり４～６個の残基）がランダム化されるＣＤＲ特異的なアプローチを伴う。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に特定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３が、しばしば標的となる。
特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が、抗原に結合する抗体または抗体断片の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）は、ＣＤＲにおいて行われ得る。かかる改変は、ＣＤＲの「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であり得る。上記に提供されるバリアントＶHおよびＶL配列の特定の実施形態では、各ＣＤＲは、改変されていないか、または１つ、２つまたは３つ以上のアミノ酸置換を含まないかのいずれかである。
変異誘発のために標的化され得る抗体の残基または領域を特定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２４４，ｐｐ．１０８１－１０８５，１９８９によって記載されている。この方法では、標的残基または標的残基の群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性または負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置き換えられて、抗体または抗体断片と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換は、最初の置換に対して機能的な感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。代替的または追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造により、抗体または抗体断片と抗原との間の接触点が特定される。かかる接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよく、または排除されてもよい。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうかを決定してもよい。
アミノ酸配列の挿入には、アミノ末端融合物および／またはカルボキシル末端融合物（鎖長が、１残基から１００残基以上のポリペプチドまでの範囲）、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体の他の挿入バリアントとしては、抗体のＮ末端またはＣ末端に、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ）またはポリペプチドの融合が挙げられる。
本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。非ヒト動物に由来する抗体のＶHおよびＶL中のＣＤＲのみを、単にヒト抗体のＶHおよびＶL中のＦＲに移植することによって、ヒト化抗体が産生される場合、抗原結合活性は、非ヒト動物に由来する元の抗体の抗原結合活性と比較して、低下することが知られている。ＣＤＲのみならずＦＲにおいても、非ヒト抗体のＶHおよびＶLのいくつかのアミノ酸残基が、抗原結合活性に直接的または間接的に関連していると考えられる。したがって、これらのアミノ酸残基を、ヒト抗体のＶHおよびＶLのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基で置換すると、結合活性が低下するであろう。この問題を解決するためには、ヒトＣＤＲで移植された抗体において、ヒト抗体のＶHおよびＶLのＦＲのアミノ酸配列の中で、抗体への結合に直接関連するアミノ酸残基、またはＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、あるいは抗体の三次元構造を維持し、抗原への結合に直接関連するアミノ酸残基を特定する試みが必要になる。減少した抗原結合活性は、特定されたアミノ酸を、非ヒト動物由来の元の抗体のアミノ酸残基で置換することによって、増加させることができる。
修飾および変更は、本発明の抗体の構造およびそれらをコードするＤＮＡ配列においてなされ、依然として所望の特徴を有する抗体をコードする機能分子を得ることができる。
アミノ配列の変更を行う際には、アミノ酸の親水性指標を考慮してもよい。タンパク質に相互作用の生物学的機能を付与する際の親水性アミノ酸指標の重要性は、当該技術分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的な親水性の特徴は、得られるタンパク質の二次構造に寄与することが受け入れられており、続いて、タンパク質と、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義する。各アミノ酸には、それらの疎水性および電荷特徴に基づいて親水性指数が割り当てられており、それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（－０．４）、スレオニン（－０．７）、セリン（－０．８）、トリプトファン（－０．９）、チロシン（－１．３）、プロリン（－１．６）、ヒスチジン（－３．２）、グルタミン酸（－３．５）、グルタミン（－３．５）、アスパラギン酸（－３．５）、アスパラギン（－３．５）、リジン（－３．９）、およびアルギニン（－４．５）である。
また、本発明のさらなる目的は、本発明の抗体の機能保存的バリアントも包含する。
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的な立体構造および機能を改変することなく変更されているものであり、これには、限定されないが、類似の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸でのアミノ酸置換が含まれる。保存されたアミノ酸として示されたもの以外のアミノ酸は、タンパク質において異なる場合があり、その結果、機能が類似する任意の２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸のパーセント配列類似性が変化する場合あり、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスター法などの整列スキームに従って決定された場合、７０％～９９％であり得る。「機能保存的バリアント」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定した場合、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらに好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％を有するポリペプチドを含み、それが比較される天然タンパク質または親タンパク質と同じまたは実質的に類似の特性または機能を有する。
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一であるか、または約９０％超、好ましくは９５％超が、より短い配列の全長にわたって類似している（機能的に同一である）場合、「実質的に相同」であるか、または「実質的に類似」している。好ましくは、類似または相同の配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）パイルアッププログラム、またはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのうちのいずれかを使用した整列によって特定される。
例えば、特定のアミノ酸は、タンパク質構造中で、活性が著しく損なわれることなく、他のアミノ酸によって置換され得る。タンパク質の相互作用の能力および性質は、タンパク質の生物学的な機能活性を定義するため、タンパク質配列内で、当然、そのＤＮＡがコードする配列内で、特定のアミノ酸置換がなされ、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、本発明の抗体または抗体断片の配列、あるいは当該抗体もしくは抗体断片をコードする対応するＤＮＡ配列において、それらの生物学的活性を著しく損なうことなく、様々な変更が行われ得ることが企図される。
当該技術分野では、特定のアミノ酸は、類似の親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換されてもよく、依然として同様の生物学的活性を有するタンパク質をもたらし、すなわち、依然として生物学的機能で同等なタンパク質が得られることが知られている。
したがって、上で概説したように、アミノ酸置換は、概して、アミノ酸側鎖の置換基、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対的類似性に基づく。前述の様々な特徴を考慮した例示的な置換は、当業者に既知であり、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
グリコシル化バリアント
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が生成または除去されるように、アミノ酸配列を改変することによって都合よく達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物は、改変され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、分岐二分岐オリゴ糖を含み、概して、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって結合されている。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２６－３２，１９９７を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。一部の実施形態では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾がなされ、特定の改善された特性を有する抗体バリアントが作製され得る。
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合するフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えばＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定されるように、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、および高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の位置約２９７に位置するアスパラギン残基（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体におけるわずかな配列のバリエーションのために、位置２９７の約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、位置２９４～３００に位置し得る。かかるフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第ＵＳ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関連する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．３３６，ｐｐ．１２３９－１２４９，２００４、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．６１４－６２２，２００４が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，ｖｏｌ．２４９，ｐｐ．５３３－５４５，１９８６、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ号、およびＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１（特に実施例１１））、ならびにα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．６１４－６２２，２００４；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．９４，ｐｐ．６８０－６８８，２００６、およびＷＯ２００３／０８５１０７が挙げられる。
二分岐オリゴ糖を含む抗体バリアントが、さらに提供され、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖が、ＧｌｃＮＡｃによって二分される。かかる抗体バリアントは、低減されたフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。かかる抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８、米国特許第６，６０２，６８４号、およびＵＳ２００５／０１２３５４６に記載されている。また、Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。かかる抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７、ＷＯ１９９８／５８９６４、およびＷＯ１９９９／２２７６４に記載されている。
Ｆｃ領域バリアント
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入さることによって、Ｆｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、ａ置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
特定の実施形態では、本発明は、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体バリアントが企図され、これにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（ＡＤＣＣなど）が不要であるかまたは有害である用途の場合、望ましい候補となる。インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠いているが（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にするために行われ得る。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単核細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．４５７－４９２，１９９１の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例としては、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８３，ｐｐ．７０５９－７０６３，１９８６も参照されたい）、およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８２，ｐｐ．１４９９－１５０２，１９８５、米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．１３５１－１３６１，１９８７も参照されたい）が挙げられる。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を参照されたい）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６５２－６５６，１９９８に開示されているような動物モデルにおいて評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できず、したがって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．２０２，ｐｐ．１６３－１７１，１９９６、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．１０４５－１０５２，２００３、およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．２７３８－２７４３，２００４を参照されたい）。また、ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野で既知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１７５９－１７６９，２００６を参照されたい）。
低減されたエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異体としては、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体が挙げられる。
ＦｃＲへの結合が改善または低下した特定の抗体バリアントが記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．６５９１－６６０４，２００１を参照されたい）。
特定の実施形態では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４における置換（残基のＥＵ付番）を有するＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域で改変が行われ、改変された（すなわち、改善または低減された）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）がもたらされる。例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１６４，ｐｐ．４１７８－４１８４，２０００に記載されている。
母体ＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１１７，ｐｐ．５８７－５９３，１９７６およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２４，ｐ．２４９，１９９４）への結合の改善および半減期の増加を伴う抗体は、ＵＳ２００５／００１４９３４に記載されている。これらの抗体は、それに１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する。かかるＦｃバリアントには、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上において置換を有するバリアントが含まれる（例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換、米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３２２，ｐｐ．７３８－７４０，１９８８、米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，６２４，８２１号、およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
システイン改変抗体バリアント
特定の実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」、を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、抗体がアクセス可能な部位で、残基の置換が生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が、抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、抗体を、薬物部分またはリンカー－薬物部分などの他の部分にコンジュゲートして、免疫コンジュゲートが作製され得る。特定の実施形態では、以下の残基のうちの任意の１つ以上が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ付番）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）、および重鎖Ｆｃ領域の５４００（ＥＵ付番）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成され得る。
抗体誘導体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体または抗体断片は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体または抗体断片の誘導体化に好適な部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ならびにデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水におけるその安定性から、製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のポリマーであってもよく、分枝または非分枝のポリマーであってもよい。抗体または抗体断片に結合するポリマーの数は異なっていてもよく、２つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、限定されないが、改良されるべき抗体または抗体断片の特定の特性または機能、誘導体が所定の条件下で療法に使用されるかどうかなどを含む、考慮事項に基づいて決定することができる。
別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体または抗体断片と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１１６００－１１６０５，２００５）。放射線は、任意の波長であってもよく、限定されないが、通常の細胞を傷つけないが、抗体－非タンパク質性部分に近接する細胞が死滅する温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含む。
別の態様では、本発明は、単離された重鎖可変領域ポリペプチドまたは単離された軽鎖可変領域ポリペプチドを含む抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を提供する。単離された重鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８を有するＨ１、Ｈ２、およびＨ３領域を含む。単離された軽鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７を有するＬ１、Ｌ２、およびＬ３領域を含む。
本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、腫瘍微小環境における条件下でのＣＴＬＡ４への結合親和性が、非腫瘍微小環境における条件下での結合親和性よりも高い。一実施形態では、腫瘍微小環境における状態および非腫瘍微小環境における状態は、両方ともｐＨである。したがって、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、ｐＨ約５．０～６．８でＣＴＬＡ４に選択的に結合することができるが、正常な生理学的環境で遭遇するｐＨ約７．２～７．８でＣＴＬＡ４に対するより低い結合親和性を有する。実施例２～３に示されるように、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、ＣＴＬＡ４に対する結合親和性が、ｐＨ７．４でよりもｐＨ６．０で高い。
特定の実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、腫瘍微小環境中の条件下で、約１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０-8Ｍ以下、あるいは１０-8Ｍ～１０-13Ｍ、または１０-9Ｍ～１０-13Ｍ）のＣＴＬＡ４との解離定数（Ｋｄ）を有する。一実施形態では、腫瘍微小環境における条件の値での、ＣＴＬＡ４との抗体または抗体断片のＫｄの、非腫瘍微小環境における同じ条件の異なる値でのＫｄに対する比は、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約７０：１、または少なくとも約１００：１である。
一実施形態では、Ｋｄは、以下のアッセイを使用して、目的の抗体およびその抗原のＦａｂバージョンで行われる放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、Ｆａｂを、非標識抗原の滴定系列の存在下で最小濃度の（125Ｉ）標識抗原で平衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体でコーティングされたプレートを用いて、結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで２～５時間室温（およそ２３℃）でブロッキングする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［125Ｉ］－抗原を、目的のＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３－４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ－１２の評価と一致している）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションは、平衡に到達することを確実にするために、より長い時間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移して、室温でインキュベートする（例えば、１時間）。次いで、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。競合結合アッセイで使用するために、最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を選択する。
別の実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、固定化抗原ＣＭ５チップを用いて、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で測定される。簡潔には、サプライヤーの説明書に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、Ｎ－エチル－Ｎ′－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流量で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基をブロックする。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、２５℃で、約２５μｌ／分の流量で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に注入する。会合速度（ｋon）および解離速度（ｋoff）は、会合センサグラムおよび解離センサグラムを同時に適合させることによって、単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋoff／ｋon比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってｏｎ速度が１０6Ｍ-1ｓ-1を超える場合、ｏｎ速度は、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃における蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する蛍光クエンチ技術を使用して、ストップフローを装備した分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００系ＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定されるように、抗原の濃度を増加させながら、決定することができる。
本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体断片、例えば、抗体断片から形成されるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはＦ（ａｂ’）2断片、および多特異性抗体が用いられる。別の実施形態では、抗体は、完全長抗体、例えば、無傷のＩｇＧ抗体、または本明細書に定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２９－１３４，２００３を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）、また、ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
本発明のダイアボディは、二価または二重特異性であり得る。例えば、ダイアボディの例について、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．６４４４－６４４８，１９９３を参照されたい。また、トリアボディおよびテトラボディの例は、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２９－１３４，２００３に記載されている。
一部の実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体断片を含み、重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または抗体の軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい）。
抗体断片は、限定されないが、無傷の抗体のタンパク質消化、ならびに本明細書に記載される組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含む、様々な技術によって作製することができる。
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体は、キメラ抗体であり得る。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８１，ｐｐ．６８５１－６８５５，（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、抗体のクラスまたはサブクラスが、親抗体のクラスまたはサブクラスと比較して変更された「クラススイッチ（ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｅｄ）」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、かかる非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上の可変ドメインを含み、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部）が、ヒト抗体配列に由来する。また、ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１６１９－１６３３，２００８に概説されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３３２，ｐｐ．３２３－３２９，１９８８、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８６，ｐｐ．１００２９－１００３３，１９８９、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．２５－３４，２００５（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフトについて記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２８，ｐｐ．４８９－４９８，１９９１（「再表面形成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」について記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．４３－６０，２００５（「ＦＲシャフリング」について記載）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．６１－６８，２００５およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．８３，ｐｐ．２５２－２６０，２０００（ＦＲシャフリングに対する「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」アプローチについて記載）に記載されている。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されないが、「最良適合（ｂｅｓｔ－ｆｉｔ）」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５１，ｐ．２２９６，１９９３を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐ．４２８５，１９９２およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５１，ｐ．２６２３，１９９３を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１６１９－１６３３，２００８を参照されたい）、およびＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．１０６７８－１０６８４，１９９７およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．２２６１１－２２６１８，１９９６を参照されたい）が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体は、多特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、一方の結合特異性は、ＣＴＬＡ４に対するものであり、他方は、別の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４を発現する細胞に、細胞傷害性剤を局在化させるためにも使用され得る。二重特異的抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。
多特異性抗体を作製するための技術としては、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐｐ．５３７－５４０，１９８３、ＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．ｖｏｌ．１０，ｐｐ．３６５５－３６５９，１９９１を参照されたい）、および「ノブインホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」工学（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられる。また、多特異性抗体は、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ）を操作すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２９，ｐｐ．８１－８３，１９８５を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４８，ｐｐ．１５４７－１５５３，１９９２を参照されたい）、二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．６４４４－６４４８，１９９３を参照されたい）、および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５２，ｐｐ．５３６８－５３７４，１９９４を参照されたい）、ならびに三重特異性抗体を調製すること（例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４７，ｐｐ．６０－６９，１９９１に記載されている）によっても作製され得る。
「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を有する改変抗体も本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、ＵＳ２０１６／００１７０４０に詳細に記載されている組換え方法および組成物を使用して産生され得る。
本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片の物理的／化学的特性および／または生物学的活性は、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって試験および測定され得る。これらのアッセイのいくつかは、米国特許第８，８５３，３６９号に記載されている。
Ｂ．免疫コンジュゲート
別の態様では、本発明はまた、免疫コンジュゲートを提供し、化学療法剤もしくは化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはその断片）、または放射性同位体などの１つ以上の細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を含む。
一実施形態では、免疫コンジュゲートは、抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）であり、抗体または抗体断片が１つ以上の薬物にコンジュゲートされ、限定されないが、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、および欧州特許第ＥＰ０４２５２３５Ｂ１号を参照されたい）、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦなどのアウリスタチン（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号および同第５，７８０，５８８号、ならびに同第７，４９８，２９８号を参照されたい）、ドラスタチン、カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、および同第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５３，ｐｐ．３３３６－３３４２，１９９３、ならびにＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．２９２５－２９２８，１９９８を参照されたい）、ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．４７７－５２３，２００６、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．３５８－３６２，２００６、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．７１７－７２１，２００５、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９７，ｐｐ．８２９－８３４，２０００、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１２，ｖｏｌ．１５２９－１５３２，２００２、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．４３３６－４３４３，２００２、および米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン（ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなど）、トリコテセン、ならびにＣＣ１０６５が挙げられる。
別の実施形態では、免疫コンジュゲートは、酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体または抗体断片を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、エクソトキシンＡ鎖（緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。
別の実施形態では、免疫コンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体または抗体断片を含み、放射性コンジュゲートを形成する。放射性コンジュゲートの産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、あるいはヨウ素－１２３ ａｇａｉｎ、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法のためのスピンラベル（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）を含んでもよい。
抗体／抗体断片と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジサクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２３８，ｐｐ．１０９８－，１９８７に記載されているように調製され得る。炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内の細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィドを含むリンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２、米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本明細書における免疫コンジュゲートは、限定されないが、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＬＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）安息香酸塩）を含むが、架橋試薬で調製されたコンジュゲートを明示的に企図する。
ＡＤＣの例示的な実施形態は、腫瘍細胞を標的とする抗体または抗体断片（Ａｂ）と、薬物部分（Ｄ）と、ＡｂをＤに結合するリンカー部分（Ｌ）と、を含む。一部の実施形態では、抗体は、リジンおよび／またはシステインなどの１つ以上のアミノ酸残基を介して、リンカー部分（Ｌ）に結合される。
例示的なＡＤＣは、Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）pとしての式Ｉを有し、式中、ｐは、１～約２０である。一部の実施形態では、抗体にコンジュゲートされ得る薬物部分の数は、遊離システイン残基の数によって制限される。一部の実施形態では、遊離システイン残基は、本明細書に記載の方法によって抗体アミノ酸配列に導入される。式Ｉの例示的なＡＤＣとしては、限定されないが、１、２、３、または４個の改変システインアミノ酸を有する抗体が含まれる（Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．，ｖｏｌ．５０２，ｐｐ．１２３－１３８，２０１２）。一部の実施形態では、１つ以上の遊離システイン残基が既に改変を使用せずに抗体中に存在し、その場合、既存の遊離システイン残基を使用して抗体を薬物にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、抗体は、１つ以上の遊離システイン残基を生成するために、抗体のコンジュゲーションの前に、還元条件に曝露される。
ｉ）例示的なリンカー
「リンカー」（Ｌ）は、薬物部分（Ｄ）などの１つ以上の部分を抗体または抗体断片（Ａｂ）に連結して、式ＩのＡＤＣなどの免疫コンジュゲートを形成するために使用することができる二官能性または多官能性である。一部の実施形態では、ＡＤＣは、薬物および抗体に共有結合するための反応性官能性を有するリンカーを使用して調製することができる。例えば、一部の実施形態では、抗体または抗体断片（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカーまたは薬物－リンカー中間体の反応性官能基と結合を形成して、ＡＤＣを生成することができる。
一態様では、リンカーは、抗体上に存在する遊離システインと反応して共有結合を形成することができる官能性を有する。かかる反応性官能基の非限定的な例示としては、マレイミド、ハロアセトアミド、α－ハロアセチル、スクシンイミドエステルなどの活性化エステル、４－ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、スルホニルクロリド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．７６５－７７３，２００４の７６６頁におけるコンジュゲーション方法を参照されたい。
一部の実施形態では、リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応することができる官能性を有する。例示的なそのような求電子基には、アルデヒドおよびケトンカルボニル基が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応し、抗体単位に共有結合を形成することができる。非限定的なそのような例示的な反応性官能基としては、限定されないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられる。
リンカーは、１つ以上のリンカー成分を含んでいてもよい。例示的なリンカー成分としては、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔまたはｖｃ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、および４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート（ＭＣＣ）が挙げられる。様々なリンカー成分は、当該技術分野で既知であり、そのいくつかを以下に記載する。
リンカーは、薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。非限定的な例示的な切断可能なリンカーとしては、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾンを含む）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、またはジスルフィドを含むリンカーが挙げられる（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２、米国特許第５，２０８，０２０号）。
特定の実施形態では、リンカーは、－Ａa－Ｗw－Ｙy－として以下の式ＩＩを有し、式中、Ａは、「伸長単位」であり、ａは、０～１の整数であり、Ｗは、「アミノ酸単位」であり、ｗは、０～１２の整数であり、Ｙは、「スペーサー単位」であり、ｙは、０、１、または２である。式ＩＩのリンカーを含むＡＤＣは、式Ｉ（Ａ）：Ａｂ－（Ａa－Ｗw－Ｙy－Ｄ）pを有し、式中、Ａｂ、Ｄ、およびｐは、式Ｉについて上記のように定義される。かかるリンカーの例示的な実施形態は、米国特許第７，４９８，２９８号に記載されている。
一部の実施形態では、リンカー成分は、「伸長単位」（Ａ）を含み、抗体を別のリンカー成分または薬物部分に連結する。非限定的で例示的な伸長単位を以下に示す（波線は、抗体、薬物、または追加のリンカー成分への共有結合部位を示す）。
Figure 2022513384000003
一部の実施形態では、リンカー成分は「アミノ酸単位」（Ｗ）を含む。一部のそのような実施形態では、アミノ酸単位は、プロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、それによって、細胞内プロテアーゼ（例えば、リソソーム酵素）への曝露時に、免疫コンジュゲートからの薬物の放出が促進される（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．７７８－７８４，２００３）。例示的なアミノ酸単位には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、およびペンタペプチドが含まれるが、これらに限定されない。例示的なジペプチドとしては、限定されないが、バリン－シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ－ｐｈｅ）、フェニルアラニン－リジン（ｆｋまたはｐｈｅ－ｌｙｓ）、フェニルアラニン－ホモリジン（ｐｈｅ－ｈｏｍｏｌｙｓ）、およびＮ－メチル－バリン－シトルリン（Ｍｅ－ｖａｌ－ｃｉｔ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、限定されないが、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）およびグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸単位は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素切断のために設計および最適化され得るシトルリンアミノ酸単位などの、天然に存在するアミノ酸残基および／または微量アミノ酸および／または非天然アミノ酸類似体を含むことができる。
典型的には、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチド断片の間でペプチド結合を形成することによって、ペプチド型リンカーを調製することができる。かかるペプチド結合は、例えば、液相合成法に従って調製され得る（例えば、Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌｕｂｋｅ（１９６５）“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐｐ ７６－１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。
一部の実施形態では、リンカー成分は、「スペーサー単位」（Ｙ）を含み、抗体を薬物部分に、いずれか直接的に連結するか、または伸長単位および／またはアミノ酸単位を介して連結する。スペーサー単位は、「自壊性（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）」または「非自壊性（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）」であり得る。「非自壊性」スペーサー単位は、ＡＤＣの切断時にスペーサー単位の一部または全てが薬物部分に結合したままであるものである。非自壊性スペーサー単位の例としては、限定されないが、グリシンスペーサー単位およびグリシン－グリシンスペーサー単位が挙げられる。一部の実施形態では、腫瘍細胞関連プロテアーゼによるグリシングリシンスペーサー単位を含むＡＤＣの酵素切断は、ＡＤＣの残りからグリシン－グリシン－薬物部分の放出をもたらす。一部のそのような実施形態では、グリシン－グリシン－薬物部分は、腫瘍細胞において加水分解ステップに供され、したがって、グリシン－グリシンスペーサー単位が薬物部分から切断される。
「自壊性」スペーサー単位は、薬物部分の放出を可能にする。特定の実施形態では、リンカーのスペーサー単位は、ｐ－アミノベンジル単位を含む。一部のそのような実施形態では、ｐ－アミノベンジルアルコールは、アミド結合を介してアミノ酸単位に結合し、ベンジルアルコールと薬物との間に、カルバメート、メチルカルバメート、またはカーボネートを生成する（Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１０８７－１１０３，２００５）。一部の実施形態では、スペーサー単位は、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）を含む。一部の実施形態では、自壊性リンカーを含むＡＤＣは、以下の構造を有し、
Figure 2022513384000004
 式中、Ｑは、－Ｃ1－Ｃ8アルキル、－Ｏ－（Ｃ1－Ｃ8アルキル）、－ハロゲン、－ニトロ、または－シアノであり、ｍは、０～４の範囲の整数であり、Ｘは、１つ以上の追加のスペーサー単位であるか、または不在であってもよく、ｐは、１～約２０の範囲である。一部の実施形態では、ｐは、１～１０、１～７、１～５、または１～４の範囲である。非限定的で例示的なＸスペーサー単位は、
Figure 2022513384000005
 式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して、ＨおよびＣ1～Ｃ6アルキルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ－ＣＨ3である。
自壊性スペーサーの他の例としては、限定されないが、ＰＡＢ基と電子的に類似する芳香族化合物、例えば、２－アミノイミダゾール－５－メタノール誘導体（米国特許第７，３７５，０７８号、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．９，ｐ．２２３７－，１９９９）、およびオルトまたはパラのアミノベンジルアセタールが挙げられる。一部の実施形態では、置換および非置換４－アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．２２３－，１９９５）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］環系およびビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．９４，ｐ．５８１５－，１９７２）、ならびに２－アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５５，ｐ．５８６７，１９９０）などの、アミド結合の加水分解時に環化を受けるスペーサーを使用することができる。グリシン残基のα炭素への薬物の結合は、ＡＤＣにおいて有用であり得る自壊性スペーサーの別の例である（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７，ｐ．１４４７，１９８４）。
一部の実施形態では、リンカーＬは、分岐多官能性リンカー部分を介して２つ以上の薬物部分を抗体に共有結合させるための樹状型リンカーであってもよい（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．２２１３－２２１５，２００２、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．１７６１－１７６８，２００３）。樹状リンカーは、抗体に対する薬物のモル比（すなわち、ＡＤＣの効力に関連する負荷）を増加させることができる。したがって、抗体が１つの反応性システインチオール基のみを有する場合、多数の薬物部分が樹状リンカーを介して結合され得る。
ＡＤＣの文脈で、非限定的で例示的なリンカーは、以下の式Ｉで示される：
Figure 2022513384000006
 式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して、ＨおよびＣ1～Ｃ6アルキルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ－ＣＨ3である。
Figure 2022513384000007
 式中、ｎは、０～１２である。一部の実施形態では、ｎは、２～１０である。一部の実施形態では、ｎは、４～８である。
さらなる非限定的で例示的なＡＤＣは、以下の構造を含む：
Figure 2022513384000008
 各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ1～Ｃ6アルキルであり、ｎは、１～１２である。
一部の実施形態では、リンカーは、溶解性および／または反応性を調節する基で置換される。非限定的な例として、スルホネート（－ＳＯ3 -）またはアンモニウムなどの荷電置換基は、ＡＤＣを調製するために使用される合成経路に応じて、リンカー試薬の水溶性を増加させ、抗体および／または薬物部分とのリンカー試薬のカップリング反応を促進し得るか、またはＤとＡｂ－Ｌ（抗体－リンカー中間体）とのカップリング反応もしくはＡｂとＤ－Ｌ（薬物－リンカー中間体）とのカップリング反応を促進し得る。一部の実施形態では、リンカーの一部が抗体にカップリングされ、リンカーの一部が薬物にカップリングされ、次いでＡｂ－（リンカー部分）aが薬物－（リンカー部分）bにカップリングされて、式ＩのＡＤＣを形成する。
本発明の化合物は、限定されないが、以下のリンカー試薬をもちいてＡＤＣが調製されることが明示的に企図される：ビス－マレイミド－トリオキシエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、Ｎ－（β－マレイミドプロピルオキシ）－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、Ｎ－（ε－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、Ｎ－［γ－マレイミドブチルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、１，６－ヘキサン－ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、スクシンイミル３－（ブロモアセトアミド）プロピオンネート（ＳＢＡＰ）、スクシンイミドヨードアセート（ＳＩＡ）、スクシンジイル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル６－［（ベータ－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、イミノチオラン（ＩＴ）、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、およびスクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、ならびにビス－マレイミド試薬を含む：ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４－ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビスマレイミジル－２，３－ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、ＢＭ（ＰＥＧ）2（以下に示す）、およびＢＭ（ＰＥＧ）3（以下に示す）；イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）。一部の実施形態では、ビス－マレイミド試薬は、抗体のシステインのチオール基を、チオール含有薬物部分、リンカー、またはリンカー－薬物中間体に結合することを可能にする。チオール基と反応する他の官能基としては、限定されないが、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
特定の有用なリンカー試薬は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）などの様々な商業的供給源から入手することができるか、または当該技術分野で記載されている手順に従って合成される（例えば、Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６７，ｐｐ．１８６６－１８７２，２００２、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．３８，ｐｐ．５２５７－６０，１９９７、Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６０，ｐｐ．５３５２－５３５５，１９９５、Ｆｒｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１８０－１８６，１９９５、米国特許第６，２１４，３４５号、ＷＯ０２／０８８１７２、ＵＳ２００３／１３０１８９、ＵＳ２００３／０９６７４３、ＷＯ０３／０２６５７７、ＷＯ０３／０４３５８３、およびＷＯ０４／０３２８２８）。
炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
ｉｉ）例示的な薬物部分
１）マイタンシンとマイタンシノイド
一部の実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つ以上のマイタンシノイド分子にコンジュゲートされる抗体を含む。マイタンシノイドは、マイタンシンの誘導体であり、チューブリンの重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、最初、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａ（米国特許第３，８９６，１１１号）から単離された。その後、特定の微生物も、マイタンシノールおよびＣ－３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号、同第４，２４８，８７０号、同第４，２５６，７４６号、同第４，２６０，６０８号、同第４，２６５，８１４号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３０８，２６８号、同第４，３０８，２６９号、同第４，３０９，４２８号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３１７，８２１号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，４５０，２５４号、同第４，３６２，６６３号、および同第４，３７１，５３３号に開示されている。
マイタンシノイドの薬物部分は、以下の理由から、抗体－薬物コンジュゲートにおける魅力的な薬物部分である：（ｉ）発酵生成物の発酵または化学修飾もしくは誘導体化によって調製するのに比較的アクセス可能である、（ｉｉ）抗体への非スルフィドリンカーを介したコンジュゲーションに好適な官能基との誘導体化に適している、（ｉｉｉ）血漿中で安定である、および（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効である。
マイタンシノイド薬物部分として使用するのに好適な特定のマイタンシノイドは、当該技術分野で既知であり、既知の方法に従って天然源から単離され得るか、または遺伝子改変技術を使用して産生され得る（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．９９，ｐｐ．７９６８－７９７３，２００２）。マイタンシノイドは、既知の方法に従って、合成的に調製してもよい。
例示的なマイタンシノイド薬物部分としては、限定されないが、以下のような修飾芳香族環を有するものが含まれる：Ｃ－１９－デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（例えば、アンサマイトシンＰ２の水素化リチウムアルミニウム還元によって調製）、Ｃ－２０－ヒドロキシ（またはＣ－２０－デメチル）＋／－Ｃ－１９－デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および同第４，３０７，０１６号）（例えば、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）もしくはアクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を使用した脱メチル化、またはＬＡＨを使用した脱塩素化によって調製）、ならびにＣ－２０－デメトキシ、Ｃ－２０－アシルオキシ（－ＯＣＯＲ）、＋／－デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（例えば、アシルクロリドを使用したアシル化によって調製）、ならびに芳香族環の他の位置で修飾を有するもの。
例示的なマイタンシノイド薬物部分には、以下のような修飾を有するものも含まれる：Ｃ－９－ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（例えば、マイタンシノールとＨ2ＳまたはＰ2Ｓ5との反応によって調製）、Ｃ－１４－アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ2ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、Ｃ－１４－ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ2ＯＨまたはＣＨ2ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（例えば、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製）、Ｃ－１５－ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（例えば、ストレプトマイセス属によるマイタンシノールの変換によって調製）、Ｃ－１５－メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および同第４，３１５，９２９号）（例えば、Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｌｆｌｏｒａから単離）、Ｃ－１８－Ｎ－デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および同第４，３２２，３４８号）（例えば、ストレプトマイセス属によるマイタンシノールの脱メチルによって調製）、および４，５－デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（例えば、マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製）。
マイタンシノイド化合物上の多くの位置が、結合位置として有用である。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用してヒドロキシル基との反応によって形成され得る。一部の実施形態では、反応は、ヒドロキシル基を有するＣ－３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ－１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ－１５位、およびヒドロキシル基を有するＣ－２０位で生じ得る。一部の実施形態では、結合は、マイタンシノールまたはマイタンシノール類似体のＣ－３位に形成される。
マイタンシノイド薬物部分には、以下の構造を有するものが含まれる：
Figure 2022513384000009
 ここで、波線は、ＡＤＣのリンカーへの、マイタンシノイド薬物部分の硫黄原子の共有結合を示す。各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ1～Ｃ6アルキルであり得る。アミド基を硫黄原子に結合させるアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、またはプロピルであってもよく、すなわち、ｍが、１、２、または３である（米国特許第６３３，４１０号、同第５，２０８，０２０号、Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９３，ｐｐ．８６１８－８６２３，１９９６）．
マイタンシノイド薬物部分のすべての立体異性体は、本発明のＡＤＣ、すなわちキラル炭素におけるＲおよびＳ配置の任意の組み合わせ、について企図される（米国特許第７，２７６，４９７号、同第６，９１３，７４８号、同第６，４４１，１６３号、同第６３３，４１０号（ＲＥ３９１５１）、同第５，２０８，０２０号、Ｗｉｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９：４３９２－４４０８）。一部の実施形態では、マイタンシノイド薬物部分は以下の立体化学を有する：
Figure 2022513384000010
マイタンシノイド薬物部分の例示的な実施形態としては、限定されないが、以下の構造を有するＤＭ１、ＤＭ３、およびＤＭ４が含まれる。
Figure 2022513384000011
 ここで、波線は、抗体－薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への薬物の硫黄原子の共有結合を示す。
ＤＭ１がＢＭＰＥＯリンカーを介して抗体のチオール基に連結される例示的な抗体－薬物コンジュゲートは、以下の構造および略語を有する：
Figure 2022513384000012
 式中、Ａｂは、抗体であり、ｎは、０、１、または２であり、ｐは、１～約２０である。一部の実施形態では、ｐは、１～１０であるか、１～７であるか、１～５であるか、または１～４である。
マイタンシノイドを含む免疫コンジュゲート、それらを作製する方法、およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号および同第５，４１６，０６４号、ＵＳ２００５／０２７６８１２Ａ１、ならびにＥＰ０４２５２３５Ｂ１に開示されている。また、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９３，ｐｐ．８６１８－８６２３，１９９６、およびＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２も参照されたい。
一部の実施形態では、抗体－マイタンシノイドコンジュゲートは、抗体またはマイタンシノイド分子のいずれかの生物学的活性を著しく低下させることなく、抗体をマイタンシノイド分子に化学的に結合させることによって調製され得る。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい。一部の実施形態では、抗体分子あたり平均３～４個のマイタンシノイド分子がコンジュゲートされたＡＤＣは、抗体の機能または溶解度に悪影響を及ぼすことなく、標的細胞の細胞傷害性を増強する有効性を示している。一部の場合、裸の抗体を使用するより、１分子の毒素／抗体でさえ細胞傷害性を増強すると予想されている。
抗体－マイタンシノイドコンジュゲートを作製するための例示的な連結基としては、例えば、本明細書に記載される連結基、および米国特許第５，２０８，０２０号、ＥＰ０４２５２３５Ｂ１、Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２、ＵＳ２００５／０２７６８１２Ａ１、およびＵＳ２００５／０１６９９３Ａ１に記載される連結基が含まれる。
（２）アウリスタチンとドラスタチン
薬物部分としては、ドラスタチン、アウリスタチン、ならびにそれらの類似体および誘導体が挙げられる（米国特許第５，６３５，４８３号、同第５，７８０，５８８号、同第５，７６７，２３７号、および同第６，１２４，４３１号）。アウリスタチンは、海洋軟体動物の化合物であるドラスタチン－１０の誘導体である。いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核分裂および細胞分裂（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．３５８０－３５８４，２００１）、および抗癌（米国特許第５，６６３，１４９号）、および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．４２，ｐｐ．２９６１－２９６５，１９９８）を妨げることが示されている。ドラスタチン／アウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合し得る（ＷＯ０２／０８８１７２、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．７７８－７８４，２００３、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１４５８－１４６５，２００３）。
例示的なアウリスタチンの実施形態としては、米国特許第７，４９８，２９８号および同第７，６５９，２４１号に開示されるＮ末端連結モノメチルアウリスタチン薬物部分であるＤEおよびＤFが挙げられる：
Figure 2022513384000013
 式中、ＤEおよびＤFの波線は、抗体または抗体－リンカー成分への共有結合部位を示し、各位置で独立して、
Ｒ2は、ＨおよびＣ1～Ｃ8アルキルから選択され、
Ｒ3は、Ｈ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、Ｃ3～Ｃ8炭素環、アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8炭素環）、Ｃ3～Ｃ8複素環、およびＣ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8複素環）から選択され、
Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、Ｃ3～Ｃ8炭素環、アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8炭素環）、Ｃ3～Ｃ8複素環、およびＣ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8複素環）から選択され、
Ｒ5は、Ｈおよびメチルから選択され、
または、Ｒ4およびＲ5は、ともに炭素環を形成し、式－（ＣＲaＲb）n－を有し、ＲaおよびＲbは、独立して、Ｈ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、およびＣ3～Ｃ8炭素環から選択され、ｎは、２、３、４、５、および６から選択され、
Ｒ6は、ＨおよびＣ1～Ｃ8アルキルから選択され、
Ｒ7は、Ｈ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、Ｃ3～Ｃ8炭素環、アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8炭素環）、Ｃ3～Ｃ8複素環、およびＣ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8複素環）から選択され、
各Ｒ8は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、Ｃ3～Ｃ8炭素環、およびＯ－（Ｃ1～Ｃ8アルキル）から選択され、
Ｒ9は、ＨおよびＣ1～Ｃ8アルキルから選択され、
Ｒ10は、アリールまたはＣ3～Ｃ8複素環から選択され、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ12であり、Ｒ12は、Ｃ1～Ｃ8アルキルであり、
Ｒ11は、Ｈ、Ｃ1～Ｃ20アルキル、アリール、Ｃ3～Ｃ8複素環、－（Ｒ13Ｏ）m～Ｒ１4、または－（Ｒ13Ｏ）m～ＣＨ（Ｒ15）2から選択され、
ｍは、１～１０００の範囲の整数であり、
Ｒ13は、Ｃ2～Ｃ8アルキルであり、
Ｒ14は、ＨまたはＣ1～Ｃ8アルキルであり、
ｅは、各出現時に独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、－（ＣＨ2）n－Ｎ（Ｒ16）2、－（ＣＨ2）n－ＳＯ3Ｈ、または－（ＣＨ2）n－ＳＯ3－Ｃ1～Ｃ8アルキルであり、
ｅは、各出現時に独立して、Ｈ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、または－（ＣＨ2）n－ＣＯＯＨであり、
Ｒ18は、－Ｃ（Ｒ8）2－Ｃ（Ｒ8）2－アリール、－Ｃ（Ｒ8）2－Ｃ（Ｒ8）2－（Ｃ3～Ｃ8複素環）、および－Ｃ（Ｒ8）2－Ｃ（Ｒ8）2－（Ｃ3～Ｃ8炭素環）から選択され、
ｎは、０～６の範囲の整数である。
一実施形態では、Ｒ3、Ｒ4およびＲ7は、独立して、イソプロピルまたはｓｅｃ－ブチルであり、Ｒ5は、－Ｈまたはメチルである。例示的な実施形態では、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ、イソプロピルであり、Ｒ5は、－Ｈであり、Ｒ7は、ｓｅｃ－ブチルである。
さらに別の実施形態では、Ｒ2およびＲ6は、それぞれ、メチルであり、Ｒ9は、－Ｈである。
さらに別の実施形態では、Ｒ8は、各出現時に、－ＯＣＨ3である。
例示的な実施形態では、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ、イソプロピルであり、Ｒ2およびＲ6は、それぞれ、メチルであり、Ｒ5は、－Ｈであり、Ｒ7は、ｓｅｃ－ブチルであり、Ｒ8は、各出現時に、－ＯＣＨ3であり、Ｒ9は、－Ｈである。
一実施形態では、Ｚは、－Ｏ－または－ＮＨ－である。
一実施形態では、Ｒ10は、アリールである。
例示的な一実施形態では、Ｒ10は、－フェニルである。
例示的な一実施形態では、Ｚが－Ｏ－である場合、Ｒ11は、－Ｈ、メチル、またはｔ－ブチルである。
一実施形態では、Ｚが－ＮＨである場合、Ｒ11は、－ＣＨ（Ｒ15）2であり、式中、Ｒ15は－（ＣＨ2）n－Ｎ（Ｒ16）2であり、Ｒ16は、－Ｃ1～Ｃ8アルキルまたは－（ＣＨ2）n－ＣＯＯＨである。
別の実施形態では、Ｚが－ＮＨである場合、Ｒ11は、－ＣＨ（Ｒ15）2であり、Ｒ15は、－（ＣＨ2）n－ＳＯ3Ｈである。
式ＤEの例示的なアウリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＥであり、波線は、抗体－薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す：
Figure 2022513384000014
式ＤEの例示的なアウリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＦであり、波線は、抗体－薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す：
Figure 2022513384000015
他の例示的な実施形態としては、ペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニンのカルボキシ修飾を有するモノメチルバリン化合物（ＷＯ２００７／００８８４８）およびペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニンの側鎖の修飾を有するモノメチルバリン化合物（ＷＯ２００７／００８６０３）が挙げられる。
ＭＭＡＦおよび様々なリンカー成分を含む式ＩのＡＤＣの非限定的で例示的な実施形態としては、Ａｂ－ＭＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦおよびＡｂ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦがさらに挙げられる。タンパク質分解性ではない切断可能なリンカーによって抗体に結合したＭＭＡＦを含む免疫コンジュゲートは、タンパク質分解性の切断可能なリンカーによって抗体に結合したＭＭＡＦを含む免疫コンジュゲートと、同等の活性を有することが示されている（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１１４－１２４，２００６）。一部のそのような実施形態では、薬物放出は、細胞における抗体の分解の影響を受けると考えられている。
典型的には、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチド断片の間にペプチド結合を形成することによって、ペプチドベースの薬物部分を調製することができる。かかるペプチド結合は、例えば、液相合成法に従って調製することができる（例えば、Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐｐ ７６－１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。アウリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、一部の実施形態では、以下の方法に従って調整することができる：米国特許第７，４９８，２９８号、同第５，６３５，４８３号、同第５，７８０，５８８号、Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１１１，ｐｐ．５４６３－５４６５，１９９８、Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．２４３－２７７，１９９８、Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．７１９－７２５，１９９６、Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．ｖｏｌ．１５，ｐｐ．８５９－８６３，１９９６、およびＤｏｒｏｎｉｎａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．７７８－７８４，２００３。
一部の実施形態では、ＭＭＡＥなどの式ＤEのアウリスタチン／ドラスタチン薬物部分、およびＭＭＡＦなどのＤE、ならびにＭＣ－ＭＭＡＦ、ＭＣ－ＭＭＡＥ、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ、およびＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥなどの薬物－リンカー中間体およびその誘導体は、米国特許第７，４９８，２９８号、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１１４－１２４，２００６、およびＤｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．７７８－７８４，２００３に記載されている方法を使用して調製することができ、次いで、目的の抗体にコンジュゲートされ得る。
（３）カリケアマイシン
一部の実施形態では、免疫コンジュゲートは１つ以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされた抗体または抗体断片を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーおよびその類似体は、サブピコモル濃度で、二本鎖ＤＮＡ切断を生成することができる（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５３，ｐｐ．３３３６－３３４２，１９９３、Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．２９２５－２９２８，１９９８）。カリケアマイシンは、細胞内の作用部位を有するが、特定の場合、容易に細胞膜を通過しない。したがって、一部の実施形態では、抗体媒介性内在化を通したこれらの薬剤の細胞取り込みは、それらの細胞傷害性効果を大幅に増強し得る。カリケアマイシン薬物部分を有する抗体－薬物コンジュゲートを調製する非限定的で例示的な方法は、例えば、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、および同第５，７６７，２８５号に記載されている。
（４）ピロロベンゾジアゼピン
一部の実施形態では、ＡＤＣは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。一部の実施形態では、ＰＤＢ二量体は、特定のＤＮＡ配列を認識し、それに結合する。天然生成物アントラマイシンであるＰＢＤは、１９６５年に最初に報告された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．５７９３－５７９５，１９６５、Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．５７９１－５７９３，１９６５）。その後、天然および類似体の両方のいくつかのＰＢＤが報告されており（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．ｖｏｌ．１９９４，ｐｐ．４３３－４６５ １９９４）、三環式ＰＢＤ骨格の二量体が含まれるＣｈｅｍ．Ｒｅｖ．ｖｏｌ．１９９４，ｐｐ．４３３－４６５ １９９４（米国特許第６，８８４，７９９号、同第７，０４９，３１１号、同第７，０６７，５１１号、同第７，２６５，１０５号、同第７，５１１，０３２号、同第７，５２８，１２６号、および同第７，５５７，０９９号）。いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、二量体構造は、Ｂ型ＤＮＡの副溝との等螺旋性に適切な３次元形状を付与し、結合部位にぴったり適合すると考えられている（Ｋｏｈｎ，Ｉｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＩＩＩ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３－１１（１９７５）、Ｈｕｒｌｅｙ ａｎｄ Ｎｅｅｄｈａｍ－ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１９，ｐｐ．２３０－２３７，１９８６）。Ｃ２アリール置換基を有する二量体ＰＢＤ化合物は、細胞傷害性剤として有用であることが示されている（Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．７０，ｐｐ．６８４９－６８５８，２０１０、Ａｎｔｏｎｏｗ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．５３，ｐｐ．２９２７－２９４１，２０１０、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ．６４６３－６４６６，２００９）。
ＰＢＤ二量体は、抗体にコンジュゲートされており、得られたＡＤＣは、抗癌特性を有することが示されている。ＰＢＤ二量体上の非限定的で例示的な連結部位としては、５員ピロロ環、ＰＢＤ単位間の繋留、およびＮ１０－Ｃ１１イミン基が挙げられる（ＷＯ２００９／０１６５１６、ＵＳ２００９／３０４７１０、ＵＳ２０１０／０４７２５７、ＵＳ２００９／０３６４３１、ＵＳ２０１１／０２５６１５７、ＷＯ２０１１／１３０５９８）。
ＡＤＣの非限定的で例示的なＰＢＤ二量体成分は、
Figure 2022513384000016
 またはその塩もしくは溶媒和物であり、式中、
波線は、リンカーへの共有結合部位を示し、
点線は、Ｃ１とＣ２との間、またはＣ２とＣ３との間の任意選択的な二重結合の存在を示し、
Ｒ2は、独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ2、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ－ＲD、＝Ｃ（ＲD）2、Ｏ－ＳＯ2－Ｒ、ＣＯ2Ｒ、およびＣＯＲから選択され、任意選択的に、ハロまたはジハロからさらに選択され、ＲDは、独立して、Ｒ、ＣＯ2Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ2Ｈ、およびハロから選択され、
Ｒ6およびＲ9は、独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ2、Ｍｅ3Ｓｎ、およびハロから選択され、
Ｒ7は、独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ2、Ｍｅ3Ｓｎ、およびハロから選択され、
Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、およびＮＨから選択され、
Ｒ11は、Ｈ、もしくはＲ、またはＱがＯである場合はＳＯ3Ｍのいずれかであり、Ｍは、金属カチオンであり、
ＲおよびＲ’は、それぞれ独立して、任意選択手的に置換されたＣ1～8アルキル、Ｃ1～12アルキル、Ｃ3～8ヘテロシクリル、Ｃ3～20複素環、およびＣ5～20アリール基から選択され、任意選択的に基ＮＲＲ’と関連して、ＲおよびＲ’は、それらが結合する窒素原子とともに、任意選択的に置換された４員、５員、６員、または７員の複素環を形成し、
Ｒ12、Ｒ16、Ｒ19およびＲ17は、それぞれＲ2、Ｒ6、Ｒ9およびＲ7について定義された通りであり、
Ｒ’’は、Ｃ3～12アルキレン基であり、この鎖は、１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ、および／または芳香族環（例えば、ベンゼンまたはピリジン）によって中断され得、これらの環は、任意選択的に置換され、
ＸおよびＸ’は、独立して、Ｏ、ＳおよびＮ（Ｈ）から選択される。
一部の実施形態では、ＲおよびＲ’は、それぞれ独立して、任意に置換されたＣ1～12アルキル、Ｃ3～20複素環、およびＣ5～20アリール基から選択され、任意選択的に基ＮＲＲ’、ＲおよびＲ’に関連して、それらが結合する窒素原子とともに、任意選択的に置換された４員、５員、６員、または７員複素環を形成する。一部の実施形態では、Ｒ9およびＲ19は、Ｈである。一部の実施形態では、Ｒ6およびＲ16は、Ｈである。
一部の実施形態では、Ｒ7およびＲ17は、両方ともＯＲ7Aであり、Ｒ7Aは、任意選択的に置換されたＣ1～4アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ7Aは、Ｍｅである。一部の実施形態では、Ｒ7Aは、Ｃｈ2Ｐｈであり、Ｐｈは、フェニル基である。一部の実施形態では、Ｘは、Ｏである。一部の実施形態では、Ｒ11は、Ｈである。一部の実施形態では、各モノマー単位においてＣ２とＣ３との間に二重結合が存在する。
一部の実施形態では、Ｒ2およびＲ12は、独立して、ＨおよびＲから選択される。一部の実施形態では、Ｒ2およびＲ12は、独立して、Ｒである。一部の実施形態では、Ｒ2およびＲ12は、独立して、任意選択的に置換されたＣ5～20アリールまたはＣ5～7アリールまたはＣ8～10アリールである。一部の実施形態では、Ｒ2およびＲ12は、独立して、任意選択的に置換されたフェニル、チエニル、ナプチル、ピリジル、キノリニル、またはイソキノリニルである。一部の実施形態では、Ｒ2およびＲ12は、独立して、＝Ｏ、＝ＣＨ2、＝ＣＨ－ＲD、および＝Ｃ（ＲD）2から選択される。一部の実施形態では、Ｒ2およびＲ12は、それぞれ、＝ＣＨ2である。一部の実施形態では、Ｒ2およびＲ12は、それぞれ、Ｈである。一部の実施形態では、Ｒ2およびＲ12は、それぞれ、＝Ｏである。一部の実施形態では、Ｒ2およびＲ12は、それぞれ、＝ＣＦ2である。一部の実施形態では、Ｒ2および／またはＲ12は、独立して、＝Ｃ（ＲD）2である。一部の実施形態では、Ｒ2および／またはＲ12は、独立して、＝ＣＨ－ＲDである。
一部の実施形態では、Ｒ2および／またはＲ12が＝ＣＨ－ＲDである場合、各基は、独立して、以下に示される構成のいずれかを有し得る：
Figure 2022513384000017
 一部の実施形態では、ａ＝ＣＨ－ＲDは、構成（Ｉ）にある。一部の実施形態では、Ｒ’’は、Ｃ3アルキレン基またはＣ5アルキレン基である。
ＰＢＤ二量体－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＡｂおよびＰＢＤ二量体－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ－Ａｂのリンカーは、プロテアーゼで切断可能であり、一方、ＰＢＤ二量体－マレイミド－アセタールのリンカーは、酸不安定である。
ＰＢＤ二量体およびＰＢＤ二量体を含むＡＤＣは、当該技術分野で既知の方法に従って調製され得る。例えば、ＷＯ２００９／０１６５１６、ＵＳ２００９／３０４７１０、ＵＳ２０１０／０４７２５７、ＵＳ２００９／０３６４３１、ＵＳ２０１１／０２５６１５７、ＷＯ２０１１／１３０５９８を参照されたい。
（５）アントラサイクリン
一部の実施形態では、ＡＤＣはアントラサイクリンを含んでいてもよい。アントラサイクリンは、細胞傷害性活性を示す抗生物質化合物である。いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、研究は、アントラサイクリンが、以下を含むいくつかの異なる機構によって細胞を死滅させるように動作し得ることを示している。１）薬物分子の細胞のＤＮＡへのインターカレーションにより、ＤＮＡ依存性の核酸合成を阻害すること、２）次いで細胞の高分子と反応して細胞に損傷を引き起こすフリーラジカルの薬物による産生、および／または３）薬物分子と細胞膜との相互作用（例えば、Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ”ｉｎ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ； Ｎ．Ｒ．Ｂａｃｈｕｒ，“Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｄａｍａｇｅ”（同上ｐｐ．９７－１０２）を参照されたい）。それらの潜在的細胞傷害性のアントラサイクリンは、白血病、乳癌、肺癌、卵巣腺癌および肉腫などの多数の癌の治療に使用されてきた（例えば、Ｐ．Ｈ－Ｗｉｅｒｎｉｋ，ｉｎ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ Ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，ｐ．１１を参照されたい）。
非限定的で例示的なアントラサイクリンは、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシン、ネモルビシン、およびそれらの誘導体を含む。ダウノルビシンおよびドキソルビシンの免疫コンジュゲートおよびプロドラッグが調製され、研究されている（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．４７７－５２３，２００６、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．３５８－３６２．１９９６、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．７１７－７２１，２００５、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９７，ｐｐ．８２９－８３４，２０００、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１５２９－１５３２，２００２、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．４３３６－４３４３，２００２、ＥＰ０３２８１４７、米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）。抗体－薬物コンジュゲートＢＲ９６－ドキソルビシンは、腫瘍関連抗原Ｌｅｗｉｓ－Ｙと特異的に反応し、第Ｉ相および第ＩＩ相試験において評価されている（Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．２２８２－２２９２，２０００、Ａｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒ．，ｖｏｌ．６，ｐｐ．７８－８１，２０００、Ｔｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．４７８－４８４，１９９９）。
ＰＮＵ－１５９６８２は、ネモルビシンの強力な代謝産物（または誘導体）である（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．１６０８－１６１７，２００５）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのグリコシドアミノ上に２－メトキシモルホリノ基を有するドキソルビシンの半合成類似体であり、臨床評価を受けており（Ｇｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１３３－１３８，１９９０、Ｒｉｐａｍｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．６５，ｐｐ．７０３－７０７，１９９２）、肝細胞癌の第ＩＩ相／第ＩＩＩ相試験を含む（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２，Ａｂｓ１４４８，２００３、Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４４：１ｓｔ Ｅｄ，Ａｂｓ ４６４９，２００３、Ｐａｃｃｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４，ｐ．１４１１６，２００６）。
ＰＮＵ－１５９６８２を含むアントラサイクリンは、いくつかの連結部位および本明細書に記載のリンカーを含む様々なリンカー（ＵＳ２０１１／００７６２８７、ＷＯ２００９／０９９７４１、ＵＳ２０１０／００３４８３７、ＷＯ２０１０／００９１２４）を介して抗体にコンジュゲートされ得る。
ＰＮＵ－１５９６８２マレイミドアセタール－Ａｂのリンカーは、酸不安定であり、一方、ＰＮＵ－１５９６８２－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－Ａｂ、ＰＮＵ－１５９６８２－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－スペーサー－Ａｂ、およびＰＮＵ－１５９６８２－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－スペーサー（Ｒ1Ｒ2）－Ａｂのリンカーは、プロテアーゼで切断可能である。
（６）他の薬物部分
また、薬物部分には、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，ｖｏｌ．９２，ｐｐ．１５７３－１５８１，２０００、Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１０２５－１０２８，２０００、Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．７８６－７９１，２００２）、ならびに酵素活性毒素およびその断片（限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エクソトキシンＡ鎖（緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリＡｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウＰｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリＭｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウＳａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテエンが挙げられる）も含まれる。例えば、ＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
薬物部分には、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）も含まれる。
特定の実施形態では、免疫コンジュゲートは、高放射性原子を含んでもよい。放射性コンジュゲート抗体の産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。一部の実施形態では、免疫コンジュゲートが検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、Ｔｃ99もしくはＩ123、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、ジルコニウム－８９、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄を含み得る。ジルコニウム－８９は、種々の金属キレート剤に複合体化され、例えば、ＰＥＴ画像撮影のために抗体にコンジュゲートされてもよい（ＷＯ２０１１／０５６９８３）。
放射標識または他の標識は、既知の方法で免疫コンジュゲートに組み込んでもよい。例えば、ペプチドは、例えば、１つ以上の水素の代わりに１つ以上のフッ素－１９原子を含む好適なアミノ酸前駆体を使用して生合成または化学合成され得る。一部の実施形態では、Ｔｃ99、Ｉ123、Ｒｅ186、Ｒｅ188、およびＩｎ111などの標識は、抗体中のシステイン残基を介して結合され得る。一部の実施形態では、イットリウム－９０は、抗体のリジン残基を介して結合され得る。一部の実施形態では、ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．８０，ｐｐ．４９－５７，１９７８）を使用して、ヨウ素－１２３を組み込むことができる。“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）は、特定の他の方法を記載している。
特定の実施形態では、免疫コンジュゲートは、プロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートされた抗体を含んでいてもよい。一部のそのような実施形態では、プロドラッグ活性化酵素は、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと）を、抗癌剤などの活性薬物に変換する。かかる免疫コンジュゲートは、一部の実施形態では、抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（「アデプト」）において有用である。抗体にコンジュゲートされ得る酵素としては、限定されないが、リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ、硫酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ、無毒な５－フルオロシトシンを抗癌薬の５－フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ、セラチアプロテアーゼ、熱分解、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）などのペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なプロテアーゼ、Ｄ－アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ－アラニルカルボキシペプチダーゼ、β－ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなど、それぞれ、グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な炭水化物切断酵素、β－ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ－ラクタマーゼ、ペニシリンＶアミダーゼおよびペニシリンＧアミダーゼなどのそれぞれフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基を持つアミン窒素で誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ、が挙げられる。一部の実施形態では、酵素は、当該技術分野でよく知られた組換えＤＮＡ技術によって、抗体に共有結合され得る。例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３１２，ｐｐ．６０４－６０８，１９８４参照されたい。
ｉｉｉ）薬物負荷
薬物負荷は、式Ｉの分子中の抗体あたりの薬物部分の平均数ｐによって表される。薬物負荷は、抗体あたり１～２０個の薬物部分（Ｄ）の範囲であり得る。式ＩのＡＤＣには、１～２０個の範囲の薬物部分とコンジュゲートされた抗体の集合体が含まれる。コンジュゲーション反応からのＡＤＣの調製に使用する抗体あたりの薬物部分の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けることができる。ｐに関してのＡＤＣの定量的な分布もまた、決定され得る。場合によっては、ｐが他の薬物負荷を有するＡＤＣとは異なる特定の値である場合、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって、均質なＡＤＣの分離、精製、および特徴付けが達成され得る。
いくつかの抗体－薬物コンジュゲートの場合、ｐは、抗体上の結合部位の数によって制限され得る。例えば、上記のある特定の例示的な実施形態のように、結合がシステインチオールである場合、抗体は、１つまたはいくつかのシステインチオール基のみを有してもよく、またはリンカーが結合され得る１つまたはいくつかの十分に反応性のあるチオール基のみを有してもよい。特定の実施形態では、より高い薬物負荷、例えば、ｐ＞５では、特定の抗体－薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の喪失を引き起こし得る。特定の実施形態では、ＡＤＣの平均薬物負荷は、１～約８、約２～約６、または約３～約５の範囲である。実際、特定のＡＤＣの場合、抗体あたりの薬物部分の最適比は、８未満であってもよく、約２～約５であってもよいことが示されている（米国特許第７，４９８，２９８号）。
特定の実施形態では、コンジュゲーション反応中に、薬物部分の理論最大値未満が抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、以下に考察されるように、薬物－リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含み得る。一般に、抗体は、薬物部分に連結され得る遊離および反応性システインチオール基を、多く含んでいない。実際、抗体中のほとんどのシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在する。特定の実施形態では、抗体は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で還元されて、部分的または全体的な還元条件下で、反応性のシステインチオール基を生成し得る。特定の実施形態では、抗体は、リジンまたはシステインなどの反応性求核基を明らかにするために変性条件に供される。
ＡＤＣの負荷（薬物／抗体比）は、異なる方法で、例えば、（ｉ）抗体に対する薬物－リンカー中間体またはリンカー試薬のモル過剰を制限すること、（ｉｉ）コンジュゲーションの反応時間または温度を制限すること、および（ｉｉｉ）システインチオール修飾の部分的または限定的な還元条件によって調節され得る。
２つ以上の求核基が薬物－リンカー中間体またはリンカー試薬と反応する場合、得られた生成物は、抗体に１つ以上の薬物部分が結合した分布を有する、ＡＤＣの混合物であることを理解されたい。抗体あたりの薬物の平均数は、抗体に特異的であり、かつ薬物に特異的である二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって、混合物から計算され得る。混合物中の個々のＡＤＣは、質量分析によって同定され、ＨＰＬＣ、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離され得る（例えば、ＭｃＤｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ．２９９－３０７，２００６、Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．７０６３－７０７０，２００４を参照されたい）。特定の実施形態では、単一の負荷値を有する均一なＡＤＣは、電気泳動またはクロマトグラフィーによってコンジュゲーション混合物から単離され得る。
ｉｖ）免疫コンジュゲートを調製する特定の方法
式ＩのＡＤＣである免疫コンジュゲートは、以下を含む、当業者に既知の有機化学の反応、条件、および試薬を用いて、いくつかの経路によって調製することができる：（１）抗体の求核基を二価リンカー試薬と反応させて、共有結合を介してＡｂ－Ｌを形成し、続いて薬物部分Ｄと反応させること、および（２）薬物部分の求核基を二価リンカー試薬と反応させて、共有結合を介してＤ－Ｌを形成し、続いて抗体の求核基と反応させること、を含む。後者の経路を介して式ＩのＡＤＣを調製するための例示的な方法は、米国特許第７，４９８，２９８号に記載されている。
抗体上の求核基としては、限定されないが、以下が含まれる：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖ヒドロキシルまたはアミノ基。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、以下を含むリンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成するように反応することができる：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸塩、および酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキルおよびベンジルハロゲン化物、ならびに（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基。特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、抗体が完全にまたは部分的に還元されるように、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で処理することによって、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にされ得る。したがって、各システイン架橋は、理論的には、２つの反応性チオール求核剤を形成する。追加の求核基は、例えば、リジン残基を２－イミノチオラン（トラウト試薬）と反応させることによるリジン残基の修飾を通して、抗体に導入され、アミンがチオールに変換され得る。また、反応性チオール基は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のシステイン残基を導入することによって（例えば、１つ以上の非天然システインアミノ酸残基を含むバリアント抗体を調製することによって）、抗体に導入されてもよい。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートはまた、アルデヒド基またはケトンカルボニル基などの抗体または抗体断片上の求電子基と、リンカー試薬または薬物上の求核基との間の反応によって生成され得る。リンカー試薬上の有用な求核基としては、限定されないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられる。一実施形態では、抗体は、リンカー試薬または薬物上の求核置換基と反応することができる求電子性部分を導入するように修飾される。別の実施形態では、グリコシル化抗体の糖は、例えば、過ヨウ素酸酸化試薬で酸化されて、リンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成し得る。得られたイミンシッフ塩基は、安定した結合を形成することができ、または、例えば、水素化ホウ素試薬によって還元されて、安定したアミン結合を形成することができる。一実施形態では、グリコシル化抗体の炭水化物部分と、ガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムとのいずれかの反応は、抗体中に、薬物上の適切な基と反応することができるカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基をもたらし得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基を含む抗体は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し得、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの産生をもたらす（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ＆Ｓｔｒｏｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３，ｐｐ．１３８－１４６，１９９２、米国特許第５，３６２，８５２号）。かかるアルデヒドは、薬物部分またはリンカー求核剤と反応し得る。
薬物部分上の例示的な求核基としては、限定されないが、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびリンカー部分上の求電子基と共有結合を形成するように反応することができるアリールヒドラジド基、ならびに以下のリンカー試薬が含まれる：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハライドなどの活性エステル、（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキルハライドおよびベンジルハライド、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基。
ＡＤＣを調製するために使用され得る非限定的で例示的な架橋剤試薬は、本明細書で「例示的なリンカー」と題された節に記載される。タンパク質性部分および化学部分を含む２つの部分を連結するためにそのような架橋剤試薬を使用する方法は、当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、抗体および細胞傷害性剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製され得る。組換えＤＮＡ分子は、抗体をコードする領域と、コンジュゲートの細胞傷害性部分とを含んでいてもよく、互いに隣接しているか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されているかのいずれかである。
さらに別の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍の前標的化に利用するための「受容体」（ストレプトアビジンなど）にコンジュゲートされ得、抗体／抗体断片－受容体コンジュゲートは、患者に投与され、続いて、除去剤を使用して循環から未結合のコンジュゲートを除去し、次いで、細胞傷害性剤（例えば、薬物または放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされる「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
Ｃ．診断および検出のための方法および組成物
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片のいずれかは、生体試料中のＣＴＬＡ４の存在を検出するために使用され得る。本明細書で使用される「検出すること」という用語は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の実施形態では、生体試料は、乳房、膵臓、食道、肺および／または脳の細胞または組織などの細胞または組織を含む。
本発明のさらなる態様は、ＣＴＬＡ４発現レベルが身体内の少なくとも１つの位置で正常な生理学的レベルから増加または減少する癌または別の疾患を診断および／またはモニタリングするための、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、上に記載したように、当該技術分野で既知の蛍光分子、放射性分子、または任意の他の標識などの検出可能な分子または物質で標識され得る。例えば、本発明の抗体または抗体断片は、放射性分子で標識され得る。例えば、好適な放射性分子としては、限定されないが、123Ｉ、124Ｉ、111Ｉｎ、186Ｒｅ、および188Ｒｅなどのシンチグラフィー研究に使用される放射性原子が挙げられる。また、本発明の抗体または抗体断片は、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージングのためのスピン標識でも標識され得る。抗体の投与後、患者内の放射標識抗体の分布が検出される。任意の好適な既知の方法を使用することができる。一部の非限定的な例としては、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、蛍光、化学発光、および超音波撮影が挙げられる。
本発明の抗体または抗体断片は、ＣＴＬＡ４の過剰発現に関連する癌および疾患の診断および病期分類に有用であり得る。ＣＴＬＡ４の過剰発現に関連する癌としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫および神経線維腫症などの神経膠細胞腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、黒色腫、大腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌、肉腫、血液癌（白血病）、星状細胞腫、ならびに様々な種類の頭頸部癌、または他のＣＴＬＡ４を発現するもしくは過剰発現する過剰増殖性疾患を挙げることができる。
本発明の抗体または抗体断片は、ＣＴＬＡ４発現が増加または減少している癌以外の疾患の診断に有用であり得る。かかる診断には、可溶性または細胞性のＣＴＬＡ４形態の両方を使用することができる。典型的には、かかる診断方法は、患者から得られた生体試料の使用を伴う。生体試料は、診断またはモニタリングアッセイに使用され得る対象から得られた様々な試料タイプを包含する。生体試料としては、限定されないが、生物起源の血液および他の液体試料、生検標本またはそれに由来する組織培養物もしくは細胞などの固体組織試料、ならびにその子孫が挙げられる。例えば、生体試料には、ＣＴＬＡ４過剰発現に関連する癌の疑いがある個体から収集された組織試料から得られた細胞、ならびに好ましい実施形態では、神経膠腫、胃癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、および子宮内膜癌から得られた細胞が含まれる。生体試料は、臨床試料、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、および組織試料を包含する。
特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体を使用して、対象由来の細胞上のＣＴＬＡ４を検出することによって、対象におけるＣＴＬＡ４過剰発現に関連する癌を診断する方法である。特に、当該方法は、以下のステップ：
（ａ）抗体または抗体断片が、ＣＴＬＡ４を発現する生体試料中の細胞と複合体を形成するのに好適な条件下で、対象の生体試料を、本発明による抗体または抗体断片と接触させることと、
（ｂ）当該複合体を検出および／または定量することであって、当該複合体の検出が、ＣＴＬＡ４の過剰発現に関連する癌を示す、検出および／または定量することと、を含む。
癌の進行をモニタリングするために、本発明に従う方法は、試料への抗体結合が増加または減少するかどうかを判定するために、異なる時間に繰り返されてもよく、そこから、癌が進行、退行または安定化したかどうかを判定することができる。
特定の実施形態では、本発明は、ＣＴＬＡ４の発現もしくは過剰発現、またはＣＴＬＡ４の可溶性形態の減少もしくは増加に関連する疾患を診断する方法である。そのような疾患の例は、ヒト免疫障害、血栓性疾患（血栓症およびアテローム血栓症）、ならびに心血管疾患を含み得る。
一実施形態では、診断または検出の方法に使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片が提供される。さらなる態様では、生体試料中のＣＴＬＡ４の存在を検出する方法が提供される。さらなる態様では、生体試料中のＣＴＬＡ４の量を定量化する方法が提供される。特定の実施形態では、本方法は、ＣＴＬＡ４への抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片の結合を許容する条件下で、生体試料を、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片と接触させることと、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片とＣＴＬＡ４との間で複合体が形成されるかどうかを検出することと、を含む。かかる方法は、インビトロまたはインビボで実施してもよい。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、治療に適格な対象を選択するために使用される。一部の実施形態では、治療は、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、標識された抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片が提供される。標識としては、限定されないが、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色標識、電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識）、ならびに、間接的に（例えば、酵素反応または分子相互作用によって）検出される酵素またはリガンドなどの部分が挙げられる。例示的な標識としては、限定されないが、放射性同位体（32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、および131Ｉ）、またはフルオロフォア（希土類キレート、またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなど）、ルセリフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号））、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ならびにグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼなど）、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化するカップリングされた酵素（例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼ）、ビオチン／アビジン、バクテリファージ標識、安定なフリーラジカルなどが挙げられる。
Ｄ．医薬製剤
抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、細胞死滅活性を有する。この細胞死滅活性は、複数の異なる種類の細胞株に及ぶ。さらに、これらの抗体または抗体断片は、一旦細胞傷害性剤にコンジュゲートされると、腫瘍サイズを減少させることができ、低減された毒性を示し得る。したがって、抗ＣＴＬＡ４抗体、その断片または免疫コンジュゲートは、ＣＴＬＡ４の発現に関連する増殖性疾患の治療に有用であり得る。抗体、断片、または免疫コンジュゲートは、単独で、または任意の好適な薬剤もしくは他の従来の治療と組み合わせて使用することができる。
抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を使用して、ＣＴＬＡ４の発現、過剰発現または活性化に関連する疾患を治療し得る。ＣＴＬＡ４発現の要件以外で治療することができる癌または組織の種類には、特に制限はない。例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫および神経線維腫症などの神経膠細胞腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、黒色腫、大腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌、肉腫、血液癌（白血病）、星状細胞腫、ならびに様々な種類の頭頸部癌が挙げられる。より好ましい癌は、神経膠腫、胃癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、および子宮内膜癌である。
抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、自然免疫応答の潜在的な活性化因子であり、したがって敗血症などのヒト免疫疾患の治療に使用され得る。また、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、ワクチンなどの免疫のためのアジュバントとして使用され得、ならびに、例えば、細菌、ウイルスおよび寄生虫に対する抗感染剤として使用され得る。
抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を使用して、静脈血栓症および動脈血栓症ならびにアテローム血栓症などの血栓性疾患に対して保護、予防または治療することができる。抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、心血管疾患に対して保護、予防、または治療するために使用することができ、ならびにラッサウイルスおよびエボラウイルスなどのウイルスの侵入を予防または抑制し、ウイルス感染を治療するためにも使用することができる。
本明細書に記載の治療方法の実施形態の各々において、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗体断片、または抗ＣＴＬＡ４抗体もしくは抗体断片の免疫コンジュゲートは、治療が求められる疾患または障害の管理に関連する従来の方法と一致する様式で送達され得る。本明細書の開示に従い、有効量の抗体、抗体断片または免疫コンジュゲートは、かかる治療を必要とする対象に、疾患または障害を予防または治療するのに十分な時間および条件下で、投与される。したがって、本発明の一態様は、ＣＴＬＡ４の発現に関連する疾患を治療するための方法に関し、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明の抗体、抗体断片、または免疫コンジュゲートを投与することを含む。
投与の場合、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗体断片、または免疫コンジュゲートは、医薬組成物として製剤化され得る。抗ＣＴＬＡ４抗体、抗体断片、または免疫コンジュゲートを含む医薬組成物は、医薬組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化することができる。かかる方法では、治療分子は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む混合物、溶液、または組成物と組み合わせられる。
薬学的に許容される担体は、レシピエント患者によって許容され得る物質である。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の好適な薬学的に許容される担体は、当業者によく知られている（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）を参照されたい）。製剤は、１つ以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面でのタンパク質損失を防止するアルブミンなどをさらに含んでもよい。
医薬組成物の形態、投与経路、投与量、およびレジメンは、治療される状態、病気の重症度、患者の年齢、体重、および性別などに当然依存する。これらの考慮事項は、好適な医薬組成物を製剤化するために、当業者によって考慮され得る。本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または眼内投与などのために製剤化することができる。
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のために、薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張性滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）であってもよく、または乾燥（特に、凍結乾燥）組成物であってもよく、例えば、滅菌水もしくは生理食塩水の添加時に、注射可能な溶液の構成を可能にする。
一部の実施形態では、時に「安定剤」としても知られる等張化剤は、組成物中の液体の張性を調整または維持するために存在する。タンパク質および抗体などの大きな荷電性の生体分子とともに使用される場合、それらは、「安定剤」と称されることが多く、なぜなら、それらがアミノ酸側鎖の荷電基と相互作用することで、分子間相互作用および分子内相互作用の可能性を低下させることができるためである。等張化剤は、医薬組成物の０．１～２５重量％、好ましくは１～５重量％の任意の量で存在し得る。好ましい等張化剤としては、多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールなどの三価以上の糖アルコールが挙げられる。
さらなる賦形剤としては、以下のうちの１つ以上として機能し得る薬剤が挙げられる：（１）増量剤、（２）溶解促進剤、（３）安定剤、および（４）ならびに変性または容器壁への付着を防止する薬剤。かかる賦形剤としては、多価糖アルコール（上に列挙）、アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン）、有機糖または糖アルコール（例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール）、硫黄含有還元剤（例えば、ウレア、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム）、低分子量タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）、二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）、三糖（例えば、ラフィノース）ならびに多糖（例えば、デキストリンまたはデキストラン）が挙げられ得る。
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤の可溶化を助けるとともに、撹拌で誘導される凝集から治療タンパク質を保護するために使用することができ、これはまた、活性の治療タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、製剤が剪断表面の負荷に曝露されることを可能にする。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在してもよい。
好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用可能な陰イオン性洗剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる。陽イオン性洗剤としては、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
投与に使用される用量は、様々なパラメータの関数として、特に使用される投与様式の関数として、関連する病理の関数として、または代替的に所望の治療期間の関数として、適合される。医薬組成物を調製するために、有効量の抗体または抗体断片を、薬学的に許容される担体または水性培地中に溶解または分散させることができる。
注射用に適した剤形には、滅菌水溶液または分散液、ゴマ油、ピーナッツ油またはプロピレングリコール水溶液を含む製剤、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。すべての場合で、形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度の流体である必要がある。製造および保存の条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される必要がある。
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性な化合物の溶液は、界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することもできる。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含む。
抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、中性または塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が挙げられ、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）、またはそのような有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）で形成される。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄）、およびそのような有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン）などに由来し得る。
担体はまた、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤および抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、組成物中に、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用によってもたらすことができる。
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上に列挙されたもの以外の成分を１つ以上含む適切な溶媒に、必要量の活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、滅菌ビヒクルに様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製され、基本の分散媒と、上に列挙されたものから必要とされる他の成分と、を含む。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、予め濾過滅菌されたその溶液から、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を得る。
また、直接注射のために、より多くの溶液、またはより高い濃度の溶液の調製も企図され、溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用することで、非常に迅速な浸透がもたらされ、小さな腫瘍領域に高濃度の活性剤が送達されることが想定される。
製剤化の際、溶液は、投薬製剤と適合性のある様式で、かつ治療的に有効な量で投与される。製剤は、上に記載の注射用溶液の種類などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
水溶液での非経口投与の場合、必要に応じて、溶液を好適に緩衝し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする必要がある。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内の投与に特に好適である。この関連で、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に既知であろう。例えば、１回の投与量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下点滴溶液に添加されるか、または提案される注入部位に注入され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。投与量におけるいくつかの変形例は、治療される対象の状態に応じて必ず生じるであろう。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量を決定する。
抗体または抗体断片は、１回の用量あたり約０．０００１～１０．０ｍｇ、または約０．００１～５ｍｇ、または約０．００１～１ｍｇ、または約０．００１～０．１ｍｇ、または約０．１～１．０、またはさらに約１０ｍｇを送達するために、治療混合物内に製剤化されてもよい。選択された時間間隔で複数回投与することもできる。
静脈内注射または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、経口投与のための錠剤または他の固形物、徐放カプセル、ならびに現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
特定の実施形態では、抗体または抗体断片を宿主細胞に導入するために、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が企図される。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は、当業者に既知である。
ナノカプセルは、概して、安定した再現性のある方法で、化合物を捕捉することができる。細胞内ポリマーの過負荷による副作用を回避するために、このような超微細粒子（０．１μｍ前後のサイズ）は、一般に、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計される。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子は、本発明で使用されることが企図され、かかる粒子は容易に作製され得る。
リポソームは、水性媒体中に分散しており、多層同心円状二重層小胞（多層状小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ、ＭＬＶ）とも称される）を自発的に形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、概して、２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、コア内に水溶液を含む、直径が２００～５００Åの範囲の小さな単層小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を含む医薬製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有するかかる抗体または抗体断片を、１つ以上の任意選択的な薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量および濃度においてレシピエントに無毒であり、限定されないが、緩衝剤（リン酸、クエン酸、および他の有機酸など）、酸化防止剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムなど）、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾール）、低分子量ポリペプチド（約１０残基未満）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど）、単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体）、ならびに／または非イオン性界面活性剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が挙げられる。
本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号およびＷＯ２００６／０４４９０８に記載されているものが挙げられ、後者の製剤は、ヒスチジン－酢酸緩衝液を含んでいる。
本明細書の製剤はまた、必要に応じて、治療される特定の適応症に対して、２つ以上の活性成分を含んでもよい。好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的な活性を有する成分を単一の製剤に組み合わせてもよい。例えば、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体、抗体断片または免疫コンジュゲートに加えて、ＥＧＦＲアンタゴニスト（エルロチニブなど）、抗血管新生剤（ＶＥＧＦアンタゴニストなどで、抗ＶＥＧＦ抗体であり得る）、または化学療法剤（タキソイドまたは白金剤など）を提供することが望ましい場合がある。かかる活性成分は、意図された目的に効果的な量で、組み合わせて存在するのが好適である。
一実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体、抗体断片または免疫コンジュゲートは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＣＤ３、ＨＥＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＲＯＲ１、ＳＦＲＰ４、およびＷＮＴタンパク質（ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６を含む）から選択される抗原に対する別の抗体または抗体断片と製剤中に組み合わされる。組み合わせは、２つの別個の分子の形態であってもよく、すなわち、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体、抗体断片または免疫コンジュゲートと、別の抗体または抗体断片である。あるいは、組み合わせはまた、単一分子の形態であってもよく、ＣＴＬＡ４と他の抗原との両方に結合親和性を有し、したがって、多特異性（例えば、二重特異性）抗体を形成する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されるマイクロカプセルに封入されてもよい。例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルを使用してもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の好適な例としては、抗体または抗体断片を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、マトリックスは、成形品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルであり得る。
インビボ投与に使用される製剤は、一般に、無菌である。滅菌は、例えば、濾過滅菌膜を介した濾過によって容易に達成され得る。
Ｅ．治療方法および組成物
本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片のいずれかを、治療方法に使用することができる。一態様では、薬剤として使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片が提供される。さらなる態様では、癌（例えば、乳癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、脳癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、白血病、子宮内膜癌、結腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、肝臓癌、骨肉腫、および／または黒色腫）の治療に使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片が提供される。特定の実施形態では、治療方法に使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片が提供される。特定の実施形態では、本発明は、癌を有する個体を治療する方法において使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を提供し、有効量の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を個体に投与することを含む。特定の実施形態では、本発明は、有効量の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を個体に投与することを含む、免疫障害（例えば、自己免疫障害）、心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧、血栓症）、感染性疾患（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）または糖尿病を有する個体を治療する方法において使用するための、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を提供する。かかる一実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、以下に記載されるもの）を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、本発明は、血管新生、細胞増殖、免疫機能、炎症性サイトカインの分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージ由来）、腫瘍血管構造（例えば、腫瘍内血管構造または腫瘍関連血管構造）、および／または腫瘍間質機能を阻害するのに使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、個体において、血管新生、細胞増殖、免疫機能、炎症性サイトカインの分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージ由来）、腫瘍血管構造（例えば、腫瘍内血管構造または腫瘍関連血管構造）、および／または腫瘍間質機能を阻害する方法に使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を提供し、個体に有効量の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を投与して、血管新生、細胞増殖、免疫機能、炎症性サイトカインの分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージ由来）、腫瘍血管構造の発達（例えば、腫瘍内血管構造または腫瘍関連血管構造）、および／または腫瘍間質機能を阻害することを含む。上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、薬剤の製造または調製における抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片の使用を提供する。一実施形態では、薬剤は、癌（一部の実施形態では、乳癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、脳癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、白血病、子宮内膜癌、結腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、肝臓癌、骨肉腫、および／または黒色腫）の治療のための薬剤である。さらなる実施形態では、薬剤は、癌を有する個体に有効量の薬剤を投与することを含む、癌を治療する方法において使用するための薬剤である。さらなる実施形態では、薬剤は、個体に有効量の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を投与することを含む、免疫障害（例えば、自己免疫障害）、心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧、血栓症）、感染性疾患（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）または糖尿病を治療する方法において使用するための薬剤ある。かかる一実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、以下に記載されるもの）を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、薬剤は、血管新生、細胞増殖、免疫機能、炎症性サイトカインの分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージ由来）、腫瘍血管構造（例えば、腫瘍内血管構造または腫瘍関連血管構造）、および／または腫瘍間質機能を阻害するための薬剤である。さらなる実施形態では、薬剤は、個体において、血管新生、細胞増殖、免疫機能、炎症性サイトカインの分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージ由来）、腫瘍血管構造（例えば、腫瘍内血管構造または腫瘍関連血管構造）、および／または腫瘍間質機能を阻害する方法において使用するための薬剤であり、個体に有効量の薬剤を投与して、血管新生を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、免疫機能を促進すること、炎症性サイトカイン切片を誘導すること（例えば、腫瘍関連マクロファージ由来）、腫瘍血管構造の発達を阻害すること（例えば、腫瘍内血管構造または腫瘍関連血管構造）、および／または腫瘍間質機能を阻害することを含む。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。
さらなる態様では、本発明は、癌を治療するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、かかる癌を有する個体に、有効量の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を投与することを含む。かかる一実施形態では、本方法は、個体に有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、以下に記載されるもの）を投与することをさらに含む。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。
さらなる態様では、本発明は、免疫障害（例えば、自己免疫障害）、心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧、血栓症）、感染性疾患（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）、または糖尿病を治療するための方法を提供する。かかる一実施形態では、本方法は、個体に有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、以下に記載されるもの）を投与することをさらに含む。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。
さらなる態様では、本発明は、個体において、血管新生、細胞増殖、免疫機能、炎症性サイトカインの分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージ由来）、腫瘍血管構造（例えば、腫瘍内血管構造または腫瘍関連血管構造）、および／または腫瘍間質機能を阻害するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、個体に、有効量の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を投与して、血管新生を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、免疫機能を促進すること、炎症性サイトカインの切片を誘導すること（例えば、腫瘍関連マクロファージ由来）、腫瘍血管構造の発達を阻害すること（例えば、腫瘍内血管構造または腫瘍関連血管構造）、および／または腫瘍間質機能を阻害することを含む。一実施形態では、「個体」はヒトである。
さらなる態様では、本発明は、例えば、上記の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態では、医薬製剤は、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、医薬製剤は、例えば、以下に記載されるように、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片のいずれかと、少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
上に記載の各治療およびそれぞれの治療において、本発明の抗体または抗体断片は、単独で、免疫コンジュゲートとして、または治療中の他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与され得る。特定の実施形態では、追加の治療剤は、抗血管新生剤である。特定の実施形態では、追加の治療剤は、ＶＥＧＦアンタゴニスト（一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、ベバシズマブ）である。特定の実施形態では、追加の治療剤は、ＥＧＦＲアンタゴニスト（一部の実施形態では、エルロチニブ）である。特定の実施形態では、追加の治療剤は、化学療法剤および／または細胞分裂阻害剤である。特定の実施形態では、追加の治療剤は、タキソイド（例えば、パクリタキセル）および／または白金剤（例えば、カルボプラチナ）である。特定の実施形態では、追加の治療剤は、患者の免疫または免疫系を増強する薬剤である。
上記のかかる併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別個の製剤に含まれる）、ならびに個別投与を包含し、この場合、抗体または抗体断片の投与は、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与の前に、同時に、および／または後に生じ得る。抗体または抗体断片もまた、放射線療法と併用され得る。
抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化、投薬、および投与され得る。この文脈において考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医師に既知の他の要因が挙げられる。抗体または抗体断片は、必ずしも必要はないが、任意選択的に、当の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体または抗体断片の量、障害または治療の種類、および上で考察された他の要因に依存する。これらは、概して、本明細書に記載される同じ投与量および投与経路で、または本明細書に記載の投与量の約１～９９％で、または経験的／臨床的に適切であると判断された任意の投与量および任意の経路によって使用される。
疾患の予防または治療のために、抗体または抗体断片の適切な投与量（単独でまたは１つ以上の他の追加の治療薬と組み合わせて使用する場合）は、治療する疾患の種類、抗体または抗体断片の種類、疾患の重症度および経過、抗体または抗体断片が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴および抗体または抗体断片に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体または抗体断片は、患者に一度に、または一連の治療にわたって好適に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇの抗体または抗体断片／ｋｇ患者の体重～４０ｍｇの抗体または抗体断片／ｋｇ患者の体重は、例えば、１回以上の別個の投与によるか、または連続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための初回候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上述の要因に応じて、約１μｇの抗体または抗体断片／ｋｇ患者の体重～１００ｍｇの抗体または抗体断片／ｋｇ患者の体重以上の範囲であり得る。数日以上にわたる繰り返し投与の場合、状態に応じて、治療は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで一般に持続するであろう。かかる用量は、例えば、毎週または３週間毎に断続的に投与され得る（例えば、患者が約２～約２０回、または例えば、約６回の用量の抗体または抗体断片を受容する）。初回より高い負荷用量、続いて１回以上のより低い用量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンが有用な場合がある。この療法の進捗は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
対象の疾患の予防または治療のために投与され得る本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片の特定の投与量は、約０．３、０．６、１．２、１８、２．４、３．０、３．６、４．２、４．８、５．４、６．０、６．６、７．２、７．８、８．４、９．０、９．６、または１０．２ｍｇの抗体または抗体断片／ｋｇ患者の体重であり得る。特定の実施形態では、投与量は、０．３～２．４、２．４～４．２、４．２～６．０、６．０～７．８、７．８～１０．２、１０．２～１２、１２～１４、１４～１６、１６～１８、または１８～２０ｍｇ抗体または抗体断片／ｋｇ患者の体重の範囲であり得る。二重特異性抗体の形態で、別の免疫チェックポイント阻害剤もしくは別の抗体もしくは抗体断片と組み合わせて、または免疫コンジュゲートとして投与される場合、抗体または抗体断片の投与量は同じままである。さらに、抗ＣＴＬＡ４活性を有するポリペプチドは、抗体または抗体断片と同じ量で投与される。
本発明の医薬製剤の単回用量は、約４５μｇの抗体もしくは抗体断片、約１３，６００ｍｇからの約４５μｇの抗体もしくは抗体断片、または約５４４０ｍｇからの約４５μｇの抗体もしくは抗体断片、からの本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体もしくは抗体断片の量を含み得る。一部の実施形態では、本発明の医薬製剤の単回用量は、１３５ｍｇ～１，３８７ｍｇ、または１３５、２３５、３３５、４３５、５３５、６３５、７３５、８３５、９３５、１０３５、１１３５、１２３５、１３８７ｍｇなどの量の本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片を含んでもよい。特定の実施形態では、医薬製剤の単回用量における本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片の量は、１３５～２３５、２３５～３３５、３３５～４３５、４３５～５３５、５３５～６３５、６３５～７３５、７３５～８３５、８３５～９３５、９３５～１０３５、１０３５～１１３５、１１３５～１２３５、１２３５～１３８７ｍｇの範囲である。医薬製剤の単回用量における抗体または抗体断片の量は、二重特異性抗体の形態で、別の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、または免疫コンジュゲートとして、または本明細書に開示される別の抗原に対する別の抗体または抗体断片と組み合わせて投与される場合、同じままである。さらに、抗ＣＴＬＡ４活性を有するポリペプチドは、抗体または抗体断片と同じ量で、医薬製剤の単回用量に含まれるであろう。
一実施例では、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、別の免疫チェックポイント阻害剤分子にコンジュゲートされ得るか、または別の免疫チェックポイント阻害剤と二重特異性抗体の一部を形成し得る。
他の免疫チェックポイント阻害剤分子は、ＣＴＬＡ４以外の別の免疫チェックポイントに対する抗体または抗体断片であり得る。組み合わせは、本出願で開示される抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片、ならびに別個の分子としてまたは二重特異性抗体として投与される別の免疫チェックポイント阻害剤分子であり得る。かかる二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４への結合活性および別の免疫チェックポイントへの第２の結合活性を有する。
免疫チェックポイントは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＧＩＴＲ（Ｚａｈａｖｉ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖｏｌ．２０，１５８，２０１９）から選択され得る。さらなる免疫チェックポイントとしては、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＤＲ３、およびＩＣＯＳが挙げられる（Ｍａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｂｂａｃａｎ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂｃａｎ．２０１８．１２．００２，２０１８）。
免疫チェックポイントは、好ましくは、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１である。
上記の製剤または治療方法のいずれも、抗ＣＴＬＡ４抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の抗体断片または免疫コンジュゲートを使用して実施され得ることを理解されたい。
腫瘍と戦うために宿主の免疫機能を増強することは、関心が高まっている対象である。従来の方法としては、（ｉ）ＡＰＣの増強、例えば（ａ）外来のＭＨＣのアロ抗原をコードするＤＮＡを腫瘍に注入すること、または（ｂ）生検腫瘍細胞を、腫瘍の免疫抗原認識の確率を増加させる遺伝子でトランスフェクションすること（例えば、免疫刺激サイトカイン、ＧＭ－ＣＳＦ、共刺激分子Ｂ７．１、Ｂ７．２）、（ｉｉｉ）養子細胞免疫療法、または活性化腫瘍特異的Ｔ細胞による治療が挙げられる。養子細胞免疫療法は、腫瘍浸潤宿主Ｔリンパ球を単離すること、例えば、ＩＬ－２もしくは腫瘍またはその両方による刺激を通して、インビトロで集団を拡大することを含む。さらに、機能不全である単離されたＴ細胞は、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のインビトロ適用によっても活性化され得る。次いで、そのように活性化されたＴ細胞を、宿主に再投与してもよい。これらの方法のうちの１つ以上を、本発明の抗体、抗体断片、または免疫コンジュゲートの投与と組み合わせて使用することができる。
癌に対する伝統的な療法には、以下が含まれる：（ｉ）放射線療法（例えば、放射線療法、Ｘ線療法、照射）、または癌細胞を死滅させ、腫瘍を縮小させるための電離放射線の使用。放射線療法は、外部ビーム放射線療法（ＥＢＲＴ）を介して、または内部で近接照射療法を介して投与することができる、（ｉｉ）化学療法、または一般に急速に分裂細胞に影響を与える細胞傷害性薬の適用、（ｉｉｉ）標的療法、または癌細胞の調節解除されたタンパク質に特異的に影響を与える薬剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブ、ゲフィチニブ；モノクローナル抗体、光力学療法）、（ｉｖ）免疫療法、または宿主の免疫応答の増強（例えば、ワクチン）、（ｖ）ホルモン療法、またはホルモンの遮断（例えば、腫瘍がホルモン感受性である場合）、（ｖｉ）血管新生阻害剤、または血管の形成および成長の遮断、ならびに（ｖｉｉ）緩和ケア、または疼痛、悪心、嘔吐、下痢および出血を低減するためのケアの質を改善することを対象とした治療。モルヒネおよびオキシコドンなどの鎮痛薬、オンダンセトロンおよびアプレピタントなどの制吐剤は、より積極的な治療レジメンを可能にすることができる。
癌の治療において、癌免疫の治療のための前述の従来の治療のうちのいずれかは、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片の投与の前に、後に、または同時に行われ得る。加えて、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片は、腫瘍結合抗体（例えば、モノクローナル抗体、毒素コンジュゲートモノクローナル抗体）の投与および／または化学療法剤の投与などの従来の癌治療の前に、後に、または同時に投与され得る。
Ｆ．製品およびキット
本発明の別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片と、上に記載の障害の治療、予防、および／または診断に有用な他の材料とを含む製品が提供される。製品は、容器と、容器にまたは容器と関連付けられたラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静脈内輸液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、組成物を、それ自体で、あるいは状態の治療、予防、および／または診断に有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内輸液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体または抗体断片である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）第１の容器（組成物がその中に含まれ、組成物が抗体または抗体断片を含む）、および（ｂ）第２の容器（組成物がその中に含まれ、組成物がさらなる細胞傷害性剤またはそれ以外の治療剤を含む）を含んでいてもよい。本発明のこの実施形態における製品は、組成物を使用して特定の状態を治療することができることを示す添付文書をさらに含んでもよい。代替的または追加的に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
上記の製品のいずれも、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫コンジュゲートを含み得ることを理解されたい。
最後に、本発明はまた、少なくとも１つの本発明の抗体または抗体断片を含むキットを提供する。本発明のポリペプチド、抗体もしくは抗体断片、または抗体薬物コンジュゲートを含むキットは、ＣＴＬＡ４発現（増加もしくは減少）の検出、または治療もしくは診断アッセイに有用である。本発明のキットは、固体支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされた抗体を含み得る。ＣＴＬＡ４をインビトロで検出および定量（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）するための抗体を含むキットを提供することができる。検出に有用なかかる抗体は、蛍光標識または放射標識などの標識とともに提供され得る。
キットは、それらの使用に関する説明書をさらに含む。一部の実施形態では、説明書は、インビトロ診断キットに関して、米国食品医薬品局によって要求される説明書を含む。一部の実施形態では、キットは、試料中のＣＴＬＡ４の有無に基づいて、試料中の脳脊髄液の有無を診断するための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは１つ以上の抗体または抗体断片を含む。他の実施形態では、キットは、１つ以上の酵素、酵素阻害剤または酵素活性化剤をさらに含む。さらに他の実施形態では、キットは、１つ以上のクロマトグラフィー化合物をさらに含む。さらに他の実施形態では、キットは、分光学的アッセイ用に試料を調製するために使用される１つ以上の化合物をさらに含む。さらなる実施形態では、キットは、インジケータの強度、色スペクトル、または他の物理的属性に従って、ＣＴＬＡ４の有無を解釈するための比較参照材料をさらに含む。
以下の実施例は、本開示の軟ゼラチンカプセルの例示であるが、これに限定されない。当該技術分野で通常遭遇し、かつ当業者には明らかである様々な条件およびパラメータの他の好適な修正および適合は、本開示の範囲内である。
実施例１：ＣＴＬＡ４に対する条件的に活性な生物学的（ＣＡＢ）抗体
この実施例では、ＣＴＬＡ４に対する抗体が産生された（表２）。
Figure 2022513384000018
これらの抗ＣＴＬＡ４抗体をさらに特徴付けた。抗体ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２のデータを本出願に提示する。
実施例２：抗ＣＴＬＡ４抗体の結合活性についてのＥＬＩＳＡアッセイ
固定化された組換えヒトＣＴＬＡ４へのＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性を、ｐＨ６．０の緩衝液（腫瘍微小環境のｐＨ）またはｐＨ７．４の緩衝液（正常な生理学的ｐＨ）において、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定した。段階希釈したＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２を、ウェルに固定化された組換えヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインに結合させた。結合したＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の量を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して定量し、次いで３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）比色基質と反応させて、着色生成物を生成した。各ウェルにおけるＯＤ吸光度は、結合したＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の量に比例した。ヒトＣＴＬＡ４への結合についてのｐＨ６．０におけるＥＣ50値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３の非線形適合モデル（可変スロープ、４パラメータ）を使用して計算した。
表３－４に、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４におけるヒトＣＴＬＡ４へのＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性のＥＣ50値を示し、図３Ａ～３Ｂに、代表的な実験の結合曲線を示す。ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の両方は、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体と比較して、ヒトＣＴＬＡ４に対して、ｐＨ６．０では同様の結合活性を示し、ｐＨ７．４では著しく低下した結合活性を示した。
Figure 2022513384000019
Figure 2022513384000020
加えて、固定化された組換えカニクイザルＣＴＬＡ４細胞外ドメインへのＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性も、ＥＬＩＳＡによって決定した。表５に、ｐＨ６．０におけるカニクイザルＣＴＬＡ４へのＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性のＥＣ50を示す。図４Ａ～４Ｂに、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４におけるカニクイザルＣＴＬＡ４へのＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性を示す。
Figure 2022513384000021
ＥＬＩＳＡによって測定された腫瘍微小環境のｐＨ６．０におけるＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性のＥＣ50は、ヒトＣＴＬＡ４に対して、それぞれ８．１８ｎｇ／ｍＬおよび９．７８ｎｇ／ｍＬであることが見出され、イピリウマブおよびイピリムマブ類似体について決定されたＥＣ50と同様であった。ＢＡ－０８７－０５－１９は、ｐＨ６．０において、ヒトＣＴＬＡ４およびカニクイザルＣＴＬＡ４の両方に同様の結合活性を有するが、ＢＡ－０８７－０８－３２は、ｐＨ６．０において、ヒトＣＴＬＡ４への結合活性と比較して、カニクイザルＣＴＬＡ４への結合活性が低下している。ＥＬＩＳＡに見られるｐＨ６．０でのカニクイザルＣＴＬＡ４へのＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性の低下は、ＳＰＲまたはＦＡＣＳのいずれを使用しても同じ低下が観察されなかったため、ＥＬＩＳＡアッセイに特異的であるように見える。ＥＬＩＳＡによって測定された正常生理学的ｐＨ７．４におけるヒトＣＴＬＡ４またはカニクイザルＣＴＬＡ４へのＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性は、ｐＨ６．０における結合活性よりも有意に低かった。
実施例３：抗ＣＴＬＡ４抗体のｐＨ依存的な結合活性
ＣＴＬＡ４への抗体の結合活性を、５．０～７．４のｐＨの範囲において、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して試験した。組換えヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインを、ｐＨ緩衝液（ｐＨ５．０～ｐＨ７．４）の範囲でウェルに固定化して、腫瘍微小環境のｐＨ（ｐＨ５．５～ｐＨ６．７）および正常な生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）を模倣し、ＥＬＩＳＡを使用して結合活性を測定した。抗体ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２を段階希釈し、組換えヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインへのそれらの結合活性を測定した。結合した抗体ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の量を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して定量し、次いで、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）比色基質と反応させて着色生成物を生成した。各ウェルにおけるＯＤ吸光度は、結合したＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の量に比例した。
ＢＡ－０８７－０５－１９のｐＨ変曲点（＝ｐＨ６．０における結合活性の５０％）は、ｐＨ６．９７であると計算され、ｐＨ６．６６では、９０％の結合活性が存在した。ＢＡ－０８７－０８－３２のｐＨ変曲点（＝ｐＨ６．０における結合活性の５０％）は、ｐＨ６．４３であると計算され、ｐＨ６．２では、９０％の結合活性が存在した。
異なるｐＨにおける平均ＯＤ値（２つの反復から）を、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して緩衝液のｐＨに対してプロットした。曲線適合は、ソフトウェアに組み込まれた４パラメータモデルを使用して行った。ｐＨ曲線の変曲点（＝ｐＨ６．０における結合活性の５０％）は、適合方程式のパラメータＣに等しい。ｐＨ６．０における結合活性を１００％に設定した。９０％の結合活性に対するｐＨは、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェアの「ＩｎｔｅｒｐＸ」関数を使用して、適合された曲線から補間した。
ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の５０％活性および９０％活性に対する平均ｐＨを、実験１～４で得られたｐＨ値を使用して計算した。実験１～４では、ＢＡ－０８７－０５－１９（ロット番号＃６９７２）およびＢＡ－０８７－０８－３２（ロット番号＃６９７８）を使用した。実験５では、他のロットのＢＡ－０８７－０５－１９（ロット番号＃６９０１）およびＢＡ－０８７－０８－３２（ロット番号＃６９０２）を使用した。実験５のデータから決定されたＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の５０％活性および９０％活性に対するｐＨは、実験１～４のｐＨ値を使用して計算された平均ｐＨ値と同様であった。表６を参照。
Figure 2022513384000022
図５に、様々なｐＨ緩衝液における組換えヒトＣＴＬＡ４へのＢＡ－０８７－０５－０１９およびＢＡ－０８７－０８－３２、ならびに陽性対照のイピリムマブおよびイピリムマブ類似体の結合活性を示す。ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２についてのｐＨ依存的結合の変曲点は、それぞれｐＨ６．９７およびｐＨ６．４３であると計算された。ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２についての９０％の結合活性は、それぞれｐＨ６．３４およびｐＨ６．２に存在した。加えて、正常な生理学的ｐＨの７．４では、ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の両方についてより弱い結合活性が検出された（図５）。
実施例４：抗ＣＴＬＡ４抗体の結合動態
抗体ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合動態を、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４における固定化された組換えヒトＣＴＬＡ４またはカニクイザルＣＴＬＡ４上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定した。ＣＴＬＡ４細胞外ドメイン（ヒトまたはカニクイザル）を、センサチップの表面に固定化した。異なる濃度のＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２を注入し、固定化されたＣＴＬＡ４および対照の表面との結合相互作用をリアルタイムでモニタリングした。結合動態を、分析ソフトウェアに組み込まれた１：１のＬｏｎｇｍｕｉｒモデルを使用して計算した。
抗体ＢＡ－０８７－０５－１９は、ｐＨ６．０において、サブナノモル濃度の結合活性を示した。結合活性は、ｐＨ６．０からｐＨ７．４まで約２倍低下する（ＫD［ｐＨ６．０］＝０．５ｎＭ、ＫD［ｐＨ７．４］＝１．１ｎＭ）。ｐＨ７．４でのより低い結合活性に加えて、ｐＨ７．４でのＳＰＲシグナルは、ｐＨ６．０で検出されたシグナルレベルの約２０％にしか達せず、ｐＨ７．４では、存在したＢＡ－０８７－０５－１９のわずかな部分のみが、ヒトＣＴＬＡ４に結合することができたことを示す。表７を参照。
Figure 2022513384000023
また、ＢＡ－０８７－０８－３２は、ｐＨ６．０において、サブナノモル濃度の結合活性を示した。結合活性は、ｐＨ６．０からｐＨ７．４まで約１００倍低下する（ＫD［ｐＨ６．０］＝０．４５ｎＭ、ＫD［ｐＨ７．４］＝４５ｎＭ）。ｐＨ７．４でのより低い結合活性に加えて、ｐＨ７．４でのＳＰＲシグナルは、ｐＨ６．０でのシグナルレベルの約１０％にしか達しないことは、存在するごく一部のＢＡ－０８７－０８－３２のみが、ｐＨ７．４でヒトＣＴＬＡ４に結合できることを示す。表８を参照。
Figure 2022513384000024
市販の抗ＣＴＬＡ４抗体イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））を同じ条件下で対照として使用し、結合活性は、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４において、非常に類似していることが見出された（ＫD［ｐＨ６．０］＝１．３９ｎＭ、ＫD［ｐＨ７．４］＝１．３７ｎＭ）。したがって、イピリムマブの結合活性はｐＨに依存しなかった。表９を参照。また、得られたＳＰＲシグナルはまた、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で非常に類似している。
Figure 2022513384000025
カニクイザルＣＴＬＡ４への抗体ＢＡ－０８７－０５－１９、ＢＡ－０８７－０８－３２、およびイピリムマブの結合活性を、ヒトＣＴＬＡ４について、上に記載の条件と同じ条件を使用して試験した。３つ全ての抗体は、速いｏｆｆ速度を有し、ＳＰＲシグナルは、試験した全ての抗体濃度で平衡に達する。ＫDを、抗体濃度に対する各濃度における最大ＳＰＲシグナルをプロットすることによって計算した。各ｐＨで、実験を３回行った。
抗体ＢＡ－０８７－０５－１９は、ｐＨ６．０において、１．９６ｎＭのＫDでカニクイザルＣＴＬＡ４に結合する。ｐＨ７．４では、計算値は、ＫD＞１００ｎＭを示す。抗体ＢＡ－０８７－０８－３２は、ｐＨ６．０において、５．９５ｎＭのＫDでカニクイザルＣＴＬＡ４に結合する。ｐＨ７．４では、得られたＳＰＲシグナルは、ＫDを計算するには低すぎる。抗体イピリムマブは、ｐＨ６．０では６．５８ｎＭのＫD、およびｐＨ７．４では６．８０ｎＭのＫDでカニクイザルＣＴＬＡ４に結合する。
実施例５：抗ＣＴＬＡ４抗体のＦＡＣＳ解析
ｐＨ６．０の緩衝液またはｐＨ７．４の緩衝液における、ＣＨＯ細胞の細胞表面に発現されたヒトＣＴＬＡ４およびカニクイザルＣＴＬＡ４への抗体ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性をＦＡＣＳによって測定した。段階希釈されたＢＡ－０８７－０５－１９、ＢＡ－０８７－０８－３２、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体を、ヒトＣＴＬＡ４またはカニクイザルＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ細胞に添加した。細胞上に結合した抗体の量を、フルオロフォアにコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して定量した。細胞への結合についてのｐＨ６．０および７．４におけるＥＣ50値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０３）に組み込まれた非線形適合（可変スロープ、４パラメータ）モデルを使用して計算した。ＣＨＯ細胞の表面上のヒトＣＴＬＡ４またはカニクイザルＣＴＬＡ４の発現レベルを、ＢＤ ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ（商標）ＰＥキットを使用して決定した。
細胞株の各々を使用して、各抗体について、少なくとも２つの独立した重複ＦＡＣＳ実験を行った。図６Ａ～６Ｂに、ｐＨ６．０および７．４におけるＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈｕＣＴＬＡ４）上のヒトＣＴＬＡ４への抗体の結合活性を示す。図７Ａ～７Ｂに、ｐＨ６．０および７．４におけるＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｃｙｎｏＣＴＬＡ４）上のカニクイザルＣＴＬＡ４への抗体の結合活性を示す。これらの図には、異なる濃度の抗体における結合活性がプロットされている。
ＦＡＣによって測定されたｐＨ６．０におけるＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性は、ヒトＣＴＬＡ４について、それぞれ３５０．１および２４３．４ｎｇ／ｍＬ、ならびにカニクイザルＣＴＬＡ４について、それぞれ３１６．２および４０２．６ｎｇ／ｍＬの平均ＥＣ50を有することが見出された。ＦＡＣによって測定されたｐＨ６．０におけるイピリムマブおよびイピリムマブ類似体の結合活性は、ヒトＣＴＬＡ４について、それぞれ３４１．１ｎｇ／ｍＬおよび３２５．４ｎｇ／ｍＬ、カニクイザルＣＴＬＡ４について、それぞれ３３７．５ｎｇ／ｍＬおよび３１９．６ｎｇ／ｍＬの平均ＥＣ50を有することが見出された。試験された最高濃度でも、ｐＨ７．４におけるＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性は、ｐＨ６．０における結合活性よりも弱かった。
ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の両方は、ｐＨ６．０において、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体と同様の親和性で、ヒトＣＴＬＡ４およびカニクイザルＣＴＬＡ４に結合する。しかしながら、ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２は、それぞれ、ｐＨ７．４におけるイピリムマブおよびイピリムマブ類似体の結合活性と比較して、ｐＨ７．４におけるヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ４への結合活性がはるかに弱い。ＣＴＬＡ４を発現しなかったＣＨＯ細胞については、結合活性が検出されなかった。
最後に、ｐＨ７．４において、ヒトＣＴＬＡ４またはカニクイザルＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ細胞上の抗体の飽和度も、ＦＡＣＳによって測定した（図８Ａ～８Ｂ）。ｐＨ７．４では、抗体ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２は、対照のイピリムマブ類似体の場合よりも、ＣＨＯ細胞上への結合が少なかった。
実施例６：抗ＣＴＬＡ４抗体安定性のＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析
異なる緩衝液を使用して、緩衝液中ｐＨ６．０、および緩衝液中ｐＨ７．４における、ヒトＣＴＬＡ４への抗体ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の結合活性を測定した。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析の両方を使用して、結合活性を測定した。ＥＬＩＳＡ分析では、段階希釈されたＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２試料を、ヒトＣＴＬＡ４で事前にコーティングされた、それぞれの緩衝液のウェルに添加した。結合した抗体の量を、ＨＲＰにコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して定量した。各測定における４５０ｎｍでの吸光度は、結合した抗体の量に比例した。図９Ａ～９ＦのＥＬＩＳＡデータを参照されたい。ヒトＣＴＬＡ４への結合のＥＣ50値（ｎｇ／ｍＬ）を、Ｐｒｉｓｍ可変勾配の４パラメータ用量応答曲線を用いた抗体濃度に対する４５０ｎｍでの吸光度によって決定し、それは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０３）に組み込まれた非線形適合（可変勾配、４つのパラメータ）モデルを使用して計算された。表１０～１１に、異なる緩衝液中でＥＬＩＳＡによって測定されたヒトＣＴＬＡ４への結合のＥＣ50値を示す。試験された緩衝液には、Ｈｉｓ緩衝液（Ｈｉｓ）、Ｔｒｉｓ緩衝液（Ｔｒｉｓ）、グルタミン緩衝液（Ｇｌｕ）、および緩衝液なし、が含まれた。
Figure 2022513384000026
Figure 2022513384000027
ＦＡＣＳ解析では、段階希釈されたＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２試料を、ヒトＣＴＬＡ４を発現する細胞に添加した。結合した抗体の量を、フルオロフォアにコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して定量した。各反応におけるＭＦＩは、結合した抗体の量に比例した。ＦＡＣＳによって測定された結合活性を、図１０Ａ～１０Ｆに示す。細胞上のヒトＣＴＬＡ４への結合に対するＥＣ50値（ｎｇ／ｍＬ）を、Ｐｒｉｓｍ可変勾配の４パラメータ用量応答曲線を用いた抗体濃度に対するシングレット集団のＭＦＩによって決定し、それは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０３）に組み込まれた非線形適合（可変勾配、４つのパラメータ）モデルを使用して計算された。ＣＨＯ細胞上のヒトＣＴＬＡ４への結合についてのＥＣ50値を、表１２～１３に示す。
Figure 2022513384000028
Figure 2022513384000029
実施例７：ＢＡ－０８７－０５－１９のインシリコ免疫原性分析
本研究は、ＥｐｉＶａｘインシリコ免疫原性スクリーニングツールキットを使用して、ＢＡ－０８７－０５－１９の潜在的な免疫原性を決定した。ソフトウェアは、ウェブベースの対話型スクリーニングおよびタンパク質再設計インターフェースであるＩＳＰＲＩを介してアクセスした。ＢＡ－０８７－０５－１９可変ドメインを入力として使用して、ソフトウェアを使用して、潜在的な免疫原性を正規化されたスケールで評価し、潜在的なＡＤＡ応答を予測した。
ＢＡ－０８７－０５－１９の潜在的な免疫原性を分析し、正規化されたスケールで既知の抗体と比較した。データは、ＢＡ－０８７－０５－１９が、トレジトープ調整ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアが２７．７０、および予測されるＴ依存性抗体応答が１．２９％を有することを示す。この予測された低免疫原性は、最適な抗体の群に該当する（低エフェクターおよび高トレジトープ含有量を有する）。
実施例８：抗ＣＴＬＡ４抗体による増強されたＩＬ－２分泌の機能アッセイ
この実施例において、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によって刺激されたヒトリンパ球によるＩＬ－２の分泌の誘導における抗体ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の機能活性を決定した。段階希釈されたＢＡ－０８７－０５－１９、ＢＡ－０８７－０８－３２、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体を、ＳＥＢで刺激された正常な健康なドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に添加した。抗体がＳＥＢで刺激されたヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－２の分泌を増強する能力を、ＩＬ－２ＥＬＩＳＡキットを使用して定量した。
合計３回の独立した実験を行った。図１１Ａに示されるように、ＳＥＢ刺激末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養において、ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の添加は、ｐＨ６．２におけるイピリムマブおよびイピリムマブ類似体で観察されるレベルでのアイソタイプ対照の添加により観察されるレベルよりも、ＩＬ－２産生を増強した。一方、図１１Ｂに示されるように、ＩＬ－２の産生は、ｐＨ７．４におけるＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の添加とともに増加しなかった。
１０μｇ／ｍＬの濃度では、ｐＨ６．２におけるアイソタイプ対照と比較して、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体で観察される増加と同様に、ＢＡ－０８７－０５－１９は、平均１．４倍の増加を促進し、ＢＡ－０８７－０８－０３２は、ＩＬ－２産生の平均１．５倍の増加を促進した。これらの結果は、ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の機能活性が、ｐＨ６．２でイピリムマブおよびイピリムマブ類似体で観察される活性と同等であることを示す。
実施例９：抗ＣＴＬＡ４抗体についてのＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）ＣＴＬＡ４遮断アッセイ
ヒトＣＴＬＡ４とそのリガンド（ＣＤ８０ｎａｄＣＤ８７）との間の相互作用の遮断における抗体ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の活性を、インビトロＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）ＣＴＬＡ４遮断アッセイを使用することによって決定した。段階希釈されたたＢＡ－０８７－０５－１９、ＢＡ－０８７－０８－３２、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体を、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞に添加した後、ベンダーのプロトコルに従ってａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞を添加した。ＣＴＬＡ４とそのリガンドとの間の相互作用の遮断は、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞で改変されたＩＬ－２経路の活性化をもたらし、これをＢｉｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイキットを使用して定量した。
図１２Ａに示されるように、結果は、ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２が、ｐＨ６．０においてイピリムマブおよびイピリムマブ類似体で観察された同様のレベルで、ＣＴＬＡ４とそのリガンド（ＣＤ８０／ＣＤ８７）との間の相互作用を遮断することができることを示した。対照的に、図１２Ｂに示されるように、ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２は、ｐＨ７．４でＣＴＬＡ４とそのリガンドとの相互作用を妨害するのにあまり有効ではなかった。これらの結果は、ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２のインビトロ機能活性が、ｐＨ６．０におけるイピリムマブおよびイピリムマブ類似体で観察される活性と同等であり、ｐＨ７．４における遮断時では、イピリムマブおよびイピリムマブの活性よりも著しく低いことを示す。
実施例１０：抗ＣＴＬＡ４抗体によるリガンド遮断のためのＦＡＣＳアッセイ
ヒトＣＴＬＡ４とそのリガンドｈＢ７－１（ｈＣＤ８０）およびｈＢ７－２（ｈＣＤ８６）との相互作用を阻害するためのＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の活性を、ＦＡＣＳによってアッセイし、異なる濃度のｈＢ７－１およびｈＢ７－２の存在下、ヒトＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ細胞へのＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の固定濃度での競合的結合を評価した。ＣＨＯ－ｈｕＣＴＬＡ４細胞に結合したＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の量を、フルオロフォアにコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて定量した。図１３Ａ～図１３Ｂに示されるように、各反応における平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＣＨＯ－ｈｕＣＴＬＡ４に結合したＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の量に比例した。
加えて、ＦＡＣＳ分析を使用して、ｈＢ７－１およびｈＢ７－２の固定濃度で、ヒトＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ細胞への段階希釈されたＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２の競合的結合を決定した。ＣＨＯ－ｈｕＣＴＬＡ４細胞に結合したｈＢ７－１およびｈＢ７－２の量を、抗Ｈｉｓ抗体およびフルオロフォアにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体を使用して定量した。各反応におけるＭＦＩは、ＣＨＯ－ｈｕＣＴＬＡ４に結合したｈＢ７－１およびｈＢ７－２の量に比例した。データは、ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２が、ｈｕＣＴＬＡ４とそのリガンドのｈＢ７－１およびｈＢ７－２との相互作用を、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体によって達成されるレベルと同様のレベルで遮断することを示した（図１４Ａ～１４Ｂ）。
データは、ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２が、ヒトＣＴＬＡ４とそのリガンドのｈＢ７－１（ｈＣＤ８０）およびｈＢ７－２（ｈＣＤ８６）との間の相互作用を、イピリムマブおよびイピリムマブ類似体のように効率的に遮断できることを示す。ＢＡ－０８７－０５－１９およびＢＡ－０８７－０８－３２は、ｐＨ７．４における結合が非常に限られているため、ｐＨ６．０でのみ競合的ＦＡＣＳ解析を行った。
実施例で使用される方法
ＥＬＩＳＡアッセイを、以下のプロトコルを使用して行った：
１）ＥＬＩＳＡプレートを、１００μＬの炭酸－重炭酸コーティング緩衝液中の０．５μｇ／ｍＬ（０６＿２０＿１７および０６＿２８＿１７実験）または１μｇ／ｍＬ（０７＿０６＿１７および０７＿１１＿１７実験）の組換えＣＴＬＡ４抗原でコーティングする。
２）シーリングフィルムでプレートを覆い、４℃で一晩インキュベートする。
３）プレートをデカントし、重ねたペーパータオルに軽く叩いて残った液体を除く。
４）試料マップに従って、２００μＬの様々なｐＨインキュベーション緩衝液をウェルに分注することによって、ウェルを２回洗浄し、内容物を完全に吸引する。
５）試料マップに従って、２００μＬの様々なｐＨインキュベーション緩衝液をウェルに添加する。プレートをシーリングフィルムで覆い、室温で６０分間、プレートシェーカー（２００ｒｐｍに設定）に置く。
６）プレートをデカントし、重ねたペーパータオルに軽く叩いて残った液体を除く。
７）様々なｐＨインキュベーション緩衝液中の試験物質を２５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬに段階希釈する。
８）１００μＬ／ウェルの希釈された試験物質を、試料マップに従ってプレートに添加する。
９）プレートをシーリングフィルムで覆い、室温で６０分間、プレートシェーカー（２００ｒｐｍに設定）に置く。
１０）プレートをデカントし、重ねたペーパータオルに軽く叩いて残った液体を除く。
１１）試料マップに従って、２００μＬの様々なｐＨ洗浄緩衝液をウェルに分注し、内容物を完全に吸引することによって、ウェルを３回洗浄する。
１２）様々なｐＨインキュベーション緩衝液中でＨＲＰ二次抗体を１：２５００に希釈する
１３）試料マップに従って、様々なｐＨインキュベーション緩衝液中で希釈された１００μＬのＨＲＰ二次抗体を、各ウェルに添加する。
１４）プレートをシーリングフィルムで覆い、室温で６０分間、プレートシェーカー（２００ｒｐｍに設定）に置く。
１５）プレートをデカントし、重ねたペーパータオルに軽く叩いて残った液体を除く。
１６）試料マップに従って、２００μＬの様々なｐＨ洗浄緩衝液をウェルに分注し、内容物を完全に吸引することによって、ウェルを３回洗浄する。
１７）ウェルあたり５０μＬのＴＭＢ基質溶液を、プレートのすべてのウェルに分注する。室温で３分間インキュベートする。
１８）ウェルあたり５０μＬの１ＮのＨＣｌを、プレートのすべてのウェルに添加する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでプレートを読み取る。
１９）ＯＤ４５０ｎｍの生データを測定する。
２０）Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、異なるｐＨにおける平均ＯＤ値（２つの反復から）を、緩衝液のｐＨに対してプロットした。曲線適合は、ソフトウェアに組み込まれた４パラメータモデルを使用して行った。ｐＨ曲線の変曲点（５０％の結合活性）は、適合方程式のパラメータＣに等しい。ｐＨ６．０における結合活性を１００％に設定した。９０％の結合活性に対するｐＨは、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェアの「ＩｎｔｅｒｐＸ」関数を使用して、適合された曲線から補間した。
以下のプロトコルを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを行った：
ＳＰＲ２／４機器、ＳＰＲ親和性センサー（Ａｍｉｎｅ Ｆｌａｔ）、および固定化緩衝液キットは、Ｓｉｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓによって製造さている。ＳＰＲセンサーには４つのフローセル（ＦＣ１－ＦＣ４）があり、それぞれ個別に、またはグループで対処することができる。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを、ＦＣ２およびＦＣ４に固定化し、一方、ＢＳＡを、ＦＣ１およびＦＣ３（対照表面）に固定化した。
ベンダーが推奨するプロトコルに従って、固定化を行った。
（１）活性化剤は、注入の直前に２００ｍＭのＥＤＣと５０ｍＭのＮＨＳ（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）を混合することによって調製した。アミンセンサーチップを、２５μＬ／分の流量で４８０秒間、混合物で活性化した。
（２）１０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．０）中の２５μｇ／ｍＬのヒトＣＴＬＡ４を、それぞれＦＣ２およびＦＣ４に、２５μＬ／分の流量で４８０秒間注入した。チップ表面を、１Ｍのエタノールアミン－ＨＣｌ（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）を、２５μＬ／分の流量で４８０秒間、ＦＣ１～４を通して非活性化した。
（３）同じ条件を使用して、しかし、タンパク質を注入せずに、対照表面を活性化および非活性化した。
（４）分析物を注入する前に、泳動用緩衝液を、必要なｐＨでＰＢＳＴに切り替えた。第１の分析物を注入する前に、測定器を泳動用緩衝液で１時間平衡化した。
（５）全ての分析物の注入は、２５μＬ／分、２５℃で行った。
ＢＡ－０８７－０５－１９を、泳動用緩衝液（ＰＢＳＴ緩衝液、ｐＨ６．０または７．４）中、５μｇ／ｍＬ（３４．２５ｎＭ）、２μｇ／ｍＬ（１３．７０ｎＭ）、１μｇ／ｍＬ（６．８５ｎＭ）、０．５μｇ／ｍＬ（３．４２ｎＭ）、０．２μｇ／ｍＬ（１．３７ｎＭ）、および０μｇ／ｍＬ（０．０ｎＭ）に希釈した。ＢＡ－０８７－０８－３２を、泳動用緩衝液（ＰＢＳＴ緩衝液、ｐＨ６．０または７．４）中、５μｇ／ｍＬ（３４．２５ｎＭ）、２μｇ／ｍＬ（１３．７０ｎＭ）、１μｇ／ｍＬ（６．８５ｎＭ）、０．５μｇ／ｍＬ（３．４２ｎＭ）、０．２μｇ／ｍＬ（１．３７ｎＭ）、および０μｇ／ｍＬ（０．０ｎＭ）に希釈した。
１００μＬの希釈された分析物ＢＡ－０８７－０５－１９またはＢＡ－０８７－０８－３２を、フローセル１および２（または３および４）上に、２５μＬ／分の流量で、２４０秒間の会合期に注入し、その後、３６０秒間の解離期が続いた。分析物の濃度を上昇させながら、分析物の泳動を６サイクル繰り返す。相互作用分析の各サイクル後、６μＬの１０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．０）を注入することによって、チップ表面を再生した。同じｐＨで、各セットを合計３回泳動した。
固定化タンパク質を含まないフローセル１（または３）を、参照減算用の対照表面として使用した。さらに、緩衝液のみを分析物（０ｎＭの分析物）として有するデータを、各泳動から減算した。提供された分析ソフトウェアＡｎａｌｙｚｅｒ Ｒ２（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）を用いて、１：１の結合モデルを使用して、二重に減算されたデータを適合させた。１４６ｋＤａの分子量を使用して、分析物のモル濃度を計算した。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイを、以下のプロトコルを使用して実行した。
ヒトＣＴＬＡ４またはカニクイザルＣＴＬＡ４の表面発現を決定するための細胞染色
１）ベンダーの説明書に従って、Ｔ－７５フラスコおよび培養液に３×１０6個の細胞を播種する。
２）ＦＡＣＳ分析当日、培養培地を除去し、廃棄する。
３）細胞層をＰＢＳ溶液で簡単にすすぐ。
４）Ｔ－７５フラスコの各々に１．５ｍＬのＤｅｔａｃｈｉｎ溶液を添加する。細胞層が分散するまで待つ。
５）対応する細胞株に４．５ｍＬの培養培地を添加し、穏やかなピペッティングにより細胞を再懸濁する。
６）細胞をプールし、細胞懸濁液を５０ｍＬコニカルチューブに移す。
７）トリパンブルー染色で細胞を数えた後、４℃で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離する。
８）細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３×１０5個の細胞をエッペンドルフチューブに移す。
９）１チューブあたり１％ＢＳＡを含む１００μＬのＰＢＳ溶液に２μＬのマウス抗ＣＴＬＡ４（ＰＥでコンジュゲートされたマウスＩｇＧ１）またはＰＥアイソタイプマウスＩｇＧ１を添加し、１００ＲＰＭで１時間氷上で振盪する。
１０）１５０μＬのＰＢＳ溶液で細胞を３回洗浄する。
１１）４％ＰＦＡで細胞を室温で１０分間固定し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄する。
１２）細胞を１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターで細胞を分析する。
試験抗体を使用したヒトＣＴＬＡ４またはカニクイザルＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析。
１）細胞を収穫し（３．３、ステップ１～７として）、ＰＢＳで細胞を１回洗浄する。
２）ｐＨ６．０またはｐＨ７．４のＦＡＣＳ緩衝液に３×１０6細胞／ｍＬに細胞を再懸濁する。
３）９６ウェルＵ底プレートに、１００μＬのｐＨ６．０またはｐＨ７．４のＦＡＣＳ緩衝液中の３×１０5細胞をアリコートする。
４）細胞を遠沈し、緩衝液を廃棄する。
５）試験物質を、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４のＦＡＣＳ緩衝液中の１０μｇ／ｍＬ（合計８つのデータ点については、０６－１６－１７、０６－２６－１７、および０６－２８－１７実験）、または１００μｇ／ｍＬ（合計１１つのデータ点については、０７＿１０＿１７の実験）で開始する３倍希釈で段階希釈する。
６）１００μＬ／ウェルの希釈された試験物質を細胞に添加し、ウェルを穏やかに混合し、氷上で１時間、振盪（１００ｒｐｍ）しながらインキュベートする。
７）細胞を、１５００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離する。細胞を１５０μＬのｐＨ６．０またはｐＨ７．４の洗浄緩衝液で２回洗浄する。
８）ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＡＦ４８８抗体をｐＨ６．０またはｐＨ７．４のＦＡＣＳ緩衝液で１：３００に希釈する。
９）１００μＬの希釈された抗体（上記のステップから）を細胞に加え、光から保護しながら、氷上で４５分間インキュベートする。
１０）細胞をペレット化し、１５０μＬのｐＨ６．０またはｐＨ７．４の洗浄緩衝液で３回洗浄する。
１１）１ＸＰＢＳ中に希釈された４％ＰＦＡで、室温で１０分間細胞を固定し、次いで、１ＸＰＢＳで細胞を洗浄する。
１２）細胞を１００μＬの１ＸＰＢＳに再懸濁する。
１３）Ｅｘ４８８ｎｍ／Ｅｍ５３０ｎｍを使用して、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターによって細胞を分析する。少なくとも２０，０００個の細胞を収集する。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０３）に組み込まれた非線形適合（可変傾き、４パラメータ）モデルを使用してＦＡＣＳデータを分析した。
ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）ＣＴＬＡ４遮断アッセイ
１）解凍して使える（Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ）ＣＴＬＡ４ Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞（ＣＳ１８６９１２）のバイアルを、液体窒素保存からベンチのドライアイス上に移す。３７℃の水浴中で細胞がちょうど解凍するまで（約２分）バイアルを解凍する。解凍中、目視検査しながら、軽く撹拌する（反転させない）。
２）バイアル内の細胞懸濁液を上下に２～３回ピペッティングして、穏やかに混合し、０．８ｍＬを、３．２ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳを含む「ＣＴＬＡ４細胞」と表示されたチューブに移す。
３）細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠沈し、１ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳに再懸濁する。よく混合し、細胞懸濁液を２つのチューブに分割して、細胞を遠沈し、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４のアッセイ培地のいずれかでペレットを１回洗浄した後、細胞ペレットを２ｍＬのｐＨ６．０またはｐＨ７．４のアッセイ培地に再懸濁する。
４）レイアウトに従って、直ちに２５μＬのＣＴＬＡ４ Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を９６ウェルプレートの内側６０ウェルに分配する。
５）試料ウェル周囲の未使用のウェルに、１ウェルあたり１００μＬの滅菌水を添加する。
６）３００μｇ／ｍＬから開始して、３倍濃度の試験物質のストックをｐＨ６．０またはｐＨ７．４アッセイ培地に二重で段階希釈し、１０倍の希釈データポイントを生成する。
７）２５μＬの段階希釈された３倍濃度の試料物質のストックを、レイアウトに従って、２５μＬのＣＴＬＡ４ Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞を含むウェルに分注する。
８）解凍して使えるＣＴＬＡ４ ａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞（ＣＳ１８６９１１）のバイアルを、液体窒素貯蔵からベンチのドライアイス上に移す。３７℃の水浴中で細胞がちょうど解凍するまで（約２分）バイアルを解凍する。解凍中、目視検査しながら、軽く撹拌する（反転させない）。
９）バイアル内の細胞懸濁液を上下に２～３回ピペッティングして、穏やかに混合し、０．８ｍＬを、７．２ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳを含む「ａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞」と表示されたチューブに移す。
１０）細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠沈し、１ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳに再懸濁する。よく混合し、細胞懸濁液を２つのチューブに分割して、細胞を遠沈し、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４のアッセイ培地でペレットを１回洗浄した後、細胞ペレットを４ｍＬのｐＨ６．０またはｐＨ７．４のアッセイ培地に再懸濁する。
１１）２５μＬのＣＴＬＡ４ ａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞を、既に５０μＬの細胞および抗体溶液を含むアッセイプレートの内側の６０ウェルに直ちに分注する。アッセイ体積は、合計７５μＬである。
１２）プレートの上に蓋を置き、５％ＣＯ2の加湿インキュベーター内で、プレートを３７℃で１６時間インキュベートする。
１３）１６時間の誘導時間中、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）基質に添加する前に、室温の水浴を使用してＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）緩衝液を周囲温度に温める。
１４）Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）基質を含むボトルに、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）緩衝液を１ボトル移すことによって、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを再構築する。
１５）１６時間誘導した後、ＣＯ2インキュベーターからアッセイプレートを取り出し、周囲温度で１５分間平衡化する。
１６）７５μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬をアッセイプレートの内側の６０ウェルに添加する。
１７）プレートを周囲温度で５～１０分間インキュベートする。
１８）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘプレートリーダーで発光を記録する。
本発明の構造および機能の詳細とともに、本発明の多くの特徴および利点が前述の説明に記載されているが、しかしながら、本開示は例示的なものに過ぎず、特に付属の特許請求の範囲が表現されている用語の広範な一般的な意味によって示される完全な範囲において、本発明の原理内の部品の形状、サイズおよび配置に関する事項で、詳細な変更が行われ得ることを理解されたい。
本明細書に言及されるすべての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用されるか、あるいはそれらが特に信頼される開示を提供する。出願人（複数可）は、開示された実施形態を公衆に捧げることを意図しておらず、開示された修正または変更が文字通り特許請求の範囲内に含まれない可能性がある限り、それらは均等論の下で本発明の一部であると見なされる。

Claims (52)

  1. ＣＴＬＡ４タンパク質に特異的に結合する単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域を含み、前記領域が、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を有し、
    （ａ）前記Ｈ１配列が、ＧＦＴＦＳＨＹＴＭＨ（配列番号１）であり、
    （ｂ）前記Ｈ２配列が、ＦＩＸ1ＹＸ2ＧＮＸ3ＫＸ4Ｘ5ＡＸ6ＳＸ7ＫＧ（配列番号２）であり、
    （ｃ）前記Ｈ３配列が、ＴＧＷＬＧＰＦＤＸ8（配列番号３）であり、
    式中、Ｘ1が、ＳまたはＤであり、Ｘ2が、Ｄ、ＨまたはＩであり、Ｘ3が、ＮまたはＹであり、Ｘ4が、ＹまたはＩであり、Ｘ5が、ＹまたはＥであり、Ｘ6が、ＤまたはＫであり、Ｘ7が、ＶまたはＭであり、Ｘ8が、ＹまたはＩである、ポリペプチド。
  2. 前記Ｈ２配列が、ＦＩＤＹＨＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＤＧＮＮＫＩＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＤＧＮＹＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＤＧＮＹＫＹＹＡＫＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＨＧＮＮＫＹＥＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＨＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＦＩＳＹＩＧＮＹＫＹＹＡＤＳＭＫＧ、ＦＩＳＹＩＧＮＹＫＹＹＡＤＳＶＫＧから選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記Ｈ３配列が、ＴＧＷＬＧＰＦＤＹおよびＴＧＷＬＧＰＦＤＩから選択される、請求項１～２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  4. 前記重鎖可変領域が、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有する３つの相補性決定領域を含む単離された軽鎖可変領域と組み合わせた、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、
    （ａ）前記Ｌ１配列が、ＲＸ9ＳＱＸ10Ｘ11ＧＳＳＹＬＡ（配列番号４）であり、
    （ｂ）前記Ｌ２配列が、ＧＡＦＳＲＡＴＧＸ12（配列番号５）であり、
    （ｃ）前記Ｌ３配列が、ＱＱＤＧＳＳＰＷＴ（配列番号６）であり、
    式中、Ｘ9が、ＡまたはＩであり、Ｘ10が、Ｙ、ＳまたはＨであり、Ｘ11が、ＶまたはＧであり、Ｘ12が、ＶまたはＩである、ポリペプチド。
  6. 前記Ｌ１配列が、ＲＡＳＱＨＶＧＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＹＧＧＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＹＶＧＳＳＹＬＡ、およびＲＩＳＱＹＶＧＳＳＹＬＡから選択される、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. 前記Ｌ２配列が、ＧＡＦＳＲＡＴＧＩおよびＧＡＦＳＲＡＴＧＶから選択される、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 前記軽鎖可変領域が、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
  9. ＣＴＬＡ４タンパク質に特異的に結合する単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を有する３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含み、
    （ａ）前記Ｌ１配列が、ＲＸ9ＳＱＸ10Ｘ11ＧＳＳＹＬＡ（配列番号４）であり、
    （ｂ）前記Ｌ２配列が、ＧＡＦＳＲＡＴＧＸ12（配列番号５）であり、
    （ｃ）前記Ｌ３配列が、ＱＱＤＧＳＳＰＷＴ（配列番号６）であり、
    式中、Ｘ9が、ＡまたはＩであり、Ｘ10が、Ｙ、ＳまたはＨであり、Ｘ11が、ＶまたはＧであり、Ｘ12が、ＶまたはＩである、ポリペプチド。
  10. 前記Ｌ１配列が、ＲＡＳＱＨＶＧＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＹＧＧＳＳＹＬＡ、ＲＡＳＱＹＶＧＳＳＹＬＡ、およびＲＩＳＱＹＶＧＳＳＹＬＡから選択される、請求項９に記載のポリペプチド。
  11. 前記Ｌ２配列が、ＧＡＦＳＲＡＴＧＩおよびＧＡＦＳＲＡＴＧＶから選択される、請求項１０に記載のポリペピド。
  12. 前記軽鎖可変領域が、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のポリペプチド。
  13. 請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドを含む、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗体断片。
  14. 請求項９～１２のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドをさらに含む、請求項１３に記載の抗体または抗体断片。
  15. 前記抗体または抗体断片が、腫瘍微小環境における条件の値で、非腫瘍微小環境において生じる同一条件の異なる値と比較して、より高いＣＴＬＡ４タンパク質に対する結合親和性を有する、請求項１３～１４のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  16. 前記条件が、ｐＨである、請求項１５に記載の抗体または抗体断片。
  17. 前記腫瘍微小環境におけるｐＨが、５．０～６．８の範囲であり、前記非腫瘍微小環境におけるｐＨが、７．０～７．６の範囲である、請求項１６に記載の抗体または抗体断片。
  18. 前記抗体または抗体断片が、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約７０：１、または少なくとも約１００：１の、非腫瘍微小環境における同じ条件の異なる値での前記ＣＴＬＡ４タンパク質への結合親和性に対する腫瘍微小環境における条件の値での前記ＣＴＬＡ４タンパク質への結合親和性の比を有する、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  19. 前記抗体または抗体断片が、キメラ抗体、多特異性抗体、またはヒト化抗体である、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  20. 請求項１３～１９のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を含む、免疫コンジュゲート。
  21. 前記免疫コンジュゲートが、化学療法剤、放射性原子、細胞分裂阻害剤、および細胞傷害性剤から選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項２０に記載の免疫コンジュゲート。
  22. 少なくとも２つの前記薬剤を含む、請求項２１に記載の免疫コンジュゲート。
  23. 前記抗体または抗体断片、および前記少なくとも１つの薬剤が、リンカー分子に共有結合される、請求項２１～２２のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
  24. 前記少なくとも１つの薬剤が、マイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、およびアントラサイクリンから選択される、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
  25. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２０～２４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートと、
    薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  26. 等張化剤をさらに含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. 約１３５ｍｇ、２３５ｍｇ、３３５ｍｇ、４３５ｍｇ、５３５ｍｇ、６３５ｍｇ、７３５ｍｇ、８３５ｍｇ、９３５ｍｇ、１０３５ｍｇ、１１３５ｍｇ、１２３５ｍｇ、または１３８７ｍｇの量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２０～２４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートを含む、単回用量の請求項２５～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  28. １３５ｍｇ～２３５ｍｇ、２３５ｍｇ～３３５ｍｇ、３３５ｍｇ～４３５ｍｇ、４３５ｍｇ～５３５ｍｇ、５３５ｍｇ～６３５ｍｇ、６３５ｍｇ～７３５ｍｇ、７３５ｍｇ～８３５ｍｇ、８３５ｍｇ～９３５ｍｇ、９３５ｍｇ～１０３５ｍｇ、１０３５ｍｇ～１１３５ｍｇ、１１３５ｍｇ～１２３５ｍｇ、または１２３５ｍｇ～１３８７ｍｇの範囲の量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２０～２４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートを含む、単回用量の請求項２５～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  29. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび請求項１３～１９のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片とは異なる、免疫チェックポイント阻害剤分子をさらに含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  30. 前記免疫チェックポイント阻害剤分子が、免疫チェックポイントに対する抗体または抗体断片である、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 前記免疫チェックポイントが、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＤＲ３、およびＩＣＯＳから選択される、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 前記免疫チェックポイントが、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  33. ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＣＤ３、ＨＥＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＲＯＲ１、ＳＦＲＰ４、およびＷＮＴタンパク質から選択される抗原に対する抗体または抗体断片をさらに含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  34. 前記ＷＮＴタンパク質が、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、およびＷＮＴ１６から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 癌を治療する方法であって、癌を有する患者に、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項２０～２４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、あるいは請求項２５～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  36. 診断または治療のためのキットであって、前記キットが、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、または請求項２５～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物と、診断または治療のために前記抗体もしくは抗体断片、前記免疫コンジュゲート、および／または前記医薬組成物を使用するための説明書と、を含む、キット。
  37. 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＣＴＬＡ４抗体であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３９～４１のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４２～４４のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域を含む、抗ＣＴＬＡ４抗体。
  38. 前記重鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項３７に記載の抗体。
  39. 前記抗体が、腫瘍微小環境における条件の値で、非腫瘍微小環境において生じる同一条件の異なる値と比較して、より高いＣＴＬＡ４タンパク質に対する結合親和性を有する、請求項３７～３８のいずれか一項に記載の抗体。
  40. 前記条件が、ｐＨである、請求項３９に記載の抗体。
  41. 前記腫瘍微小環境におけるｐＨが、５．０～６．８の範囲であり、前記非腫瘍微小環境におけるｐＨが、７．０～７．６の範囲である、請求項４０に記載の抗体。
  42. 前記抗体が、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約７０：１、または少なくとも約１００：１の、非腫瘍微小環境における同じ条件の異なる値での前記ＣＴＬＡ４タンパク質への結合親和性に対する腫瘍微小環境における条件の値での前記ＣＴＬＡ４タンパク質への結合親和性の比を有する、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の抗体。
  43. 前記抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の抗体。
  44. 請求項３７～４３のいずれか一項に記載の抗体を含む、免疫コンジュゲート。
  45. 前記免疫コンジュゲートが、化学療法剤、放射性原子、細胞分裂阻害剤、および細胞傷害性剤から選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項４４に記載の免疫コンジュゲート。
  46. 少なくとも２つの前記薬剤を含む、請求項４５に記載の免疫コンジュゲート。
  47. 前記抗体、および前記少なくとも１つの薬剤が、リンカー分子に共有結合される、請求項４５～４６のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
  48. 前記少なくとも１つの薬剤が、マイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、およびアントラサイクリンから選択される、請求項４６～４７のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
  49. 請求項３７～４３のいずれか一項に記載の抗体、または請求項４４～４８のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートと、
    薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  50. 等張化剤をさらに含む、請求項４９に記載の医薬組成物。
  51. 癌を治療する方法であって、癌を有する患者に、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の抗体、もしくは請求項４４～４８のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、または請求項４９～５０のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  52. 診断または治療のためのキットであって、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の抗体、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、または請求項４９～５０のいずれか一項に記載の医薬組成物と、診断もしくは治療のために前記抗体、前記免疫コンジュゲート、および／または前記医薬組成物を使用するための説明書と、を含む、キット。
JP2021547665A 2018-10-31 2019-10-25 抗ｃｔｌａ４抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用 Active JP7445995B2 (ja)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862753498P 2018-10-31 2018-10-31
US62/753,498 2018-10-31
US201962798234P 2019-01-29 2019-01-29
US62/798,234 2019-01-29
US201962803060P 2019-02-08 2019-02-08
US62/803,060 2019-02-08
US201962822971P 2019-03-24 2019-03-24
US62/822,971 2019-03-24
US201962824014P 2019-03-26 2019-03-26
US201962823992P 2019-03-26 2019-03-26
US62/824,014 2019-03-26
US62/823,992 2019-03-26
PCT/US2019/058066 WO2020092155A1 (en) 2018-10-31 2019-10-25 Anti-ctla4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024023003A Division JP2024073454A (ja) 2018-10-31 2024-02-19 抗ｃｔｌａ４抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2022513384A true JP2022513384A (ja) 2022-02-07
JPWO2020092155A5 JPWO2020092155A5 (ja) 2022-10-28
JP7445995B2 JP7445995B2 (ja) 2024-03-08

Family

ID=70463883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021547665A Active JP7445995B2 (ja) 2018-10-31 2019-10-25 抗ｃｔｌａ４抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20230192858A1 (ja)
EP (1) EP3873940A4 (ja)
JP (1) JP7445995B2 (ja)
KR (2) KR102521276B1 (ja)
CN (1) CN112996813A (ja)
AU (2) AU2019371223B2 (ja)
BR (1) BR112021008060A2 (ja)
CA (1) CA3117700C (ja)
IL (2) IL282610B (ja)
MX (1) MX2021005048A (ja)
NZ (1) NZ775959A (ja)
SG (1) SG11202104373YA (ja)
TW (1) TW202028249A (ja)
WO (1) WO2020092155A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220193237A1 (en) * 2019-04-18 2022-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Ipilimumab variants with enhanced specificity for binding at low ph
JP2023537412A (ja) 2020-08-13 2023-08-31 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 目的の細胞を標的とするためのｉｌ－２の向け直し方法
EP4240769A1 (en) * 2020-11-06 2023-09-13 Bristol-Myers Squibb Company Dosing and administration of non-fucosylated anti-ctla-4 antibody as monotherapy
TW202317612A (zh) * 2021-03-01 2023-05-01 美商艾希利歐發展股份有限公司 用於治療癌症的ｃｔｌａ４及ｐｄ１／ｐｄｌ１抗體之組合
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
WO2024056049A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 同润生物医药(上海)有限公司 具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1371416B (zh) * 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
US6981720B2 (en) * 2003-11-07 2006-01-03 Agilent Technologies, Inc. Tapered ceramic GC fitting and assembly
CA2647282A1 (en) 2006-04-05 2007-10-11 Pfizer Products Inc. Ctla4 antibody combination therapy
CN104479017A (zh) * 2008-04-25 2015-04-01 戴埃克斯有限公司 针对fcrn的抗体及其用途
CA2810668A1 (en) * 2010-09-08 2012-03-15 Halozyme, Inc. Methods for assessing and identifying or evolving conditionally active therapeutic proteins
GB201103955D0 (en) * 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
AU2013251309B2 (en) * 2012-04-27 2017-06-22 Bioatla, Llc Modified antibody regions and uses thereof
EA028244B1 (ru) * 2012-08-13 2017-10-31 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. АНТИТЕЛА К PCSK9 C pH-ЗАВИСИМЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ СВЯЗЫВАНИЯ
WO2015058048A1 (en) * 2013-10-18 2015-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of a vegf antagonist and an anti-ctla-4 antibody
CN104292334B (zh) * 2014-04-25 2018-11-27 河南省健康伟业生物医药研究股份有限公司 一种全人源抗ctla-4单克隆抗体、制备方法及应用
BR112017004131A2 (pt) 2014-09-03 2017-12-12 Bioatla Llc método de produção de uma proteína biológica condicionalmente ativa, proteína biológica condicionalmente ativa, receptor de antígeno quimérico, e, célula citotóxica.
CN108271359B (zh) * 2015-02-13 2021-11-09 索伦托药业有限公司 结合ctla4的抗体治疗剂
KR102492532B1 (ko) * 2015-05-29 2023-01-30 아게누스 인코포레이티드 항-ctla-4 항체 및 이의 사용 방법
KR20230054508A (ko) * 2016-06-14 2023-04-24 젠코어 인코포레이티드 이중특이적 체크포인트 억제제 항체
KR20230130174A (ko) * 2016-08-30 2023-09-11 젠코어 인코포레이티드 공자극 및 체크포인트 수용체에 결합하는 이중특이적 면역조절 항체
WO2018218076A1 (en) * 2017-05-26 2018-11-29 Janux Therapeutics, Inc. Modified antibodies
SG11202007017PA (en) * 2018-02-02 2020-08-28 Oncoimmune Inc Mutant anti-ctla-4 antibodies with improved immunotherapeutic effect but attenuated adverse effects

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022204161A1 (en) 2022-06-30
IL282610A (en) 2021-06-30
US20230192858A1 (en) 2023-06-22
MX2021005048A (es) 2021-09-08
TW202028249A (zh) 2020-08-01
EP3873940A4 (en) 2022-11-30
JP7445995B2 (ja) 2024-03-08
KR102521276B1 (ko) 2023-04-12
EP3873940A1 (en) 2021-09-08
CA3117700C (en) 2024-02-20
CN112996813A (zh) 2021-06-18
KR20230051630A (ko) 2023-04-18
IL291545A (en) 2022-05-01
KR20210071058A (ko) 2021-06-15
WO2020092155A1 (en) 2020-05-07
SG11202104373YA (en) 2021-05-28
BR112021008060A2 (pt) 2021-11-23
IL282610B (en) 2022-05-01
CA3117700A1 (en) 2020-05-07
AU2019371223A1 (en) 2021-06-03
AU2019371223B2 (en) 2022-03-17
NZ775959A (en) 2022-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7161783B2 (ja) 抗Ａｘｌ抗体、抗体断片およびそれらの免疫コンジュゲートならびにそれらの使用
JP7445995B2 (ja) 抗ｃｔｌａ４抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用
JP7432253B2 (ja) 抗Ｒｏｒ２抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用
US11542332B2 (en) Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
JP2024073454A (ja) 抗ｃｔｌａ４抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用
NZ791066A (en) Anti-ctla4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
TW202342537A (zh) 使用條件性活性抗ror2抗體-藥物結合物之癌症治療
JP2023511403A (ja) 条件的に活性な抗ｈｅｒ２抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲート、およびそれらの使用

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221019

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221019

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20230908

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230919

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231219

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240130

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240219

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7445995

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150