JP2022506897A - 組換えパルボウイルスベクターならびにその作製および使用方法 - Google Patents

Abstract

共有結合性閉鎖末端を有するウイルスゲノムを有するパルボウイルスベクター（ｃｃｅＰＶベクター）、そのようなベクターを産生するための方法、およびそのようなベクターを産生するために使用されるＤＮＡ構築物。【選択図】図２

Description

関連出願

[0001]本願は、２０１８年１１月２日に出願された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮出願第６２／７５５，１４４号の優先権を主張するものである。

[0002]本願は、全体的に、組換えウイルスベクター、特に、共有結合性閉鎖末端（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｅｎｄ）を有する二本鎖領域を有するウイルスゲノムを有するパルボウイルスベクターに関する。

[0003]本願は、共有結合性閉鎖末端を有するウイルスゲノムを有するパルボウイルスベクター（ｃｃｅＰＶベクター）、そのようなベクターを産生するための方法、およびそのようなベクターを産生するために使用されるＤＮＡ構築物を記載する。ベクターおよび方法は、全ての遺伝子移入／遺伝子療法用途、例えば、組換え遺伝子発現カセットの送達を必要とする遺伝子移入／遺伝子療法用途に適用可能である。ｃｃｅＰＶベクターは、非常にフレキシブルであり、使い勝手がよく、（日常的なＤＮＡクローニングを介して）容易に修飾することができ、様々な用途に（標準的なＰＶベクターまたはＡＡＶベクター技術を介して）利用することができる。

[0004]図１、パネル（Ａ）は、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする発現カセットに隣接する野生型ＩＴＲを有する一本鎖ＡＡＶゲノムを作製するための従来の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクタープラスミドを示す。パネル（Ｂ）中の一本鎖ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ粒子にパッケージされる。パネル（Ｃ）は、ｍＩＴＲのいずれかの側の自己相補的配列を介して自身に折り返すかまたはアニールする、パネル（Ｄ）（左側）に示される一本鎖前駆体から形成される二本鎖ｓｃＡＡＶゲノムを作製するための従来の自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクタープラスミドを示す。この場合、一本鎖ベクターゲノムは、いずれの末端にも野生型ＩＴＲ（ｗｔＩＴＲ）を含む。パネル（Ｄ）の右側には、ウイルス粒子にパッケージされたベクターゲノムが示され、相補的領域がアニーリングして、図示される二本鎖ｓｃＡＡＶゲノムを形成することを示す。パネル（Ａ）および（Ｃ）中の２つのプラスミドは、細菌宿主中で安定して増殖することができる。 [0005]図２は、パッケージされた様々なＡＡＶ鋳型からの導入遺伝子発現の経路を示す。パネル（Ａ）は、導入遺伝子発現のための二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するための、一本鎖組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ＤＮＡからの第２鎖合成を示す。パネル（Ｂ）は、パネル（Ａ）に示す中間第２鎖合成工程なしで導入遺伝子の転写を容易にすることができる、３’末端に共有結合性閉鎖末端（ＣＣＥ）ドメインを有する二重鎖ＤＮＡを含むｓｃＡＡＶを示す。パネル（Ｃ）は、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡではない、ＣＣＥドメインを含む、完全に相補的なゲノムを有するｃｃｅＡＡＶ－ＺＬを示す。パネル（Ｃ）において、ＣＣＥドメインは、安定したステム構造が形成されることを可能にするために、通常、いくつかのヌクレオチド（２～５ヌクレオチド）のｓｓＤＮＡ領域を含む。ｓｃＡＡＶと比較して、パネル（Ｃ）に示されるｃｃｅＡＡＶ－ＺＬでは、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡが必要とされない。これにより、他の点では同一のｓｃＡＡＶベクターと比較して、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬにおけるパッケージング容量の増加が可能になる。 [0006]図３、パネル（Ａ）は、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡの長い非相補的領域を含むｃｃｅＡＡＶの一実施形態を示す。パネル（Ｂ）は、相補的な二本鎖領域内に一本鎖ループ領域（またはバルジ領域）を含むｃｃｅＡＡＶの別の実施形態を示す。非相補ｓｓＤＮＡは、アプタマー／デオキシリボザイムコード配列、ポリペプチドコード配列、ｓｉＲＮＡコード配列、ｍｉＲＮＡコード配列、ｓｈＲＮＡコード配列、ポリアデニル化シグナル、インシュレーター配列等の任意のＤＮＡ配列を含むことができる。アプタマーは、それに隣接するフランキング相補的ＤＮＡ配列への連結／結合を通じて安定化されてもよい。ｃｃｅＡＡＶ－ＬＳにおけるｓｓＤＮＡは、遺伝子編集またはＤＮＡ修復用途のための効率的な鋳型である。 [0007]図４は、従来のパルボウイルスベクターおよび様々なｃｃｅ－パルボウイルスベクターを含む、いくつかのパルボウイルスベクターの実施形態を示す。パネル（Ａ）は、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡゲノムを有する従来のパルボウイルスを示す。パネル（Ｂ）は、相補的な二本鎖（ｄｓ）ゲノムを有するｃｃｅ－パルボウイルスを示す。パネル（Ｃ）は、ｄｓ鋳型の一本鎖上にｓｓループ領域を有するｃｃｅ－パルボウイルスを示す。パネル（Ｄ）は、ＣＣＥドメインを定義し、非相補的領域を含む、目的遺伝子（ＧＯＩ）の拡張ｓｓループ領域３’を有するｃｃｅ－パルボウイルスを示す。非相補的ｓｓ配列は、アプタマー／デオキシリボザイムコード配列、ポリペプチドコード配列、ｍｉＲＮＡコード配列、ｓｈＲＮＡコード配列、ポリアデニル化シグナル、インシュレーター配列等の任意のＤＮＡ配列を含むことができる。アプタマーは、それに隣接するフランキング相補的ＤＮＡ配列への連結／結合を通じて安定化されてもよい。ｃｃｅＰＶ－ＬＳにおける一本鎖ＤＮＡは、遺伝子編集またはＤＮＡ修復用途のための効率的な鋳型である。 [0008]図５は、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬベクターを産生するための例示的なライゲーション戦略を示す。まず、ＡＡＶ ＩＴＲを有する出発プラスミドおよび目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする発現カセットが、目的酵素による消化（または線状化）を容易にするために、発現カセットの３’末端に認識配列を含むように操作される。得られた断片は、３’ＣＣＥドメインを有する２つのＩＴＲを含むｃｃｅＡＡＶ－ＺＬ粒子を産生するための３つの異なる経路に供され得る。出発プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され（つまり、線状化され）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄ（および産生細胞株で供給されない追加のアデノウイルスヘルパー遺伝子）と共に、トランスフェクトされるＡＡＶ産生細胞（例えば、２９３、または供給された相補遺伝子を有する任意の他の細胞）にトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され（つまり、線状化され）、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にＡＡＶ産生細胞にトランスフェクトされ、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）ＡＡＶ産生細胞にＲｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄと共に直接トランスフェクトされ、ここで出発プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで消化され、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよい。その結果、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬゲノムＤＮＡ（右上）が作製され、ウイルス粒子内にパッケージされる。ここでの図示は、アデノウイルスヘルパーを使用して２９３細胞で産生されたＡＡＶについての図示である。提案される消化／ライゲーション方法に利用することができる他のヘルパーシステムとしては、ヘルペスウイルスシステム、ワクシニアウイルスシステム、バキュロウイルスシステムが挙げられる。ベクタープラスミドは、産生されるｃｃｅＰＶおよびｃｃｅＡＡＶベクターに対応する鋳型分子を形成するための消化／ライゲーション工程の前に、安定したエピソーム形態で宿主細胞中に存在してもよい。 [0009]図６は、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬベクターを生成するための例示的なｉｎ ｖｉｖｏ消化－ライゲーション戦略をさらに示す。出発プラスミドは、ＡＡＶ ＩＴＲを含み、目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードする発現カセットは、目的の酵素によるｉｎ ｖｉｖｏ消化（または線状化）を容易にするために、発現カセットの３’末端に認識配列を含むように操作される。プラスミドは、線状化反応のための酵素を有するＡＡＶプロデューサー細胞（例えば、２９３）にＲｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄと共にコトランスフェクトされる。酵素は、ウイルスベクターによって送達されてもよく、ＡＡＶプロデューサー細胞ゲノムに安定して組み込まれてもよい。図６は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡヌクレアーゼで安定して組み込まれたプロデューサー細胞を示す。次いで、プラスミドは線状化され、その後、宿主細胞リガーゼによってそれ自体にライゲーションされ、示されるように、いずれの側もＡＡＶ ＩＴＲが隣接する発現カセット配列を含む、ＡＡＶ産生のための鋳型を形成する。このように、ＤＮＡ断片は、宿主細胞環境内で起こるｉｎ ｖｉｖｏ消化およびライゲーション工程によって修飾される。一部の実施形態において、ヌクレオチド挿入または欠失は、ライゲーション部位へ操作されてもよい。ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬの閉鎖末端は、同一の配列を有してもよく、わずかな変化を有してもよい。 [0010]図７は、ｃｃｅＰＶ－ＬＳベクターの産生のための例示的な一般化された消化ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。パルボウイルス（ＰＶ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）、ＰＶ右末端ヘアピン（ＲＥＨ）、およびそれらの間の発現カセットを含む第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、発現カセットの３’末端で、酵素によって、位置１で切断され、一方、発現カセットの追加の非相補的領域３’を含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、位置２で、非相補的領域の下流で、同様に切断される。第２のプラスミドは、同じ酵素によって切断されてもよく、異なる酵素によって切断されてもよい。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、２９３細胞株（または特定のパルボウイルスベクターに適合する任意の他の細胞株）などのＰＶプロデューサー細胞に、パルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、プロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされ、ｉｎ ｖｉｖｏで、プロデューサー細胞内でライゲーションされてもよく；または（３）ＰＶ産生細胞に、パルボウイルスヘルパー遺伝子と共に直接トランスフェクトされ、ここで出発プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで消化され、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよい。これら３つの経路のいずれかの結果、示されるように、目的遺伝子（ＧＯＩ）に隣接するＬＥＨ配列およびＲＥＨ配列を有する複製鋳型が、それらの間にＰＶ産生細胞におけるＰＶベクター産生のための非相補的領域を含んで作製される。ライゲーションされた断片が非相補的領域を含むため、ＣＣＥドメインは、図の右上部に示すように、伸長された一本鎖ループまたはバルジ領域を形成する。ｃｃｅＰＶ－ＺＬの形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用されてもよい。しかしながら、第２のプラスミドにおける消化部位は、非相補的領域の始点または終点にある必要はなく、非相補的領域の中間の任意の場所にあってもよい。対照的に、第１のプラスミドと第２のプラスミドの末端が同一であるか、またはほぼ同一である場合、結果としてベクターｃｃｅＰＶ－ＺＬが作製され、このベクターは閉鎖末端に有意なループを有さない。ｃｃｅＰＶは、ベクターの両方の極性または１方の極性のみをパッケージし得る。ここでの例示は、１方の極性のみを示す。 [0011]図８は、図７に概説される一般的なアプローチに基づいて、ｃｃｅＡＡＶ－ＬＳベクターを産生するための例示的な消化－ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。ＡＡＶ ＩＴＲおよび発現カセットを含む第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）が、発現カセットの３’末端で、酵素によって、位置１で切断され、一方、発現カセットの追加の非相補的領域３’を含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、位置２で、非相補的領域の下流で、同様に切断される。第２のプラスミドは、同じ酵素によって切断されてもよく、異なる酵素によって切断されてもよい。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、２９３細胞株または他のＡＡＶ細胞株などのＡＡＶ産生細胞に、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にプロデューサー細胞にコトランスフェクトされ、ｉｎ ｖｉｖｏで、プロデューサー細胞内でライゲーションされてもよく；または（３）ＡＡＶ産生細胞にＲｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄと共に直接トランスフェクトされ、ここで出発プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで消化され、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよい。これら３つの経路のいずれかの結果、示されるように、目的遺伝子（ＧＯＩ）に隣接するＩＴＲを有する複製鋳型が、それらの間にＡＡＶ産生細胞におけるＡＡＶベクター産生のための非相補的領域を含んで作製される。ライゲーションされた断片が非相補的領域を含むため、ＣＣＥドメインは、図の右上部に示すように、伸長された一本鎖ループまたはバルジ領域を形成する。ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬの形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用されてもよい。しかしながら、第２のプラスミドにおける消化部位は、非相補的領域の始点または終点にある必要はなく、非相補的領域の中間の任意の場所にあってもよい。対照的に、第１のプラスミドと第２のプラスミドの末端が同一であるか、またはほぼ同一である場合、結果としてベクターｃｃｅＡＡＶ－ＺＬが生成され、このベクターは閉鎖末端に有意なループを有さない。さらに、複数断片ライゲーションおよび／またはＤＮＡアセンブリ技術を用いて、ｃｃｅＡＡＶまたはｃｃｅＰＶの産生のための鋳型分子を作製することができる。 [0012]図９は、ｃｃｅＰＶ－ＢＲベクターを産生するための一般的な消化－ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。ＧＯＩを含む発現カセットの上流にＰＶ ＬＥＨを含む第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、発現カセットの３’末端で、酵素によって、位置１で切断され、一方、ＲＥＨ、発現カセット、およびプロモーターとＧＯＩとの間の追加の非相補的領域を含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、位置２で、発現カセットの下流で切断される。第２のプラスミドは、同じ酵素によって切断されてもよく、異なる酵素によって切断されてもよい。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、２９３細胞株などのＰＶプロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、プロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされ、ｉｎ ｖｉｖｏで、プロデューサー細胞内でライゲーションされてもよく；または（３）ＰＶ産生細胞に、パルボウイルスヘルパー遺伝子と共に直接トランスフェクトされ、ここで出発プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで消化され、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよい（図示せず）。これら３つの経路のいずれかの結果として、示されるように、目的遺伝子（ＧＯＩ）の発現を駆動するプロモーターの上流にＬＥＨ／ＲＥＨ配列、ならびにそれらの間に非相補的領域を有する複製鋳型（ｃｃｅＰＶ－ＢＲ、右上）が作製される。ライゲーションされた断片が非相補的領域を含むため、ＣＣＥドメインは、図の右上部に示すように、伸長された一本鎖ループまたはバルジ領域を形成し、このループまたはバルジ領域は、アプタマー配列などの追加の配列を収容することができる。第１および第２のプラスミド由来の対称ライゲーション産物の形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用されてもよい。複数のＳＳループ構造を有するｃｃｅＰＶ－ＢＲは、追加の非相補的配列を含むことによって形成することができる。ｃｃｅＰＶ－ＢＲにおけるｓｓループは、アプタマーコード領域、または遺伝子編集のための一本鎖ＤＮＡ鋳型を含んでもよい。定義された極性を有するパルボウイルスパッケージングの性質は、例えば、アプタマー配列を含む構築物が、相補鎖の影響を受けない複製鋳型を生じることを意味する。ベクターゲノムが宿主細胞によって分解／変換されるまで、アプタマー活性は維持され得る。 [0013]図１０は、図９に概説される一般的なアプローチに基づいて、ｃｃｅＡＡＶ－ＢＲベクターを産生するための例示的な消化－ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。ＡＡＶ ＩＴＲおよび発現カセットを含む第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、発現カセットの３’末端で、酵素によって、位置１で切断され、一方、プロモーターとＧＯＩとの間に追加の非相補的領域を含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、それ以外は同一の発現カセットの下流で、位置２で、切断される。第２のプラスミドは、同じ酵素によって切断されてもよく、異なる酵素によって切断されてもよい。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、２９３細胞株または他の適合する細胞などのＡＡＶプロデューサー細胞に、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にプロデューサー細胞にコトランスフェクトされ、ｉｎ ｖｉｖｏで、プロデューサー細胞内でライゲーションされてもよく；または（３）ＡＡＶ産生細胞にＲｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄと共に直接トランスフェクトされ、ここで出発プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで消化され、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよい（図示せず）。これら３つの経路のいずれかの結果として、示されるように、目的遺伝子（ＧＯＩ）の発現を駆動するプロモーターの上流にＡＡＶ ＩＴＲ、ならびにそれらの間に非相補的領域を有する複製鋳型（ｃｃｅＡＡＶ－ＢＲ、右上）が作製される。ライゲーションされた断片が非相補的領域を含むため、ＣＣＥドメインは、図の右上部に示すように、伸長された一本鎖ループまたはバルジ領域を形成し、このループまたは領域は、アプタマー配列などの追加の配列を収容することができる。第１および第２のプラスミド由来の対称ライゲーション産物の形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用されてもよい。複数のｓｓループ構造を有するｃｃｅＡＡＶ－ＢＲは、追加の非相補的配列を含むことによって形成することができる。本明細書に記載のＡＡＶベクターは、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスベースのＡＡＶ産生システムを含む任意の現在のＡＡＶ産生システムで産生することができる。 [0014]図１１は、余剰のパッケージング容量のためのｃｃｅＰＶ－ＸＰベクターを生成するための、一般的な消化－ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。発現カセットの上流にＰＶ ＬＥＨを含む第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、ｃＤＮＡを含む発現カセットの３’末端で、酵素によって、位置１で切断され、一方、プロモーターの上流にＰＶ ＲＥＨのみ（ｃＤＮＡなし）を含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、プロモーターの下流で、位置２で切断される。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、パルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ＰＶプロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされ、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）ｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーションのために宿主細胞に直接コトランスフェクトされてもよい（図示せず）。その形成される構造は、ｃＤＮＡに対応する非相補的ループ領域をそれぞれ含むＰＶゲノム（ｃｃｅＰＶ－ＸＰ、右上）を含み、これが、ＰＶ粒子にパッケージされる。したがって、ＰＶゲノムは、コード配列およびポリアデニル化シグナルを有する一本鎖ｃＤＮＡ（ループ）領域に作動可能に連結されたプロモーター活性を有する二重鎖ＤＮＡ領域の構成を有する。第１または第２のプラスミド由来の対称ライゲーション産物の形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用されてもよい。 [0015]図１２は、図１１に概説される一般的なアプローチに基づいて、余剰のパッケージング容量のためのｃｃｅＡＡＶベクターを産生するための、例示的な消化－ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび発現カセットを含む第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、ｃＤＮＡを含む発現カセットの３’末端で、酵素によって、位置１で切断され、一方、５’ＡＡＶ ＩＴＲおよびプロモーターのみ（ｃＤＮＡなし）を含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、プロモーターの下流で、位置２で、切断される。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、ＡＡＶヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ＡＡＶプロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされてもよく；または（３）ｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーションのために宿主細胞に直接コトランスフェクトされてもよい（図示せず）。その形成される構造は、ｃＤＮＡに対応する非相補的ループ領域をそれぞれ含むＡＡＶゲノム（ｃｃｅＡＡＶ－ＸＰ、右上）を含み、それらの両方が、ＡＡＶ粒子にパッケージされ、そのゲノムの１つのみ（プラス鎖）が、ｃＤＮＡを発現することができる。したがって、ＡＡＶプラス鎖ゲノムは、完全なプロモーター活性を有する二重鎖ＤＮＡ領域、ならびにコード配列およびポリアデニル化シグナルを有する一本鎖ｃＤＮＡ領域の構成を有する。対照的に、マイナス鎖は、二重鎖形式に変換された後に、ｃＤＮＡを発現することができる。第１または第２のプラスミド由来の対称ライゲーション産物の形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用され得る。 [0016]図１３は、余剰のパッケージング容量のためのｃｃｅＰＶベクターを産生するための、別の一般的な消化－ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。ＰＶ ＬＥＨ、ならびにプロモーター、ｃＤＮＡ、およびポリアデニル化部位を含む発現カセットを含む第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、ポリアデニル化部位の３’で、酵素によって、位置１で切断され、一方、ＰＶ ＲＥＨ、ならびにプロモーター、ｃＤＮＡ、およびポリＡ部位を含む発現カセットを含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、ポリＡ部位の３’で、酵素によって、位置２で切断される。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、ＰＶプロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ＰＶ産生細胞にトランスフェクトされ、ここで、消化されたプラスミドがｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）プラスミドは、ｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーションのために、パルボウイルスヘルパー遺伝子と共にＰＶプロデューサー細胞に直接トランスフェクトされてもよい（図示せず）。ＰＶ粒子にパッケージされた、結果として生じるＰＶゲノムは、ｃＤＮＡに対応する非相補的ループ領域を含む。したがって、ＰＶゲノムは、プロモーターを有する二重鎖ＤＮＡ領域、およびｃＤＮＡをコードする一本長鎖ＤＮＡ領域の上流のポリＡ部位を有する。第２のプラスミドにポリＡを含めることは、ＰＶゲノムが第２鎖ＤＮＡ合成を経るときに導入遺伝子発現を低下させ得るアンチセンスＤＮＡの産生を防止する。あるいは、または加えて、この帰結をさらに低減させるためにＤＮＡインシュレーター配列を組み込んで、転写単位を互いに効果的に分離してもよい。このことは、自己相補的領域が、反対方向でも同様に機能し得るエンハンサー配列を含むために、重要であり得る。第１または第２のプラスミド由来の対称ライゲーション産物の形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用されてもよい。 [0017]図１４は、図１３に概説される一般的なアプローチに基づいて、余剰のパッケージング容量のためのｃｃｅＡＡＶベクターを産生するための、例示的な消化－ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。プロモーター、ｃＤＮＡ、およびポリＡ部位（本願における全てのポリＡ部位は、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが使用される場合、転写終結因子であり得る）を含む発現カセットの上流にＡＡＶ ＩＴＲを含む第１のプラスミド（つまり、最も左に示すプラスミド）は、ポリＡ部位の３’末端で、酵素によって、位置１で切断され、一方、プロモーター、ｃＤＮＡ、およびポリＡ部位を含む発現カセットの上流のＡＡＶ ＩＴＲを含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、ポリＡ部位の３’で、酵素によって、位置２で切断される。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、ＡＡＶ産生細胞にＲｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ＡＡＶプロデューサー細胞にトランスフェクトされ、ここで、消化されたプラスミドがｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）プラスミドは、ｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーションのために、ＡＡＶプロデューサー細胞にＲｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄと共に直接トランスフェクトされてもよい（図示せず）。その形成される構造は、ｃＤＮＡに対応する非相補的ループ領域をそれぞれ含む２つの異なるＡＡＶゲノム（右上）を含み、それらの両方が、ＡＡＶ粒子にパッケージされる。しかしながら、そのゲノムの１つのみ（プラス鎖）が、ＡＡＶキャプシドから放出された直後にｃＤＮＡを発現することができる。その形成されたＡＡＶプラスゲノムは、一本鎖ｃＤＮＡ領域の発現を駆動する完全なプロモーター活性を有する二重鎖ＤＮＡ領域の構成を有する。対照的に、マイナス鎖は、ｓｓＤＮＡゲノムが二重鎖形態になるように変換された後にのみ、ｃＤＮＡを発現することができる。第２のプラスミドにポリＡを含めることは、ＡＡＶゲノムが第２鎖ＤＮＡ合成を経るときに導入遺伝子発現を低下させ得るアンチセンスＤＮＡの産生を防止する。あるいは、または加えて、この帰結をさらに低減させるためにＤＮＡインシュレーター配列を組み込んで、転写単位を互いに効果的に分離してもよい。このことは、自己相補的領域が、反対方向でも同様に機能し得るエンハンサー配列を含むために、重要であり得る。第１または第２のプラスミド由来の対称ライゲーション産物の形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用されてもよい。 [0018]図１５は、単一のプロモーターを使用して２つの遺伝子を発現するためのｃｃｅＰＶ－二重ベクターを産生するための、別の一般的な消化－ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、対向する鎖上にステムループ構造を含むＬＥＨ領域、続いて、５’－３’方向のプロモーター、続いて、３’－５’方向の第１の遺伝子（つまり、ルシフェラーゼ、Ｌｕｃ）のための発現カセットを含む。さらに、Ｌｕｃ領域を包含する第２鎖は、非相補的領域を含む。第１のプラスミドは、第１の酵素によって、位置１で切断され、一方、ＧＦＰ発現カセットを含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、第２の酵素によって、位置２で切断される。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、ＰＶプロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ＰＶ産生細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にトランスフェクトされ、ここで、消化されたプラスミドがｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）プラスミドは、ｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーションのために、ＰＶ産生細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共に直接トランスフェクトされてもよい（図示せず）。結果として生じる、ＰＶ粒子にパッケージされたＰＶゲノムは、ｃＤＮＡに対応する非相補的ループ領域（ｃｃｅＰＶ－二重、右上）を含む。したがって、ＰＶゲノムは二重鎖ＤＮＡ領域を有し、プロモーターが２つの遺伝子（ＬｕｃおよびＧＦＰによって例示される）の発現を導き、各遺伝子の下流に別個のポリＡ部位が伴う。主な特徴は、プロモーターが、２つの遺伝子の転写を同時にオンにすることができることである。これを使用して、ＰＶゲノムが、第２の導入遺伝子（例えば、Ｌｕｃ）をプロモーターの下流に反対方向に配置する二重鎖形態に変換される場合に、第２の遺伝子の発現をオフにすることもできる。これは、ＰＶベクターを遺伝子スイッチとして使用する一例である。第１または第２のプラスミド由来の対称ライゲーション産物の形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用されてもよい。 [0019]図１６は、単一のプロモーターを使用して２つの遺伝子を発現するためのｃｃｅＡＡＶ二重ベクターを産生するための、例示的な消化－ライゲーション戦略を示す。２つの異なる出発プラスミドが利用される。第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、対向する鎖上にステムループ構造を含むＡＡＶ ＩＴＲ、続いて、５’－３’方向のプロモーター、続いて、３’－５’方向の第１の遺伝子（つまり、ルシフェラーゼ、Ｌｕｃ）のための発現カセットを含む。さらに、Ｌｕｃ領域を包含する第２鎖は、非相補的領域を含む。第１のプラスミドは、第１の酵素によって、位置１で切断され、一方、ＧＦＰ発現カセットを含む第２のプラスミド（つまり、最も右のプラスミド）は、第２の酵素によって、位置２で切断される。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、ＡＡＶプロデューサー細胞にＲｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ＡＡＶプロデューサー細胞にトランスフェクトされ、ここで、消化されたプラスミドがｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）プラスミドは、ｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーションのために、ＡＡＶプロデューサー細胞にＲｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄと共に直接トランスフェクトされてもよい（図示せず）。その形成される構造は、２つの遺伝子の発現を駆動するプロモーターをそれぞれ含む２つの異なるＡＡＶゲノム（右上）を含み、１つは、遺伝子（Ｌｕｃ）の１つに対応する非相補ループ領域を含む。他の遺伝子（ＧＦＰ）は、ＣＣＥドメインの上流で二本鎖ステムにおいてコードされる。両方のゲノムがＡＡＶ粒子にパッケージされる。その形成されるＡＡＶゲノムは、１方が一本鎖領域に由来し、他方が二本鎖領域に由来する、２つの遺伝子の発現を駆動する完全なプロモーター活性を有する、二重鎖ＤＮＡ領域の構成を有する。主な特徴は、感染後にゲノムが宿主細胞内に放出されたら、プロモーターが、２つの遺伝子の転写を同時にオンにすることができることである。さらに、これを使用して、ＡＡＶゲノムが、第２のゲノム（ｌｕｃ）をプロモーターの下流に反対方向に配置する二重鎖形態に変換される場合に、第２の遺伝子の発現をオフにすることもできる。これは、ＡＡＶを遺伝子スイッチとして使用する一例である。第１または第２のプラスミド由来の対称ライゲーション産物の形成に代替的につながり得る望ましくない自己ライゲーションを排除するために、非対称消化が、シームレスクローニングまたは他の方向性クローニング技術を使用して採用されてもよい。 [0020]図１７は、２つの遺伝子を発現するための単一のプロモーターを含む別のｃｃｅＰＶベクターを産生するための、一般的な消化－ライゲーション戦略を示す。３つの異なる出発プラスミドが利用される。第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、ＬＥＨ配列、および５’－３’方向の第１の遺伝子（例えば、ＬＵＣ）のための発現カセットを含み、このプラスミドは、酵素によって、位置１で切断される。第２のプラスミド（つまり、中間のプラスミド）は、３’－５’方向でＧＦＰ－Ｌｕｃコード領域のタンデムヘッドツーテール配置で隣接するポリＡ部位を含み、このプラスミドは、位置２および位置３で、第２の酵素によって切断される。第３のプラスミドは、ＧＦＰ発現カセットの上流にＲＥＨ配列を含み、このプラスミドは、位置４で、第３の酵素によって切断される。この方法において、酵素は同一であっても異なってもよい。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、ＰＶプロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ＰＶプロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にトランスフェクトされ、ここで、消化されたプラスミドがｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）プラスミドは、ｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーションのために、ＰＶ産生細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共に直接トランスフェクトされてもよい（図示せず）。結果として生じる、ＰＶ粒子にパッケージされたＰＶゲノム（右上）は、Ｌｕｃをコードする相補的分岐領域、およびＧＦＰをコードする二重鎖ＤＮＡ領域を含み、単一のプロモーターが各遺伝子の発現を導き、それぞれの遺伝子の下流に別個のポリＡ部位が伴う。したがって、この配置の主な特徴は、プロモーターが２つの遺伝子の転写を同時に駆動することができることである。さらに、この配置のために、２つの遺伝子は、図示される二重鎖形成へと鎖を折り返した後でも発現され続けるであろう。 [0021]図１８は、図１７に概説される一般的なアプローチに基づいて、２つの遺伝子を発現するための単一のプロモーターを含むｃｃｅＡＡＶベクターを産生するための例示的な消化－ライゲーション戦略を示す。３つの異なる出発プラスミドが利用される。第１のプラスミド（つまり、示される最も左のプラスミド）は、ＡＡＶ ＩＴＲおよび５’－３’方向の第１の遺伝子（例えば、Ｌｕｃ）のための発現カセットを含み、このプラスミドは、酵素によって、位置１で切断される。第２のプラスミド（つまり、中間のプラスミド）は、３’－５’方向のタンデムヘッドツーテール配置のＧＦＰ－Ｌｕｃコード領域に隣接するポリＡ部位を含み、このプラスミドは、位置２および位置３で、第２の酵素によって切断される。第３のプラスミドは、ＧＦＰ発現カセットの上流にＡＡＶ ＩＴＲを含み、このプラスミドは、位置４で、第３の酵素によって切断される。この方法において、酵素は同一であっても異なってもよい。プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、ＡＡＶプロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共にコトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、ＡＡＶプロデューサー細胞にトランスフェクトされ、ここで、消化されたプラスミドがｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）プラスミドは、ｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーションのために、ＡＡＶプロデューサー細胞にパルボウイルスヘルパー遺伝子と共に直接トランスフェクトされてもよい（図示せず）。これら３つの経路のいずれかの結果、２つの異なるＡＡＶゲノムが、ＡＡＶ粒子（右上）にパッケージされる。各ゲノムは、Ｌｕｃをコードする相補的分岐領域、およびＧＦＰをコードする二重鎖ＤＮＡ領域を含み、単一のプロモーターが、各遺伝子の発現を導き、それぞれの遺伝子の下流に別個のポリＡ部位が伴う。したがって、この配置の主な特徴は、プロモーターが２つの遺伝子の転写を同時に駆動することができることである。さらに、この配置のために、２つの遺伝子は、図示される二重鎖形成へと鎖を折り返した後でも発現され続けるであろう。 [0022]図１９は、ＴｅｌＮ／ｔｅｌＲＬシステムで作動可能な単一プラスミドを使用する、ｃｃｅＡＡＶベクターを産生するための例示的な方法を示す。プラスミドは、両方の鎖上のステムループ構造を形成するＡＡＶ ＩＴＲ、目的の核酸（ＮＡＯＩまたはＧＯＩ）を含む発現カセット、および下流のポリＡ部位を含み、続いて、ＴｅｌＮ酵素のためのｔｅｌＲＬ部位を含む。ＴｅｌＮ酵素によるプラスミドの切断およびライゲーションにより、中間体である二本鎖閉鎖末端分子が形成される。この分子は、ＡＡＶ産生細胞にトランスフェクトされる際に、図１９に示されるｃｃｅＡＡＶベクターをパッケージするための鋳型分子である。「Ｄ」配列を含むＡＡＶパッケージシグナルは、中間体において、ＩＴＲの５’ではなく、ＩＴＲの３’に構成されるため、図の右上に示すｃｃｅＡＡＶベクターを形成するために、中間体の右側のみが複製およびキャプシド形成に適合する。ＴｅｌＮ酵素は、アデノウイルスなどのウイルスベクターを使用して送達されてもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｅｌＮ反応を行う必要性を回避するためにＡＡＶ産生細胞から発現されてもよい。この設計は、５’末端または３’末端に同一のＩＴＲを含むｃｃｅＰＶベクターの産生にさらに拡張することができる。ｓｈＤＮＡを有するｓｃＡＡＶは、ｓｈＤＮＡ配列がプロテロメラーゼ認識または適合部位と一致している場合にも、この手法を用いて同様に作製することができる。 [0023]図２０は、ＣＥＬｉＤベクターＤＮＡを使用してｃｃｅＡＡＶベクターを産生するための例示的な方法を示す。公開されている出発ＣＥＬｉＤ－ベクターＤＮＡは、設計されたＴｅｌＲＬまたはｒｅｓＴ部位を有することができる。ＴｅｌＮまたはｒｅｓＴ酵素とインキュベートすると、ＡＡＶ産生細胞にトランスフェクトしたときにｃｃｅＡＡＶを産生するために使用することができる２つの線状プラスミドが形成される。１つのＩＴＲのみを有する無末端基質は、ＤＮＡワクチン等の医薬品として直接使用することができる。この戦略を拡張して、ＩＴＲが同一である場合に、ｃｃｅＰＶを産生することもできる。ｐＦＢＧＲ－ｂｓｄまたはＣＥＬｉＤベクターを使用して線状分子を作製するためにバキュロウイルスを使用するプロセスが、文献に記載されている。 [0024]図２１は、テロメア分解酵素ＲｅｓＴを使用してｃｃｅＡＡＶベクター鋳型分子を作製するための例示的な方法を示す。出発プラスミドは、ＡＡＶ ＩＴＲと、酵素ＲｅｓＴによって切断されるＬＬまたはＲＲ切断部位を含む発現カセットを含む二本鎖ドメイン（ＤＳドメイン）とを含む。このことは、ＡＡＶ産生細胞にトランスフェクトされたときにｃｃｅＡＡＶを産生するために使用することができる線状プラスミドの形成をもたらす。ＲｅｓＴは、アデノウイルスなどのウイルスベクターを使用して送達されてもよく、またはＡＡＶ産生細胞から発現されてもよい。左のパネルは、線状分子の複製が、二量体連結部またはテロメア分解（ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）によってプロセシングされる複製テロメア（Ｌ’Ｌ、ＲＲ’）の形成、固有の型のＤＮＡ切断、および再結合反応に至ることを示す。テロメア分解により、線状ＤＮＡ分子の末端にヘアピンテロメアが形成され、二量体複製中間体が、ＤＮＡ複製の単量体産物に分離される。Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）酵素ＲｅｓＴ（テロメラーゼのリゾルバーゼ）は、一例である。 [0025]図２２は、ＡＡＶ ＩＴＲならびにＴｅｌＲおよびＴｅｌＬ結合配列に近接してクローニングされるＤＳドメインを含む線状プラスミドを使用して、ｃｃｅＡＡＶベクター鋳型分子を産生するための例示的な方法を示す。この線状プラスミドは、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）法により、細菌内でまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで大量生産することができる。得られる線状プラスミドは、ＡＡＶプロデューサー宿主細胞におけるｃｃｅＡＡＶベクターの産生に適合する。 [0026]図２３は、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ閉鎖末端（ｃｌｏｓｅ ｅｎｄ）ベクターを有するｓｃＡＡＶを産生するための例示的なライゲーション戦略を示す。まず、ＡＡＶ ＩＴＲならびにｍＴＲおよびｓｈＤＮＡの少なくとも半分を有する出発プラスミドが、断片がｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ配列の半分を有するように消化される。自己ライゲーションは、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを有するｓｃＡＡＶのための鋳型化された分子を生成する。得られる断片は、対応するｓｃＡＡＶ粒子を産生するための３つの異なる経路に供され得る。出発プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され（つまり、線状化され）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄ（および産生細胞株で供給されない追加のアデノウイルスヘルパー遺伝子）と共に、トランスフェクトされるＡＡＶ産生細胞（例えば、２９３、または供給される相補遺伝子を有する任意の他の細胞）にトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され（つまり、線状化され）、ＡＡＶ産生細胞にＲｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にトランスフェクトされ、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）ＡＡＶ産生細胞にＲｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄと共に直接トランスフェクトされ、ここで出発プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで消化され、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよい。ここでの図示は、アデノウイルスヘルパーを使用して２９３細胞で産生されるＡＡＶについての図示である。他のパッケージングシステムとしては、提案される消化／ライゲーション方法に適合するヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスベースのパッケージングシステムが挙げられる。ベクタープラスミドは、消化の前に安定なエピソーム形態で宿主細胞中に存在してもよい。本アプローチは、複製およびパルボウイルス粒子へのパッケージングに直接適合する野生型ＩＴＲ配置を採用するため、ｓｃＡＡＶ産生のための、より効率的なシステムを表す。対照的に、ｓｃＡＡＶを産生するための従来の方法は、二本鎖プラスミドベクターまたはｓｈＤＮＡから鋳型分子を生成する間接スキームに依存する。ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを介した間接的な変換は、ｓｃＡＡＶベクター作製における速度制限的工程を提示する。本アプローチは、本明細書に記載される方法および組成物に従って、他のパルボウイルスにさらに拡張することができる。 [0027]図２４は、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ閉鎖末端ベクターの形態のｓｃＡＡＶを産生するための例示的なライゲーション戦略を示す。ＡＡＶ ＩＴＲをそれぞれ含む２つの出発プラスミドが使用され、それにより、各プラスミドは、消化およびライゲーションされ、示されるように、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを有する構造を形成する。ここで、断片は、自己ライゲーションを回避するように設計され、得られる断片は、対応するｓｃＡＡＶ粒子を産生するための３つの異なる経路に供され得る。出発プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され（つまり、線状化され）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄ（および産生細胞株で供給されない追加のアデノウイルスヘルパー遺伝子）と共に、トランスフェクトされるＡＡＶ産生細胞（例えば、２９３、または供給される相補遺伝子を有する任意の他の細胞）にトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され（つまり、線状化され）、ＡＡＶ産生細胞においてＲｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にトランスフェクトされ、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）ＡＡＶ産生細胞にＲｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄと共に直接トランスフェクトされ、ここで出発プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで消化され、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよい。ここでの図示は、アデノウイルスヘルパーを使用して２９３細胞で産生されたＡＡＶについての図示である。他のパッケージングシステムとしては、提案される消化／ライゲーション方法に適合するヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスベースのパッケージングシステムが挙げられる。ベクタープラスミドは、消化の前に安定なエピソーム形態で宿主細胞中に存在してもよい。上記の通り、このアプローチは、ｓｃＡＡＶ産生のための、より効率的なシステムを表す。 [0028]図２５は、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ閉鎖末端ベクターの形態のｓｃＡＡＶを産生するための例示的なライゲーション戦略を示す。このアプローチは、ＡＡＶ ＩＴＲを有する単一出発プラスミドを利用し、プラスミドは、消化され、合成アダプターにライゲーションされ、図示されるｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを含む構造を形成する。断片は自己ライゲーションを回避するように設計される。合成されたアダプターは、部分的または完全なｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを含み得る。得られた断片は、対応するｓｃＡＡＶ粒子を産生するための３つの異なる経路に供され得る。出発プラスミドは、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され（つまり、線状化され）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされ、次いで、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄ（および産生細胞株で供給されない追加のアデノウイルスヘルパー遺伝子）と共に、トランスフェクトされるＡＡＶ産生細胞（例えば、２９３、または供給される相補遺伝子を有する任意の他の細胞）にトランスフェクトされてもよく；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され（つまり、線状化され）、ＡＡＶ産生細胞においてＲｅｐ、ＣａｐおよびｐＡｄと共にトランスフェクトされ、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよく；または（３）ＡＡＶ産生細胞にＲｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄと共に直接トランスフェクトされ、ここで出発プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで消化され、ｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされてもよい。ここでの図示は、アデノウイルスヘルパーを使用して２９３細胞で産生されるＡＡＶについての図示である。他のパッケージングシステムとしては、提案される消化／ライゲーション方法に適合するヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスベースのパッケージングシステムが挙げられる。ベクタープラスミドは、消化の前に安定なエピソーム形態で宿主細胞中に存在してもよい。上記の通り、このアプローチは、ｓｃＡＡＶ産生のための、より効率的なシステムを表す。 [0029]図２６は、ループのない二本鎖ＡＡＶ ＲＮＡ（パネルＡ、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬ－ｄｓＲＮＡ）または分岐領域を有する二本鎖ＡＡＶ ＲＮＡ（パネルＢ、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬ－ｄｓＲＮＡ）を発現する例示的なｃｃｅＡＡＶを示す。主要な違いは、ベクターが自己相補的構成で示されるとき、転写終結因子部位の位置が、逆方向であることである。転写終結因子部位（ここでは一例としてポリＡを使用）は、逆方向でｄｓＲＮＡ領域の前にある。ベクターが二重鎖形式に変換されるとき、全体の構成は以下の順序になる：ＩＴＲ、ポリＡ（逆）、プロモーター、ｄｓＲＮＡコード領域、プロモーター（逆）、ポリＡ、およびＩＴＲ。一部の特定の場合において、ポリＡまたは転写終結因子部位は、逆方向で、プロモーター領域内に埋め込まれてもよい。イントロンが使用される場合、転写終結因子部位などを、イントロンに埋め込んでもよい。ポリＡまたは転写終結因子部位は、ｄｓＲＮＡコード領域の相補鎖の後の任意の場所にある必要がある。パネルＢは、ｄｓＲＮＡコード領域の異なる構成を示す。パルボウイルスベクターについても、同様のベクターを産生することができる。 [0030]図２７は、長一本鎖領域を有する二本鎖ＡＡＶ ＲＮＡを発現する例示的なｃｃｅＡＡＶを示す（パネルＣ）。 [0031]図２８は、１つのＤＮＡプロモーターと１つの転写終結因子のみを含む、ループのない二本鎖ＡＡＶ ＲＮＡ（パネルＡ、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬ－ｄｓＲＮＡ）を発現する例示的なｃｃｅＡＡＶを示す。ｄｓＲＮＡコード配列のための容量が向上している。このベクターは、脱殻されるとき、すぐにｄｓＲＮＡを発現しない。ｄｓＲＮＡを発現する前に、第２鎖ＤＮＡ合成またはベクターＤＮＡの他の極性へのアニーリング等の工程が必要である。

定義
[0032]本明細書で使用されるとき、用語「パルボウイルス」は、自律複製パルボウイルスおよびディペンドパルボウイルス属のメンバーを含む、パルボウイルス亜科の任意のメンバーに関して使用される。自律複製パルボウイルスには、アムドパルボウイルス属、アベパルボウイルス属、ボカパルボウイルス属、チャッパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、エリスロパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属のメンバーが含まれる。例示的な自律型パルボウイルスとしては、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ウシパルボウイルス（ＢＰＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、トリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ボカウイルス、Ｂ１９ウイルス、ラットウイルス（ＲＶ）、Ｈ－ｌウイルス（Ｈ－ｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。ネコの他の種。他の自律型パルボウイルスは、当業者に既知である。例えば、Ｋｉｎｇ Ａ．Ｍ．Ｑ．、Ａｄａｍｓ Ｍ．Ｊ．、Ｃａｒｓｔｅｎｓ Ｅ．Ｂ．およびＬｅｆｋｏｗｉｔｚ Ｅ．Ｊ．（２０１２）Ｖｉｒｕｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ： ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ： Ｎｉｎｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．）を参照。

[0033]ディペンドパルボウイルス属には、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ－６）、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ等が含まれるが、これらに限定されない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。本発明のパルボウイルス粒子、キャプシドおよびゲノムは、好ましくはＡＡＶ由来である。

[0034]本願で使用されるパルボウイルスには、ＰＶキャプシド遺伝子、非構造遺伝子、逆位末端反復（ＩＴＲ）、左末端ヘアピン（ＬＥＨ）、右末端ヘアピン（ＲＥＨ）においてさらなる修飾を有する遺伝子工学からの新たなバリアントがさらに含まれる。本発明のパルボウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、核酸を細胞に送達するために有用である。特に、本発明のベクターは、核酸を動物細胞に送達または移行するために有利に用いられ得る。目的の核酸（ＮＡＯＩ）としては、ＲＮＡ、ペプチドおよびタンパク質をコードする核酸、好ましくは治療用（例えば、医療用または獣医用）または免疫原性（例えば、ワクチン用）ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸が挙げられる。遺伝子編集のためのＤＮＡ鋳型配列および／または標的化送達のためのアプタマーも提供し得る。

[0035]本明細書で使用されるとき、用語「ハイブリッドパルボウイルス」は、異なる（つまり、別の、異種の、外因性の）パルボウイルスキャプシド内にキャプシド形成されるパルボウイルスゲノムを指す。別言すれば、ハイブリッドパルボウイルスは、異なるパルボウイルスキャプシド内にキャプシド形成されるパルボウイルスゲノムを有する。本明細書で使用されるとき、「異なる」とは、ＡＡＶゲノムが別のパルボウイルスキャプシド内にパッケージされることを意図し、例えば、パルボウイルスキャプシドは、別のＡＡＶ血清型由来または自律型パルボウイルス由来である。

[0036]本明細書で使用されるとき、用語「パルボウイルスＩＴＲ」は、パロウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）複製、キャプシド形成、レスキュー、組込み等を支援する際に機能する、任意のパルボウイルス由来の逆位末端反復を指す。パルボウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲが異なる場合、左末端ヘアピン（ＬＥＨ）、右末端ヘアピン（ＲＥＨ）とも称される。「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムに隣接する逆位末端反復を指す。パルボウイルスＩＴＲおよびＡＡＶ ＩＴＲは、任意のパルボウイルス由来または任意のパルボウイルス血清型由来のＩＴＲを含むことができ、さらに、野生型ＩＴＲと同様のＡＡＶ複製、キャプシド形成、レスキューおよび／または組込みを支援する変異を有するＩＴＲを含むことができる。

[0037]本明細書で使用されるとき、用語「ＡＡＶ血清型」は、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを有するゲノムを伴ってパッケージされた任意のキャプシドを指す。この用語は、天然で見出される任意のＡＡＶ血清型、またはＡＡＶゲノムをパッケージすることができる（ｃａｎ ｐａｃｋｇｉｎ）任意の操作されたまたは化学的に修飾されたキャピド（ｃａｐｉｄ）を含む。この用語は、生物学的または化学的に修飾されたキャプシドを含む。

[0038]用語「ショートヘアピンＤＮＡ」および「ｓｈＤＮＡ」は、米国特許出願公開第２０１８／０２９８３８０号に記載されるｓｈＤＮＡを参照して本明細書で互換的に使用される。

[0039]本明細書で使用されるとき、用語「ｓｃＡＡＶ」は、ＡＡＶのＩＴＲのうちの１つから、末端分解部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ、ＴＲ）の非存在によって生成される二本鎖領域を含む一本鎖ＡＡＶベクターを指し、ＴＲの非存在は、ＴＲが存在しないベクター末端での複製の開始を防止する。ｓｃＡＡＶベクターは、典型的には、各末端に野生型（ｗｔ）ＡＡＶ ＴＲを含み、中間に、二本鎖領域によってＡＡＶ ＴＲに連結された変異型ＴＲ（ｍＴＲ）を含む。用語「ｍＴＲ」および「ｍＩＴＲ」は、米国特許第７，４６５，５８３号に記載される変異型逆位末端反復を意味するように本明細書において互換的に使用される。

[0040]語句「共有結合性閉鎖末端ドメイン」、「ｃｃｅドメイン」、「一本鎖共有結合性閉鎖末端ドメイン」、および「ＳＳ－ＣＣＥドメイン」は、互換的に使用される。
[0041]語句「共有結合性閉鎖末端（ｃｃｅ）パルボウイルス」は、本明細書で使用されるとき、パルボウイルスキャプシドにパッケージされる線状パルボウイルスゲノムを指し、パルボウイルスゲノムは、５’および３’末端に一対のヘアピン構造を形成する自己相補的ＤＮＡ配列、５’および３’末端の間の二本鎖ドメイン（本明細書において「ＤＳドメイン」と称される）、ならびにＳＳ－ＣＣＥ末端を含む。ＤＳドメインは、ゲノムＤＮＡ内で互いにアニールする自己相補的配列で構成される。ＳＳ－ＣＣＥ末端は、ＤＳ ＤＳドメイン内のアニールされた部分を連結する閉じた一本鎖領域を含む非相補的配列を含む。キャプシドは、任意のパルボウイルス血清型を含む、任意のパルボウイルス由来であり得る。好ましい実施形態において、ｃｃｅパルボウイルス（ｃｃｅＰＶ）は、ｃｃｅアデノ随伴ウイルス（ｃｃｅＡＡＶ）である。

[0042]ＤＳドメインにおけるＤＮＡ鎖は、ＤＳドメインの長さにわたって完全に相補的であっても部分的に相補的であってもよく、そのように相補的配列は、互いにアニールして、安定した二重鎖領域を形成することができ、非相補的領域においてバルジ構造またはループ構造を形成し得る。非相補的領域は、ＤＮＡ鎖を自身にアニールした後に固有の一本鎖ＤＮＡ領域が形成され得るように、一方またはその両方のＤＮＡ鎖に欠失または挿入を含んでもよい。得られるステム構造は、ＤＳドメインの長さの少なくとも５％を構成し得る。ｃｃｅＡＡＶとｓｃＡＡＶとの差異は、ｃｃｅＡＡＶが、変異型ＴＲ（ｍＴＲ）を必要としない様式で、より広義に定義され得ることである。ｓｃＡＡＶは、変異型ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）またはｓｈＤＮＡ配列の形態で固有のｃｃｅ末端を有する、本明細書に記載されるより大きなｃｃｅＡＡＶ属内の一種を表す。ｓｃＡＡＶを調製するための方法は、本明細書で定義されるｃｃｅＡＡＶベクターを産生することができない。しかしながら、本願の方法は、新たな中間体鋳型分子が、上記のように、プロデューサー細胞においてより効率的に複製され得る２つの完全な機能的ＩＴＲを採用するため、ｓｃＡＡＶを産生するためのより効率的な手段を提供するというさらなる利点を有する。

[0043]線状変性形態では、ｃｃｅ ＰＶまたはｃｃｅ ＡＡＶは、５’パルボウイルス左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）、ＤＳドメイン、３’パルボウイルス右末端ヘアピン（ＲＥＨ）またはＩＴＲ、ならびに非相補的領域を有し、このことは、線状非変性形態（ｆｒｏｍ）におけるループ構造の形成を説明する。５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、同一であっても異なってもよい。ＤＳドメインは、完全に自己相補性であってもよく、または一部の非相補的配列を有してもよいが、ただし、それ自身への一本鎖折り返しまたはアニーリングによって形成されるＤＳドメインを含む安定な二重鎖の形成を妨げないことを条件とする。ＤＳドメインの相同性は、ｃｃｃＰＶ中のＤＮＡ鎖が互いにアニールするときに、少なくとも１つの領域において安定した二重鎖ＤＮＡが形成されることを可能にするべきである。ＤＳドメイン内のＤＮＡ鎖は、アニールされた配列を含むＤＳドメインの部分にわたって少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の自己相補的（またはこの場合は逆相補的）領域を共有してもよい。しかしながら、ＤＳドメインが、数千ヌクレオチド長の挿入または欠失を含む、自己相補的領域に対する挿入または欠失を収容することができることを考慮すると、ＤＳドメインの一方の末端から他方の末端までの相同性の全体的なレベルは、わずか０．１％であってもまたは１００％と同程度であってもよい。

[0044]用語「アプタマー」は、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子を指す。アプタマーは、通常、大きなランダム配列プールを利用する選択プロセスによって作製され、様々な研究、産業および臨床用途を有する。例えば、アプタマーを、リボザイムと組み合わせて、標的分子の存在下で自己切断が起きるようにすることができる。さらに、天然のアプタマーは、リボスイッチに存在することが知られている。標的リガンドに選択的に結合する従来の機能に加えて、「アプタマー」は、本明細書で使用されるとき、より広義に、デオキシリボザイム、例えば、ＤＮＡ酵素、ＤＮＡザイム、および特定の酵素反応を行うことができるＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む触媒ＤＮＡを含み得る。

[0045]用語「ガイドＲＮＡベースのヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ編集のためのガイドＲＮＡ分子と関連して作用するヌクレアーゼを指す。用語「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ガイドＲＮＡヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、と共にＤＮＡ編集プロセスにおいて使用されるＲＮＡ配列に対して互換的に使用される。

[0046]用語「ガイドＤＮＡベースのヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ編集のためのガイドＤＮＡ分子と関連して使用される構造誘導エンドヌクレアーゼ（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＳＧＮ）を指す。用語「ガイドＤＮＡ」または「ｇＤＮＡ」は、ガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＦｏｋ１エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合したフラップエンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ－ｌ）酵素を含む融合タンパク質などの構造誘導エンドヌクレアーゼ（ＳＧＮ）、と共にＤＮＡ編集プロセスにおいて使用されるＤＮＡ配列に対して互換的に使用される。

[0047]用語「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」および「ＴＡＬＥＮ」は、ＤＮＡ切断ドメインに融合したＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質に対して互換的に使用される。

[0048]本明細書で使用されるとき、用語「メガヌクレアーゼ」は、所与のゲノムにおいて通常は存在しない、大きな認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼを指す。例えば、Ｉ－Ｓｃｅｌメガヌクレアーゼによって認識される１８塩基対配列は、偶然に１回見出される（単一のミスマッチを有する配列は、ヒトサイズのゲノム当たり約３回生じるが）、平均してヒトゲノムのサイズの２０倍のゲノムを必要とする。したがって、メガヌクレアーゼは、最も特異的な、天然に存在する制限酵素であると考えられる。メガヌクレアーゼのうち、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーは、過去１５年間にわたってゲノムおよびゲノム工学の研究のための貴重なツールとなっている。メガヌクレアーゼは、高度に標的化された様式で、配列を置換、除去、または改変するために使用することができる「分子ＤＮＡハサミ」である。タンパク質操作によりそれらの認識配列を改変することにより、標的化配列を変化させることができる。メガヌクレアーゼは、細菌、植物、または動物を問わず、全てのゲノム型を改変するために使用される。それらは、特にヒトの健康の分野、例えば、ウイルス遺伝物質の排除または遺伝子療法を使用する損傷遺伝子の「修復」において、イノベーションに向けた広い道を開いている。

[0049]用語「ヘアピンテロメアリゾルバーゼ」および「プロテロメラーゼ」は、ある特定のファージ、細菌プラスミド、および細菌染色体における線状ＤＮＡ分子の共有結合性閉鎖ヘアピン末端の形成を促進する酵素に対して互換的に使用される。テロメアリゾルバーゼは、チロシンリコンビナーゼおよびＩＢ型トポイソメラーゼとメカニズム的に関連し、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種を特徴付けるゲノム可塑性においても役割を担っていると考えられている。ＤＮＡ分子の重複は、ヘアピンのテロメアリゾルバーゼによって促進されるＤＮＡ切断および再結合反応において認識および処理される複製テロメア（ｒＴｅｌ、二量体接合部とも称される）をもたらす。反応産物は、線状単量体ＤＮＡ分子の両末端にある共有結合性閉鎖ヘアピンテロメアである。テロメアリゾルバーゼとしては、大腸菌ファージＮ１５、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ファージφＫ０２、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）ファージＰＹ５４等のファージ由来のテロメアリゾルバーゼ、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ライムスピロヘータのボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、回帰熱ボレリアのＢ．ヘルムシ（Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ）、Ｂ．パーケリ（Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ）、Ｂ．リカレンティス（Ｂ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、Ｂ．トゥリカタエ（Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅ）、および鳥類スピロヘータのＢ．アンセリーナ（Ｂ．ａｎｓｅｒｉｎａ）等の細菌種由来のテロメアリゾルバーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

[0050]全体的に、本願は、それ自身に折り返されるときに共有結合性閉鎖末端（ｃｃｅ）構成を有し、パルボウイルスキャプシドにパッケージされることができる、単離されたパルボウイルス（ＰＶ）ＤＮＡ分子に関する。さらに、本願は、共有結合性閉鎖末端パルボウイルス（ｃｃｅＰＶ）ベクターを産生するための方法に関する。

[0051]図１、パネル（Ａ）は、目的遺伝子（ＧＯＩ）および３’ポリＡシグナルに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットに隣接する野生型ＩＴＲを含む、従来の二本鎖（ｄｓ）パルボウイルスベクタープラスミド、特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクタープラスミドを示す。パネル（Ａ）のｄｓ ＡＡＶプラスミドの複製により、先ずパネル（Ｂ）に示される一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ ＤＮＡ鋳型が形成され、この鋳型は、次いで、図２に示されるような、第２鎖合成後の導入遺伝子配列の転写／翻訳のための二本鎖ＤＮＡ鋳型に変換される。パネル（Ｃ）は、野生型ＩＴＲ（ｗｔＩＴＲ）と、目的遺伝子（ＧＯＩ）に作動可能に連結されたプロモーターとそれに続く３’ポリＡシグナルを含む発現カセットに隣接する変異型ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を含む、従来のｄｓ自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクタープラスミドを示す。パネル（Ｃ）におけるｄｓ ｓｃＡＡＶプラスミドの複製は、最初に、パネル（Ｄ）に示される一本鎖（ｓｓ）ｓｃＡＡＶ ＤＮＡ鋳型の形成をもたらし、この鋳型は、自身に折り返されて、パネル（Ｄ）の右側に示される二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成し、この二本鎖ＤＮＡ鋳型は、内部の導入遺伝子配列の転写／翻訳のための鋳型を提供する。パネル（Ａ）および（Ｃ）の２つのプラスミドは、細菌宿主中で安定して増殖することができる。

[0052]図２は、異なるＡＡＶ粒子およびそれらの対応するＤＮＡ鋳型からの導入遺伝子発現のための転写－翻訳経路を示す。ＡＡＶ粒子は、図１のパネル（Ｂ）および（Ｄ）に示されるものと同様に、一本鎖ＤＮＡゲノムを伴ってパッケージされる。従来の組換えＡＡＶゲノムは、ＤＮＡ複製および導入遺伝子発現のための二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するための第２鎖ＤＮＡ合成工程を受ける一本鎖ＤＮＡ鋳型である。図２、パネル（Ａ）は、第２鎖合成工程によるｓｓ ＤＮＡからｄｓ ＤＮＡへの変換を示す。パネル（Ｂ）は、パネル（Ａ）に図示される中間第２鎖合成工程なしで導入遺伝子の転写を容易にすることができる、共有結合性閉鎖末端（ＣＣＥ）ドメインを３’末端に有する二重鎖ＤＮＡを含むｓｃＡＡＶを示す。ｓｃＡＡＶ粒子のゲノムは完全に自己相補性であるため、図２のパネル（Ｂ）に示されるように、自身に折り返して変異型ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を閉鎖末端において形成する。したがって、パネル（Ｂ）のＣＣＥドメインは、ｍＩＴＲの形態である。ある特定のｓｃＡＡＶバリアントにおいて、閉鎖ｃｃｅ末端は、ｓｈＤＮＡ配列を含む（図示せず）。パネル（Ｃ）は、本願の一実施形態による例示的なｃｃｅＡＡＶであるｃｃｅＡＡＶ－ゼロループ（ＺＬ）を示す。パネル（Ｃ）の特定の構造も、ＣＣＥドメインおよび完全な自己相補性のゲノムを有し、図２のパネル（Ｃ）に示されるように、自身に折り返して、５’末端の一対のＩＴＲ、二本鎖ドメイン（ＤＳドメイン）、およびＣＣＥドメインを含む二本鎖ＡＡＶを形成する。しかしながら、この場合、ＣＣＥドメインは、ｍＩＴＲまたはｓｈＤＮＡではない。代わりに、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬ中のＣＣＥドメインは、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを必要とせずに設計され、これは、ＡＡＶ（および／またはＰＶ）産生の効率を低下させる。パネル（Ｃ）におけるｃｃｅ末端部は、ＤＳドメインが終了する位置に平滑末端を含むように見える。しかしながら、二重鎖形成における空間立体障害のため、一本鎖ループは少なくとも２つのヌクレオチドを含む。

[0053]ｓｃＡＡＶとは異なり、本願のｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶベクターのＣＣＥドメインは、例えば、ｍＩＴＲまたはｓｈＤＮＡを必要としない。このことは、その他の点では同一のｓｃＡＡＶベクターと比較して、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬにおけるパッケージング容量を増加させることを可能にするだけでなく、以下でさらに説明するように、ｓｃＡＡＶベクターを上回るいくつかの利点を提供する。ｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶゲノムは、４つのエレメント、つまり、５’末端ＩＴＲ（またはＬＥＨ／ＲＥＨ）、二本鎖ＤＮＡドメイン（「ＤＳドメイン」）、３’ＩＴＲ（またはＬＥＨ／ＲＥＨ）、および任意に一本鎖ループ領域を形成する１つまたは複数の非相補的領域に、分割されることができる。より詳細には、ＤＳドメインおよびその相補的ＤＮＡ鎖は、任意の程度の相同性を有することができ、欠失および挿入を含んでもよく、それによって、異なる構造構成を有する広範囲のｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶ分子の形成を可能にする。

[0054]一例として、図３、パネル（Ａ）は、図２、パネル（Ｃ）に示されるｃｃｅＡＡＶ－ＺＬベクターよりもはるかに長い一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡの非相補的領域を含む、ｃｃｅＡＡＶの一実施形態を示す。図３、パネル（Ｂ）は、相補的二本鎖領域内に一本鎖ループ領域（またはバルジ領域）を含む、ｃｃｅＡＡＶの別の例示的な実施形態を示す。非相補的ｓｓ ＤＮＡとしては、アプタマー／ＤＮＡザイムコード配列、ポリペプチドコード配列、ｍｉＲＮＡコード配列、ｓｈＲＮＡコード配列、ポリアデニル化シグナル、またはインシュレーター配列等の任意のＤＮＡ配列を挙げることができる。アプタマー／ＤＮＡザイムは、それに隣接するフランキング相補的ＤＮＡ配列への連結／結合を通じて安定化されてもよい。有利には、ｃｃｅＰＶ－ＬＳまたはｃｃｅＡＡＶ－ＬＳにおける一本鎖ＤＮＡは、遺伝子編集またはＤＮＡ修復用途のための効率的な鋳型を提供する。

[0055]一態様において、共有結合性閉鎖末端パルボウイルス（ｃｃｅＰＶ）は、ＰＶキャプシドにパッケージされたｃｃｅＰＶ ＤＮＡを含む。感染後、導入遺伝子転写のための第２鎖合成は必要ない。これは、ベクターの１つの極性をパッケージするのみのパルボウイルス（ｐａｒｖｏｉｒｕｓ）ベクターにとってさらに有利である。ｃｃｅＰＶゲノムは、（１）３’末端および５’末端を有する第１鎖と、３’末端および５’末端を有する第２鎖とを有する二本鎖（ＤＳ）ドメイン、（２）第１鎖の３’末端に連結された３’末端パルボウイルスＩＴＲ、および（３）第２鎖の５’末端に連結された５’末端パルボウイルスＩＴＲ、ならびに（４）第１鎖の５’末端を第２鎖の３’末端に共有結合的に連結する共有結合性閉鎖末端（ｃｃｅ）ドメインを含む。ＣＣＥドメインは、パルボウイルスがＡＡＶでない場合、任意の配列であることができる。

[0056]本願は、ＤＳドメインにおけるバルジ領域、またはｃｃｅ末端もしくはＣＣＥドメインにおけるｍＴＲもしくはｓｈＤＮＡを有する長ループセグメントを有する、さらなる実施形態を含む。そのようなベクター構築物は、当該技術分野で公知の既存の方法論を使用して作製することはできず、そのような特殊な分子／ベクターは、先行技術では不可能である。

[0057]本願におけるｃｃｅキャプシドおよびｃｃｅゲノムは、同じパルボウイルスに由来してもよく、または異なるパルボウイルスに由来してもよい。一部の実施形態において、本願のｃｃｅキャプシドおよびｃｃｅゲノムは、同じパルボウイルスおよび同じ血清型に由来する（例えば、ＡＡＶ２ベースのキャプシドおよびＡＡＶ２ベースのウイルスゲノム）。一部の実施形態において、本願のｃｃｅキャプシドおよびｃｃｅゲノムは、同じパルボウイルスであるが、異なる血清型に由来する（例えば、ＡＡＶ２ベースのキャプシドおよびＡＡＶ８ベースのウイルスゲノム）。一部の実施形態において、本願のｃｃｅキャプシドおよびｃｃｅゲノムは、異なるパルボウイルスに由来する（例えば、ＡＡＶ２ベースのキャプシドおよびＢｌ９ベースのウイルスゲノム）。一部の実施形態において、ｃｃｅキャプシドは、ＡＡＶキャプシドであり、ｃｃｅゲノムは、ＡＡＶ ＩＴＲを含む組換えＡＡＶゲノムである。

ＤＳドメインおよびＣＣＥドメイン
[0058]一部の実施形態において、本願のパルボウイルスのＤＳドメインの第１鎖および第２鎖は、互いに１００％相補的であり、ＣＣＥドメインは、０～５０ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡからなる（ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬ）。一部の他の実施形態において、ＣＣＥドメインは、０～５、０～１０、０～１５、０～２０、０～２５、０～３０、０～３５、０～４０、０～４５、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１０～３５、１０～４０、１０～４５、１０～５０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、１５～３５、１５～４０、１５～４５、１５～５０、２０～２５、２０～３０、２０～３５、２０～４０、２０～４５、２０～５０、２５～３０、２５～３５、２５～４０、２５～４５、２５～５０、３０～３５、３０～４０、３０～４５、３０～５０、３５～４０、３５～４５、３５～５０、４０～４５、４０～５０または４５～５０ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡからなる。

[0059]一部の実施形態において、本願のパルボウイルスのＤＳドメインの第１鎖および第２鎖は、互いに１００％相補的であり、ＣＣＥドメインは、一本鎖ＤＮＡによって支配される（５０％以上支配される）（ｃｃｅＡＡＶ－ＬＳ）。一部の実施形態において、ＣＣＥドメインは、ＤＮＡアプタマー／ＤＮＡザイムを含む。一部の他の実施形態において、ＣＣＥドメインは、５１～６０、５１～７５、５１～１００、５１～２００、５１～５００、５１～７００、５１～１０００、５１～２０００、５１～３０００、５１～４０００、６０～７５、６０～１００、６０～２００、６０～５００、６０～７００、６０～１０００、６０～２０００、６０～３０００、６０～４０００、７５～１００、７５～２００、７５～５００、７５～７００、７５～１０００、７５～２０００、７５～３０００、７５～４０００、１００～２００、１００～５００、１００～７００、１００～１０００、１００～２０００、１００～３０００、１００～４０００、２００～５００、２００～７００、２００～１０００、２００～２０００、２００～３０００、２００～４０００、５００～７００、５００～１０００、５００～２０００、５００～３０００、５００～４０００、７００～１０００、７００～２０００、７００～３０００、７００～４０００、１０００～２０００、１０００～３０００、１０００～４０００、２０００～３０００、２０００～４０００または３０００～４０００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡからなる。

[0060]一部の実施形態において、本願のパルボウイルスのＤＳドメインの第１鎖および第２鎖は、互いに１００％相補的ではないが、鎖が互いに折り返されるときに、１つまたは複数の領域において安定な二重鎖の形成を可能にする程度の相同性を有する。一部の実施形態において、ＤＳドメインの第１鎖および第２鎖は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を共有する。

[0061]一部の実施形態において、本願のパルボウイルスのＤＳドメインにおける第１鎖は、第２鎖に相補的な１つまたは複数の領域、および第２鎖に相補的でない１つまたは複数の領域を有する（ｃｃｅＡＡＶ－ＢＲ）。一部の実施形態において、第２鎖に相補的でない１つまたは複数の領域は、ｓｈＤＮＡまたはＤＮＡアプタマーを含む。

[0062]一部の実施形態において、本願のパルボウイルスのＤＳドメインにおける第２鎖は、第１鎖に相補的な２つ以上の領域、および第１鎖に相補的でない１つ以上の領域を有する（ｃｃｅＰＶ－ＢＲ）。一部の実施形態において、第１鎖に相補的でない１つ以上の領域は、ｓｈＤＮＡまたはＤＮＡアプタマーを含む。

[0063]一部の実施形態において、ＤＳドメインにおける第１鎖および第２鎖の一方またはその両方は、他方の鎖と比較して欠失または挿入を含む。かかる欠失または挿入は、ＤＳドメインにおけるバルジまたはループＤＮＡ領域の形成を可能にする。一部の実施形態において、バルジＤＮＡ領域は、ｓｈＤＮＡ配列またはＤＮＡアプタマーを含む。一部の実施形態において、複数のバルジまたはループＤＮＡ領域が形成されてもよい。バルジＤＮＡ領域は、ｃｃｅＰＶベクターのパッケージング容量を（他のＤＮＡ配列を伴って）不利に超えない限り、１つまたは複数のヌクレオチドであってもよく、１または複数キロベースまでの長さであってもよい。一部の実施形態において、バルジＤＮＡ配列は、ＤＮＡアプタマーに折り畳むことができる。ＤＳドメインにおける二本鎖領域は、ＤＮＡアプタマーの安定化に役立つ。一部の実施形態において、バルジＤＮＡは、互いに相補的な領域を含み、バルジＤＮＡ領域において二本鎖ステムを形成する。一部の実施形態において、ＤＳドメインにおけるバルジＤＮＡ領域における一本鎖ＤＮＡ配列またはＣＣＥドメインにおける一本鎖ＤＮＡ配列は、遺伝子編集、ＤＮＡ修復またはＤＮＡ組換えのための鋳型として使用される。一部の実施形態において、バルジ領域は、少なくとも２、３または４ヌクレオチド長である。

[0064]一部の実施形態において、ＤＳドメインは、タンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＤＳドメインは、阻害性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）産物、例えば、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする。一部の実施形態において、ＤＳドメインは、それぞれ独立して、約０．２ｋｂ～約３ｋｂのサイズの範囲であり、合わせて最大で４ｋｂ以下の総サイズの、１つまたは複数の発現カセットを含む。

ＩＴＲ
[0065]５’末端ＩＴＲおよび３’末端ＩＴＲは、同一であっても異なってもよい。線状変性形態では、５’末端ＩＴＲはｃｃｅゲノムの５’末端に位置し、３’末端ＩＴＲはｃｃｅゲノムの３’末端に位置する。

[0066]一部の実施形態において、ＩＴＲのうちの１つは、ＤＮＡ複製を支援することができるが、パッケージを開始する機能は失う。これにより、ベクターのプラスおよびマイナス極性のアニーリングが望ましくない場合に必要となる、ベクターの１つの極性を生成させることが可能となる。

ｃｃｅＤＮＡ生成
[0067]ｃｃｅＤＮＡのためのベクターＤＮＡは、ライゲーション反応またはプロテロメラーゼ反応を介して生成される。ライゲーション反応は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。典型的なサブクローニングのためのライゲーションと、本明細書に記載のライゲーションとの間には差がある。本明細書に記載のライゲーションは、典型的に細菌内では安定でない、ｃｃｅベクターＤＮＡのため鋳型分子を生成する。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーション産物が、産生のために直接使用される。あるいは、ベクター産生のためにそれらを使用する前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーション産物を、ＰＣＲまたはＬＡＭＰ増幅を使用してさらに増幅することができる。また、ｉｎ ｖｉｖｏ（宿主細胞）で消化を行い、ライゲーションのために宿主酵素を利用し、続いてベクター産生を行うことができる。

本願のｃｃｅＰＶの構造的利点
[0068]上述のように、ｃｃｅＰＶ鋳型中のＤＮＡ鎖が互いに折り畳まれる／アニールされるとき、本願のＣＣＥパルボウイルスゲノムは、ＤＳドメインの上流のパルボウイルスＩＴＲ／ＬＥＨ／ＲＥＨを有する二本鎖ドメイン（ＤＳドメイン）と、ＤＳドメインの下流の共有結合性閉鎖末端とを含む。本願のｃｃｅＰＶベクターのゲノムは、ＣＣＥドメイン内に任意のヌクレオチドを有することができ、特定のパルボウイルスベクターのサイズ／パッケージング制約特性に基づいて（ＩＴＲおよびＤＳドメインの長さを除き）、０ヌクレオチドから許容される長さまでの任意の長さを収容することができる。さらに、本願のｃｃｅＰＶは、ＤＳドメインにおいて１００％の相補性を必要とせず、ＤＳドメインの任意の位置で分岐したＤＮＡ配列を許容する。

[0069]ｃｃｅＡＡＶの場合、本願のｃｃｅＡＡＶベクターのゲノムは、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡに限定されず、ＣＣＥドメイン内に広範囲の挿入を収容することができる。ＣＣＥドメインにおけるｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ配列の排除は、有効なパッケージング容量を増加させ、プラスミド配列の混入につながり得るｍＴＲまたはｓｈＲＮＡによるウイルスゲノムの非効率的な変換を排除することによって、ベクター品質を改善する。さらに、本願のｃｃｅＡＡＶは、ＤＳドメインにおいて１００％の相補性を必要とせず、ＤＳドメインの任意の位置で分岐したＤＮＡ配列を許容する。

本願のｃｃｅＰＶの機能的利点
[0070]ウイルス産生に専ら必要とされる、ＣＣＥドメイン内のｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを含む自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）と比較して、本願のｃｃｅＡＡＶ内のＣＣＥドメインは、全体が利用可能である。ＣＣＥドメインは、任意の配列を含んでよく、イントロン、プロモーターなどの調節エレメント、遺伝子コード領域、またはｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡ分子をコードするエレメント、リボザイム、ガイドＤＮＡの一部であってもよい。ＣＣＥドメインはまた、機能的ＤＮＡ分子、例えば、遺伝子編集のための一本鎖ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡ誘導エンドヌクレアーゼのためのガイドＤＮＡ、またはＤＮＡアプタマーをコードしてもよい。一部の実施形態において、ＣＣＥドメインは、ｓｈＤＮＡの両末端上の少なくとも１０ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ領域によってＤＳドメインから分離されるｓｈＤＮＡをさらにコードする。一部の実施形態において、ＣＣＥドメインは、２つの異なる発現カセットの発現を駆動するプロモーターを含む。他の実施形態において、ｃｃｅＡＡＶまたはｃｃｅＰＶは、遺伝子発現のオンおよびオフのための遺伝子スイッチとして開発され得る（図１４～１６）。

[0071]本明細書に記載されるｃｃｅＰＶは、プラス鎖およびマイナス鎖のアニーリングならびに第２鎖ＤＮＡ合成のための要件を迂回し、それによって増強されたベクターゲノム安定化および改善された遺伝子発現を提供する利点を有する。

[0072]本願のｃｃｅＰＶのゲノムには自己相補的領域が存在するため、本願のｃｃｅＰＶは、ｉｎ ｖｉｖｏで増強された性能を有する。本願におけるｃｃｅＰＶのゲノムは、一本鎖ＤＮＡパルボウイルスベクターよりも安定である。アプタマー／ＤＮＡザイムがｃｃｅゲノムのＣＣＥドメインに導入される実施形態において、アプタマーは、アプタマー領域がｃｃｅゲノムの自己相補的ＤＳドメインに連結されるため、より安定である。

[0073]図４に示されるように、ＤＳ領域における一致しないヌクレオチド、ＤＳ領域におけるバルジループもしくはステム、またはＣＣＥドメインにおける一本鎖ループを有しないｃｃｅＰＶは、向上した遺伝子発現効率を有する。なぜなら、本願のｃｃｅゲノムは、第２鎖ＤＮＡ合成の必要性を迂回するからである。このことは、そのゲノム内にＤＮＡアプタマーを有するｃｃｅＰＶにとって特に有利であり、なぜなら、多くのパルボウイルスが、マイナスセンスＤＮＡを含み、３’から５’の方向にパッケージされるためである。極性が１つのみである場合、ｃｃｅＰＶゲノム中のＤＮＡアプタマーは相補鎖を有さず、アプタマーの効果は、相補鎖による不利な影響を受けない。

[0074]本発明は、変異型ＩＴＲなしで自己相補的ベクターが作製されることを可能にする。変異型ＩＴＲのレスキューは非効率的であり、望ましくない配列のパッケージも許容される。この新しい発明は、ベクターの収率を向上させるだけでなく、ベクターの品質も向上させる。

[0075]この新しい発明において、産生の材料は、標準のベクターとして、事実上２つのＩＴＲを有し、このことは非常に効率的である。加えて、配列の自己相補的性質上、そのようなＤＮＡは、細菌中で不安定性であるために、細菌において作製されない。加えて、ｃｃｅＡＡＶおよびｃｃｅＰＶのためのヌクレアーゼｉｎ ｖｉｖｏ消化は非常に効率的である。

[0076]本発明は、レスキューのための回文配列またはヘアピンＤＮＡの使用を回避する。これらは、変異型ＩＴＲと同様の利点である。
[0077]本発明は、第２鎖ＤＮＡ合成またはアニーリングに起因するＤＮＡ鋳型変化を介して、宿主細胞内の遺伝子発現の他の制御を可能にする。第２鎖ＤＮＡ合成は、機能性の鋳型を生成または消去させることができる。ＡＡＶゲノムの多くの構成が、本発明によってのみ作製することができる。パルボウイルスベクターは、単一のプロモーターでｄｓＲＮＡを発現させるために使用することができる。

[0078]パルボウイルスベクターでｄｓＲＮＡを産生するために、ベクターにおいて、マイナス鎖内の１つおよびプラス鎖内の１つの、２つのプロモーターを用いることが必要な場合がある。しかしながら、この方法はベクターの容量を低下させ、ｄｓＲＮＡを形成するために分子をアニールさせる必要がある。本発明において、ｄｓＲＮＡは、１つの単一のＲＮＡ転写産物内にあり、１つのプロモーターのみが必要とされる。

ｃｃｅＰＶを作製するための方法
[0079]本願の別の態様は、本願のｃｃｅＰＶを産生するための方法に関する。従来の方法によってｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶベクターを産生するための１つの主要な問題は、ｃｃｅＰＶおよびｃｃｅＡＡＶゲノムを含む即時鋳型分子が、ＤＮＡ反復の長いストレッチのために細菌宿主細胞内で安定でなく、増殖に対して適合性がないことである。従来のｓｃＡＡＶベクタープラスミドは、ＡＡＶ産生の過程で自己相補的領域と併せてｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ配列を組み込むことによって、この問題を回避する。しかしながら、この方法は、ある特定の欠点を有する。例えば、ｓｃＡＡＶベクターゲノムは、ステム領域（本願のｃｃｅＰＶゲノムのＤＳドメインに対応）において完全に相補性である。二本鎖ステム内において、バルジ領域を有することはできない。加えて、ｓｃＡＡＶは、ステム領域の末端（本願のｃｃｅＰＶゲノムのＣＣＥドメインに対応）にｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを有する。ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡの存在は、ｓｃＡＡＶベクターが、ｓｃＡＡＶベクターへのさらなる挿入を受け入れる容量を低下させる。本願の方法は、ＣＣＥドメインにおけるｍＴＲまたはｓｈＤＮＡの必要性を排除する。従来の感覚で使用される場合、ｍＩＴＲまたはｓｈＤＮＡは、挿入ＤＮＡ（つまり、プラスミド二重鎖）を、ｓｃＡＡＶ産生中の複製およびキャプシド形成に適合する直接的ＤＮＡ鋳型に変換するには非効率であり、短いベクターゲノムを有する混入物質をもたらすことも多い。

[0080]ｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶを作製するための出発物質は、プラスミド、酵母シャトルベクター、ウイルスおよび／または化学合成鋳型の形態の１つまたは複数の鋳型ベクターを含む。一実施形態において、出発物質は、１つまたは複数のプラスミドを含み、そのプラスミドの少なくとも１つは、パルボウイルスＩＴＲ、ＬＥＨまたはＲＥＨ、続いてＤＳドメイン、および１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ切断部位を含む。制限部位は、ベクター中に任意の不必要な配列を残さないように設計され得る。鋳型の消化により、ＩＴＲおよびＤＳドメインを含む１つまたは複数のＤＮＡ断片が生成される。図１７に例示される実施形態を含め、一部の実施形態において、プラスミドのうちの１つまたは複数は、パルボウイルスＩＴＲ、ＬＥＨもしくはＲＥＨ、または本明細書に記載されるＤＳドメインを含まない。

[0081]核酸移行用途のための本願によるｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶウイルス粒子を産生するために、複製のためのｃｃｅＰＶ ＤＮＡ鋳型分子を、まず（組換えＤＮＡ技術によって）調製し、続いて、細胞外消化および／またはライゲーション、細胞内消化および／またはライゲーション、またはそれらの組合せに供し、次いで、図５～２２に示されるように、好適なＰＶ産生細胞にトランスフェクトするまたは安定的に組み込む。

[0082]特定の実施形態において、（本明細書に記載されるように）本願のｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶ粒子を産生するための方法は、ＰＶ鋳型分子を、パルボウイルス複製を可能にする条件下で好適な宿主細胞に導入する工程、ｃｃｅＰＶベクター粒子を産生するために十分な条件下で細胞を維持する工程、および培養された宿主細胞からｃｃｅＰＶを収集する工程を含む。

[0083]パルボウイルス複製に好適な条件を提供するために、例えば、ＰＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするパルボウイルスヘルパー遺伝子発現プラスミドが、ＰＶ産生に好適な宿主細胞、例えば、限定されないが、２９３細胞に、一過性にまたは安定的にトランスフェクトされてもよい。あるいは、好適なヘルパーウイルスを宿主細胞に導入して、ＰＶ産生に必要なヘルパーウイルス機能を提供してもよい。

[0084]一部の実施形態において、ｃｃｅＰＶ鋳型分子は、ＰＶ産生に好適な宿主細胞、例えば、限定されないが、２９３細胞に、一過性にまたは安定的にトランスフェクトされてもよい。あるいは、ｃｃｅＰＶ鋳型分子は、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスなどの好適な担体ウイルスの感染によって、宿主細胞に導入されてもよい。

[0085]一部の実施形態において、１つもしくは複数のタンパク質の発現および／または１つもしくは複数の非コード配列の送達のためのｃｃｅＰＶウイルス粒子の遺伝子移入のためのｉｎ ｖｉｖｏ方法は、１つもしくは複数のタンパク質が宿主細胞内で発現されるように、または１つもしくは複数の非コード配列がそれらの意図される目的のために宿主細胞に送達されるように、またはそれらの組合せで、有効量のｃｃｅＰＶウイルス粒子を宿主に投与する工程を含む。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。一部の実施形態において、ｃｃｅＰＶウイルス粒子は、治療を必要とする対象における治療用タンパク質または治療用ＲＮＡをコードする発現カセットを含む核酸を含む。

１． 単一ＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化およびｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーション
[0086]一実施形態において、単一のｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶ鋳型分子は、図５～６に示されるように、ＰＶプロデューサー細胞へのトランスフェクションの前に、細胞外で、消化され、ライゲーションされる。消化された断片は、ＤＮＡリガーゼによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで自己ライゲーションされ得る。これにより、ゼロループ（ＺＬ）配列を有するｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＶを産生するためのＤＮＡ鋳型分子を生成することができる（例えば、図５～６を参照）。

[0087]ＰＶ複製のためのＤＮＡ鋳型は、ＰＶまたはＡＡＶ ＩＴＲ、ＤＳドメイン、および１つまたは複数のヌクレアーゼによって切断される１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ切断部位を含む。切断部位は、制限酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ガイドＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、他のヌクレアーゼ、またはそれらの組合せによって切断されてもよい。次いで、断片は、ＤＮＡリガーゼによってライゲーションされてもよい。得られた断片は、増幅ありまたはなしで、パルボウイルス産生のために使用され得る。増幅方法は、ＰＣＲおよびローリングサイクルｐｈｉ２９型ポリメラーゼを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏであってもよい。

[0088]自己ライゲーションされた断片の、ＰＶまたはＡＡＶベクター粒子産生に適合するＰＶプロデューサー細胞へのトランスフェクションは、本明細書に記載される本発明の主題に従ったｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶの形成をもたらす。パルボウイルス／ＡＡＶベクター産生に必要な他のシスまたはトランス機能は、トランスフェクション、ウイルスベクター送達、またはヘルパー遺伝子の宿主細胞への安定な組込みによって供給される。

２． ２つ以上のＤＮＡ鋳型分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化およびｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーション
[0089]一部の実施形態において、ｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶを産生するための方法は、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む少なくとも１つのＤＮＡ鋳型分子を含む２つ以上のＤＮＡ鋳型分子の使用を含み、１つのＤＳドメインは、図８～１８に示されるように、制限酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ガイドＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、他のヌクレアーゼ、またはそれらの組合せによって切断される。２つ以上の鋳型分子の使用は、ＣＣＥドメイン内に１つまたは複数の伸長したバルジ、ループまたは分岐構造を含むゲノムを有するＰＶまたはＡＡＶ粒子の産生を可能にする。

[0090]分岐またはループを有するｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶを生成するために、典型的には、２つ以上の出発プラスミドが利用される。これは、プラスミド、ウイルスベクター、または合成ＤＮＡ断片の組合せであってもよい。２つの出発プラスミドにおける指定された部位は、同一であってもよく、または全く異なってもよい。混入ｃｃｅベクターをもたらす自己ライゲーションを回避するために、非対称酵素消化、またはクラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９消化が利用される。非対称性および認識配列長は、望ましくない自己ライゲーションを効率的に遮断し得る。

[0091]ライゲーションに使用されるプラスミド由来の２つの断片が存在するため、一般的な分子生物学的技術を使用して、自己ライゲーションを行わないＤＮＡ末端を作製することが不可欠である（制限酵素およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を用いる非対称消化がこの目的を達成する）。断片は、ＤＮＡリガーゼでライゲーションされてもよい。ライゲーションに使用される断片は様々である。得られた断片は、増幅ありまたはなしで、パルボウイルス産生のために使用され得る。増幅方法は、ＰＣＲおよびローリングサイクルｐｈｉ２９型ポリメラーゼを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏであってもよい。

３． ｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーションなしの単一ＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化
[0092]別の実施形態において、プラスミドなどの単一のＤＮＡ鋳型がｉｎ ｖｉｔｒｏで消化され、消化された断片が、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびｐＡｄなどの１つまたは複数のパルボウイルスヘルパー遺伝子と共に（ミニアデノウイルスが追加のヘルパー遺伝子を提供する）、ＡＡＶ産生に好適な宿主細胞にトランスフェクトされる。宿主細胞は、１つまたは複数のこれらのヘルパー遺伝子を用いて、一過性にまたは安定的に形質転換され得る。次いで、宿主の細胞ライゲーション酵素を使用して、トランスフェクトされた断片が、ｉｎ ｖｉｖｏで、細胞内でライゲーションされる。

[0093]少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲおよび１つのＤＳドメインを有するプラスミドは、制限酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ガイドＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、他のヌクレアーゼ、またはそれらの組合せによって切断される。得られた断片は、パルボウイルス産生のための宿主細胞にトランスフェクトされる。宿主細胞リガーゼが、ライゲーションを促進して、ベクター産生のためのベクターＤＮＡ配列を生成する。

４． ｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーションを伴わない、２つ以上のＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化
[0094]少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲおよび１つのＤＳドメインを有する２つのプラスミドは、制限酵素、または他のメガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼで切断される。ライゲーションに使用されるプラスミド由来の２つの断片が存在するため、一般的な分子生物学的技術を使用して、自己ライゲーションを行わないＤＮＡ末端を作製することが不可欠である（制限酵素およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を用いる非対称消化がこの目的を達成する）。得られた断片は、パルボウイルス産生のための宿主細胞にトランスフェクトされる。宿主細胞リガーゼが、ライゲーションを促進して、ベクター産生のためのベクターＤＮＡ配列を生成する。

５． 単一のＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーション
[0095]さらに別の実施形態において、単一のＤＮＡ鋳型分子、例えば、図５～６に示されるような鋳型が、宿主細胞にトランスフェクトされ、その後、宿主細胞中でＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーションが行われる。指定された部位を切断する酵素は、宿主細胞にコトランスフェクトされる。あるいは、酵素は、ワクシニア、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクター、または他の一般的なウイルスベクターおよび非ウイルスベクターによって送達されてもよい。酵素は、物理的方法によって宿主細胞に送達されてもよく、または宿主細胞に組み込まれてもよい。プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏでライゲーションされる場合、消化部位にいくつかの挿入または欠失がみられることが一般的である。一般に、少しの欠失または挿入は、ベクターの性能に影響を与えない。

[0096]特定の実施形態において、対称ゲノムを有するｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶを産生するための方法は、図１９に示されるように、パルボウイルスＩＴＲおよびＤＳドメインを有するｃｃｅ ＤＮＡ分子と共に、宿主細胞に送達される、ＲｅｓＴなどのテロメアリゾルバーゼの使用を含む。テロメアリゾルバーゼの使用は、ｃｃｅＡＡＶまたはｃｃｅＰＶ産生のための鋳型分子の形成を促進することができ、鋳型分子は、ｃｃｅＰＶおよびｃｃｅＡＡＶが産生され得るように、パルボウイルスまたはＡＡＶプロデューサー細胞株にトランスフェクトされ得る。あるいは、パルボウイルスＩＴＲ、ＤＳドメイン、およびテロメアリゾルバーゼ部位を有するＤＮＡ分子が、テロメアリゾルバーゼがｉｎ ｖｉｖｏで発現され得るように、宿主細胞にトランスフェクトされてもよく、またはウイルスベクターによって宿主細胞に送達されてもよく、または宿主細胞に安定して組み込まれてもよい。次いで、テロメアリゾルバーゼは、出発ＤＮＡ分子に作用して、ｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶ産生のための分子を生成する。

[0097]少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲおよび１つのＤＳドメインを有するプラスミドまたはウイルスベクターが、宿主細胞にトランスフェクトされるまたは感染する。制限酵素、または他のメガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、宿主細胞にコトランスフェクトされるか、またはウイルスベクターによって運ばれるか、または宿主細胞に組み込まれ、所望の部位でプラスミドを消化するために使用される。得られた断片は、宿主細胞リガーゼによってライゲーションされ、ベクター産生のためのベクターＤＮＡ配列を生成する。

６． ｉｎ ｖｉｖｏライゲーションまたは２つ以上のＤＮＡ鋳型分子
[0098]少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲおよび１つのＤＳドメインを有する２つのプラスミドまたはウイルスベクターが、宿主細胞にトランスフェクトされるかまたは感染する。制限酵素、または他のメガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはガイドＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、宿主細胞にコトランスフェクトされてもよく、ウイルスベクターによって送達されてもよく、または安定して組み込まれてもよく、宿主細胞において、所望の部位でプラスミドを消化し得る。ライゲーションに使用されるプラスミド由来の２つの断片が存在するため、一般的な分子生物学的技術を使用して、自己ライゲーションを行わないＤＮＡ末端を作製することが不可欠である（制限酵素およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素を用いる非対称消化がこの目的を達成する）。得られた断片は、宿主細胞リガーゼによってライゲーションされ、ベクター産生のためのベクターＤＮＡ配列を生成する。

７． １つまたは複数の組み込まれたＤＮＡ鋳型分子のｉｎ ｖｉｖｏ消化およびｉｎ ｖｉｖｏライゲーション
[0099]この方法では、２つのＤＮＡ断片が、宿主染色体に近接して組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介消化は、それらの間の空間を除去し、必要なベクターの産生を可能にする。

[0100]一実施形態において、パルボウイルスＩＴＲまたはＡＡＶ ＩＴＲは、ＤＳドメインおよび指定された消化部位を伴って、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等のウイルスベクターによって送達される。鋳型分子を消化する酵素は、細胞にトランスフェクトされてもよく、ウイルスベクターによって送達されてもよく、または宿主細胞に安定して組み込まれてもよい。その後、パルボウイルスまたはＡＡＶベクターのための他の必須のエレメントが提供されると、ｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶが産生され得る。

[0101]指定部位を消化するために使用される酵素は、一般的な制限ヌクレアーゼ（参照：制限酵素データベース（Ｔｈｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＲＥＢＡＳＥ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびハイブリッドメガヌクレアーゼ（数万のタンパク質単位を含む大型バンクが作製されている。これらの単位を組み合わせて、標的部位を認識するキメラメガヌクレアーゼを得ることができる）、クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９）システムであってもよい。

[0102]一部の実施形態において、１つまたは複数のｃｃｅＰＶ鋳型分子が、宿主細胞に導入され、宿主細胞染色体に組み込まれる。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ、ＤＳ領域の第１鎖、および指定の消化部位が、宿主細胞染色体の１つの部位に組み込まれる。下流、指定の部位、ＤＳドメインの第２鎖、および３’ＩＴＲが、同じ染色体に組み込まれる。ガイドＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどの好適なヌクレアーゼ酵素による消化は、ｃｃｅＰＶのレスキューおよび産生に適合する２つの領域の間のスペーサー配列を除去する。

ｍＴＲおよびｓｈＤＮＡ配列を有するｓｃＡＡＶを作製するための方法
[0103]上記方法を用いて、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを有するｓｃＡＡＶを産生してもよい。ｓｃＡＡＶを産生するための従来の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでのｒＡＡＶゲノムレスキュー工程中に相補鎖を生成し得るメカニズムを提供するために、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡの包含に依拠する。この変換効率は、相対的に非効率で、ベクター産生を減少させる副産物の形成を引き起こすことも多く、欠陥干渉粒子または短いゲノムを有するベクターの産生をもたらす。

[0104]ｃｃｅＡＡＶまたはｃｃｅＰＶを産生するための上記方法は、本明細書に概説される消化／ライゲーション戦略を用いて、または記載されているテロメアリゾルバーゼアプローチを用いて、ｓｃＡＡＶベクターを産生するために使用することもできる。上述の通り、消化／ライゲーションアプローチは、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを伴うｓｃＡＡＶ産生のための鋳型分子を利用する従来のｓｃＡＡＶ産生方法に対して有利であり、その理由は、本明細書に記載の方法は、２つの完全に機能するＩＴＲを既に有するためである。例えば、本願は、トランスフェクションのための所望の閉鎖末端を有する分子を直接生成することによって、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを有するｓｃＡＡＶを産生するための改善された方法をさらに提供する。これは、閉鎖末端を有する断片の直接ライゲーションによって達成することができる。あるいは、閉鎖末端は、テロメアリゾルバーゼまたはプロテロメラーゼを用いて作製することができる。そのような分子は、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡを有するｓｃＡＡＶベクターを産生するための、より効率的な基質を提供する（図２３～２５およびそれらの付随する図の凡例を参照）。

本願のｃｃｅＰＶおよびｃｃｅＡＡＶの使用方法
[0105]本願の別の態様は、本願のｃｃｅＰＶまたはｃｃｅＡＡＶを用いて治療的病態を処置する方法であって、そのような処置を必要とする対象に、有効量の本願のｃｃｅＰＶを投与する工程を含み、ｃｃｅＰＶは、治療的病態の処置のための治療的利益を有する１つまたは複数の産物を発現する、方法に関する。

他の実施形態
[0106]一部の実施形態において、本願は、５’から３’の方向に、一本鎖形態で、（１）５’末端のパルボウイルス末端反復と、（２）（ａ）プロモーター領域、または（ｂ）ポリＡもしくはポリＴ配列、または（ａ）および（ｂ）の両方を含む第１の調節領域と、（３）第１の異種ヌクレオチド配列と、（４）共有結合性閉鎖末端（ＣＣＥ）ドメインと、（５）第２の異種ヌクレオチド配列と、（６）（ａ）プロモーター領域、または（ｂ）ポリＡもしくはポリＴ配列、または（ａ）および（ｂ）の両方を含む、第１の調節領域と、（７）３’末端のパルボウイルス末端反復とを含むＤＮＡゲノムを有するベクターであって、第１の調節配列が、第２の異種配列と相補的であり、ベクターゲノムにおいて二本鎖領域（ＤＳドメイン）を形成し；ＣＣＥドメインが、（ａ）第１の異種ヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とを連結する単一の共有結合、または（ｂ）一本鎖ＤＮＡ領域であり；かつ、ベクターＤＮＡゲノムが、ベクターゲノムのＤＳドメインから二本鎖（ＤＳ）－ＲＮＡ分子を作製することができる、ベクターに関する。

[0107]一部の実施形態では、ＤＳドメインは、変異型逆位末端反復（ｍＴＲ）配列またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）コード配列由来の２０を超える連続ヌクレオチドの塩基対を含む自己アニールステム部分と連続していない。

[0108]一部の実施形態では、ＣＣＥドメインは、ｍＴＲ配列、またはｓｈＲＮＡコード配列、またはその両方を含まない。
[0109]以下の１から４７まで連続して列挙される項は、本発明の様々な態様および／または実施形態を提供する。

[0110]１． 二重鎖パルボウイルス粒子であって、パルボウイルスキャプシドと、５’から３’の方向に、（ａ）５’末端のパルボウイルス末端反復；（ｂ）３’末端のパルボウイルス末端反復；（ｃ）（ａ）と（ｂ）の末端反復の間の二本鎖（ＤＳ）ＤＮＡドメインであって、第２の異種ヌクレオチド配列にアニールされた、自己相補性の第１の異種ヌクレオチド配列を含むＤＳ－ＤＮＡドメイン；および（ｄ）第１の異種ヌクレオチド配列と第２の異種ヌクレオチド配列との間の一本鎖共有結合閉鎖末端（ＳＳ－ＣＣＥ）ドメインであって、ループ構造を含むＳＳ－ＣＣＥドメインを含むベクターゲノムとを含み、ＤＳドメインが、変異型逆位末端反復（ｍＴＲ）配列またはショートヘアピンＤＮＡ（ｓｈＤＮＡ）配列由来の２０を超える連続ヌクレオチド塩基対を含む自己アニールされたステム部分と連続しておらず、ベクターゲノムが、二重鎖パルボウイルス粒子を産生するために十分なヘルパー機能を発現する宿主細胞に導入されるとき、複製されて二重鎖パルボウイルス粒子を形成することができる、二重鎖パルボウイルス粒子。

[0111]２． ＳＳ－ＣＣＥドメインが、変異型逆位末端反復（ｍＴＲ）またはショートヘアピンＤＮＡ（ｓｈＤＮＡ）配列由来の２０を超える連続ヌクレオチドを含まない、項１に記載のパルボウイルス粒子
[0112]３． ＳＳ－ＣＣＥドメインが、３～４，０００ヌクレオチド、５０～４，０００ヌクレオチド、１，０００～４，０００ヌクレオチド、３～２，０００ヌクレオチド、５０～２，０００ヌクレオチド、２５０～２，０００ヌクレオチド、または５００～２，０００ヌクレオチドを含む、項１または２に記載のパルボウイルス粒子。

[0113]４． ＳＳ－ＣＣＥドメインが、タンパク質またはＲＮＡをコードする配列を含む、項１～３のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。
[0114]５． タンパク質またはＲＮＡをコードする配列が、それに作動可能に連結された下流ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項４に記載のパルボウイルス粒子。

[0115]６． 第１の異種ヌクレオチド配列が、第２の異種ヌクレオチド配列に対して９５％超、９９％超、または１００％の逆相補性を有する、項１～５のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。

[0116]７． ＤＳドメインが、タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、項１～６のいずれか１項に記載のパルボウイルス粒子。
[0117]８． ＤＳドメインが、タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルをさらに含む、項７に記載のパルボウイルス粒子。

[0118]９． ＤＳドメインが、ループ状のまたは分岐した一本鎖ＤＮＡによって中断されている、項１～５のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。
[0119]１０． ループ状のまたは分岐した一本鎖ＤＮＡが、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチドを含む、項９に記載のパルボウイルス粒子。

[0120]１１． タンパク質またはＲＮＡをコードする配列が、それに作動可能に連結された下流ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項１０に記載のパルボウイルス粒子。
[0121]１２． （ａ）のパルボウイルス末端反復が、左末端ヘアピン（ＬＥＨ）を含み、（ｂ）の末端反復が、右末端ヘアピン（ＲＥＨ）を含む、項１～１１のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。

[0122]１３． パルボウイルス末端反復が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、項１～１１のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。
[0123]１４． 項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、（ａ）断片を含むプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復、（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター、および（ｉｉｉ）プラスミド内のヌクレアーゼ切断部位を含む、プラスミドを用意する工程と、（ｂ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、（ｃ）プラスミドを線状にするために十分な条件下で、プラスミドをヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、プラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｄ）プラスミドをＤＮＡリガーゼで自身にライゲーションする工程であって、プラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、（ｅ）工程（ｄ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｃ）および（ｄ）に従って処理されたプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｆ）工程（ｆ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程とを含む方法。

[0124]１５． 断片がパルボウイルスＬＥＨを含む、項１４に記載の方法。
[0125]１６． 断片がＡＡＶ ＩＴＲを含む、項１４に記載の方法。
[0126]１７． プラスミドが断片の下流にサブ断片をさらに含み、サブ断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ｔｅｌＲ結合部位、（ｂ）ＴｅｌＮヌクレアーゼ認識切断部位、および（ｉｉｉ）ｔｅｌｌ結合部位を含み；プラスミドが消化され、ＴｅｌＮ酵素で自己ライゲーションされ；かつプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化および自己ライゲーションされるか、または宿主細胞内で消化および自己ライゲーションされる、項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。

[0127]１８． 項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、（ａ）第１の断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、第１の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；および（ｉｉｉ）第１のプラスミド内の第１のヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、（ｂ）第２の断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、第２の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）右末端ヘアピン（ＲＥＨ）またはＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸；および（ｉｖ）第２のプラスミド内の第２のヌクレアーゼ切断部位を含み、第２の断片が、第１の断片に存在しない１つまたは複数の連続するヌクレオチド塩基対をさらに含むことを除いて、第１の断片と同一である、第２のプラスミドを用意する工程と、（ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、（ｄ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｉｉｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｅ）第２のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｉｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）で消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドをＤＮＡリガーゼでライゲーションする工程であって、消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、（ｇ）工程（ｆ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）～（ｆ）に従って処理された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｈ）工程（ｇ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程とを含む方法。

[0128]１９． 第１の断片がパルボウイルスＬＥＨを含み、第２の断片がパルボウイルスＲＥＨを含む、項１８に記載の方法。
[0129]２０． 第１の断片および第２の断片のそれぞれが、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、項１８に記載の方法。

[0130]２１． 第２の断片が、（ｂ）（ｉｉｉ）と（ｂ）（ｉｖ）との間にサブ断片を含む、項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
[0131]２２． サブ断片が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、項２１に記載の方法。

[0132]２３． 第２の断片が、（ｂ）（ｉｉ）と（ｂ）（ｉｉｉ）との間にサブ断片を含む、項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
[0133]２４． サブ断片が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、項２３に記載の方法。

[0134]２５． 項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、（ａ）第１の断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、第１の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸；（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル；および（ｖ）第１のプラスミド内の第１のヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、（ｂ）第２の断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、第２の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）右末端ヘアピン（ＲＥＨ）またはＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）プロモーター；および（ｉｉｉ）第２のプラスミド内の第２のヌクレアーゼ切断部位を含む、第２のプラスミドを用意する工程と、（ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、（ｄ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｅ）第２のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｉｉｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）で消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドをＤＮＡリガーゼでライゲーションする工程であって、消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、（ｇ）工程（ｆ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）～（ｆ）に従って処理された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｈ）工程（ｇ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程とを含む方法。

[0135]２６． 第１の断片がパルボウイルスＬＥＨを含み、第２の断片がパルボウイルスＲＥＨを含む、項２５に記載の方法。
[0136]２７． 第１の断片および第２の断片のそれぞれが、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、項２５に記載の方法。

[0137]２８． （ａ）（ｉｉｉ）のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。

[0138]２９． 項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、（ａ）第１の断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、第１の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）第１のポリアデニル化シグナル；（ｉｖ）第１のタンパク質または第１のＲＮＡをコードする逆相補的核酸であって、第１のタンパク質および第１のＲＮＡのそれぞれが、右から左への極性を有する、逆相補的核酸；（ｖ）第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸であって、第２のタンパク質および第２のＲＮＡのそれぞれが、左から右への極性を有する、核酸；（ｖｉ）第２のポリアデニル化シグナル；ならびに（ｖｉｉ）第１のプラスミド内の第１のヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、（ｂ）第２の断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、第２の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）右末端ヘアピン（ＲＥＨ）またはＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）（ａ）（ｉｉ）のプロモーター；（ｉｉｉ）第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸であって、第２のタンパク質および第２のＲＮＡのそれぞれが、左から右への極性を有する、核酸；（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル；ならびに（ｖ）第２のプラスミド内の第２のヌクレアーゼ切断部位を含む、第２のプラスミドを用意する工程と、（ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、（ｄ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｖｉｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｅ）第２のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）で消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドをＤＮＡリガーゼでライゲーションする工程であって、消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、（ｇ）工程（ｆ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）～（ｆ）に従って処理された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｈ）工程（ｇ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程とを含む方法。

[0139]３０． 第１の断片がパルボウイルスＬＥＨを含み、第２の断片がパルボウイルスＲＥＨを含む、項２９に記載の方法。
[0140]３１． 第１および第２の断片のそれぞれが、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、項２９に記載の方法。

[0141]３２． （ａ）（ｉｖ）、（ａ）（ｖ）、またはその両方のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

[0142]３３． （ｂ）（ｉｉｉ）のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

[0143]３４． 項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、（ａ）第１の断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、第１の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）左から右への極性を有するプロモーター；（ｉｉｉ）左から右への極性を有する第１のタンパク質または第１のＲＮＡをコードする核酸；（ｉｖ）左から右への極性を有するポリアデニル化シグナル；および（ｖ）第１のプラスミド内の第１のヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、（ｂ）第２の断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、第２の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のヌクレアーゼ切断部位；（ｉｉ）右から左への極性を有する第１のポリアデニル化シグナル；（ｉｉｉ）（ａ）（ｉｉｉ）の第１のタンパク質または第１のＲＮＡをコードする核酸であって、第１のタンパク質または第１のＲＮＡが、右から左への極性を有する核酸；（ｉｖ）第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸であって、第２のタンパク質および第２のＲＮＡのそれぞれが、左から右への極性を有する核酸；（ｖ）第２のポリアデニル化シグナル；および（ｖｉ）第２のヌクレアーゼ切断部位を含み、（ｂ）（ｉ）の切断部位および（ａ）（ｖ）の切断部位が同じである、第２のプラスミドを用意する工程と、（ｃ）第３の断片を含む第３のプラスミドを用意する工程であって、第３の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）左から右への極性を有する、（ａ）（ｉｉ）のプロモーター；（ｉｉｉ）（ｂ）（ｉｖ）の第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸であって、第２のタンパク質および第２のＲＮＡのそれぞれが、左から右への極性を有する、核酸；（ｉｖ）左から右への極性を有するポリアデニル化シグナル；ならびに（ｖ）第３のプラスミドに固有の第３のヌクレアーゼ切断部位を含み、（ｂ）（ｉｖ）の切断部位と、（ｃ）（ｖ）の切断部位が同じである、第３のプラスミドを用意する工程と、（ｄ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、（ｅ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｆ）第２のプラスミドを消化するために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化し、および第２のプラスミドを、（ｂ）（ｖｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｇ）第３のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第３のプラスミドを、（ｃ）（ｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第３のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｈ）線状にされた第１のプラスミド断片、第２の断片、および線状にされた第３のプラスミド断片を、ＤＮＡリガーゼで一緒にライゲーションする工程であって、ライゲーションがｉｎ ｖｉｔｒｏまたは宿主細胞内で行われる、ライゲーションする工程と、（ｉ）工程（ｈ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｅ）～（ｈ）に従って処理された第１のプラスミド、第２のプラスミド、および第３のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｊ）工程（ｉ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程とを含む方法。

[0144]３５． 第１の断片がパルボウイルスＬＥＨを含み、第３の断片がパルボウイルスＲＥＨを含む、項３４に記載の方法。
[0145]３６． 第１の断片および第３の断片のそれぞれが、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、項３４に記載の方法。

[0146]３７． （ａ）（ｉｉｉ）、（ｂ）（ｉｉ）、またはその両方の第１のタンパク質または第１のＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

[0147]３８． （ｂ）（ｉｖ）、（ｃ）（ｉｉｉ）、またはその両方の第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

[0148]３９． 自己相補的ＡＡＶを作製するための方法であって、（ａ）断片を含むプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；（ｉｉｉ）変異型逆位末端反復（ｍＩＴＲ）の少なくとも半分またはショートヘアピンＤＮＡ（ｓｈＤＮＡ）の少なくとも半分；および（ｉｖ）ヌクレアーゼ切断部位を含む、プラスミドを用意する工程と、（ｂ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、（ｃ）プラスミドを線状にするために十分な条件下で、プラスミドをヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、プラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｄ）プラスミドをＤＮＡリガーゼで自身にライゲーションする工程であって、プラスミドが、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ配列を含むヘアピンが形成されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、（ｅ）工程（ｄ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｃ）および（ｄ）に従って処理されたプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｆ）工程（ｆ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程とを含む方法。

[0149]４０． 自己相補的ＡＡＶを作製するための方法であって、（ａ）断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；（ｉｉｉ）部分ｍＴＲまたは部分ｓｈＤＮＡ；および（ｉｖ）ヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、（ｂ）断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；（ｉｉｉ）部分ｍＴＲまたは部分ｓｈＤＮＡ；および（ｉｖ）ヌクレアーゼ切断部位を含む、第２のプラスミドを用意する工程と、（ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、（ｄ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｉｉｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｅ）第２のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｉｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）で消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドをＤＮＡリガーゼでライゲーションする工程であって、消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドが、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ配列を含むヘアピンが形成されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、（ｇ）工程（ｆ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）～（ｆ）に従って処理された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｈ）工程（ｇ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程とを含む方法。

[0150]４１． 自己相補的ＡＡＶを作製するための方法であって、（ａ）断片を含むプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；および（ｉｉｉ）プラスミド内のヌクレアーゼ切断部位を含む、プラスミドを用意する工程と、（ｂ）ｍＩＴＲの少なくとも半分またはｓｈＤＮＡの少なくとも半分を含むＤＮＡ断片を用意する工程と、（ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、（ｄ）プラスミドを線状にするために十分な条件下で、プラスミドを、ヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、プラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、（ｅ）プラスミドをＤＮＡリガーゼでライゲーションする工程であって、プラスミドが、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ配列を含むヘアピンが形成されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、（ｆ）工程（ｅ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）および（ｔ）に従って処理されたプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｇ）工程（ｆ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程とを含む方法。

[0151]４２． ベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、（１）５’末端のパルボウイルス末端反復；（２）（ａ）プロモーター領域、または（ｂ）ポリＡもしくはポリＴ配列、または（ａ）および（ｂ）の両方を含む、第１の調節領域、（３）第１の異種ヌクレオチド配列、（４）共有結合性閉鎖末端（ＣＣＥ）ドメイン、（５）第２の異種ヌクレオチド配列、（６）（ａ）プロモーター領域、または（ｂ）ポリＡもしくはポリＴ配列、または（ａ）および（ｂ）の両方を含む、第１の調節領域、ならびに（７）３’末端のパルボウイルス末端反復を含み、第１の調節配列は第２の異種配列に相補的であり、ベクターゲノムにおいて二本鎖領域（ＤＳドメイン）を形成し、ＣＣＥドメインが、（ａ）第１の異種ヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とを連結する単一の共有結合、または（ｂ）一本鎖ＤＮＡ領域であり、かつベクターゲノムが、ベクターゲノムのＤＳドメインから二本鎖（ＤＳ）－ＲＮＡ分子を作製することができる、ベクターゲノム。

[0152]４３． ＤＳドメインが、変異型逆位末端反復（ｍＴＲ）配列またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）コード配列由来の２０を超える連続ヌクレオチド塩基対を含む自己アニールステム部分と連続していない、項４２に記載のベクターゲノム。

[0153]４４． ＣＣＥドメインが、ｍＴＲ配列、またはｓｈＲＮＡコード配列、またはその両方を含まない、項４２に記載のベクターゲノム。
[0154]４５． ＣＣＥドメインが、０～５０ヌクレオチドを含む、項４２に記載のベクターゲノム。

[0155]４６． ＣＣＥドメインが、５１～４０００ヌクレオチドを含む、項４２に記載のベクターゲノム。
[0156]４７． ｄｓＲＮＡ分子を作製するための方法であって、（１）宿主産生細胞を増殖する工程と、（２）宿主産生細胞に、項４２に記載のベクターゲノムを導入する工程と、（３）宿主産生細胞に、ヘルパー遺伝子を導入する工程と、（４）宿主産生細胞を少なくとも１２時間インキュベートする工程であって、ベクターゲノムがｄｓＲＮＡ分子を発現する、インキュベートする工程とを含む方法。

実施例

ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸ作製方法の比較
[0157]ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸを、ＣＢプロモーターの制御下でＦＩＸを発現するように構築した。ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸは、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬの構成を有する。ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸは、ｓｃＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸを出発物質として使用して構築した。まず、変異型ＩＴＲをｓｃＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸから除去し、Ｉ－ｓｃｅｌ、Ｎｏｔ Ｉ部位およびＣＲ１（ガイドＲＮＡ ｇＣＲｌを使用するｃａｓ９部位）を含む断片に置き換え、プレ－ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸプラスミドを得た。ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸは、以下の方法を使用して作製した。次いで、それらの収率を測定し、それらの性能をｓｃＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸと比較した。

[0158]ライゲーション指針 プレ－ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸをＮｏｔ ＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ＩＴＲを含む断片をライゲーションに使用した。得られたライゲーションされた断片を用いて、アデノウイルスプラスミドおよびｐＲｅｐＣａｐ（ＡＡＶヘルパープラスミド）と共に２９３細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後にベクターを収集し、精製のための標準プロトコルに従った。

[0159]Ｉ－ｓｃｅＩとのｉｎ ｖｉｖｏライゲーション プレ－ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸプラスミドを使用して、アデノウイルスプラスミドおよびｐＲｅｐＣａｐ（ＡＡＶヘルパープラスミド）と共に、２９３－ｉ－ｓｃｅＩ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後にベクターを収集し、精製のための標準プロトコルに従った。２９３－ｉ－ｓｃｅＩは、２９３細胞株においてＩ－ｓｃｅＩヌクレアーゼを安定的に発現する細胞株である。

[0160]Ｃａｓ９支援産生 プレ－ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＦＩＸを使用して、ｐＲｅｐＣａｐ（ＡＡＶヘルパープラスミド）と共に、２９３細胞にトランスフェクトした。その後、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ ｇＣＲｌを有するアデノウイルスを感染させた。アデノウイルス感染の４８時間後にベクターを収集し、精製のための標準プロトコルに従った。

ｄｓＲＮＡ発現のためのｃｃｅＡＡＶ
[0161]ｃｃｅＡＡＶ－ｄｓＲＮＡ発現を図２６に示す。留意すべきことに、ポリＡ部位はアンチセンス鎖にある。ポリＡまたはポリＡ機能等価エレメント（転写終結因子）は、マイナス鎖の任意の場所に配置することができる（例えば、プロモーターの前または後、またはアンチセンス鎖の中間であり得る）。ＡＡＶが自己相補的構成にある場合、ｄｓＲＮＡは発現されない。ｄｓＲＮＡのためのプロモーターは、クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩプロモーターを含む任意のプロモーターであり得る。ＡＡＶ ＤＮＡが第２鎖ＤＮＡ合成またはプラス鎖およびマイナス鎖のアニーリングを経た後、ｄｓＲＮＡが発現される。ｄｓＲＮＡを使用して、細胞応答を誘発するか、または標的遺伝子発現を調節することができる。ｃｃｅＡＡＶ－ＧＦＰ－ｄｓＲＮＡを作製するために、ｐＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰからポリＡ配列を除去し、ＣＢプロモーターの開始時に逆方向にポリＡ配列をクローニングして、ｐＡＡＶ－アンチセンス－ポリＡ－ＣＢ－ＧＦＰを得た。ＧＦＰのｄｓＲＮＡを発現するためのＡＡＶベクターを作製するために、ｐＡＡＶ－アンチセンス－ポリＡ－ＣＢ－ＧＦＰを、Ｎｏｔ ＩおよびＥｃｏＲＶによって消化して、ＩＴＲ－アンチセンス－ポリＡ－ＣＢ－ＧＦＰを有する断片を得て、次いで、断片を、ＡＡＶヘルパーおよびアデノウイルスヘルパープラスミドと共に使用して、２９３細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後９６で、ベクターｃｃｅ－ＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰ－ｄｓＲＮＡを収集した。次いで、得られたベクターをｄｓＲＮＡ発現について試験した。感染の４８時間後にｑＰＣＲによってｄｓＲＮＡ発現を観察した。ｄｓＲＮＡベクターを通常のＧＦＰベクターと同時感染させた場合、これら２つのベクターの比率に応じて、ＧＦＰ発現はｌ０％～９９％低下した。

遺伝子編集のための一本鎖ＤＮＡ鋳型を送達するためのｃｃｅＡＡＶ
[0162]基本構成は図３に示す通りである。ｃｃｅ－ＡＡＶ－ｓｓＧＦＰを作製するために、ライゲーションのための２つの断片を調製した。１つの断片は、遺伝子編集のためのＩＴＲ、３００ｂｐセンス鎖、ｓｓＤＮＡカセット（１３００ｂｐ）を含む。もう一方の断片は、ＩＴＲ、３００ｂｐセンス鎖を含む（ｓｓＤＮＡカセットなし）。次いで、これらの２つの断片をトランスフェクションの前にライゲーションして、ＡＡＶベクターを作製した。次いで、ｃｃｅ－ＡＡＶ－ｓｓＧＦＰを配列決定によって確認した。ｃｃｅ－ＡＡＶ－ＧＦＰを遺伝子編集のためにＣａｓ９－ｇＲＮＡで試験した。ｃｃｅ－ＡＡＶ－ｓｓＧＦＰのＭＯＩに応じて、５～１００倍の改善が認められた。

ｄｓＲＮＡを発現させ、同時にｓｓＤＮＡを送達するためのｃｃｅＡＡＶ
[0163]ｄｓＲＮＡを発現させ、同時にｓｓＤＮＡを送達するためのｃｃｅＡＡＶのプロトタイプについての図を、図２７に示す。一本鎖ＤＮＡは、フランキング領域が二重鎖であるため、より安定である。このスキームは、ＩＴＲ、アンチセンス方向のポリＡ、ＣＢプロモーター、ＧＦＰセンス鎖、および８００ｂｐの一本鎖ＤＮＡ領域を含む１つの断片と、ＩＴＲ、アンチセンス方向のポリＡ、ＣＢプロモーター、およびＧＦＰセンス鎖を含む別の断片とをライゲーションすることによって達成される。ベクターは、ＡＡＶヘルパーおよびミニアデノウイルスプラスミドを伴ったコトランスフェクションによって作製される。ｄｓＲＮＡの発現は、産生されたベクターに感染した細胞で確認される。

ＴｅｌＮに基づくｃｃｅＡＡＶ
[0164]ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰ－ｍｉＲＮＡを、ＣＢプロモーター制御下でｍｉＲＮＡを発現するように構築した。ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰ－ｍｉＲＮＡは、ｃｃｅＡＡＶ－ＺＬの構成を有する。ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰ－ｍｉＲＮＡは、ｓｃＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰを出発物質として使用して構築した。まず、変異型ＩＴＲをｓｃＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰから除去し、Ｉ－ｓｃｅＩ、Ｎｏｔ Ｉ部位、ＴｅｌＲＬおよびＣＲ１（ガイドＲＮＡ ｇＣＲｌを使用するｃａｓ９部位）を含むｍｉＲＮＡ発現断片に置き換え、プレ－ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰ－ｍｉＲＮＡプラスミドを得た。ｃｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰ－ｍｉＲＮＡは、Ｉ－ｓｃｅｌ、Ｎｏｔ Ｉ部位、およびＣＲ１を利用する場合、実施例１に記載のように以下の方法を使用して作製した。ＴｅｌＲＬ部位を利用する場合、前駆体プラスミドをＴｅｌＮ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に、トランスフェクション前の１時間インキュベーションする。新しい方法からの得られるｅｃｅＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰ－ｍｉＲＮＡの収率は、典型的なｓｃＡＡＶ発現ｍｉＲＮＡよりも５～１０倍良好である。混入レベルは、典型的なベクター作製方法よりも５～１０倍低い。

ＤＮＡザイムを有するｃｃｅＡＡＶ
[0165]構築物ｃｃｅＡＡＶ－ＤＮＡザイムは、ｃｃｅＡＡＶ－ＬＳの構成（図３）を使用して構築される。８－１７および１０－２３ＤＮＡザイムを含む、試験されるＤＮＡザイム（Ｓａｎｔｏｒｏ ＳＷ、Ｊｏｙｃｅ ＧＦ（１９９７年４月）「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｕｒｐｏｓｅ ＲＮＡ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ＤＮＡ ｅｎｚｙｍｅ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．９４（９）：４２６２－６．ｄｏｉ： ｌ０．１０７３／ｐｎａｓ．９４．９．４２６２． ＰＭＣ２０７１０． ＰＭＩＤ９１１３９７７）。１０－２３ＤＮＡザイムは、２つの基質認識ドメインが隣接する１５ヌクレオチド触媒コアを含む。このＤＮＡザイムは、対合していないプリンと対合したピリミジンとの間で、配列特異的様式で効率的に相補的ＲＮＡを切断する。１０－２３ＤＮＡザイムは、ライゲーションのために１つの断片にクローニングされる。１つの断片の構成は１．ＩＴＲ、ＣＢ－ＧＦＰ、ポリＡ、－フレキシブルＤＮＡリンカー（５０ｂｐ）、１０－２３ＤＮＡザイムであり、他方の断片は、ＩＴＲ、ＣＢ－ＧＦＰ、ポリＡ、－フレキシブルＤＮＡリンカー（５０ｂｐ）である。このライゲーションは、一本鎖ＤＮＡ領域（対合していない）において１０－２３ＤＮＡザイムを有するｃｃｅＡＡＶゲノムを作製する。１０－２３ＤＮＡザイムの機能は、Ｊｏｙｃｅ’ｓ ｇｒｏｕｐによって公開されている標準プロトコルに従って特徴付けられる。

２つの異なるＩＴＲ（ＬＥＨおよびＲＥＨ）を有するｃｃｅＰＶ
[0166]我々は、３つのバージョンのヒトボカウイルス ウイルス－ｌ（ＨＢｏＶｌ）ベクターを作製した。１つ目は、ｃｃｅＨＢｏＶ－ＬＥＨ２－ＣＢ－ＧＦＰである。これは、ＬＥＨ－ＣＢ－ＧＦＰ断片の自己ライゲーションによって構築され、ＬＥＨの２コピーと自己相補性である。２つ目は、ｃｃｅＨＢｏＶ－ＲＥＨ２－ＣＢ－ＧＦＰである。これは、ＲＥＨ－ＣＢ－ＧＦＰ断片の自己ライゲーションによって構築され、ＲＥＨの２コピーと自己相補性である。３つ目は、ｃｃｅＨＢｏＶ－ＲＥＨ２－ＣＢ－ＧＦＰである。これは、ＲＥＨ－ＣＢ－ＧＦＰ断片およびＬＥＨ－ＣＢ－ＧＦＰによって構築され、導入遺伝子カセットにおいて自己相補性であるが、１つのＲＥＨおよび１つのＬＥＨを有する。得られたプラスミドを、ＨＢｏＶｌヘルパー、およびアデノウイルスヘルパーと共にコトランスフェクトした。他の試薬は複製を容易にする。得られたベクターを、サザンブロットおよびｑＰＣＲにより確認し、２９３細胞に対する感染性を試験した。

ＡＡＶ第２合成またはプラスおよびマイナス極性のアニーリング後の、ＡＡＶを用いたｄｓＲＮＡの発現
[0167]ベクターを、２つの断片、つまりＡＡＶ－ＩＴＲ、ＣＢプロモーター、ＧＦＰ配列を含む第１の断片と、相補的ＧＦＰ配列、ポリＡ配列、およびＡＡＶ ＩＴＲを含む第２の断片とのライゲーションによって構築した。この断片のライゲーションは、ＡＡＶ－ＩＴＲ、ＣＢプロモーター、ＧＦＰ配列、相補的ＧＦＰ配列、ポリＡ配列、およびＡＡＶ ＩＴＲの分子構成をもたらす（宿主細胞におけるその不安定性のために、このプラスミドを、プラスミドとして作製することはできない）。これにより、感染時にｄｓＲＮＡとしてＧＦＰ配列が生成される。第２のＤＮＡ合成なしで発現されるＧＦＰのｄｓＲＮＡの対照は、以下の、ＡＡＶ－ＩＴＲ、相補的ポリＡ配列、ＣＢプロモーター、およびＧＦＰ配列を（順番に）含む第１の断片と、相補的ＧＦＰ配列、相補的ＣＢプロモーター配列、ポリＡ配列、およびＡＡＶ－ＩＴＲを（順番に、本質的に第１の断片である）含む第２の断片とのライゲーションによって作製される。最終分子構成は、ＡＡＶ－ＩＴＲ、相補的ポリＡ配列、ＣＢプロモーター、ＧＦＰ配列、相補的ＧＦＰ配列、相補的ＣＢプロモーター配列、ポリＡ配列、およびＡＡＶ－ＩＴＲである。対照ＡＡＶベクターは、ポリＡおよびプロモーターのための余剰の相補的配列のために、ｄｓＲＮＡの容量が低下している。しかしながら、自己ライゲーションを用いるため、ライゲーションを簡素化する利点がある。

[0168]上記の説明は、当業者に本発明の実施の仕方を教示する目的のためのものであり、本明細書を読んで当業者に明らかとなる明白な改変および変形の全てを詳細に説明することを意図するものではない。しかしながら、そのような明白な改変および変形の全ては、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲に含まれることが意図される。特許請求の範囲は、文脈が特に反対のことを示す場合を除き、そこで意図される目的を満たすために有効な任意の順序で、特許請求される要素および工程を網羅することが意図される。

Claims (47)

1. 二重鎖パルボウイルス粒子であって、
   パルボウイルスキャプシドと、
   ５’から３’の方向に、
   （ａ）５’末端のパルボウイルス末端反復；
   （ｂ）３’末端のパルボウイルス末端反復；
   （ｃ）（ａ）と（ｂ）の末端反復の間の二本鎖（ＤＳ）ＤＮＡドメインであって、第２の異種ヌクレオチド配列にアニールされた、自己相補性の第１の異種ヌクレオチド配列を含むＤＳ－ＤＮＡドメイン；および
   （ｄ）第１の異種ヌクレオチド配列と第２の異種ヌクレオチド配列との間の一本鎖共有結合閉鎖末端（ＳＳ－ＣＣＥ）ドメインであって、ループ構造を含むＳＳ－ＣＣＥドメイン
   を含むベクターゲノムと
   を含み、ＤＳドメインが、変異型逆位末端反復（ｍＴＲ）配列またはショートヘアピンＤＮＡ（ｓｈＤＮＡ）配列由来の２０を超える連続ヌクレオチド塩基対を含む自己アニールされたステム部分と連続しておらず、
   ベクターゲノムが、二重鎖パルボウイルス粒子を産生するために十分なヘルパー機能を発現する宿主細胞に導入されるとき、複製されて二重鎖パルボウイルス粒子を形成することができる、
   二重鎖パルボウイルス粒子。
2. ＳＳ－ＣＣＥドメインが、変異型逆位末端反復（ｍＴＲ）またはショートヘアピンＤＮＡ（ｓｈＤＮＡ）配列由来の２０を超える連続ヌクレオチドを含まない、請求項１に記載のパルボウイルス粒子。
3. ＳＳ－ＣＣＥドメインが、３～４，０００ヌクレオチド、５０～４，０００ヌクレオチド、１，０００～４，０００ヌクレオチド、３～２，０００ヌクレオチド、５０～２，０００ヌクレオチド、２５０～２，０００ヌクレオチド、または５００～２，０００ヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載のパルボウイルス粒子。
4. ＳＳ－ＣＣＥドメインが、タンパク質またはＲＮＡをコードする配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。
5. タンパク質またはＲＮＡをコードする配列が、それに作動可能に連結された下流ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項４に記載のパルボウイルス粒子。
6. 第１の異種ヌクレオチド配列が、第２の異種ヌクレオチド配列に対して９５％超、９９％超、または１００％の逆相補性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。
7. ＤＳドメインが、タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のパルボウイルス粒子。
8. ＤＳドメインが、タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項７に記載のパルボウイルス粒子。
9. ＤＳドメインが、ループ状のまたは分岐した一本鎖ＤＮＡによって中断されている、請求項１～５のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。
10. ループ状のまたは分岐した一本鎖ＤＮＡが、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチドを含む、請求項９に記載のパルボウイルス粒子。
11. タンパク質またはＲＮＡをコードする配列が、それに作動可能に連結された下流ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１０に記載のパルボウイルス粒子。
12. （ａ）のパルボウイルス末端反復が、左末端ヘアピン（ＬＥＨ）を含み、（ｂ）の末端反復が、右末端ヘアピン（ＲＥＨ）を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。
13. パルボウイルス末端反復が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のパルボウイルス粒子。
14. 請求項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、
    （ａ）断片を含むプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復、（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター、および（ｉｉｉ）プラスミド内のヌクレアーゼ切断部位を含む、プラスミドを用意する工程と、
    （ｂ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、
    （ｃ）プラスミドを線状にするために十分な条件下で、プラスミドをヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、プラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｄ）プラスミドをＤＮＡリガーゼで自身にライゲーションする工程であって、プラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｃ）および（ｄ）に従って処理されたプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、
    （ｆ）工程（ｆ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程と
    を含む方法。
15. 断片がパルボウイルスＬＥＨを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 断片がＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項１４に記載の方法。
17. プラスミドが断片の下流にサブ断片をさらに含み、
    サブ断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ｔｅｌＲ結合部位、（ｂ）ＴｅｌＮヌクレアーゼ認識切断部位、および（ｉｉｉ）ｔｅｌｌ結合部位を含み；
    プラスミドが消化され、ＴｅｌＮ酵素で自己ライゲーションされ；かつ
    プラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化および自己ライゲーションされるか、または宿主細胞内で消化および自己ライゲーションされる、
    請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 請求項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、
    （ａ）第１の断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、第１の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；および（ｉｉｉ）第１のプラスミド内の第１のヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、
    （ｂ）第２の断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、第２の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）右末端ヘアピン（ＲＥＨ）またはＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸；および（ｉｖ）第２のプラスミド内の第２のヌクレアーゼ切断部位を含み、第２の断片が、第１の断片に存在しない１つまたは複数の連続するヌクレオチド塩基対をさらに含むことを除いて、第１の断片と同一である、第２のプラスミドを用意する工程と、
    （ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、
    （ｄ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｉｉｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｅ）第２のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｉｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）で消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドをＤＮＡリガーゼでライゲーションする工程であって、消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）～（ｆ）に従って処理された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、
    （ｈ）工程（ｇ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程と
    を含む方法。
19. 第１の断片がパルボウイルスＬＥＨを含み、第２の断片がパルボウイルスＲＥＨを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 第１の断片および第２の断片のそれぞれが、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項１８に記載の方法。
21. 第２の断片が、（ｂ）（ｉｉｉ）と（ｂ）（ｉｖ）との間にサブ断片を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. サブ断片が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、請求項２１に記載の方法。
23. 第２の断片が、（ｂ）（ｉｉ）と（ｂ）（ｉｉｉ）との間にサブ断片を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
24. サブ断片が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、請求項２３に記載の方法。
25. 請求項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、
    （ａ）第１の断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、第１の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸；（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル；および（ｖ）第１のプラスミド内の第１のヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、
    （ｂ）第２の断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、第２の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）右末端ヘアピン（ＲＥＨ）またはＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）プロモーター；および（ｉｉｉ）第２のプラスミド内の第２のヌクレアーゼ切断部位を含む、第２のプラスミドを用意する工程と、
    （ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、
    （ｄ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｅ）第２のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｉｉｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）で消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドをＤＮＡリガーゼでライゲーションする工程であって、消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）～（ｆ）に従って処理された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、
    （ｈ）工程（ｇ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程と
    を含む方法。
26. 第１の断片がパルボウイルスＬＥＨを含み、第２の断片がパルボウイルスＲＥＨを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 第１の断片および第２の断片のそれぞれが、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項２５に記載の方法。
28. （ａ）（ｉｉｉ）のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 請求項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、
    （ａ）第１の断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、第１の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）第１のポリアデニル化シグナル；（ｉｖ）第１のタンパク質または第１のＲＮＡをコードする逆相補的核酸であって、第１のタンパク質および第１のＲＮＡのそれぞれが、右から左への極性を有する、逆相補的核酸；（ｖ）第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸であって、第２のタンパク質および第２のＲＮＡのそれぞれが、左から右への極性を有する、核酸；（ｖｉ）第２のポリアデニル化シグナル；ならびに（ｖｉｉ）第１のプラスミド内の第１のヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、
    （ｂ）第２の断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、第２の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）右末端ヘアピン（ＲＥＨ）またはＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）（ａ）（ｉｉ）のプロモーター；（ｉｉｉ）第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸であって、第２のタンパク質および第２のＲＮＡのそれぞれが、左から右への極性を有する、核酸；（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル；ならびに（ｖ）第２のプラスミド内の第２のヌクレアーゼ切断部位を含む、第２のプラスミドを用意する工程と、
    （ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、
    （ｄ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｖｉｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｅ）第２のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）で消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドをＤＮＡリガーゼでライゲーションする工程であって、消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）～（ｆ）に従って処理された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、
    （ｈ）工程（ｇ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程と
    を含む方法。
30. 第１の断片がパルボウイルスＬＥＨを含み、第２の断片がパルボウイルスＲＥＨを含む、請求項２９に記載の方法。
31. 第１および第２の断片のそれぞれが、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項２９に記載の方法。
32. （ａ）（ｉｖ）、（ａ）（ｖ）、またはその両方のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. （ｂ）（ｉｉｉ）のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
34. 請求項１に記載のパルボウイルス粒子を作製するための方法であって、
    （ａ）第１の断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、第１の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）左から右への極性を有するプロモーター；（ｉｉｉ）左から右への極性を有する第１のタンパク質または第１のＲＮＡをコードする核酸；（ｉｖ）左から右への極性を有するポリアデニル化シグナル；および（ｖ）第１のプラスミド内の第１のヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、
    （ｂ）第２の断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、第２の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のヌクレアーゼ切断部位；（ｉｉ）右から左への極性を有する第１のポリアデニル化シグナル；（ｉｉｉ）（ａ）（ｉｉｉ）の第１のタンパク質または第１のＲＮＡをコードする核酸であって、第１のタンパク質または第１のＲＮＡが、右から左への極性を有する核酸；（ｉｖ）第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸であって、第２のタンパク質および第２のＲＮＡのそれぞれが、左から右への極性を有する核酸；（ｖ）第２のポリアデニル化シグナル；および（ｖｉ）第２のヌクレアーゼ切断部位を含み、（ｂ）（ｉ）の切断部位および（ａ）（ｖ）の切断部位が同じである、第２のプラスミドを用意する工程と、
    （ｃ）第３の断片を含む第３のプラスミドを用意する工程であって、第３の断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）左末端ヘアピン（ＬＥＨ）または逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）左から右への極性を有する、（ａ）（ｉｉ）のプロモーター；（ｉｉｉ）（ｂ）（ｉｖ）の第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸であって、第２のタンパク質および第２のＲＮＡのそれぞれが、左から右への極性を有する、核酸；（ｉｖ）左から右への極性を有するポリアデニル化シグナル；ならびに（ｖ）第３のプラスミドに固有の第３のヌクレアーゼ切断部位を含み、（ｂ）（ｉｖ）の切断部位と、（ｃ）（ｖ）の切断部位が同じである、第３のプラスミドを用意する工程と、
    （ｄ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、
    （ｅ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｆ）第２のプラスミドを消化するために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化し、および第２のプラスミドを、（ｂ）（ｖｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｇ）第３のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第３のプラスミドを、（ｃ）（ｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第３のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｈ）線状にされた第１のプラスミド断片、第２の断片、および線状にされた第３のプラスミド断片を、ＤＮＡリガーゼで一緒にライゲーションする工程であって、ライゲーションがｉｎ ｖｉｔｒｏまたは宿主細胞内で行われる、ライゲーションする工程と、
    （ｉ）工程（ｈ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｅ）～（ｈ）に従って処理された第１のプラスミド、第２のプラスミド、および第３のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、
    （ｊ）工程（ｉ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程と
    を含む方法。
35. 第１の断片がパルボウイルスＬＥＨを含み、第３の断片がパルボウイルスＲＥＨを含む、請求項３４に記載の方法。
36. 第１の断片および第３の断片のそれぞれが、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項３４に記載の方法。
37. （ａ）（ｉｉｉ）、（ｂ）（ｉｉ）、またはその両方の第１のタンパク質または第１のＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. （ｂ）（ｉｖ）、（ｃ）（ｉｉｉ）、またはその両方の第２のタンパク質または第２のＲＮＡをコードする核酸が、３～４，０００塩基対の長さ、５０～４，０００塩基対の長さ、１，０００～４，０００塩基対の長さ、３～２，０００塩基対の長さ、５０～２，０００塩基対の長さ、２５０～２，０００塩基対の長さ、または５００～２，０００塩基対の長さである、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
39. 自己相補的ＡＡＶを作製するための方法であって、
    （ａ）断片を含むプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；（ｉｉｉ）変異型逆位末端反復（ｍＩＴＲ）の少なくとも半分またはショートヘアピンＤＮＡ（ｓｈＤＮＡ）の少なくとも半分；および（ｉｖ）ヌクレアーゼ切断部位を含む、プラスミドを用意する工程と、
    （ｂ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、
    （ｃ）プラスミドを線状にするために十分な条件下で、プラスミドをヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、プラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｄ）プラスミドをＤＮＡリガーゼで自身にライゲーションする工程であって、プラスミドが、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ配列を含むヘアピンが形成されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｃ）および（ｄ）に従って処理されたプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、
    （ｆ）工程（ｆ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程と
    を含む方法。
40. 自己相補的ＡＡＶを作製するための方法であって、
    （ａ）断片を含む第１のプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；（ｉｉｉ）部分ｍＴＲまたは部分ｓｈＤＮＡ；および（ｉｖ）ヌクレアーゼ切断部位を含む、第１のプラスミドを用意する工程と、
    （ｂ）断片を含む第２のプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；（ｉｉｉ）部分ｍＴＲまたは部分ｓｈＤＮＡ；および（ｉｖ）ヌクレアーゼ切断部位を含む、第２のプラスミドを用意する工程と、
    （ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、
    （ｄ）第１のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第１のプラスミドを、（ａ）（ｉｉｉ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第１のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｅ）第２のプラスミドを線状にするために十分な条件下で、第２のプラスミドを、（ｂ）（ｉｖ）のヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、第２のプラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）で消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドをＤＮＡリガーゼでライゲーションする工程であって、消化された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドが、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ配列を含むヘアピンが形成されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）～（ｆ）に従って処理された第１のプラスミドおよび第２のプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、
    （ｈ）工程（ｇ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程と
    を含む方法。
41. 自己相補的ＡＡＶを作製するための方法であって、
    （ａ）断片を含むプラスミドを用意する工程であって、断片が、５’から３’の方向に、（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを含むパルボウイルス末端反復；（ｉｉ）タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター；および（ｉｉｉ）プラスミド内のヌクレアーゼ切断部位を含む、プラスミドを用意する工程と、
    （ｂ）ｍＩＴＲの少なくとも半分またはｓｈＤＮＡの少なくとも半分を含むＤＮＡ断片を用意する工程と、
    （ｃ）目的の核酸に隣接するパルボウイルス末端反復を含む核酸を複製するために十分な１つまたは複数のヘルパー遺伝子を含む宿主細胞を用意する工程と、
    （ｄ）プラスミドを線状にするために十分な条件下で、プラスミドを、ヌクレアーゼ切断部位に特異的なヌクレアーゼ酵素で消化する工程であって、プラスミドがｉｎ ｖｉｔｒｏで消化されるか、または宿主細胞内で消化される、消化する工程と、
    （ｅ）プラスミドをＤＮＡリガーゼでＤＮＡ断片にライゲーションする工程であって、プラスミドが、ｍＴＲまたはｓｈＤＮＡ配列を含むヘアピンが形成されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでライゲーションされるか、または宿主細胞内でライゲーションされる、ライゲーションする工程と、
    （ｆ）工程（ｅ）の完了後にパルボウイルス粒子を産生するために適した条件下で工程（ｄ）および（ｔ）に従って処理されたプラスミドを含む宿主細胞を培養する工程と、
    （ｇ）工程（ｆ）で産生されたパルボウイルス粒子を回収する工程と
    を含む方法。
42. ベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
    （１）５’末端のパルボウイルス末端反復；
    （２）（ａ）プロモーター領域、または（ｂ）ポリＡもしくはポリＴ配列、または（ａ）および（ｂ）の両方を含む、第１の調節領域、
    （３）第１の異種ヌクレオチド配列、
    （４）共有結合性閉鎖末端（ＣＣＥ）ドメイン、
    （５）第２の異種ヌクレオチド配列、
    （６）（ａ）プロモーター領域、または（ｂ）ポリＡもしくはポリＴ配列、または（ａ）および（ｂ）の両方を含む、第１の調節領域、ならびに
    （７）３’末端のパルボウイルス末端反復
    を含み、
    第１の調節配列は第２の異種配列に相補的であり、ベクターゲノムにおいて二本鎖領域（ＤＳドメイン）を形成し、
    ＣＣＥドメインが、（ａ）第１の異種ヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とを連結する単一の共有結合、または（ｂ）一本鎖ＤＮＡ領域であり、かつ
    ベクターゲノムが、ベクターゲノムのＤＳドメインから二本鎖（ＤＳ）－ＲＮＡ分子を作製することができる、
    ベクターゲノム。
43. ＤＳドメインが、変異型逆位末端反復（ｍＴＲ）配列またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）コード配列由来の２０を超える連続ヌクレオチド塩基対を含む自己アニールステム部分と連続していない、請求項４２に記載のベクターゲノム。
44. ＣＣＥドメインが、ｍＴＲ配列、またはｓｈＲＮＡコード配列、またはその両方を含まない、請求項４２に記載のベクターゲノム。
45. ＣＣＥドメインが、０～５０ヌクレオチドを含む、請求項４２に記載のベクターゲノム。
46. ＣＣＥドメインが、５１～４０００ヌクレオチドを含む、請求項４２に記載のベクターゲノム。
47. ｄｓＲＮＡ分子を作製するための方法であって、
    （１）宿主産生細胞を増殖する工程と、
    （２）宿主産生細胞に、請求項４２に記載のベクターゲノムを導入する工程と、
    （３）宿主産生細胞に、ヘルパー遺伝子を導入する工程と、
    （４）宿主産生細胞を少なくとも１２時間インキュベートする工程であって、ベクターゲノムがｄｓＲＮＡ分子を発現する、インキュベートする工程と
    を含む方法。
    

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