JP2022505604A - 抗ｎｐｒ１抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｎｐｒ１抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ１）タンパク質に結合するモノクロナール抗体およびその使用方法を提供する。本発明の種々の実施形態において、抗体は、ＮＰＲ１に結合する完全ヒト抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＮＰＲ１活性を活性化するのに有用であり、そのためヒトにおけるＮＰＲ１関連の疾患、障害または状態を処置または予防する手段を提供する。

Description

本出願は、２０１９年１０月１８日にＰＣＴ国際特許出願として出願されており、２０１８年１０月２３日に出願された米国仮出願第６２／７４９，５５７号、および２０１８年１１月５日に出願された第６２／７５５，７２０号の優先権の利益を主張するものであり、それぞれの開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）に特異的に結合する抗体および抗体の抗原結合性フラグメント、ならびにそれらの抗体を用いた治療および診断方法に関する。
ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１；ＮＰＲ－Ａとしても知られる）は、ＧＴＰからサイクリックＧＭＰへの変換を触媒する酵素であるグアニルシクラーゼ受容体の細胞表面ファミリーに属する。ＮＰＲ１は、腎臓、肺、副腎、血管系、脳、肝臓、内皮および脂肪組織に高度に発現され、心臓では低レベルである。それは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）および脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）への結合によって活性化される。ＮＰＲ１活性化およびシグナル伝達は、多くの組織に関わる多くの生理的反応を引き起こす。ＡＮＰ－ＮＰＲ１システムは、血管弛緩、ナトリウム利尿、利尿、内皮透過性ならびに脂肪分解および免疫細胞機能のような非心血管機能における役割についてよく研究されている（非特許文献１）。ＮＰＲ１が活性化されると、ナトリウム利尿（腎臓による塩分の排泄）が起こり、血圧が低下する。
ＮＰＲ１に対するモノクローナル抗体は、最初に１９９５年にＫｉｔａｎｏらによって非特許文献２に記載された。活性化またはアゴニスト抗ＮＰＲ１抗体は、例えば、特許文献１および特許文献２ならびに特許文献３に開示されている。
ＮＰＲ１タンパク質に高い親和性で特異的に結合し、それを活性化する完全ヒト抗体は、例えば、高血圧、肥満、心不全などの予防や処置に重要な役割を果たす可能性がある。
米国特許第９０９０６９５号 米国特許第２０１６０１６８２５１号 ＷＯ２０１００６５２９３
Ｐｏｔｔｅｒ ２０１１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３０：７１－８２ Ｋｉｔａｎｏら，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．４７：２１５－２２
本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の実施形態では、抗ＮＰＲ１抗体は、ＮＰＲ１に高親和性で結合し、ＮＰＲ１を活性化するか、または活性化されたコンフォメーションを安定化させる完全ヒト抗体である。本発明の抗体は、特に、ＮＰＲ１タンパク質の活性化または活性の増加に有用である。特定の実施形態では、抗体は、対象におけるＮＰＲ１関連の疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を予防、処置または改善するのに有用である。特定の実施形態では、抗体は、ＮＰＲ１関連の疾患または障害を有する、またはそのリスクがある対象に、予防的または治療的に投与され得る。特定の実施形態では、抗体は、高血圧を患っている対象の全身血圧を低下させるために使用される。そのような抗体は、それを必要とする対象に投与したときに、心不全などの障害の治療として使用することができる。
ある特定の実施形態では、抗体は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）または脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の存在下または非存在下でＮＰＲ１に結合し、すなわち、抗体は「ペプチド非依存性結合剤」である。このような抗体は、内因性リガンドの濃度が異なっていても、ＮＰＲ１に結合して活性化させるため使用することができるので有利である。このような抗体は、それを必要とする患者に投与したとき、処置における（リガンド濃度に関する）患者間のばらつきを避けるために有利に使用することができる。さらに、本明細書に開示された抗体は、ＮＰＲ１に高い親和性で結合し、（標準的な治療薬と比較して）改善された薬物動態特性を有する。この抗体は、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、マウスにおいて最大１１日のｔ１／２を示した。この抗体は、それを必要とする対象に投与したときに、血圧を低下させ、低下した血圧を２８日間も維持する効果がある。本発明の抗体の単回投与により、血圧の持続的な低下が得られた。このような抗体は、ＮＰＲ１関連の疾患または障害（例えば、高血圧）を有する対象において、より少ない投与頻度で優れた有効性を提供するために使用することができる。
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であってもよいし、または抗原結合性部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、機能性に影響を与えるために、例えば、宿主中での持続性を高めるために、または残存するエフェクター機能を排除するために、改変してもよい（Ｒｅｄｄｙら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）。特定の実施形態では、抗体は二重特異性であってもよい。
第１の態様では、本発明は、ＮＰＲ１に特異的に結合する単離された組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、抗体またはその抗原結合性フラグメントが水素／重水素交換によって決定されるように、ＮＰＲ１の細胞外ドメイン（配列番号：１９４のアミノ酸２９～３４７）内に含まれる１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用し、抗体またはその抗原結合性フラグメントが（ｉ）心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の存在下または非存在下で、ヒトＮＰＲ１を発現する細胞に結合し、かつ／または、（ｉｉ）ＮＰＲ１に結合し、ＮＰＲ１を活性化する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
本発明の例示的な抗ＮＰＲ１抗体は、本明細書の表１および表２に記載されている。表１は、例示的な抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。表２は、例示的な抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を示す。
本発明は、表１に記載されたＨＣＶＲのアミノ酸配列のいずれかから選択されたアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＨＣＶＲを含む抗体、またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載されたＬＣＶＲのアミノ酸配列のいずれかから選択されたアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含む抗体、またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと対になった表１に記載されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含んでなるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の実施形態によれば、本発明は、表１に記載の例示的な抗ＮＰＲ１抗体のいずれかに含まれるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体、またはその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号：２／１０（例えば、ｍＡｂ２２０３３）、および６６／７４（例えば、ｍＡｂ２２８１０）のうちの１つから選択される。
また、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該ＨＣＶＲが１２個を超えないアミノ酸置換を有する表１に記載のアミノ酸配列を含み、かつ／または該ＬＣＶＲが１０個を超えないアミノ酸置換を有する表１に記載のアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該ＨＣＶＲが表１に記載のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸置換を有する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。別の例では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該ＬＣＶＲが表１に記載のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該ＨＣＶＲが表１に記載のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ／または該ＬＣＶＲが表１に記載のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されたアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載されたＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されたアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載されたＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されたアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されたアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載のＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対になった表１に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含んでなるＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の実施形態によれば、本発明は、表１に記載された例示的な抗ＮＰＲ１抗体のいずれかに含まれるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号：８／１６（例えば、ｍＡｂ２２０３３）、および７２／８０（例えば、ｍＡｂ２２８１０）からなる群から選択される。
また、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該ＨＣＶＲが、表１に記載のアミノ酸配列と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、表１に記載のアミノ酸配列と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および表１に記載のアミノ酸配列と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該ＬＣＶＲが、表１に記載のアミノ酸配列と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、表１に記載のアミノ酸配列と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および表１に記載のアミノ酸配列と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該ＨＣＶＲが、配列番号：４のアミノ酸配列または配列番号：４と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号：６のアミノ酸配列または配列番号：６と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号：８のアミノ酸配列または配列番号：８と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。別の例示的な実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該ＬＣＶＲが、配列番号：１２のアミノ酸配列または配列番号：１２と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号：１４のアミノ酸配列または配列番号：１４と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号：１６のアミノ酸配列または配列番号：１６と１アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、表１に記載の例示的な抗体のいずれかに含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号：４－６－８－１２－１４－１６（例えば、ｍＡｂ２２０３３）、および６８－７０－７２－７６－７８－８０（例えば、ｍＡｂ２２８１０）からなる群から選択される。
関連する実施形態において、本発明は、表１に記載の例示的な抗体のいずれかによって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。例えば、本発明は、配列番号：２／１０（例えば、ｍＡｂ２２０３３）、および６６／７４（例えば、ｍＡｂ２２８１０）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含まれるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技術は、当技術分野でよく知られており、本明細書に開示されて特定されたＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を特定するために使用することができる例示的な規約には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が含まれる。一般的には、Ｋａｂａｔ定義は配列多様性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチの間の妥協点である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）；およびＭａｒｔｉｎら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）に記載されている。また、抗体内のＣＤＲ配列を特定するために、公共のデータベースも利用可能である。
特定の実施形態では、本発明は、ＮＰＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＶＲは、（ｉ）配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が１２個を超えないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列；を含み、ＬＣＶＲは、（ａ）配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列；または（ｄ）配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が１０個を超えないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列；を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
特定の好ましい実施形態では、本発明は、アゴニスト様式でＮＰＲ１に特異的に結合する、すなわち、ＮＰＲ１の結合および／または活性を増強または誘導する抗体を含む。
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＮＰＲ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変が有用であり、すなわち、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能を高めるために、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体が有用でありうる（Ｓｈｉｅｌｄら（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３参照）。他の用途では、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の改変を行うことができる。
特定の実施形態では、本発明は、ＮＰＲ１に対するｐＨ依存性の結合を示す抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。例えば、本発明は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨで高い親和性でＮＰＲ１と結合する（すなわち、酸性ｐＨでは結合が減少する）抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。
また、本発明は、ＮＰＲ１への特異的結合に関して、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントと競合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがそれぞれ、表１に記載されたＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの配列から選択されたアミノ酸配列を有する、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、ＮＰＲ１への結合に関して、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合性フラグメントと交差競合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがそれぞれ、表１に記載されたＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの配列から選択されたアミノ酸配列を有する、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、ＨＣＶＲの３つのＣＤＲおよびＬＣＶＲの３つのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合性フラグメントと同じエピトープに結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントであって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがそれぞれ、表１に記載のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの配列から選択されたアミノ酸配列を有する、抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
また、本発明は、ＮＰＲ１のそのリガンド（例えば、ＡＮＰまたはＢＮＰ）への結合を増加または安定化させる単離された抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、ＮＰＲ１のＡＮＰへの結合を活性化する抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＮＰＲ１上のＡＮＰと同じエピトープに結合してもよいし、またはＮＰＲ１上のＡＮＰと異なるエピトープに結合してもよい。
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ＮＰＲ１の第１のエピトープに対する第１の結合特異性と、ＮＰＲ１の第２のエピトープに対する第２の結合特異性とを含む二重特異性であり、第１のエピトープと第２のエピトープとは区別され、重複していない。
特定の実施形態では、本発明は、以下の特徴：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；（ｂ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰおよび／またはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、６９０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、単量体のヒトＮＰＲ１に結合する；（ｃ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰまたはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、４２ｎＭ未満のＫＤで二量体のヒトＮＰＲ１に結合する；（ｄ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、８０ｎＭ未満のＫＤで、ＡＮＰと複合体形成したヒトＮＰＲ１に結合する；（ｅ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、２０ｎＭ未満のＫＤで、ＢＮＰと複合体形成したヒトＮＰＲ１に結合する；（ｆ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰおよび／またはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、３６５ｎＭ未満のＫＤで、単量体のサルＮＰＲ１に結合する；（ｇ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰまたはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、３０ｎＭ未満のＫＤで、二量体のサルＮＰＲ１に結合する；（ｈ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、１０ｎＭ未満のＫＤで、ＡＮＰと複合体形成したサルＮＰＲ１に結合する；（ｉ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で１０ｎＭ未満のＫＤでＢＮＰと複合形成したサルＮＰＲ１に結合する；（ｊ）マウスＮＰＲ１とは結合しない；（ｋ）ヒトＮＰＲ１（ＡＮＰなし）またはＡＮＰと複合体形成したＮＰＲ１を発現する細胞に、５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する；（ｌ）カルシウムフラックス細胞ベースのバイオアッセイ（ｃａｌｃｉｕｍ ｆｌｕｘ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｂｉｏａｓｓａｙ）で測定されるように、３８５ｎＭ未満のＥＣ５０でＮＰＲ１を活性化する；（ｍ）正常血圧および高血圧のマウスに投与したときに、全身の血圧を低下させ、全身血圧および平均動脈血圧の低下は、単回投与で２８日まで持続する；（ｎ）食事誘発性肥満マウスに投与したときに、耐糖能が改善される；および（ｏ）表１に記載のＨＣＶＲ配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび表１に記載のＬＣＶＲ配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む；の１つまたはそれ以上を有する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
第２の態様では、本発明は、抗ＮＰＲ１抗体またはその一部をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に記載されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に記載されたＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、本発明は、表１に記載されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に記載されたＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、本発明は、表１に記載されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に記載されたＨＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、本発明は、表１に記載されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に記載されたＨＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、本発明は、表１に記載されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に記載されたＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、本発明は、表１に記載されたＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に記載されたＬＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、本発明は、表１に記載されたＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に記載されたＬＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、本発明は、表１に記載されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に記載されたＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、本発明は、ＨＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＨＣＶＲは３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、表１に記載された例示的な抗体のいずれかによって定義された通りである、核酸分子を提供する。
また、本発明は、ＬＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＬＣＶＲは３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、表１に記載された例示的な抗体のいずれかによって定義された通りである、核酸分子を提供する。
また、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子であって、ＨＣＶＲが、表１に記載されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲが、表１に記載されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に記載されたＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列、および表１に記載されたＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。本発明のこの態様による特定の実施形態では、核酸分子はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはいずれも表１に記載された同じ抗ＮＰＲ１抗体に由来する。
関連する態様において、本発明は、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子のいずれか、すなわち、表２に記載されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。特定の実施形態では、本発明は、（ａ）ＮＰＲ１に結合する抗体のＨＣＶＲをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、ＨＣＶＲが表１に記載の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む核酸分子、および／または（ｂ）ＮＰＲ１に結合する抗体のＬＣＶＲをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、ＬＣＶＲが表１に記載の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。また、本発明の範囲には、このようなベクターが導入された宿主細胞、および抗体または抗体フラグメントの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養して抗体またはその一部を産生し、産生された抗体および抗体フラグメントを回収する方法も含まれる。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞または原核生物細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを製造する方法を提供し、該方法は、プロモーターに作動可能に連結された本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントのＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲをコードする核酸配列を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することと、核酸配列の発現に有利な条件で宿主細胞を培養することと、培養液および／または宿主細胞から抗体またはその抗原結合性フラグメントを単離することとを含む。単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、従来技術で知られているいずれかの方法を用いて精製することができる。
第３の態様では、本発明は、ＮＰＲ１に特異的に結合する少なくとも１つの組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの治療有効量と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗ＮＰＲ１抗体と第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＮＰＲ１抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＮＰＲ１抗体と有利に組み合わされる例示的な薬剤には、限定されないが、ＮＰＲ１に結合し、かつ／またはＮＰＲ１活性を活性化する他の薬剤（他の抗体またはその抗原結合性フラグメントなどを含む）、および／または、ＮＰＲ１に直接結合しないが、それにもかかわらず、ＮＰＲ１関連の疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を処置または改善する薬剤（本明細書の他の場所に開示される）が含まれる。本発明の抗ＮＰＲ１抗体を含む追加の併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）および合剤（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）は、本明細書の別の場所に開示されている。
第４の態様では、本発明は、本発明の抗ＮＰＲ１抗体または抗体の抗原結合部分を用いて、対象におけるＮＰＲ１に関連する疾患または障害を処置する治療方法を提供し、該治療方法は、本発明の抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。処置される障害は、ＮＰＲ１活性の増強によって向上、改善、阻害または予防される任意の疾患または状態（例えば、高血圧）である。特定の実施形態では、本発明は、治療上有効な量の本発明の抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合性フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＮＰＲ１関連の疾患または障害を予防または処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＮＰＲ１関連の疾患または障害を有するか、またはそのリスクがある対象に、予防的または治療的に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それを必要とする対象に第２の治療剤と組み合わせて投与される。第２の治療剤は、アルドステロン拮抗剤、アルファ－アドレナリン遮断剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、細動脈拡張剤、自律神経節性血管拡張剤、ベータ－アドレナリン遮断剤、カテコラミン枯渇性交感神経遮断剤、中枢性アルファ－２アドレナリン作動剤、カルシウムチャネル遮断剤、利尿剤、レニン阻害剤、抗凝固剤、抗血小板剤、コレステロール低下剤、血管拡張剤、ジギタリス、手術、埋め込み型デバイス、抗腫瘍療法、インスリン、ＧＬＰ１アゴニスト、メトホルミン、透析、骨髄刺激剤、血液濾過、生活習慣の改善、栄養補助食品、および当技術分野で知られている他の任意の薬物または療法からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、第２の治療剤は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントに関連する可能性のある副作用が発生した場合に、これを打ち消すまたは軽減するのに役立つ薬剤であってもよい。抗体またはそのフラグメントは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、または筋肉内に投与してもよい。抗体またはそのフラグメントは、対象の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与してもよい。特定の実施形態では、本発明の抗体は、１０ｍｇから６００ｍｇの間で構成される１つまたはそれ以上の用量で投与してもよい。
また、本発明は、ＮＰＲ１の結合および／または活性の活性化から恩恵を受ける疾患または障害の処置のための薬剤の製造における、本発明の抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を含む。
他の実施形態は、続く詳細な説明から明らかになる。
正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの収縮期血圧における選択された抗ＮＰＲ１アゴニスト抗体の効果を示す図である。遠隔測定された（ｔｅｌｅｍｅｔｅｒｄ）正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを、体重に基づいて群にランダム化した。動物には、表３０に記載したように、ＮＰＲ１アゴニスト抗体またはＰＢＳ対照を２５ｍｇ／ｋｇで単回皮下注射した。すべての値は、３～７日目のベースラインからの変化の平均値±標準誤差であり、各群あたりｎ＝３～９である。統計－ダネット法による一元配置分散分析； *ｐ＜．０５対ＰＢＳ対照。 正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの収縮期血圧における抗ＮＰＲ１抗体ｍＡｂ２２０３３の効果を示す図である。遠隔測定された正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを体重の等しい５群にランダム化し、表３２に記載の用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下注射した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝４～６。統計－ダネット法による二元配置分散分析。 正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの拡張期血圧における抗ＮＰＲ１抗体ｍＡｂ２２０３３の効果を示す図である。遠隔測定された正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを体重の等しい５群にランダム化し、表３２に記載の用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下注射した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝４～６。統計－ダネット法による二元配置分散分析。 正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの心拍数における抗ＮＰＲ１抗体ｍＡｂ２２０３３の効果を示す図である。遠隔測定された正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを体重の等しい５群にランダム化し、表３２に記載の用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下注射した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝４～６。統計－ダネット法による二元配置分散分析。 正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの平均動脈血圧における抗ＮＰＲ１抗体ｍＡｂ２２０３３の効果を示す図である。テ遠隔測定された正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを体重の等しい５群にランダム化し、表３２に記載の用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下注射した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝４～６。統計－ダネット法による二元配置分散分析。 図６Ａおよび図６Ｂは、正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの左心室機能における抗ＮＰＲ１抗体ｍＡｂ２２０３３の効果を示す図である。遠隔測定された体重の等しい５群にランダム化し、表３２に記載の用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下注射した正常血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにおける収縮末期容積（％）（図６Ａ）；および拡張末期容積（％）（図６Ｂ）。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。心エコー検査は、投与後２８日目に麻酔をかけたマウスの短軸において、高周波超音波システムおよびプローブを用いて行った。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝６～７。統計－ダネット法による一元配置分散分析；*ｐ＜．０５対ＩｇＧ４アイソタイプコントロール。 図７Ａおよび図７Ｂは、正常血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの左心室機能における抗ＮＰＲ１抗体ｍＡｂ２２０３３の効果を示す図である。体重の等しい５群にランダム化し、表３２に記載された用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下注射した、遠隔測定された正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにおける短縮率（％）（図７Ａ）；および駆出率（％）（図７Ｂ）。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。心エコー検査は、投与後２８日目に麻酔をかけたマウスの短軸において、高周波超音波システムおよびプローブを用いて行った。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝６～７。統計－ダネット法による一元配置分散分析。 高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの収縮期血圧における２つの抗ＮＰＲ１抗体の単回投与の効果を示す図である。遠隔測定された高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを収縮期血圧の等しい６群にランダム化し、表３６に記載した用量のｍＡｂ２２０３３またはｍＡｂ２２８１０を単回皮下投与した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝４～６。統計－ダネット法による二元配置分散分析；*ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ２５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；＃ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；！ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２８１０ １９ｍｇ／ｋｇ対コントロール。 高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの拡張期血圧における２つの抗ＮＰＲ１抗体の単回投与の効果を示す図である。遠隔測定された高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを収縮期血圧の等しい６群にランダム化し、表３６に記載した用量のｍＡｂ２２０３３またはｍＡｂ２２８１０を単回皮下投与した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝３～６。統計－ダネット法による二元配置分散分析；*ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ２５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；＃ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；！ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２８１０ １９ｍｇ／ｋｇ対コントロール；％ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２８１０ ５ｍｇ／ｋｇ対コントロール。 高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの心拍数における２つの抗ＮＰＲ１抗体の単回投与の効果を示す図である。遠隔測定された高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを収縮期血圧の等しい６群にランダム化し、表３６に記載した用量のｍＡｂ２２０３３またはｍＡｂ２２８１０を単回皮下投与した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝３～６。統計－ダネット法による二元配置分散分析；*ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ２５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；＃ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ５ｍｇ／ｋｇ対コントロール。 高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの平均動脈血圧における２つの抗ＮＰＲ１抗体の単回投与の効果を示す図である。遠隔測定された高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを収縮期血圧の等しい６群にランダム化し、表３６に記載した用量のｍＡｂ２２０３３またはｍＡｂ２２８１０を単回皮下投与した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝３～６。統計－ダネット法による二元配置分散分析；*ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ２５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；＃ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；！ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２８１０ １９ｍｇ／ｋｇ対コントロール。 高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの収縮期血圧における抗ＮＰＲ１抗体の単回投与および反復投与の効果を示す図である。遠隔測定された高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを収縮期血圧の等しい５群にランダム化し、表４０に記載した用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下投与または週２回３週間のいずれかで投与した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝３～６。矢印はマウスに投与した用量を示す。統計－ダネット法による二元配置分散分析；*ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ２５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；＃ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；！ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ５０ｍｇ／ｋｇ対コントロール。 高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの拡張期血圧における抗ＮＰＲ１抗体の単回投与および反復投与の効果を示す図である。遠隔測定された高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを収縮期血圧の等しい５群にランダム化し、表４０に記載した用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下投与または週２回３週間のいずれかで投与した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝３～６。矢印はマウスに投与した用量を示す。統計－ダネット二元配置分散分析。 高血圧症のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの心拍数における抗ＮＰＲ１抗体の単回投与および反復投与の効果を示す図である。遠隔測定された高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを収縮期血圧の等しい５群にランダム化し、表４０に記載した用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下投与または週２回３週間のいずれかで投与した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝３～６。矢印はマウスに投与した用量を示す。統計－ダネット法による二元配置分散分析。 高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの平均動脈血圧における抗ＮＰＲ１抗体の単回投与および反復投与の効果を示す図である。遠隔測定された高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスを収縮期血圧の等しい５群にランダム化し、表４０に記載した用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下投与または週２回３週間のいずれかで投与した。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝３～６。矢印はマウスに投与した用量を示す。統計－ダネット法による二元配置分散分析；*ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ２５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；＃ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ５ｍｇ／ｋｇ対コントロール；！ｐ＜．０５ ｍＡｂ２２０３３ ５０ｍｇ／ｋｇ対コントロール。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、高血圧症のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの心機能における抗ＮＰＲ１抗体の単回投与および反復投与の効果を示す。収縮期血圧が等しい５つの群にランダム化され、表４０に記載した用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下投与または週２回３週間投与した、遠隔測定された高血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにおける収縮末期容積％（図１６Ａ）；および収縮末期容積％（図１６Ｂ）。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。心エコー検査は、投与後２１日目に、麻酔をかけたマウスに高周波超音波装置およびプローブを用いて短軸において行った。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝５～６。統計－ダネット法による一元配置分散分析。 図１７Ａおよび図１７Ｂは、高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの心機能における抗ＮＰＲ１抗体の単回投与および反復投与の効果を示す図である。収縮期血圧が等しい５群にランダム化し、表４０に記載した用量のｍＡｂ２２０３３を単回皮下投与または週２回３週間投与した、遠隔測定された高血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにおける短縮率（％）（図１７Ａ）；および駆出率（％）（図１７Ｂ）。アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ４抗体を用いた。心エコー検査は、投与後２１日目に、麻酔をかけたマウスに高周波超音波装置およびプローブを用いて短軸において行った。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝５～６。統計－ダネット法による一元配置分散分析。 図１８Ａは、ｍＡｂ２２８１０ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂの投与後の体重の変化を示す図である。図１８Ｂおよび図１８Ｃは、それぞれＥｃｈｏＭＲＩによって測定された、投与６週間後の総脂肪量および総除脂肪量を示す図である。ＮＰＲ１ヒト化マウスは、６０％高脂肪食を１０週間摂取させることで肥満にした。この期間の後，マウスを体重の等しい３群にランダム化し、表４４に示す用量および頻度で皮下注射の処置を行った。アイソタイプコントロールとしてヒトＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝１０である。*＝Ｐ＜０．０５対アイソタイプコントロール；**＝Ｐ＜０．０１対アイソタイプコントロール。体重については二元配置分散分析＋Ｔｕｋｅｙ、脂肪量と除脂肪量については一元配置分散分析＋Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉによる統計。 図１９Ａ、図１９Ｂおよび図１９Ｃは、ｍＡｂ２２８１０ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂのいずれかで１週間処理した後の各昼／夜サイクルの平均値として分類された、ＶＯ２（図１９Ａ）、ＶＣＯ２（図１９Ｂ）またはエネルギー消費量（図１９Ｃ）の変化を示す図である。投与１週間後、各群のマウスをＣｏｌｕｍｂｉａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ代謝ケージシステム（ＣＬＡＭＳ）に１週間入れ、代謝パラメータを記録した。マウスは、ストレスを最小限にするため、測定の１週間前からケージに馴らした。アイソタイプコントロールとしてヒトＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝５～６。**＝Ｐ＜０．０１対アイソタイプコントロール、***＝Ｐ＜０．００１対アイソタイプコントロール。一元配置分散分析＋Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉによる統計。 図２０Ａは、ｍＡｂ２２８１０ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂのいずれかで２週間処置した後の、経口ブドウ糖負荷試験（グルコース２ｇ／ｋｇ）によって測定される耐糖能の変化を示す。図２０Ｂは、Ａの試験開始時に記録した一晩絶食後の血糖値を示す。２週間の処置後、各群のマウスを清潔なケージ内で一晩絶食させ、翌朝、２ｇ／ｋｇの経口グルコース負荷を与えた。その後、Ｔ０、Ｔ１５、Ｔ３０、Ｔ６０、Ｔ９０、Ｔ１２０において、手持ちのグルコメーターを用いて尾静脈からグルコースを記録した。アイソタイプコントロールとして、ヒトＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、各群ｎ＝１０。ｈＦｃ．ＦＧＦ２群：**＝Ｐ＜０．０１対アイソタイプコントロール、***＝Ｐ＜０．００１対アイソタイプコントロール、****＝Ｐ＜０．０００１対アイソタイプコントロール。ｍＡｂ２２８１０群：＋＋＝Ｐ＜０．０１対アイソタイプコントロール。ｏＧＴＴについては二元配置分散分析＋Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ、空腹時血糖値については一元配置分散分析＋Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉによる統計。 図２１Ａは、ｍＡｂ２２０３３ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂの投与後の体重の変化を示す。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、ＥｃｈｏＭＲＩで測定した、処置６週間後の総脂肪量および総除脂肪量をそれぞれ示す。ＮＰＲ１ヒト化マウスに、６０％高脂肪食を１０週間摂取させることで肥満にした。この期間の後，マウスを体重の等しい３つの群にランダム化し、表４５に記載した用量および頻度で皮下注射の処置を行った。アイソタイプコントロールとしてヒトＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝１０である。*＝Ｐ＜０．０５対アイソタイプコントロール、****＝Ｐ＜０．０００１対アイソタイプコントロール。体重については二元配置分散分析＋Ｔｕｋｅｙ、脂肪量と除脂肪量については一元配置分散分析＋Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉによる統計。 図２２Ａ、図２２Ｂおよび図２２Ｃは、ｍＡｂ２２０３３ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂのいずれかで１週間処置した後の、ＶＯ２（図２２Ａ）、ＶＣＯ２（図２２Ｂ）またはエネルギー消費量（図２２Ｃ）の変化を、各昼／夜サイクルの平均値として分割して示した図である。投与１週間後、各群のマウスをＣｏｌｕｍｂｉａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのメタボリックケージシステム（ＣＬＡＭＳ）に１週間入れ、代謝パラメータを記録した。マウスは、ストレスを最小限にするため、測定前の１週間ケージに慣らした。アイソタイプコントロールとしてヒトＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、１群あたりｎ＝５～６。****＝Ｐ＜０．０００１対アイソタイプコントロール。一元配置分散分析＋Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉによる統計。 図２３Ａおよび２３Ｂは、血糖値（図２３Ａ）および空腹時血糖値（図２３Ｂ）によって示される、耐糖能における抗ＮＰＲ１抗体ｍＡｂ２２０３３の効果を示す。４週間の処置後、各群のマウスを清潔なケージ内で一晩絶食させ、翌朝、２ｇ／ｋｇの経口グルコース負荷を与えた。その後、Ｔ０、Ｔ１５、Ｔ３０、Ｔ６０、Ｔ９０およびＴ１２０において、手持ちのグルコメーターを用いて尾静脈からグルコースを記録した。アイソタイプコントロールとして、ヒトＩｇＧ４抗体を用いた。すべての値は平均値±標準誤差、各群ｎ＝１０。ｈＦｃ．ＦＧＦ２１群：***＝Ｐ＜０．００１対アイソタイプコントロール、****＝Ｐ＜０．０００１対アイソタイプコントロール。ｍＡｂ２２０３３群：＋＝Ｐ＜０．０５対アイソタイプコントロール、＋＋＝Ｐ＜０．０１対アイソタイプコントロール。ｏＧＴＴは二元配置分散分析＋Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ、空腹時血糖は一元配置分散分析＋Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉによる統計。
本発明の方法を記載する前に、本発明は、特定の方法、および記載された実験条件に限定されるものではなく、そのような方法および条件は変更されうることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図したものではないことを理解されたい。
特に定義されていない限り、本明細書に使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を持つ。本明細書に記載されたものと類似のまたは同等のあらゆる方法および材料が、本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書に記載されたすべての出版物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
定義
用語「ＮＰＲ１」は、「ＮＰＲＡ」とも呼ばれ、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａとも呼ばれる）のことである。ＮＰＲ１は、ホモ二量体の膜貫通型グアニル酸シクラーゼであり、ｃＧＭＰの合成を触媒する酵素である。ＮＰＲ１は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）および脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の両方の受容体であり、リガンドの結合に伴い、細胞外ドメインの構造変化を起こす（Ｏｇａｗａら ２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２８６２５－３１）。このタンパク質は、細胞外リガンド結合ドメイン、単一の膜貫通領域、細胞内タンパク質キナーゼ様相同ドメイン、およびグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを含む４つの異なる領域を有する。完全長のＮＰＲ１タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔに受入番号Ｐ１６０６６．１（配列番号：１９３）として提供されているアミノ酸配列によって例示される。用語「ＮＰＲ１」は、組換えＮＰＲ１タンパク質またはそのフラグメントを含む。また、この用語は、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトＦｃ、またはＲＯＲ１（例えば、配列番号：１９４～１９９）などのシグナル配列に結合したＮＰＲ１タンパク質またはそのフラグメントを包含する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合で相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖で構成される免疫グロブリン分子（すなわち「完全な抗体分子」）、ならびにその多量体（例えばＩｇＭ）またはその抗原結合性フラグメントを指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（「ＣＬ」）で構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらにフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の高い領域と、その領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域とに分けることができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。本発明のある実施形態では、抗体（またはその抗原結合性フラグメント）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列の配列と同一であってもよいし、天然もしくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸共通配列は、２つまたはそれ以上のＣＤＲのサイド－バイ－サイド分析（ｓｉｄｅ－ｂｙ－ｓｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいて定義してもよい。
１つもしくはそれ以上のＣＤＲ残基の置換または１つもしくはそれ以上のＣＤＲの省略も可能である。結合のため１つまたは２つのＣＤＲを省略することができる抗体が、科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎら（１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９）は、公開されている結晶構造に基づいて、抗体とその抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約５分の１から３分の１だけが実際に抗原に接触すると結論付けた。また、Ｐａｄｌａｎは、１つまたは２つのＣＤＲが抗原と接触するアミノ酸を持たない多くの抗体を発見した（またＶａｊｄｏｓら ２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照のこと）。
抗原に接触していないＣＤＲ残基は、先行研究に基づいて（例えば、ＣＤＲＨ２のＨ６０－Ｈ６５残基は必要ないことが多い）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から、分子モデリングおよび／または経験的に同定することができる。ＣＤＲまたはその残基が省略された場合は、通常、他のヒト抗体配列またはそのような配列の共通認識において対応する位置を占めるアミノ酸で置換される。ＣＤＲ内の置換位置および置換するアミノ酸は、経験的に選択することもできる。経験的な置換は、保存的置換または非保存的置換であることができる。
本明細書に開示された完全ヒト抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体は、対応する生殖細胞系列の配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含んでもよい。そのような変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、例えば公的な抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列の配列と比較することにより、容易に確認することができる。本発明には、本明細書に開示されたアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合性フラグメントが含まれ、ここでは、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸が、抗体が由来する生殖細胞系列の対応する残基、または別のヒト生殖細胞系列の対応する残基、または対応する生殖細胞系列の残基の保存的アミノ酸置換に変異している（このような配列変化を、本明細書では「生殖細胞系列の変異」と総称する）。当業者は、本明細書に開示された重鎖および軽鎖可変領域配列から始めて、１つまたはそれ以上の個々の生殖細胞系列変異またはその組み合わせを含む多数の抗体および抗原結合性フラグメントを容易に作製することができる。特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基のすべてが、抗体が由来する元の生殖細胞系列に見られる残基に変異して戻る。他の実施形態では、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内に見出される変異した残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見出される変異した残基のみが元の生殖細胞系列に変異して戻る。他の実施形態では、フレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基の１つまたはそれ以上が、異なる生殖細胞系列（すなわち、抗体がもともと由来する生殖細胞系列とは異なる生殖細胞系列）の対応する残基に変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の２つまたはそれ以上の生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含むことができ、例えば、特定の個々の残基が特定の生殖細胞系列の配列の対応する残基に変異している一方で、元の生殖細胞系列の配列と異なる特定の他の残基は維持されるか、または異なる生殖細胞系列の配列の対応する残基に変異している。一旦得られれば、１つまたはそれ以上の生殖細胞系列変異を含む抗体および抗原結合性フラグメントは、結合特異性の向上、結合親和性の向上、拮抗的生物学的特性の向上または強化、免疫原性の低下などの１つまたはそれ以上の所望の特性について容易に試験することができる。このような一般的な方法で得られた抗体および抗原結合性フラグメントは、本発明に包含される。
また、本発明は、１つまたはそれ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む完全ヒト抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体を含む。例えば、本発明には、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０またはそれ未満、８またはそれ未満、６またはそれ未満、４またはそれ未満などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＮＰＲ１抗体が含まれる。
本明細書で使用される「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒトｍＡｂは、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異もしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでもよい。しかし、本明細書で使用する「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」という用語は、他の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトＦＲ配列に移植されたｍＡｂを含むことを意図していない。この用語には、非ヒト哺乳動物または非ヒト哺乳動物の細胞内で組換え的に産生された抗体が含まれる。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象で生成された抗体を含むことを意図していない。
本明細書で使用される「組換え」という用語は、例えば、ＤＮＡスプライシングおよびトランスジェニック発現を含む組換えＤＮＡ技術として当技術分野で知られている技術または方法によって作成、発現、単離、または入手された本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを意味する。その用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えばトランスジェニックマウスを含む）もしくは細胞（例えばＣＨＯ細胞）発現系で発現させた抗体、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体を指す。
「特異的に結合する」または「に特異的に結合する」などの用語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、生理的条件下で比較的安定した抗原との複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、少なくとも約１×１０－８Ｍまたはそれ未満の平衡解離定数によって特徴づけることができる（例えば、ＫＤが小さいほど結合がより強固であることを示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などがある。本明細書に記載されるように、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって、ＮＰＲ１に特異的に結合する抗体が同定されている。さらに、ＮＰＲ１の１つのドメインと１つまたはそれ以上の追加の抗原に結合する多特異性抗体、またはＮＰＲ１の２つの異なる領域に結合する二重特異性は、それでも、本明細書で使用されるように、「特異的に結合する」抗体とみなされる。
「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液アフィニティＥＬＩＳＡによって測定される、少なくとも１０－８Ｍ；好ましくは１０－９Ｍ；より好ましくは１０－１０Ｍ、さらに好ましくは１０－１１ＭのＫＤとして表される、ＮＰＲ１に対する結合親和性を有するｍＡｂを意味する。
用語「スローオフレート（ｓｌｏｗ ｏｆｆ ｒａｔｅ）」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」は、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定される、１×１０－３秒－１またはそれ未満、好ましくは１×１０－４秒－１またはそれ未満の速度定数で、ＮＰＲ１から解離する抗体を意味する。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」などの用語には、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性フラグメント」または「抗体フラグメント」という用語は、ＮＰＲ１タンパク質に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを意味する。
特定の実施形態において、本発明の抗体または抗体フラグメントは、リガンドもしくは治療用部分（「イムノコンジュゲート」）、第２の抗ＮＰＲ１抗体、またはＮＰＲ１関連の疾患もしくは障害を処置するのに有用な他の治療用部分などの部分に結合されてもよい。
本明細書で使用される「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、ＮＰＲ１またはそのフラグメントを特異的に結合する単離された抗体は、ＮＰＲ１以外の抗原を特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）。
本明細書で使用される「活性化抗体」または「アゴニスト抗体」（すなわち「ＮＰＲ１活性を増加または増強する抗体」または「活性化されたコンフォメーションを安定化する抗体」）は、ＮＰＲ１への結合がＮＰＲ１の少なくとも１つの生物学的活性の活性化をもたらす抗体を指すものとする。例えば、本発明の抗体は、それを必要とする対象に投与すると、全身血圧を低下させることができる。
「表面プラズモン共鳴」とは、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、スウェーデン、ウップサラおよびニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することで、リアルタイムの生体分子相互作用を分析することができる光学現象のことである。
本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すものとする。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域にある特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を意味する。１つの抗原が１つよりも多いエピトープを持つこともありうる。そのため、異なる抗体は抗原の異なる領域に結合することがあり、異なる生物学的効果を有することがありうる。また、用語「エピトープ」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位のことである。また、それは、抗体が結合する抗原の領域のことでもある。エピトープは、構造的または機能的なものとして定義されうる。機能的エピトープは、一般的に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。また、エピトープは、立体構造的、すなわち非線形のアミノ酸で構成されていてもよい。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面グループである決定基を含んでいてもよく、また、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性、および／または特定の電荷特性を有していてもよい。
本明細書で使用される「交差競合」という用語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが抗原に結合し、別の抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合を阻害または遮断することを意味する。また、この用語には、２つの抗体間の両方向における競合、すなわち、第２の抗体に結合してその結合を阻害する第１の抗体、およびその逆も含まれる。特定の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、同じエピトープに結合してもよい。あるいは、第１の抗体と第２の抗体とは、異なるが重複するエピトープに結合してもよく、一方の抗体の結合が立体障害を介して第２の抗体の結合を阻害または遮断するようになっていてもよい。抗体間の交差競合は、当技術分野で知られている方法、例えば、リアルタイム・ラベルフリー・バイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ，ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ）によって測定することができる。２つの抗体間の交差競合は、自己－自己結合（ｓｅｌｆ－ｓｅｌｆ ｂｉｎｄｉｎｇ）によるバックグラウンド信号よりも小さい第２の抗体の結合として表してもよい（ここで、第１および第２の抗体は同じ抗体である）。２つの抗体間の交差競合は、例えば、ベースラインの自己－自己結合によるバックグラウンド結合よりも小さい第２の抗体の結合％（ここで、第１および第２の抗体は同じ抗体である）として表してもよい。
核酸またはそのフラグメントに言及するときの「実質的同一性」または「実質的に同一」という用語は、別の核酸（またはその相補鎖）により適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って最適に整列させたときに、後述するＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰなどの配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列の同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的同一性を有する核酸分子は、特定の例では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
ポリペプチドに適用される「実質的な類似性」または「実質的に類似した」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップウェイトを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列させた場合、少なくとも９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、残基の位置は、同一ではなく、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷や疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的な置換によって互いに異なる場合、置換の保存的な性質に関する補正のために、類似性の割合または程度を上方に調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者にはよく知られている。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３を参照し、これは本明細書に参照により組み込まれている。類似の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニンおよびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保守的置換とは、Ｇｏｎｎｅｔｅｔら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を持つ変化のことであり、参照により本明細書に組み込まれる。また、「適度な保存的」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において非負値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、通常、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を用いて、類似の配列を照合する。例えば、ＧＣＧソフトウェアには、ＧＡＰやＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムが含まれており、これらをデフォルトのパラメータで使用して、異なる種の生物からの相同ポリペプチドなどの近縁ポリペプチド間の、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の、配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照のこと。また、ポリペプチド配列は、デフォルトまたは推奨パラメータを用いてＦＡＳＴＡ；ＧＣＧバージョン６．１のプログラムを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列とサーチ配列との間で最もよくオーバーラップする領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（前出のＰｅａｒｓｏｎ（２０００））。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトのパラメータを用いたコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２を参照し、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
「治療上有効な量」とは、それを投与するための所望の効果をもたらす量を意味する。正確な量は、処置の目的によって異なり、当業者であれば知られている技術を用いて確認できるであろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
本明細書で使用される「対象」という用語は、高血圧などのＮＰＲ１関連の疾患または障害の改善、予防および／または処置を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。この用語には、そのような疾患や障害を有する、またはそのリスクがあるヒト対象も含まれる。
本明細書で使用される「処置する」、「処置すること」、または「処置」という用語は、それを必要とする対象への本発明の抗体などの治療剤の投与による、ＮＰＲ１関連の疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候の重症度の軽減または改善を指す。該用語には、疾患の進行または症状／徴候の悪化の抑制が含まれる。また、該用語には、本発明の抗体などの治療剤を投与することにより、疾患の予後が良好になること、すなわち、対象の疾患がなくなりうる、または疾患が軽減されうることも含まれる。治療剤は、対象に治療用量で投与してもよい。
「予防する」、「予防すること」または「予防」という用語は、本発明の抗体の投与により、ＮＰＲ１に関連する疾患もしくは障害、またはそのような疾患もしくは障害のなんらかの症状もしくは徴候の発現を抑制することを指す。
抗体の抗原結合性フラグメント
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特に他に示さない限り、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち「完全な抗体分子」）だけでなく、その抗原結合性フラグメントも包含することが理解される。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」などの用語は、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、天然由来の、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性フラグメント」または「抗体フラグメント」という用語は、ＮＰＲ１タンパク質に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントのことである。抗体フラグメントには、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、ＣＤＲを含むフラグメント、または孤立ＣＤＲが含まれる。特定の実施形態では、用語「抗原結合性フラグメント」は、多特異性抗原結合分子のポリペプチドフラグメントを指す。抗体の抗原結合性フラグメントは、例えば、タンパク質消化などの任意の適切な標準的技術または抗体の可変ドメインおよび（場合により）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子操作技術を用いて、完全な抗体分子から誘導することができる。このようなＤＮＡは、知られており、かつ／または、例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、化学的に、または分子生物学的技術を用いて配列決定および操作して、例えば、１つまたはそれ以上の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切な構成に配置する、またはコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、追加、もしくは削除することができる。
抗原結合性フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの孤立した相補性決定領域（ＣＤＲ））または制約されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模倣したアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、が挙げられる。ドメイン特異的抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（一価のナノボディ、二価のナノボディなど）、小型モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、鮫の可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の改変分子も、本明細書で使用される「抗原結合性フラグメント」という表現に包含される。
抗体の抗原結合性フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であってもよく、一般的には、少なくとも１つのＣＤＲを含み、これは１つまたはそれ以上のフレームワーク配列を有するフレームに隣接するかまたはフレーム内にある。ＶＬドメインに関連するＶＨドメインを有する抗原結合性フラグメントでは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、互いに任意の適切な配置に位置付けされうる。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬの二量体を含みうる。あるいは、抗体の抗原結合性フラグメントは、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含んでもよい。
特定の実施形態では、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合性フラグメント内に見出されうる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的で例示的な構成には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが含まれる。上に挙げた例示的な構成のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の構成において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよいし、または完全なもしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれ以上）のアミノ酸から構成されていてもよく、その結果、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間に柔軟性または半柔軟性のある連結部が形成される。さらに、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントは、上記の可変ドメイン構成および定常ドメイン構成のいずれかが、互いに、かつ／または１つもしくはそれ以上の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインと（例えば、ジスルフィド結合によって）非共有結合した、ホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでもよい。
完全な抗体分子と同様に、抗原結合性フラグメントは、単一特異性または多特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。抗体の多特異性抗原結合性フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別々の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書で開示された例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用可能な常用技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントに関連して使用するために適合させることができる。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を調製する方法は当分野で知られている。このような知られた方法はいずれも、本発明に関連して、ＮＰＲ１に特異的に結合するヒト抗体を調製するために使用することができる。
以下のいずれか１つを含む免疫原を用いて、ＮＰＲ１タンパク質に対する抗体を産生することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、全長天然ＮＰＲ１タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１６０６６．１参照）、または該タンパク質もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡで免疫されたマウスから得られる。あるいは、該タンパク質またはそのフラグメントを、標準的な生化学的技術を用いて製造し、修飾して免疫原として使用してもよい。
いくつかの実施形態では、免疫原は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または任意の他の真核細胞もしくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた組換えＮＰＲ１タンパク質またはそのフラグメントであってもよい（例えば、配列番号：１９４～１９９）。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）参照）またはモノクローナル抗体を生成するための他の知られた方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＮＰＲ１に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術には、マウスが抗原刺激に反応してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域部位に作動可能に連結されたヒトの重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを持つトランスジェニックマウスを作製することが含まれる。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖および軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結する。次に、このＤＮＡを、完全なヒト抗体を発現できる細胞中で発現させる。
一般に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに目的の抗原を曝露させ、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収する。このリンパ系細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し、このようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することができる。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプの定常領域に連結してもよい。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞で産生してもよい。あるいは、抗原特異的なキメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、抗原特異的なリンパ球から直接単離してもよい。
最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下の実験セクションのように、親和性、選択性、エピトープなどを含めた望ましい特性について抗体を特徴付けし、選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域で置換して、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または改変ＩｇＧ１またはＩｇＧ４を産生する。
選択された定常領域は、特定の用途に応じて変化してもよいが、高親和性の抗原結合および標的特異性の特性は可変領域に存在する。
生物学的同等物（Ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）
本発明の抗ＮＰＲ１抗体および抗体フラグメントは、記載された抗体のものから変化しているが、ＮＰＲ１タンパク質と結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような変異型抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較してアミノ酸の１つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体と本質的に同等の生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較して、ヌクレオチドの１つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体フラグメントと本質的に生物学的に同等な抗体または抗体フラグメントをコードする配列を包含する。
２つの抗原結合タンパク質、すなわち抗体は、例えば、単回投与または複数回投与のいずれかの類似した実験条件下で同じモル用量を投与したときに、吸収の速度および程度が有意差を示さない医薬的同等物または医薬的代替物である場合、生物学的に同等であると考えられる。いくつかの抗体は、吸収の程度は同等であるが、吸収の速度は同等ではない場合、同等物または医薬代替物とみなされるものがあるが、それでも、そのような吸収速度の違いは意図的なものであり、表示に反映されており、例えば慢性的な使用において有効な体内薬物濃度を達成するために必須ではなく、研究された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないと考えられるため、生物学的に同等であるとみなしてもよい。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、または効力に臨床的に意味のある差がない場合、生物学的に同等である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、患者が基準製品と生物学的製品との間で１回またはそれ以上切り替えることができ、そのような切り替えを行わずに治療を継続した場合と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含む副作用のリスクにおける予想される増加がない、または有効性の低下がない場合、生物学的に同等である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの両方が、１つまたは複数の使用条件に関して共通の１つまたは複数の作用機構によって、そのような機構が知られている範囲で作用する場合、生物学的に同等である。
生物学的同等性は、インビボおよび／またはインビトロの方法で実証することができる。生物学的同等性の尺度には、例えば（ａ）血液、血漿、血清、または他の生物学的流体中の抗体またはその代謝物の濃度を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトのインビボバイオアベイラビリティデータと相関があり、合理的に予測できるインビトロ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理効果を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験、および（ｄ）抗体の安全性、有効性、またはバイオアベイラビリティもしくは生物学的同等性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
本発明の抗体の生物学的同等な変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うか、または生物学的活性に必要のない末端もしくは内部の残基もしくは配列を削除することによって構築することができる。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を削除するか、または他のアミノ酸で置換して、再生時に不必要なまたは間違った分子内ジスルフィド結合が形成されるのを防ぐことができる。他の文脈では、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特性を変更するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含む、抗体変異体を含むことができる。
Ｆｃ変異体を含む抗ＮＰＲ１抗体
本発明の特定の実施形態によれば、ＦｃＲｎ受容体に対する抗体の結合を、例えば中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで増強または減少させる１つまたはそれ以上の変異を含むＦｃドメインを含む抗ＮＰＲ１抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＮＰＲ１抗体を含み、該変異は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５から約６．０の範囲にあるエンドソーム内）においてＦｃドメインのＦｃＲｎへの親和性を増加させる。このような変異は、動物に投与したときに抗体の血清半減期の増加をもたらすことがありうる。このようなＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、位置２５０（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８（例えば、ＬまたはＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾；または位置４２８および／または４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／または４３４（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、ＦまたはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４ＦまたはＮ４３４Ｙ］）での修飾；または位置２５０および／または４２８での修飾；または位置３０７または３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４の修飾が含まれる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａおよび４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ）；および４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される１つまたはそれ以上の変異の対または群を含むＦｃドメインを含む抗ＮＰＲ１抗体を含む。前述のＦｃドメイン変異および本明細書に開示された抗体可変ドメイン内の他の変異のすべての可能な組み合わせは、本発明の範囲内で企図される。
また、本発明には、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＮＰＲ１抗体であって、キメラＣＨ領域が、１つよりも多い免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む、抗ＮＰＲ１抗体が含まれる。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部と、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部とを組み合わせてなるキメラＣＨ領域を含んでもよい。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６から２２７までのアミノ酸残基）と、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８から２３６までのアミノ酸残基）とを組み合わせたものであってもよい。特定の実施形態によれば、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４の上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２の下部ヒンジに由来するアミノ酸残基とを含む。本明細書に記載のキメラＣＨ領域を含む抗体は、特定の実施形態において、抗体の治療特性または薬物動態特性に悪影響を及ぼすことなく、改変されたＦｃエフェクター機能を示すことができる。（例えば、米国特許出願公開２０１４／０２４３５０４号を参照し、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明の抗体の生物学的特性
一般に、本発明の抗体は、ＮＰＲ１タンパク質に結合し、その活性を高めることによって機能する。例えば、本発明には、ＡＮＰまたはＢＮＰのいずれかの非存在下で（例えば、２５℃または３７℃で）単量体のヒトＮＰＲ１タンパク質を、例えば本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットを用いて表面プラズモン共鳴によって測定される６９０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体および抗体の抗原結合性フラグメントが含まれる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定される、約６５０ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約４００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、または約２５ｎＭ未満のＫＤでＮＰＲ１と結合する。
また、本発明には、ＡＮＰまたはＢＮＰのいずれかの非存在下で（例えば、２５℃または３７℃で）、二量体ヒトＮＰＲ１タンパク質を、例えば本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットを用いて表面プラズモン共鳴によって測定される４２ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントが含まれる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定される約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤでＮＰＲ１と結合する。
また、本発明には、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、ＡＮＰと複合体化したヒトＮＰＲ１タンパク質（例えば、２５℃または３７℃で）を、８０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体および抗体の抗原結合性フラグメントが含まれる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、約７０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤでＮＰＲ１と結合する。
また、本発明には、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、ＢＮＰと複合体化したヒトＮＰＲ１タンパク質を（例えば、２５℃または３５℃で）、２０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体および抗体の抗原結合性フラグメントが含まれる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤでＮＰＲ１と結合する。
また、本発明には、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、ＡＮＰまたはＢＮＰのいずれかの非存在下で（例えば、２５℃または３７℃で）単量体のサルＮＰＲ１タンパク質を３６５ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントも含まれる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３で定義されたアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、約３６０ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤでＮＰＲ１と結合する。
また、本発明には、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、ＡＮＰまたはＢＮＰのいずれかの非存在下で（例えば、２５℃または３７℃で）、二量体のサルＮＰＲ１タンパク質を３０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントも含まれる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤでＮＰＲ１と結合する。
また、本発明には、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、１０ｎＭ未満のＫＤで、ＡＮＰと複合体化したサルＮＰＲ１タンパク質（例えば、２５℃または３７℃で）と結合する抗体および抗体の抗原結合性フラグメントも含まれる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤでＮＰＲ１と結合する。
また、本発明には、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、ＢＮＰと複合体化した二量体サルＮＰＲ１タンパク質（例えば、２５℃または３７℃で）と１０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体および抗体の抗原結合性フラグメントも含まれる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に定義されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫＤでＮＰＲ１と結合する。
また、本発明には、例えば、本明細書の実施例５に記載されるようなアッセイフォーマットまたは実質的に同様のアッセイを用いて測定した場合に、ＡＮＰを含むまたは含まないヒトＮＰＲ１を発現する細胞に、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントも含まれる。
また、本発明は、例えば、本明細書の実施例６に定義されるようなアッセイフォーマットを使用した、カルシウムフラックス細胞ベースのバイオアッセイによって測定されるように、３８５ｎＭ未満のＥＣ５０でＮＰＲ１を活性化する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば本明細書の実施例６に定義されるようなアッセイフォーマットを用いたカルシウムフラックス細胞ベースのバイオアッセイ、または実質的に同様のアッセイによって測定されるように、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＥＣ５０でＮＰＲ１を活性化する。
また、本発明は、例えば本明細書の実施例８に示すように、ＮＰＲ１に結合し、それを必要とする対象に単回投与したときに２８日を超える間、対象の全身血圧を低下させる抗体および抗体の抗原結合性フラグメントを含む。
また、本発明は、例えば本明細書の実施例１１に示すように、ＮＰＲ１に結合し、それを必要とする対象に投与したときに空腹時血糖値を低下させる抗体および抗体の抗原結合性フラグメントを含む。
一実施形態では、本発明は、ＡＮＰまたはＢＮＰの存在下または非存在下でＮＰＲ１タンパク質に特異的に結合し、ＮＰＲ１の活性を増加させる単離された組換え抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントは、以下の特徴：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；（ｂ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰおよび／またはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、６９０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、単量体のヒトＮＰＲ１に結合する；（ｃ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰまたはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、４２ｎＭ未満のＫＤで二量体のヒトＮＰＲ１に結合する；（ｄ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、８０ｎＭ未満のＫＤで、ＡＮＰと複合体形成したヒトＮＰＲ１に結合する；（ｅ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、２０ｎＭ未満のＫＤで、ＢＮＰと複合体形成したヒトＮＰＲ１に結合する；（ｆ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰおよび／またはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、３６５ｎＭ未満のＫＤで、単量体のサルＮＰＲ１に結合する；（ｇ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰまたはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、３０ｎＭ未満のＫＤで、二量体のサルＮＰＲ１に結合する；（ｈ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、１０ｎＭ未満のＫＤで、ＡＮＰと複合体形成したサルＮＰＲ１に結合する；（ｉ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で１０ｎＭ未満のＫＤでＢＮＰと複合形成したサルＮＰＲ１に結合する；（ｊ）マウスＮＰＲ１とは結合しない；（ｋ）ヒトＮＰＲ１（ＡＮＰの非存在下）またはＡＮＰと複合体形成したＮＰＲ１を発現する細胞に、５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する；（ｌ）カルシウムフラックス細胞ベースのバイオアッセイで測定されるように、３８５ｎＭ未満のＥＣ５０でＮＰＲ１を活性化する；（ｍ）正常血圧および高血圧のマウスに投与したときに、全身の血圧を低下させ、全身血圧および平均動脈血圧の低下は、単回投与で２８日まで持続する；（ｎ）食事誘発性肥満マウスに投与したときに、耐糖能が改善される；および（ｏ）表１に記載のＨＣＶＲ配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、表１に記載のＬＣＶＲ配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む；の１つまたはそれ以上を示す。
本発明の抗体は、前述の生物学的特性の１つもしくはそれ以上、またはそれらの組み合わせを有していてもよい。本発明の抗体の他の生物学的特性は、本明細書の実施例を含む本開示の検討から当業者に明らかになるであろう。
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明には、ＮＰＲ１タンパク質分子の１つまたはそれ以上の領域内に見出される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＮＰＲ１抗体が含まれる。抗体が結合するエピトープは、ＮＰＲ１タンパク質分子の前述のドメインのいずれか内に位置する３つまたはそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）のアミノ酸の単一の連続した配列から構成されていてもよい（例えば、ドメイン内の線形エピトープ）。あるいは、エピトープは、タンパク質分子の前述のドメインのいずれかまたは両方内に位置する複数の連続しないアミノ酸（またはアミノ酸配列）から構成されていてもよい（例えば、コンフォメーションエピトープ）。
抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する」か、どうかを決定するために、当業者に知られている様々な技術を使用することができる。例示的な技術には、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載されているような、常用のクロスブロッキングアッセイが含まれる。他の方法としては、アラニンスキャニング突然変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析結晶学的研究、ＮＭＲ分析などがある。さらに、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出、化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用できる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的には、水素／重水素交換法では、目的のタンパク質を重水素標識した後、重水素標識されたタンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水中に移動させると、抗体複合体によって保護されたアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の部分ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素－水素逆交換を行う。その結果、タンパク質と抗体の界面の部分を形成するアミノ酸は重水素を保持し、そのため界面に含まれないアミノ酸と比較して相対的に高い質量を示すことになる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼで切断し、質量分析を行うことで、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識された残基が明らかになる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照のこと。
用語「エピトープ」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位を意味する。Ｂ細胞エピトープは、連続したアミノ酸、またはタンパク質の三次折り畳み（ｔｅｒｔｉａｒｙ ｆｏｌｄｉｎｇ）によって並置された非連続のアミノ酸の両方から形成することができる。連続したアミノ酸から形成されたエピトープは、変性溶媒にさらされても保持されるのに対し、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、変性溶媒で処理されると典型的には失われる。エピトープは、通常、少なくとも３つ、より一般的には、少なくとも５または８～１０個のアミノ酸が独特の空間的コンフォメーションを形成している。
修飾支援プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＭＡＰ）は、抗原構造に基づく抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＡＳＡＰ）とも呼ばれ、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に応じて、同一の抗原に向けられた多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（ＵＳ２００４／０１０１９２０参照、本明細書ではその全体が参照により具体的に組み込まれる）。各カテゴリーは、他のカテゴリーで表されるエピトープと明確に異なるか、または部分的に重なる独特のエピトープを反映してもよい。この技術により、遺伝的に同一の抗体を迅速にフィルタリングすることができ、遺伝的に異なる抗体に焦点を当てた特性評価が可能になる。ＭＡＰをハイブリドーマのスクリーニングに適用すると、所望の特性を持つｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にすることができる。ＭＡＰは、本発明の抗体を、異なるエピトープを結合する抗体のグループに分類するために使用することができる。
特定の実施形態では、本発明は、ＮＰＲ１の細胞外ドメイン内に見出される１つまたはそれ以上のエピトープと相互作用する抗ＮＰＲ１抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。エピトープは、ＮＰＲ１の細胞外ドメイン内に位置する３つまたはそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）のアミノ酸の１つまたは以上の連続した配列で構成されていてもよい。あるいは、エピトープは、ＮＰＲ１内に位置する複数の非連続のアミノ酸（またはアミノ酸配列）から構成されてもよい。
本発明には、表１に記載された特定の例示的な抗体のいずれかと同じエピトープ、またはエピトープの一部に結合する抗ＮＰＲ１抗体が含まれる。同様に、本発明には、表１に記載された具体的な例示的抗体のいずれかとＮＰＲ１タンパク質またはそのフラグメントへの結合を競合する抗ＮＰＲ１抗体も含まれる。例えば、本発明は、ＮＰＲ１タンパク質への結合を、表１に記載の１つまたはそれ以上の抗体と交差競合する抗ＮＰＲ１抗体を含む。
ある抗体が参照抗ＮＰＲ１抗体と同じエピトープに結合するか、または結合を競合するかどうかは、当分野で知られている常用の方法を用いて容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＮＰＲ１抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和状態でＮＰＲ１タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、ＮＰＲ１タンパク質分子に結合する試験抗体の能力を評価する。参照抗ＮＰＲ１抗体との飽和結合後に試験抗体がＮＰＲ１に結合できる場合、試験抗体は参照抗ＮＰＲ１抗体とは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。一方、参照抗ＮＰＲ１抗体との飽和結合後、試験抗体がＮＰＲ１タンパク質に結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＮＰＲ１抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合している可能性がある。
抗体が参照抗ＮＰＲ１抗体との結合を競合するかどうかを決定するために、上述の結合方法を２つの方向性で実施する。第１の方向性では、参照抗体を飽和状態でＮＰＲ１タンパク質に結合させた後、試験抗体のＮＰＲ１分子への結合を評価する。第２の方向性では、試験抗体を飽和状態でＮＰＲ１分子に結合させた後、参照抗体のＮＰＲ１分子への結合を評価する。両方の方向性において、第１の（飽和）抗体のみがＮＰＲ１分子に結合することができる場合、試験抗体と参照抗体とはＮＰＲ１への結合について競合すると結論付けられる。当業者によって理解されるように、参照抗体との結合を競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するとは限らず、重複または隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断することができる。
２つの抗体は、それぞれが別の抗体の抗原への結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じまたはオーバーラップエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍の過剰な一方の抗体は、競合的結合アッセイで測定すると、他方の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％または９９％までさえ阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２参照）。あるいは、一方の抗体の結合を減少または排除する抗原のアミノ酸変異が、他方の抗体の結合を減少または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有している。一方の抗体の結合を減少または排除するいくつかのアミノ酸変異が、他方の抗体の結合を減少または排除する場合、２つの抗体はオーバーラップエピトープを有する。
次に、追加の常用実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を行って、試験抗体の結合が観察されないのは、実際には参照抗体と同じエピトープに結合しているためなのか、または結合が観察されないのは立体的な遮断（または別の現象）が原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当分野で利用可能なその他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを用いて行うことができる。
特定の実施形態において、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、水素／重水素交換によって決定されるＮＰＲ１の細胞外ドメイン（配列番号：１９４のアミノ酸２９～３４７）内に含まれる１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用し、かつ該抗体またはその抗原結合性フラグメントが（ｉ）心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の存在下または非存在下で、ヒトＮＰＲ１を発現する細胞に結合する；かつ／または（ｉｉ）ＮＰＲ１に結合し、ＮＰＲ１を活性化する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３４７；（ｃ）配列番号：１９４のアミノ酸３３６～３４７；（ｄ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３３５；および（ｅ）配列番号：１９４のアミノ酸７０～８１からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；および（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸３３６～３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＡＮＰの存在下で、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；および（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＡＮＰの存在下で、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸７０～８１；および（ｃ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用する。一実施形態では、本発明は、ＡＮＰの存在下でＮＰＲ１タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、水素／重水素交換によって決定されるように、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；および（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用するが、配列番号：１９４のアミノ酸７０～８１とは相互作用せず、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、（ｉ）ＡＮＰの存在下または非存在下で、ヒトＮＰＲ１を発現する細胞に結合する；かつ／または（ｉｉ）ＮＰＲ１に結合し、ＮＰＲ１を活性化する；単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
免疫複合体
本発明は、ＮＰＲ１に関連する疾患または障害（例えば、高血圧）を処置するために、治療部分に結合したヒト抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。本明細書で使用される「免疫複合体」という用語は、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部位、酵素、ペプチドもしくはタンパク質または治療剤に化学的もしくは生物学的に結合した抗体を指す。抗体は、標的と結合できる限り、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部位、酵素、ペプチド、治療剤などと、分子に沿って任意の位置で結合することができる。免疫複合体の例としては、抗体薬物複合体および抗体－毒素融合タンパク質が挙げられる。ある実施形態では、薬剤は、ＮＰＲ１タンパク質に対する第２の異なる抗体であってもよい。抗ＮＰＲ１抗体に結合されうる治療部位のタイプは、処置すべき状態および達成すべき所望の治療効果を考慮することになる。免疫複合体を形成するのに適した薬剤の例は、当技術分野で知られており、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと。
多特性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多特異性であってもよい。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよいし、または１つより多い標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含んでもよい。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；Ｋｕｆｅｒら、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４参照。
本発明の多特異性抗原結合分子のいずれか、またはその変異体は、当業者に知られているように、標準的な分子生物学的技術（例えば、組換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）を用いて構築することができる。
いくつかの実施形態では、ＮＰＲ１特異的抗体は、ＮＰＲ１タンパク質の異なるドメインに結合する可変領域が一緒に連結されて、単一の結合分子内で二重ドメイン特異性を付与する二重特異的フォーマット（「二重特異的」）で生成される。適切に設計された二重特異性は、特異性および結合力の両方を高めることにより、全体的なＮＰＲ１タンパク質の阻害効果を高めることができる。個々のドメイン（例えば、Ｎ－末端ドメインのセグメント）に特異性を有するか、または１つのドメイン内の異なる領域に結合することができる可変領域は、各領域が別々のエピトープに同時に結合するか、または１つのドメイン内の異なる領域に結合することを可能にする構造的骨格上で対になっている。二重特異性の一例では、１つのドメインに対する特異性を有する結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）の重鎖可変領域（ＶＨ）を、２つ目のドメインに対する特異性を有する一連の結合剤の軽鎖可変領域（ＶＬ）と組み替えて、ＶＨの元々の特異性を損なわずにＶＨと対になることができる非同系（ｎｏｎ－ｃｏｇａｔｅ）のＶＬパートナーを特定する。このようにして、単一のＶＬセグメント（例えば、ＶＬ１）を２つの異なるＶＨドメイン（例えば、ＶＨ１およびＶＨ２）と組み合わせて、２つの結合「アーム（ａｒｍ）」（ＶＨ１－ＶＬ１およびＶＨ２－ＶＬ１）を含む二重特異性を生成することができる。単一のＶＬセグメントを使用することで、システムの複雑さが軽減され、それによって、二重特異性を生成するために使用されるクローニング、発現、および精製プロセスが単純化され、効率が向上する（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４およびＵＳ２０１０／０３３１５２７を参照）。
別法として、１より多いドメインおよび第２の標的を結合する抗体、例えば、限定されるわけではないが、第２の異なる抗ＮＰＲ１抗体は、本明細書に記載された技術、または当業者に知られている他の技術を用いて、二重特異性フォーマットで調製してもよい。異なる領域に結合する抗体可変領域を、例えばＮＰＲ１の細胞外ドメインの関連部位に結合する可変領域と一緒に連結して、単一の結合分子内に二重抗原特異性を付与してもよい。この性質の適切に設計された二重特異性は、二重の機能を果たす。細胞外ドメインに対して特異性を有する可変領域は、細胞外ドメインの外側に対して特異性を有する可変領域と組み合わされ、それぞれの可変領域が別々の抗原に結合できる構造的骨格上で対になっている。
本発明の文脈で使用することができる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み、該第１および第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸だけ互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の違いは、アミノ酸の違いがない二重特異性抗体と比較して、プロテインＡに対する二重特異性抗体の結合を減少させる。一実施形態では、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡを結合し、第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）のようなプロテインＡ結合を減少または消失させる変異を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含んでもよい。第２のＣＨ３内に見出されうるさらなる修飾には、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。上述の二重特異性抗体のフォーマットのバリエーションは、本発明の範囲内で企図されている。
本発明の文脈で使用することができる他の例示的な二重特異性フォーマットには、限定されないが、例えば、ｓｃＦｖベースまたは二重特性抗体の二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブス－イントゥ－ホールズ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブス－イントゥ－ホールズを有する共通軽鎖）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマット（前述のフォーマットのレビューについては、例えば、Ｋｌｅｉｎら、２０１２、ｍＡｂｓ ４：６、１－１１、およびそこに引用された文献を参照のこと）。また、二重特異性抗体は、ペプチド／核酸複合体を用いて構築することができ、例えば、直交する化学反応性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する非天然アミノ酸を用いて、部位特異的な抗体－オリゴヌクレオチド複合体を生成し、これはその後、所定の組成、価数、および形状を有する多量体複合体を自己組織化可能である（例えば、Ｋａｚａｎｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：１２月４日，２０１２年］参照）。
治療的投与および製剤
本発明は、本発明の抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる治療用組成物を提供する。本発明による治療用組成物は、適切な担体、賦形剤、および改善された移送、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤とともに投与される。多数の適切な製剤は、すべての製薬化学者に知られている処方集に見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルバニア州、イーストン。これらの製剤には、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックス含有半固体混合物が含まれる。また、Ｐｏｗｅｌｌらの「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１を参照のこと。
抗体の用量は、投与されるべき対象の年齢および体格、標的疾患、状態、投与経路などによって異なることがありうる。本発明の抗体を成人患者の疾患もしくは障害の処置、またはそのような疾患の予防に用いるときは、通常、本発明の抗体を約０．１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で投与するのが有利である。状態の重症度に応じて、処置の頻度および期間を調整することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約６００ｍｇ、約５～約５００ｍｇ、または約１０～約４００ｍｇの初期用量として投与することができる。特定の実施形態では、初回用量に続いて、抗体またはその抗原結合性フラグメントの２回目または複数回の後に続く用量の投与を、初期用量のものとほぼ同じまたはそれより少ない量で投与することができ、後に続く用量は少なくとも１日から３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間離される。
様々な送達システム、例えば、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異型ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシスが知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる（例えば、Ｗｕら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２参照）。導入方法としては、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本組成物は、任意の都合のよい経路、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）からの吸収によって投与することができ、他の生物学的活性剤と一緒に投与することができる。投与は、全身または局所的に行うことができる。医薬組成物は、ベシクル、特にリポソームで送達することもできる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３参照）。
また、本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用も、本明細書において企図される。抗体結合ナノ粒子は、治療および診断の両方の用途に使用することができる。抗体結合ナノ粒子、ならびに調製および使用の方法は、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．ら，２００９（「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ． Ｖｏｌｕｍｅ ２００９， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４３９３８９，２４頁，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）に詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。ナノ粒子を開発し、標的細胞に対する医薬組成物に含まれる抗体に結合させてもよい。また、薬物送達用のナノ粒子は、例えば、ＵＳ８２５７７４０、またはＵＳ８２４６９９５に記載されており、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の状況では、医薬組成物を制御放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用してもよい。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、制御放出システムを組成物の標的に近接して配置することができ、そのため、全身用量のごく一部しか必要としない。
注射用製剤は、静脈内、皮下、頭蓋内、腹腔内および筋肉内の注射、点滴注入などのための剤形を含んでもよい。これらの注射用製剤は、公知の方法で調製してもよい。
本発明の医薬組成物は、標準的な針および注射器を用いて、皮下または静脈内に送達することができる。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達に適用するのが容易である。このようなペン型送達デバイスは、再利用可能または使い捨てであることができる。再利用可能なペン型送達デバイスは、一般に、医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内のすべての医薬組成物が投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジを容易に廃棄して医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換することができる。その後、ペン型送達デバイスを再利用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジがない。というよりも、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバーに保持された医薬組成物であらかじめ充填されている。リザーバーが空になると、デバイス全体が廃棄される。
有利には、上述の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製される。このような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射剤（アンプル）、座剤などが挙げられる。含まれる抗体の量は、一般的に単位用量の剤形あたり約５～約５００ｍｇであり、特に注射剤の形態では約５～約３００ｍｇ、その他の剤形では約１０～約３００ｍｇで含まれることが好ましい。
抗体の治療的使用
本発明の抗体は、ＮＰＲ１に関連する疾患もしくは障害もしくは状態の処置、および／もしくは予防、ならびに／またはそのような疾患、障害もしくは状態に関連する少なくとも１つの症状の改善に有用である。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＮＰＲ１に関連する疾患または障害または状態を有する患者に治療用量で投与してもよい。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、高血圧、心不全、肥満、腎不全、慢性腎臓病、黄斑浮腫、緑内障、脳卒中、肺障害、肺線維症、炎症、喘息、骨格成長障害、骨折、糖尿病、および癌からなる群から選択される、ＮＰＲ１に関連する疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を処置または予防するために有用である。
また、本明細書では、本発明の１つまたはそれ以上の抗体を、ＮＰＲ１関連の疾患または障害に罹患するリスクのある対象に予防的に使用することも企図される。
本発明の一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に開示された疾患、障害または状態に罹患している患者を処置するための医薬組成物または薬剤の調製に使用される。本発明の別の実施形態では、本抗体は、本明細書に開示された疾患、障害または状態を処置または改善するために有用な、当業者に知られている任意の他の薬剤または任意の他の療法との補助療法として使用される。
併用療法
併用療法は、本発明の抗体と、本発明の抗体または本発明の抗体の生物学的に活性なフラグメントと有利に組み合わせうる任意の追加の治療剤とを含んでもよい。本発明の抗体は、ＮＰＲ１関連の疾患または障害の処置に使用される１つまたはそれ以上の薬物または治療法と相乗的に組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患または状態の１つまたはそれ以上の症状を改善するために、第２の治療剤と組み合わせてもよい。
疾患、障害または状態に応じて、本発明の抗体は、限定されるわけではないが、以下を含む１つまたはそれ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用することができる：アルドステロン拮抗剤（例えば、エプレレノン、スピロノラクトン）、アルファ－アドレナリン遮断剤（例えば、ドキサゾシン、フェノキシベンザミン、フェントラミン、プラゾシン、テラゾシン）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル）、動脈性血管拡張剤（例えば、ヒドラジン、ミノキシジル）、自律神経節性血管拡張剤（例：メカミラミン）、ベータ－アドレナリン遮断剤（アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルベジロール、カルテオロール、エスモロール、ラベトロル、メトプロロール、ナドロール、ペンブテロール、ピンドロール、プロプラノロール、チモロール）、カテコラミン枯渇性交感神経遮断剤（例えば、デセルピジン、レセルピン）、中枢性アルファ－２アドレナリンアゴニスト（例えば、クロニジン、グアナベンツ、グアンファシン、メチルドパ）、カルシウム拮抗剤（ジルチアゼム、ベラパミル、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニカジピン、ニフェジピン、ニソルジピン）、利尿剤（例えば、ブメタニド、エタクリニック酸、フロセミド、トルセミド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン）、レニン阻害剤（例えば、アリスキレン）、抗凝固剤（例えば、クマダン、ダビガトラン、アピキサバン）、抗血小板剤（例えば、アスピリン、クロピドグレル）、コレステロール低下剤（例えば、スタチン、アリロクマブなどのＰＣＳＫ９阻害剤）、血管拡張剤（例えば、ミノキシジル、ヒドラジン、硝酸塩）、ジギタリス、手術（例えば、血管形成術、冠動脈バイパス術、心臓移植）、埋め込み型機器（例えば、弁置換、除細動器、左心室補助装置、ペースメーカー）、抗腫瘍療法（例えば、化学療法剤、手術、放射線、ＰＤ－１阻害剤）、インスリン、ＧＬＰ１アゴニスト（例えば、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチド）、メトホルミン、透析、骨髄刺激剤、血液濾過、生活習慣の改善、ならびに栄養補助食品など。
本明細書で使用される「と組み合わせて」という用語は、本発明の抗ＮＰＲ１抗体の投与前に、投与と同時に、または投与後に、追加の治療活性成分を投与してもよいことを意味する。また、「と組み合わせて」という用語は、抗ＮＰＲ１抗体および第２の治療剤の逐次的または同時的な投与を含む。
追加の治療活性成分は、本発明の抗ＮＰＲ１抗体の投与前に対象に投与してもよい。例えば、第１成分が、第２成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、または３０分未満前に投与される場合、第１成分は第２成分の「前に」投与されるとみなしてもよい。他の実施形態では、本発明の抗ＮＰＲ１抗体の投与後に、追加の治療活性成分を対象に投与してもよい。例えば、第１成分が、第２成分の投与の３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、またはそれより後に投与された場合、第１成分は第２成分の「後に」投与されたとみなしてもよい。さらに他の実施形態では、追加の治療活性成分を、本発明の抗ＮＰＲ１抗体の投与と同時に対象に投与してもよい。本発明の目的のための「同時」投与には、例えば、抗ＮＰＲ１抗体および追加の治療活性成分を対象に単一の剤形で、または互いに約３０分もしくはそれ未満の内に対象に投与される別々の剤形で投与することが含まれる。別々の剤形で投与する場合、各剤形を同じ経路で投与してもよいし（例えば、抗ＮＰＲ１抗体および追加の治療活性成分の両方を静脈内に投与してもよい、など）、代わりに、各剤形を異なる経路で投与してもよい（例えば、抗ＮＰＲ１抗体を静脈内に投与してもよく、追加の治療活性成分を経口投与してもよい、など）。いずれにしても、本開示の目的では、成分を単一の剤形で投与すること、同じ経路で別々の剤形で投与すること、または異なる経路で別々の剤形で投与することは、すべて「同時投与」とみなされる。本開示の目的では、追加の治療活性成分の「投与前」、「投与と同時」、または「投与後」（これらの用語は本明細書に定義されている）の抗ＮＰＲ１抗体の投与は、追加の治療活性成分「と組み合わせた」抗ＮＰＲ１抗体の投与とみなす。
本発明は、本発明の抗ＮＰＲ１抗体が、本明細書の他の箇所に記載されているような１つまたはそれ以上の追加の治療活性成分と共配合されている医薬組成物を含む。
抗体の診断的使用
本発明の抗体は、例えば、診断目的で、サンプル中のＮＰＲ１を検出および／または測定するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＮＰＲ１に関連する疾患または障害を検出するためのアッセイにおいて、本発明の１つまたはそれ以上の抗体を使用することを企図している。ＮＰＲ１の例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得たサンプルを本発明の抗ＮＰＲ１抗体と接触させることを含み、その際、抗ＮＰＲ１抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されているか、または患者サンプルからＮＰＲ１を選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用される。別法として、非標識の抗ＮＰＲ１抗体を、それ自体で検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断用途に使用することもできる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンなどの蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素である。サンプル中のＮＰＲ１を検出または測定するために使用できる特定の例示的なアッセイには、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。
本発明によるＮＰＲ１診断アッセイに使用できるサンプルには、患者から得られるなんらかの組織または液体サンプルが含まれ、これらのサンプルは、正常なまたは病的な状態で検出可能な量のＮＰＲ１タンパク質またはそのフラグメントを含む。一般的には、健康な患者（例えば、ＮＰＲ１に関連する疾患を患ってない患者）から得られた特定のサンプル中のＮＰＲ１タンパク質のレベルを測定して、ＮＰＲ１のベースラインまたは標準レベルを最初に確立する。次に、このベースラインのＮＰＲ１レベルを、ＮＰＲ１に関連する状態、またはそのような状態に関連する症状を有することが疑われる人から得られたサンプルで測定したＮＰＲ１レベルと比較することができる。
ＮＰＲ１タンパク質に特異的な抗体は、追加の標識もしくは部位を含まないか、またはＮ－末端もしくはＣ－末端の標識もしくは部位を含んでもよい。一実施形態では、標識または部位はビオチンである。結合アッセイでは、標識の位置（もしあれば）によって、ペプチドが結合している表面に対するペプチドの向きが決まることがある。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ－末端にビオチンを含むペプチドは、ペプチドのＣ－末端部分が表面の遠位になるように配向される。
実施例
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の製造および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されたものであり、本発明者らがその発明とみなす範囲を限定することを意図したものではない。使用する数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するようにしているが、いくらかの実験的な誤差および逸脱を考慮する必要がある。別段の指示がない限り、部は重量部、分子量は平均分子量、温度は摂氏度で、室温は約２５℃、圧力は大気圧またはその近くである。
実施例１：ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）に対するヒト抗体の産生
ＮＰＲ１タンパク質に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）マウスにおいて産生した。このマウスを、ハイドロダイナミックＤＮＡデリバリーにより、ヒトＮＰＲ１およびマウスＡＮＰ ＤＮＡで免疫し、マウスＡＮＰと複合体形成したヒトＮＰＲ１タンパク質の細胞外ドメインでブーストした。
抗体免疫応答は、ＮＰＲ１特異的免疫測定法によってモニターした。所望の免疫応答が得られたとき、脾臓細胞を採取し、マウスの骨髄腫細胞と融合させて、その生存能力を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。このハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、ＮＰＲ１特異的な抗体を生成する細胞株を選択した。この細胞株を用いて、いくつかの抗ＮＰＲ１キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。
また、抗ＮＰＲ１抗体は、骨髄腫細胞と融合することなく、抗原陽性のマウスＢ細胞から直接単離され、このことは、米国特許７５８２２９８号に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗ＮＰＲ１抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を得た。
上に開示したように産生された例示的な抗体は、ｍＡｂ２２０３３、ｍＡｂ２２０３５、ｍＡｂ２２８０５、ｍＡｂ２２８０９、ｍＡｂ２２８１０、ｍＡｂ２５４７９、ｍＡｂ２５４９１、ｍＡｂ２５４９７、ｍＡｂ２５４９８、ｍＡｂ２５５０２、ｍＡｂ２５５０８、およびｍＡｂ２５５４５として指定した。
本実施例の方法に従って産生された例示的な抗体の生物学的特性を、以下に示す実施例で詳細に説明する。
実施例２：重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列
表１は、本発明の選択された抗ＮＰＲ１抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。
Figure 2022505604000001
対応する核酸配列の識別子を表２に示す。
Figure 2022505604000002
本明細書で言及する抗体は、典型的には完全にヒトの可変領域を有するが、ヒトまたはマウスの定常領域を有してもよい。当業者であれば理解できるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを持つ抗体は、ヒトＩｇＧ４を持つ抗体に変換することができるなど）が、いずれにしても、表２に示した数字の識別子で示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであり、抗原に対する結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず、同一または実質的に類似していることが予想される。特定の実施形態では、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する選択された抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する抗体に変換される。一実施形態では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、米国特許第２０１００３３１５２７号に開示されているような２つまたはそれ以上のアミノ酸変化を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃは、二量体の安定化を促進するために、ヒンジ領域（Ｓ１０８Ｐ）におけるセリンからプロリンへの変異を含む。特に指示がない限り、以下の実施例で使用するすべての抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプを含む。
以下の実施例で使用するコントロール構築物
本明細書に開示された実験は、比較のために、以下のコントロール構築物（抗ＮＰＲ１抗体）：「コンパレータ１（Ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ １）」、米国特許第２０１２０１１４６５９号による抗体「ｍＡｂ５５９１」のＶＨ／ＶＬ配列を有するヒトＮＰＲ１に対するモノクローナル抗体（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を含む。
実施例３：表面プラズモン共鳴によるＮＰＲ１への抗体の結合
実験手順
精製された抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する異なるＮＰＲ１試薬の平衡解離定数（ＫＤ）を、リアルタイム表面プラズモン共鳴ベースのＢｉａｃｏｒｅ ４０００バイオセンサーを用いて測定した。すべての結合試験は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＴ）のランニングバッファーを用いて、２５℃および３７℃で行った。 Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップ表面を、まず、マウス抗ヒトＦｃ特異的ｍＡｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃ＢＲ１００８３９）またはヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＢＲ－１００８－３９）のいずれかでアミンカップリングにより誘導体化し、抗ＮＰＲ１ ｍＡｂを捕捉した。結合試験は、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンで発現させたヒトＮＰＲ１細胞外ドメイン（ｈＮＰＲ１－ＭＭＨ）（配列番号：１９４）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンで発現させたサルＮＰＲ１細胞外ドメイン（ｍｆＮＰＲ１－ＭＭＨ）（配列番号：１９５）、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジン発現させたマウスＮＰＲ１細胞外ドメイン（ｍＮＰＲ１－ＭＭＨ）（配列番号：１９６）、Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａで発現させたヒトＮＰＲ１細胞外ドメイン（ｈＮＰＲ１－ｍＦｃ）（配列番号：１９７）、Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａで発現させたサルＮＰＲ１細胞外ドメイン（ｍｆＮＰＲ１－ｍＦｃ）（配列番号：１９８）、Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａで発現させたマウスＮＰＲ１細胞外ドメイン（ｍＮＰＲ１－ｍＦｃ）（配列番号：１９９）、ｈＮＰＲ１－ｍＦｃ＋ｈＡＮＰ、ｈＮＰＲ１－ｍＦｃ＋ｈＢＮＰ、ｍｆＮＰＲ１－ｍＦｃ＋ｈＡＮＰ、ｍｆＮＰＲ１－ｍＦｃ＋ｈＢＮＰ、ｍＮＰＲ１－ｍＦｃ＋ｍＡＮＰ、ｍＮＰＲ１－ｍＦｃ＋ｍＢＮＰにおいて実施した。異なる濃度のｈＮＰＲ１－ＭＭＨ、ｍｆＮＰＲ１－ＭＭＨ（１００ｎＭ～３．７ｎＭ、３倍連続希釈または１００ｎＭ～６．２５ｎＭ、４倍連続希釈）；ｈＮＰＲ１－ｍＦｃ、ｍｆＮＰＲ１．ｍＦｃ（１００ｎＭ～１．５６ｎＭ、４倍連続希釈、または１００ｎＭ～３．７ｎＭ、３倍連続希釈）；ｍＮＰＲ１．ｍｍｈ（１００ｎＭ）、１０倍濃度のｈＡＮＰまたはｈＢＮＰと複合体形成したｈＮＰＲ１－ｍＦｃまたはｍｆＮＰＲ１－ｍＦｃ（１００ｎＭ、２５ｎＭ、６．２５ｎＭまたは１００ｎＭ～３．７ｎＭ、３倍連続希釈）；ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファーで調製された、１０倍濃度のｍＡＮＰもしくはｍＢＮＰと複合体形成したｍＮＰＲ１．ｍＦｃ（１００ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ－３．７ｎＭ、３倍連続希釈）または１０倍濃度のｈＡＮＰと複合体形成したｈＮＰＲ１－ｈＦｃもしくはｈＮＰＲ１－ｈＦｃ（１００ｎＭ～６．２５ｎＭ、４倍連続希釈）を、３０μＬ／分の流速で４分間注入する一方、ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファー中で、異なるＮＰＲ１試薬を結合したｍＡｂの解離を１０分間モニターした。各サイクルの終わりに、マウス抗ヒトＦｃ特異的ｍＡｂ表面の場合は２０ｍＭリン酸を１０秒注入するか、ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的ポリクローナル抗体の場合は１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ、ｐＨ１．５を４０秒注入するか、または１０ｍＭグリシン ｐＨ１．５の１分注入を２回して、ＮＰＲ１ ｍＡｂ捕捉表面を再生した。結合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）は，Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを用いて，リアルタイムの結合センサグラムを質量輸送制限のある１：１結合モデルに適合させることにより決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）は、動態速度から以下のように算出した。
Figure 2022505604000003
結果
２５℃および３７℃で本発明の選択された抗ＮＰＲ１抗体に結合する異なるＮＰＲ１タンパク質の結合動態パラメータを表３～２６に示す。
Figure 2022505604000004
Figure 2022505604000005
Figure 2022505604000006
Figure 2022505604000007
Figure 2022505604000008
Figure 2022505604000009
Figure 2022505604000010
Figure 2022505604000011
Figure 2022505604000012
Figure 2022505604000013
Figure 2022505604000014
Figure 2022505604000015
Figure 2022505604000016
Figure 2022505604000017
Figure 2022505604000018
Figure 2022505604000019
Figure 2022505604000020
Figure 2022505604000021
Figure 2022505604000022
Figure 2022505604000023
Figure 2022505604000024
Figure 2022505604000025
Figure 2022505604000026
Figure 2022505604000027
表３～６に示すように、選択された抗ＮＰＲ１抗体は、単量体のヒトおよびサルＮＰＲ１に結合した。
表９～２０に示すように、抗体は、ＡＮＰまたはＢＮＰの存在下および非存在下の両方で、ヒトおよびサルのＮＰＲ１二量体に結合した。
ｍＡｂ２５５０２がＡＮＰ／ＢＮＰの存在下でｍＮＰＲ１に結合したことを除いて、抗体はマウスＮＰＲ１に結合しなかった（表２１～２６）。
実施例４：選択された抗ＮＰＲ１アゴニストモノクローナル抗体間の交差競合
実験手順
抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体のパネル内の結合競争は、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）上のリアルタイム、ラベルフリーバイオ－レイヤーインターフェロメトリーアッセイを用いて決定した。実験全体は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｗｅｅｎ－２０、１ｍｇ／ｍＬ、ＢＳＡ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＴ）緩衝液を用いて、２５℃で１０００ｒｐｍの速度でプレートを振盪して行った。２つの抗体がそれぞれのエピトープに結合するために互いに競合するかどうかを評価するために、Ｃ－末端マウスＩｇＧ２ａを発現させた１００ｎＭのリコンビナントヒトＮＰＲ１（ｈＮＰＲ１－ｍＦｃ；配列番号：４５３）を、まず２μＭのヒトＡＮＰと共に少なくとも２時間インキュベートした。最初に、抗マウスＦｃ抗体をコーティングしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ，＃１８－５０９０）をｈＮＰＲ１－ｍＦｃ／ｈＡＮＰ複合体を含むウェルに４５秒間浸漬することにより、約０．３－０．５ｎｍのリコンビナントｈＮＰＲ１－ｍＦｃ／ｈＡＮＰ複合体を捕捉した。次に、抗原を捕捉したバイオセンサーチップを、ｍＡｂ－１の５０μｇ／ｍＬ溶液を含むウェルに５分間浸漬することにより、第１の抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ－１と称する）で飽和させた。次に、バイオセンサーチップを、第２の抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ－２と呼ぶ）の５０μｇ／ｍＬの溶液を含むウェルに３分間浸漬した。バイオセンサーチップを、実験の各ステップの間にＨＢＳ－ＥＢＴ緩衝液で洗浄した。実験の全過程でリアルタイムの結合応答をモニターし，各ステップの終了時の結合応答を記録した。ｍＡｂ－１とプレ複合体形成した（ｐｒｅ－ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）ｈＮＰＲ１－ｍＦｃ／ｈＡＮＰに結合するｍＡｂ－２の応答を比較し、異なる抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体の競合／非競合挙動を決定した。
結果
Figure 2022505604000028
Figure 2022505604000029
表２７は、選択された抗ＮＰＲ１抗体間の交差競合を示す。
実施例５：ＮＰＲ１を発現する細胞への抗体の結合
実験手順
リガンドの１つ、ヒトＡＮＰ（ｈＡＮＰ）を用いて、または用いることなく、ヒトＮＰＲ１（ｈＮＰＲ１）を発現する細胞に結合する抗ヒト（ｈ）ＮＰＲ１モノクローナル抗体の能力を、電気化学発光（ＥＣＬ）に基づく検出を用いて決定した。
簡潔には、ヒトＮＰＲ１（アミノ酸Ｍ１－Ｇ１０６１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１６０６６）をコードするネオマイシン耐性ｐＬＶＸ．ｈＮＰＲ１．ｍｙｃ．ＤＤＫ発現プラスミドでヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞をトランスフェクトすることにより、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ１．ｍｙｃ．ＤＫＫ発現細胞を設計した。非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞は、市販のａ－ｈＮＲＰ１抗体を用いた蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりＮＰＲ１の発現が検出されず、非特異的結合コントロールとして含めた。
実験は、以下の手順に従って実施した。上述の株の細胞を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない１ｘＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、酵素を含まない細胞溶解液（Ｅｎｚｙｍｅ Ｆｒｅｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて３７℃で１０分間インキュベートし、フラスコから細胞を剥離した。すべての細胞をＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含む１ｘＰＢＳで１回洗浄し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標）オートＴ４セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でカウントした。約２．０ｘ１０４個のＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ１．ｍｙｃ．ＤＤＫまたはＨＥＫ２９３細胞を９６ウェル炭素電極プレート（ＭＵＬＴＩ－ ＡＲＲＡＹ ｈｉｇｈ ｂｉｎｄ ｐｌａｔｅ， Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ （ＭＳＤ、メリーランド州、ロックビル））に別々に播種し、３７℃で１時間（ｈ）インキュベートした。非特異的結合部位は，Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含む１ｘＰＢＳ中の２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）により、室温（ＲＴ）で１時間ブロックした。ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ１．ｍｙｃ．ＤＤＫ細胞は、１０ｎＭヒトＡＮＰ（Ｔｏｃｒｉｓ、ミネソタ州、ミネアポリス）を含む、または含まないサンプル希釈緩衝液中、室温で０．５時間インキュベートし、ＨＥＫ２９３細胞はサンプル希釈緩衝液のみで同じ条件でインキュベートした。洗浄せずに、１．７ｐＭから１００ｎＭの範囲の抗ＮＰＲ１、ＣＯＭＰ１、もしくはアイソタイプコントロール抗体の連続希釈液、または抗体を含まない緩衝液を、プレートに結合した細胞に室温で１時間加えた。その後、プレートを洗浄し、細胞洗浄ヘッドを備えたＡｑｕａＭａｘ２０００プレートウォッシャー（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリホルニア州、サニーベール）を用いて、結合していない抗体および／またはｈＡＮＰを除去した。プレートに結合した抗体を、重鎖および軽鎖に特異的なＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）コンジュゲートヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州、ウエストグローブ）を用いて、室温で１時間検出した。
洗浄後、プレートを製造者の推奨手順に従ってＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ、メリーランド州、ロックビル）で現像し、発光シグナルをＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６００（ＭＳＤ、メリーランド州、ロックビル）で記録した。相対光単位（ＲＬＵ）で測定した発光強度を記録して、各抗体の濃度範囲での結合強度を示した。１０ｎＭ ｈＡＮＰを用いて、または用いることなくＮＰＲ１遺伝子改変細胞に結合する３．７ｎＭ抗体で検出したシグナルを、ｈＡＮＰなしで親細胞に結合する同じ濃度の抗体と比較した比率を、ＮＰＲ１結合の特異性の指標として報告した。結合比が３またはそれ以上の抗体を特異的結合剤とし、結合比が３未満の抗体を非結合剤とした。
さらに、直接結合シグナル（ＲＬＵ）を抗体濃度の関数として分析し、Ｒ統計パッケージ（オープンソース）を用いてシグモイド形（４パラメータロジスティック）用量応答モデルでデータを適合させた。ＥＣ５０値は、最大結合シグナルの５０％が検出される抗体濃度として定義され、１０ｎＭ ｈＡＮＰを用いてまたは用いることなくＮＰＲ１遺伝子改変細胞に対する結合力を示すものとして決定された。ＥＣ５０値は特異的結合剤についてのみ報告し、表２８において比率が３より下の抗体には（－）を付けた。
結果
表２８は、ヒトＮＰＲ１またはＮＰＲ１－ＡＮＰ複合体を発現するように設計された細胞に対する選択された抗ＮＰＲ１抗体の結合を示す。
Figure 2022505604000030
表２８の結果が示すように、すべての抗ＮＰＲ１抗体は、１０ｎＭのｈＡＮＰの存在下で、比率≧２でｈＮＰＲ１改変細胞に特異的に結合した。１０ｎＭ ｈＡＮＰ存在下でのＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ１．ｍｙｃ．ＤＤＫ細胞におけるこれらの抗体の効力は、ＥＣ５０値が０．１５ｎＭから３．７ｎＭの範囲であった。５つの抗体とコンパレータ１は、１０ｎＭのｈＡＮＰの存在下でのみＮＰＲ１改変細胞に特異的に結合し、ペプチド依存性ＮＰＲ１結合剤に分類された。他の７つの抗体は、１０ｎＭのｈＡＮＰを用いておよび用いることなしにｈＮＰＲ１改変細胞に結合し、これらの抗体はペプチド非依存性ＮＰＲ１結合剤として分類された。ｈＡＮＰを添加していないＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ１．ｍｙｃ．ＤＤＫ細胞におけるこれらの抗体の効力は、ＥＣ５０値が０．４９ｎＭから４．６ｎＭの範囲であった。
実施例６：アゴニスト抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体によるＮＰＲ１の活性化
実験手順
ヒトナトリウム利尿ペプチド受容体１（ｈＮＰＲ１）の転写活性化を評価するために、ＨＥＫ２９３にサイクリックヌクレオチドゲートチャネルアルファ２（ＣＮＧＡ２）およびｈＮＰＲ１を安定的に発現させることによって安定した細胞株を作成した。ＣＮＧＡ２は、ｃＧＭＰによって活性化されるカルシウムチャネルであるため、ｃＧＭＰ発生のセンサーとして使用することができる（Ｗｕｎｄｅｒら、２００５、ＰＭＩＤ：１５７６６７１６）。ＮＰＲ１がリガンドによって活性化され、ｃＧＭＰが生成されると（Ｚｏｉｓら、２０１４、ＰＭＩＤ：２４８２０８６８）、ＣＮＧＡ２が活性化され、蛍光Ｃａ＋＋インジケーターを用いてカルシウム流入量を測定することができる。ｈＮＰＲ１、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ１．ＭｙｃＤＤＫ／ＣＮＧＡ２．Ｍｙｃ ＨＳ、または略称ＨＥＫ２９３／ＣＮＧＡ２／ｈＮＰＲ１を高発現する細胞株を選別し、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕｔ、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシン、５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８ 硫酸塩を含むＤＭＥＭ中で維持した。
ＡＮＰの非存在下でのヒトＮＰＲ１シグナル伝達における抗ｈＮＰＲ１抗体の効果を測定するためにバイオアッセイを行った。バイオアッセイのために、ＨＥＫ２９３／ＣＮＧＡ２／ｈＮＰＲ１細胞を、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕｔを含むＤＭＥＭ中で３０，０００細胞／ウェルでブラッククリアボトムＰＤＬプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌朝、培地を除去し、プロベネシド入りＦＬＵＯ４－ＮＷアッセイバッファ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）８０μｌを用いて３７℃で３０分間細胞に負荷をかけた。精製したｈＮＰＲ１抗体またはアイソタイプコントロール抗体を１：３で約０．４ｎＭ～１μＭに連続希釈し（８ポイント）、またはＡＮＰを１：３で約０．３ｐＭ～２ｎＭに連続希釈し（１０ポイント）、ＦＬＩＰＲ ＴＥＴＲＡ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてアッセイプレートに移した。ベースラインと反応画像を撮影した。用量反応曲線は、最大－最小または曲線下面積（ここに示す）に基づいて決定し、その結果をＰｒｉｓｍ（商標）６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）の非線形回帰（４パラメータロジスティック）を用いて分析し、ＥＣ５０値を得た。抗体の活性化％は、ＡＮＰによって達成されたＲＦＵの最大範囲を超える、抗体によって達成されたＲＦＵの最大範囲を計算した。
結果
表２９は、抗ＮＰＲ１抗体によるヒトＮＰＲ１の活性化を示す。
Figure 2022505604000031
本発明の選択された抗ＮＰＲ１抗体によるｈＮＰＲ１の活性化は、２つの実験（実験ＩおよびＩＩ）においてＨＥＫ２９３／ＣＮＧＡ２／ｈＮＰＲ１のカルシウムフラックス活性を測定することによって試験した（表２９）。表２９（実験Ｉ）に示すように、１１個の精製ＮＰＲ１抗体はＣａ２＋フラックスの活性化を示し、最大活性化は５５～１３０％の範囲であり、ＥＣ５０は８３．７～３８３．９ｎＭの範囲であった。１９個の抗体は、最大活性化が３１％未満と弱い活性化を示した（データは示さず）。実験ＩＩでは、９個の抗ＮＰＲ１抗体が、４１．６～＞２００ｎＭのＥＣ５０で５７～１２９％の最大活性化を示した（表２９）。ＡＮＰはＥＣ５０が６０．５～９８．８ｐＭであった。コントロールｈＩｇＧ４アイソタイプ抗体では活性化は見られなかった。
実施例７：アゴニスト抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体の単回投与による正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの全身血圧における効果
実験手順
本研究の目的は、遠隔測定された正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにおいて、選択したＮＰＲ１アゴニスト抗体がベースラインの全身血圧に及ぼす効果を評価することであった。
１０～２０週齢の雄ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕ（ｎ＝５０）マウスにＰＡ－Ｃ１０遠隔計測器（ＤＳＩ、ミネアポリス州、セントポール）を移植し、７日間回復させた後、群（群１～１２）に割り当てた（表３０）。
Figure 2022505604000032
動物は、標準的な条件（温度６４°Ｆ～８４°Ｆ（１８℃～２９℃）、相対湿度３０％～７０％）で個別に飼育し、１２時間の明／１２時間の暗サイクルを維持した。餌（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｅｌｌｅｔ ｃｈｏｗ）および水は自由に与えた。
試験タンパク質またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、０日目に適切な動物に単回皮下注射で投与した。各動物の用量体積は、直近の体重測定に基づいて決定した。
試験期間中、１分毎に収縮期血圧、拡張期血圧、平均動脈圧、心拍数を１０秒間収集した。有効性の急性評価は、試験３日目から試験７日目までに集計したデータで行った。ＮＰＲ１アゴニスト抗体の慢性的な効果は、毎日２４時間データを収集し、２８日にわたる平均で評価した。データはすべて平均値±標準誤差で示した。
結果
ＮＰＲ１アゴニスト抗体の最初のインビボスクリーニングにおいて、投与後３日目から７日目のＰＢＳ投与対照動物と比較すると、９つの抗体（ｍＡｂ２２０３３、ｍＡｂ２５４７９、ｍＡｂ２５４９７、ｍＡｂ２２８０５、ｍＡｂ２５５４５、ｍＡｂ２２８０９、ｍＡｂ２５４９１、ｍＡｂ２５５０２およびｍＡｂ２２８１０）では、全身血圧が有意に低下し、１つの抗体（ｍＡｂ２２０３５）では効果がなかったことが実証された（図１）。投与後３日目から７日目までの収縮期血圧のベースラインからの変化の平均値で評価した血圧低下の大きさは、－３．２±０．２（ｍＡｂ２５４９７Ｎ）から－１１．５±０．８（ｍＡｂ２２８１０）ｍｍＨｇの範囲であった。
ＮＰＲ１アゴニスト抗体の慢性的な効果を２８日にわたって評価した（表３１）。
Figure 2022505604000033
正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにおいて、０日目に単回皮下注射を行ったところ、１つの抗体（ｍＡｂ２２０３５）では血圧が約４～７ｍｍＨｇ有意に上昇し、残りの抗体では全身血圧が２～１１ｍｍＨｇ低下した。全身血圧の上昇および低下に対する心拍数の反応は変わりやすく、いくつかの群では上昇し、他では低下した。
実施例８：正常血圧のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの全身血圧におけるアゴニスト抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体の用量効果
実験手順
本研究の目的は、遠隔測定された正常血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにおいて、ＮＰＲ１アゴニスト抗体ｍＡｂ２２０３３の全身血圧における用量反応を評価することであった。約２０週齢の雄ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕ（ｎ＝３０）マウスにＰＡ－Ｃ１０遠隔計測器（ＤＳＩ、ミネソタ州、セントポール）を移植し、７日間回復させてから、群（群１～５）に割り当てた（表３２）。
Figure 2022505604000034
動物は、標準的な条件（温度６４°Ｆ～８４°Ｆ（１８℃～２９℃）、相対湿度３０％～７０％）で個別に飼育し、１２時間の明／１２時間の暗サイクルを維持した。餌（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｅｌｌｅｔ ｃｈｏｗ）および水は自由に与えた。
試験タンパク質は、０日目に１回、皮下注射で適切な動物に投与した。各動物の用量体積は、直近の体重測定値に基づいた。尿および血清バイオマーカー評価のために、２８日目に尿を採取し、試験１４日目および試験終了時に血液サンプルを採取した。心エコー図は、利尿前の２８日目に実施した。
試験期間中、収縮期血圧、拡張期血圧、平均動脈圧、および心拍数を毎分１０秒間収集した。図示した遠隔測定データは、試験の生存部分の期間中、生存信号を有する動物から得た。
結果
血圧（図２、３および５）は、正常血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにｍＡｂ２２０３３を単回投与した後、最大４週間１０～１５ｍｍＨｇ低下した。全ての用量におけるピーク圧低下は同様であり、血圧効果の持続期間は１ｍｇ／ｋｇで約１０日、５０ｍｇ／ｋｇでは２８日より長かった。
Figure 2022505604000035
尿中のｃＧＭＰ濃度（表３４）は、５０ｍｇ／ｋｇ群で２８日目に有意に増加し、他のすべての用量ではコントロールと同様のレベルであった。
Figure 2022505604000036
相対的な心臓重量（表３５）は、５０ｍｇ／ｋｇ群でより低く、１、５および２５ｍｇ／ｋｇ群では減少傾向にあった。体重（表３５）、絶対心臓重量（表３５）、標準血清（ＡＬＴ、ＡＭＹＬＡＳ、ＡＳＴ、ＣＨＯＬ、ＣＫＮＡＣ、ＣＲＥＡ、ＤＨＤＬ、ＩＰ、ＴＲＩＧ、ＴＰ、ＵＡ、ＵＮ、ＭＧ、ＮＥＦＡ）または尿（ＡＬＢ、ＧＬＵＨ、ＣＲＥＡ、ＰＲＯ、ＣＡ、ＩＰ、ＭＧ、ＵＮ、ＡＭＹＬＡＳ、ＵＡ、ＮＡ、Ｋ、ＣＬ）の化学的性質に有意な効果は認められなかった。
Figure 2022505604000037
ｍＡｂ２２０３３の投与後、心機能（図６および７Ａ）が向上し、２５ｍｇ／ｋｇ用量群で収縮末期容積が統計的に有意に減少し（図７Ａ）、２５および５０ｍｇ／ｋｇ用量群で最も明らかなように、短縮率（図７Ｃ）および駆出率（図７Ｂ）の両方において増加傾向にあった。
重要な所見として、ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｍＡｂ２２０３３は、収縮期血圧および平均動脈血圧を有意に低下させ、最大２８日持続した。心拍数の代償的増加は、最初にすべての群で観察され、アイソタイプコントロールｍＡｂと比較して、５０ｍｇ／ｋｇ ｍＡｂ２２０３３用量群では持続的で軽微な増加があった。
実施例９：高血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの全身血圧におけるアゴニスト抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体の単回投与の効果
実験手順
本研究の目的は、遠隔測定されたアンジオテンシンＩＩ－（Ａｎｇ ＩＩ）誘発性高血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの全身血圧におけるＮＰＲ１アゴニスト抗体（ｍＡｂ２２０３３またはｍＡｂ２２８１０）の単回投与の効果を評価することであった。約１３週齢の雄ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕ（ｎ＝３６）マウスにＰＡ－Ｃ１０遠隔計測器（ＤＳＩ、ミネソタ州、セントポール）を移植し、７日間回復させてから、群（群１～６）に割り当てた（表３６）。
Figure 2022505604000038
次に、動物に浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ Ｍｉｃｒｏ－Ｏｓｍｏｔｉｃ Ｐｕｍｐ；Ｍｏｄｅｌ １００４；Ｌｏｔ １０３３５－１４）を移植した。ミニポンプにはアンジオテンシンＩＩ酢酸塩（Ｂａｃｈｅｍ；ロット＃１０６６８０４）を充填し、１．５ｍｇ／ｋｇ／日のアンジオテンシンＩＩを送達するために、平均ポンピング速度を０．１１μＬ／時に設定した。ミニポンプは投与開始の３日前に肩甲骨部の皮下に移植した。動物は標準的な条件（温度６４°Ｆ～８４°Ｆ（１８℃～２９℃）、相対湿度３０％～７０％）で個別に飼育し、１２時間の明／１２時間の暗サイクルを維持した。餌（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｅｌｌｅｔ ｃｈｏｗ）および水は自由に与えた。
試験タンパク質は、３日目に１回、適切な動物に皮下注射で皮下投与した。各動物の用量体積は、直近の体重測定に基づいた。
試験期間中、収縮期血圧、拡張期血圧、平均動脈圧、および心拍数を毎分１０秒間収集した。尿は１４日目および２０日目に採取した。
結果
ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ（ｍＡｂ２２０３３またはｍＡｂ２２８１０）の単回投与は、アンジオテンシン－ＩＩ誘発性高血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスに投与したときに、全身血圧を有意に低下させた（図８、９および１１）。２３日平均血圧（表３７）は、ＩｇＧ４アイソタイプコントロールと比較して、ｍＡｂ２２０３３またはｍＡｂ２２８１０のいずれかを投与した動物において、すべて有意に低かった。
Figure 2022505604000039
Figure 2022505604000040
Figure 2022505604000041
心拍数効果（図１０）は、急性的に有意に増加し、慢性的にはより緩やかな増加を示した。２３日平均心拍数（表３７）は、アイソタイプコントロール動物と比較して、すべての試験物質投与群で有意に高かった。尿中ｃＧＭＰレベルは、ｍＡｂ２２０３３またはｍＡｂ２２８１０のいずれかを投与したほとんどの群でより高い傾向があり、２５ｍｇ／ｋｇ ｍＡｂ２２０３３の動物では、１４日目および２０日目にＩｇＧアイソタイプコントロール動物と比較して尿中ｃＧＭＰレベルが有意に増加した（表３８）。体重、絶対的または相対的な臓器重量への効果は見られなかった（表３９）。
実施例１０：高血圧症のＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの全身血圧におけるアゴニスト抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体の反復投与の効果
実験手順
本研究の目的は、遠隔測定されたアンジオテンシンＩＩ－（Ａｎｇ ＩＩ）誘発性高血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスの全身血圧におけるＮＰＲ１アゴニスト抗体ｍＡｂ２２０３３の反復投与の効果を評価することであった。約２６週齢の雄ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕ（ｎ＝３０）マウスにＰＡ－Ｃ１０遠隔計測器（ＤＳＩ、ミネソタ州、セントポール）を移植し、７日間回復させた後、群（群１～５）に割り付けた（表４０）。
Figure 2022505604000042
その後、動物に浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ Ｍｉｃｒｏ－Ｏｓｍｏｔｉｃ Ｐｕｍｐ； Ｍｏｄｅｌ １００４； Ｌｏｔ １０３３５－１４）を移植した。ミニポンプには、アンジオテンシンＩＩ酢酸塩（Ｂａｃｈｅｍ；ロット＃１０６６８０４）を充填し、１．５ｍｇ／ｋｇ／日のアンジオテンシンＩＩを送達するために、平均ポンピング速度を０．１１μＬ／時に設定した。ミニポンプは投与開始の７日前に肩甲骨部の皮下に移植した。動物は標準的な条件（温度６４°Ｆ～８４°Ｆ（１８°Ｃ～２９°Ｃ）、相対湿度３０％～７０％）で個別に飼育し、１２時間の明／１２時間の暗サイクルを維持した。餌（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｅｌｌｅｔ ｃｈｏｗ）および水は自由に与えた。
収縮期血圧に基づいて動物を群に層別化した。試験タンパク質を、皮下注射により、０日目に１回（群５）、または６日目に始めて３週間、週２回（群１～４）、適切な動物に投与した。各動物の用量体積は、直近の体重測定に基づいた。
試験期間中、収縮期血圧、拡張期血圧、平均動脈圧、および心拍数を毎分１０秒間計測した。
結果
ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ２２０３３の単回または反復投与は、アンジオテンシン－ＩＩ誘導高血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにおいて、全身血圧（図１２、１３および１５）を正常血圧に近いレベルまで低下させた。ｍＡｂ２２０３３の１、５、または２５ｍｇ／ｋｇの反復投与は、用量依存的に収縮期血圧を低下させ、週２回３週間投与後、各群のベースラインに対する最大低下は、それぞれ１１、１９、および３９ｍｍＨｇであった。５０ｍｇ／ｋｇの単回投与では、７日目までに収縮期血圧は３１ｍｍＨｇ低下し、その後、徐々により高血圧レベルに戻った。２１日平均血圧（表４１）は、ＩｇＧ４アイソタイプコントロールと比較して、ｍＡｂ２２０３３の単回投与または反復投与のいずれかを受けた動物において、すべて有意により低かった。
Figure 2022505604000043
Figure 2022505604000044
Figure 2022505604000045
ｍＡｂ２２０３３の急性効果を分析し、初回投与の２４時間以内に１０～２０ｍｍＨｇの血圧低下があった。心拍数効果（図１４）は変動し、２１日の投与期間中により高い値およびより低い値が観察された。２１日平均心拍数（表４１）は、５および２５ｍｇ／ｋｇの反復投与群で有意により低く、５０ｍｇ／ｋｇの単回投与群でより高い傾向があった。尿中ｃＧＭＰレベルは、２５ｍｇ／ｋｇ反復投与群で有意に上昇し、他の全ての群ではＩｇＧ４アイソタイプコントロールｍＡｂ投与動物と比較して統計学的に有意ではない上昇傾向を示した（表４３）。体重、絶対的もしくは相対的な臓器重量、標準的な血清もしくは尿の化学的性質、または心機能における効果は観察されなかった（表４２および図１６～１７）。
実施例１１：食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスの体重、代謝率およびグルコース恒常性における抗ＮＰＲ１アゴニスト抗体の効果
実験１
この実験では、食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスの体重、代謝率およびグルコース恒常性におけるｍＡｂ２２８１０ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂの効果を試験した。
３０匹の雄ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスに６０％高脂肪食を１０週間与え、その後３群（群あたりｎ＝１０）：アイソタイプコントロール（ヒトＩｇＧ４）抗体、ＮＰＲ１アゴニスト抗体ｍＡｂ２２８１０、またはｈＦｃ．ＦＧＦ２１にランダム化した。ＦＧＦ２１は、肥満マウスモデルにおいて耐糖能の改善、エネルギー消費量の増加、および体重の減少が証明されている分子である（Ｖeｎｉａｎｔ ＭＭ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１２，ＰＭＩＤ：２２７９８３４８）。本試験では、それをエンドポイントのポジティブコントロールとして使用した。処置は、生理食塩水ビヒクル中、毎週（コントロール抗体およびｍＡｂ２２８１０に関して）または週２回（ｈＦｃ．ＦＧＦ２１に関して）のいずれかで皮下注射（Ｓ．Ｃ．）により投与した。表４４は、試験における群、動物の数および用量を示す。
Figure 2022505604000046
個々の体重を、投与前およびその後は週２回記録した。試験の第２週目の間に、マウスを代謝ケージに入れてエネルギー消費量を評価した。試験の第３週目の間に経口グルコース耐性を評価し、６週間の処置後にＥｃｈｏＭＲＩにより体組成を測定した。
図１８Ａは、ｍＡｂ２２８１０ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂの投与後の体重における変化を示す。図１８Ｂおよび図１８Ｃは、ＥｃｈｏＭＲＩによって測定された、処置６週間後の総脂肪量および総除脂肪量をそれぞれ示している。重要な所見は、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１分子が処置期間中に体重および脂肪蓄積の有意な減少をもたらしたのに対し、ｍＡｂ２２８１０ ＮＰＲ１アゴニスト抗体はそうではなかったということである。
図１９Ａ－Ｃは、ｍＡｂ２２８１０ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂのいずれかで１週間処置した後の、ＶＯ２（Ａ）、ＶＣＯ２（Ｂ）またはエネルギー消費量（Ｃ）の変化を、各昼夜サイクルの平均値として分割して示す。重要な所見は、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１分子が処置期間中にＶＯ２、ＶＣＯ２およびエネルギー消費量の有意な増加をもたらしたのに対し、ｍＡｂ２２８１０ ＮＰＲ１アゴニスト抗体はそうではなかったということである。
図２０Ａは、ｍＡｂ２２８１０ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂのいずれかによる２週間の処置後の、経口ブドウ糖負荷試験（２ｇ／ｋｇグルコース）によって測定される耐糖能における変化を示す。図２０Ｂは、Ａの試験開始時に記録した一晩絶食後の血糖値を示す。重要な所見は、ｍＡｂ２２８１０とｈＦｃ．ＦＧＦ２１の両分子が、２週間後に耐糖能の有意な改善をもたらしたことである。さらに、ｍＡｂ２２８１０による耐糖能の改善は、体重またはエネルギー消費量の変化とは無関係であった（図１８および１９に示すとおり）。
実験２
この実験は、食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスの体重、代謝率およびグルコース恒常性におけるｍＡｂ２２０３３ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂの効果を説明する。
３０匹の雄ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスに６０％高脂肪食を１０週間与えた後、３群：アイソタイプコントロール（ヒトＩｇＧ４）抗体、ＮＰＲ１アゴニスト抗体ｍＡｂ２２０３３、またはポジティブコントロールとしてｈＦｃ．ＦＧＦ２１にランダム化した（群あたりｎ＝１０）。処置は、生理食塩水ビヒクル中で、週１回（コントロール抗体およびｍＡｂ２２０３３の場合）または週２回（ｈＦｃ．ＦＧＦ２１の場合）のいずれかで皮下注射（Ｓ．Ｃ．）により投与した。表４５は、試験における群、動物の数、および用量を示す。
Figure 2022505604000047
個々の体重を、投与前およびその後に週２回記録した。試験の第２週目の間に、マウスを代謝ケージに入れてエネルギー消費量を評価した。試験の第４週目の間に経口ブドウ糖耐性を評価し、６週間の処置後にＥｃｈｏＭＲＩにより体組成を測定した。
図２１Ａは、ｍＡｂ２２０３３ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂの投与後の体重における変化を示す。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、ＥｃｈｏＭＲＩで測定した、６週間の処置後の総脂肪量および総除脂肪量をそれぞれ示す。重要な所見は、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１分子が処置期間にわたって体重および脂肪蓄積における有意な減少をもたらしたのに対し、ｍＡｂ２２０３３ ＮＰＲ１アゴニスト抗体はそうではなかったということである。
図２２Ａ－Ｃは、ｍＡｂ２２０３３ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂのいずれかで１週間処置した後のＶＯ２（Ａ）、ＶＣＯ２（Ｂ）またはエネルギー消費量（Ｃ）の変化を、各昼夜サイクルの平均値として分割して示す。重要な所見は、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１分子が処置期間中にＶＯ２、ＶＣＯ２およびエネルギー消費量における有意な増加をもたらしたのに対し、ｍＡｂ２２０３３ ＮＰＲ１アゴニスト抗体はそうではなかったということである。
図２３Ａは、ｍＡｂ２２０３３ ＮＰＲ１アゴニストｍＡｂ、ｈＦｃ．ＦＧＦ２１またはアイソタイプコントロールｍＡｂのいずれかによる４週間の処置後の、経口ブドウ糖負荷試験（２ｇ／ｋｇグルコース）によって測定される耐糖能における変化を示す。図２３Ｂは、Ａの試験開始時に記録した一晩絶食した後の血糖値を示す。重要な所見は、ｍＡｂ２２０３３およびｈＦｃ．ＦＧＦ２１の両分子が、２週間後に耐糖能における有意な改善をもたらしたことである。さらに、ｍＡｂ２２０３３による耐糖能における改善は、体重またはエネルギー消費量の変化とは無関係であった（図２１および図２２に示すとおり）。
実施例１２：ＨＤＸエピトープマッピング
抗ＮＰＲ１抗体によって認識されるヒトＮＰＲ１のエピトープを決定するために、ｍＡｂ２２０３３およびｍＡｂ２２８１０について、それぞれ水素－重水素交換（ＨＤＸ）研究を行った。事前の社内実験では、ＮＰＲ１のｍＡｂ２２８１０への結合には、ＡＮＰペプチドの存在が必要であることが示されている。したがって、ＮＰＲ１／ｍＡｂ２２０３３複合体を用いる従来のＨＤＸ実験に加えて、ＮＰＲ１／ＡＮＰ／ｍＡｂ２２０３３複合体およびＮＰＲ１／ＡＮＰ／ｍＡｂ２２８１０複合体についてもＨＤＸ実験を行った。
この研究のために、抗ＮＰＲ１抗体（ｍＡｂ２２０３３およびｍＡｂ２２８１０）を、製造者のプロトコルに従って、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）アガロースビーズ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，ｃａｔ ＃１７－０９０６－０１）に共有結合させた。ＣＨＯ細胞で発現された組換えヒトＮＰＲ１タンパク質は、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグ（配列番号：１９４）を有するヒトＮＰＲ１タンパク質のエクトドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｐ１６０６６）を含む。ＡＮＰペプチドはＴＯＣＲＩＳから購入した（ｃａｔ ＃１９０６）。
重水素化緩衝液は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、および２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含むＤ２Ｏ中で調製した（ｐＤ＝７．４）。抗原－オン（ａｎｔｉｇｅｎ－ｏｎ）」または「複合体－オン（ｃｏｍｐｌｅｘ－ｏｎ）」のいずれかの実験では、３０μＬ抗体ビーズスラリー（１５μＬビーズに相当）をｈＮＰＲ１．ｍｍｈまたはｈＮＰＲ１．ｍｍｈ／ＡＮＰ複合体と混合した。混合物を室温で穏やかに回転させながらインキュベートした。抗体ビーズからｈＮＰＲ１．ｍｍｈを溶出にさせながら、０．０７５％氷冷ＴＦＡを用いて重水素化をクエンチした。クエンチしたサンプルを直ちにＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ Ｍａｎａｇｅｒに注入し、オンラインでペプシン消化を行った（Ｗａｔｅｒｓ Ｅｎｚｙｍａｔｅ ＢＥＨペプシンカラム、２．１ｘ３０ｍｍ）。消化されたペプチドを、０℃でＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｘ５ｍｍ ＶａｎＧｕａｒｄプレカラムで捕捉し，１％－３０％ Ｂ（移動相Ａ：水中の０．１％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ギ酸）の８分間の勾配分離を用いてＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｘ５０ｍｍカラムに溶出した。質量分析計は、コーン電圧３７Ｖ、スキャン時間０．５秒、質量／電荷範囲５０－１７００Ｔｈに設定した。
ｍＡｂ２２０３３によって認識されるｈＮＰＲ．ｍｍｈ結合エピトープをマッピングするために、２セットのＨ／Ｄ交換実験を行った。最初の実験では、「抗原－オン」フォーマット（抗原のみのＨＤＸの後、抗体ビーズに結合）を使用した。「抗原－オン」実験では，ｈＮＰＲ１．ｍｍｈをＤ２Ｏで調製したリン酸緩衝液（ＰＢＳ－Ｄ、ｐＤ＝７．４）中、室温で３分および８分（２つの別々の予備実験で）重水素化した。続いて、重水素化したｈＮＰＲ１．ｍｍｈをＰＢＳ－Ｄで洗浄したｍＡｂ２２０３３ビーズに加えて、室温で２分間インキュベートした結果、総重水素化時間は、それぞれ５分と１０分となった。その後、氷冷した０．０７５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を用いて、結合したｈＮＰＲ．ｍｍｈをビーズから溶出した。溶出したｈＮＰＲ．ｍｍｈを、オンラインでのペプシン消化、続いて消化性ペプチド質量測定のため、直ちにＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ管理システムに注入した。
第２の実験は、「複合体－オン」フォーマット（複合体化した抗原／抗体ビーズのＨＤＸ）と呼ばれる。この実験では、まずｈＮＰＲ．ｍｍｈを通常のＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中でｍＡｂ２２０３３ビーズに２分間結合させた。その後、複合体をＰＢＳ－Ｄ（ｐＤ＝７．４）で５分または１０分（別々の予備実験で）インキュベートして重水素化した。次のステップ（溶出、注入、ペプシン消化、およびＭＳ分析）は、前の「抗原－オン」手順に記載されているように実施した。
ペプチドの同定および重水素取り込み測定のために、重水素化されていないｈＮＰＲ１．ｍｍｈからのＬＣ－ＭＳＥデータを最初に処理し、Ｗａｔｅｒｓ ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒ（ＰＬＧＳ）ソフトウェアを介してｈＮＰＲ１．ｍｍｈを含むデータベースに対して検索した。同定されたペプチドをＤｙｎａｍＸソフトウェアにインポートし、２つの基準：１）アミノ酸あたりの最小産物：０．３、および２）複製ファイル閾値：２でフィルタリングした。次に、ＤｙｎａｍＸソフトウェアにより、２つの時点での各ペプチドの保持時間および質量精度（＜３０ｐｐｍ）に基づいて、「抗原－オン」、「複合体－オン」実験から各ペプチドの重水素取り込み量を決定することができた。同定されたすべてのペプチドは、偽陽性のヒットを最小限にするために、手作業で検査およびスクリーニングした。
検出したすべてのペプチドのセントロイド値（ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｖａｌｕｅｓ）または平均質量対電荷比（ｍ／ｚ）を計算し、２つの時点での「抗原－オン」実験と「複合体－オン」実験の間で比較した。「複合体－オン」の重水素化後と比較して「抗原－オン」の重水素化後に増加した質量を示したペプチドは、抗体結合の結果として重水素交換から保護されたアミノ酸を含み、したがって結合エピトープ領域を示している。
ＮＰＲ１／ｍＡｂ２２０３３ ＨＤＸ実験では、ｈＮＰＲ１．ｍｍｈから合計１０１個のペプチドが同定され、７４％の配列カバー率（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ）を示した。これらのペプチドのうち、２９～５０および３２８～３４７のアミノ酸を含む１０個のペプチドは、表４６に示すように、「複合体オン」の重水素化と比較して、「抗原－オン」の重水素化の後に有意に質量が増加した。
Figure 2022505604000048
２つのペプチド、アミノ酸４６～５４および３２８～３３５は、「抗原－オン」および「複合体－オン」の手順の間で重水素の取り込みの差を示さなかったので、２９～５０および３２８～３４７のペプチドにおける重水素交換から保護される領域は、残基２９～４５および３３６～３４７に減少された。したがって、アミノ酸２９～４５および３３６～３４７を含む２つのセグメントが、ｈＮＰＲ１．ｍｍｈタンパク質に結合する抗体ｍＡｂ２２０３３のエピトープとして同定される。
ＮＰＲ１／ＡＮＰ／ｍＡｂ２２０３３ ＨＤＸ実験では、ｈＮＰＲ．ｍｍｈから合計９５個のペプチドが同定され、６８％の配列カバー率を示した。これらのペプチドのうち、２９～５０および３３１～３４７にまたがるアミノ酸を含む９つのペプチドは、表４７に示すように、「複合体オン」の重水素交換と比較して、「抗原オン」の重水素交換後に有意に質量が増加した。
Figure 2022505604000049
別のペプチドであるアミノ酸４６～５４は、「抗原－オン」と「複合体－オン」の手順の間で重水素の取り込みの差を示さなかったので、２９～５０ペプチドの重水素交換から保護される領域は、残基２９～４５に減少された。したがって、アミノ酸２９～４５および３３１～３４７を含む２つのセグメントが、ｈＮＰＲ１．ｍｍｈ／ＡＮＰタンパク質複合体に結合する抗体ｍＡｂ２２０３３のエピトープとして同定される。
ＮＰＲ１／ＡＮＰ／ｍＡｂ２２８１０ ＨＤＸ実験では、ｈＮＰＲ．ｍｍｈから合計９３個のペプチドが同定され、７０％の配列カバー率を示した。これらのペプチドのうち、２９～５０、７０～８１および３３１～３４７にまたがるアミノ酸をカバーする１０個のペプチドは、表４８に示すように、「複合体－オン」の重水素交換と比較して、「抗原－オン」の重水素交換後に有意に質量が増加した。
Figure 2022505604000050
３つのペプチド、アミノ酸４６～５４、３３６～３４７、３３７～３４７は、「抗原－オン」と「複合体－オン」の手順の間で重水素の取り込みの差を示さなかったので、２９～５０、および３３１～３４７のペプチドの重水素交換から保護される領域は、残基２９～４５および３３１～３３５に減少される。したがって、アミノ酸２９～４５、７０～８１および３３１～３３５を含む３つのセグメントが、ｈＮＰＲ１．ｍｍｈ／ＡＮＰタンパク質複合体に結合する抗体ｍＡｂ２２８１０のエピトープとして同定される。
実施例１３：ヒト化ＮＰＲ１マウスにおけるＮＰＲ１抗体の硝子体内注射による眼圧低下
本実施例は、ヒト化ＮＰＲ１マウスの眼圧（ＩＯＰ）における例示的なヒトＮＰＲ１抗体ｍＡｂ２２０３３の硝子体内注射（ＩＶＴ）の効果を記載する。
方法：ヒト化ＮＰＲ１マウス（ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕ）を、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）を用いて産生した。ヒト化ＮＰＲ１または野生型（ＷＴ）マウスに、４０μｇ ｍＡｂ２２０３３またはコントロールＡｂの単回硝子体内注射を行った。眼圧は注射後４日間、毎日測定した。２回目の実験では、用量反応を調べるために、４０、１２．６、もしくは４μｇのｍＡｂ２２０３３または４０μｇのコントロールＡｂを硝子体内に注射し、眼圧を毎日監視した。別の実験では、長期送達Ａｂの効果を調べるために、ＮＰＲ１抗体またはｅＧＦＰを発現するＡＡＶ２ベクターを注射し、眼圧を７週間にわたって追跡した。
結果：ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスへの４０μｇのｍＡｂ２２０３３の硝子体内注射では、コントロール抗体と比較して、１日目から３日目まで眼圧が有意に低下した。平均眼圧変化量は５ｍｍＨｇであった。しかし、ＷＴマウスでは眼圧低下効果がなかった。用量反応試験では、４０または１２．６μｇのｍＡｂ２２０３３の硝子体内注射で同様の眼圧低下効果が得られたが、４０μｇのｍＡｂ２２０３３の効果は１２．６μｇよりも長く持続した。４μｇのＮＰＲ１抗体の硝子体内注射では眼圧が低下しなかった。ＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＡＡＶ２－ＮＰＲ１抗体の硝子体内注射後、すべての実験時点で眼圧効果は見られなかった。これは、ＮＰＲ１抗体の発現が低いこと、すなわち全眼球ライセート中に１０ｎｇしか検出されなかったことに起因すると考えられる。
結論：ヒト化ＮＰＲ１マウスにヒトＮＰＲ１抗体（ｍＡｂ２２０３３）を硝子体内投与すると、眼圧が有意に低下したことから、緑内障疾患における眼圧低下のためのアゴニスト抗ＮＰＲ１抗体の可能性が示された。
実施例１４：電子顕微鏡による抗体－ＮＰＲ１複合体の構造解析
方法
多角度光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）滴定
様々な抗体と異なるモル比で複合体化した、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－６ｘＨｉｓタグを有するヒトＮＰＲ１細胞外ドメイン（ｈＮＰＲ１－ｍｍｈ；配列番号：１９４）のいくつかの滴定シリーズを調製した。試験した抗体は、ｍＡｂ２２０３３、ＲＥＧＮ５３０８（ｍＡｂ２２０３３のＦａｂフラグメント）、ｍＡｂ２２８１０、およびＲＥＧＮ５３１４（ｍＡｂ２２８１０のＦａｂフラグメント）であった。すべての滴定シリーズは、ｈＮＰＲ１－ｍｍｈに対して２倍モル過剰の心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＰ、Ｔｏｃｒｉｓ）を用いてまたは用いることなしに両方で行った。ＰＢＳ中４℃で一晩インキュベートした後、複合体をＳＥＣ－ＭＡＬＳシステムに注入した。このシステムは、AＫＴＡマイクロシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ Ｇｌカラム、続いてｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴｒｅｏｓおよびＯｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で構成されている。リン酸塩緩衝液は電子顕微鏡のネガティブ染色と適合しないため、ＳＥＣカラムは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌのランニングバッファーで平衡化し、以下に調製した大規模複合体はすべてこの緩衝液中であった。サイズ排除クロマトグラフィーのデータはＵｎｉｃｏｒｎ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．２０ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて評価し、ＭＡＬＳデータはＡＳＴＲＡ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０．０．６９ Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて評価した。
ネガティブ染色電子顕微鏡サンプル調製
ネガティブ染色電子顕微鏡で使用するために、ｈＮＰＲ１の複合体をより大スケールで調製した。以下のように５つのサンプル：サンプル１＝ｈＮＰＲ１－ｍｍｈ（配列番号：１９４）単独；サンプル２＝ｈＮＰＲ１－Ｆｃ（配列番号：１９７）単独；サンプル３＝ｈＮＰＲ１－ｍｍｈ＋ＡＮＰ、モル比１：２；サンプル４＝ｈＮＰＲ１－ｍｍｈ＋ＲＥＧＮ５３０８；モル比１：１．５；サンプル５＝ｈＮＰＲ１－ｍｍｈ＋ＡＮＰ＋ＲＥＧＮ５３０８、モル比１：２：１．５を調製した。サンプル１、３、４、５は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験と同じ方法でサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ピーク画分を集め、－８０℃で凍結し、ＥＭ分析のためにＮａｎｏＩｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．に送った。サンプル２は，ＰＢＳに溶解した２．６２ｍｇ／ｍｌのストック溶液から直接採取し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５＋１５０ｍＭ ＮａＣｌに緩衝液交換した後、１．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、－８０℃で凍結し、他のサンプルと一緒に送った。
ネガティブ染色電子顕微鏡データの収集および処理
５つのタンパク質サンプルは、ギ酸ウラニル（ＮａｎｏＩｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を用いて標準的な方法でネガティブ染色ＥＭグリッドを調製した。グリッドは、Ｃ－フラットホーリーカーボングリッド上に置かれた連続カーボンの薄層を含んでいた。ＴＥＭ像は、Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２電子顕微鏡（ＦＥＩ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて１２０ｋｅＶで動作させ、ＦＥＩ Ｅａｇｌｅ ４ｋ ｘ ４ｋ ＣＣＤカメラを用いて室温で収集した。画像は、さまざまな公称倍率、主に６７，０００倍および１１０，０００倍で収集した。収集した画像をさらに社内で処理した。
ＮａｎｏＩｍａｇｉｎｇ顕微鏡写真を眼により目視検査し、汚れのコントラストが悪い画像、全体の画像の約１／５を削除した。残りの画像を倍率によって分けた。１１０，０００倍の画像は、画像あたりの粒子数が少ないため、さらなる分析にはあまり役に立たなかった。そのため、その後の処理工程はすべて６７，０００倍の画像を用いて行った。すべての画像はＣＴＦＦＩＮＤ４を用いてＣＴＦ補正を行った。
ＥＭ粒子ピッキングおよび２Ｄクラス平均化
５つのネガティブ染色サンプルすべての粒子分布は非常に良好で、均一な粒子サイズ、ごくわずかな凝集、および良好な粒子密度であった。サンプル４および５では、初期段階の手動ピッキングおよび２Ｄクラス平均化から得られたオートピッキングテンプレートでＲｅｌｉｏｎを用いて粒子をピッキングした。サンプル４（ｈＮＰＲ１＋ＲＥＧＮ５３０８）では、合計７５枚の顕微鏡写真から１９１８４個の良好な粒子を選択した。サンプル５（ｈＮＰＲ１＋ＡＮＰ＋ＲＥＧＮ５３０８）では、合計８８枚の顕微鏡写真から２０３１８個の良好な粒子を最初に選択した。Ｒｅｌｉｏｎを用いた初期の２Ｄクラス平均化は、両データセットにおいて実質的に不均一性を示し、相当な数のクラスがＲＥＧＮ５３０８ Ｆａｂのみ、またはＮＰＲ１のみを示した。
サンプル５の２Ｄクラス平均化は、ＦａｂのみまたはＮＰＲ１のみに対応する粒子を排除することでさらに精密化された。残りの９２１９個の粒子を使用して新しい２Ｄクラス平均を計算し、これはＮＰＲ１＋ＲＥＧＮ５３０８複合体のより良好な分布図を示し、少数の複合体がＮＰＲ１二量体に結合した１つのＦａｂのみを含む一方で、大多数の複合体が２つのＦａｂを含むことが明らかになった。１つのＦａｂの複合体を除去すると、粒子セットはさらに６７２８個の粒子に減少した。
ネガティブ染色ＥＭデータからの３Ｄ画像再構築
ＮＰＲ１－ＡＮＰ－ＲＥＧＮ５３０８複合体の初期３Ｄモデルは、確率的勾配降下法の「３Ｄ初期モデル」手順を用いて、解像度を４０Åに制限してＲｅｌｉｏｎで構築した。次に、このモデルをさらに６０Åまでローパスフィルターをかけて、予想段階の解像度を２５Åに限定して、上記の６７２８個の粒子をＲｅｌｉｏｎで３Ｄクラス分類する際の基準として使用した。その後、「ゴールドスタンダード」ＦＳＣで測定して最終的な解像度２２Åで、最良の３ＤクラスをＲｅｌｉｏｎで収束するまでさらに精密化した。なお、３Ｄクラス分類または精密化の際には、２回転対称（ｔｗｏ－ｆｏｌｄ ｓｙｍｍｅｔｒｙ）は考慮しなかった。３Ｄ再構成の結果得られた密度マップでは、ＡＮＰ結合ＮＰＲ１の結晶構造（ＰＤＢコード１Ｔ３４）と一致した、正方形の粒子の片側に結合した２つのＦａｂを示した、。
低温電子顕微鏡サンプルの調製とデータ収集
ＮＰＲ１－ＡＮＰ－ＲＥＧＮ５３０８複合体のサンプルを、上述のネガティブ染色ＥＭサンプルと同様の方法で、クライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）用に調製した。最終複合体濃度は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で０．８ｍｇ／ｍｌであった。ＵｌｔｒＡｕＦｏｉｌグリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｏｌｓ ＧｍｂＨ）およびＶｉｔｒｏｂｏｔ（ＦＥＩ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、標準的な手法でＣｒｙｏＥＭサンプルを調製した。データ収集は、３００ｋＶの電圧で動作するＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ電子顕微鏡（ＦＥＩ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で、計数モードのＫ２直接電子検出器およびＧＩＦエネルギーフィルタ（Ｇａｔａｎ， Ｉｎｃ）を用いて行った。倍率１３０，０００倍（１．０４Å／ピクセル）、デフォーカス範囲－０．５～－１．５ミクロン、および総線量４５．４４ｅ－／Å２で１４０９本の動画を収集した。データ収集はＬｅｇｉｎｏｎソフトウェアで制御した。
ＣｒｙｏＥＭデータの処理および構造決定
すべてのｃｒｙｏＥＭ動画は、ｃｉｓＴＥＭパッケージを使用して、動き補正、線量加重（ｄｏｓｅ－ｗｅｉｇｈｔｅｄ）、ＣＴＦ補正した。その後、画像を手作業で検査して、厚い氷、ＣＴＦパラメータ不良（フィット分解能が６Åより悪い）、粒子なし、汚染があるものなどを除去した。このフィルタリング後に１１７２枚の画像が残り、次に、これをｃｉｓＴＥＭの非テンプレート式粒子ピッキングに使用して、８７２９１５個の粒子位置を得た。２Ｄクラス分類で不良粒子を除去した後、最初に生成した出発３Ｄ基準体積によるｃｉｓＴＥＭを用いた３Ｄ自動精密化では、６８６７０９個の粒子が含まれていた。３Ｄ精密化により、フーリエ・シェル相関曲線から推定される２．８Åの解像度で単一解に収束した。
次に、この３Ｄマップを、上述のネガティブ染色ＥＭ ３Ｄマップに組み込まれたモデルから出発して、構造精密化に使用した。両方のＮＰＲ１分子のＮ末端とＣ末端のドメインを、ＥＭマップ中に剛体として実空間精密化し、その後、モデルがＥＭ密度と一致しないいくつかの場所では、手作業で再構築した。ＲＥＧＮ５３０８のホモロジーモデルは、手作業でＥＭ密度に配置した。ＣＤＲ領域を注意深く観察することで、軽鎖に対する重鎖の向きを決定することができた。このモデルのＣＤＲ領域は、ＥＭ密度に合わせるために大規模な再構築が必要であった。最後に、Ｐｈｅｎｉｘを用いた実空間位置の精密化により最新の複合体の構造モデルを作成した。
結果／考察
多角度光散乱を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）滴定
ｈＮＰＲ１－ｍｍｈとｍＡｂ２２０３３との相互作用において、ｈＮＰＲ１－ｍｍｈ自体は、ＡＮＰの存在下および非存在下で、分子量約１１０ｋＤａの二量体として振る舞い、ＡＮＰがＮＰＲ１に結合すると分子量がわずかに増加した。ｈＮＰＲ１－ｍｍｈそれ自体では、遊離単量体のピークは観察されなかった。ＡＮＰ非存在下でｍＡｂ２２０３３を用いた滴定は、複合体の２つの主要な種：１つのＮＰＲ１二量体に１つのＩｇＧが結合した分子量を有する種、および２つのＮＰＲ１二量体に１つのＩｇＧが結合した分子量を有する種を示した。しかし、ＡＮＰの存在下でＮＰＲ１にｍＡｂ２２０３３を加えると、ＮＰＲ１およびＩｇＧの「ペーパードール（ｐａｐｅｒ ｄｏｌｌ）」ポリマーを表す可能性のある、より高分子量の種が形成された。
続いて、ｍＡｂ２２０３３のＦａｂフラグメント、ＲＥＧＮ５３０８を考慮してシステムを単純化した。ｈＮＰＲ１－ｍｍｈおよびＲＥＧＮ５３０８の複合体では、ＡＮＰのない同じ複合体と比べて、結合したＡＮＰにより非常に異なるＳＥＣプロファイルを示す。ＮＰＲ１－ＲＥＧＮ５３０８複合体は、約１５５ｋＤａの分子量を有しており、ＮＰＲ１二量体あたり結合した１つのＦａｂ結合と一致する。ＡＮＰの存在下では、ＮＰＲ１－ＡＮＰ－ＲＥＧＮ５３０８複合体の分子量は約５０ｋＤａ増加し、ＮＰＲ１二量体あたり結合した２つのＦａｂと一致する。本発明者らは、以前に記載されたＡＮＰ結合によるＮＰＲ１の構造変化（Ｏｇａｗａ，Ｈら、２００４）が２つ目のＦａｂの結合を可能にしており、そして、完全なＩｇＧ ｍＡｂ２２０３３で観察されたペーパードールポリマーの成長には、２Ｆａｂ＋２ＮＰＲ１＋ＡＮＰの複合体が必要であると提案している（さらなる考察は下記参照）。
また、ｈＮＰＲ１－ｍｍｈおよびｍＡｂ２２８１０を用いた滴定も実施した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析では、ｍＡｂ２２８１０サンプルのごく一部が二量体であり、標準的なＩｇＧの分子量の１５０ｋＤａに対して、約３１５ｋＤａの分子量であることが示された。ＮＰＲ１－ｍＡｂ２２８１０－ＡＮＰ複合体を用いたＳＥＣ－ＭＡＬＳ滴定では、４３０～７００ｋＤａの範囲にある種の不均一な混合物が示された。このプロファイルは複雑すぎて信頼性の高い解釈ができなかったが、これはおそらくｍＡｂ２２８１０タンパク質に含まれるＩｇＧ二量体不純物が原因である。ｍＡｂ２２８１０のＦａｂフラグメント、ＲＥＧＮ５３１４を用いたＳＥＣ－ＭＡＬＳ滴定では、ＡＮＰの非存在下でＮＰＲ１に対するＲＥＧＮ５３１４の結合は、ＳＥＣによって単離できる複合体種を生成するには、弱すぎる、または一時的であることが示された。ＡＮＰが存在する場合、単一のＮＰＲ１－ＲＥＧＮ５３１４－ＡＮＰ複合体が、約１７０ｋＤａの分子量で形成され、ＮＰＲ１の二量体あたり結合した１つのＦａｂと一致している。
ネガティブ染色２Ｄクラス平均
ｈＮＰＲ１＋ＲＥＧＮ５３０８およびｈＮＰＲ１＋ＡＮＰ＋ＲＥＧＮ５３０８の複合体をさらにネガティブ染色電子顕微鏡によって分析した。複合体粒子の２Ｄクラス分類および平均化により、サンプルの実質的な不均一性が明らかになった。ＥＭグリッド上の粒子の大部分は、ｈＮＰＲ１のみ、またはＲＥＧＮ５３０８ Ｆａｂのみにクラス分類することができた。画像処理用に提出されたタンパク質サンプルは精製された均一な複合体であったため、これらの複合体はネガティブ染色グリッドの作成過程で成分に解離していると考えられる。しかし、複合体のかなりの部分は無傷で残っており、分析に使用することができる。
ｈＮＰＲ１＋ＲＥＧＮ５３０８のネガティブ染色２Ｄクラス平均は、単一のＦａｂのみがｈＮＰＲ１二量体に結合しているのが見られる「ワンアーム型（ｏｎｅ ａｒｍｅｄ）」複合体を示しており、ＳＥＣ－ＭＡＬＳの結果と一致している。これに対して、ｈＮＰＲ１＋ＡＮＰ＋ＲＥＧＮ５３０８のネガティブ染色２Ｄクラス平均では、２つのＦａｂが二量体に結合した「ツーアーム型（ｔｗｏ ａｒｍｅｄ）」の複合体を示している。異なる平均は、実際の３次元複合体の異なる投影図を表している。１つのクラス平均では、ｈＮＰＲ１二量体は側面から見て、密度の２つのローブがあり、一方は２つの単量体のＮ末端ドメインが互いに重なり合ったものに相当し、もう一方のローブは２つの重なり合ったＣ－末端ドメインに相当する。この向きでは、結合した２つのＦａｂは、ＮＰＲ１の密度の頂部にある「ウサギの耳」のように見える。別の見方をすると、ｈＮＰＲ１の４つのすべてのドメインは、正方形を形成する４つの密度の塊として見ることができ、正方形の上の２つのＲＥＧＮ５３０８ Ｆａｂは、お互いに交差して逆Ｖ字を作っている。ｈＮＰＲ１＋ＡＮＰ＋ＲＥＧＮ５３０８のクラス平均では、「ワンアーム型」複合体も見られたが、これらは、遊離Ｆａｂおよび遊離ＮＰＲ１を生成したのと同じ複合体の解離によるものと考えられる。
ｈＮＰＲ１＋ＡＮＰ＋ＲＥＧＮ５３０８のｃｒｙｏＥＭデータから算出された２Ｄクラス平均は、ネガティブ染色データと比較して、複合体の異なる見解を示しており、特に「ウサギの耳」の向きは存在しない。しかし、他のｃｒｙｏＥＭの２Ｄクラス平均は、ネガティブ染色データの対応する平均と密接に一致させることができる。ｃｒｙｏＥＭのデータでは、複合体の解離の証拠があまり見られず、これは、おそらく出発試料がより均質であることと、低温凍結条件が溶液中の複合体の固有のコンフォメーションをよりよく保つことによるものと考えられる。
３Ｄ画像の再構成
２Ｄクラス平均を出発点として使用し、ｈＮＰＲ１＋ＡＮＰ＋ＲＥＧＮ５３０８のｃｒｙｏＥＭ密度の３次元マップを構築した。この再構築手順は、複合体直径の大まかな推定を超えて、複合体の予想される形状またはサイズに関するなんらかの事前情報を必要としないので、得られるｃｒｙｏＥＭマップは、抗体－標的複合体がどのように形成されるべきかという予想に偏ることはない。次に、既知のｈＮＰＲ１＋ＡＮＰの結晶構造を、既知のＦａｂ構造とのホモロジーによって生成されたＲＥＧＮ５３０８のＦａｂのモデルとともに、このＥＭ密度マップに配置し、精密化した。ＮＰＲ１およびＦａｂの構造は手作業でおよその位置に配置し、次にＰｈｅｎｉｘを使って正しい位置に剛体として精密化した。ｃｒｙｏＥＭマップの解像度は、ＮＰＲ１：抗体接触界面の残基、特にホモロジーによって正確にモデル化することができないＲＥＧＮ５３０８相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を手作業で再構築するのに十分である。現在の構造モデルでは、すべての抗体のＣＤＲ残基およびＮＰＲ１の残基を接触させて配置している。モデルのより遠い領域（ＮＰＲ１のＣ末端ドメイン、および抗体Ｆａｂｓの定常ドメイン）は、現在のｃｒｙｏＥＭマップと、以前に決定されたＮＰＲ１のＸ線結晶構造情報（ＰＤＢコード１Ｔ３４）と、単離された抗体構造とを組み合わせてモデル化している。
ＮＰＲ１上のｍＡｂ２２０３３エピトープ：ｈＮＰＲ１＋ＡＮＰ＋ＲＥＧＮ５３０８構造の検査により、ＮＰＲ１のどの残基がＲＥＧＮ５３０８ Ｆａｂ（ひいては親ＩｇＧ ｍＡｂ２２０３３）に接触しているかが明らかになった。このエピトープは、ＮＰＲ１のアミノ酸の４つの独立した区間：残基２～４、４１～４５、４７、７３～７９、３３２、３３６～３４４、３４７（配列番号：１９４に従って番号が付けられている）から構成されており、それらが組み合わさって３次元的に連続した表面を形成している。前の水素／重水素交換（ＨＤＸ）質量分析実験では、これらの残基のいくつかが重要であると同定されたが（実施例１２参照）、ｃｒｙｏＥＭ構造では、エピトープのより詳細が得られる。
ｍＡｂ２２０３３の構造的作用機構
ＮＰＲ１抗体複合体のこのモデルにおける２つのＦａｂは、Ｆａｂ可変ドメインおよびＦａｂ定常ドメインの間の「エルボー」近くの地点で、互いに約１０Å以内にある。この２つのＦａｂのＣ末端は約１００Åとかなり離れているので、１つのＩｇＧ分子の２つのアームにはなり得ない。また、Ｆａｂは、モデル化されたＡＮＰペプチドに特に接近しておらず（最接近時の距離は約３０Å）、ＦａｂとＡＮＰとの間に直接的な相互作用があるとは考えられない。
ＮＰＲ１のＮ末端ドメイン上の結合部位に対するＦａｂの固定された位置および相対的な向きを仮定すると、ＲＥＧＮ５３０８ ＦａｂのＡＮＰ依存的な結合の説明が明らかになる。ＮＰＲ１はＡＮＰが結合すると、二量体化したまま一方のＮＰＲ１単量体が他方のＮＰＲ１単量体に対して回転するという構造変化を起こすことが示されている。この回転を２つのＮＰＲ１＋２つのＦａｂ複合体の半分に適用すると、ＮＰＲ１二量体がＡＮＰを含まないＮＰＲ１の結晶構造に似たモデルができあがる。しかし、ここでは、ＲＥＧＮ５３０８ Ｆａｂの一方が、もう片方のＦａｂと立体的に衝突する位置に回転するという、物理的に不可能な状況になっている。この立体的な干渉が、ＡＮＰ非存在下でＮＰＲ１の二量体に１つのＲＥＧＮ５３０８ Ｆａｂしか結合できない理由である。２つのモノマー上の両方の抗体結合部位は等しくアクセス可能であるが、最初のＦａｂの結合が２番目のＦａｂの結合をブロックする。
この効果を逆に考えると、ＡＮＰを含むＮＰＲ１二量体に２つのＦａｂが結合していると、両方のＦａｂが結合している限り、この複合体がＡＮＰのない構造に緩んで戻るのを防ぐことができる。ここで見られる効果が細胞表面で維持されると仮定すると、平衡状態では、下流のシグナル伝達が可能な活性状態にあるＮＰＲ１分子の割合が増えることになる。抗体の結合によるもう一つの可能な効果は、上述したように抗体とＮＰＲ１＋ＡＮＰとのオリゴマークラスターの形成である。この効果は、各ＮＰＲ１二量体が２つの別々のＩｇＧ分子から２つのＦａｂアームを結合できる場合にのみ可能である。ＡＮＰが存在しない場合、各ＮＰＲ１二量体には１つのＦａｂアームしか結合できず、複合体形成は、各Ｆａｂアームに結合したＮＰＲ１二量体と共にＩｇＧを最大１つしか含ない、はるかに小さな種で停止する。これらの効果、受容体のクラスター化および受容体の活性状態の延長の両方が、ＮＰＲ１受容体におけるｍＡｂ２２０３３の活性化効果を説明することができる。
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims (38)

  1. ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、水素／重水素交換によって決定されるように、ＮＰＲ１の細胞外ドメイン（配列番号：１９４のアミノ酸２９～３４７）内に含まれる１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用し、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが（ｉ）心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の存在下または非存在下で、ヒトＮＰＲ１を発現する細胞に結合する；かつ／または（ｉｉ）ＮＰＲ１に結合し、ＮＰＲ１を活性化する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  2. 抗体または抗原結合性フラグメントが、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３４７；（ｃ）配列番号：１９４のアミノ酸３３６～３４７；（ｄ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３３５；および（ｅ）配列番号：１９４のアミノ酸７０～８１；からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用する、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
  3. 抗体またはその抗原結合性フラグメントが、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；および（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸３３６～３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用する、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  4. 抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＡＮＰの存在下で、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；および（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用する、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  5. 抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＡＮＰの存在下で、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸７０～８１；および（ｃ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用する、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  6. 心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の存在下でナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントが、水素／重水素交換によって決定されるように、（ａ）配列番号：１９４のアミノ酸２９～４５；および（ｂ）配列番号：１９４のアミノ酸３３１～３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用するが、配列番号：１９４のアミノ酸７０～８１とは相互作用せず、抗体またはその抗原結合性フラグメントが（ｉ）ＡＮＰの存在下または非存在下で、ヒトＮＰＲ１を発現する細胞に結合する；かつ／または（ｉｉ）ＮＰＲ１に結合し、ＮＰＲ１を活性化する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  7. 抗体が完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  8. 抗体が、（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；（ｂ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰおよび／または脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の非存在下、２５℃および３７℃で、６９０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、単量体のヒトＮＰＲ１に結合する；（ｃ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰまたはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、４２ｎＭ未満のＫＤで、二量体のヒトＮＰＲ１に結合する；（ｄ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、８０ｎＭ未満のＫＤで、ＡＮＰと複合体形成したヒトＮＰＲ１に結合する；（ｅ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、２０ｎＭ未満のＫＤで、ＢＮＰと複合体形成したヒトＮＰＲ１に結合する；（ｆ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰおよび／またはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、３６５ｎＭ未満のＫＤで、単量体のサルＮＰＲ１に結合する；（ｇ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、ＡＮＰまたはＢＮＰの非存在下、２５℃および３７℃で、３０ｎＭ未満のＫＤで、二量体のサルＮＰＲ１に結合する；（ｈ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、１０ｎＭ未満のＫＤで、ＡＮＰと複合体形成したサルＮＰＲ１に結合する；（ｉ）表面プラズモン共鳴法で測定されるように、２５℃および３７℃で、１０ｎＭ未満のＫＤで、ＢＮＰと複合形成したサルＮＰＲ１に結合する；（ｊ）マウスＮＰＲ１とは結合しない；（ｋ）ヒトＮＰＲ１（ＡＮＰなし）またはＡＮＰと複合体形成したＮＰＲ１を発現する細胞に、５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する；（ｌ）カルシウムフラックス細胞ベースのバイオアッセイで測定されるように、３８５ｎＭ未満のＥＣ５０でＮＰＲ１を活性化する；（ｍ）正常血圧および高血圧のマウスに投与したときに、全身血圧を低下させ、全身血圧および平均動脈血圧の低下は、単回用量の投与で２８日まで持続する；および（ｎ）食事誘発性肥満マウスに投与したときに、耐糖能が改善される；からなる群から選択される１つまたはそれ以上の特性を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. 抗体または抗原結合性フラグメントが、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、該ＨＣＶＲが、表１に記載のＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
  10. 表１に記載のＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  11. （ａ）配列番号：４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、および１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
    （ｂ）配列番号：６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
    （ｃ）配列番号：８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
    （ｄ）配列番号：１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
    （ｅ）配列番号：１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、および１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
    （ｆ）配列番号：１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、および１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
    を含む、請求項９または１０に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  12. 配列番号：２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、および１７８／１８６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  13. （ａ）配列番号：４、６、８、１２、１４、および１６；ならびに（ｂ）配列番号：６８、７０、７２、７６、７８、および８０からなる群から選択されるＣＤＲを含む、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  14. 配列番号：２／１０、および６６／７４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  15. ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体または抗原結合性フラグメントが、ＨＣＶＲ内に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；およびＬＣＶＲ内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、該ＨＣＶＲが、
    （ｉ）配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列；
    （ｉｉ）配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｉｖ）配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が１２個を超えないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列
    を含み、ＬＣＶＲが
    （ａ）配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｄ）配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が１０個を超えないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列
    を含む、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  16. 配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  17. 配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  18. 配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるＨＣＶＲ内に含まれる３つのＣＤＲ；ならびに配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるＬＣＶＲ内に含まれる３つのＣＤＲを含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  19. 配列番号：２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、および１７８／１８６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
  20. （ａ）配列番号：４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、および１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
    （ｂ）配列番号：６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、および１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
    （ｃ）配列番号：８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
    （ｄ）配列番号：１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
    （ｅ）配列番号：１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、および１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
    （ｆ）配列番号：１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、および１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
    を含む、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  21. （ａ）配列番号：４、６、８、１２、１４、および１６；ならびに（ｂ）配列番号：６８、７０、７２、７６、７８、および８０からなる群から選択されるＣＤＲを含む、請求項２０に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  22. 配列番号：２／１０、および６６／７４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項２１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  23. ＨＣＶＲの３つのＣＤＲであって、ＨＣＶＲが、配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、および１７８からなる群から選択されるアミノさん配列を有する、ＨＣＶＲの３つのＣＤＲ；ならびに、ＬＣＶＲの３つのＣＤＲであって、ＬＣＶＲが配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、および１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＬＣＶＲの３つのＣＤＲを含む、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質を活性化する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  24. ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質への結合に関して、請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントと競合する抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  25. 請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントと同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  26. 請求項１～２５のいずれか１項に記載のナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
  27. 請求項１～２５のいずれか１項に記載された抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  28. 請求項１～２５のいずれか１項に記載された抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  29. 請求項２７に記載のポリヌクレオチド配列および／または請求項２８に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
  30. 請求項２９に記載のベクターを発現する宿主細胞。
  31. 抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合性フラグメントを製造する方法であって、請求項３０に記載の宿主細胞を、抗体またはフラグメントの産生を可能にする条件下で培養し、そうして産生された抗体またはフラグメントを回収することを含む方法。
  32. 抗体またはその抗原結合性フラグメントを、許容可能な担体を含む医薬組成物として製剤化することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. ＮＰＲ１関連の疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を処置、予防または改善する方法であって、請求項１～２５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントの治療上有効な量を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
  34. ＮＰＲ１関連の疾患または障害が、高血圧、心不全、肥満、腎不全、慢性腎臓病、黄斑浮腫、緑内障、脳卒中、肺障害、肺線維症、炎症、喘息、骨格成長障害、骨折、糖尿病、および癌からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 医薬組成物が、それを必要とする対象に予防的または治療的に投与される、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 医薬組成物を第２の治療剤と組み合わせて投与する、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 第２の治療剤が、アルドステロン拮抗剤、アルファ－アドレナリン遮断剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、動脈性血管拡張剤、自律神経節性血管拡張剤、ベータ－アドレナリン遮断剤、カテコラミン枯渇性交感神経弛緩剤、中枢性アルファ－２アドレナリン作動剤、カルシウムチャネル遮断剤、利尿剤、レニン阻害剤、抗凝固剤、抗血小板剤、コレステロール低下剤、血管拡張剤、ジギタリス、手術、埋め込み型デバイス、抗腫瘍療法、インスリン、ＧＬＰ１アゴニスト、メトホルミン、透析、骨髄刺激剤、血液濾過、生活習慣の改善、および栄養補助食品からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 医薬組成物が皮下、静脈内、皮内、腹腔内、または筋肉内に投与される、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の方法。
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