JP2022505263A - 光学媒体の屈折率を特定するための方法および顕微鏡 - Google Patents

Abstract

試料空間（１４）に面する対物レンズ（１２）を有する顕微鏡（１０，７８）において光学媒体の屈折率を特定するための方法であって、特定されるべき屈折率を有する光学媒体は、２つの光学媒体（２６，２８）のうちの一方の光学媒体であり、２つの光学媒体（２６，２８）は、試料空間（１４）内のカバーガラスまたは載物ガラス（２４）の２つの互いに反対側にある表面（６４，６８）に隣接していて、これにより、対物レンズ（１２）からそれぞれ異なる距離を置いて配置された２つの部分反射性の界面を形成している、方法が記載されている。本方法では、測定光束（３４）が、対物レンズ（１２）を通って斜めに入射するようにカバーガラスまたは載物ガラス（２４）へと向けられ、測定光束（３４）を２つの界面においてそれぞれ部分的に反射させることにより、互いに空間的に分離された２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）が生成され、２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）が対物レンズ（１２）によって受け取られ、位置感知検出器（６０）へと向けられ、２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）の強度が、位置感知検出器（６０）によって検出され、２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）の検出された強度に基づいて光学媒体の屈折率が計算される。

Description

本発明は、試料空間に面する対物レンズを有する顕微鏡において光学媒体の屈折率を特定するための方法であって、特定されるべき屈折率を有する光学媒体は、２つの光学媒体のうちの一方の光学媒体であり、２つの光学媒体は、試料空間内のカバーガラスまたは載物ガラスの２つの互いに反対側にある表面に隣接していて、これにより、対物レンズからそれぞれ異なる距離を置いて配置された２つの部分反射性の界面を形成している、方法に関する。本発明はさらに、光学媒体の屈折率を特定するための装置を有する顕微鏡に関する。

試料の光学顕微鏡法による結像は、顕微鏡の試料空間内で互いに隣接している複数の異なる光学媒体によって影響を受ける。これらの光学媒体は、各自のそれぞれ異なる屈折率に起因して、屈折率が急激に変化する界面を形成する。これらの界面の各々は、これらの界面での屈折率の急変の大きさに応じてそれぞれ異なる影響を光学結像に及ぼす。とりわけ球面収差は、屈折率の急激な変化によって顕著に影響を受ける。結像において協働する光学媒体には、通常、カバーガラスまたは載物ガラスと、互いに反対側にある両面からカバーガラスまたは載物ガラスに隣接する２つの媒体と、が含まれる。後者の２つの媒体は、例えば、カバーガラスまたは載物ガラスと対物レンズとの間に設けられる浸漬媒体と、試料を包囲する埋め込み媒体と、によって形成されている。

屈折率の急激な変化によって影響を受ける収差を効果的に補正できるようにするためには、使用されている光学媒体の屈折率を把握することが重要である。多くの場合、カバーガラスまたは載物ガラスの屈折率と浸漬媒体の屈折率とは、最初から高精度で既知である。しかしながら、このことは、試料を包囲する埋め込み媒体の屈折率には当てはまらない。したがって、この屈折率を、顕微鏡の外部または内部においてこのために専用に企図された測定において特定すべきである。

顕微鏡の外部での屈折率の測定は、測定後に実施される試料調製の不可測性に結び付いている。顕微鏡の外部で取得された測定値と、光学顕微鏡法による結像において実際に有効な屈折率と、の相関関係は、保証できない。したがって、多くの用途では、例えば生細胞顕微鏡法では、埋め込み媒体の屈折率は、試料によって顕著に影響を受けるので、顕微鏡用のプレパラートの外部において十分な精度で測定することは不可能である。

独国特許出願公開第１０２００６０２１９９６号明細書は、顕微鏡の内部での屈折率の特定を可能にする内部の全反射顕微鏡法、略してＴＩＲＦのための顕微鏡を開示している。このＴＩＲＦ顕微鏡は、対物レンズを含み、この対物レンズを介して試料にエバネッセント照明が当てられる。試料において全反射された照明光は、検出器によって検出される。試料において反射された照明光の強度が最大値からゼロに低下する遷移に基づいて、全反射の入射角が特定される。次いで、この入射角に基づいて屈折率が特定される。しかしながら、屈折率のそのような特定は、試料を全反射で照明することができるようにするために、高い開口数を有する浸漬対物レンズを必要とする。そのような対物レンズは、製造が複雑であり、したがって高価である。

従来技術に関しては、顕微鏡用の三角測量型の自動合焦装置が開示されている独国特許出願公開第１０２０１００３０４３０号明細書も参照される。同自動合焦装置は、試料上にスリット画像を生成し、このスリット画像が、位置感知検出器上に結像される。検出器によって検出された入射位置により、自動合焦が制御される。

本発明の課題は、光学媒体の屈折率を簡単かつ正確に特定することを可能にする方法および顕微鏡を提供することである。

上記の課題は、請求項１記載の方法および請求項９記載の顕微鏡によって解決される。有利な発展形態は、それぞれ従属請求項に記載されている。

本発明による方法は、試料空間に面する対物レンズを有する顕微鏡において光学媒体の屈折率を特定するために使用され、特定されるべき屈折率を有する光学媒体は、２つの光学媒体のうちの一方の光学媒体であり、２つの光学媒体は、試料空間内のカバーガラスまたは載物ガラスの２つの互いに反対側にある表面に隣接していて、これにより、対物レンズからそれぞれ異なる距離を置いて配置された２つの部分反射性の界面を形成している。本方法では、測定光束が、対物レンズを通って斜めに入射するようにカバーガラスまたは載物ガラスへと向けられる。測定光束が２つの界面においてそれぞれ部分的に反射されることにより、互いに空間的に分離された２つの反射光束が生成される。２つの反射光束は、対物レンズによって受け取られ、位置感知検出器へと向けられる。２つの反射光束の強度が、位置感知検出器によって検出される。２つの反射光束の検出された強度に基づいて光学媒体の屈折率が特定される。

本明細書におけるカバーガラスまたは載物ガラスとは、とりわけ、試料を覆うカバーガラス、スライドガラス、ペトリ皿の底部、またはマイクロタイタープレートのウェルの底部であると理解される。

２つの反射光束の強度は、カバーガラスまたは載物ガラスと、互いに反対側にある両面からカバーガラスまたは載物ガラスに隣接する２つの光学媒体と、によって画定された２つの界面における、測定光束の反射性および透過性に依存している。したがって、最終的に互いに空間的に分離された２つの反射光束の強度が基づいている反射プロセスおよび透過プロセスは、実質的に、カバーガラスまたは載物ガラスの屈折率と、カバーガラスまたは載物ガラスに隣接する光学媒体の屈折率と、によって決まる。カバーガラスまたは載物ガラスの屈折率と、カバーガラスまたは載物ガラスに隣接する２つの光学媒体のうちの一方の光学媒体の屈折率と、が既知である場合には、他方の媒体の屈折率を、位置感知検出器によって検出された強度と、試料空間内における測定光束の入射角の知識と、から確実に特定することが可能である。

２つの反射光束の空間的な分離は、測定光束をカバーガラスまたは載物ガラスに斜めに向けることによって実現される。２つの部分反射性の界面は、軸方向に互いにオフセットされており、すなわち、対物レンズの光軸に沿って互いに離間されているので、これら２つの界面に測定光束が斜めに入射することにより、２つの反射光束は、それぞれ異なる光路上で対物レンズへと反射されるようになる。結果として、２つの反射光束を、位置感知検出器のそれぞれ異なる入射位置において互いに別々に検出することができる。

本発明は、顕微鏡の内部の光学媒体の屈折率を簡単かつ正確に特定することを可能にする。本発明は、さらなる顕微鏡パラメータを設定するために有益に利用可能である。とりわけ本発明は、例えば顕微鏡対物レンズに含まれる補正レンズを、特定された屈折率に基づいて自動的に制御することにより、顕微鏡対物レンズにおいて実施される補正調整を、種々異なる埋め込み媒体に対して自動化することを可能にする。デコンボリューションの枠内での点拡がり関数のモデル化を、特定された屈折率に基づいて実施することも可能である。

有利な発展形態では、一方の光学媒体の屈折率が、他方の光学媒体の屈折率と、カバーガラスまたは載物ガラスの屈折率と、測定光束の開口数と、に基づいて特定される。測定光束の開口数は、対物レンズの焦点距離と、対物レンズ瞳における測定光束の位置と、によって特定可能である。

２つの界面の反射率および透過率、カバーガラスまたは載物ガラスの屈折率、それぞれの界面を画定している光学媒体の屈折率、および測定光束の開口数は、いわゆるフレネルの式によって互いに関連付けられる。反射率および透過率は、２つの反射光束の強度に基づいて特定可能である。さらに、カバーガラスまたは載物ガラスの屈折率、測定光束の開口数、および２つの光学媒体のうちの一方の光学媒体の屈折率が既知である場合には、他方の媒体の屈折率を簡単に計算することができる。

好ましい実施形態では、一方の光学媒体の屈折率が、２つの反射光束の強度の比率に基づいて特定される。これにより、本発明による屈折率の測定は、いわば自己参照的になる。このことはつまり、測定光束の強度とは無関係に屈折率を特定することができることを意味しており、すなわち、この強度を把握する必要がなくなる。

好ましくは、測定光束は、対物レンズの入射瞳のうちの、当該入射瞳の中心に対してオフセットされた部分領域へと導かれる。このようにすると、対物レンズの入射瞳が測定光束によって偏心的に照明され、これによって測定光束は、対物レンズから出射する際に対物レンズの光軸に対して斜めに配向される。このように入射瞳を偏心的に照明することにより、２つの界面において生成された反射光束の所望の空間的な分離が、特に簡単な手法で可能になる。次いで、反射光束は、好ましくは、測定光束の伝搬方向とは逆の方向に、入射瞳のうちの、当該入射瞳の前述した部分領域に対してオフセットされた他の部分領域を貫通するように対物レンズへと戻される。

有利な実施形態では、測定光束により、２つの界面においてそれぞれ１つの測定パターンが生成され、２つの測定パターンは、２つの反射光束によって位置感知検出器上に結像される。例えば、測定光束を放射する光源の一部であるか、または光源の前に配置されているスリット絞りの画像の形態で、それぞれの測定パターンを生成することが可能である。

好ましくは、位置感知検出器上に結像された２つの測定パターンは、空間強度分布の形態で検出され、当該空間強度分布から２つの反射光束の強度が特定される。位置感知検出器上に結像された測定パターンが、例えばスリット絞りの画像によって与えられる場合には、スリット絞りの長手配向に対して平行に位置する方向にわたって、検出器上のそれぞれの絞り画像を積分することにより、前述した強度分布が得られる。関連する部分反射性の界面と対物レンズとの間の距離に依存している、検出器上で検出されたそれぞれの絞り画像の位置は、この場合、強度分布において発生するピークによって反映される。

好ましくは、本発明に従って屈折率が特定されるべき光学媒体は、カバーガラスまたは載物ガラスの２つの表面のうちの一方に隣接している、試料のための埋め込み媒体である。この場合には、好ましくは、屈折率が最初から既知である他方の光学媒体は、一方ではカバーガラスまたは載物ガラスの他方の表面に隣接していて、かつ他方では対物レンズに隣接している浸漬媒体である。しかしながら、本発明による方法が、これに限定されていないことは言うまでもない。したがって、任意の媒体の屈折率を、この媒体がカバーガラスまたは載物ガラスの２つの表面のうちの一方に直接的に隣接し、それによって部分反射性の界面を形成する限りにおいて、特定することが可能である。

本発明による顕微鏡は、カバーガラスまたは載物ガラスと２つの光学媒体とを有する試料空間と、試料空間に面する対物レンズと、２つの部分反射性の界面であって、試料空間内に対物レンズからそれぞれ異なる距離を置いて配置されていて、試料空間内の２つの光学媒体がカバーガラスまたは載物ガラスの２つの互いに反対側にある表面に隣接していることによって形成されている２つの部分反射性の界面と、２つの光学媒体のうちの一方の光学媒体の屈折率を特定するための装置と、を含む。前述した装置は、測定光束を、対物レンズを通って斜めに入射するようにカバーガラスまたは載物ガラスへと向けるように構成されている。さらに、本装置は、測定光束を２つの界面においてそれぞれ部分的に反射させることにより、互いに空間的に分離された２つの反射光束を生成するように構成されている。本装置は、位置感知検出器を有し、２つの反射光束を対物レンズによって受け取り、位置感知検出器へと向けるように構成されている。位置感知検出器は、２つの反射光束の強度を検出するように構成されている。屈折率を特定するために設けられた装置はさらに、２つの反射光束の検出された強度に基づいて光学媒体の屈折率を特定するように構成された特定ユニットを含む。

好ましくは、本装置は、対物レンズの光軸に対して距離を置いて偏心的に配置された絞り開口部を有するアパーチャ絞りを有する。アパーチャ絞りは、測定光束が対物レンズの入射瞳を偏心的に照明し、これによって光軸に対して斜めに対物レンズから出射されるように、測定光束の断面を制限する。このようにして、２つの部分反射性の界面において生成された反射光束が、互いに空間的に分離されて対物レンズに戻され、最終的に位置感知検出器のそれぞれ異なる入射位置において検出可能となることが保証されている。対物レンズの入射瞳を偏心的に照明することは、さらに、対物レンズを形成するレンズの面頂点において最も強力に発生し、かつ信号対雑音比を悪化させるいわゆる一次反射を引き起こすような近軸光線成分が回避されるという利点を有する。

好ましい実施形態では、本装置は、赤外線波長範囲内の測定光束を放射する光源を有する。このことは、測定光束によってカバーガラスまたは載物ガラスに生成された測定パターンが人間の目には見えず、したがって顕微鏡による試料の観察を妨げないという利点を有する。しかしながら、可視波長範囲内の測定光束を使用することも可能である。測定光束が赤外線波長範囲内の光からなる場合には、媒体の適切なモデルまたはキャリブレーションを用いて、可視スペクトル範囲内の屈折率を推定することができる。

好ましくは、位置感知検出器は、ライン検出器であり、このライン検出器は、測定パターンの２つの画像を反映する２つの反射光束の強度分布を全体として検出できるように位置合わせされている。これに代えて、位置感知検出器をエリア検出器として、例えば二次元ＣＣＤカメラとして構成することも可能である。

有利な実施形態では、特定ユニットは、光学媒体の屈折率を特定するためのパラメータを保存可能なメモリを有する。これにより、例えば、屈折率の特定に関連する、多数の顕微鏡コンポーネントに関するパラメータを保持することが可能となり、これらのパラメータを顕微鏡において用途に応じて選択的に利用することが可能となる。したがって、例えば、種々の浸漬媒体の屈折率、および種々のカバーガラスまたは載物ガラスの屈折率、ならびに種々の対物レンズの光学データを保存し、求められている屈折率を特定するために必要に応じて読み出すことができる。

好ましくは、カバーガラスまたは載物ガラスの互いに反対側にある表面同士は、互いに平面平行に形成されている。

本発明による装置は、本明細書に記載されている当該装置の構造的特徴および機能的特徴に起因して、顕微鏡における自動合焦装置として利用するためにも適している。さらに、本装置は、その特徴に起因して、光学媒体の屈折率に加えてカバーガラスまたは載物ガラスの厚さおよび／または傾きのような、光学顕微鏡の結像に影響を与える他の変数を特定する可能性を提供する。

本発明は、例えば、透過型倒立顕微鏡または透過型正立顕微鏡のような、種々の種類の顕微鏡に適用可能である。

以下では、本発明を、図面に基づいてより詳細に説明する。

第１の実施例としての透過型倒立顕微鏡の概略図である。 光学媒体の屈折率を特定するために規定された、図１の顕微鏡の一部である装置を示す図である。 図１の顕微鏡の試料空間を示す概略図である。 図２の装置の位置感知検出器によって検出された強度分布を示す図である。 屈折率を特定するための本発明による方法の特定の実施形態を示すフローチャートである。 埋め込み媒体の屈折率に依存している２つの反射光束の強度の比率を示す特性曲線である。 本発明による顕微鏡の第２の実施例を形成する透過型正立顕微鏡の概略図である。

図１は、第１の実施例としての顕微鏡１０を示し、この顕微鏡１０において本発明による屈折率の特定を適用することができる。

顕微鏡１０は、透過型倒立顕微鏡として構成されている。したがって、顕微鏡１０は、図１では参照符号１４が付された試料空間に下から面している対物レンズ１２と、上から試料空間１４に向いている光源１６と、を含む。顕微鏡１０はさらに、接眼レンズ２０を有する鏡筒１８を有し、この接眼レンズ２０を通して操作者は、対物レンズ１２によって捕捉された試料画像を観察することができる。さらに、種々異なる顕微鏡コンポーネントを制御する制御ユニット２２が設けられている。

顕微鏡１０の試料空間内には、図１には明示的に図示されていない試料をカバーするためのカバーガラス２４が設けられている。カバーガラス２４上には光学媒体２６が設けられており、この光学媒体２６内には試料が埋め込まれており、この光学媒体２６は、以下では埋め込み媒体２６と称される。試料空間１４内にはさらに、浸漬媒体２８が配置されており、この浸漬媒体２８は、図１では対物レンズ１２に上から隣接していて、かつカバーガラス２４に下から隣接している。

顕微鏡１０はさらに、図１では概して参照符号３０が付されている装置を有し、この装置３０は、試料を収容している埋め込み媒体２６の屈折率を特定するために使用される。この装置は、図２により詳細に図示されている。

図２に示されているように、装置３０は、赤外線波長範囲内の測定光束３４を放射する光源３２を有する。光源３２は、例えばスリット絞り３３を有するＬＥＤであり、測定光束３４は、このスリット絞り３３を通って照明光学系３６へと向けられる。照明光学系３６を通過した後、測定光束３４は、アパーチャ絞り３８に当たり、このアパーチャ絞り３８は、照明光学系３６の光軸Ｏ１の中心に位置決めされており、照明光学系３６の光軸Ｏ１に対して距離を置いて偏心的に配置された絞り開口部３９を有する。アパーチャ絞り３８の絞り開口部は、測定光束３４のうちの、図２では照明光学系３６の光軸Ｏ１の下側に位置する部分だけがアパーチャ絞りを偏向プリズム４０の方向に通過するように、測定光束３４のビーム断面を制限する。

ビーム断面が制限された測定光束３４は、偏向プリズム４０において輸送光学系４２へと反射され、この輸送光学系４２は、自身の光軸Ｏ２に沿って変位可能な集束レンズ４４と、散乱光絞り４６と、さらなるレンズ４８と、から形成されている。輸送光学系４２を通過した後、測定光束３４は、ダイクロイックビームスプリッタ５０に当たり、このダイクロイックビームスプリッタ５０は、赤外線波長範囲内の光を反射させ、その一方で、可視範囲内の光を透過する。測定光束３４は、ダイクロイックミラー５０によって対物レンズ１２の方向に反射される。ダイクロイックミラー５０において反射された測定光束３４は、対物レンズ１２の光軸Ｏ３に対して平行なオフセットを伴って延在する。このようにして、測定光束３４は、対物レンズ１２の入射瞳５２のうちの、対物レンズ１２の光軸Ｏ３に対して、ひいては入射瞳５２の中心に対して横方向にオフセットされた部分領域へと導かれる（図３を参照）。したがって、対物レンズ１２の入射瞳５２は、偏心的に照明され、これによって測定光束３４は、光軸Ｏ３に対して斜めに角度αで試料空間１４へと向けられるようになる。

簡単にするために、試料空間１４内において互いに反対側にある両面からカバーガラス２４に隣接している埋め込み媒体２６および浸漬媒体２８は、図２の図示では省略されている。試料空間１４内において斜めに入射するように導かれた測定光束３４は、さらに下の方で図３を参照しながらより詳細に説明するようにカバーガラス２４において反射され、これにより、対物レンズ１２へと戻される２つの反射光束が生じ、これら２つの反射光束は、（図３の詳細図とは異なり）図２の概略図では、参照符号５４が付された単一の光束の形態で図示されている。

対物レンズ１２を通過した後、２つの反射光束５４は、ダイクロイックミラー５０に当たり、このダイクロイックミラー５０は、これらの反射光束５４を輸送光学系４２へと向ける。輸送光学系４２を通過した後、反射光束５４は、偏向プリズム４０に当たり、この偏向プリズム４０は、反射光束５４を検出器光学系５６へと反射させる。検出器光学系５６は、反射光束５４をスペクトルフィルタ５８へと向け、このスペクトルフィルタ５８は、赤外線波長範囲内の光に対してのみ透過性であり、この波長範囲外の散乱光を遮断する。スペクトルフィルタ５８を透過した反射光束５４は、最終的に位置感知検出器６０に当たり、この位置感知検出器６０は、反射光束５４の強度を空間分解して検出することができる。

完全を期すために図２には、ダイクロイックミラー５０によって実現される鏡筒１８と装置３０との結合も図示されている。したがって、本実施例におけるダイクロイックミラー５０は、対物レンズ１２が試料空間１４からダイクロイックミラー５０の方向へと導いた、本来の顕微鏡法による画像化のために利用される可視検出光６２を、透過によって鏡筒１８に供給するためにも使用される。

図３には、本発明に従って埋め込み媒体２６の屈折率を特定するために利用される２つの反射光束（図３では５４ａ，５４ｂが付されている）が、測定光束の反射によってどのようにして生成されるかがより詳細に示されている。したがって、対物レンズ１２の入射瞳５２を偏心的に照明する測定光束３４は、対物レンズ１２を通って光軸Ｏ３に対して斜めに角度αで、対物レンズ１２に面している図３では参照符号６４が付されたカバーガラス２４の前面へと向けられる。カバーガラス２４とカバーガラス２４の前面６４に隣接する浸漬媒体２８とは、それぞれ異なる屈折率を有しているので、カバーガラス２４の前面６４とカバーガラス２４の前面６４に隣接する浸漬媒体２８とは、第１の界面を形成し、この第１の界面において、入射してきた測定光束３４が部分的に反射される。測定光束のうちの、この第１の界面において反射された部分は、対物レンズ１２へと戻される第１の反射光束５４ａを生成する。

測定光束３４のうちの、第１の界面を透過した残りの部分６６は、カバーガラス２４に入射するときに対物レンズ１２の光軸Ｏ３から離れるように屈折されて、この光軸Ｏ３に対して角度αよりも大きい角度βを形成する。測定光束３４のこの透過した部分６６は、カバーガラス２４の背面６８と、カバーガラス２４の背面６８に隣接する、カバーガラス２４とは異なる屈折率を有する埋め込み媒体２６と、によって画定された第２の界面において部分的に反射される。第２の界面における測定光束３４のこの第２の部分反射によって、第２の反射光束５４ｂが生成され、この第２の反射光束５４ｂは、カバーガラス２４の前面６４を通過し、次いで、対物レンズ１２へと戻る。

図３の図示に示されているように、測定光束３４が試料空間１４内に斜めに入射することにより、カバーガラス２４の前面６４または背面６８における２つの部分反射によって生成される反射光束５４ａ，５４ｂが、それぞれ異なる光路上で対物レンズ１２へと戻るようになる。このようにすると、２つの反射光束５４ａ，５４ｂは、位置感知検出器６０のそれぞれ異なる入射位置に当たる。換言すれば、カバーガラス２４の前面６４または背面６８においてスリット画像の形態で生成される２つの測定パターンは、図４の線図に示されているように位置感知検出器６０上に互いに空間的に分離されて結像される。

図４は、２つの反射光束５４ａ，５４ｂが位置感知検出器６０上に一緒に生成する例示的な強度分布Ｖを示す。線図の横軸７０は、検出器６０上での入射位置を示し、縦軸７２は、それぞれの入射位置において測定された強度を示す。図４の強度分布Ｖは、２つのピークを示し、そのうちのＰ１が付されたピークは、第１の反射光束５４ａに対応付けられており、Ｐ２が付されたピークは、第２の反射光束５４ｂに対応付けられている。ピークＰ１の方がピークＰ２よりも高くて急峻であるという状況から、図３の例では、測定光束３４がカバーガラス２４の前面６４上で合焦されていることが見て取れる。このことはつまり、カバーガラス２４の前面６４において光源３２のスリット絞り３３の合焦画像が生成され、その一方で、カバーガラス２４の背面６８では、これに対してスリット絞り３３の非合焦画像が生じることを意味する。このことは、カバーガラス２４の前面６４のうちの、対物レンズ１２の光軸Ｏ３に中心合わせされた点において第１の部分反射が行われる限りにおいて、図３の図示に対応する。これに対して、第２の部分反射は、カバーガラス２４の背面６８のうちの、光軸Ｏ３に対して横方向にオフセットされた点において行われる。図４に示されているピークＰ１，Ｐ２の下側の面積はそれぞれ、それぞれの反射光束５４ａ，５４ｂの強度のための尺度である。

図５は、本発明に従って埋め込み媒体２６の屈折率をどのようにして特定することができるかを純粋に一例として示すフローチャートを示す。

第１のステップＳ１において、測定光束３４が、対物レンズ１２を通って試料空間１４内へと導かれる。浸漬液２８を通過した後、測定光束３４は、図３に示されているようにカバーガラス２４の前面６４に角度αで斜めに当たる。角度αは、対物レンズ１２とカバーガラス２４の前面６４との間の距離と、測定光束３４の開口数と、から決定可能である。測定光束３４の開口数は、対物レンズ１２の焦点距離と、対物レンズ１２の入射瞳５２における測定光束３４の位置と、に基づいて得られるか、またはアパーチャ絞り３８の絞り開口部３９の配置と、アパーチャ絞り３８が対物レンズ１２の入射瞳５２に結像される倍率と、に基づいて得られる。

第２のステップＳ２において、カバーガラス２４の前面６４または背面６８における２つの部分反射により、互いに空間的に分離された２つの反射光束５４ａ，５４ｂが生成される。

第３のステップＳ３において、２つの反射光束５４ａ，５４ｂが、位置感知検出器６０へと導かれる。２つの反射光束５４ａ，５４ｂは互いに空間的に分離されているので、これら２つの反射光束５４ａ，５４ｂは、位置感知検出器６０のそれぞれ異なる入射位置に当たる。

第４のステップＳ４において、２つの反射光束５４ａ，５４ｂの、以下ではＩ_ａまたはＩ_ｂと称される強度が、位置感知検出器６０によって検出される。このことは、例えば、図４に示されている強度分布Ｖを積分することによって実施される。したがって、強度分布Ｖの２つのピークＰ１，Ｐ２の下側の面積はそれぞれ、それぞれの反射光束５４ａ，５４ｂの強度のための尺度である。測定信号、またはそれぞれのピークＰ１，Ｐ２に適合された曲線、例えばガウス曲線を積分することにより、それぞれの強度Ｉ_ａ，Ｉ_ｂを特定することができる。

第５のステップＳ５において、最終的に、２つの反射光束５４ａ，５４ｂの強度Ｉ_ａ，Ｉ_ｂに基づいて埋め込み媒体２６の屈折率が特定される。これは、以下の考慮事項に基づいている。

以下では、２つの反射光束５４ａおよび５４ｂの強度Ｉ_ａ，Ｉ_ｂをどのようにして詳細に計算することができるかを説明する。

反射光束５４ａの強度Ｉ_ａは、以下の関係：
Ｉ_ａ＝（Ｓ・Ｒ_ａ⊥＋（１－Ｓ）・Ｒ_ａ∥）・Ｉ （１）
に従って得られる。

ここで、Ｒ_ａｉは、本実施例では測定光束３４によって与えられた、９０°－αの角度で入射する垂直偏光（ｉ＝⊥）および平行偏光（ｉ＝∥）に対する、カバーガラス２４と浸漬媒体２８とによって形成される界面６４の反射率を示す。さらに、Ｓは、垂直偏光の強度成分を示し、Ｉは、測定光束３４の強度を示す。

反射光束５４ｂの強度Ｉ_ｂは、以下の関係：
Ｉ_ｂ＝（Ｓ・Ｔ_ａ⊥・Ｒ_ｂ⊥・Ｔ’_ａ⊥＋（１－Ｓ）・Ｔ_ａ∥・Ｒ_ｂ∥・Ｔ’_ａ∥）・Ｉ （２）
に従って得られる。

ここで、Ｒ_ｂｉおよびＴ_ｂｉは、本実施例では照明光束３４の透過した部分６６によって与えられた、９０°－βの角度で入射する垂直偏光（ｉ＝⊥）および平行偏光（ｉ＝∥）に対する、カバーガラス２４と埋め込み媒体２６とによって形成される界面６８の反射率または透過率を示す。Ｔ_ａｉは、本実施例では測定光束３４によって与えられた、９０°－αの角度で入射する垂直偏光（ｉ＝⊥）および平行偏光（ｉ＝∥）に対する、第１の界面６４の透過率を示す。さらに、Ｔ’_ａｉは、本実施例では界面６８において対物レンズ１２の方向に反射された部分によって与えられた、９０°－βの角度で入射する垂直偏光（ｉ＝⊥）および平行偏光（ｉ＝∥）に対する、界面６４の透過率を示す。

以下の関係：
Ｉ_ａ／Ｉ_ｂ＝（Ｓ・Ｔ_ａ⊥・Ｒ_ｂ⊥・Ｔ’_ａ⊥＋（１－Ｓ）・Ｔ_ａ∥・Ｒ_ｂ∥・Ｔ’_ａ∥）／（Ｓ・Ｒ_ａ⊥＋（１－Ｓ）・Ｒ_ａ∥） （３）
が示すように、２つの強度Ｉ_ａ，Ｉ_ｂの比率は、測定光束３４の強度Ｉとは無関係である。

したがって、本実施例は、自己参照的な測定である。反射率Ｒ_ｉおよび透過率Ｔ_ｉは、フレネルの式（BORNおよびWOLF著の“Principles of Optics”，Cambridge University Press，第７版，１９９９年，第４０～４５頁を参照）を用いて、界面６４，６８における光学媒体２６，２８の屈折率と、入射してきた測定光束３４の開口数と、に基づいて特定可能である。測定光束３４の開口数は、対物レンズ１２の焦点距離と、対物レンズ１２の入射瞳５２における測定光束３４の位置と、によって特定可能である。

測定光束３４の開口数が既知であって、かつ浸漬媒体２８およびカバーガラス２４の屈折率が既知である場合には、埋め込み媒体２６の屈折率が、唯一の未知のものとなり、関係（３）を使用して特定可能である。このことは、数値的な手法によって、または表形式の値および補間を使用したルックアップテーブルを用いて、分析的に実施可能である。

図６は、埋め込み媒体２６の屈折率に依存している２つの強度Ｉ_ａ，Ｉ_ｂの比率を示す例示的な特性曲線Ｋを示す。線図の横軸７４には、埋め込み媒体２６の屈折率が示されている。線図の縦軸７６には、２つの強度Ｉ_ａ，Ｉ_ｂの比率が示されている。強度Ｉ_ａ，Ｉ_ｂを特定する際には、浸漬媒体２８として水を使用した。

図７は、図１に示されている顕微鏡１０とは異なり、透過型正立顕微鏡として構成された顕微鏡７８を示す。ここでは、図１の顕微鏡１０のコンポーネントに対応している図７の顕微鏡コンポーネントには、既に図１で使用した参照符号が付されている。

図１による実施形態とは異なり、図７に示されている顕微鏡の場合には、対物レンズ１２が試料空間１４の上側に配置されており、その一方で、光源１６は、試料空間１４の下側に設けられている。したがって、一方では対物レンズ１２に隣接していて、かつ他方ではカバーガラス２４に隣接している浸漬媒体２８は、カバーガラス２４の上側に設けられており、その一方で、本発明に従って屈折率が特定されるべき埋め込み媒体２６は、カバーガラス２４の下側に配置されている。

埋め込み媒体２６の屈折率の本発明による特定は、図７の顕微鏡７８の場合にも、図１に示されている顕微鏡１０と同じようにして実施される。

これまで本発明を、特定の実施例に基づいて説明してきた。本発明がこれらの実施例に限定されておらず、一連の変更が可能であることは言うまでもない。

例えば、図３の例では、カバーガラス２４の前面６４においてスリット絞り３３の合焦画像が生じ、カバーガラス２４の背面６８において非合焦画像が生じる。しかしながら、これとは逆に、カバーガラス２４の背面６８において合焦スリット画像を生成し、カバーガラス２４の前面６４において合焦スリット画像を生成することも可能である。焦点平面をカバーガラス２４の内部に位置させて、これにより、２つのスリット画像のどちらも非合焦にすることも可能である。

１０ 顕微鏡
１２ 対物レンズ
１４ 試料空間
１６ 光源
１８ 鏡筒
２２ 制御ユニット
２０ 接眼レンズ
２４ カバーガラス
２６，２８ 光学媒体
３０ 装置
３２ 光源
３３ スリット絞り
３４ 測定光束
３６ 照明光学系
３８ アパーチャ絞り
３９ 絞り開口部
４０ 偏向プリズム
４２ 輸送光学系
４４ 集束レンズ
４６ 散乱光絞り
５０ ビームスプリッタ
５２ 入射瞳
５４，５４ａ，５４ｂ 反射光束
５６ 検出器光学系
５８ スペクトルフィルタ
６０ 検出器
６２ 結像光路
６４，６８ 表面
６６ 透過した測定光束
７０，７４ 横軸
７２，７６ 縦軸
Ｋ 特性曲線
Ｏ１，Ｏ２，Ｏ３ 光軸
Ｐ１，Ｐ２ ピーク
Ｖ 強度分布
α，β 角度

Claims (15)

1. 試料空間（１４）に面する対物レンズ（１２）を有する顕微鏡（１０，７８）において光学媒体の屈折率を特定するための方法であって、
   特定されるべき屈折率を有する前記光学媒体は、２つの光学媒体（２６，２８）のうちの一方の光学媒体であり、前記２つの光学媒体（２６，２８）は、前記試料空間（１４）内のカバーガラスまたは載物ガラス（２４）の２つの互いに反対側にある表面（６４，６８）に隣接していて、これにより、前記対物レンズ（１２）からそれぞれ異なる距離を置いて配置された２つの部分反射性の界面を形成している方法において、
   測定光束（３４）を、前記対物レンズ（１２）を通って斜めに入射するように前記カバーガラスまたは載物ガラス（２４）へと向け、
   前記測定光束（３４）を前記２つの界面においてそれぞれ部分的に反射させることにより、互いに空間的に分離された２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）を生成し、
   前記２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）を前記対物レンズ（１２）によって受け取り、位置感知検出器（６０）へと向け、
   前記２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）の強度を、前記位置感知検出器（６０）によって検出し、
   前記２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）の検出された前記強度に基づいて前記光学媒体の屈折率を特定する、
   方法。
2. 前記一方の光学媒体の屈折率を、他方の光学媒体の屈折率と、前記カバーガラスまたは載物ガラス（２４）の屈折率と、前記測定光束（３４）の開口数と、に基づいて特定する、
   請求項１記載の方法。
3. 前記一方の光学媒体の屈折率を、前記２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）の前記強度の比率に基づいて特定する、
   請求項１または２記載の方法。
4. 前記測定光束（３４）を、前記対物レンズ（１２）の入射瞳（５２）のうちの、前記入射瞳（５２）の中心に対してオフセットされた部分領域へと導く、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. 前記測定光束（３４）により、前記２つの界面においてそれぞれ１つの測定パターンを生成し、
   ２つの前記測定パターンを、前記２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）によって前記位置感知検出器（６０）上に結像させる、
   請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. 前記位置感知検出器（６０）上に結像された２つの前記測定パターンを、空間強度分布（Ｖ）の形態で検出し、前記空間強度分布（Ｖ）から前記２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）の強度を特定する、
   請求項５記載の方法。
7. 前記一方の光学媒体は、前記カバーガラスまたは載物ガラス（２４）の前記２つの表面（６４，６８）のうちの一方に隣接している、試料のための埋め込み媒体である、
   請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. 他方の光学媒体は、前記カバーガラスまたは載物ガラス（２４）の他方の表面と、前記対物レンズ（１２）と、に隣接している浸漬媒体である、
   請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
9. 顕微鏡であって、前記顕微鏡は、
   カバーガラスまたは載物ガラス（２４）と、２つの光学媒体（２６，２８）と、を有する試料空間（１４）と、
   前記試料空間（１４）に面する対物レンズ（１２）と、
   ２つの部分反射性の界面であって、前記試料空間（１４）内に前記対物レンズ（１２）からそれぞれ異なる距離を置いて配置されていて、前記試料空間（１４）内の前記２つの光学媒体（２６，２８）が前記カバーガラスまたは載物ガラス（２４）の２つの互いに反対側にある表面（６４，６８）に隣接していることによって形成されている２つの部分反射性の界面と、
   前記２つの光学媒体（２６，２８）のうちの一方の光学媒体の屈折率を特定するための装置（３０）と、
   を含む顕微鏡において、
   前記装置（３０）は、測定光束（３４）を、前記対物レンズを通って斜めに入射するように前記カバーガラスまたは載物ガラス（２４）へと向けるように構成されており、
   前記装置（３０）は、前記測定光束（３４）を前記２つの界面においてそれぞれ部分的に反射させることにより、互いに空間的に分離された２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）を生成するように構成されており、
   前記装置（３０）は、位置感知検出器（６０）を有し、前記２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）を前記対物レンズ（１２）によって受け取り、前記位置感知検出器（６０）へと向けるように構成されており、
   前記位置感知検出器（６０）は、前記２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）の強度を検出するように構成されており、
   前記装置（３０）は、前記２つの反射光束（５４ａ，５４ｂ）の検出された前記強度に基づいて前記光学媒体の屈折率を特定するように構成された特定ユニットを含む、
   顕微鏡。
10. 前記装置（３０）は、前記対物レンズ（１２）の光軸（Ｏ３）に対して距離を置いて偏心的に配置された絞り開口部（３９）を有するアパーチャ絞り（３８）を有する、
    請求項９記載の顕微鏡。
11. 前記装置（３０）は、赤外線波長範囲内の前記測定光束（３４）を放射する光源（３２）を有する、
    請求項９または１０記載の顕微鏡。
12. 前記位置感知検出器（６０）は、ライン検出器である、
    請求項９から１１までのいずれか１項記載の顕微鏡。
13. 前記特定ユニットは、前記光学媒体の屈折率を特定するためのパラメータを保存可能なメモリを有する、
    請求項９から１２までのいずれか１項記載の顕微鏡。
14. 前記カバーガラスまたは載物ガラス（２４）の互いに反対側にある表面（６４，６８）同士は、互いに平面平行に形成されている、
    請求項９から１３までのいずれか１項記載の顕微鏡。
15. 前記顕微鏡は、倒立顕微鏡または正立顕微鏡である、
    請求項９から１４までのいずれか１項記載の顕微鏡。

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