JP2022116003A - Ｎａｄｐｈ依存性酵素を含む組み換え型の微生物及びそれの生成方法 - Google Patents

Ｎａｄｐｈ依存性酵素を含む組み換え型の微生物及びそれの生成方法 Download PDF

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Abstract

【課題】発酵によって所望の化合物の生成を増加するための、組み換え型の微生物、および該微生物を生成する方法を提供する。【解決手段】少なくとも１つの外因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を発現するように適合されたまたは少なくとも１つの内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を過剰発現するように適合された組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物であって、前記外因性酵素が発現されるときにまたは前記内因性酵素が過剰発現されるときに、前記微生物による前記ＮＡＤＰＨの全体的な利用が、親の微生物に対して増加されるように、前記酵素が選択される、組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、発酵によって所望の化合物の生成を最適化する酵素を選択する方法に関する
。より詳細には、排他的にではないが、本発明は、発酵経路における共同因子の均衡及び
代謝工学技術に関する。
還元当量、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）やニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）などは、酵素による酸化還元反応、例え
ばオキシドレダクターゼ反応などのための重要な補酵素であり、全ての生細胞において見
つけられる。一般に、ＮＡＤＰＨプールは、ＮＡＤＨのプールよりもかなり小さいことが
認められる（Ｇ．Ｎ．Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｓａｎ、２００９）。ブドウ糖上で成長される大
腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）において、ＮＡＤＨのプールは、ＮＡＤＰＨプールよりも２０倍以
上大きい（Ｂ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ、２００９）。この低いＮＡＤＰＨ利用
可能性は、特に発酵プロセスにおいて、多くの生合成反応及び生物学的変換を制限する（
Ｒ Ｐｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２００５）。ＮＡＤＰＨについての酵素の好みは、所
望の生成物の生成を制限し得る（Ｇ．Ｎ．Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｓａｎ、２００９）。これは
、新しい反応や経路を微生物の中に工学操作するときに問題であり、バイオ燃料、化学物
質、アミノ酸またはビタミンを含む化合物の効率的な生成プラットフォームの発生に対す
る大きな障害の１つである（Ｃｈｅｍｌｅｒ、Ｆｏｗｌｅｒ、ＭｃＨｕｇｈ、＆Ｋｏｆｆ
ａｓ、２０１０）。
それにもかかわらず、代謝工学技術は、可能であれば、ＮＡＤＰＨ依存性反応を制限す
ること、回避することまたはバイパスすることによる広範囲の燃料及び化学物質の生成に
ついて成功裏に実証されている（Ｐｅｒａｌｔａ－Ｙａｈｙａ＆Ｋｅａｓｌｉｎｇ、２０
１０）。あるいは、エネルギーを消費するトランスヒドロゲナーゼが使用されており、そ
れは、ＮＡＤＨプールとＮＡＤＰＨプールとの間で相互変換する。成功した代謝工学技術
を実現するための別の戦略は、競合するＮＡＤＰＨ依存性反応の排除である。これらの進
歩にもかかわらず、そのような新規な戦略は、生産歩留り及び／または成長率を犠牲にし
て追求されることが多い（Ａｕｒｉｏｌ、Ｂｅｓｔｅｌ－Ｃｏｒｒｅ、Ｃｌａｕｄｅ、Ｓ
ｏｕｃａｉｌｌｅ、＆Ｍｅｙｎｉａｌ－Ｓａｌｌｅｓ、２０１１）。更に、それらは、複
数の修正を用いる広範囲にわたる工学技術作業によってのみ可能になる（Ｓ．Ｍ．Ｍａ
ｅｔ ａｌ、２０１１）。それ故、これらの努力は、例えば大腸菌や出芽酵母（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのような、遺伝子的に扱い易い生物だ
けに制限されている（Ｐｅｒａｌｔａ－Ｙａｈｙａ＆Ｋｅａｓｌｉｎｇ、２０１０）。こ
れらの生物は、それらが糖だけを常食とするように制限される。したがって、それらの商
業上の使用及び実現可能性は、土地利用、食料安全保障、供給の不安定さ及び環境問題を
めぐるかなりの欠点に悩まされる。
カルボキシド栄養性（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）クロストリジウムは、大腸
菌及び出芽酵母に代わるものを提供して、廃棄ガスや合成ガス上で成長することができる
。限られた数の修正を有する組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウムのいくつ
かの例がある（Ｓｃｈｉｅｌ－Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ＆Ｄuｒｒｅ、２０１２）。全て
の既知の例は、ＮＡＤＨ依存性反応を使用する。
発明の目的は、先行技術の欠点の１つ以上を克服するか改善すること、または、少なく
とも、有用な選択肢を社会に提供することである。
第１の態様において、発明は、１つ以上の外因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を発現するよう
に適合された、及び／または１つ以上の内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を過剰発現するよう
に適合された、組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を提供するもの
であり、酵素は、外因性酵素が発現されるときに、及び／または内因性酵素が過剰発現さ
れるときに、微生物によるＮＡＤＰＨの全体的な利用が、親の微生物に対して増加される
ように選択される。
第２の態様において、発明は、親の微生物に対して増加されたＮＡＤＰＨの利用を呈す
る組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を生成する方法であって、
ａ．１つ以上の外因性及び／または内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を選択することと、
ｂ．親の微生物を転換して、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性外因性酵素を発現する、及び
／または１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性内因性酵素を過剰発現するように適合された組み換
え型の微生物を生じることと、を含む、方法を提供する。微生物におけるＮＡＤＰＨ依存
性酵素の任意の１つ以上の発現または過剰発現は、親の微生物に対してＮＡＤＰＨの利用
における全体的な増加を結果としてもたらす。
発明はまた、第２の態様の方法によって作製される組み換え型のカルボキシド栄養性ク
ロストリジウムを提供する。
第１または第２の態様の特定の実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が
、ヒドロゲナーゼ（例えば、Ｓｅｑ．ＩＤ（配列番号）６、８、１０、１２、１４、１６
、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、ＹＰ＿００３７８１０１６、ＹＰ
＿００３７８１０１７、ＹＰ＿００３７７８８７９、ＹＰ＿００３７７９６４０、ＹＰ＿
００３７７９８９３、ＹＰ＿００３７８０１９３もしくはそれらのいずれか１つの機能的
等価変異体）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＥＩ９０７２１、ＡＥＩ９０７２３、
ＡＥＩ９０７２５、ＹＰ＿００３７７９０６３、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＹＰ＿００
３７８０１６８、ＡＥＩ９０７２２、ＡＥＩ９０７２４、ＡＥＩ９０７２６もしくはそれ
らのいずれか１つの機能的等価変異体）またはメチレン－ＴＨＦ－デヒドロゲナーゼ（例
えば、ＡＥＩ９０７５３、ＹＰ＿００３７８１８９１、ＡＥＩ９０７７１もしくはそれら
のいずれか１つの機能的等価変異体）を含む。
第１または第２の態様の特定の実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が
、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームで存在しており、組み換え型の微生物が
、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び／または過剰発現するように適合され
る。
特定の実施形態において、微生物は、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び
／または過剰発現するように適合される一方、対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームの
発現は、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームの発現における変化と比較されるときに、実質
的に変化しない、減る、または比較的小さな増加を呈する。１つの特定の実施形態におい
て、微生物は、１つ以上のＮＡＤＨ依存性アイソフォームの発現が、親の微生物と比較し
て弱化されるか無力化されるように適合される。一実施形態において、その発現は、１つ
以上のＮＡＤＨ依存性酵素をコード化する核酸を修正することによって、あるいはＮＡＤ
Ｈ依存性アイソフォームをコード化する１つ以上の核酸を、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォ
ームをコード化する１つ以上の核酸と置き換えることによって、弱化されるか無力化され
る。
第１または第２の態様の特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨの全体的な利用における
増加は、経路であって、それにおいて１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が活性である、経
路を通るＮＡＤＰＨ流動における増加を含む。特定の実施形態において、流動は、少なく
とも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００
％だけ増加される。経路を通る流動は、代謝物及び生成物のレベル（メタボロミクス）（
Ｐａｔｔｉ、Ｙａｎｅｓ、＆Ｓｉｕｚｄａｋ、２０１２）ならびに／またはＣ１３として
標識付ける実験（フラクソミクス）（Ｎｉｉｔｔｙｌａｅ、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ、Ｓａｕ
ｅｒ、＆Ｆｒｏｍｍｅｒ、２００９、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ、日付不明）によって測定さ
れ得る。
第１または第２の態様の１つの特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨの全体的な利用に
おける増加は、使用中に、微生物による１つ以上の生成物の生成の効率における増加を結
果としてもたらす。
１つの特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在
している１つ以上の酵素は、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レ
ダクターゼであり、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォーム（ＥＣ１．１．１．３４、ＧＯ：０
００４４２０、例えば、出芽酵母：ＤＡＡ０９８２２．１、ＢＫ００６９４６．２：１１
５７３４．．１１８８９８またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）及びＮＡＤ
Ｈ依存性アイソフォーム（ＥＣ１．１．１．８８、ＧＯ：００４２２８２、例えば、シュ
ードモナス・メバロニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）：Ｐ１３７０
２．１またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体）を含む。
１つの特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在
している１つ以上の酵素は、ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ／アセトアセ
チル－ＣｏＡレダクターゼ／３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡヒドラターゼであり、ＮＡ
ＤＰＨ依存性アイソフォームｐｈａＢ（ＥＣ：１．１．１．３６、ＧＯ：００１８４５４
、例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）：Ｙ
Ｐ＿７２５９４２．１、遺伝子ＩＤ：４２４９７８４から、またはそれらのいずれか１つ
の機能的等価変異体）、ＮＡＤＰＨ依存性ｐｈａＪ（ＥＣ４．２．１．１１９、例えば、
アエロモナス・プンクタタ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃｔａｔａ）：ＢＡＡ２１８１
６．１から）ならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームｈｂｄ（ＥＣ１．１．１．
１５７、ＧＯ：０００８６９１、例えば、Ｃ．アセトブチリクム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌ
ｉｃｕｍ）：ＮＰ＿３４９３１４．１、遺伝子ＩＤ：１１１８８９１から、またはそれら
のいずれか１つの機能的等価変異体）を含む。
１つの特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在
している１つ以上の酵素は、クロトニル－ＣｏＡレダクターゼ／トランス－２－エノイル
－ＣｏＡレダクターゼ／ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼであり、ＮＡＤＰＨ依存性ア
イソフォームｃｃｒ（ＥＣ１．３．１．８６、例えば、ストレプトマイセス・コリナス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉｎｕｓ）から、またはそれらのいずれか１つの機
能的等価変異体）あるいはｃｃｒＲｓ（ＥＣ１．３．１．８５、例えば、ロドバクター・
スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）：ＹＰ＿３５４０
４４．１、遺伝子ＩＤ：３７２０７５１から）ならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフ
ォームｔｅｒ（ＥＣ１．３．１．４４、ＧＯ：００５０３４３、例えば、トレポネーマ・
デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）から、またはそれらのいずれ
か１つの機能的等価変異体）を含む。
更なる実施形態において、酵素は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームで存
在しており、また、複数の共同因子依存性を呈する。第２の態様の一実施形態において、
複数の共同因子依存性を呈する酵素は、ＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐酵素またはＮＡＤ
Ｈ／ＮＡＤＰＨ共依存性酵素を含み得る。特定の実施形態において、酵素は、ＮＡＤＨ／
ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォーム及びＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐アイソフォームで存在
しており、微生物は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び／また
は過剰発現するように適合される。特定の実施形態において、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存
性アイソフォームは、ｔｅｒ（ＥＣ１．３．１．４４、ＧＯ：００５０３４３、例えば、
ユーグレナ・グラシリス（ミドリムシ）：ＡＹ７４１５８２．１から、またはそれらのい
ずれか１つの機能的等価変異体）である。更なる実施形態において、ＮＡＤＨ／Ｆｄ依存
性アイソフォームは、ＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐ｂｃｄ－ｅｔｆＡＢ複合体（ＥＣ１
．３．８．１、ＧＯ：０００４０８５、例えば、Ｃ．アセトブチリクム：ＮＰ＿３４９３
１７．１、遺伝子ＩＤ：１１１８８９４から、またはそれらのいずれか１つの機能的等価
変異体）である。
第１または第２の態様の特定の実施形態において、組み換え型の微生物は、１つ以上の
ＮＡＤＨ依存性酵素の弱化された発現を呈する。この実施形態において、親の微生物にお
ける酵素のＮＡＤＨ依存性アイソフォームは、組み換え型の微生物における酵素のＮＡＤ
ＰＨ依存性アイソフォームによって置き換えられている可能性がある。
第１または第２の態様の特定の実施形態において、微生物は、親の微生物と比較される
ときに、発酵反応の間に増加された効率を呈する。
第１または第２の態様の１つの特定の実施形態において、親の微生物は、クロストリジ
ウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ
）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌ
ｉｉ）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅ
ｉ）、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏ
ｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・ドラケイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒ
ａｋｅｉ）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏ
ｌｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・アセチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔ
ｉｃｕｍ）、クロストリジウム・フォルミコアセチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏ
ｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・マグナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｍａｇｎｕｍ）を含むカルボキシド栄養性クロストリジウムの群から選択される。
第１または第２の態様の一実施形態において、親の微生物は、クロストリジウム・オー
トエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイである。１つの特定の実施形態
において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３、ＤＳＭ
１００６１株の誘導体である。別の特定の実施形態において、微生物は、クロストリジウ
ム・リュングダリイＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
第１の態様の更なる実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が、それのＮ
ＡＤＨ共同因子特異性に対して、それのＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加するように修正
される。
第２の態様の更なる実施形態において、方法は、（複数の）酵素のＮＡＤＨ共同因子特
異性に対して１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素のＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加するス
テップを更に含む。一実施形態において、これは、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素をコ
ード化する１つ以上の核酸を修正することを含む。
特定の実施形態において、１つ以上の酵素であって、それにおいてＮＡＤＰＨ共同因子
特異性が増加される、１つ以上の酵素が、好ましくは、クロトニル－ＣｏＡレダクターゼ
／トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ／ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼか
らなる群から選択される、オキシドレダクターゼ酵素である。
特定の実施形態において、１つ以上の外因性または内因性酵素が、本明細書に記載され
るような、分岐ＮＡＤＰ鉄のみの（Ｆｅ－ｏｎｌｙ）ヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸
デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体、あるいはそれらの機能的等価
変異体を含む。
更なる実施形態において、発明は、本明細書に記載された態様のいずれかに記載される
ような１つ以上の修正を有する第１の態様に係る組み換え型の微生物を提供する。
更なる実施形態において、発明は、本明細書に記載された態様のいずれかに記載される
ような１つ以上の修正を有する第２の態様に係る組み換え型の微生物を生成する方法を提
供する。
第３の態様において、発明は、１つ以上の発酵生成物を生成する方法であって、その方
法が、カルボキシド栄養性微生物の存在下でＣＯを含む基質を嫌気的に発酵させることを
含み、カルボキシド栄養性微生物が、第１の態様に記載されるようなまたは第２の態様に
よって生成されるような組み換え型の微生物である、方法を提供する。
特定の実施形態において、１つ以上の発酵生成物が、エタノール、ブタノール、イソプ
ロパノール、イソブタノール、高級アルコール、ブタンジオール、コハク酸塩、イソプレ
ノイド、脂肪酸及び／または生体高分子を含む。
特定の実施形態において、ＣＯを含む基質が、ＣＯを含むガス状基質である。一実施形
態において、基質が、産業廃棄ガスを含む。一定の実施形態において、ガスが、製鋼所の
廃棄ガスまたは合成ガスである。
一実施形態において、基質は、典型的には、ＣＯの大きな比率、例えば、容量で少なく
とも約２０％から約１００％のＣＯ、容量で２０％から７０％のＣＯ、容量で３０％から
６０％のＣＯ、及び容量で４０％から５５％のＣＯなど、を含有することになる。特定の
実施形態において、基質は、容量で約２５％、または約３０％、または約３５％、または
約４０％、または約４５％、または約５０％のＣＯ、または約５５％のＣＯ、または約６
０％のＣＯを含む。
第４の態様において、発明は、反応において複数の共同因子を利用する目的で、分岐Ｎ
ＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸
水素リアーゼ複合体あるいはそれらの機能的等価変異体の使用を提供する。好ましくは、
複数の共同因子が、フェレドキシン及びＮＡＤＰＨを含む。
特定の実施形態において、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼが、ＡＥＩ９０７２１、
ＹＰ＿００３７７８８７１、ＡＥＩ９０７２２、及びそれらの任意の１つ以上の機能的等
価変異体からなる群から選択される。
特定の実施形態において、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＹＰ＿００３７７８８７９、ならびにそれらの
任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択される。
特定の実施形態において、分岐ギ酸水素リアーゼ複合体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５
から６７まで、またはそれらの機能的等価変異体のいずれか１つによってコード化される
。
第５の態様において、発明は、組み換え型の微生物であって、微生物が、反応において
複数の共同因子を利用するように適合されるように、微生物は、外因性分岐ＮＡＤＰ鉄の
みのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアー
ゼ複合体を発現するように、ならびに／あるいは内因性分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナ
ーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体を過剰
発現するように適合された、組み換え型の微生物を提供する。
第６の態様において、発明は、反応において複数の共同因子を利用し得る組み換え型の
微生物を作製する方法であって、少なくとも、
ａ）１つ以上の分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナ
ーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体を選択するステップと、
ｂ）親の微生物を転換して、反応において複数の共同因子を利用するように適合される
組み換え型の微生物を生じるステップと、を含む、方法を提供する。
第５または第６の態様の一実施形態において、複数の共同因子が、フェレドキシン及び
ＮＡＤＰＨを含む。
第５または第６の態様の一実施形態において、親の微生物は、カルボキシド栄養性クロ
ストリジウムである。一実施形態において、親の微生物は、クロストリジウム・オートエ
タノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、ク
ロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウ
ム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム・フォルミコア
セチクム、クロストリジウム・マグナムを含むカルボキシド栄養性クロストリジウムの群
から選択される。一実施形態において、親の微生物はクロストリジウム・オートエタノゲ
ナムまたはクロストリジウム・リュングダリイである。１つの特定の実施形態において、
微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３、ＤＳＭ１００６１
株の誘導体である。別の特定の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・リュン
グダリイＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
第５または第６の態様の一実施形態において、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼは、
ＡＥＩ９０７２１、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＡＥＩ９０７２２、及びそれらの任意の
１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択される。
第５または第６の態様の一実施形態において、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼが
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＹＰ＿００３７７８８７９
、ならびにそれらの任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択される。
第５または第６の態様の一実施形態において、分岐ギ酸水素リアーゼ複合体は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６５から６７まで、またはそれらの機能的等価変異体によってコード化さ
れる。
第５または第６の態様の特定の実施形態において、親の微生物は、分岐ＮＡＤＰ鉄のみ
のヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ
複合体をコード化する１つ以上の外因性ポリヌクレオチドで転換される。１つの特定の実
施形態において、親の微生物は、ＨＱ８７６０１５、ＣＬＪＵ＿ｃ０６９９０、ＡＥＩ９
０７２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７
０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５から６７まで、及びそれらの任意の
１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択された１つ以上の外因性ポリヌクレオチ
ドで転換される。
関連した態様において、発明は、反応において複数の共同因子を利用する目的で、分岐
ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ
酸水素リアーゼ複合体を含む組み換え型の微生物の使用を提供する。好ましくは、複数の
共同因子が、フェレドキシン及びＮＡＤＰＨを含む。一実施形態において、分岐ＮＡＤＰ
鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リ
アーゼ複合体は、第４の態様において記載されたようなものである。
第７の態様において、発明は、反応の効率を増す方法であって、その方法が、分岐ＮＡ
ＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／もしくはギ酸
水素リアーゼ複合体、ならびに／またはそれらと同じものをコード化するポリヌクレオチ
ド、ならびに／あるいはそれらと同じものを発現する及び／または過剰発現するように適
合された組み換え型の微生物の使用を含む、方法を提供する。特定の実施形態において、
反応は、ＣＯを含む基質の発酵である。効率は、ＮＡＤＰＨのみではなくて、フェレドキ
シンとＮＡＤＰＨの両方を利用する分岐酵素に起因して、増される。理論によって縛られ
ることを望まずに、発明者らは、フェレドキシンのより負の酸化還元電位（Ｅ０’＝－４
１０ｍＶ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（Ｅ０’＝－３２０ｍＶ）に結合することは、より大きなエ
ネルギーの電位を提供して、更なる発エルゴン反応を推進して、したがって、反応速度及
びＣＯ基質処理量を増加することを信じている。
特定の実施形態において、第７の態様の分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐Ｎ
ＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び／またはギ酸水素リアーゼ複合体は、第４の態様に記
載されたようなものである。
第８の態様において、発明は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するための組み換え型の微
生物の使用を提供するものであり、組み換え型の微生物は、単一のＮＡＤＨ依存性還元型
フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（Ｎｆｎ）酵素を発現する及び／また
は過剰発現するように適合される。特定の実施形態において、Ｎｆｎ酵素が、ＳＥＱ＿Ｉ
Ｄ Ｎｏ．２、４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０のアミノ酸
配列、または少なくとも７６％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配
列同一性を有するそれらのいずれか１つの機能的等価変異体を含む。Ｎｆｎ酵素は、ＮＡ
ＤＨをＮＡＤＰＨに変換して、したがって、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性酵素の存在下
で発現されるときに、酵素効率が増されて、ＮＡＤＰＨの高速反応速度と高速再生速度を
導く。
特定の実施形態において、微生物は、カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を含
む。更なる実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロ
ストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイを含むカルボキシド栄
養性クロストリジウムの群から選択される。
更なる実施形態において、発明は、第８の態様に記載されるような使用を提供するもの
であり、組み換え型の微生物が、第５の態様に記載されたような１つ以上の修正を含む。
第９の態様において、発明は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するためのポリペプチドの
使用を提供するものであり、ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、ＹＰ＿００
３７８１８５２．１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０に従う単一のＮＡＤＨ依存性還元型フェレ
ドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（Ｎｆｎ）酵素、または少なくとも７６％、
８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するそれらの機能的
等価変異体を含む。
特定の実施形態において、第８または第９の態様の単一のＮｆｎ酵素が、ポリヌクレオ
チドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３によってコード化されて、その配列は、ＹＰ＿００３７
８１８５２．１またはＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０、あるいは少なくとも８３％、８５％、９
０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体をコード化
する。
第１０の態様において、発明は、ＳＥＱ＿ＩＤ ＮＯ．１または３に係るポリヌクレオ
チドを提供する。
第１１の態様において、発明は、ＳＥＱ＿ＩＤ ＮＯ．２または４に係るポリペプチド
を提供する。
第１２の態様において、発明は、第１０の態様に係るポリヌクレオチド、または第１１
の態様に係るポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
第１３の態様において、発明は、第１０の態様に係るポリヌクレオチド、または第１１
の態様に係るポリペプチドを発現するように適合された組み換え型の微生物を提供する。
本発明はまた、出願の明細書において参照されたか示された部分、要素及び特徴に、そ
の部分、要素もしくは特徴のうちの２つ以上のいずれかまたは全ての組み合わせにおいて
、個別的にあるいは集合的にあることが広く言えるであろうし、ここで、特定の整数が本
明細書において述べられ、それは、本発明が関連する分野における既知の均等物を有して
おり、そのような既知の均等物は、個別に説明されるかのように、本明細書に組み込まれ
るようにみなされる。
本発明の実施形態は、添付の図面を参照にして、ほんの一例として、次に記載されるこ
とになる。
それらの共同因子特異性を決定するためのＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に関わるオキシドレダクターゼステップについての酵素測定の結果を示す。 共同因子の使用に関して（例えば、大腸菌における）糖分解と、カルボキシド栄養性クロストリジウム（例えば、Ｃ．オートエタノゲナム）におけるＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路による自己栄養成長との差を示す。 ギ酸水素リアーゼ複合体を形成することができるギ酸デヒドロゲナーゼ及びヒドロゲナーゼ遺伝子の構成を示す。 ｑＲＴ－ＰＣＲ遺伝子発現結果の分布を示しており、自己栄養成長の間に大いに発現されたＮＡＤＰＨ依存性反応を強調している。 Ｃ．オートエタノゲナムの第２級アルコールデヒドロゲナーゼならびに基質としてアセトン及び共同因子としてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのいずれかを用いる酵素測定の結果を示す。活性は、ＮＡＤＨではなくて、ＮＡＤＰＨのみを用いて測定されて、この酵素が厳密にＮＡＤＰＨ依存性であることを実証している。 高い率でのＮＡＤＰＨ依存性第２級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によるアセトンのイソプロパノールへの連続的な変換を示す。アセトンが、バイオリアクタへの導入の直後にイソプロパノールに変換されることが見られ得る。２０ｇ／Ｌの高濃度でさえも、培養物が全てのアセトンをイソプロパノールに変換して、ＮＡＤＰＨプールが高い率でさえもこれを持続するのに十分であることを実証している。 新規な電子－分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ／ギ酸水素リアーゼ複合体によるＣＯ上の成長の間にＮＡＤＰＨ推進型生成物の形成を示す。 ブタノール生合成のための完全なＮＡＤＰＨ依存性経路を示す。各ステップは、イタリック体で注釈を付けられた遺伝子にコード化される酵素によって触媒される。 Ｃ．オートエタノゲナムＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨレベルの分析を示す。
用語「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド」（ＮＡＤＨ）は、ＮＡＤ＋（酸化型）
とＮＡＤＨ＋Ｈ＋（還元型）の両方の酸化還元対のことを言い得る。
用語「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸」（ＮＡＤＰＨ）は、ＮＡＤＰ＋
（酸化型）とＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋（還元型）の両方の酸化還元対のことを言い得る。
本明細書において呼ばれる際、「ＮＡＤＰＨ依存性酵素」は、主に（必ずしも排他的に
ではないが）共同因子としてＮＡＤＰＨを使用して、反応するための電子を供給する。同
様に、ＮＡＤＨ依存性酵素は、主に（必ずしも排他的にではないが）共同因子としてＮＡ
ＤＨを使用して、反応するための電子を供給する。また、いくつかの酵素が、ＮＡＤＰＨ
及びＮＡＤＨを利用できることと、二機能性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性酵素として呼ばれ得る
こととは、当業者によって理解されるであろう。
本明細書において呼ばれる際、言い回し「微生物によるＮＡＤＰＨの全体的な利用が増
加される」、または同様のものは、特定の期間に酵素に結合するＮＡＤＰＨ共同因子の量
における増加のことを言う。特定の実施形態において、増加は、少なくとも５％、少なく
とも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％のもので
ある。この増加は、実施例３において使用される方法、または当分野において既知の他の
方法、例えば（Ｓ．Ｗａｎｇ、Ｈｕａｎｇ、Ｍｏｌｌ、＆Ｔｈａｕｅｒ、２０１０）に従
って測定され得る。その言い回しはまた、経路を通るＮＡＤＰＨ流動における増加があり
、その増加が上記したものと同じ量のものであることを意味するように解釈され得る。Ｎ
ＡＤＰＨ流動は、代謝物と生成物のレベル（メタボロミクス）及び／またはＣ１３として
標識付ける実験（フラクソミクス）によって測定され得る。
本明細書において使用される際、「共同因子特異性」は、親和性の度合いであって、そ
れをもって共同因子が反応の間に酵素に結合する、親和性の度合いのことを言う。酵素及
び共同因子が絶対的な特異性を有することを意味するように取られるべきではないが、こ
れは、あり得るかもしれず、また、特定の酵素と、別の共同因子を超える１つの共同因子
との間の結合についての好みを少なくとも含む。
本明細書において呼ばれる際、酵素の「アイソフォーム」は、同じ反応を触媒して、全
く同じではないが類似のアミノ酸配列を有することができる２つ以上の機能的に類似のタ
ンパク質のいずれかである。
本明細書において呼ばれる際、「分岐酵素」は、複数の共同因子を利用することができ
る酵素であり、ここで、触媒され得ない反応を触媒する共役反応において、一方の共同因
子が、より低い反応電位（例えばフェレドキシンなど）を有して、もう一方が、より高い
反応電位（例えばＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨなど）を有しており、あるいは、ここで、
反応は、より高い反応電位（例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなど）を有する共同因子だ
けによって、より低いレートで進むことになる。一実施形態において、分岐酵素は、複数
の共同因子を利用し得、反応のレートを増加する。分岐酵素は、複合体、例えば本明細書
に記載されたギ酸水素リアーゼ複合体などであり得る。
用語「ように適合される」は、本発明の組み換え型の微生物を記載するように本明細書
において使用され得、例えば、微生物は、特定の酵素を表現する「ように適合される」。
酵素の発現に関して使用されるとき、用語は、酵素が連続的に発現されることを暗示せず
、酵素が発現され得、そのような発現が、構成性であり得るか誘発され得る状況を包含す
ることが意図される。
本明細書において呼ばれる際、「発酵培養液」は、少なくとも栄養培地及び細菌細胞を
含む培養培地である。
用語「効率を増す」、「増された効率」及び同様のものは、発酵プロセスに関して使用
されるときに、限定されるものではないが、発酵を触媒する微生物の成長のレート、上昇
した生成物濃度における成長及び／または生成物の生成、消費される基質の量当たりに生
成される所望の生成物の量、所望の生成物の生成のレートまたは生成のレベル、ならびに
発酵の他の副産物と比較した生成される所望の生成物の相対比率のうちの１つ以上を増や
すことを含む。
言い回し「一酸化炭素を含む基質」や類似の用語は、任意の基質であって、それにおい
て一酸化炭素が、例えば、成長及び／または発酵のために細菌の１つ以上の株（ｓｔｒａ
ｉｎ）に利用可能である、任意の基質を含むことが理解されるべきである。
言い回し「一酸化炭素を含むガス状基質」及び類似の言い回しや用語は、あるレベルの
一酸化炭素を含有する任意のガスを含む。一定の実施形態において、基質は、容量で少な
くとも約２０％から約１００％までのＣＯ、容量で２０％から７０％までのＣＯ、容量で
３０％から６０％までのＣＯ、及び容量で４０％から５５％までのＣＯを含有する。特定
の実施形態において、基質は、容量で約２５％、または約３０％、または約３５％、また
は約４０％、または約４５％、または約５０％のＣＯ、または約５５％のＣＯ、または約
６０％のＣＯを含む。
基質が水素を含有する必要はないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法に従う生成物形成の
害にならない方がよい。特定の実施形態において、水素の存在は、アルコール生成の全体
的な効率の改善を結果としてもたらす。例えば、特定の実施形態において、基質は、Ｈ２
：ＣＯの約２：１、または１：１、または１：２の比率を含み得る。一実施形態において
、基質は、容量で約３０％以下のＨ２、容量で２０％以下のＨ２、容量で約１５％以下の
Ｈ２または容量で約１０％以下のＨ２を含む。他の実施形態において、基質の流れは、例
えば、５％よりも少ない、または４％よりも少ない、または３％よりも少ない、または２
％よりも少ない、または１％よりも少ない低濃度のＨ２を含むか、あるいは実質的に水素
がない。基質はまた、いくらかのＣＯ２、例えば、容量で約１％から約８０％までのＣＯ
２、または容量で１％から約３０％までのＣＯ２などを含有し得る。一実施形態において
、基質は、容量で約２０％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形態において、基質は、容量
で約１５％以下のＣＯ２、容量で約１０％以下のＣＯ２、容量で約５％以下のＣＯ２を含
むか、あるいは実質的にＣＯ２を含まない。
後に続く記載において、本発明の実施形態は、「ＣＯを含有するガス状基質」を送り届
けて発酵させる点で記載される。しかしながら、ガス状基質が代替の形態で提供されても
よいことが理解されるべきである。例えば、ＣＯを含有するガス状基質は、液体に溶解さ
れて提供されてもよい。本質的に、液体は、ガスを含有する一酸化炭素で飽和されて、次
いで、その液体は、バイオリアクタに追加される。これは、標準的な方法論を使用して実
現され得る。例として、微小気泡分散発生器（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ ｅｔ．ａｌ、Ｓｃ
ａｌｅ－ｕｐ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔ
ｏｒ ｆｏｒ ａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０１、Ｎｕ
ｍｂｅｒ３／１０月、２００２）が使用され得る。更なる例として、ＣＯを含有するガス
状基質が、固形支持体の上に吸着され得る。そのような代替の方法は、用語「ＣＯを含有
する基質」及び同様のものの使用によって包含される。
本発明の特定の実施形態において、ＣＯを含有するガス状基質は、産業排ガスまたは廃
棄ガスである。「産業廃棄ガスまたは排ガス」は、産業プロセスによって生成されたＣＯ
を含む任意のガスを含むように、ならびに鉄系金属生成物製造、非鉄生成物製造、石油精
製プロセス、石炭のガス化、バイオマスのガス化、電力生成、カーボンブラック生成、及
びコークス製造の結果として生成されたガスを含むように、広くみなされるべきである。
更なる例が、本明細書における他の場所に提供され得る。
文脈が他のことを要求する場合を除いて、言い回し「発酵すること」、「発酵プロセス
」または「発酵反応」及び同様のものは、本明細書において使用される際、プロセスの成
長段階と生成物生合成段階の両方を包含することが意図される。本明細書において更に記
載されることになるように、いくつかの実施形態において、バイオリアクタは、第１の成
長リアクタ及び第２の発酵リアクタを含み得る。そういうものとして、発酵反応に対する
金属または組成物の追加は、これらのリアクタのいずれかまたは両方に対する追加を含む
ように理解されるべきである。
用語「バイオリアクタ」は、１つ以上の容器及び／または塔もしくは配管から成る発酵
デバイスを含み、それは、連続式撹拌槽リアクタ（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクタ（Ｉ
ＣＲ）、トリクルベッドリアクタ（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサー
、あるいは気液接触に適した他の容器または他のデバイスを含む。いくつかの実施形態に
おいて、バイオリアクタは、第１の成長リアクタ及び第２の発酵リアクタを含み得る。そ
ういうものとして、バイオリアクタまたは発酵反応に対する基質の追加を言うときに、そ
れは、適切な場合には、これらのリアクタのいずれかまたは両方に対する追加を含むこと
が理解されるべきである。
本明細書において呼ばれる際、「シャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）微生物」は、微生物であ
って、それにおいてメチルトランスフェラーゼ酵素が発現され、目的微生物とは異なる微
生物である。
本明細書において呼ばれる際、「目的微生物」は、微生物であって、それにおいて発現
構築物／ベクター上に含まれる遺伝子が発現され、シャトル微生物とは異なる微生物であ
る。
「外因性核酸」は、微生物の外側に起因する核酸であり、その微生物に対してそれらが
導入される。外因性核酸は、任意の適切な源から得られ得、限定されるものではないが、
微生物であって、その微生物に対してそれらが導入されることになる微生物（例えば、親
の微生物であって、その親の微生物から組み換え型の微生物が得られる、親の微生物）、
生物とは異なる微生物の株もしくは種であって、それに対してそれらが導入されることに
なるか、それらが人工的または組み換え式に生成され得る、株もしくは種を含む。一実施
形態において、外因性核酸は、微生物内に自然に存在する核酸配列であって、その微生物
に対してそれらが導入されることになり、ならびにそれらが（例えば、配列（例えば、遺
伝子）のコピー数を増やすことによって、または強いもしくは構成性プロモーターを導入
して発現を増やすことによって、）特定の遺伝子の発現または過剰発現を増やすように導
入される、核酸配列を表わす。別の実施形態において、外因性核酸は、微生物内に自然に
存在しない核酸配列であって、その微生物に対してそれらが導入されることになり、なら
びに微生物内に自然に存在しない生成物の発現または（例えば、プロモーターなどのよう
な調整要素の導入の場合において）微生物生まれの遺伝子の発現の増加を可能にさせる、
核酸配列を表わす。外因性核酸は、微生物のゲノムであって、その微生物に対してそれが
導入されることになるか染色体外の状態にとどまる、微生物のゲノムに組み込むように適
合され得る。
「外因性」はまた、タンパク質を言うために使用され得る。これは、親の微生物におい
て存在しないか発現されることができないタンパク質であって、その親の微生物から組み
換え型の微生物が得られる、タンパク質のことを言う。
用語「内因性」は、組み換え型の微生物及び核酸に関して本明細書において使用される
際、親の微生物において存在する任意の核酸であって、その親の微生物から組み換え型の
微生物が得られる、核酸のことを言う。タンパク質を説明するために使用されるとき、「
内因性」は、親の微生物において存在するか発現されることができる任意のタンパク質で
あって、その親の微生物から組み換え型の微生物が得られる、タンパク質のことを言うよ
うにみなされるべきである。
（「デヒドロゲナーゼ」または「オキシダーゼ」としても知られる）「オキシドレダク
ターゼ」は、電子供与体とも呼ばれる、１つの分子－還元剤から、電子受容体とも呼ばれ
る、別の分子－酸化剤への電子の伝達を触媒する酵素を含む。オキシドレダクターゼは、
酵素のＥＣ番号分類においてＥＣ１として分類される。酵素のこの群は、通常、共同因子
、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨまたはフェレドキシンなどを要求する。
酵素による「反応」は、本明細書において呼ばれる際、酵素によって触媒される別の１
つ以上の分子（生成物）への１つ以上の分子（基質）の変換である。
本発明は、核酸であって、その核酸の配列が、それらが実質的に同じ機能を果たすとい
う前提で、本明細書において具体的に例示される配列とは異なる、核酸を使用して実施さ
れ得ることが理解されるべきである。タンパク質またはペプチドをコード化する核酸配列
の場合、これは、コード化されるタンパク質またはペプチドが実質的に同じ機能を有する
ことを意味する。プロモーター配列を表わす核酸配列の場合、変異体配列は、１つ以上の
遺伝子の発現を促進する能力を有することになる。そのような核酸は、本明細書において
「機能的等価変異体」として呼ばれ得る。例として、核酸の機能的等価変異体は、対立遺
伝子変異体、遺伝子の断片、突然変異（欠失、挿入、ヌクレオチド置換及び同様のもの）
を含む遺伝子及び／または多形ならびに同様のものを含む。他の微生物からの相同遺伝子
はまた、本明細書において具体的に例示された配列の機能的等価変異体の例として考えら
れ得る。これらは、例えば、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・
ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、Ｃ．リュング
ダリイなどの種における相同遺伝子を含み、それらの詳細は、例えばＧｅｎｂａｎｋまた
はＮＣＢＩなどのようなウェブサイト上で公的に利用可能である。言い回し「機能的等価
変異体」はまた、核酸であって、その核酸の配列が特定の生物のためのコドン最適化の結
果として変動する、核酸を含むようにみなされるべきである。文脈が他のことを要求する
場合を除いて、本明細書における核酸の「機能的等価変異体」は、好ましくは、特定され
た核酸と少なくとも約７０％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または
それ以上の核酸配列同一性を有することになる。
また、本発明は、ポリペプチドであって、そのポリペプチドの配列が、本明細書におい
て具体的に例示されたアミノ酸配列とは異なる、ポリペプチドを使用して実施され得るこ
とも理解されるべきである。これらの変異体は、本明細書において「機能的等価変異体」
として呼ばれ得る。文脈が他のことを要求する場合を除いて、タンパク質またはペプチド
の機能的等価変異体は、特定されたタンパク質またはペプチドと少なくとも４０％、５０
％、６０％、７０％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以
上のアミノ酸同一性を共有するそれらのタンパク質またはペプチドを含み、興味のあるペ
プチドまたはタンパク質と実質的に同じ機能を有する。そのような変異体は、それらの範
囲内にタンパク質またはペプチドの断片を含み、その断片が、ポリペプチドの切断形態を
含み、欠失は、１から、５まで、１０まで、１５まで、２０まで、２５までのアミノ酸で
あり得、ポリペプチドの両端において残基１から２５まで拡張し得、欠失は、その領域内
の任意の長さのものであり得、あるいは内部位置にあり得る。本明細書における特定のポ
リペプチドの機能的等価変異体はまた、例えば、前の段落に例示されたように、細菌の他
の種における相同遺伝子によって発現されたポリペプチドを含むようにみなされるべきで
ある。
本明細書において使用される際、「実質的に同じ機能」は、核酸またはポリペプチドが
、核酸またはポリペプチドであって、その内、それが変異体である、核酸またはポリペプ
チドの機能を果たすことができることを意味するように意図される。例えば、本発明の酵
素の変異体は、その酵素と同じ反応を触媒することができることになる。しかしながら、
変異体が、ポリペプチドまたは核酸であって、その内、それが変異体である、ポリペプチ
ドまたは核酸と同じレベルの活性を有することを意味するようにみなされるべきではない
。
機能的等価変異体が、当業者に知られた方法を使用して、核酸またはポリペプチドであ
って、その内、それが変異体である、核酸またはポリペプチドと実質的に同じ機能を有す
るかどうかを評価し得る。しかしながら、例として、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナ
ーゼまたはメチレン－ＴＨＦ－デヒドロゲナーゼの活性について試験するための測定が、
（Ｈｕａｎｇ、Ｗａｎｇ、Ｍｏｌｌ、＆Ｔｈａｕｅｒ、２０１２）に記載される。
本発明に関して使用されるとき、「過剰に発現」、「過剰発現」及び類似の用語や言い
回しは、同じ条件下で親の微生物の（核酸を含む）タンパク質の発現レベルと比較して、
（同じものをコード化する１つ以上の核酸の発現を含む）１つ以上のタンパク質の発現に
おける任意の増加を含むように広くみなされるべきである。それは、タンパク質（または
核酸）が、任意の特定のレベルで発現されることを意味するようにみなされるべきではな
い。
本明細書において呼ばれる際、「弱化された発現」は、親の微生物におけるそれの発現
に対して減らされる核酸またはタンパク質の発現のことを言う。一実施形態において、弱
化された発現は、実質的に発現がないこと（または実質的に「ゼロの」発現）を含み得る
。これは、例えば、ＲＮＡサイレンシング、発現プロセスの修正（例えば、プロモーター
機能の崩壊）、（１つ以上のヌクレオチドの欠失、追加及び置換を含む）核酸配列の変更
または修正、あるいはゲノムから酵素をコード化する核酸の完全なまたは部分的な除去を
含む、当業者に知られた任意の方法によって実現され得る。遺伝子が機能しないようにさ
れる場合、それは、本明細書において「無力化する（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）」または「無
力化され（ｋｎｏｃｋｅｄ ｏｕｔ）」ているあるいは類似の用語として呼ばれ得る。
「親の微生物」は、本発明の組み換え型の微生物を生じさせるために使用される微生物
である。親の微生物は、自然に発生するもの（すなわち、野生型の微生物）、または前に
修正されているものの本発明の主題の酵素の１つ以上を発現しないか過剰発現しないもの
であり得る。したがって、本発明の組み換え型の微生物は、親の微生物において発現され
ていないか過剰発現されていない１つ以上の酵素を発現するか過剰発現するように修正さ
れる。
一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリ
ジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボ
キシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、ク
ロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム・フォルミコアセチクム、クロストリジ
ウム・マグナム、アセトバクテリウム・ウーディ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏ
ｏｄｉｉ）、アルカリバクラム・バッチィ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ
ｉ）、ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、
スポロミュサ・オヴァタ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔｅ）、ブチリバクテリウム・メ
チロトロフィカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕ
ｍ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）、ユーバクテリ
ウム・リモーサム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ）、サーモアナエロバクタ
ー・キウヴィ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉ）種を含む酢酸生成
性カルボキシド栄養性生物の群から選択される。
これらのカルボキシド栄養性アセトゲンは、アセチル－ＣｏＡ、アセテート及び他の生
成物を形成する嫌気条件下でエネルギー源として、ガス状の１つの炭素（Ｃ１）源、例え
ば一酸化炭素（ＣＯ）ならびに一酸化炭素（ＣＯ）及び／または水素（Ｈ２）を有する二
酸化炭素（ＣＯ２）などの上で化学自己栄養的に利用して成長するそれらの能力によって
定義される。それらは、発酵の同じ形態、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌまたは還元的な
アセチル－ＣｏＡ経路を共有しており、ならびに一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ
）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル－テトラヒドロ葉酸シンテターゼ
、メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル－テトラヒドロ葉酸シクロヒ
ドロラーゼ、メチレン－テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及び一酸化炭素デヒドロゲナー
ゼ／アセチル－ＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）から成る酵素の組の存在によって
定義されており、その組み合わせは、この種の細菌に特有であって固有である（Ｄｒａｋ
ｅ、Ｋuｓｅｌ、Ｍａｔｔｈｉｅｓ、Ｗｏｏｄ、＆Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、２００６）。基
質をバイオマス、二次代謝産物及びピルビン酸塩に変換する糖発酵細菌の化学従属栄養性
の成長であって、そのバイオマス、二次代謝産物及びピルビン酸塩から生成物が（アセチ
ル－ＣｏＡによってまたは直接的に）形成される成長とは対照的に、アセトゲン（ａｃｅ
ｔｏｇｅｎ）では、基質は、アセチル－ＣｏＡに直接的に導かれ、そのアセチル－ＣｏＡ
から生成物、バイオマス、及び二次代謝産物が形成される。
一実施形態において、微生物は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、及び
「Ｃ．ラグスダレイ」種ならびに関連した分離株を含むカルボキシド栄養性クロストリジ
ウムのクラスターから選択される。これらは、限定されるものではないが、Ｃ．オートエ
タノゲナムＪＡＩ－１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ、Ｎａｖｅａｕ、＆Ｎｙｎ
ｓ、１９９４）、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ／
２００９／０６４２００）、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３
）、Ｃ．リュングダリイＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ５５３８３）（Ｔａｎ
ｎｅｒ、Ｍｉｌｌｅｒ、＆Ｙａｎｇ、１９９３）、Ｃ．リュングダリイＥＲＩ－２（ＡＴ
ＣＣ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、Ｃ．リュングダリイＣ－０１（
ＡＴＣＣ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、Ｃ．リュングダリイＯ－５
２（ＡＴＣＣ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）、または「Ｃ．ラグスダ
レイＰ１１Ｔ」（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－６２２）（ＷＯ２００８／０２８０５５）株、及び
関連した分離株、例えば「Ｃ．コスカチィ（Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ）」（米国特許第２０
１１／０２２９９４７号）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ３５１」（Ｔｙｕｒｉｎ＆Ｋ
ｉｒｉｕｋｈｉｎ、２０１２）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ６５３」（Ｂｅｒｚｉｎ
、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１２ａ）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ
６８３」（Ｂｅｒｚｉｎ、２０１２）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ９６２」（Ｂｅｒ
ｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１３）、「クロストリジウムｓｐ．
ＭＴ１１２１」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１２ｂ）、
「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ１２３０」（Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１
３）、または「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ１９６２」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｔｙｕｒｉｎ、
＆Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、２０１３）など、及びそれらの突然変異株、例えばＣ．リュング
ダリイＯＴＡ－１（Ｔｉｒａｄｏ－Ａｃｅｖｅｄｏ Ｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒ
ｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１０）または「クロストリジウム
ｓｐ．ＭＴ８９６」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１２ｃ
）などを含む。
これらの株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子レベル上で少なくとも９９％の同一性を有する
ものの、ＤＮＡ－ＤＮＡ再結合やＤＮＡ指紋採取実験によって決定されるような（ＷＯ２
００８／０２８０５５、米国特許第２０１１／０２２９９４７号）異なる種である、クロ
ストリジウム属のｒＲＮＡクラスターＩ内にサブクラスターを形成する（Ｃｏｌｌｉｎｓ
ｅｔ ａｌ、１９９４）。
このクラスターの株は、類似の遺伝子型と表現型の両方を有する、共通の特徴によって
定義されており、それらは全て、エネルギー変換及び発酵性代謝の同じ形態を共有する。
このクラスターの株は、シトクロムを欠いており、エネルギーをＲｎｆ複合体によって保
存する。
このクラスターの全ての株は、約４．２ＭＢｐのゲノムサイズ（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａ
ｌ、２０１０）及び約３２％モルのＧＣ組成（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ、１９９４、Ｋ
oｐｋｅ ｅｔ ａｌ、２０１０、Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９３）（ＷＯ２００
８／０２８０５５、米国特許第２０１１／０２２９９４７号）、ならびにＷｏｏｄ－Ｌｊ
ｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ホルミル－テトラヒドロ葉酸
シンテターゼ、メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル－テトラヒドロ
葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレン－テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及び一酸化炭素デ
ヒドロゲナーゼ／アセチル－ＣｏＡシンターゼ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナー
ゼ、Ｒｎｆ複合体（ｒｎｆＣＤＧＥＡＢ）、ピルビン酸塩：フェレドキシンオキシドレダ
クターゼ、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ
、２０１０、２０１１）についてコード化する保存された必須の重要な遺伝子オペロンを
有する。ガスの取り込みに関与する、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子の構成や
数は、核酸及びアミノ酸配列における差にもかかわらず、全種において同じであることが
分かっている（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ、２０１１）。
株は全て、類似の形態やサイズを有しており（対数的に成長する細胞は、０．５～０．
７×３～５μｍの間にあり）、中温性（３０～３７℃の間の最適の成長温度）であり、厳
密に嫌気性生物である（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ、１９９４、Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ、１９９３）（ＷＯ２００８／０２８０５５）。その上、それらは全て、同じ主要な系
統発生的形質、例えば同じｐＨ範囲（最適の最初のｐＨが５．５～６で、ｐＨ４～７．５
）など、類似の成長率を有するＣＯ含有ガス上の強い自己栄養成長、ならびに一定の条件
下で形成された少量の２，３－ブタンジオール及び乳酸を伴う、主な発酵最終生成物とし
てエタノールと酢酸を有する代謝プロファイル（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ、１９９４、
Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ、２０１１、Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９３）を共有する
（ＷＯ 様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、
クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（例えば
、ベタイン、ブタノール）の基質利用において区別する。それらの種のうちのいくつかは
、一定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求体であることが発見
された一方、他は発見されていない。それらの対応するアルコールへのカルボキシル酸の
還元は、これらの生物の範囲において示されている（Ｐｅｒｅｚ、Ｒｉｃｈｔｅｒ、Ｌｏ
ｆｔｕｓ、＆Ａｎｇｅｎｅｎｔ、２０１２）。
したがって、記載された形質は、Ｃ．オートエタノゲナムまたはＣ．リュングダリイの
ような１つの生物に特異的ではなくて、むしろ、カルボキシド栄養性の、エタノール合成
クロストリジウムのための一般的な形質に特異的である。それ故、本発明は、これらの株
にわたって作用することが期待され得るが、能力における差があり得る。
一定の実施形態において、親の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、ク
ロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイを含む群から選
択される。一実施形態において、その群はまた、クロストリジウム・コスカティを含む。
１つの特定の実施形態において、親の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム
ＤＳＭ２３６９３である。
用語、核酸「構築物」または「ベクター」及び類似の用語は、遺伝物質を細胞に伝達す
る媒体としての使用に適した任意の（ＤＮＡとＲＮＡを含む）核酸を含むように広くみな
されるべきである。それらの用語は、プラスミド、（バクテリオファージを含む）ウィル
ス、コスミド及び人工染色体を含むようにみなされるべきであり、例えば、構築物または
ベクターは、１つ以上の調整要素、複製の元、マルチクローニングサイト及び／または選
択可能なマーカーを含み得る。１つの特定の実施形態において、構築物またはベクターは
、構築物またはベクターによってコード化される１つ以上の遺伝子の発現を可能にするよ
うに適合される。核酸構築物またはベクターは、細胞に送り届けることを容易にする裸の
（ｎａｋｅｄ）核酸ならびに１つ以上の作用物質で構築される核酸（例えば、リポソーム
抱合核酸、生物であって、その中に核酸が含まれる、生物）を含む。
廃棄ガスや合成ガス上で成長するカルボキシド栄養性クロストリジウムの全ての既知の
例は、ＮＡＤＨ依存性反応を使用する。酸化還元対ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋／ＮＡＤＰ＋は、Ｎ
ＡＤＨ＋Ｈ＋／ＮＡＤ＋酸化還元対より負の酸化還元電位を有する（Ａｕｒｉｏｌ ｅｔ
ａｌ、２０１１）。生体内の条件下において、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ対の酸化還元電位Ｅ
´は、約－２８０ｍＶ（Ｅｏ´＝－３２０ｍＶ）であるのに対して、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤ
ＰＨ対のＥ´は、約－３６０ｍＶ（Ｅｏ´＝－３２０ｍＶ）である。発明者らは、驚いた
ことには、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２ガスの取り込みや利用のための自己栄養成長に関わる
多数の酵素（例えば、ヒドロゲナーゼ酵素及びＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路酵素）
は、ＮＡＤＨを超えてＮＡＤＰＨの利用の方に明確な偏りを示すことを発見した。これは
、例えば、大部分の細菌性のプロセスのためのモデルとして機能するとともに完全にＮＡ
ＤＨに偏った大腸菌などの細菌を利用する糖の糖分解とは完全に対照的である。これらの
大腸菌をベースとした反応は、ＮＡＤＰＨ依存性反応ステップを含まないものの、いくつ
かのＮＡＤＨ依存性ステップ（グルコース＋２ＮＡＤ＋＋２ＡＤＰ＋２Ｐｉ－＞２ピルビ
ン酸塩＋２ＮＡＤＨ＋２Ｈ＋＋２ＡＴＰ＋２Ｈ２Ｏ、図２）を含む。
大腸菌におけるＮＡＤＰＨ依存性反応は、ＮＡＤＰＨプールを急速に使い果たして、細
胞成長の阻害や死に導くことが示されている。大腸菌におけるＮＡＤＰＨ容量のこの欠如
は、ＮＡＤＰＨ依存性を減らすことを試みる先行研究につながっており、したがって、そ
の研究は、ＮＡＤＰＨ利用の増加が発酵反応において望まれないであろうことを提案する
。したがって、発明者らにとって、本明細書において参照されるカルボキシド栄養性クロ
ストリジウムは、進行するＮＡＤＰＨ依存性反応のための比較的大きな容量を有すること
を発見することは驚きであった。
発明者らは、ＮＡＤＰＨ依存性酵素によるバイオリアクタ内のアセトンの変換を監視す
る実験によって、カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物において比較的大きな容量
のＮＡＤＰＨプールを実証した（例３を参照）。したがって、発明者らは、ＮＡＤＨを超
えるＮＡＤＰＨの使用は、発酵プロセスにおいて酵素による反応を推進するのに好ましい
ことを示した。
それ故、ＮＡＤＨ依存性反応を使用して、ＮＡＤＰＨ依存性反応をバイパスする（それ
は、生産歩留りの低下を結果としてもたらして、広範囲にわたる修正を要求する）大腸菌
のための既存の戦略は、カルボキシド栄養性クロストリジウムにおいて生産的ではない。
本明細書に記載されるような発明は、カルボキシド栄養性クロストリジウムにおいてＮＡ
ＤＰＨ依存性反応について優先的に選択することによってこれを克服する戦略を提供して
、代謝工学技術のための最大の生産歩留りを実現する。ＮＡＤＰＨ依存性反応の容量や電
位は、実施例３ならびに大腸菌を利用する糖に対する差に示される。同様に、この戦略は
、非相同経路に適用され得、最大の生産歩留りや流動を実現する。
更に、発明者らは、ＮＡＤＰＨ依存性反応が、カルボキシド栄養性微生物において急増
することを特定した。これは、ＮＡＤＰＨプールを使用する酵素と遺伝子を特定して特徴
付けるための選択技法の開発を可能にする。これらの技法に従って選択された酵素を発現
するか過剰発現することができる組み換え型の微生物が、カルボキシド栄養性微生物の効
率を改善することと、それらの所望の生成物の生成を増加することとにおいて、実用性を
有する。
例えば大腸菌などのような生物を利用する糖に関して先行技術によって教示されたもの
とは対照的に、発明者らは、ＮＡＤＰＨ依存性反応が、カルボキシド栄養性微生物を考慮
するときに、望ましくない障害ではないことを考察する。発明者らは、実際、ＮＡＤＰＨ
を利用する酵素が、それらが、ＮＡＤＨの存在下でそれらの活性と比較されるときに、そ
れの存在下で増加された活性を有するので、肯定的に望ましいことを信じている。
ＮＡＤＰＨ依存性酵素が、所望の生成物の生成を推進するために使用され得るという発
見は、発明者らに、これらの酵素を発現するか過剰発現することができる新規な組み換え
型の微生物を工学操作させることを導いた。これらの組み換え型の微生物は、新規な経路
が探究されることと、所望の生成物が生成されることと、を可能にする。特定の実施形態
において、組み換え型の微生物は、カルボキシド栄養性微生物である。ＮＡＤＰＨ依存性
酵素が回避されるかバイパスされるべきであることが以前考えられていたのに対して、発
明者らは、驚いたことには、カルボキシド栄養性微生物におけるこれらの酵素の利用が、
微生物の成長及び／または生成における減少をもたらさないことと、そのような酵素を回
避する広範囲にわたる工学操作が必要ではないことと、を示した。
本発明の第１の態様に従って、１つ以上の外因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を発現するよう
に適合された、及び／または１つ以上の内因性酵素を過剰発現するように適合された組み
換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物が提供されており、酵素は、外因性
酵素が発現されるときに、及び／または内因性酵素が過剰発現されるときに、微生物によ
るＮＡＤＰＨの全体的な利用が、親の微生物に対して増加されるように選択される。
更なる態様において、本発明はまた、親の微生物に対して増加されたＮＡＤＰＨ利用を
呈する組み換え型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を生成する方法であって
、
ａ．１つ以上の外因性及び／または内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を選択することと、
ｂ．親の微生物を転換して、１つ以上の外因性酵素を発現する、及び／または１つ以上
の内因性酵素を過剰発現するように適合された組み換え型の微生物を生じることと、を含
む方法を提供するものである。
微生物におけるＮＡＤＰＨ依存性酵素の任意の１つ以上の発現または過剰発現は、微生物
に対するＮＡＤＰＨの利用であって、それにおいて１つ以上の酵素が、発現されないか過
剰発現されない、微生物に対するＮＡＤＰＨの利用における全体的な増加を結果としても
たらす。
１つ以上の酵素は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームで存在し得る。特定
の実施形態において、組み換え型の微生物は、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発現す
る及び／または過剰発現するように適合される。本発明の方法は、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤ
Ｈの利用が類似の範囲内にある特定の実用性のものであり、すなわち、共同因子を利用す
るアイソフォームの活性が、それがＮＡＤＨ共同因子に結合するときに、それがＮＡＤＰ
Ｈ共同因子に結合するときのアイソフォームの活性に類似する。
特定の実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素が、（例えば、Ｓｅｑ．Ｉ
Ｄ６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２
、ＹＰ＿００３７８１０１６、ＹＰ＿００３７８１０１７、ＹＰ＿００３７７８８７９、
ＹＰ＿００３７７９６４０、ＹＰ＿００３７７９８９３、ＹＰ＿００３７８０１９３に従
う、アミノ酸配列、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体を有する）ヒドロゲ
ナーゼ、（例えば、ＡＥＩ９０７２１、ＡＥＩ９０７２３、ＡＥＩ９０７２５、ＹＰ＿０
０３７７９０６３、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＹＰ＿００３７８０１６８、ＡＥＩ９０
７２２、ＡＥＩ９０７２４、ＡＥＩ９０７２６のアミノ酸配列、またはそれらのいずれか
１つの機能的等価変異体を有する）ギ酸デヒドロゲナーゼ、あるいは（例えば、ＡＥＩ９
０７５３、ＹＰ＿００３７８１８９１、ＡＥＩ９０７７１のアミノ酸配列、またはそれら
の機能的等価変異体を有する）メチレン－ＴＨＦ－デヒドロゲナーゼを含む。
本発明の特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性反応の選択肢が存在
する。本発明は、親の微生物におけるＮＡＤＰＨ利用に対してＮＡＤＰＨの全体的な利用
を増加させる手段として、ＮＡＤＨ依存性アイソフォームと比較してＮＡＤＰＨ依存性ア
イソフォームを優先的に使用する組み換え型の微生物及び方法を提供する。そのような経
路及びオキシドレダクターゼ反応の例は、以下を含む。
・イソプレノイド生成物のためのメバロン酸経路：
〇ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ（Ｓ．Ｍ．
Ｍａ ｅｔ ａｌ、２０１１）：
・ＮＡＤＰＨ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．３４、ＧＯ：０００４４２０、例えば
、出芽酵母：ＤＡＡ０９８２２．１、ＢＫ００６９４６．２：１１５７３４．．１１８８
９８）及び
・ＮＡＤＨ依存性酵素（ＥＣ１．１．１．８８、ＧＯ：００４２２８２、例えば、
シュードモナス・メバロニイ：Ｐ１３７０２．１）
・ブタノール／ＰＨＢ経路（Ｂｏｎｄ－Ｗａｔｔｓ、Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ、＆Ｃｈａｎ
ｇ、２０１１）：
〇３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ／アセトアセチル－ＣｏＡレダ
クターゼ／３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡヒドラターゼ：
・ＮＡＤＰＨ依存性ｐｈａＢ（ＥＣ：１．１．１．３６、ＧＯ：００１８４５４、
例えば、ラルストニア・ユートロファ：ＹＰ＿７２５９４２．１、遺伝子ＩＤ：４２４９
７８４から）及び
・ＮＡＤＰＨ依存性ｐｈａＪ（ＥＣ４．２．１．１１９、例えば、アエロモナス・
プンクタタ：ＢＡＡ２１８１６．１から）
・ＮＡＤＨ依存性ｈｂｄ（ＥＣ１．１．１．１５７、ＧＯ：０００８６９１、例え
ば、Ｃ．アセトブチリクム：ＮＰ＿３４９３１４．１、遺伝子ＩＤ：１１１８８９１から
）
〇クロトニル－ＣｏＡレダクターゼ／クロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ－レダク
ターゼ／トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ／ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナ
ーゼ（Ｈｕ ｅｔ ａｌ、２０１２）：
・ＮＡＤＰＨ依存性ｃｃｒ（ＥＣ１．３．１．８６、例えば、ストレプトマイセス
・コリナスから）またはｃｃｒＲｓ（ＥＣ１．３．１．８５、例えば、ロドバクター・ス
フェロイデス：ＹＰ＿３５４０４４．１、遺伝子ＩＤ：３７２０７５１から）
・ＮＡＤＨ依存性ｔｅｒ（ＥＣ１．３．１．４４、ＧＯ：００５０３４３、例えば
、トレポネーマ・デンティコラから）
・ＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐ｂｃｄ－ｅｔｆＡＢ複合体（ＥＣ１．３．８．１
、ＧＯ：０００４０８５、例えば、Ｃ．アセトブチリクム：ＮＰ＿３４９３１７．１、遺
伝子ＩＤ：１１１８８９４から）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ、２００８）または
・ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ二機能性依存性ｔｅｒ（ＥＣ１．３．１．４４、ＧＯ：０
０５０３４３、例えば、ユーグレナ・グラシリス：ＡＹ７４１５８２．１から）（Ｈｏｆ
ｆｍｅｉｓｔｅｒ、Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉ、Ｎｏｗｉｔｚｋｉ、＆Ｍａｒｔｉｎ、２００
５）
デヒドロゲナーゼ（例えば、エタノールもしくはブタノールのためのアルコールデヒド
ロゲナーゼ、またはブタンジオールのためのジオールデヒドロゲナーゼ）及びオキシダー
ゼに関する大部分のオキシドレダクターゼ反応の場合、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ依存性
酵素の選択肢が利用可能であり、それぞれの酵素は、データベース、例えば、Ｂｒａｕｎ
ｓｃｈｗｅｉｇ Ｅｎｚｙｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ ＢＲＥＮＤＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｂｒｅｎｄａ－ｅｎｚｙｍｅｓ．ｉｎｆｏ／）（Ｓｃｈｅｅｒ ｅｔ ａｌ、２０１
１）などを使用して特定され得る。
特定の実施形態において、対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォームの発現が、ＮＡＤＰ
Ｈ依存性アイソフォームの発現における変化と比較されるときに、変化しない、減る、ま
たは比較的小さな増加を呈する一方で、微生物は、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを発
現する及び／または過剰発現するように適合される。このようにして、ＮＡＤＰＨの全体
的な利用が、親の微生物に対して増加される。
特定の実施形態において、本発明は、組み換え型の微生物に、１つ以上のＮＡＤＨ依存
性酵素の弱化された発現またはゼロの発現を提供する。１つの特定の実施形態において、
１つ以上のＮＡＤＨ依存性アイソフォームの発現は、親の微生物に比較して弱化されてい
るか無力化されている。弱化／無力化は、１つ以上のＮＡＤＨ依存性酵素をコード化する
核酸を修正することによって、またはＮＡＤＨ依存性アイソフォームをコード化する１つ
以上の核酸を、ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームをコード化する１つ以上の核酸と置き換
えることによって、実現され得る。酵素の弱化または無力化は、任意の数の既知の転換及
び組み換え型の核酸技法を使用して、本発明の微生物に到達するように親の微生物の転換
によって実現され得る。カルボキシド栄養性アセトゲンにおける弱化または無力化を実現
することができる特定の方法は、Ｌｅａｎｇ、Ｕｅｋｉ、＆Ｌｏｖｌｅｙ、２０１１に記
載されており、更なる技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）に記載されている。一般的な例として、突然変異を遺伝子
に導入する場合、またはそうではなくて、遺伝子を分断するか無力化する場合において、
適切な核酸構築物またはベクターが、遺伝子を分断するために親の微生物のゲノムに組み
込むように設計され得る。そのような構築物は、典型的には、分断されることになる遺伝
子内の範囲またはその遺伝子の側方に位置する範囲に相同である核酸配列（アーム）を含
むことになり、それは、相同再結合が発生すること、及び突然変異の導入、遺伝子からの
核酸の範囲の切除、または対照的なものについて核酸との遺伝子の範囲の置換が発生する
ことを可能にする。構築物上のアームが、ゲノムにおける範囲であって、それらがターゲ
ットとしている範囲に対して１００％の相補性を有することが好適であるが、配列が、興
味の遺伝子範囲とのターゲットとされた再結合を可能にするのに十分に相補的であるとい
う前提で、これは必要ではない。典型的には、アームは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
１９８９に定義されるような、厳格な条件下で、ターゲット範囲に対する交配を可能に
することになる、あるレベルの相同性を有することになる。当業者は、本明細書に記載さ
れるような発明に関わる酵素についての利用可能な配列情報を考慮して、ターゲットとさ
れた相同再結合と、親の微生物のゲノムへの外因性核酸の組み込みと、を可能にするのに
十分な核酸配列を理解するであろう。
一実施形態において、酵素は、複数の共同因子依存性を呈し得る。そのような酵素は、
ＮＡＤＨ／フェレドキシン分岐酵素またはＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ共依存性酵素を含み得る
。特定の実施形態において、酵素は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォーム及びＮＡ
ＤＨ／フェレドキシン分岐アイソフォームで存在しており、微生物は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ
ＰＨ依存性アイソフォームを発現する及び／または過剰発現するように適合される。特定
の実施形態において、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームは、ｔｅｒ（ＥＣ１．
３．１．４４、ＧＯ：００５０３４３、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒ
ａｃｉｌｉｓ）：ＡＹ７４１５８２．１から、またはそれらの機能的等価変異体）である
。更なる実施形態において、ＮＡＤＨ／Ｆｄ依存性アイソフォームは、ＮＡＤＨ／フェレ
ドキシン分岐ｂｃｄ－ｅｔｆＡＢ複合体（ＥＣ１．３．８．１、ＧＯ：０００４０８５、
例えば、Ｃ．アセトブチリクム：ＮＰ＿３４９３１７．１、遺伝子ＩＤ：１１１８８９４
から、またはそれらの機能的等価変異体）である。
本発明の特定の実施形態において、微生物は、親の微生物に比較されるときに、発酵反
応の間に増加された効率を呈する。発酵生成物の生成に関わる微生物は、共同因子として
ＮＡＤＰＨを使用して、発酵生成物の成長や生成に関わる反応を促進する。そのような微
生物が、ＮＡＤＨ共同因子と比較されるときに、ＮＡＤＰＨ共同因子のために高い親和性
で酵素を発現する場合、ＮＡＤＰＨの利用の増加がある場合に、それらの効率（上記定義
を参照）が増加されることになる可能性が存在する。
本発明の酵素は、多数の生成物を生成する生合成経路に関わる。特定の実施形態におい
て、経路は、メバロン酸経路またはブタノール合成経路である。
本発明の一実施形態において、１つ以上のＮＡＤＰＨ依存性酵素の共同因子特異性は、
それのＮＡＤＨ共同因子特異性に対してそれのＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加するよう
に修正され得る。
特定の実施形態において、本発明は、酵素のＮＡＤＨ共同因子特異性に対してオキシド
レダクターゼ酵素のＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加させることによって、カルボキシド
栄養性微生物の効率を上げる方法を提供する。
オキシドレダクターゼ酵素の共同因子特異性は、特に、それぞれのＮＡＤＨ及びＮＡＤ
ＰＨ結合ポケットの一部分に寄与するまたはその一部分を形成する酵素の範囲において、
アミノ酸配列を修正することによって、ＮＡＤＨからＮＡＤＰＨに（またはその逆に）修
正され得る。ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ結合ポケットは、当分野において既知の他の手法で修
正されてもよい。
アミノ酸配列の修正は、１つ以上のアミノ酸残基の追加、欠失及び／または置換、ある
いは当分野において容易に既知であり得る１つ以上の他の修正を含み得る。修正は、酵素
の任意の範囲において起こり得る。しかしながら、一実施形態において、それは、ＮＡＤ
Ｈ結合ポケット内である。
特定の実施形態において、アミノ酸配列の修正が、ブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
酵素についてのグルタミン酸残基の例として、ＮＡＤＨ結合ポケットにおける（複数の）
特定のアミノ酸残基の修正を含む。特定の実施形態において、グルタミン酸残基は、Ｃ．
アセトブチリクムのｂｃｄにおけるＧｌｕ７５及び／またはＴ．デンティコラにおけるＧ
ｌｕ８０である。一実施形態において、当分野において既知の所望された共同因子特異性
を実現するための修正、例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ（２０１２）に記載された修正が、使
用され得る。
特定の実施形態において、発明者らは、共同因子特異性の修正が、様々な種から上述の
クロトニル－ＣｏＡレダクターゼ／トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ／ブチ
リル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼの構造上の分析、及びＮＡＤＰＨに対してＮＡＤＨを区別
する際に重要な役割を果たすＧｌｕ（Ｃ．アセトブチリクムのｂｃｄにおけるＧｌｕ７５
及びＴ．デンティコラにおけるＧｌｕ８０）の保護を通して、実現され得ることを想定す
る。理論によって縛られることを望まずに、これは、ＮＡＤＨのアデニンリボースの２’
－ＯＨを認識する酵素によって起こることが信じられている。ＮＡＤＰＨ依存性酵素にお
いて、この残基は修正される（Ｈｕ ｅｔ ａｌ、２０１２）。
共同因子特異性の修正を実現する方法は、当業者に知られることになる。しかしながら
、例として、様々なオキシドレダクターゼ酵素のための共同因子特異性の変化に係わる以
下の例において使用される方法が、使用され得る。
・１，３－プロパンジオールオキシドレダクターゼ（Ｃ．Ｍａ、Ｚｈａｎｇ、Ｄａｉ、
＆Ｘｉｕ、２０１０）
・ｐ－ヒドロキシベンゾアートヒドロキシラーゼ（Ｅｐｐｉｎｋ、Ｏｖｅｒｋａｍｐ、
Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ、＆Ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ、１９９９）
・１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＭｃＫｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ、
２００２）
・ケトール酸レダクトイソメラーゼ（Ｒａｎｅ＆Ｃａｌｖｏ、１９９７）
新規の分岐酵素
電子分岐は、嫌気細菌及び古細菌の細胞質において吸エルゴン的な酸化還元反応を発エ
ルゴン的な酸化還元反応に結合する最近発見された機構である。現在までのところ、ごく
少数の電子分岐酵素複合体が、特定されており、４つが特徴付けられている（Ｈｅｒｒｍ
ａｎｎ、Ｊａｙａｍａｎｉ、Ｍａｉ、＆Ｂｕｃｋｅｌ、２００８、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ、２０１２、Ｌｉ ｅｔ ａｌ、２００８、Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ、
２０１２、Ｓｃｈｕｔ＆Ａｄａｍｓ、２００９、Ｇ．Ｗａｎｇ＆Ｗａｎｇ、１９８４）。
２００８年に、酪酸形成クロストリジウムにおいて、ＮＡＤＨ（Ｅｏ´＝－３２０ＭＶ）
でのクロトニル－ＣｏＡ（Ｅｏ´＝－１０ｍＶ）の発エルゴン的な還元が、ＮＡＤＨとの
フェレドキシンの吸エルゴン的な還元（Ｅｏ´＝－４００ｍＶ）と結合されることと、そ
の結合反応が、細胞質のブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ－電子伝達フラボタンパク質
複合体Ｂｃｄ－ＥｔｆＡＢによって触媒されることと、が発見された（Ｈｅｒｒｍａｎｎ
、Ｊａｙａｍａｎｉ、Ｍａｉ、＆Ｂｕｃｋｅｌ、２００８、Ｌｉ ｅｔ ａｌ、２００８
）。このプロセスは、フラビンをベースとするものであり、タンパク質結合フラビンが、
ＮＡＤＨによってヒドロキノンに還元され、それは、その後に、クロトニル－ＣｏＡによ
ってセミキノン型ラジカルに再び酸化されて、それは、フェレドキシン（Ｆｄ）を還元す
るのに十分に負の酸化還元電位を有することが提案されている。現在までのところ、少数
の電子分岐酵素複合体が、特定されており、４つが特徴付けられている（Ｈｅｒｒｍａｎ
ｎ ｅｔ ａｌ、２００８、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ、２０１２、Ｌｉ ｅｔ ａｌ、２
００８、Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ、２０１２、Ｓｃｈｕｔ＆Ａｄａｍｓ、
２００９、Ｇ．Ｗａｎｇ＆Ｗａｎｇ、１９８４）。反応１のＢｃｄ－ＥｔｆＡＢ複合体に
加えて、メタン生成古細菌からのＭｖｈＡＤＧ－ＨｄｒＡＢＣ複合体は、反応２を触媒し
て、細菌及び古細菌からのＮｆｎＡＢ複合体は、反応３を触媒して、細菌からのＨｙｄＡ
ＢＣ複合体は、反応４を触媒する。

（１）２ＮＡＤＨ＋Ｆｄｏｘ＋クロトニル－ＣｏＡ→２ＮＡＤ＋＋Ｆｄｒｅｄ ２－＋ブチ
リル－ＣｏＡ
ΔＧｏ´＝－４４ｋＪ／ｍｏｌ＊

（２）２Ｈ２＋ＣｏＭ－Ｓ－Ｓ－ＣｏＢ＋Ｆｄｏｘ→ＣｏＭ－ＳＨ＋ＣｏＢ－ＳＨ＋Ｆｄ
ｒｅｄ ２－＋２Ｈ＋
ΔＧｏ´＝－５０ｋＪ／ｍｏｌ＊

（３）ＮＡＤＨ＋Ｆｄｒｅｄ ２－＋２ＮＡＤＰ＋＋Ｈ＋⇔ＮＡＤ＋＋Ｆｄｏｘ＋２ＮＡＤ
ＰＨ
ΔＧｏ´＝－１６ｋＪ／ｍｏｌ＊

（４）ＮＡＤＨ＋Ｆｄｒｅｄ ２－＋３Ｈ＋⇔ＮＡＤ＋＋Ｆｄｏｘ＋２Ｈ２
ΔＧｏ´＝＋２１ｋＪ／ｍｏｌ＊

＊－４００ｍＶのＥｏ´を使用する標準条件下（１Ｍ濃度の基質及び生成物、ガスの分圧
＝１バール、ｐＨ＝７）
これらの複合体の全ては、ＮＡＤＨ依存性であり、それらの間で２つ、異種の鉄のみの
ヒドロゲナーゼが、Ｈ２でのフェレドキシンの吸エルゴン的な還元を、Ｈ２でのＮＡＤの
発エルゴン的な還元と可逆的に結合する（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ、２０
１２、Ｓｃｈｕｔ＆Ａｄａｍｓ、２００９）。発明者らは、初めて、ＮＡＤＰＨ依存性分
岐酵素（反応５）、ＮＡＤではなくてＮＡＤＰに特異的である新規な電子分岐［ＦｅＦｅ
］ヒドロゲナーゼを特定した。

（５）ＮＡＤＰＨ＋Ｆｄｒｅｄ ２－＋３Ｈ＋⇔ＮＡＤＰ＋＋Ｆｄｏｘ＋２Ｈ２
ΔＧｏ´＝＋２１ｋＪ／ｍｏｌ＊

＊－４００ｍＶのＥｏ´を使用する標準条件下（１Ｍ濃度の基質及び生成物、ガスの分圧
＝１バール、ｐＨ＝７）
この理論に拘束されずに、ヒドロゲナーゼに加えてこの複合体の役割は、ギ酸塩：水素
リアーゼとして働くことである。この機能において、それは、Ｆｄｏｘ／Ｆｄｒｅｄ ２－
対の及びＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ対の細胞内の酸化還元電位がＣＯ過還元に起因して低く
なり過ぎるときに、それぞれ、陽子とＣＯ２の還元によってＨ２及びギ酸塩を形成するこ
とによって、ＮＡＤＰＨ推進型の生成物形成のための電子オーバーフロー弁を表わす。
生体内の条件下で、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ対の酸化還元電位Ｅ´は約－２８０ｍＶ（Ｅｏ
´＝－３２０ｍＶ）であり、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ対のＥ´は約－３６０ｍＶ（Ｅｏ´
＝－３２０ｍＶ）である。Ｆｄｏｘ／Ｆｄｒｅｄ２－対の酸化還元電位Ｅ´は、かなり低
い－４００ｍＶ（Ｃ．パストゥリアヌム・フェレドキシン（Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕ
ｍ ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）からのＥｏ´）である。そういうものとして、本発明のこの
分岐プロセスの態様は、例えば高速反応速度などの利点を提供する。
生体内の条件下で、フェレドキシンの酸化還元電位は、ほぼ－５００ｍＶであり、ＮＡ
ＤＰは、ほぼ－３７０ｍＶの酸化還元電位にあり、ＮＡＤは、ほぼ－２８０ｍＶの酸化還
元電位にあることが予測される。Ｆｄｏｘ／Ｆｄｒｅｄ ２－対とＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ対と
の間の約２００ｍＶの酸化還元電位差は、膜結合Ｒｎｆ複合体及びＦｏＦ１ＡＴＰシンタ
ーゼによって媒介された電子伝達リン酸化と結合されるのに十分大きい。フェレドキシン
でのＮＡＤ＋還元は、ＣＯ上で成長するＣ．オートエタノゲナムのエネルギー代謝作用に
おける主な結合部位であることが予測される。ＮＡＤ＋は、ＮＡＤＰＨを生じるＮｆｎ触
媒反応によって連続的に再生され、次いで、そのＮＡＤＰＨは、生成物形成を推進し得る
（図７）。
発明者らは、ＮＡＤではなくてＮＡＤＰに特異的である、新規な電子分岐［ＦｅＦｅ］
ヒドロゲナーゼを特定した。発明者らはまた、Ｃ．オートエタノゲナムにおいて発現され
たギ酸デヒドロゲナーゼが、（本明細書において分岐ギ酸デヒドロゲナーゼと呼ばれる）
ＮＡＤＰＨだけではなくて、フェレドキシンとＮＡＤＰＨの両方を利用できることも特定
した。
これらの酵素の新規な機能は、以前に知られておらず、特定されることになる最初のＮ
ＡＤＰＨ依存性分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ及び分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナ
ーゼ酵素である。発明者らによる更なる研究は、ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ及びＮ
ＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼが、本明細書においてギ酸水素リアーゼ複合体として呼ばれ
る、酵素複合体を形成することを示した。特定の実施形態において、この複合体はまた、
複数の共同因子依存性を実現するための組み換え型の微生物の生成における実用性も有す
る。
したがって、本発明は、反応において複数の共同因子（例えば、フェレドキシンやＮＡ
ＤＰＨ）を利用する目的で、上記酵素を発現するかコード化する、組み換え型の微生物、
ポリペプチド、またはポリヌクレオチドの使用を提供する。特定の実施形態において、ポ
リペプチドが、ＡＥＩ９０７２１、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＡＥＩ９０７２２に従う
分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、またはそれらのいずれか１つの機能的等価変異体を
含む。
特定の実施形態において、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＹＰ＿００３７７８８７９、ならびにそれらの
任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択される。
特定の実施形態において、分岐ギ酸水素リアーゼ複合体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５
から６７またはそれらの機能的等価変異体によってコード化される。
特定の実施形態において、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰギ酸デヒド
ロゲナーゼまたはギ酸水素リアーゼ複合体をコード化するポリヌクレオチドが、ＨＱ８７
６０１５、ＣＬＪＵ＿ｃ０６９９０、ＡＥＩ９０７２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２５、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７から６９、
ならびにそれらの任意の１つ以上の機能的等価変異体からなる群から選択された１つ以上
のポリヌクレオチドを含む。
分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ及び分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼのために
遺伝子をコード化するタンパク質は、ＮＡＤＰ結合部位を有する鉄－硫黄フラボタンパク
質、鉄－硫黄（ＦｅＳ）タンパク質、ならびにセレノシステイン及びモリブドプテリン含
有ギ酸デヒドロゲナーゼ（図３）のための遺伝子と共に、単一の遺伝子クラスターにおい
て発明者らによって発見された。これらの遺伝子が、本明細書においてギ酸水素リアーゼ
（実施例１を参照）と呼ばれることになる機能複合体をコード化することが、発明者らに
よって提案される。鉄－硫黄フラボタンパク質、鉄－硫黄（ＦｅＳ）タンパク質、ならび
にギ酸塩及びモリブデン補助タンパク質は、以下の表１に示されるようにポリペプチドに
よってコード化される遺伝子クラスターを構成するものを含む。

Figure 2022116003000002
本発明はまた、反応において複数の共同因子を利用する目的のために使用されるときに
、新規な分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ及び
／またはギ酸水素リアーゼを発現する組み換え型のカルボキシド栄養性微生物を提供する
。好ましくは、複数の共同因子は、フェレドキシン及びＮＡＤＰＨを含む。
本発明はまた、上記したように分岐ヒドロゲナーゼを発現する組み換え型のカルボキシ
ド栄養性微生物を使用することによって、ＣＯ含有基質の発酵の効率を上げる方法を提供
する。効率は、ＮＡＤＰＨだけではなくて、フェレドキシンとＮＡＤＰＨの両方を利用す
る分岐酵素に起因して増される。ＮＡＤＰＨと比較してフェレドキシンのより負の酸化還
元電位は、より大きなエネルギーの電位を反応に提供して、したがって、反応速度とＣＯ
基質処理量が増加する。
加えて、発明者らは、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ及びＣ．ラグスダ
レイを含むカルボキシド栄養性クロストリジウムの種において新規なＮｆｎ酵素を特定し
た。このＮｆｎ酵素は、ＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋に還元して、ＮＡＤＨ＋＋Ｈ＋を
犠牲にしてプールを補給することができる（またはその逆）（反応２）：

（２）Ｆｄｒｅｄ ２－＋ＮＡＤＨ＋２ＮＡＤＰ＋＋Ｈ＋⇔Ｆｄｏｘ＋ＮＡＤ＋＋２ＮＡＤ
ＰＨ
この酵素は、今までのところ、１つの生物、Ｃ．クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）（Ｓ
．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ、２０１０）だけについて記載されており、ここで、それは、複
合体を形成する２つのサブユニットＮｆｎＡ及びＮｆｎＢからなる。発明者らは、Ｃ．オ
ートエタノゲナムの細胞における活性を特定して、対応する遺伝子を特定した（実施例４
）。これは、初めて、単一のＮｆｎ遺伝子が特定されて、カルボキシド栄養性生物におい
て初めて特定されたＮｆｎ酵素である。２つのサブユニットの複合体ではなくて、１つだ
けのサブユニットを有することは、酵素を生成することと修正することとを含む利点を有
する。
この理論に拘束されずに、発明者らは、２つの新規な複合体、電子分岐ＮＡＤＰ鉄のみ
のヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ／ギ酸水素リアーゼ及びＮｆｎ複合体
が、エネルギー保存及びＣＯから還元された生成物の形成において重大な役割を果たし、
それが、反応７～９（図７）の記載されたフェレドキシン依存性一酸化炭素デヒドロゲナ
ーゼ（ＣＯＤＨ）、ＦｏＦ１Ｒｎｆ複合体（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ、２０１０、Ｔｒｅ
ｍｂｌａｙ、Ｚｈａｎｇ、Ｄａｒ、Ｌｅａｎｇ、＆Ｌｏｖｌｅｙ、２０１２）と共にＮＡ
ＤＰＨによって推進されることを信じている。

（７）ＣＯ＋Ｈ２Ｏ＋Ｆｄｏｘ⇔ＣＯ２＋Ｆｄｒｅｄ ２－＋２Ｈ＋
（８）Ｆｄｒｅｄ ２－＋ＮＡＤ＋＋Ｈ＋⇔．Ｆｄｏｘ＋ＮＡＤＨ＋ΔμＨ＋
（９）ΔμＨ＋＋０．５ＡＤＰ＋０．５Ｐｉ⇔０．５ＡＴＰ＋０．５Ｈ２Ｏ
フェレドキシンは、－４００ｍＶよりも負の酸化還元電位で、ＮＡＤＰは、ほぼ－３６
０ｍＶの酸化還元電位で、ＮＡＤは、ほぼ－２８０ｍＶの酸化還元電位で、生体内で作用
する。Ｆｄｏｘ／Ｆｄｒｅｄ ２－対とＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ対との間の１２０ｍＶより大き
な酸化還元電位差が、膜結合Ｒｎｆ複合体（反応８）及びＦｏＦ１ＡＴＰシンターゼ（反
応９）によって媒介された電子伝達リン酸化と結合されるのに十分大きい。ＮＡＤ＋は、
ＮＡＤＰＨを生じるＮｆｎ複合体触媒反応６によって、及び他のＮＡＤＨ依存性反応によ
って、連続的に再生される。ＮＡＤＰＨは、次いで、特定された他のＮＡＤＰＨ依存性反
応（図７）と共に、生成物形成を推進するために使用され得る。
ＣＯのかなり負の酸化還元電位（－５２０ｍＶ）が原因で、これらの電子キャリアが十
分迅速に再度酸化され得ないときに、フェレドキシン及びＮＡＤＰを過還元する可能性が
ある。フェレドキシン及びＮＡＤＰＨの再酸化のレートを上げるための１つの手法は、Ｎ
ＡＤＰＨ依存性反応を選択する還元される生成物形成のレートを上げることである。
以下の表２における結果は、Ｎｆｎ酵素を発現するカルボキシド栄養性微生物が、ＮＡ
ＤＰＨ依存性酵素による使用のために、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するための能力を有
することを示す。
Figure 2022116003000003
Ｎｆｎ酵素は、Ｃ．クルイベリにおけるような２つではなくて、単一の遺伝子／タンパ
ク質（それぞれ、Ｃ．オートエタノゲナムにおけるＳｅｑ．ＩＤ Ｎｏ１及び２）に遡ら
れることが、発明者らによって発見された。この酵素をコード化する類似の遺伝子がまた
、Ｃ．リュングダリイ（ＹＰ＿００３７８１８５２．１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０）（こ
こで、それは、グルタミン酸シンターゼとして注釈付けされる）及びＣ．ラグスダレイ（
Ｓｅｑ＿ＩＤ Ｎｏ：３及び４）に存在する。
発明者らは、組み換え型の微生物において、Ｎｆｎ遺伝子またはそれの機能的変異体の
発現を上方調整することは、ＮＡＤＰＨ依存性酵素の効率の向上を可能にして、発酵反応
から高い生成物出力を導くことを想定する。
したがって、特定の態様において、本発明は、Ｎｆｎ酵素複合体を発現するか過剰発現
することによって、微生物の生成の効率を上げる方法を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、ＮＡＤＰＨプールサイズを増加する、ＮＡＤＨを
ＮＡＤＰＨに変換する組み換え型の微生物の使用を提供して、組み換え型の微生物は、単
一のＮｆｎ酵素を発現する及び／または過剰発現するように適合される。特定の実施形態
において、Ｎｆｎ酵素は、ＳＥＱ＿ＩＤ ＮＯ．２、４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１
、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０のアミノ酸配列、あるいは少なくとも７６％、８０％、８５％
、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するそれらのいずれか１つの機能的等
価変異体を含む。Ｎｆｎ酵素は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換して、したがって、ＮＡＤ
Ｈ及びＮＡＤＰＨ依存性酵素の存在下で発現されるときに、酵素効率が上げられ、ＮＡＤ
ＰＨの高速反応速度と高速再生速度をもたらす。
特定の実施形態において、微生物が、カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物を含
む。更なる実施形態において、微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロ
ストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイを含むカルボキシド栄
養性クロストリジウムの群から選択される。
本発明はまた、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するポリペプチドの使用を提供するもので
あり、ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１、
ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０に従う単一のＮｆｎ酵素、またはそれらのいずれか１つの機能的
等価変異体を含む。更に、本発明は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するポリヌクレオチド
の使用を提供するものであり、ポリヌクレオチドは、単一のＮｆｎ酵素をコード化して、
ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０もしくはＹ
Ｐ＿００３７８１８５２．１をコード化する配列、または少なくとも８３％、８５％、９
０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体を含む。
更なる態様において、本発明は、ＳＥＱ＿ＩＤ ＮＯ．１または３に従うポリヌクレオ
チドを提供する。
更なる態様において、本発明は、ＳＥＱ＿ＩＤ ＮＯ．２または４に従うポリペプチド
を提供する。更なる態様において、本発明は、新規なＮｆｎポリヌクレオチド、及び／も
しくは本発明の新規なＮｆｎポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むベクタ
ーならびに／または組み換え型の微生物を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、ＮＡＤＨ依存性反応の最適化を提供する。この場
合において、それぞれのＮＡＤＰＨ依存性ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸
水素リアーゼ、及び／またはメチレン－ＴＨＦ－デヒドロゲナーゼは、例えばムーレラ・
サーモアセチカまたはＡ．ウーディからの、対応するＮＡＤＨ依存性酵素と置き換えられ
得る。これは、ＮＡＤＨのために設計され最適化された経路を通る流動を最適化すること
になる。この実施形態は、特定の実用性を有することになり、ここで、ＮＡＤＰＨ依存性
酵素が利用可能であり、またはＮＡＤＰＨ依存性酵素を含む組み換え型の生物が、効率的
に工学操作され得ない。
特定の酵素の発現を増大するために、その酵素をコード化する核酸の発現が増大される
。所望の酵素をコード化する核酸の発現を増大する方法は、以下に概説される。当業者は
、使用の他の技法を容易に理解するであろう。
本発明は、本明細書において参照されるタンパク質及びペプチドをコード化する核酸を
含み得、または本発明における使用のタンパク質及びペプチドをコード化する核酸を使用
し得る。一実施形態において、核酸は、核酸構築物またはベクターである。１つの特定の
実施形態において、核酸構築物またはベクターは、発現構築物またはベクターであるが、
他の構築物及びベクター、例えばクローン化のために使用されるものなどが、本発明によ
って包含される。１つの特定の実施形態において、発現構築物またはベクターは、プラス
ミドである。
本発明の発現構築物／ベクターは、所望される場合、プロモーターならびに更なるタン
パク質の発現に適した追加の遺伝子に加えて任意の数の調整要素を含有し得ることが認識
されるであろう。一実施形態において、発現構築物／ベクターは、１つのプロモーターを
含む。別の実施形態において、発現構築物／ベクターは、２つ以上のプロモーターを含む
。１つの特定の実施形態において、発現構築物／ベクターは、発現されることになる各遺
伝子に対して１つのプロモーターを含む。一実施形態において、発現構築物／ベクターは
、１つ以上のリボソーム結合部位、好ましくは、発現されることになる各遺伝子のための
リボソーム結合部位を含む。
本明細書に記載された核酸配列及び構築物／ベクター配列が、標準リンカーヌクレオチ
ド、例えばリボソーム結合部位及び／または制限部位に要求されるものなどを含有し得る
ことは、当業者によって認識されるであろう。そのようなリンカー配列は、要求されてい
ると解釈されるべきではないし、定義される配列上の限定をもたらすものではい。
本発明の発現構築物／ベクターを含む、核酸及び核酸構築物は、当分野において標準の
任意の数の技法を使用して構築され得る。例えば、化学合成または組み換え型の技法が使
用され得る。そのような技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）に記載される。更なる例示的な技法は、この後に実施例
の欄に記載される。本質的に、個々の遺伝子及び調整要素は、遺伝子が、所望のタンパク
質を形成するように発現され得るように、互いに操作可能に連鎖されることになる。本発
明における使用に適したベクターが、当業者によって認識されることになる。しかしなが
ら、例として、以下のベクター、すなわち、ｐＭＴＬ８００００ベクター、ｐＩＭＰ１、
ｐＪＩＲ７５０、及びこの後に実施例の欄に例示されるプラスミドが、適切であり得る。
本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含む任意の適切な形態にあり得る
ことが認識されるべきである。
本発明はまた、ホスト生物、特に、微生物を提供するものであり、本明細書に記載され
た核酸の任意の１つ以上を含むウィルス、細菌、及び酵母を含む。
組み換え型の微生物を生成する方法
１つ以上の外因性核酸は、裸の核酸として親の微生物に送り届けられ得、または転換プ
ロセスを容易にする１つ以上の作用物質（例えば、リポソーム抱合核酸、生物であって、
その中に核酸が含有される、生物）で構築され得る。１つ以上の核酸は、適切であるよう
に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであり得る。制限阻害剤が、一定の実施
形態において使用され得、例えば、Ｍｕｒｒａｙ、Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ（２０００）Ｍｉ
ｃｒｏｂｉａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６４、４１２．）を参照。
本発明の微生物は、組み換え型の微生物を生成するための当分野において既知の任意の
数の技法を使用して、親の微生物及び１つ以上の外因性核酸から準備され得る。ほんの一
例として、（形質導入またはトランスフェクションを含む）転換は、電気穿孔法、超音波
処理、ポリエチレングリコール媒介転換、化学的または自然の能力、プロトプラスト形質
転換、プロファージ誘発または抱合によって実現され得る。適切な転換技法は、例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ：Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｒｏｔａｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｕｒ、１９８９に記載される。
電気穿孔法は、Ｃ．リュングダリイ（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ、２０１０、Ｐｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７：１３０８７－９２、（Ｌｅａｎｇ ｅｔ
ａｌ、２０１１）ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３、ＷＯ２０１２／０５３９０５
）、Ｃ．オートエタノゲナム（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３、ＷＯ２０１２／０
５３９０５）、アセトバクテリウム・ウーディ（Ｓｔｒａｅｔｚ ｅｔ ａｌ、１９９４
、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１０３３－３７）またはムー
レラ・サーモアセチカ（Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ、２０１２）のようないくつかのカルボキ
シド栄養性アセトゲンについて記載されており、多くのクロストリジウム、例えばＣ．ア
セトブチリクム（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、１０、１９０－１９５）、Ｃ．セルロリティカム（ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ
ｕｍ）（Ｊｅｎｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ、２０００、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４６：
３０７１－３０８０）またはＣ．サーモセルム（ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）（Ｔｙｕｒ
ｉｎ ｅｔ ａｌ、２００４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：
８８３－８９０）などにおいて使用される標準方法である。プロファージ誘発は、Ｃ．ス
カトロゲネス（Ｐｒａｓａｎｎａ Ｔａｍａｒａｐｕ Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ、２
０１０、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣ
Ｃ ２５７７５ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔｓ、Ｍａｓｔｅｒ
ｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の場
合にはカルボキシド栄養性アセトゲンについても同様に実証されており、一方、抱合は、
クロストリジウム・ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ
、２００３、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２９：１０３－１１０）また
はＣ．アセトブチリクム（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ、１９９０、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：８１９－８２６）を含む多くのクロストリジウムのための選択
の方法として記載されており、カルボキシド栄養性アセトゲンのための類似の様式におい
て使用され得る。
一定の実施形態において、転換されることになる微生物において活性である制限システ
ムに起因して、微生物に導入されることになる核酸をメチル化する必要がある。これは、
以下に記載されるもの、及びこの後に実施例の欄に更に例示されるものを含む種々の技法
を使用して行われ得る。
例として、一実施形態において、本発明の組み換え型の微生物は、以下のステップを含
む方法によって生成される。
ａ．（ｉ）本明細書に記載されたような発現構築物／ベクターの、及び（ｉｉ）メチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物／ベクターのシャトル微生物への導入
、
ｂ．メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現、
ｃ．シャトル微生物からの１つ以上の構築物／ベクターの分離、ならびに、
ｄ．目的微生物への１つ以上の構築物／ベクターの導入
一実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子が構成的に発現される
。
別の実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が誘発される。
シャトル微生物は、微生物、好ましくは、発現構築物／ベクターを構成する核酸配列の
メチル化を容易にする制限消極的微生物である。特定の実施形態において、シャトル微生
物は、制限消極的大腸菌、枯草菌、またはラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）である。
メチル化構築物／ベクターが、メチルトランスフェラーゼをコード化する核酸配列を含
む。
発現構築物／ベクター及びメチル化構築物／ベクターがシャトル微生物に一旦導入され
ると、メチル化構築物／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が、誘発
される。誘発は、本発明の１つの特定の実施形態では任意の適切なプロモーターシステム
によるものであり得るが、メチル化構築物／ベクターは、誘発性ラックプロモーターを含
み、乳糖またはそれらの類似物、より好ましくは、イソプロピル－β－Ｄ－チオ－ガラク
トシド（ＩＰＴＧ）の追加によって誘発される。他の適切なプロモーターは、ａｒａ、ｔ
ｅｔ、またはＴ７システムを含む。本発明の更なる実施形態において、メチル化構築物／
ベクタープロモーターは、構成性プロモーターである。
特定の実施形態において、メチル化構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子が、シ
ャトル微生物において発現されるように、メチル化構築物／ベクターは、シャトル微生物
の同一性に特異的である複製の元を有する。好ましくは、発現構築物／ベクター上に存在
する任意の遺伝子が、目的微生物において発現されるように、発現構築物／ベクターは、
目的微生物の同一性に特異的である複製の元を有する。
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、発現構築物／ベクター上に存在する遺伝子の
メチル化を結果としてもたらす。発現構築物／ベクターは、次いで、多数の既知の方法の
いずれか１つに従ってシャトル微生物から分離され得る。ほんの一例として、この後に記
載される実施例の欄に記載された方法論が、発現構築物／ベクターを分離するために使用
され得る。
１つの特定の実施形態において、構築物／ベクターの両方が、同時に分離される。
発現構築物／ベクターは、任意の数の既知の方法を使用して目的微生物に導入され得る
。しかしながら、例として、この後に実施例の欄に記載された方法論が使用されてもよい
。発現構築物／ベクターはメチル化されるので、発現構築物／ベクター上に存在する核酸
配列は、目的微生物に組み込まれ、成功裏に発現されることができる。
メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、シャトル微生物に導入され得、過剰発現され得る
。それ故、一実施形態において、結果として生じるメチルトランスフェラーゼ酵素は、既
知の方法を使用して集められ得、生体外で使用され得、発現プラスミドをメチル化する。
発現構築物／ベクターは、次いで、発現のために目的微生物に導入され得る。別の実施形
態において、メチルトランスフェラーゼ遺伝子が、シャトル微生物のゲノムに導入されて
、その後に、シャトル微生物への発現構築物／ベクターの導入、シャトル微生物からの１
つ以上の構築物／ベクターの分離、次いで、目的微生物への発現構築物／ベクターの導入
が、続く。
上記で定義したような発現構築物／ベクター及びメチル化構築物／ベクターは、物質の
組成を提供するために組み合わされ得ることが想定される。そのような組成は、本発明の
組み換え型の微生物を生成するための制限バリア機構を回避する際の特定の実用性を有す
る。
１つの特定の実施形態において、発現構築物／ベクター及び／またはメチル化構築物／
ベクターは、プラスミドである。
当業者は、本発明の微生物の生成における使用の多数の適切なメチルトランスフェラー
ゼを認識するであろう。しかしながら、例として、枯草菌ファージΦＴ１メチルトランス
フェラーゼ及びこの後に実施例に記載されるメチルトランスフェラーゼが、使用されても
よい。一実施形態において、メチルトランスフェラーゼは、ＷＯ／２０１２／０５３９０
５に記載されている。
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするように適合された任意の数の構築
物／ベクターは、メチル化構築物／ベクターを生じるために使用され得る。しかしながら
、例として、この後に実施例の欄に記載されるプラスミドが、使用されてもよい。
生成の方法
本発明のある実施形態において、微生物によって発酵されるガス状基質は、ＣＯを含有
するガス状基質である。ガス状基質は、産業プロセスの副産物として、またはいくつかの
他の源から、例えば自動車排気ガスなどから、得られるＣＯ含有廃棄ガスであり得る。一
定の実施形態において、産業プロセスは、鉄金属生成物の製造、例えば製鋼所、非鉄生成
物の製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモ
ニア生成、メタノール生成及びコークス製造などからなる群から選択される。これらの実
施形態において、ＣＯ含有ガスは、任意の便利な方法を使用して、それが大気に放出され
る前に、産業プロセスから捕捉され得る。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素と水素を含むガ
ス）の成分であり得る。産業プロセスから生成されるＣＯは、通常、広がって、ＣＯ２を
生成して、したがって、本発明は、ＣＯ２温室効果ガス放出を削減する際、及びバイオ燃
料を生成する際における特定の実用性を有する。ガス状のＣＯ含有基質の組成に依存して
、それを発酵に導入する前に、任意の所望されない不純物、例えば塵粒などを除去するよ
うにそれを取り扱うこともまた望ましいであろう。例えば、ガス状基質は、既知の方法を
使用して、フィルタリングされ得るかこすり落とされ得る。
ＣＯ含有基質ガスに加えて、細菌の成長及び生成物の生成が起こるために、適切な液体
栄養培地が、バイオリアクタに供給される必要があることになることが認識されるであろ
う。
方法の態様の特定の実施形態において、発酵は、水性培養培地において起こる。方法の
態様の特定の実施形態において、基質の発酵は、バイオリアクタ内で起こる。
基質及び培地は、連続的な、回分（ｂａｔｃｈ）または流加回分（ｂａｔｃｈ ｆｅｄ
）様式でバイオリアクタに供給され得る。栄養培地は、使用される微生物の成長を可能に
するのに十分なビタミン及びミネラルを含有することになる。ＣＯを使用する発酵に適し
た嫌気培地は、当分野において既知である。例えば、適切な培地は、Ｂｉｅｂｅｌ（２０
０１）に記載される。本発明の一実施形態において、培地は、この後に実施例の欄に記載
されるようなものである。
発酵は、望ましくは、バイオ燃料の生成が起こるための適切な発酵条件下で実行される
べきである。考慮されるべきである反応条件は、圧力、温度、ガス流量率、液体流量率、
培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌率（連続式撹拌槽リアクタを使用する場合）、接種レ
ベル、液相におけるＣＯが限界にならないことを確実にする最大のガス基質濃度、及び生
成物の阻害を回避する最大の生成物濃度を含む。
加えて、基質の流れのＣＯ濃度（または、ガス状基質におけるＣＯ分圧）を増大して、
それ故、ＣＯが基質である発酵反応の効率が上がることが望まれることが多い。増大され
た圧力で操作することは、気相から液相へのＣＯ伝達率における著しい増加を可能にして
、ここで、それは、発酵の生成のための炭素源として微生物に取り込まれ得る。これは、
次いで、バイオリアクタが、大気圧ではなくて上昇した圧力に維持されるときに、（入力
ガス流量率によって除算されるバイオリアクタ内の液体量として定義される）滞留時間が
削減され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される本発明の特定の微生物に部分
的に依存することになる。しかしながら、一般に、発酵は、周囲圧力よりも高い圧力で行
われることが好適である。また、所与のＣＯ変換率は、基質滞留時間に一部応じるもので
あり、所望の滞留時間を実現して、次いで、要求された容量のバイオリアクタを決定づけ
るので、加圧システムの使用は、要求されたバイオリアクタの容量、その結果として、発
酵設備の資本費用を大いに削減し得る。米国特許第５，５９３，８８６号に与えられた例
に従って、リアクタ容量は、リアクタ動作圧力の増加に線形比例して削減され得、すなわ
ち、１０気圧で動作されるバイオリアクタは、１気圧で動作されるものの１０分の１の容
量だけを必要とする。
例として、上昇した圧力でガスからエタノールへの発酵を行うことの利益が、記載され
ている。例えば、ＷＯ０２／０８４３８は、それぞれ、１５０ｇ／ｌ／日及び３６９ｇ／
ｌ／日のエタノール生産性を与える、３０ｐｓｉｇ及び７５ｐｓｉｇの圧力下で行われる
ガスからエタノールへの発酵を説明する。しかしながら、大気圧において類似の培地及び
入力ガス組成を使用して行われる発酵例は、１日につき１リットル当たり１０から２０分
の１のエタノールを生成することが見付けられた。
ＣＯ含有ガス状基質の導入率は、例えば、液相におけるＣＯの濃度が限界にならないこ
とを確実にすることなどもまた望ましい。これは、ＣＯ限界条件の結果が、１つ以上の生
成物が培養によって消費されることであり得るからである。
発酵反応を与えるために使用されるガス流の組成は、その反応の効率及び／または費用
にかなりの影響を与え得る。例えば、Ｏ２は、嫌気発酵プロセスの効率を減らし得る。発
酵前または後の発酵プロセスの段階において望まれていないガスあるいは不必要なガスを
処理することは、そのような段階への負担を増加し得る（例えば、ガス流がバイオリアク
タに入る前に圧縮される場合、不必要なエネルギーが、発酵において必要とされないガス
を圧縮するために使用され得る）。したがって、基質の流れ、特に、産業源に由来する基
質の流れを取り扱うことが望ましい可能性があり、望まれていない成分を除去して、所望
の成分の濃度を増加する。
一定の実施形態において、本発明のバクテリアの培養は、水性培養培地において維持さ
れる。好ましくは、水性培養培地は、最小嫌気微生物の成長培地である。適切な培地は、
当分野において既知であり、例えば米国特許第５，１７３，４２９号や第５，５９３，８
８６号及びＷＯ０２／０８４３８に記載されており、ならびにこの後に実施例の欄に記載
されるようなものである。
また、培養液のｐＨが、活性炭に対する酢酸の吸着を強めるために上記したように調整
された場合、そのｐＨは、バイオリアクタに戻される前に、発酵バイオリアクタにおける
培養液のそれに類似のｐＨに再調整されるべきである。
実施例１
Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の全部で５つのオキシドレダクターゼ酵素ステップ
を測定して、異なる基質の存在下でそれらの活性を決定した。これらの酵素は、反応を推
進する共同因子を使用し得る。酵素は、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２ガスの取り込みならびに
利用を含む自己栄養成長に関わる。
測定された酵素及びそれらの活性は、図１に詳細にされる。行われた全ての測定は、基
準の、メチルビオロゲン（ＭＶ）またはベンジルビオロゲン（ＢＶ）のような合成酸化還
元色素を使用して試験した。共同因子フェレドキシン（Ｆｄ）、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ
またはそれらの組み合わせを試験した。酵素測定は、ＣＯ及び水素上で自己栄養的に成長
する典型的なリアクタランからの粗抽出物を使用して行った。
発酵
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を用いる発酵は、３７℃においてならびに以
下に記載されるような単一のエネルギー及び炭素源としてＣＯ含有製鋼所ガスにおいて１
．５Ｌのバイオリアクタ内で実行した。リットル当たり：ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ２（０．５
ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍＭ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（
５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する定義した培地を培養成長のた
めに使用した。培地は、バイオリアクタの中に移動させて、１２１℃で４５分間オートク
レーブ処理した。オートクレーブ処理後、培地は、チアミン、パントテン酸塩（０．０５
ｍｇ）、ビオチン（０．０２ｍｇ）を補充して、３ｍＭのシステイン－ＨＣｌで還元した
。嫌気性を実現するために、リアクタ容器は、０．２μｍフィルタを通して窒素を散布し
た。接種の前に、ガスは、ＣＯ含有製鋼所ガスに切り替えて、リアクタに連続的に供給し
た。供給ガス組成は、２％Ｈ２、４２％ＣＯ、２０％ＣＯ２、３６％Ｎ２であった。培養
のｐＨは、５から５．２の間に維持した。
細胞の採取
細胞を採取するときに、ガス消費は、５モルＣＯ Ｌ－１日－１及び１０ミリモルＨ２
Ｌ－１日－１であって、以下の代謝物：１４ｇＬ－１日－１アセテート及び１９．５ｇ
Ｌ－１日－１エタノールを生成した。培養のｐＨは、Ｋ２ＣＯ３でｐＨ６に調整して、リ
アクタは、氷水浴において冷却した。約１．２Ｌの培養物は氷上に集めた。培養は、２×
１－Ｌ遠心分離瓶の間で分離して（このステップ及び全ての後続するステップは、嫌気チ
ャンバ内で実行して、無酸素性条件を確保して、酵素の不活性化を回避した）、細胞は、
５０００ｒｐｍで１０分間造粒させた。上澄みは静かに移して、残りの液体は除去した。
各造粒物は、１０ｍＭのＤＴＴで約３０ｍＬの５０ｍＭ ＫＰＯ４ｐＨ７．０において再
懸濁した。再懸濁は、予め重さを量った５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移動させて、
細胞は、最高速度（５０００ｇ）で１５分間再び造粒させた。チューブは、嫌気チャンバ
から取り出して、測定の前に液体Ｎ２上で即時に凍らせた。
粗細胞抽出及び酵素測定の準備
細胞は、無酸素性条件下で連続リアクタから採取した。それらは、（Ｈｕａｎｇ ｅｔ
ａｌ、２０１２）によって記載されるようなフレンチプレスを通る３つのパスによって
破砕した。
示される場合を除いて、全ての測定は、（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ、２０１２）によっ
て記載されるように１．２×１０５Ｐａで０．８ｍｌの反応混合物及び０．７ｍｌのＮ２
またはＨ２またはＣＯで満たされたゴム栓で閉じられた１．５ｍｌの嫌気キュベットにお
いて３７℃で行った。
ＣＯデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、メチレン－ＴＨＦデヒドロゲナーゼ及
びメチレン－ＴＨＦレダクターゼは、（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ、２０１２）によって記
載されるように全て測定した。
ＣＯデヒドロゲナーゼは、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤ
ＴＴ及び約３０μＭのフェレドキシンならびに／あるいは１ｍＭのＮＡＤ＋または１ｍＭ
のＮＡＤＰ＋を含有した測定混合物を使用して測定した。気相は、１００％ＣＯであった
。
ヒドロゲナーゼ活性は、Ｈ２でのＮＡＤＰ＋依存性フェレドキシン還元の測定の追加を
用いて記載されるように測定した。反応混合物には、フェレドキシン（３０μＭ）及び１
ｍＭのＮＡＤＰを補充した。気相は、１００％Ｈ２であった。酵素フェレドキシンとの反
応の開始後、還元は、４３０ｎｍ（εΔｏｘ－ｒｅｄ＝１３．１ｍＭ－１ｃｍ－１）で続
けた。
ギ酸水素リアーゼ活性は、１．２×１０５Ｐａで０．８ｍｌの反応混合物及び４．２ｍ
ｌのＮ２で満たされたゴム栓で閉じた５ｍｌの嫌気性しょう液瓶において測定した。反応
混合物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５及び２０ｍＭのギ酸塩を含有した
。酵素の追加によって反応を開始した後に、Ｈ２生成は、ガスクロマトグラフィによって
監視した。ギ酸塩に対するＨ２でのＣＯ２の還元についてのギ酸水素リアーゼ活性は、１
００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＤＴＴ、及び３０ｍＭの［１４Ｃ］Ｋ２ＣＯ３（２
４，０００ｄｐｍ／μモル）を含有する測定混合物を用いて測定した。気相は、１００％
Ｈ２であった。しょう液瓶は、２００ｒｐｍで連続的に振って、液相と気相の平衡状態を
確保した。酵素との反応の開始後、１００μｌの液体サンプルは、１．５分毎に回収して
、１００μｌの１５０ｍＭの酢酸を含有する１．５ｍｌのセーフシールマイクロチューブ
に追加して、酸化による反応を停止した。２００μｌの混合物は、次いで、４０℃で１０
分間培養して、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて１，４００ｒｐｍで振って、全ての１４
ＣＯ２を除去して、形成された１４Ｃギ酸塩を残した。その後に、１００μｌの混合物を
５ｍｌのＱｕｉｃｋｓａｖｅ Ａシンチレーション流体（Ｚｉｎｓｓｅｒ Ａｎａｌｙｔ
ｉｃ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に追加して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ６５０
０液体シンチレーションカウンタ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）において１４Ｃ放射能に
ついて分析した。
ギ酸デヒドロゲナーゼ測定は、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）または１
００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのギ酸塩を含有する測定混合物を
用いて実行して、ここで、２５μＭのフェレドキシン、１ｍＭのＮＡＤＰ＋、１ｍＭのＮ
ＡＤ＋及び／または１０ｍＭのメチルビオロゲンを示した。気相は、１００％Ｎ２であっ
た。
メチレン－Ｈ４Ｆデヒドロゲナーゼは、１００ｍＭのＭＯＰＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．５）
、５０ｍＭの２－メルカプトエタノール、０．４ｍＭのテトラヒドロ葉酸、１０ｍＭのホ
ルムアルデヒド及び０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋または０．５ｍＭのＮＡＤ＋を含有する測定
混合物を使用して測定した。気相は、１００％Ｎ２であった。
メチレン－Ｈ４Ｆレダクターゼは、以下の条件下で測定した。測定混合物は、１００ｍ
ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのアスコルビン酸塩、１０μＭのＦＡＤ
、２０ｍＭのベンジルビオロゲン及び１ｍＭのメチル－Ｈ４Ｆを含有した。酵素との反応
の開始の前に、ベンジルビオロゲンは、亜ジチオン酸ナトリウムで０．３のΔＡ５５５に
還元した。
アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼは、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ、１．１ｍＭのアセトアルデヒド、及び約２５μＭのフ
ェレドキシンを含有する混合物を使用して測定した。気相は、１００％Ｎ２であった。
ＣｏＡアセチル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ、１．１ｍＭのアセトアルデヒド、１ｍＭの補酵素Ａ
、及び１ｍＭのＮＡＤＰ＋または１ｍＭのＮＡＤ＋を含有した混合物を使用して測定した
。気相は、１００％Ｎ２であった。
アルコールとブタンジオールデヒドロゲナーゼは、１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ
６）、２ｍＭのＤＴＴ、１．１ｍＭのアセトアルデヒドまたはアセトインをそれぞれ、及
び１ｍＭのＮＡＤＰＨまたは１ｍＭのＮＡＤＨを用いる測定で、測定した。気相は、１０
０％Ｎ２であった。
フェレドキシンは、（Ｓｃｈoｎｈｅｉｔ、Ｗaｓｃｈｅｒ、＆Ｔｈａｕｅｒ、１９７８
）によって記載されるようなＣ．パストゥリアヌムから精製した。
結果
ヒドロゲナーゼ：この酵素は、エネルギー源として水素の取り込みに重要であり、ＣＯ
２上のカルボキシド栄養性微生物の成長のために必須である。この酵素はまた、水素を放
出することができ、ギ酸水素リアーゼとしてギ酸デヒドロゲナーゼと関連して作用し得る
。
Ｃ．オートエタノゲナムのゲノムにおいて、７つのヒドロゲナーゼ遺伝子（６つの鉄の
みのヒドロゲナーゼと１つのＮｉＦｅヒドロゲナーゼ、Ｓｅｑ．ＩＤ５―２０）が存在す
る。これらの遺伝子のうちの５つについての相同物は、Ｃ．リュングダリイ（Ｋoｐｋｅ
ｅｔ ａｌ、２０１０）（ＹＰ＿００３７８１０１６／ＣＬＪＵ＿ｃ２６０６０、ＹＰ
＿００３７８１０１７／ＣＬＪＵ＿ｃ２６０７０、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０／ＹＰ＿００
３７７８８７９、ＣＬＪＵ＿ｃ１４７００／ＹＰ＿００３７７９６４０、ＣＬＪＵ＿ｃ１
７２８０／ＹＰ＿００３７７９８９３、ＣＬＪＵ＿ｃ２０２９０／ＹＰ＿００３７８０１
９３）のゲノムに存在しており、また、Ｃ．ラグスダレイ（Ｓｅｑ．ＩＤ２１－３２）の
ゲノムにおいて特定され得る（表３）。
Figure 2022116003000004
単一の共同因子を使用して、活性は、ＮＡＤＰＨ（０．２Ｕ／ｍｇ）で観測した一方、
ゼロの活性もしくはかなり低い活性は、ＮＡＤＨ（０．０５Ｕ／ｍｇ）またはフェレドキ
シン（＜０．０１Ｕ／ｍｇ）で観察した。これは、ヒドロゲナーゼがＮＡＤＰＨに特異的
であることを実証する。
最も高い活性は、共同因子の組み合わせを使用して見付けた。フェレドキシンの存在下
におけるＮＡＤＰＨで０．６８Ｕ／ｍｇを測定した。対照的に、測定可能な活性が、ＮＡ
ＤＨ（＜０．０１Ｕ／ｍｇ）で観測されず、ＮＡＤＰＨについてこの酵素の高い特異性を
改めて確認した。このデータは、分岐ヒドロゲナーゼが、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈ
ｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｓｃｈｕｔ＆Ａｄａｍｓ、２００９）またはア
セトバテリウム・ウーディ（Ａｃｅｔｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ）（Ｓｃｈｕｃ
ｈｍａｎｎ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ、２０１２）またはムーレラ・サーモアセチカ（Ｈｕａｎｇ
ｅｔ ａｌ、２０１２）にあるように存在することを示す。しかしながら、これらの他
の生物において、酵素はＮＡＤＨ依存性である。そういうものとして、これは、発見され
た最初のＮＡＤＰＨ依存性分岐ヒドロゲナーゼである。
ギ酸デヒドロゲナーゼ：この酵素は、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のメチル分枝
においてギ酸塩に対してＣＯ２の還元を触媒して、アセトゲンによるＣＯまたはＣＯ２及
びＨ２上の自己栄養成長のために必須である。
３つの遺伝子が、セレノ及び非セレノギ酸デヒドロゲナーゼについてコード化して、Ｃ
．オートエタノゲナム（ＡＥＩ９０７２１、ＡＥＩ９０７２３、ＡＥＩ９０７２５、ＨＱ
８７６０１５、ＨＱ８７６０１７、ＨＱ８７６０１９）、Ｃ．リュングダリイ（ＹＰ＿０
０３７７９０６３、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＹＰ＿００３７８０１６８、ＣＬＪＵ＿
ｃ０８９３０、ＣＬＪＵ＿ｃ０６９９０、ＣＬＪＵ＿ｃ２００４０）ならびにＣ．ラグス
ダレイ（ＡＥＩ９０７２２、ＡＥＩ９０７２４、ＡＥＩ９０７２６、ＨＱ８７６０１６、
ＨＱ８７６０１８、ＨＱ８７６０２０）（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ、２０１０、２０１１
）のゲノムにおいて存在する。
１つの共同因子だけを使用して、ＮＡＤではなくてＮＡＤＰＨについての特異性、すな
わち、非常に少ない０．０３Ｕ／ｍｇを超える０．２Ｕ／ｍｇを検出した。
しかしながら、著しく高い活性を２つの共同因子の組み合わせを使用して検出した。す
なわち、ＮＡＤＰＨ及びフェレドキシンで１．１０Ｕ／ｍｇを検出したが、ＮＡＤＰＨの
代わりにＮＡＤＨで０．０７だけであった。これは、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ
、前に説明されたことのない酵素の存在を示した。
分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤＰＨ分岐ヒドロゲナーゼとギ酸水素複合
体を形成し得ることを示す、ギ酸－水素リアーゼ、すなわち、Ｈ２を使用して２．４Ｕ／
ｍｇの高い活性を検出した。
ＮＡＤＰ結合部位を有する鉄－硫黄フラボタンパク質、鉄－硫黄（ＦｅＳ）タンパク質
、ならびにセレノシステイン及びモリブドプテリンを含有するギ酸デヒドロゲナーゼのた
めの遺伝子と共に、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ（ＡＥＩ９０７２１、ＨＱ８７６
０１５、ＹＰ＿００３７７８８７１、ＣＬＪＵ＿ｃ０８９３０、ＡＥＩ９０７２２、ＨＱ
８７６０１６）及び分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ（Ｓｅｑ．ＩＤ９―１０、ＣＬ
ＪＵ＿ｃ０７０７０、ＹＰ＿００３７７８８７９、ＳｅｑＩＤ２５－２６）のための遺伝
子をコード化するタンパク質を、１つの遺伝子クラスターにおいて見付けた（図３）。機
能複合体の形成は、２つの酵素のための遺伝子が、ゲノムにおいて並んでいることを見付
けることによって反映され、転写単位を形成し得る。
ＣＯ２及びＨ２からギ酸塩にこの方向に作用するギ酸水素リアーゼは、前に説明されて
おらず、カルボキシド栄養性クロストリジウムに対して新規である（図１）。この反応の
可逆性がまた、実証されており、ギ酸塩から水素及びＣＯ２を放出する。この酵素の使用
は、水素を使用してギ酸塩の形態でＣＯ２の捕捉を可能にして、それは、次いで、再度放
出され得る。精製された酵素を用いて、ＣＯ２＋Ｈ２からのギ酸塩の形成について４１Ｕ
／ｍｇ及びギ酸塩からの水素形成について４０Ｕ／ｍｇのギ酸水素リアーゼ活性を測定し
た（表４）。
Figure 2022116003000005
表４に関して、Ｃ．オートエタノゲナムのギ酸水素リアーゼ複合体の精製は、室温で、
厳密に無酸素条件下で行った。２ｍＭのＤＴＴ、５μＭのＦＡＤ、及び５μＭのＦＭＮ（
Ｂｕｆｆｅｒ Ａ）を含有する無酸素性の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を
、プロセス全体を通して使用した。約４７ｍｇのタンパク質ｍｌ－１を有する細胞質断片
を含有する１５０，０００×ｇ上澄みは、硫酸アンモニウムで断片化した。４０から５５
％までの硫酸アンモニウム飽和の断片は、３０，０００×ｇ及び４℃における３０分間の
遠心分離によって集めた。沈殿物は、０．８Ｍの硫酸アンモニウムを含有する７ｍｌのＢ
ｕｆｆｅｒ Ａにおいて溶解した。遠心分離によって溶解されなかったタンパク質を除去
した後、上澄みは、０．８Ｍの硫酸アンモニウムを含有するＢｕｆｆｅｒ Ａと平衡状態
を保たれたフェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）高性能カラム（
２．６ｃｍ×１２ｃｍ）の上に載せた。タンパク質は、５ｍｌ分－１の流量率で段階的な
硫酸アンモニウム勾配（０．８０、０．６４、０．４８、０．３２、０．１６、及び０Ｍ
、Ｂｕｆｆｅｒ Ａにおいてそれぞれ１００ｍｌ）で溶離した。ヒドロゲナーゼ活性は、
０．４８Ｍの硫酸アンモニウムにおけるピークにおいて溶離した。プールされた断片は、
凝集して、５０ｋＤａのカットオフ膜を有するアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）細胞で脱塩した
。次いで、凝集物は、Ｂｕｆｆｅｒ Ａと平衡状態を保たれたＱセファロース（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）高性能カラム（１．６ｃｍ×１３ｃｍ）の上につけた。カラムは、次いで、
９０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ａで洗浄した。タンパク質は、５ｍｌ分－１の流量率で０から
１ＭのＮａＣｌ線形勾配で溶離した。ヒドロゲナーゼ活性は、約０．４ＭのＮａＣｌを溶
離する単一のピークにおいて回復させた。断片は、凝集して、５０ｋＤａのカットオフＡ
ｍｉｃｏｎフィルタで脱塩して、次いで、使用されるまで９５％Ｎ２／５％Ｈ２の大気下
で、Ｂｕｆｆｅｒ Ａにおいて－２０℃で保管した。
活性は、示されたｐＨにおいて１００ｍＭのリン酸カリウムにおいて３７℃で測定した
。ギ酸塩からのＨ２の形成（ギ酸水素リアーゼ活性）を続けたとき、測定混合物は、１０
０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（表１）または１００ｍＭのリン酸カリウム（
示されるようなｐＨ）（表３）、２ｍＭのＤＴＴ及び２０ｍＭのギ酸ナトリウムを含有し
た。気相は、１００％Ｎ２―であった。しょう液瓶は、２００ｒｐｍで連続的に振って、
液相から気相中へのＨ２の移動を確保した。ガスサンプル（０．２ｍｌ）は、１分毎に回
収して、Ｈ２は、ガスクロマトグラフィによって定量化した。ギ酸塩に対するＨ２でのＣ
Ｏ２の還元を測定したとき、測定混合物は、１００ｍＭのリン酸カリウム（示されるよう
な最終ｐＨ）、２ｍＭのＤＴＴ、及び３０ｍＭの［１４Ｃ］Ｋ２ＣＯ３（２４，０００ｄ
ｐｍ／μモル）を含有した。気相は、１００％Ｈ２であった。しょう液瓶は、２００ｒｐ
ｍで連続的に振って、液相と気相の平衡状態を確保した。酵素との反応の開始後、１００
μｌの液体サンプルを１．５分毎に回収して、１００μｌの１５０ｍＭの酢酸を含有する
１．５ｍｌのセーフシールマイクロチューブに追加して、酸化による反応を停止した。２
００μｌの混合物は、次いで、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（タイプ５４３６、Ｅｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において１，４００ｒｐｍで振って、４０℃で１０分間培養し
て、全ての１４ＣＯ２を除去して、形成された１４Ｃギ酸塩を残した。その後に、１００
μｌの混合物を５ｍｌのＱｕｉｃｋｓａｖｅ Ａシンチレーション流体（Ｚｉｎｓｓｅｒ
Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に追加して、Ｂｅｃｋｍａ
ｎ ＬＳ６５００液体シンチレーションカウンタ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）
において１４Ｃ放射能について分析した。ギ酸塩に対して還元されたフェレドキシン及び
ＮＡＤＰＨでのＣＯ２の還元を続けたとき、測定混合物は、１００ｍＭのリン酸カリウム
（示されるような最終のもの）、２ｍＭのＤＴＴ、３０ｍＭの［１４Ｃ］Ｋ２ＣＯ３（２
４，０００ｄｐｍ／μモル）、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、及び還元されたフェレドキシン再生
システム（１０ｍＭのピルビン酸塩、０．１ｍＭのチアミンピロリン酸、１ｍＭの補酵素
Ａ、２５μＭのＣ．パストゥリアヌム・フェレドキシン、１Ｕのピルビン酸塩：フェレド
キシンオキシドレダクターゼ、及び５Ｕのホスホトランスアセチラーゼ）を含有した。気
相は、１００％Ｎ２であった。しょう液瓶は、２００ｒｐｍで連続的に振って、液相と気
相の平衡状態を確保した。酵素との反応の開始後、１００μｌの液体アリコートを１．５
分毎に回収して、ギ酸塩について分析した。ギ酸塩に対して還元されたフェレドキシン及
びＮＡＤＰＨでＣＯ２の還元を続けたときに、測定混合物は、１００ｍＭのリン酸カリウ
ム（示されるような最終のもの）、２ｍＭのＤＴＴ、３０ｍＭの［１４Ｃ］Ｋ２ＣＯ３（
２４，０００ｄｐｍ／μモル）、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、及び還元されたフェレドキシン再
生システム（１０ｍＭのピルビン酸塩、０．１ｍＭのチアミンピロリン酸、１ｍＭの補酵
素Ａ、２５μＭのＣ．パストゥリアヌムフェレドキシン、１Ｕのピルビン酸塩：フェレド
キシンオキシドレダクターゼ、及び５Ｕのホスホトランスアセチラーゼ）を含有した。気
相は、１００％Ｎ２であった。しょう液瓶は、２００ｒｐｍで連続的に振って、液相と気
相の平衡状態を確保した。酵素との反応の開始後、上記したように、１００μｌの液体ア
リコートを１．５分毎に回収して、ギ酸塩について分析した。Ｃ．パストゥリアヌムＤＳ
Ｍ５２５からの精製したフェレドキシン（Ｆｄ）をＳｃｈoｎｈｅｉｔ ｅｔ ａｌ（Ｒ
ａｐｉｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｒｅ
ｄｏｘｉｎ ｆｒｏｍ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｉｍｉｎｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９７８、８９：２１９－２２２）に従って準備して
使用した。１ユニット（Ｕ）は、１分当たりに伝達される２μモルの電子に等しい。
メチレン－ＴＨＦ－デヒドロゲナーゼ：この酵素は、５，１０－メチレンテトラヒドロ
葉酸から５，１０－メテニルテトラヒドロ葉酸への反応を触媒するものであり、自己栄養
成長に必須である。それは、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の一部であり、明確にＮ
ＡＤＰＨに特異的である（ＮＡＤＰＨで１．１２Ｕ／ｍｇであるが、ＮＡＤＨまたはフェ
レドキシンで検出可能な活性はない）ことを見い出した。
この酵素及びそれぞれの遺伝子は、二機能性メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナ
ーゼ／ホルミル－テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼとして、Ｃ．オートエタノゲナム
（ＡＥＩ９０７５３、ＨＱ８７６０３１、ＧＩ：３３８２２５３５３）、Ｃ．リュングダ
リイ（ＹＰ＿００３７８１８９１、ＣＬＪＵ＿ｃ３７６３０）及びＣ．ラグスダレイ（Ａ
ＥＩ９０７７１、ＨＱ８７６０３２、ＧＩ：３３８２２５３７２）において特定した。
この酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性であることになるムーレラ・サーモアセチカにおいて前
に示したが、他の反応は、この生物においてＮＡＤＨまたはフェレドキシン依存性である
（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ、２０１２）。
測定可能な活性は、いずれかの共同因子を有する（合成色素だけを有する）メチレン－
ＴＨＦレダクターゼについての生体外の測定において検出され得ない。しかしながら、発
明者らは、この結果が、他の酵素、例えばＣ．リュングダリイまたはＡ．ウーディ（Ｋo
ｐｋｅ ｅｔ ａｌ、２０１０、Ｐｏｅｈｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ、２０１２）などについ
て提案されているように、追加酵素として未知の結合部位を要求する酵素によって説明さ
れ得ることを考察する。この結合機構は、ＮＡＤＰＨ依存性であり得る。ＣＯデヒドロゲ
ナーゼ反応は、この種の酵素について前に報告されているように、フェレドキシン依存性
であることが分かった。
カルボキシド栄養性クロストリジウム属のクロストリジウム・オートエタノゲナムにお
けるＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の全部で５つの試験したオキシドレダクターゼ反
応から、驚いたことには、どれもＮＡＤＨ依存性ではないことが分かり、むしろ、大部分
はＮＡＤＰＨ依存性であることが分かった。これは、例えば、大腸菌（図２）として細菌
を利用する糖の糖分解とは完全に対照的である。それ故、ＮＡＤＨ依存性反応を使用して
、ＮＡＤＰＨ依存性反応をバイパスする（それは、生産歩留りの低下を結果としてもたら
し、広範囲にわたる修正を要求する）大腸菌のための既存の戦略は、カルボキシド栄養性
クロストリジウムにおいて生産的ではない。本明細書に記載されるような発明は、カルボ
キシド栄養性クロストリジウムにおけるＮＡＤＰＨ依存性反応について優先的に選択する
ことによってこれを克服する戦略を提供して、代謝工学技術のための最大の生産歩留りを
実現する。ＮＡＤＰＨ依存性反応の容量と可能性、ならびに大腸菌を利用する糖に対する
差は、実施例３に示される。同様に、この戦略は、非相同経路に適用され得、最大の生産
歩留り及び流動を実現する。
実施例２
２００を超える遺伝子Ｃ．オートエタノゲナム遺伝子の相対発現を、実時間定量ＰＣＲ
を使用して分析して、最高の発現を伴う遺伝子を決定した。
発酵
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３での発酵は、３７℃及び以下に記載されるよ
うな単一のエネルギー及び炭素源としてＣＯ含有製鋼所ガスで１．５Ｌのバイオリアクタ
内で実行した。１リットルにつき：ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍ
Ｍ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、
Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する定義した培地を培養成長のために使用した。培地は
、バイオリアクタの中に移動させて、１２１℃で４５分間オートクレーブ処理した。オー
トクレーブ処理後、培地は、チアミン、パントテン酸塩（０．０５ｍｇ）、ビオチン（０
．０２ｍｇ）を補充して、３ｍＭのシステイン－ＨＣｌで還元した。嫌気性を実現するた
めに、リアクタ容器は、０．２μｍフィルタを通して窒素を分散させた。接種の前に、ガ
スは、ＣＯ含有製鋼所ガスに切り替えて、リアクタに連続的に供給した。ガス流量は、最
初に８０ｍｌ／分に設定して、中間の対数期の間に２００ｍｌ／分に増加させて、一方、
撹拌は、２００ｒｐｍから３５０ｒｐｍまで増加させた。Ｎａ２Ｓは、０．２５ｍｌ／時
でバイオリアクタの中に与えた。ＯＤ６００が０．５に一旦到達したら、バイオリアクタ
を１．０ｍｌ／分のレート（希釈率０．９６ｄ－１）で連続的な形態に切り替えた。培地
サンプルをバイオマスと代謝物を測定するために取って、内外に流れるガスのヘッドスペ
ース分析を定期的に行った。
ｑＲＴ－ＰＣＲ
２００を超える遺伝子を用いるｑＲＴ－ＰＣＲ研究は、適切なプライマーを使用して行
った。サンプルは、成長期間全体（４日）にわたって、上記したように典型的な１．５Ｌ
の流加回分（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）発酵ランから取った。サンプルは、遠心分離（６，０
００×ｇ、５分、４℃）によって採取して、細胞造粒物は、液体窒素において急速凍結し
て、使用まで－８０℃で保管した。ＲＮＡは、氷上で細胞造粒物を解凍して、それを１０
０μｌのリゾチーム溶液（５０，０００Ｕのリゾチーム、０．５μＬ１０％のＳＤＳ、１
０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）において懸濁することによ
って分離した。５分後、（１０μＬの２－メルカプトエタノールを含有する）３５０μＬ
の溶解バッファーを追加した。細胞懸濁物は、１８～２１ゲージ針を５回通過させること
によって機構的に破壊した。ＲＮＡは、次いで、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡ Ｍｉ
ｎｉ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ９２００８、ＵＳＡ）を
使用して分離して、１００μＬのＲＮａｓｅフリー水において溶離した。ＲＮＡは、ＰＣ
Ｒ及びゲル電気泳動法によって調べて、分光光度法で定量化して、必要に応じてＤＮａｓ
ｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。逆の転写ステップは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ
Ｉ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ
ａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ９２００８、ＵＳＡ）を使用して実行した。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、
２５ｎｇのｃＤＮＡテンプレート、６７ｎＭの各プライマー、及び１ｘ ｉＱ ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃ
ｕｌｅｓ、ＣＡ９４５４７、ＵＳＡ）を用いて１５μｌの反応量でＭｙｉＱ Ｓｉｎｇｌ
ｅ Ｃｏｌｏｕｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（
Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ９４５４７、ＵＳＡ
）において行った。グアニル酸キナーゼ（ＧｎＫ）及びギ酸塩テトラヒドロ葉酸リガーゼ
（ＦｏＴ４Ｌ）をハウスキーピング遺伝子として使用して、非テンプレートコントロール
（ｎｏｎ－ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）を含んだ。反応条件は、９５℃３分間で
あって、９５℃１５秒間、５５℃１５秒間及び７２℃３０秒間の４０サイクルを後に続け
た。融解曲線分析は、増幅のプライマー二量化または他の人工物の検出のために、ｑＲＴ
ＰＣＲ（１℃／秒における５８℃から９５℃までの３８サイクル）の完了の直後に行っ
た。発現レベル上のデータは、Ｂｉｏｒａｄ ｉＱ５ ２．０ソフトウェアによって計算
されるようなＰＣＲ基線減算曲線あてはめ方法に基づいて閾値サイクル（Ｃｔ）値の形態
で計算した。生のＣｔ値は、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ Ｔｏｏｌ（ＲＥＳＴ（著作権））２００８ Ｖ２．０．７を使用して更に分析した。
結果
自己栄養的に成長するときに、カルボキシド栄養性微生物は、炭素及びエネルギー源と
して働くガスを取り込む。図４は、Ｃ．オートエタノゲナムにおいて発現された遺伝子の
相対発現を示す。特定された３つの酵素は、自己栄養成長及びガス取り込みに関わってお
り、発明者らは、それらが、最も強く発現した遺伝子の中で微生物内にあることが分かっ
た。実施例１に示されるように、これらの同じ酵素が、ＮＡＤＨと比較してＮＡＤＰＨの
高いまたは独占的な利用を呈することが分かった。ＮＡＤＨ依存性酵素の発現は、かなり
低いレベルにあった。これらの遺伝子がコード化する酵素が、ＮＡＤＰＨ依存性であるこ
とが分かっていると仮定すると、これは、（大腸菌として生物を利用する糖とは対照的に
）ＮＡＤＰＨプールが非常に重要であり、ＮＡＤＰＨ依存性反応が、障害ではないことを
示す。カルボキシド栄養性クロストリジウム細胞における工学技術経路について、これは
、ＮＡＤＰＨ依存性反応を選択することができるので大きな利点であり、これらの反応が
、回避されるかバイパスされる必要はない。更に、ＮＡＤＰＨプールは、性能が低下しな
いほどに大きく、広範囲にわたる工学技術は、必要ではない。
実施例３
第１級－第２級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、アセトンをイソプロパノー
ルに変換する厳密にＮＡＤＰＨ依存性酵素である。それの活性は、アセトンならびに０．
２ｍＭのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ（Ｉｓｍａｉｅｌ、Ｚｈｕ、Ｃｏｌｂｙ、＆Ｃｈｅｎ
、１９９３）を含有する発酵培養液から準備した粗抽出物を用いる酵素測定を使用して実
証する。
Ｃ．オートエタノゲナムを用いるリアクタ研究を、高い率でイソプロパノールへのアセ
トンの効果的なＮＡＤＰＨ依存性変換を実証するために行った。安定したバイオマス及び
代謝物生成を伴う連続的な形態で、アセトンをバイオリアクタと流加培地の両方に追加し
た。アセトンをリアクタの中に一定のレベルまで混ぜて、次いで、それを連続的な流加に
よって取得した。最初に、１ｇ／Ｌアセトンを追加して、代謝物濃度を一旦安定化させて
、濃度を５ｇ／Ｌ、１５ｇ／ｌまで、また、第２の実験では２０ｇ／Ｌまで増加させた。
材料及び方法
代謝物の分析
アセトン、イソプロパノール及び他の代謝物のＨＰＬＣ分析は、３５℃（屈折率検出器
）で動作されるＲＩＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣシス
テム及び６０℃に保たれたＡｌｌｔｅｃｈ ＩＯＡ－２０００有機酸カラム（１５０×６
．５ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）を使用して行った。わずかに酸性化した水を０．７ｍｌ／
分の流量率で移動相として使用した（０．００５ＭのＨ２ＳＯ４）。タンパク質及び他の
細胞残基を除去するために、４００μｌのサンプルを１００μｌの２％（ｗ／ｖ）５－ス
ルホサリチル酸と混合して、１４，０００×ｇで３分間遠心分離して、沈殿した残基を分
離した。次いで、１０μｌの上澄みを分析のためにＨＰＬＣに注入した。
アセトン、イソプロパノール及び他の代謝物のＧＣ分析は、Ｓｕｐｅｌｃｏ ＰＤＭＳ
１００ １ｃｍファイバーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ＮヘッドスペースＧＣ、
Ａｌｌｔｅｃｈ ＥＣ－１０００（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）カラム、及び
炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を使用して行った。５ｍｌのサンプルは、Ｈｕｎｇａｔｅチ
ューブの中に移して、水浴中において４０℃まで加熱して、正確に５分間ファイバーに露
出した。注入器は、２５０℃に保ち、１ｍｌ／分の一定流量でヘリウムをキャリアガスと
して使用した。炉のプログラムは、４０℃５分間であって、２００℃まで１０℃／分の増
加を後に続けた。温度は、次いで、５０℃／分のレートで２２０℃まで更に増加させて、
温度を５０℃／分のレートで４０℃まで低下させて最後の１分保持する前に、この温度を
５分保持することを後に続けた。ＦＩＤは、構成ガスとして水素４０ｍｌ／分、空気４５
０ｍｌ／分及び窒素１５ｍｌ／分で２５０℃に保った。
ヘッドスペース分析
測定は、２つの備え付けチャネルを有するＶａｒｉａｎ ＣＰ－４９００ ｍｉｃｒｏ
ＧＣ上で実行した。チャネル１は、７０℃、２００ｋＰａのアルゴン及び４．２秒のバ
ックフラッシュ時間で動作する１０ｍ分子ふるいカラムであった一方で、チャネル２は、
９０℃、１５０ｋＰａのヘリウム及びバックフラッシュなしで動作する１０ｍＰＰＱカラ
ムであった。両方のチャネルのための注入器温度は７０℃であった。実行時間は１２０秒
に設定したが、興味のある全てのピークは、通常、１００秒前に溶離することになる。
細胞の採取
４の光学濃度（ＯＤ）を有するとともにエタノール、アセテート及び２，３－ブタンジ
オールを生成するＣＯならびにＨ２を利用する、１．５Ｌバイオリアクタからの細胞は、
ゴム栓で閉じられるとともに主としてＮ２で満たされた２リットル瓶の中に管を介してゆ
っくりと移した。過剰圧力は、その栓を通る針によって解放した。瓶は、０℃以下の温度
に保って、培養の移動は、培養を移動後に出来るだけ迅速に０℃まで冷却するようにゆっ
くりと実行した。移動が完了したときに、瓶は、嫌気性のテント状のもの（ｔｅｎｔ）内
に置いた。チューブを遠心分離して、次いで、上澄みを静かに移して、残りの液体をろ紙
で除去した。造粒物は、１０ｍＭのジチオスレイトールを含有する５０ｍＭの嫌気性リン
酸カリウムｐＨ７において懸濁した。いくつかの瓶の懸濁物は、組み合わせて、遠心分離
させて、乾燥させて、重さを量って、ドライアイス上に保管した。
酵素測定
酵素測定は、Ｈｕａｎｇ（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ、２０１２）及びＩｓｍａｉｅｌ（
Ｉｓｍａｉｅｌ ｅｔ ａｌ、１９９３）に概説される方法に従って行った。
結果
イソプロパノールに対するアセトンの還元は、図５に示されるように、厳密にＮＡＤＰ
Ｈ依存性の第２級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の相関関係であることが分かった。活
性は、ＮＡＤＨではなくてＮＡＤＰＨだけで測定して、この酵素が厳密にＮＡＤＰＨ依存
性であることを実証する。
ＣＯ上の自己栄養成長の間のＮＡＤＰＨプールの容量を実証するために、アセトンを、
アセトン上で成長するリアクタの中に連続的に流加した。アセトンが、高い率でこのＮＡ
ＤＰＨ依存性の第２級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によってイソプロパノールに効率
的に変換されたことが分かった．図６は、アセトンが、バイオリアクタへの導入直後にイ
ソプロパノールに変換されることを示す。２０ｇ／Ｌの高濃度でさえも、全てのアセトン
をイソプロパノールに変換した培養は、ＮＡＤＰＨプールが、高い率でさえもこれを持続
するのに十分であることを実証する。
この実験は、カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物が、持続的なＮＡＤ
ＰＨ依存性反応を推進するために有する容量を実証する。大腸菌では、ＮＡＤＰＨ容量は
、フルフラールの研究（ＥＮ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、２００９、Ｅｌｌｉｏｔ Ｎ
Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、２００９）に示されるように、かなり低い。
実施例４
ＮＡＤＨ依存性酵素とＮＡＤＰＨ依存性酵素の間に選択肢を提供するいくつかの経路、
例えば、ブタノール経路が存在する。最も大きな工学技術努力は、今までのところ、ＮＡ
ＤＰＨ依存性反応を回避する一方でＮＡＤＨ依存性反応を使用することに集中している。
これは、経路の選択を制限して、ＮＡＤＰＨによってもたらされる更なる推進力を無視す
る。
ブタノール生合成のための新規で完全にＮＡＤＰＨ依存性の経路が設計されており、チ
オラーゼ（ＥＣ２．３．１．９、ｂｔｋＢ、例えば、ラルストニア・ユートロファ：ＹＰ
＿７２５９４８．１、遺伝子ＩＤ：４２４８８１５から、ｐｈａＡ、例えば、ラルストニ
ア・ユートロファ：ＹＰ＿７２５９４１．１、遺伝子ＩＤ：４２４９７８３から）、ＮＡ
ＤＰＨ依存性Ｒ－３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ：１．１．１
．３６、ｐｈａＢ ＧＯ：００１８４５４、例えば、ラルストニア・ユートロファ：ＹＰ
＿７２５９４２．１、遺伝子ＩＤ：４２４９７８４から）及び３－ヒドロキシブチリル－
ＣｏＡデヒドロターゼ（ＥＣ４．２．１．１１９、ｐｈａＪ、例えば、アエロモナス・プ
ンクタタ：ＢＡＡ２１８１６．１から）、ＮＡＤＰＨ依存性クロトニル－ＣｏＡカルボキ
シラーゼ／レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．８６、ｃｃｒ、例えば、ストレプトマイセス
・コリナスから、ＥＣ１．３．１．８５、ｃｃｒＲｓ、例えば、ロドバクター・スフェロ
イデス：ＹＰ＿３５４０４４．１、遺伝子ＩＤ：３７２０７５１から）及びブチリル－Ｃ
ｏＡに対するＮＡＤＰＨ依存性エチルマロニル－ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１
．１．４１、例えば、ハツカネズミ：ＮＰ＿００１１０３６６５．１、遺伝子ＩＤ：５２
６６５から）から成り、それは、次いで、アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼを通
して直接的に、あるいはホスホトランスアセチラーゼ及びブチレートキナーゼを介してブ
チレートによって、ブタノールに変換され得、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダク
ターゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ依存性ブチリル－ＣｏＡレダクター
ゼ（ＥＣ１．１．２．１０、ｂｌｄｈ、例えば、クロストリジウム・サッカロパーブチル
アセトニクム（ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｍ）Ｎ１－４：ＡＧ
Ｆ５９４１３．１、遺伝子ＩＤ：Ｃｓｐａ＿ｃ５６８８０から）ならびにアルデヒドレダ
クターゼ（ＥＣ１．１．１．１、ａｄｈＡ、例えば、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏ
ｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ．ＰＣＣ６８０３：ＮＰ＿４４３０２８．１、遺伝子ＩＤ：９５１８
９６から）（図７）が、使用され得る。
アセチル－ＣｏＡの２つの分子は、ラルストニア・ユートロファからｐｈａＡＢＪによ
ってコード化される３つの酵素によってクロトニル－ＣｏＡに変換される。２つのアセチ
ル－ＣｏＡは、チオラーゼによってアセトアセチル－ＣｏＡに凝縮され、ＮＡＤＰＨに特
異的なＲ－３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼによるＲ－３ヒドロキシブ
チリル－ＣｏＡに対する還元が後に続く。Ｒ－３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡは、次い
で、Ｒ－３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドラターゼによってクロトニル－ＣｏＡに
変換される。
ロドバクター・スフェロイデス（Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ、２００７）からのクロトニル－
ＣｏＡカルボキシラーゼ／レダクターゼとハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（
マウス）（Ｌｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ、２０１１）からのエチルマロニル－ＣｏＡデカ
ルボキシラーゼの組み合わせは、まず、二酸化炭素でクロトニル－ＣｏＡの凝縮物を触媒
して、ＮＡＤＰＨの消費を伴ってエチルマロニル－ＣｏＡを形成して、ブチリル－ＣｏＡ
に対するエチルマロニル－ＣｏＡの脱カルボキシル化が後に続く。
クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニクムＮＩ－４からのブチリル－ＣｏＡ
レダクターゼは、ブチリル－ＣｏＡからＣｏＡの一部分を切断して、ブチルアルデヒドを
形成する。クロストリジウム・ベイジェリンキ（ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉｉ）ＮＲＲＬ Ｂ
５９２からの相同物が、ＮＡＤＰＨ（Ｙａｎ及びＣｈｅｎ、１９９０）と最も活性的であ
るので、酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性であると推定される。
シアノバクテリアのシネコシスティスｓｐ．ＰＣＣ６８０３のアルデヒドレダクターゼ
は、アルコールに対する中間鎖長及び芳香族アルデヒドのＮＡＤＰＨ還元に対して強い好
みを有する（Ｖｉｄａｌ ｅｔ ａｌ、２００９）。ブタノールの酸化に対するブタノー
ルへのブチルアルデヒドの還元についての好みは、還元を優先して２５１：１である。
実施例５
ブドウ糖上で成長した大腸菌細胞において、ＮＡＤＨのプールがＮＡＤＰＨプールより
も２０倍以上大きく（Ｂ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ、２００９）、それは、特に
発酵プロセスにおいて、多くの生合成反応や生物変換を制限する（Ｒ Ｐｏｕｌｓｅｎ
ｅｔ ａｌ、２００５）ことが実証されている。ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨプールは、カル
ボキシド栄養性酢酸生成クロストリジウムにおいて測定した。
実施例２に記載したようなクロストリジウム・オートエタノゲナムを用いる連続的な発
酵からのサンプルを取って分析した。５ｍＬの培養サンプルは、遠心分離（－１０℃で５
分間１３０００ｒｐｍ）によって迅速に造粒して、上澄みは除去して、細胞造粒物は、液
体窒素において急速凍結して、次いで、分析まで－８０℃に保管した。代謝物分析は、記
載されるように微生物の造粒物上で行った（Ｂ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ、２０
０９、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ Ａ
ＴＣＣ２７４０５ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ、ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｆｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌ ｓｔｒｅｓｓ．
ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１２、１３：３３６、Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ Ｅ、Ｑｕａ
ｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｇａ
ｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ ｓｕｇａｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｅｎ
ｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ ｕｓｉｎｇ ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ２００９、４、５８-６３。
大腸菌とは対照的に、Ｃ．オートエタノゲナムでは、ＮＡＤＰＨプールは、ＮＡＤＨ＋
Ｈ＋及びＮＡＤＨに対してＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋及びＮＡＤＰが２．２：１の比率で、ＮＡＤ
Ｈプールよりも大きいことがわかった（図７７）。それぞれ、３６．８：１のＮＡＤＨ＋
Ｈ＋に対するＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋は、基質としてＣＯを用いる酢酸生成カルボキシド栄養性
クロストリジウムにおいてＮＡＤＰＨの推進力を実証する。
標準法的な段落
読み手が、不適当な実験を用いずに発明を実施することを可能にするために、本発明は
、一定の好適な実施形態を参照にして、本明細書に記載されている。しかしながら、当業
者は、構成要素及びパラメータの多くが、本発明の範囲から逸脱すること無く、一定の範
囲に変えられ得るか修正され得、または既知の均等物に置換され得ることを容易に認識す
るであろう。そのような修正及び均等物が、本明細書において個別に定められるように組
み込まれることが認識されるべきである。タイトル、見出し、または同様のものは、この
書類の読み手の理解を増すように提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものと
して読み取られるべきではない。
上記や下記の全ての出願、特許及び刊行物の全開示は、もしあれば、参照によって本明
細書に組み込まれる。しかしながら、この明細書における任意の出願、特許及び刊行物に
対する参照は、それらが、有効な先行技術を構成するという、または、いずれの国におい
ても普通の一般的知識の一部を形成するという認識もしくは任意の形態の提案ではないし
、あるいは、そのようにみなされるべきではない。
この明細書及び後続する任意の特許請求の範囲全体を通して、文脈が他のものを要求す
る場合を除いて、文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉ
ｎｇ）」及び同様のものは、排他的な意味とは対照的に包括的な意味に、すなわち、「限
定されるものではないが、～を含む」という意味に、解釈されることになる。

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Ｋoｐｋｅ、Ｍ．、Ｈｅｌｄ、Ｃ．、Ｈｕｊｅｒ、Ｓ．、Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ、Ｈ．、Ｗ
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ｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａ、１０７（２９）、１３０８７-９２．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎ
ａｓ．１００４７１６１０７

Ｋoｐｋｅ、Ｍ．、Ｍｉｈａｌｃｅａ、Ｃ．、Ｌｉｅｗ、Ｆ．、Ｔｉｚａｒｄ、Ｊ．Ｈ．
、Ａｌｉ、Ｍ．Ｓ．、Ｃｏｎｏｌｌｙ、Ｊ．Ｊ．、Ａｌ－Ｓｉｎａｗｉ、Ｂ．ｅｔ ａｌ
（２０１１）．２，３－Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｂｙ Ａｃｅｔ
ｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ、ａｎ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｒｏｕｔｅ Ｔｏ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｗａｓｔ
ｅ Ｇａｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ、７７（１５）、５４６７-７５．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．００３５
５－１１

Ｌｅａｎｇ、Ｃ．、Ｕｅｋｉ、Ｔ．、＆Ｌｏｖｌｅｙ、Ｄ．Ｒ．（２０１１）．Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．Ｐｏｓｔｅｒ．

Ｌｉ、Ｆ．、Ｈｉｎｄｅｒｂｅｒｇｅｒ、Ｊ．、Ｓｅｅｄｏｒｆ、Ｈ．、Ｚｈａｎｇ、Ｊ
．、Ｂｕｃｋｅｌ、Ｗ．、＆Ｔｈａｕｅｒ、Ｒ．Ｋ．（２００８）．Ｃｏｕｐｌｅｄ ｆ
ｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ａｎｄ ｃｒｏｔｏｎｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ（ＣｏＡ）ｒｅ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＮＡＤＨ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｂｕｔｙｒ
ｙｌ－ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／Ｅｔｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ、１９０（３）、８４３-５０．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．０１４１７－０７

Ｍａ、Ｃ．、Ｚｈａｎｇ、Ｌ．、Ｄａｉ、Ｊ．、＆Ｘｉｕ、Ｚ．（２０１０）．Ｒｅｌａ
ｘｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｅｎｚｙｍｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ １，３－ｐｒｏ
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ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４６（４）、１７３-８．ｄｏｉ：１０．１０１６／
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ｅ ｇｅｎｅｓ（ｙｑｈＤ ａｎｄ ｄｋｇＡ）ｉｎ ｆｕｒｆｕｒａｌ－ｒｅｓｉｓｔ
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、Ｓ．、Ｂａｉｄｏｏ、Ｅ．Ｅ．Ｋ．、＆Ｋｅａｓｌｉｎｇ、Ｊ．Ｄ．（日付不明）．Ａ
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Ｔａｎｎｅｒ、Ｒ．Ｓ．、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｌ．Ｍ．、＆Ｙａｎｇ、Ｄ．（１９９３）．Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ．ｎｏｖ．、ａｎ ａｃｅｔｏｇ
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Ｗａｎｇ、Ｓ．、Ｈｕａｎｇ、Ｈ．、Ｍｏｌｌ、Ｊ．、＆Ｔｈａｕｅｒ、Ｒ．Ｋ．（２０
１０）．ＮＡＤＰ＋ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｅｒｒｅｄｏ
ｘｉｎ ａｎｄ ＮＡＤＰ＋ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＮＡＤＨ ａｒｅ ｃｏ
ｕｐｌｅｄ ｖｉａ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｂｉｆｕｒｃａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ
ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９２（１９）、５１１５-２３．ｄｏｉ：１０．
１１２８／ＪＢ．００６１２－１０

Ｖｉｄａｌ Ｒ．、Ｌ´ｏｐｅｚ－Ｍａｕｒｙ Ｌ．、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ Ｍ．Ｇ．ａｎ
ｄ Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ Ｆ．Ｊ．（２００９）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ａｎ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｙａ
ｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＰＣＣ６
８０３ ｔｈａｔ ｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｅｓ
ｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｔｈｅ Ｈｉｋ３４－Ｒｒｅ１ ｔｗｏ－ｃｏｍｐ
ｏｎｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９１
、４３８３-４３９１．

Ｃｏｏｌｅｙ Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｖｅｒｍａａｓ Ｗ．Ｆ．（２００１）Ｓｕｃｃｉｎａ
ｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐ
ａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｔｈｙｌａｋｏｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ Ｓｙｎｅｃｈ
ｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＰＣＣ６８０３：ｃａｐａｃｉｔｙ ｃｏｍｐａ
ｒｉｓｏｎｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８３、４２５１-４２５８．

Ｅｒｂ Ｔ．、Ｂｅｒｇ Ｉ．ａｎｄ Ｂｒｅｃｈｔ Ｖ．（２００７）Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ｏｆ Ｃ５－ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｃ２－ｕｎｉｔ
ｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｃｒｏｔｏｎｙｌ－ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｒｅｄ
ｕｃｔａｓｅ：ｔｈｅ ｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ ｐａｔｈｗａｙ．ＰＮＡＳ
、ＵＳＡ１０４、１-６．

Ｌａｎ Ｅ．Ｉ．ａｎｄ Ｌｉａｏ Ｊ．Ｃ．（２０１２）ＡＴＰ ｄｒｉｖｅｓ ｄｉ
ｒｅｃｔ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ １－ｂｕｔａ
ｎｏｌ ｉｎ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．ＰＮＡＳ、ＵＳＡ１０９、６０１８-６０
２３．

Ｌｉｎｓｔｅｒ Ｃ．Ｌ．、Ｎｏ¨ｅｌ Ｇ．、Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ Ｖ．、Ｖｅｒｔｏ
ｍｍｅｎ Ｄ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｍ．Ｆ．、Ｂｏｍｍｅｒ Ｇ．Ｔ．、Ｖｅｉｇａ－ｄ
ａ Ｃｕｎｈａ Ｍ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ Ｅ．（２０１１）Ｅｔ
ｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、ａ ｎｅｗ ｅｎｚｙｍ
ｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ．Ｊｏ
ｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８６、４２９９２-４３０
０３．

Ｙａｎ Ｒ．Ｔ．ａｎｄ Ｃｈｅｎ Ｊ．Ｓ．（１９９０）Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ－ａｃ
ｙｌａｔｉｎｇ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｒｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ５９２．Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５６、２５９１－２５９９．

Claims (46)

  1. 少なくとも１つの外因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を発現するように適合されたまたは少な
    くとも１つの内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を過剰発現するように適合された組み換え型の
    カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物であって、前記外因性酵素が発現されるとき
    にまたは前記内因性酵素が過剰発現されるときに、前記微生物による前記ＮＡＤＰＨの全
    体的な利用が、親の微生物に対して増加されるように、前記酵素が選択される、組み換え
    型のカルボキシド栄養性クロストリジウム微生物。
  2. 前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナー
    ゼ及びメチレン－ＴＨＦ－デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載
    の組み換え型の微生物。
  3. 前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ
    、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及びギ酸水素リアーゼ複合体からなる群から選択
    される、請求項１に記載の組み換え型の微生物。
  4. 前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソ
    フォームで存在しており、前記組み換え型の微生物が、前記ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォ
    ームを発現するか過剰発現するように適合される、請求項１に記載の組み換え型の微生物
    。
  5. 前記少なくとも１つのＮＡＤＨ依存性アイソフォームが、親の微生物に比較して弱化さ
    れるか無力化される、請求項４に記載の組み換え型の微生物。
  6. 前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵
    素が、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼである、請
    求項４に記載の組み換え型の微生物。
  7. 前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵
    素が、ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡレダクタ
    ーゼ及び３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択され、前記酵
    素のうちのいずれか１つが、ｐｈａＢ及びｐｈａＪ、ならびに対応するＮＡＤＨ依存性ア
    イソフォームｈｂｄからなる群から選択されるＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを含む、
    請求項４に記載の組み換え型の微生物。
  8. 前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵
    素が、クロトニル－ＣｏＡレダクターゼ、トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ
    及びブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群から選択されており、前記酵素のうち
    のいずれか１つが、ｃｃｒ及びｃｃｒＲｓ、ならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォ
    ームｔｅｒからなる群から選択されるＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを含む、請求項４
    に記載の組み換え型の微生物。
  9. 前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵
    素が、複数の共同因子依存性を更に呈しており、前記複数の共同因子依存性を呈する酵素
    が、ＮＡＤＨ／フェロドキシン分岐酵素またはＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ共依存性酵素から選
    択される、請求項４に記載の組み換え型の微生物。
  10. 前記少なくとも１つの酵素が、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォーム及びＮＡＤＨ
    ／フェレドキシン分岐アイソフォームで存在しており、前記微生物が、前記ＮＡＤＨ／Ｎ
    ＡＤＰＨ分岐アイソフォームを発現するか過剰発現するように適合される、請求項１に記
    載の組み換え型の微生物。
  11. 前記少なくとも１つの内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素が、それのＮＡＤＨ共同因子特異性
    に対してそれのＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加するように修正される、請求項１に記載
    の組み換え型の微生物。
  12. 前記少なくとも１つの酵素であって、それにおいてＮＡＤＰＨ共同因子特異性が増加さ
    れる、少なくとも１つの酵素が、オキシドレダクターゼ酵素である、請求項１１に記載の
    組み換え型の微生物。
  13. 前記ＮＡＤＰＨの全体的な利用における前記増加が、前記微生物による少なくとも１つ
    の発酵生成物の生成の増加を結果としてもたらす、請求項１に記載の組み換え型の微生物
    。
  14. 前記親の微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュ
    ングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボラン
    ス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウ
    ム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナ
    ム及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組み換え型の微生物
    。
  15. 親の微生物に対して増加されたＮＡＤＰＨの利用を呈する組み換え型のカルボキシド栄
    養性クロストリジウム微生物を生成する方法であって、
    ａ．少なくとも１つの外因性または内因性ＮＡＤＰＨ依存性酵素を選択することと、
    ｂ．親の微生物を転換して、前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性外因性酵素を発現
    するまたは前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性内因性酵素を過剰発現するように適合
    された組み換え型の微生物を生成することと、を含む、方法。
  16. 前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナー
    ゼ及びメチレン－ＴＨＦ－デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１５に記
    載の方法。
  17. 前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存性酵素が、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソ
    フォームで存在しており、前記組み換え型の微生物が、前記ＮＡＤＰＨ依存性アイソフォ
    ームを発現するか過剰発現するように適合される、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つのＮＡＤＨ依存性アイソフォームが、親の微生物に比較して弱化さ
    れるか無力化される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵
    素が、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼである、請
    求項１７に記載の方法。
  20. 前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵
    素が、ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡレダクタ
    ーゼ及び３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択されており、
    前記酵素のうちのいずれか１つが、ｐｈａＢ及びｐｈａＪ、ならびに対応するＮＡＤＨ依
    存性アイソフォームｈｂｄからなる群から選択されたＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを
    含む、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵
    素が、クロトニル－ＣｏＡレダクターゼ、トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ
    及びブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼを含む群から選択されており、前記酵素のうちの
    いずれか１つが、ｃｃｒ及びｃｃｒＲｓならびに対応するＮＡＤＨ依存性アイソフォーム
    ｔｅｒからなる群から選択されたＮＡＤＰＨ依存性アイソフォームを含む、請求項１７に
    記載の方法。
  22. 前記ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨ依存性アイソフォームで存在している少なくとも１つの酵
    素が、複数の共同因子依存性を更に呈しており、前記複数の共同因子依存性を呈する酵素
    が、ＮＡＤＨ／フェロドキシン分岐酵素またはＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ共依存性酵素から選
    択される、請求項１７に記載の方法。
  23. 前記少なくとも１つの酵素が、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ分岐アイソフォーム及びＮＡＤＨ
    ／フェレドキシン分岐アイソフォームで存在しており、前記微生物が、前記ＮＡＤＨ／Ｎ
    ＡＤＰＨ分岐アイソフォームを発現するか過剰発現するように適合される、請求項１５に
    記載の方法。
  24. 前記酵素の前記ＮＡＤＨ共同因子特異性に対して前記少なくとも１つのＮＡＤＰＨ依存
    性酵素の前記ＮＡＤＰＨ共同因子特異性を増加させることを更に含む、請求項１５に記載
    の方法。
  25. 前記少なくとも１つの酵素であって、それにおいてＮＡＤＰＨ共同因子特異性が増加さ
    れる、少なくとも１つの酵素が、オキシドレダクターゼ酵素である、請求項２４に記載の
    方法。
  26. 前記組み換え型の微生物が、親の微生物に対して少なくとも１つの発酵生成物の増加さ
    れた生成を有する、請求項１５に記載の方法。
  27. 前記親の微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュ
    ングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボラン
    ス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウ
    ム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナ
    ム及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  28. 少なくとも１つの発酵生成物を生成する方法であって、カルボキシド栄養性微生物の存
    在下でＣＯを含む基質を嫌気的に発酵させることを含み、前記カルボキシド栄養性微生物
    が、請求項１に記載の組み換え型の微生物または請求項１５によって生成される組み換え
    型の微生物である、方法。
  29. 前記少なくとも１つの発酵生成物が、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、イ
    ソブタノール、Ｃ５＋アルコール、ブタンジオール、コハク酸塩、イソプレノイド、脂肪
    酸及び生体高分子からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 発酵反応において複数の共同因子を利用し得る組み換え型の微生物を生成する方法であ
    って、
    ａ．分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼ、分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼ、及び
    ギ酸水素リアーゼ複合体からなる群から選択された少なくとも１つの酵素を選択すること
    と、
    ｂ．親の微生物を転換して、前記選択された酵素のうちの少なくとも１つを発現するか
    過剰発現するように適合された組み換え型の微生物を生成することと、を含む、方法。
  31. 前記複数の共同因子が、フェロドキシン及びＮＡＤＰＨを含む、請求項３０に記載の方
    法。
  32. 前記分岐ＮＡＤＰ鉄のみのヒドロゲナーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ ＮＯ：２６及びＹＰ＿００３７７８８７９、または少なくとも７６％の配列同一性を
    有するそれらのいずれか１つの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列
    を含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記分岐ＮＡＤＰギ酸デヒドロゲナーゼが、ＡＥＩ９０７２１、ＹＰ＿００３７７８８
    ７１、ＡＥＩ９０７２２、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらのいずれ
    か１つの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項３０に
    記載の方法。
  34. 前記ギ酸水素リアーゼ複合体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５～６７、または少なくとも
    ７６％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ
    酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
  35. 前記親の微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュ
    ングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボラン
    ス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウ
    ム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナ
    ム及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  36. ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換し得る組み換え型の微生物を生成する方法であって、親の
    微生物を転換して、少なくとも１つの単一のＮＡＤＨ依存性還元型フェレドキシン：ＮＡ
    ＤＰ＋オキシドレダクターゼ（Ｎｆｎ）酵素を発現するか過剰発現するように適合された
    組み換え型の微生物を生成することを含む、方法。
  37. 前記Ｎｆｎ酵素が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、ＹＰ＿００３７８１８５２．１及び
    ＣＬＪＵ＿ｃ３７２４０、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらのいずれ
    か１つの機能的等価変異体からなる群から選択された前記アミノ酸配列を含む、請求項３
    ６に記載の方法。
  38. 前記親の微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュ
    ングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボラン
    ス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウ
    ム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミコアセチクム、クロストリジウム・マグナ
    ム及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  39. ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに変換するためのポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチ
    ドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＹＰ＿００３７８１８５２．
    １、またはＣＬＩＵ＿ｃ３７２４０、あるいは少なくとも７６％の配列同一性を有するそ
    れらの機能的等価変異体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単一のＮＡＤＨ依
    存性還元型フェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（Ｎｆｎ）酵素を含む、ポ
    リペプチドの使用。
  40. ＣＯ２及びＨ２からギ酸塩を生成する方法であって、
    ａ．カルボキシド栄養性クロストリジウム属の親の微生物を転換して、少なくとも１つ
    のギ酸水素リアーゼを発現するか過剰発現するように適合された組み換え型の微生物を生
    成することと、
    ｂ．前記組み換え型の微生物の存在下でＣＯ２及びＨ２を含む基質を嫌気的に発酵させ
    て、ギ酸塩を生成することと、を含む、方法。
  41. 前記ギ酸水素リアーゼが、ＡＥＩ９０７２１、ＨＱ８７６０１５、ＹＰ＿００３７７８
    ８７１、ＣＬＪＵ＿ｃ０８９３０、ＡＥＩ９０７２２、ＨＱ８７６０１６、ＳＥＱ ＩＤ
    ：９～１０、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０、ＹＰ＿００３７７８８７９及びＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    Ｏ．２５～２６、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異
    体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記カルボキシド栄養性クロストリジウム属の親の微生物が、クロストリジウム・オー
    トエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ
    、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリ
    ジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム、フォルミ
    コアセチクム、クロストリジウム・マグナム及びそれらの混合物からなる群から選択され
    る、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記少なくとも１つのギ酸水素リアーゼが、ギ酸塩を変換してＣＯ２及びＨ２を形成す
    ることが更にできる、請求項４０に記載の方法。
  44. ＣＯ２及びＨ２からギ酸塩を生成する方法であって、
    ａ．カルボキシド栄養性クロストリジウム微生物から少なくとも１つのギ酸水素リアー
    ゼを精製することと、
    ｂ．前記少なくとも１つの精製されたギ酸水素リアーゼの存在下でＣＯ２及びＨ２を含
    む基質を変換して、ギ酸塩を生成することと、を含む、方法。
  45. 前記ギ酸水素リアーゼが、ＡＥＩ９０７２１、ＨＱ８７６０１５、ＹＰ＿００３７７８
    ８７１、ＣＬＪＵ＿ｃ０８９３０、ＡＥＩ９０７２２、ＨＱ８７６０１６、ＳＥＱ ＩＤ
    ：９～１０、ＣＬＪＵ＿ｃ０７０７０、ＹＰ＿００３７７８８７９及びＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    Ｏ．２５～２６、または少なくとも７６％の配列同一性を有するそれらの機能的等価変異
    体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記少なくとも１つのギ酸水素リアーゼが、ギ酸塩を変換してＣＯ２及びＨ２を形成す
    ることが更にできる、請求項４４に記載の方法。
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