CN104955938B

CN104955938B - 包含nadph依赖性酶的重组微生物及其生产方法

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Publication number: CN104955938B
Application number: CN201480006822.9A
Authority: CN
Inventors: A·米勒; M·科普克
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2014-01-30
Publication date: 2018-03-02
Anticipated expiration: 2034-01-30
Also published as: CN104955938A; US9422565B2; WO2014120852A2; JP2016508718A; KR102290728B1; WO2014120852A3; CA2899587A1; AU2014212462A1; AU2014212462B2; EP2951286A2; CA2899587C; EP2951286A4; FI2951286T3; US20140212976A1; JP2022116003A; JP2020096602A; EP2951286B1; PT2951286T; ES2961674T3; KR20150110806A

Abstract

本发明提供了重组一氧化碳营养梭菌微生物，其相对于亲代微生物具有增加的NADPH的总体利用。此外，本发明提供了产生重组一氧化碳营养梭菌微生物的方法，所述重组一氧化碳营养梭菌微生物展示相对于亲代微生物增加的NADPH利用。尤其，本发明涉及增加重组一氧化碳营养梭菌微生物中的NADPH的总体利用，以便增加微生物的至少一种发酵产物的产生。

Description

包含NADPH依赖性酶的重组微生物及其生产方法

技术领域

本发明涉及选择酶以优化通过发酵产生期望的化合物的方法。更具体地，但是不是排他性地，本发明涉及发酵途径和代谢工程化中的辅助因子平衡。

背景

还原等价物比如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)是重要的辅酶，用于比如氧化还原酶反应的酶氧化还原反应并且出现在所有活细胞中。通常认为的是NADPH库远小于NADH的库(G.N.Bennett&San，2009)。在葡萄糖上生长的大肠杆菌中NADH库超过NADPH库的20倍(B.D.Bennett等，2009)。该低的NADPH可用性限制了许多生物合成反应和生物转化，尤其在发酵过程中(R Poulsen等，2005)。酶对NADPH的偏好可限制期望产物的产生(G.N.Bennett&San，2009)。当将新反应和途径工程化至微生物时这是个问题，并且是产生包括生物燃料、化学品、氨基酸或维生素的化合物的有效生产平台的主要障碍之一(Chemler，Fowler，McHugh，&Koffas，2010)。

然而，代谢工程化已经成功表明可能的情况下通过限制、避免或绕过NADPH依赖性反应而用于产生宽范围的燃料和化学品(Peralta-Yahya&Keasling，2010)。可选地，已经使用消耗能量转氢酶，其在NADH和NADPH库之间互变。实现成功代谢工程化的另一策略是消除竞争NADPH依赖性反应。尽管这些进步，但是这样新的策略通常以生产产率和/或生长速度为代价追求(Auriol，Bestel-Corre，Claude，Soucaille，&Meynial-Salles，2011)。此外，它们仅仅通过许多修饰的大量工程化工作是可能的(S.M.Ma等，2011)。因此这些努力仅仅局限于遗传上易处理的生物体，比如大肠埃希杆菌和酿酒酵母(Aaccharomyces cerevisiae)(Peralta-Yahya&Keasling，2010)。这些生物体是受限的，因为它们仅仅在糖上生长。因此，它们的商业用途和活力就土地利用、食品安全、供应的波动和环境问题而言具有明显的缺点。

一氧化碳营养梭菌为大肠杆菌和酿酒酵母提供了可选方案，并且能够在废气和合成气上生长。有少数重组一氧化碳营养梭菌的例子，其具有有限数量的修饰(Schiel-Bengelsdorf&Dürre，2012)。所有已知的例子使用NADH-依赖性反应。

本发明的目的是克服或减少现有技术的一个或多个缺点，或至少为公众提供有用选择。

发明内容

在第一方面中，本发明提供了重组一氧化碳营养梭菌微生物，其适于表达一个或多个外源NADPH-依赖性酶，和/或适于过表达一个或多个内源NADPH-依赖性酶，选择所述酶使得当表达外源酶时，和/或过表达内源酶时，相对于亲代微生物，该微生物对NADPH的总体使用增加。

在第二方面中，本发明提供了产生重组一氧化碳营养梭菌微生物的方法，所述重组一氧化碳营养梭菌微生物相对于亲代微生物展示增加的NADPH使用，方法包括：

a.选择一个或多个外源和/或内源NADPH-依赖性酶；

b.转化亲代微生物，以产生重组微生物，其适于表达一个或多个NADPH-依赖性外源酶，和/或过表达一个或多个NADPH-依赖性内源酶。微生物中任何一个或多个NADPH-依赖性酶的表达或过表达使得相对于亲代微生物NADPH的使用总体增加。

本发明也提供了通过第二方面的方法制备的重组一氧化碳营养梭菌。

在第一或第二方面的具体实施方式中，一个或多个NADPH-依赖性酶包括氢化酶(例如Seq.ID 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、YP_003781016、YP_003781017、YP_003778879、YP_003779640、YP_003779893、YP_003780193或其任何一个的功能等价变体)，甲酸盐脱氢酶(例如AEI90721、AEI90723、AEI90725、YP_003779063、YP_003778871、YP_003780168、AEI90722、AEI90724、AEI90726或其任何一个的功能等价变体)或亚甲基-THF-脱氢酶(例如AEI90753、YP_003781891、AEI90771或其任何一个的功能等价变体)。

在第一或第二方面的具体实施方式中，一个或多个NADPH-依赖性酶以NADH-和NADPH-依赖性同种型存在并且重组微生物适于表达和/或过表达NADPH-依赖性同种型。

在具体的实施方式中，微生物适于表达和/或过表达NADPH-依赖性同种型，同时相应的NADH-依赖性同种型的表达当与NADPH-依赖性同种型的表达比较时，基本上不变、下降或展示相当小的增加。在具体的实施方式中，调整微生物，从而一个或多个NADH-依赖性同种型的表达与亲代微生物相比减弱或敲除。在一个实施方式中，通过修饰编码一个或多个NADH-依赖性酶的核酸或用编码NADPH-依赖性同种型的一个或多个核酸替换编码NADH-依赖性同种型的一个或多个核酸，表达减弱或敲除。

在第一或第二方面的具体的实施方式中，NADPH的总体使用的增加包括通过其中一个或多个NADPH-依赖性酶是活性的途径中NADPH通量的增加。在具体的实施方式中，通量增加至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少100％。通过途径的通量可通过代谢分子和产物的水平测量(代谢组学)(Patti，Yanes，&Siuzdak，2012)和/或如C13的标记实验测量(通量组学)(Niittylae，Chaudhuri，Sauer，&Frommer，2009；Tang等，无日期)。

在第一或第二方面的一个具体实施方式中，NADPH的总体使用的增加在使用中使得微生物产生一个或多个产物的效率增加。

在具体的实施方式中，以NADPH-和NADH-依赖性同种型存在的一个或多个酶是羟甲基戊二酸-CoA(HMG-CoA)还原酶，和包括NADPH-依赖性同种型(EC 1.1.1.34；GO：0004420；例如酿酒酵母：DAA09822.1；BK006946.2：115734..118898或其任何一个的功能等价变体)和NADH-依赖性同种型(EC1.1.1.88；GO：0042282；例如迈氏假单胞菌：P13702.1或其任何一个的功能等价变体)。

在具体的实施方式中，以NADPH-和NADH-依赖性同种型存在的一个或多个酶是羟基丁酰-CoA脱氢酶/乙酰乙酰-CoA还原酶/3-羟基丁酰-CoA水合酶，并且包括NADPH-依赖性同种型phaB(EC：1.1.1.36；GO：0018454；例如来自Ralstonia eutropha：YP_725942.1，GeneID：4249784或其任何一个的功能等价变体)，NADPH依赖性phaJ(EC 4.2.1.119；例如来自点状产气单胞菌：BAA21816.1)和相应的NADH-依赖性同种型hbd(EC 1.1.1.157；GO：0008691；例如来自丙酮丁醇梭菌：NP_349314.1，Gene ID：1118891或其任何一个的功能等价变体)。

在具体的实施方式中，以NADPH-和NADH-依赖性同种型存在的一个或多个酶是巴豆酰-CoA还原酶/反式-2-烯酰-CoA还原酶/丁酰-CoA脱氢酶，并且包括NADPH-依赖性同种型ccr(EC 1.3.1.86；例如来自山丘链霉菌(Streptomyces collinus)或其任何一个的功能等价变体)或ccr_Rs(EC 1.3.1.85；例如来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)：YP_354044.1，Gene ID：3720751)和相应的NADH-依赖性同种型ter(EC 1.3.1.44；GO：0050343；例如来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)或其任何一个的功能等价变体)。

在进一步的实施方式中，酶以NADH和NADPH依赖性同种型存在并且也展示多个辅助因子依赖性。在第二方面的一个实施方式中，展示多个辅助因子依赖性的酶可包括NADH/铁氧还蛋白分支酶或NADH/NADPH共依赖酶。在具体的实施方式中，酶以NADH/NADPH分支同种型和NADH/铁氧还蛋白分支同种型存在并且微生物适于表达和/或过表达NADH/NADPH依赖性同种型。在具体的实施方式中，NADH/NADPH依赖性同种型是ter(EC 1.3.1.44；GO：0050343；例如来自小眼虫(Euglena gracilis)：AY741582.1或其任何一个的功能等价变体)。在进一步的实施方式中，NADH/Fd依赖性同种型是NADH/铁氧还蛋白分支bcd-etfAB复合物(EC 1.3.8.1；GO：0004085；例如来自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)：NP_349317.1；Gene ID：1118894或其任何一个的功能等价变体)。

在第一或第二方面的具体实施方式中，重组微生物展示一个或多个NADH-依赖性酶的减弱表达。在该实施方式中，重组微生物中，亲代微生物中NADH-依赖性同种型酶可能已经被NADPH-依赖性同种型酶替换。

在第一或第二方面的具体的实施方式中，当与亲代微生物比较时微生物在发酵反应期间展示增加的效率。

在第一或第二方面的一个具体实施方式中，亲代微生物选自一氧化碳营养梭菌，其包括自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、臭味梭菌(Clostridiumscatologenes)、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)、甲酸乙酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)。

在第一或第二方面的一个实施方式中，亲代微生物选自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在具体的实施方式中，微生物选自产乙醇梭菌DSM23693，其是菌株DSM10061的衍生品。在另一具体的实施方式中，微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。

在第一方面的进一步实施方式中，修饰一个或多个NADPH-依赖性酶，以相对于其NADH辅助因子特异性，增加其NADPH辅助因子特异性。

在第二方面的进一步实施方式中，方法进一步包括相对于酶(一个或多个)的NADH辅助因子特异性增加一个或多个NADPH-依赖性酶的NADPH辅助因子特异性的步骤。在一个实施方式中，这包括修饰编码一个或多个NADPH-依赖性酶的一个或多个核酸。

在具体的实施方式中，其中NADPH辅助因子特异性增加的一个或多个酶是氧化还原酶，优选地选自巴豆酰-CoA还原酶/反式-2-烯酰-CoA还原酶/丁酰-CoA脱氢酶。

在具体的实施方式中，一个或多个外源或内源酶包括如本文所描述的分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物，或其功能等价变体。

在进一步的实施方式中，本发明提供了根据第一方面的重组微生物，其具有如在本文所述的任何方面描述的一个或多个修饰。

在进一步的实施方式中，本发明提供了根据第二方面生产重组微生物的方法，其具有如在本文所述的任何方面描述的一个或多个修饰。

在第三方面中，本发明提供了产生一个或多个发酵产物的方法，所述方法包括在存在一氧化碳营养微生物的情况下厌氧发酵包括CO的底物，其中一氧化碳营养微生物是如在第一方面中描述的重组微生物或如通过第二方面产生的重组微生物。

在具体的实施方式中，一个或多个发酵产物包括乙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、高级醇、丁二醇、琥珀酸、类异戊二烯、脂肪酸和/或生物聚合物。

在具体的实施方式中，包括CO的底物是包括CO的气态底物。在一个实施方式中，底物包括工业废气。在某些实施方式中，气体是钢厂废气或合成气。

在一个实施方式中，底物通常包含大比例的CO，比如按体积计至少约20％至约100％的CO、按体积计20％至70％的CO，按体积计30％至60％的CO，和按体积40％至55％的CO。在具体的实施方式中，底物包括按体积计约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％的CO，或约55％的CO、或约60％的CO。

在第四方面中，本发明提供了分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物或其功能等价变体为了在反应中使用多个辅助因子目的的用途。优选地，多个辅助因子包括铁氧还蛋白和NADPH。

在具体的实施方式中，分支NADP甲酸盐脱氢酶选自AEI90721、YP_003778871、AEI90722，和其任何一个或多个的功能等价变体。

在具体的实施方式中，分支NADP仅仅Fe氢化酶选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：26和YP_003778879，和其任何一个或多个的功能等价变体。

在具体的实施方式中，分支甲酸盐-氢裂解酶复合物由SEQ ID NOs：65至67或其功能等价变体的任何一个编码。

在第五方面中，本发明提供了重组微生物，其中微生物适于表达外源分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物，和/或过表达内源分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物，使得微生物适于在反应中使用多个辅助因子。

在第六方面中，本发明提供了制备重组微生物的方法，所述重组微生物可在反应中使用多个辅助因子，所述方法包括至少下述步骤：a)选择一个或多个分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物

b)转化亲代微生物，以产生适于在反应中使用多个辅助因子的重组微生物。

在第五或第六方面的一个实施方式中，多个辅助因子包括铁氧还蛋白和NADPH。

在第五或第六方面的一个实施方式中，亲代微生物是一氧化碳营养梭菌。在一个实施方式中，亲代微生物选自一氧化碳营养梭菌，其包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、臭味梭菌、乙酸梭菌、甲酸乙酸梭菌、大梭菌。在一个实施方式中，亲代微生物选自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在具体的实施方式中，微生物选自产乙醇梭菌DSM23693，菌株DSM10061的衍生品。在另一具体的实施方式中，微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。

在第五或第六方面的一个实施方式中，分支NADP甲酸盐脱氢酶选自AEI90721、YP_003778871、AEI90722，和其任何一个或多个的功能等价变体。

在第五或第六方面的一个实施方式中，分支NADP仅仅Fe氢化酶选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：26和YP_003778879，和其任何一个或多个的功能等价变体。

在第五或第六方面的一个实施方式中，分支甲酸盐-氢裂解酶复合物由SEQ IDNO：65至67或其功能等价变体编码。

在第五或第六方面的具体实施方式中，用一个或多个外源多核苷酸转化亲代微生物，所述外源多核苷酸编码分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物。在具体的实施方式中，亲代微生物用一个或多个外源多核苷酸转化，所述外源多核苷酸选自HQ876015、CLJU_c06990、AEI90722、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、CLJU_c07070、SEQ ID NO：SEQ ID Nos：65至67和其任何一个或多个的功能等价变体。

在相关的方面中，本发明提供了重组微生物为了在反应中使用多个辅助因子目的的用途，所述重组微生物包括分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物。优选地，多个辅助因子包括铁氧还蛋白和NADPH。在一个实施方式中，分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物如在第四方面中描述。

在第七方面中，本发明提供了增加反应效率的方法，方法包括分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物和/或编码其的多核苷酸，和/或适于表达和/或过表达其的重组微生物的用途。在具体的实施方式中，反应是包括CO的底物的发酵。由于分支酶使用铁氧还蛋白和NADPH二者，而不是仅仅NADPH，效率增加。不希望被理论限制，发明人认为偶联铁氧还蛋白更多的负氧化还原电势(E₀’＝-410mV)至NAD(P)H(E₀’＝-320mV)提供了更大的能量电势和驱动更加放能的反应，所以提高反应速度和CO底物吞吐量。

在具体的实施方式中，第七方面的分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶，和/或甲酸盐-氢裂解酶复合物如在第四方面中描述。

在第八方面中，本发明提供了重组微生物将NADH转化成NADPH的用途，其中重组微生物适于表达和/或过表达单个NADH-依赖性还原的铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶(Nfn)。在具体的实施方式中，Nfn酶包括SEQ_ID No.2、4、YP_003781852.1、CLJU_c37240的氨基酸序列或其具有至少76％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的任何一个的功能等价变体。Nfn酶将NADH转化成NADPH，所以当在存在NADH和NADPH-依赖性酶的情况下表达时，酶效率增加产生更快的反应速度和NADPH更快的再生速度。

在具体的实施方式中，微生物包括一氧化碳营养梭菌微生物。在进一步的实施方式中，微生物选自一氧化碳营养梭菌，其包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌。

在进一步的实施方式中，本发明提供了如在第八方面中描述的用途，其中重组微生物包括如在第五方面中描述的一个或多个修饰。

在第九方面中，本发明提供了多肽将NADH转化成NADPH的用途，其中多肽包括单个NADH-依赖性还原的铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶(Nfn)，所述氧化还原酶(Nfn)根据SEQID NO：2、4、YP_003781852.1、CLJU_c37240或其具有至少76％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的功能等价变体。

在具体的实施方式中，第八或第九方面的单个Nfn酶由下述编码：多核苷酸SEQ IDNO：1、3，编码YP_003781852.1或CLJU_c37240的序列，或其具有至少83％、85％、90％、95％，或99％序列同一性的功能等价变体。

在第十方面中，本发明提供了根据SEQ_ID NO.1或3的多核苷酸。

在第十一方面中，本发明提供了根据SEQ_ID NO.2或4的多肽。

在第十二方面中，本发明提供了包括根据第十方面的多核苷酸，或编码根据第十一方面多肽的多核苷酸的载体。

在第十三方面中，本发明提供了重组微生物，其适于表达根据第十方面的多核苷酸，或根据第十一方面的多肽。

本发明也可宽泛地认为与本申请说明书中单独或共同以任何或所有组合两个或更多个所述部分、要素或特征中提及或指示的部分、要素和特征一致，并且其中本文提到的具有本发明所涉及领域已知的等价物的具体的整数，这样已知的等价物视为如同单独阐释并入本文。

附图说明

现参考附图，仅仅作为例子描述本发明的实施方式，其中：

图1显示参与Wood Ljungdahl途径的氧化还原酶步骤的酶试验的结果，以确定它们的辅助因子特异性；

图2显示就辅助因子使用而言，糖酵解(例如大肠杆菌中)和一氧化碳营养梭菌(例如自产乙醇梭菌)中经Wood-Ljungdahl途径的自养生长之间的区别；

图3显示甲酸盐脱氢酶和能够形成甲酸盐-氢裂解酶复合物的氢化酶基因的组织；

图4显示qRT-PCR基因表达结果的分布，强调自养生长期间的高表达NADPH依赖性反应；

图5显示用自产乙醇梭菌的仲醇脱氢酶，并且丙酮作为底物和NADPH或NADH作为辅助因子的酶试验的结果。仅仅用NADPH而不是用NADH测量到活性，表明该酶是严格NADPH依赖性的；和

图6显示经NADPH依赖性仲醇脱氢酶，丙酮高速连续转化成异丙醇。可见在引入至生物反应器之后丙酮迅速转化成异丙醇。即使以20g/L的高浓度，培养将所有丙酮酮转化成异丙醇，表明NADPH库足够维持着，即使以高的速度。

图7显示在CO上生长期间经新的电子-分支NADP仅仅Fe氢化酶/NADP甲酸盐脱氢酶/甲酸盐-氢裂解酶复合物，NADPH驱动非产物形成。

图8显示用于丁醇生物合成的完整NADPH-依赖性途径。每个步骤被催化并且酶由斜体注释的基因编码。

图9显示自产乙醇梭菌NADPH和NADH水平的分析。

优选实施方式详述

定义

术语“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸”(NADH)可指NAD+(氧化形式)和NADH+H+(还原形式)二者的氧化还原对。

术语“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸”(NADPH)可指NADP+(氧化形式)和NADPH+H+(还原形式)二者的氧化还原对。

如本文提及，“NADPH依赖性的酶”主要(尽管没必要排他性地)使用NADPH作为辅助因子为反应提供电子。类似地，NADH-依赖性酶主要(尽管没必要排他性地)使用NADH作为辅助因子为反应提供电子。本领域技术人员认识到一些酶能够使用NADPH和NADH和可称为双功能NAD(P)H-依赖性酶。

如本文提及，短语“微生物对NADPH的总体使用增加”，或类似的语句指在具体的时间段内结合酶的NADPH辅助因子的量增加。在具体的实施方式中，增加是至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、或至少100％。该增加可根据实施例3中使用的方法，或本领域已知的其他方法，例如(S.Wang，Huang，Moll，&Thauer，2010)测量。短语也可解释为意思是通过途径的NADPH通量的增加并且增加是如上述相同量的。NADPH通量可通过代谢分子和产物的水平测量(代谢组学)和/或如C13的标记实验测量(通量组学)。

如本文所使用，“辅助因子特异性”指反应期间辅助因子结合酶的亲和性程度。不应解释为酶和辅助因子具有绝对的特异性，尽管这可这种情况，并且包括至少具体的酶和一种辅助因子相对于另一辅助因子结合的偏好。

如本文提及，酶的“同种型”是任何两个或更多个功能上类似的蛋白质，其能够催化相同的反应并且具有类似但是不同的氨基酸序列。

如本文提及，“分支酶”是能够使用多个辅助因子的酶，其中在成对的反应中一个辅助因子具有更低的反应电势(比如铁氧还蛋白)和一个具有更高的反应电势(比如NADH或NADPH)，以催化不能被催化的反应，或其中反应以更低的速度进行，仅仅通过具有更高反应电势的辅助因子(比如NADH或NADPH)。在一个实施方式分支酶可使用多个辅助因子，以增加反应的速度。分支酶可以是复合物，比如本文所述的甲酸盐氢裂解酶复合物。

术语“适于”本文可用于描述本发明的重组微生物；例如，微生物“适于”表达具体的酶。当结合酶的表达使用时，术语不暗示酶是连续表达的，其旨在覆盖酶可被表达并且这样的表达可以是组成型或诱导的情况。

如本文提及，“发酵液”是包括至少营养培养基和细菌细胞的培养基。

术语“增加效率”、“增加的效率”等，当结合发酵过程使用时，包括但不限于增加下述一个或多个：催化发酵的微生物的生长速度、以升高产物浓度的生长和/或产物产生速度，每体积消耗的底物产生的期望的产物的体积，产生的速度或产生期望的产物的水平，和与发酵的其他副产物相比产生的期望产物的相对比例。

短语“包括一氧化碳的底物”和类似的术语应理解为包括其中一氧化碳是一个或多个细菌菌株用于例如生长和/或发酵可用的任何底物。

短语“包括一氧化碳的气态底物”和类似的短语和术语包括包含一氧化碳水平的任何气体。在某些实施方式中，底物包含至少按体积计约20％至约100％的CO、按体积计20％至70％的CO，按体积计30％至60％的CO，和按体积计40％至55％的CO。在具体的实施方式中，底物包括按体积计约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％的CO，或约55％的CO，或约60％的CO。

尽管底物没必要包含任何氢，H₂的存在不应对根据本发明方法的产物形成有害。在具体的实施方式中，氢的存在产生醇生产的改进的总体效率。例如，在具体的实施方式中，底物可包括约2∶1，或1∶1，或1∶2比例的H₂∶CO。在一个实施方式中，底物包括按体积计约30％或更少的H₂，按体积计20％或更少的H₂，按体积计约15％或更少的H₂或按体积计约10％或更少的H₂。在其他实施方式中，底物流包括低浓度的H₂，例如，小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％、或小于1％、或基本上不含氢。底物也可包含一些CO₂，例如，比如按体积计约1％至约80％的CO₂，或按体积计1％至约30％的CO₂。在一个实施方式中，底物包括小于或等于按体积计约20％的CO₂。在具体的实施方式中，底物包括小于或等于按体积计约15％的CO₂，小于或等于按体积计约10％的CO₂，小于或等于按体积计约5％的CO₂或基本上无CO₂。

在下面的说明书中，从递送和发酵“包含CO的气态底物”角度描述本发明的实施方式。但是，应当认识到可以可选的形式提供气态底物。例如，包含CO的气态底物可提供为溶解在液体中。本质上，液体是包含一氧化碳的气体饱和的并且然后将该液体添加至生物反应器。这可使用标准方法实现。作为例子，可使用微气泡分散发生器(Hensirisak等.Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation；AppliedBiochemistry and Biotechnology 101卷，3/10月期，2002)。进一步的例子，包含CO的气态底物可吸附在固体载体上。术语“包含CO的底物”等的使用包括这样可选的方法。

在本发明具体的实施方式中，包含CO的气态底物是工业尾气或废气。“工业废气或尾气”应宽泛的解释为包括包含工业过程产生的CO的任何气体并且包括由于下述产生的气体：含铁金属产物制造、非含铁产物制造、石油精炼过程、煤的气化、生物质的气化、发电、炭黑生产和焦炭制造。进一步的例子可提供本文的其他地方。

除非上下文以其他方式指出，短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等，如本文所使用，旨在包括过程的生长阶段和产物生物合成阶段。如本文进一步描述，在一些实施方式中生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。这样，添加金属或组合物至发酵反应应理解为包括添加至这些反应器的每一个或全部。

术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道排列组成的发酵设备，其包括连续搅拌罐反应器(CSTR)、固定细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、泡罩塔、气升发酵罐、静态混合器，或适于气体-液体接触的其他容器或其他设备。在一些实施方式中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。这样，当提及添加底物至生物反应器或发酵反应时，应理解为包括添加至适当的这些反应器之一或二者。

如本文提及，“穿梭微生物”是其中表达甲基转移酶并且与目的微生物不同的微生物。

如本文提及，“目的微生物”是其中表达表达构建体/载体上包括的基因并且与穿梭微生物不同的微生物。

“外源核酸”是起源于它们所引入的微生物外部的核酸。外源核酸可源自任何适当的来源，包括但不限于它们引入的微生物(例如重组微生物所源自的亲代微生物)，与它们引入的生物体不同的微生物的菌株或物种，或它们可以是人工或重组产生的。在一个实施方式中，外源核酸表示天然存在于它们引入的微生物中的核酸序列，并且引入它们以增加具体基因的表达或过表达(例如，通过增加序列(例如基因)的拷贝数，或引入强启动子或组成型启动子以增加表达)。在另一实施方式中，外源核酸表示非天然存在于引入它们的微生物中，并且允许非天然存在于微生物中产物的表达或增加微生物天然基因的表达(例如在引入调节元件比如启动子的情况下)的核酸序列。外源核酸可以适于整合至它们引入的微生物的基因组或保持为额外的-染色体状态。

“外源”也可用于指蛋白质。这指重组微生物起源的亲代微生物中不存在或不能表达的蛋白质。

如本文提及重组微生物和核酸所使用术语“内源”指存在于重组微生物起源的亲代微生物中的任何核酸。当用于描述蛋白质时，“内源”应指在重组微生物起源的亲代微生物中存在或能够表达的任何蛋白质。

“氧化还原酶”(也称为“脱氢酶”或“氧化酶”)包括催化电子从一个分子——还原剂，也称为电子供体——转移至另一分子——氧化剂，也称为电子受体——的酶。氧化还原酶归类为酶EC编号分类中的EC1。该组酶通常需要辅助因子，比如NADH、NADPH或铁氧还蛋白。

如本文提及酶“反应”，是通过酶催化一个或多个分子(底物)转化成另一个或多个分子(产物)。

应当认识到，本发明可使用序列与本文具体举例的序列不同的核酸实施，前提是它们基本上具备相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列，这意思是编码的蛋白质或肽具有基本上相同的功能。对于表示启动子序列的核酸序列，变体序列具有促进一个或多个基因表达的能力。这样的核酸可在本文称为“功能等价变体”。作为例子，核酸的功能等价变体包括等位基因变体、基因的片段，包括突变(核苷酸的缺失、插入、替换等)和/或多态性的基因等。来自其他微生物的同源基因也可视为本文具体列举的序列的功能等价变体的例子。这些包括物种，比如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、杨氏梭菌中的同源基因，其细节在网站比如Genbank或NCBI上是公众可得到的。短语“功能等价变体”应也解释为包括其序列由于对于具体生物体的密码子优化而不同的核酸。除非上下文以其他方式指出，本文核酸的“功能等价变体”优选地与鉴定的核酸具有至少约70％、72％、75％、80％、85％、90％、95％或更大的核酸序列同一性。

也应认识到本发明可使用其序列与本文具体列举的氨基酸序列不同的多肽实施。这些变体可在本文称为“功能等价变体”。除非上下文以其他方式指出，蛋白质或肽的功能等价变体包括与鉴定的蛋白质或肽具有至少40％、50％、60％、70％、72％、75％、80％、85％、90％、95％或更大的氨基酸同一性并且具有与感兴趣的肽或蛋白质基本上相同的用途的那些蛋白质或肽。这样的变体包括在它们的范围内，蛋白质或肽的片段，其中片段包括截短形式的多肽，其中缺失可从1至5，至10，至15，至20，至25个氨基酸，并且可从残基1延伸至25在多肽的任一末端，并且其中缺失可以是该区域内的任何长度；或可在内部位置。本文具体多肽的功能上等价的变体应也解释为包括细菌的其他物种，例如在之前的段落中列举的同源基因表达的多肽。

如本文所使用，“基本上相同功能”旨在意思是能够进行其作为变体的核酸或多肽功能的核酸或多肽。例如，本发明酶的变体能够催化如该酶相同的反应。但是，不应解释为变体具有如其作为变体的多肽或核酸相同水平的活性。

使用本领域技术人员已知的方法，人们可评估功能等价变体是否具有如其作为变体的核酸或多肽基本上相同的功能。但是，作为例子，测试氢化酶，甲酸盐脱氢酶或亚甲基-THF-脱氢酶活性的试验描述(Huang，Wang，Moll，&Thauer，2012)中。

当结合本发明使用时，“过表达(over-express)”，“过表达(over-expression)”和类似的术语和短语应宽泛的解释为包括与亲代微生物在相同条件下蛋白质(包括核酸)的表达水平相比，一个或多个蛋白质的表达(包括一个或多个编码其的核酸的表达)的任何增加。不应解释为蛋白质(或核酸)在任何具体水平表达。

如本文提及，“减弱的表达”指核酸或蛋白质的表达相对于其在亲代微生物中的表达下降。在一个实施方式中，减弱的表达可包括基本上不表达(或基本上“零”表达)。这可通过本领域技术人员已知的任何方法实现，包括，例如，RNA沉默、表达过程的修饰(例如启动子功能的破坏)、改变或修饰核酸序列(包括一个或多个核苷酸的缺失、添加和置换)，或从基因组完全或部分去除编码酶的核酸。在基因无效时，可在本文可称为“敲除”或已经被“敲除”等术语。

“亲代微生物”是用于产生本发明的重组微生物的微生物。亲代微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前已经被修饰但是不表达或过表达本发明主题的一个或多个酶的微生物。因此，本发明的重组微生物被修饰，以表达或过表达在亲代微生物中表达或过表达的一个或多个酶。

在一个实施方式中，微生物选自产乙酸一氧化碳营养生物体，包括物种自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、臭味梭菌、乙酸梭菌、甲酸乙酸梭菌、大梭菌、伍氏乙酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculumbacchii)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、Blautia producta、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、凯伍嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。

这些一氧化碳营养产乙酸菌由它们在气态一碳(C1)源比如一氧化碳(CO)和二氧化碳(CO2)上，一氧化碳(CO)和/或氢(H2)作为能源在形成乙酰辅酶A、乙酸盐和其他产物的厌氧条件下，使用和生长的化能自养能力定义。它们具有相同的发酵模式、Wood-Ljungdahl或还原乙酰辅酶A途径，并且由存在的酶集合定义，所述酶集合由下述组成：一氧化碳脱氢酶(CODH)、氢化酶、甲酸盐脱氢酶、甲酰-四氢叶酸合酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶，和一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(CODH/ACS)，其组合是该类型的细菌的特征和独特的(Drake，Küsel，Matthies，Wood，&Ljungdahl，2006)。与将底物转化成形成产物(经乙酰辅酶A或直接)的生物质、次级代谢分子和丙酮酸盐的化学异养生长的糖-发酵细菌相对照，在产乙酸菌中，底物直接连通至乙酰辅酶A，由其形成产物、生物质和次级代谢子。

在一个实施方式中，微生物选自一氧化碳营养梭菌群，其包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和“拉氏梭菌”物种和相关的隔离群。这些包括但不限于菌株自产乙醇梭菌JAI-1^T(DSM10061)(Abrini，Naveau，&Nyns，1994)、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETC^T(DSM13528＝ATCC 55383)(Tanner，Miller，&Yang，1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC55380)(美国专利5,593,886)、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6,368,819)、杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)或“拉氏梭菌P11^T“(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055)，和相关的隔离群比如“C.coskatii’(美国专利2011/0229947)、“梭菌种MT351”(Tyurin&Kiriukhin，2012)、“梭菌种MT 653”(Berzin，Kiriukhin，&Tyurin，2012a)、“梭菌种MT683”(Berzin，2012)、“梭菌种MT962”(Berzin，Kiriukhin，&Tyurin，2013)“梭菌种MT1121”(Berzin，Kiriukhin，&Tyurin，2012b)、“梭菌种MT1230”(Kiriukhin&Tyurin，2013)或“梭菌种MT1962”(Berzin，Tyurin，&Kiriukhin，2013)，和其突变体菌株，比如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O。Productionof Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii。PhD thesis，North Carolina State University，2010)或“梭菌种MT896”(Berzin，Kiriukhin，&Tyurin，2012c)。

这些菌株形成梭菌rRNA群I的亚群(Collins等，1994)，在16S rRNA基因水平具有至少99％的同一性，但是通过DNA-DNA重新组合和DNA指纹识别实验测定为不同的物种(WO2008/028055，美国专利2011/0229947)。

该群的菌株由共同的特征限定，具有类似的基因型和表型，并且它们都共享相同的能量转化和发酵代谢模式。该群的菌株缺少细胞色素并且经Rnf复合物转化能量。

该群的所有菌株的基因组大小为约4.2MBp(等，2010)和GC组分为约32％mol(Abrini等，1994；等，2010；Tanner等，1993)(WO 2008/028055；美国专利2011/0229947)，并且具有保守的必要关键基因操纵子，其用于编码Wood-Ljungdahl途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰-四氢叶酸合酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶，和一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶)、氢化酶、甲酸盐脱氢酶、Rnf复合物(rnfCDGEAB)、丙酮酸盐：铁氧还蛋白氧化还原酶、醛：铁氧还蛋白氧化还原酶(等，2010，2011)。已经发现在所有物种中，负责气体吸收的Wood-Ljungdahl途径基因的组织和数量相同，但是核酸和氨基酸序列不同(等，2011)。

菌株都具有类似的形态和尺寸(对数生长细胞在0.5-0.7x 3-5μm之间)，是嗜温性的(最佳生长温度在30-37℃之间)并且严格厌氧菌(Abrini等，1994；Tanner等，1993)(WO2008/028055)。而且，它们都具有相同的主要系统发生特性，比如相同的pH范围(pH 4-7.5，最佳初始pH为5.5-6)，在包含CO的气体上以类似的生长速度强的自养生长，和乙醇和乙酸作为主要发酵终端产物的代谢概况，在某些条件下形成少量的2，3-丁二醇和乳酸(Abrini等，1994；等，2011；Tanner等，1993)(WO底物利用不同：各种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡萄糖酸酯、柠檬酸酯)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)，或其他底物(例如甜菜碱、丁醇)。发现一些物种是某些维生素(例如硫胺素、生物素)营养缺陷型的，而其他的则不是。在一些范围的这些生物体中，已经显示了羧酸还原成相应的醇(Perez，Richter，Loftus，&Angenent，2012)。

所以，描述的特征不限于一种生物体，如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌，而是一氧化碳营养型、乙醇-合成梭菌的一般特征。因此，本发明可预期在这些菌株中发挥作用，但是表现可能不同。

在某些实施方式中，亲代微生物选自：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌。在一个实施方式中，也包括Clostridium coskatii。在具体的实施方式中，亲代微生物选自产乙醇梭菌DSM23693。

术语核酸“构建体”或“载体”和类似的术语应宽泛的解释为包括适于用作转移遗传物质至细胞的媒介的任何核酸(包括DNA和RNA)。术语应解释为包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体，例如构建体或载体可包括一个或多个调节因子、复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在具体的实施方式中，构建体或载体适于表达构建体或载体编码的一个或多个基因。核酸构建体或载体包括裸露的核酸以及与一个或多个试剂一起配制，以利于递送至细胞的核酸(例如，脂质体缀合的核酸、包含核酸的生物体)。

所有已知的在废气和合成气上生长的一氧化碳营养梭菌使用NADH-依赖性反应。氧化还原对NADPH+H⁺/NADP⁺具有比NADH+H+/NAD+氧化还原对更负的氧化还原电势(Auriol等，2011)。在体内条件下，NAD+/NADH对的氧化还原电势E′是约-280mV(Eo′＝-320mV)而NADP+/NADPH对的E′是约-360mV(Eo′＝-320mV)。发明人吃惊地发现参与自养生长用于吸收和利用CO、CO₂和H₂气体的许多酶(例如氢化酶酶和Wood-Ljungdahl途径酶)显示明显偏好使用NADPH而不是NADH。这与完全例如利用糖的糖酵解的细菌比如大肠杆菌完全相反，其用作大部分细菌过程的模型并且完全是NADH偏好的。这些基于大肠杆菌的反应不包括NADPH依赖性反应步骤，但是的确包括数个NADH依赖性步骤(葡萄糖+2NAD++2ADP+2Pi-＞2丙酮酸盐+2NADH+2H++2ATP+2H2O；图2)。

大肠杆菌中的NADPH-依赖性反应已经显示快速消耗NADPH库并且导致细胞生长抑制和死亡。大肠杆菌中这种缺少NADPH能力使得之前的研究试图减少NADPH依赖性并且所以研究提示增加NADPH利用在发酵反应中是非期望的。所以令发明人吃惊的发现，本文提交的一氧化碳营养梭菌具有相对大容量用于处理NADPH-依赖性反应。

发明人已经通过监测生物反应器中通过NADPH-依赖性酶的丙酮转化实验，表明一氧化碳营养梭菌微生物中相对大容量的NADPH库(见实施例3)。因此，发明人已经显示相对NADH使用NADPH有利于驱动发酵过程中的酶反应。

因此现有用于大肠杆菌的策略，使用NADH依赖性反应和绕过NADPH依赖性反应(其导致产物产率下降和需要过多的修饰)，在一氧化碳营养梭菌中是无效的。如本文所描述的发明提供了通过在一氧化碳营养梭菌中优选选择NADPH依赖性反应克服这的策略，以实现最大的产物产率用于代谢工程化。NADPH依赖性反应的容量和潜能以及与利用糖的大肠杆菌的不同显示在实施例3中。类似地，该策略可用于异源途径以实现最大的产物产率和通量。

另外，发明人已经鉴定了NADPH依赖性反应在一氧化碳营养微生物中增加。这确保开发选择技术，以鉴定和表征使用NADPH库的酶和基因。可表达或过表达根据这些技术所选择酶的重组微生物用于提高一氧化碳营养微生物的效率和增加它们期望产物的生产。

相比结合利用糖的生物体比如大肠杆菌的现有技术的教导，当考虑一氧化碳营养微生物时，发明人考虑NADPH依赖性反应不是非期望的瓶颈。发明人认为，事实上使用NADPH的酶是非常期望的，因为当相比在存在NADH的情况下它们的活性时，在存在NADPH的情况下它们具有增加的活性。

发现NADPH-依赖性酶可用于驱动产生期望的产物，已经使得发明人改造可表达或过表达这些酶的新的重组微生物。这些重组微生物确保开发新的途径并且产生期望的产物。在具体的实施方式中，重组微生物是一氧化碳营养微生物。尽管其先前认为NADPH依赖性的酶应被避免或绕开，发明人令人吃惊地显示一氧化碳营养微生物中这些酶的利用不造成微生物生长和/或生产的下降并且避免避免这样的酶的过多的工程化不是必要的。

根据本发明的第一方面，提供了重组一氧化碳营养梭菌微生物，其适于表达一个或多个外源NADPH-依赖性酶，和/或适于过表达一个或多个内源酶，选择酶使得当表达外源酶时，和/或过表达内源酶时，相对于亲代微生物，该微生物对NADPH的总体使用增加。

在进一步的方面中，本发明也提供了产生重组一氧化碳营养梭菌微生物的方法，所述微生物相对于亲代微生物展示增加的NADPH使用，所述方法包括：

a.选择一个或多个外源和/或内源NADPH-依赖性酶；

b.转化亲代微生物，以产生适于表达一个或多个外源酶，和/或过表达一个或多个内源酶的重组微生物。

微生物中任何一个或多个NADPH-依赖性酶的表达或过表达导致相对于其中不表达或不过表达一个或多个酶的微生物NADPH使用的总体增加。

一个或多个酶可以NADH和NADPH依赖性同种型存在。在具体的实施方式中，重组微生物适于表达和/或过表达NADPH-依赖性同种型。当NADPH和NADH的使用在类似的范围情况下，即当其结合NADH辅助因子时，使用辅助因子的同种型的活性与当其结合NADPH辅助因子时同种型的活性，本发明的方法尤其有用。

在具体的实施方式中，一个或多个NADPH-依赖性酶包括氢化酶(例如具有根据Seq.ID 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32的氨基酸序列、YP_003781016、YP_003781017、YP_003778879、YP_003779640、YP_003779893、YP_003780193，或其任何一个的功能等价变体)、甲酸盐脱氢酶(具有例如AEI90721、AEI90723、AEI90725、YP_003779063、YP_003778871、YP_003780168、AEI90722、AEI90724、AEI90726的氨基酸序列，或其任何一个的功能等价变体)或亚甲基-THF-脱氢酶(具有例如AEI90753、YP_003781891、AEI90771的氨基酸序列或其功能等价变体)。

在本发明具体的实施方式中，存在NADPH和NADH依赖性反应的选择。本发明提供了重组微生物和相比NADH依赖性同种型优选使用NADPH-依赖性同种型的方法，作为亲代微生物中相对于NADPH利用增加NADPH的总体利用的方式。这样的途径和氧化还原酶反应的例子包括：

■用于类异戊二烯生产的甲羟戊酸途径：

○羟甲基戊二酸-CoA(HMG-CoA)还原酶(S.M.Ma等，2011)：

■NADPH-依赖性酶(EC 1.1.1.34；GO：0004420；例如酿酒酵母：DAA09822.1；BK006946.2：115734..118898)和

■NADH-依赖性酶(EC1.1.1.88；GO：0042282；例如迈氏假单胞菌(Pseudomonasmevalonii)：P13702.1)

■丁醇/PHB途径(Bond-Watts，Bellerose，&Chang，2011)：

○3-羟基丁酰-CoA脱氢酶/乙酰乙酰-CoA还原酶/3-羟基丁酰-CoA水合酶：

■NADPH依赖性phaB(EC：1.1.1.36；GO：0018454；例如来自Ralstonia eutropha：YP_725942.1，Gene ID：4249784)和

■NADPH依赖性phaJ(EC 4.2.1.119；例如来自点状产气单胞菌(Aeromonaspunctata)：BAA21816.1)

■NADH依赖性hbd(EC 1.1.1.157；GO：0008691；例如来自丙酮丁醇梭菌：NP_349314.1，Gene ID：1118891)

○巴豆酰-CoA还原酶/巴豆酰-CoA羧化酶-还原酶/反式-2-烯酰-CoA还原酶/丁酰-CoA脱氢酶(Hu等，2012)：

■NADPH依赖性ccr(EC 1.3.1.86；例如来自山丘链霉菌)或ccr_Rs(EC 1.3.1.85；例如来自类球红细菌：YP_354044.1，Gene ID：3720751)

■NADH依赖性ter(EC 1.3.1.44；GO：0050343；例如来自齿垢密螺旋体)

■NADH/铁氧还蛋白分支bcd-etfAB复合物(EC 1.3.8.1；GO：0004085；例如来自丙酮丁醇梭菌：NP_349317.1；Gene ID：1118894)(Li等，2008)或

■NADH/NADPH双功能依赖性ter(EC 1.3.1.44；GO：0050343；例如来自小眼虫：AY741582.1)(Hoffmeister，Piotrowski，Nowitzki，&Martin，2005)。

对于大部分涉及脱氢酶(例如用于乙醇或丁醇的醇脱氢酶，或用于丁二醇的二醇脱氢酶)和氧化酶的氧化还原酶反应，选择NADH或NADPH依赖性的酶是可取的并且可使用数据库比如Braunschweig酶数据库BRENDA(http：//www.brenda-enzymes.info/)鉴定各自的酶(Scheer等，2011)。

在具体的实施方式中，微生物适于表达和/或过表达NADPH-依赖性同种型，同时相应的NADH-依赖性同种型的表达，当与NADPH-依赖性同种型的表达比较时，不变、下降或展示相当小的增加。这样，NADPH的总体使用相对于亲代微生物增加。

在具体的实施方式中，本发明提供了具有一个或多个NADH-依赖性酶的减弱或零表达的重组微生物。在具体的实施方式中，一个或多个NADH-依赖性同种型的表达相比亲代微生物已经被减弱或敲除。减弱/敲除可通过修饰编码一个或多个NADH-依赖性酶的核酸或用编码NADPH-依赖性同种型的一个或多个核酸替换编码NADH-依赖性同种型的一个或多个核酸而实现。酶的减弱或敲除可通过使用任何数量已知的转化和重组核酸技术，转化亲代微生物实现本发明的微生物而实现。可实现一氧化碳营养产乙酸菌中减弱或敲除的具体方法描述在Leang，Ueki，&Lovley，2011中并且进一步的技术描述在例如Sambrook等，(Molecular Cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)中。通过一般的例子，在将突变引入基因，或以其他方式破坏或敲除基因的情况下，可设计适当的核酸构建体或载体以整合至亲代微生物的基因组，以破坏基因。这样的构建体通常包括核与待破坏的基因中或侧翼区域同源的酸序列(臂)，其允许发生同源重组，并且发生引入突变、切除来自基因的核酸区域，或用构建体上的核酸置换基因的区域。尽管优选地构建体上的臂与基因组中它们靶向的区域100％互补，但这不是必须的，前提是序列足够互补，允许与感兴趣的基因区域靶向重组。典型地，臂具有同源性水平使得与靶区域在如在Sambrook等1989中限定的严格条件下杂交。具有本文所描述发明涉及的酶可用的序列信息的技术人员认识到足够允许靶向同源重组和将外源核酸整合至亲代微生物基因组的核酸序列。

在一个实施方式中，酶可展示多个辅助因子依赖性。这样的酶可包括NADH/铁氧还蛋白分支酶或NADH/NADPH共依赖酶。在具体的实施方式中，酶以NADH/NADPH分支同种型和NADH/铁氧还蛋白分支同种型存在并且微生物适于表达和/或过表达NADH/NADPH依赖性同种型。在具体的实施方式中，NADH/NADPH依赖性同种型是ter(EC 1.3.1.44；GO：0050343；来自小眼虫：AY741582.1或其功能等价变体)。在进一步的实施方式中，NADH/Fd依赖性同种型是NADH/铁氧还蛋白分支bcd-etfAB复合物(EC 1.3.8.1；GO：0004085；例如来自丙酮丁醇梭菌：NP_349317.1；Gene ID：1118894或其功能等价变体)。

在本发明具体的实施方式中，当与亲代微生物比较时，微生物在发酵反应期间展示增加的效率。参与发酵产物产生的微生物使用NADPH作为辅助因子，以驱动生长和发酵产物产生涉及的反应。如果这样的微生物表达具有当与NADH辅助因子比较，对于NADPH辅助因子高亲和性的酶，如果NADPH的使用增加，存在它们的效率(见上面的定义)增加的可能性。

本发明的酶涉及产生许多产物的生物合成途径。在具体的实施方式中，途径是甲羟戊酸途径或丁醇合成途径。

在本发明的一个实施方式中，可修饰一个或多个NADPH-依赖性酶的辅助因子特异性，以相对于其NADH辅助因子特异性，增加其NADPH辅助因子特异性。

在具体的实施方式中，本发明提供了通过相对于酶的NADH辅助因子特异性增加氧化还原酶的NADPH辅助因子特异性，而增加一氧化碳营养微生物的效率方法。

可通过修饰氨基酸序列，尤其在有助于或形成各自NADH和NADPH结合口袋的酶区域，从NADH至NADPH(或反之亦然)修饰氧化还原酶的辅助因子特异性。可以本领域已知的其他方式修饰NADH/NADPH结合口袋。

氨基酸序列的修饰可包括一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或置换，或本领域容易知道的一个或多个其他修饰。修饰可发生在酶的任何区域。但是，在一个实施方式中，其在NADH结合口袋中。

在具体的实施方式中，氨基酸序列的修饰包括NADH结合口袋中具体氨基酸残基(一个或多个)的修饰，如例如丁酰-CoA脱氢酶的谷氨酸残基。在具体的实施方式中，谷氨酸残基是丙酮丁醇梭菌bcd中的Glu75和/或齿垢密螺旋体中的Glu80。在一个实施方式中，可使用实现本领域已知的期望的辅助因子特异性的修饰，例如Hu等(2012)中描述的修饰。

在具体的实施方式中，发明人设想辅助因子特异性的修饰可通过上面提到的来自不同物种的巴豆酰-CoA还原酶/反式-2-烯酰-CoA还原酶/丁酰-CoA脱氢酶结构分析和在识别NADH而不是NADPH中其重要的作用的Glu(在丙酮丁醇梭菌的bcd中的Glu75和齿垢密螺旋体中的Glu80)的保守而实现。不希望被理论限制，相信这通过识别NADH的腺嘌呤核糖2’-OH的酶出现。在NADPH依赖性的酶中，该残基被修饰(Hu等，2012)。

实现辅助因子特异性修饰的方法是本领域技术人员已知的。但是，作为例子，可使用在下述实施例中使用的涉及改变各种氧化还原酶的辅助因子特异性的方法：

●1，3-丙二醇氧化还原酶(C.Ma，Zhang，Dai，&Xiu，2010)

●对羟苯甲酸酯羟化酶(Eppink，Overkamp，Schreuder，&Van Berkel，1999)

●17β-羟基类固醇脱氢酶(McKeever等，2002)

●酮醇酸还原异构酶(Rane&Calvo，1997)

新的分支酶

电子分支是最近发现厌氧细菌和古细菌细胞质中将吸热氧化还原反应与放热氧化还原反应偶联的机制。迄今为止，已经鉴定了仅仅数个电子分支酶复合物并且已经表征了4个(Herrmann，Jayamani，Mai，&Buckel，2008；Huang等，2012；Li等，2008；Schuchmann&Mueller，2012；Schut&Adams，2009；G.Wang&Wang，1984)。在2008年，发现在丁酸形成梭菌中，巴豆酰-CoA(Eo′＝-10mV)用NADH(Eo′＝-320MV)的放热还原与铁氧还蛋白(Eo′＝-400mV)用NADH的吸热还原偶联并且偶联的反应由细胞质丁酰-CoA脱氢酶-电子转移黄素蛋白复合物Bcd-EtfAB催化(Herrmann，Jayamani，Mai，&Buckel，2008；Li等，2008)。提示该过程是基于黄素的：结合蛋白质的黄素被NADH还原成对苯二酚，其随后被巴豆酰-CoA再氧化成半醌自由基，其氧化还原电势足够是负的，以还原铁氧还蛋白(Fd)。迄今为止，已经鉴定了数个电子分支酶复合物并且和已经表征了4个(Herrmann等，2008；Huang等，2010；Li等，2008；Schuchmann&Mueller，2012；Schut&Adams，2009；G.Wang&Wang，1984)。除了反应1的Bcd-EtfAB复合物，来自产甲烷古细菌的MvhADG-HdrABC复合物催化反应2，来自细菌和古细菌的NfnAB复合物催化反应3和来自细菌的HydABC复合物催化反应4。

(1)2NADH+Fd_ox+巴豆酰-CoA→2NAD⁺+Fd_red ^2-+丁酰-CoA

ΔG^o′＝-44kJ/mol*

(2)2H₂+CoM-S-S-CoB+Fd_ox→CoM-SH+CoB-SH+Fd_red ^2-+2H⁺

ΔG_o′＝-50kJ/mol*

ΔG^o′＝-16kJ/mol*

ΔG_o′＝+21kJ/mol*

*在标准条件下(1M浓度的底物和产物；气体分压＝1bar；pH＝7)，使用的Eo′为-400mV

所有的这些复合物是NADH依赖性的，它们两个中，异聚仅仅Fe氢化酶可逆地偶联铁氧还蛋白用H₂的吸热还原与NAD用H₂的放热还原(Schuchmann&Mueller，2012；Schut&Adams，2009)。发明人已经首次鉴定了NADPH依赖性分支酶(反应5)，新的电子分支[FeFe]-氢化酶，其NADP而不是NAD特异性的。

ΔG_o′＝+21kJ/mol*

不被理论限制，该复合物的作用除了氢化酶是用作甲酸盐：氢裂解酶。在该功能中，其表示电子溢出阀，用于当Fd_ox/Fd_red ^2-对和NADP+/NADPH对的细胞内氧化还原电势由于CO过度还原过低时，NADPH驱动的产物形成，其通过分别还原质子和CO₂形成H₂和甲酸盐。

在体内条件下，NAD+/NADH对的氧化还原电势E′是约-280mV(Eo′＝-320mV)和NADP+/NADPH对的E′是约-360mV(Eo′＝-320mV)。Fdox/Fdred2对的氧化还原电势E′是-400mV(来自巴氏芽孢梭菌(C.pasteurianum)铁氧还蛋白的Eo′)，其相当更低。这样，本发明的该分支过程方面提供了比如更快的反应速度的优势。

在体内条件下，预测铁氧还蛋白的氧化还原电势接近-500mV，NADP的氧化还原电势接近-370mV和NAD的氧化还原电势接近-280mV。Fd_ox/Fd_red ^2-对和NAD⁺/NADH对之间约200mV的氧化还原电势差别足够大而与膜相关的Rnf复合物和F_oF₁ATP合酶介导的电子运输磷酸化偶联。预测NAD⁺用铁氧还蛋白的还原是在CO上生长的自产乙醇梭菌中能量代谢中的主要偶联位置。经产生可接着驱动产物形成的NADPH的Nfn催化反应持续再生NAD⁺(图7)。

发明人已经鉴定了新的电子分支[FeFe]-氢化酶，其是NADP特异性的而不是NAD特异性的。发明人也已经鉴定了自产乙醇梭菌中表达的甲酸盐脱氢酶可使用铁氧还蛋白和NADPH而不是仅仅NADPH(本文称为分支甲酸盐脱氢酶)。

这些酶的新的功能先前是未知的并且是第一个鉴定的NADPH-依赖性分支NADP仅仅Fe氢化酶和分支NADP甲酸盐脱氢酶。发明人的进一步研究已经指出NADP仅仅Fe氢化酶和NADP甲酸盐脱氢酶形成酶复合物，本文称为甲酸盐-氢裂解酶复合物。在具体的实施方式中，该复合物也用于产生用于实现多个辅助因子依赖性的重组微生物。

因此，本发明提供重组微生物、多肽或表达或编码所述酶的多核苷酸为了在反应中使用多个辅助因子(例如铁氧还蛋白和NADPH)的目的的用途。在具体的实施方式中，多肽包括根据AEI90721、YP_003778871、AEI90722的分支NADP甲酸盐脱氢酶，或其任何一个的功能等价变体。

在具体的实施方式中，分支甲酸盐-氢裂解酶复合物由SEQ ID NOs：65至67或其功能等价变体编码。

在具体的实施方式中，编码分支NADP仅仅Fe氢化酶、NADP甲酸盐脱氢酶或甲酸盐-氢裂解酶复合物的多核苷酸包括选自下述的一个或多个多核苷酸：HQ876015、CLJU_c06990、AEI90722、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：25、CLJU_c07070、SEQ ID NOs：67至69和其任何一个或多个的功能等价变体。

发明人在单个基因簇中发现了分支NADP甲酸盐脱氢酶和分支NADP仅仅Fe氢化酶的蛋白质编码基因，以及具有NADP结合位点的铁-硫黄素蛋白，铁-硫(FeS)蛋白质和包含硒代半胱氨酸和亚钼嘌呤的甲酸盐脱氢酶的基因(图3)。发明人提出，这些基因编码本文称为甲酸盐氢裂解酶的功能复合物(见实施例1)。铁硫黄素蛋白、铁硫(FeS)蛋白质和甲酸盐和钼附件蛋白质包括组成基因蔟的由下面表1显示的多肽编码：

表1：自产乙醇梭菌的完整甲酸盐-氢裂解酶复合物簇的序列：Seq ID65，杨氏梭菌：Seq ID 66，和拉氏梭菌：Seq.ID 67).

本发明也提供重组一氧化碳营养微生物，其当用于在反应中使用多个辅助因子的目的时，表达新的分支NADP仅仅Fe氢化酶、分支NADP甲酸盐脱氢酶和/或甲酸盐-氢裂解酶。优选地，多个辅助因子包括铁氧还蛋白和NADPH。

本发明也提供了通过使用如上述表达分支氢化酶的重组一氧化碳营养微生物增加包含CO的底物发酵效率的方法。由于分支酶使用铁氧还蛋白和NADPH二者而不是仅仅NADPH，而增加效率。与NADPH相比铁氧还蛋白更多的负氧化还原电势为反应提供了更大的能量电势，所以提高反应速度和CO底物吞吐量。

另外，发明人已经鉴定了包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌的一氧化碳营养梭菌物种中的新的Nfn酶。该Nfn酶能够将NADP⁺还原成NADPH+H⁺，以NADH⁺+H⁺的代价补充库(或反之亦然)(反应2)：

迄今为止，已经仅仅为一个生物体描述了该酶克氏羧菌(C.kluyveri)(S.Wang等，2010)，其中由形成复合物的两个亚单位NfnA和NfnB组成。发明人鉴定了自产乙醇羧菌的细胞的活性并且鉴定了相应的基因(实施例4)。这是第一次鉴定单个Nfn基因和一氧化碳营养生物体中第一个鉴定的Nfn酶。具有仅仅一个亚单位，而不是两个亚单位的复合物的优势包括在产生和修饰酶中。

不限于该理论，发明人认为两个新的复合物电子-分支NADP仅仅Fe氢化酶/NADP甲酸盐脱氢酶/甲酸盐-氢裂解酶和Nfn复合物在能量转化和由CO形成还原产物中起到关键作用，其由反应7-9(图7)的NADPH以及描述的铁氧还蛋白依赖性一氧化碳脱氢酶(CODH)，F_OF₁Rnf复合物(等，2010；Tremblay，Zhang，Dar，Leang，&Lovley，2012)驱动。

铁氧还蛋白在体内以比-400mV更负的氧化还原电势操作，以接近-360mV的氧化还原电势操作NADP和以接近-280mV的氧化还原电势操作NAD。大于120mV的Fd_ox/Fd_red ²对和NAD⁺/NADH对的氧化还原电势差足够大而与膜相关的Rnf复合物(反应8)和F_OF₁ATP合酶(反应9)介导的电子运输磷酸化偶联。经产生NADPH的Nfn复合物催化的反应6和经其他NADH依赖性反应持续再生NAD⁺。NADPH可然后用于驱动产物形成已经鉴定的其他NADPH依赖性反应(图7)。

因为CO非常负的氧化还原电势(-520mV)，当这些电子载体不能足够快速再氧化时，可能过度还原铁氧还蛋白和NADP。增加铁氧还蛋白-和NADPH再氧化的一个方式是增加选择NADPH依赖性反应的还原产物形成的速度。

下面表2的结果显示表达Nfn酶的一氧化碳营养微生物能够将NADH转化成NADPH，而被NADPH-依赖性酶使用。

表2

发明人发现Nfn酶追踪回至单个基因/蛋白质(自产乙醇梭菌中分别Seq.ID Nos 1和2)，而不是如克氏羧菌中的两个。编码该酶的类似的基因也存在于杨氏梭菌(YP_003781852.1；CLJU_c37240)(其中其被标注为谷氨酸合酶)和拉氏梭菌(Seq_ID Nos：3和4)中。

发明人设想重组微生物中Nfn基因，或其功能变体的上调表达能够提高NADPH-依赖性酶的效率并且使得从发酵反应更高的产物输出。

因此，在具体的方面中，本发明提供了通过表达或过表达Nfn酶复合物，提高产生微生物的效率的方法。

在具体的实施方式中，本发明提供了使用重组微生物将NADH转化成NADPH增加NADPH库尺寸，其中重组微生物适于表达和/或过表达单个Nfn酶。在具体的实施方式中，Nfn酶包括SEQ_ID No.2、4、YP_003781852.1、CLJU_c37240的氨基酸序列或具有至少76％、80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的其任何一个的功能等价变体。Nfn酶将NADH转化成NADPH，所以当在存在NADH和NADPH-依赖性酶的情况下表达时，酶效率提高，使得更快的反应速度和NADPH更快的再生速度。

本发明也提供了使用多肽将NADH转化成NADPH，其中多肽包括根据SEQ ID NO：2、4、YP_003781852.1、CLJU_c37240的单个Nfn酶，或其任何一个的功能等价变体。此外，本发明提供了使用多核苷酸将NADH转化成NADPH，其中多核苷酸编码单个Nfn酶，多核苷酸包括SEQ ID NO：1，3，编码CLJU_c37240或YP_003781852.1的序列，或具有至少83％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的其功能等价变体。

在进一步的方面中，本发明提供了根据SEQ_ID NO.1或3的多核苷酸。

在进一步的方面中，本发明提供了根据SEQ_ID NO.2或4的多肽。在进一步的方面中，本发明提供了载体和/或重组微生物，其包括新的Nfn多核苷酸，和/或编码本发明新的Nfn多肽的多核苷酸。

在具体的实施方式中，本发明提供了NADH-依赖性反应的优化。在该情况下，各自的NADPH依赖性的氢化酶、甲酸盐脱氢酶、甲酸盐-氢裂解酶，和/或亚甲基-THF-脱氢酶可用相应的NADH-依赖性酶，例如来自热醋穆尔氏菌或伍氏乙酸杆菌替换。这将优化通过为NADH设计和优化的途径的通量。该实施方式具有特别的用途，其中没有NADPH-依赖性酶可用或包括NADPH-依赖性酶的重组生物体不能被有效工程化的。

为了提高具体酶的表达，增加编码该酶的核酸的表达。下面概述了增加编码期望的酶的核酸表达的方法。技术人员可容易认识到其他有用的技术。

本发明可包括编码本文提及的蛋白质和肽的核酸或可使用编码本发明中使用的蛋白质和肽的核酸。在一个实施方式中，核酸是核酸构建体或载体。在具体的实施方式中，核酸构建体或载体是表达构建体或载体，但是其他构建体和载体，比如用于克隆那些也包括在本发明中。在具体的实施方式中，表达构建体或载体是质粒。

认识到，除了启动子以及如果需要适于进一步蛋白质表达的另外的基因，本发明的表达构建体/载体可包含任何数量的调节元件。在一个实施方式中，表达构建体/载体包括一个启动子。在另一实施方式中，表达构建体/载体包括两个或更多个启动子。在具体的实施方式中，表达构建体/载体为每个待表达的基因包括一个启动子。在一个实施方式中，表达构建体/载体包括一个或多个核糖体结合位点，优选地用于每个待表达基因的核糖体结合位点。

本领域技术人员见认识到，本文所述的核酸序列和构建体/载体序列可包含标准连接体核苷比如核糖体结合位点和/或限制酶切位点需要的那些。这样的连接体序列不应解释为是必须的并且不提供对限定序例的限制。

核酸和核酸构建体，包括本发明的表达构建体/载体可以使用本领域任何数量的技术标准构建。例如，可使用化学合成或重组技术。这样的技术描述在，例如Sambrook等(Molecular Cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。进一步示例性技术描述在下文实施例章节。本质上，单个基因和调节因子可操作地彼此连接使得基因可表达形成期望的蛋白质。本领域技术人员认识到在本发明中使用的适当的载体。但是，作为例子，下述载体可能是合适的：pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750，和下文实施例章节列举的质粒。

应当认识到本发明的核酸可以为任何适当的形式，包括RNA、DNA或cDNA。

本发明也提供了包括本文所述的任何一个或多个核酸的宿主生物体，尤其微生物，和包括病毒、细菌以及酵母。

产生重组微生物的方法

一个或多个外源核酸可作为裸露核酸递送至亲代微生物或可与一个或多个试剂一起配制，以利于转化过程(例如，脂质体缀合核酸、其中包含核酸的生物体)。一个或多个核酸可以适当的是DNA、RNA，或其组合。限制抑制剂可使用在某些实施方式中；见，例如Murray，N.E.等(2000)Microbal.Molec.Biol.Rev.64，412.)

使用本领域已知的用于产生重组微生物的任何数量的技术，由亲代微生物和一个或多个外源核酸制备本发明的微生物。仅仅作为例子，可通过下述实现转化(包括转导或转染)：电穿孔、超声破碎、聚乙二醇介导的转化，化学或自然感受、原生质体转化、噬菌体引导或结合。适当的转化技术描述例如，Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T：MolecularCloning：A laboratory Manual，Cold Spring Harbour Labrotary Press，Cold SpringHarbour，1989中。

已经为数个一氧化碳营养产乙酸菌，如杨氏梭菌(等2010，Poc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.107：13087-92；(Leang等，2011)PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)，自产乙醇梭菌(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)，伍氏乙酸杆菌(Straetz等，1994，Appl.Environ.Microbiol.60：1033-37)或热醋穆尔氏菌(Kita等，2012)描述了电穿孔并且是许多梭菌比如丙酮丁醇梭菌(Mermelstein等，1992，Biotechnology，10，190-195)，解纤维素梭菌(Jennert等，2000，Microbiology，146：3071-3080)或热纤梭菌(Tyurin等，2004，Appl.Environ.Microbiol.70：883-890)中使用的标准方法。噬菌体引导已经表明用于一氧化碳营养产乙酸菌以及臭味梭菌(Prasanna Tamarapu Parthasarathy，2010，Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC25775for Generation of Mutants，Masters Project Western Kentucky University)，而结合已经描述为用于许多梭菌包括艰难梭菌(Herbert等，2003，FEMSMicrobiol.Lett.229：103-110)或C.acetobuylicum(Williams等，1990，J.Gen.Microbiol.136：819-826)的选择方法和可以类似的方式用于一氧化碳营养产乙酸菌。

在某些实施方式中，由于在待转化的微生物中活性的限制系统，必须使待引入微生物的核酸甲基化。这可使用各种技术进行，包括下面描述的那些，并且进一步在下文实施例章节举例。

作为例子，在一个实施方式中，通过包括下述步骤的方法产生本发明的重组微生物：

a.将(i)如本文所描述的表达构建体/载体和(ii)包括甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体引入穿梭微生物；

b.表达甲基转移酶基因；

c.从穿梭微生物分离一个或多个构建体/载体；和，

d.将一个或多个构建体/载体引入目的微生物。

在一个实施方式中，组成型表达步骤B的甲基转移酶基因。在另一实施方式中，诱导步骤B中甲基转移酶基因的表达。

穿梭微生物是微生物，优选地是限制负微生物，其利于组成表达构建体/载体的核酸序列的甲基化。在具体的实施方式中，穿梭微生物是限制负大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸乳球菌。

甲基化构建体/载体包括核酸编码甲基转移酶的序列。

一旦表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入穿梭微生物，诱导甲基化构建体/载体上存在的甲基转移酶基因。引导可通过任何适当的启动子系统，但是在本发明具体的实施方式中，甲基化构建体/载体包括可诱导的lac启动子并且通过添加乳糖或其类似物，更优选地异丙基-β-D-巯基-半乳糖苷(IPTG)诱导。其他适当的启动子包括ara、tet或T7系统。在本发明进一步的实施方式中，甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。

在具体的实施方式中，甲基化构建体/载体具有穿梭微生物身份特异的复制起点，从而甲基化构建体/载体上存在的任何基因在穿梭微生物中表达。优选地，表达构建体/载体具有目的微生物身份特异的复制起点，从而表达构建体/载体上存在的任何基因在目的微生物中表达。

甲基转移酶的表达导致表达构建体/载体上存在的基因的甲基化。根据许多已知方法的任何一种，表达构建体/载体可然后从穿梭微生物分离。仅仅作为例子，在本文下面实施例章节描述的方法可用于分离表达构建体/载体。

在具体的实施方式中，同时分离构建体/载体。

表达构建体/载体可使用任何数量已知的方法引入目的微生物。但是，作为例子，可使用在下文实施例章节描述的方法。因为表达构建体/载体被甲基化，表达构建体/载体上存在的核酸序列能够并入目的微生物和成功表达。

可设想，甲基转移酶基因可引入穿梭微生物并且过表达。因此，在一个实施方式中，可使用已知的方法收集所得甲基转移酶并且体外用于使表达质粒甲基化。表达构建体/载体可然后引入目的微生物用于表达。在另一实施方式中，甲基转移酶基因引入穿梭微生物的基因组，随后将表达构建体/载体引入穿梭微生物，从穿梭微生物分离一个或多个构建体/载体并且然后将表达构建体/载体引入目的微生物。

可设想，如上定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体可被组合，以提供组合物。这样的组合物尤其用于避免限制屏障机制，以产生本发明的重组微生物。

在具体的实施方式中，表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质粒。

本领域普通技术人员认识到许多在本发明的生产微生物中使用的适当的甲基转移酶。但是，作为例子，可使用下文实施例中描述的枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和甲基转移酶。在一个实施方式中，甲基转移酶已经描述在WO/2012/053905中。

适于表达甲基转移酶基因的任何数量的构建体/载体可用于产生甲基化构建体/载体。但是，作为例子，可使用下文实施例章节描述的质粒。

产生方法

在本发明的实施方式中，微生物发酵的气态底物是包含CO的气态底物。气态底物可以是作为工业过程副产物而获得的包含CO的废气，或来自一些其他来源，比如来自汽车废尾气。在某些实施方式中，工业过程选自铁金属产物制造，比如钢厂，非铁产物制造、石油精炼过程、煤的气化、发电、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方式中，使用任何方便的方法在其排放至大气之前，包含CO的气体可捕获自工业过程。CO可以是合成气(包含一氧化碳和氢的气体)的组分。从工业过程产生的CO突出燃烧以生产CO₂并且所以本发明尤其用于降低CO₂温室气体排放和生产生物燃料。取决于气态包含CO的底物的组分，也可期望处理它，以去除任何非期望的杂质，比如灰尘颗粒，然后引入它发酵。例如，气态底物可使用已知的方法过滤或洗气。

认识到为了进行细菌的生长和产物的产生，除了包含CO的底物气体，适当的液体养分媒介也需要进料至生物反应器。

在方法方面具体的实施方式中，发酵发生在水性培养基中。在方法方面具体的实施方式中，底物的发酵发生在生物反应器中。

底物和媒介可以连续、分批或分批进料方式进料至生物反应器。培养基包含足够使得使用的微生物生长的维生素和矿物质。适于使用CO发酵的厌氧培养基是本领域已知的。例如，适当的培养基描述Biebel(2001)中。本发明的一个实施方式中，培养基如下文实施例章节所描述。

发酵应期望地在适当的用于进行产生生物燃料的发酵条件下进行。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速度(如果使用连续搅拌罐反应器)、接种体水平、最大气体底物浓度，以确保液相中的CO不是限制，和最大产物浓度避免产物抑制。

另外，通常期望增加底物流(或气态底物中的CO分压)的CO浓度并且因此增加其中CO是底物的发酵反应的效率。在增加的压力下的操作使得明显增加CO从气相至液相的转移速度，其中其可被微生物作为产生发酵的碳源吸收。这接着意味着当生物反应器保持在升高的压力而不是大气压的情况下可减少驻留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最佳反应条件部分取决于本发明使用的具体微生物。但是，一般而言，优选地发酵在比环境压力更高的压力下进行。而且，因为给定的CO转化速度部分是底物驻留时间的函数，并且实现期望的驻留时间接着指示需要的生物反应器的体积，加压系统的使用可显著降低需要的生物反应器的体积，并且从而降低发酵装置的资本成本。根据美国专利号5,593,886中给定的实施例，反应器体积可与反应器操作压力的增加成线性比例下降，即在10个大气压下操作的生物反应器仅仅需要在1个大气压下那些的十分之一体积。

作为例子，已经描述了在升高的压力下进行气体-至-乙醇发酵的好处。例如，WO02/08438描述了在30psig和75psig的压力下进行的气体-至-乙醇发酵，分别产生150g/l/天和369g/l/天的乙醇产量。但是，发现使用类似培养基和输入气体组合物在大气压下进行的示例性发酵，产生10和20倍更少的乙醇每升每天。

也期望引入包含CO的气态底物的速度是比如确保液相中CO的浓度不受限制。这是因为CO首先添加的结果可能是一个或多个产物被培养消耗。

用于进料发酵反应的气流的组成可对该反应的效率和/或成本具有明显的影响。例如，O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后，发酵过程阶段有害的或不需要的气体的加工可增加对这些阶段的负担(例如其中气流在进入生物反应器之前被压缩，不需要的能可用于压缩发酵中不需要的气体)。因此，可期望处理底物流，尤其源自工业来源的底物流，以去除不需要的组分和增加期望的组分的浓度。

在某些实施方式中，本发明细菌的培养基保持在水性培养基中。优选地，水性培养基是最小厌氧微生物生长培养基。适当的培养基是本领域已知的并且描述在例如美国专利号5,173,429和5,593,886和WO 02/08438中，并且如下文实施例章节所描述。

而且，如果如上述调整发酵液的pH，以增强乙酸吸附至活性炭，pH应调整至与发酵生物反应器中发酵液类似的pH，然后返回至生物反应器。

实施例

实施例1

评估Wood-Ljungdahl途径的所有的五个氧化还原酶步骤，以确定它们在存在不同底物的情况下的活性。这些酶可使用辅助因子，以驱动反应。酶参与自养生长，包括CO、CO₂和H₂气体的吸收和利用。

评估的酶它们的活性详述在图1中。使用合成氧化还原染料作为对照，甲基紫罗碱(MV)或苄基紫罗碱(BV)，测试所有进行的试验。测试辅助因子铁氧还蛋白(Fd)、NADH和NADPH或其组合。使用来自在CO和氢上自养生长的典型反应器的粗提取物进行酶试验。

发酵

在1.5L生物反应器中在37℃下进行自产乙醇梭菌DSM23693的发酵并且包含CO的钢厂气体作为唯一能源和碳源，如下描述。用每升包含下述的限定培养基用于培养生长：MgCl、CaCl₂(0.5mM)、KCl(2mM)、H₃PO₄(5mM)、Fe(100μM)、Ni、Zn(5μM)、Mn、B、W、Mo、Se(2μM)。培养基转移至生物反应器并且在121℃下高压灭菌45分钟。高压灭菌之后，培养基补充硫胺素、泛酸盐(0.05mg)、生物素(0.02mg)并且用3mM半胱氨酸-HCl还原。为了实现厌氧，用氮通过0.2μm过滤器吹洗反应器容器。接种之前，气体切换至包含CO的钢厂气体，持续进料至反应器。进气的组成是2％的H₂、42％的CO、20％的CO₂、36％的N₂。培养物的pH保持在5和5.2之间。

收获细胞

在收获细胞时，气体消耗是5摩尔CO L^-1天^-1和10毫摩尔H₂L^-1天^-1，产生下述代谢分子：14g L^-1天^-1乙酸盐和19.5g L^-1天^-1乙醇。培养物的pH用K₂CO₃调整至pH 6和反应器冷冻在冰-水浴。～1.21的培养物收集在冰上。培养物分开在2x 1-L离心机瓶子(该步骤和所有的随后步骤在厌氧腔室中进行，以确保厌氧条件，以避免酶的抑制)并且使细胞在5000rpm下成小球10min。轻轻倒出上清液，并且去除残留的液体。每个小球再悬浮在～30ml的50mMK PO₄中pH 7.0，具有10mM DTT。再悬浮液转移至预先称重的50-mL-Falcon-管和细胞以最大速度(5000g)再成小球15min。从厌氧腔室去除管并且立即冷冻在液N₂中，然后分析。

制备粗细胞提取物和酶试验

从连续反应器中，在厌氧条件下收获细胞。通过三系穿过French压印，破坏它们，如(Huang等，2012)描述。

除非另外指出，所有的试验在37℃下1.5-ml-厌氧比色皿中进行，所述比色皿用橡胶塞密封，填充0.8ml反应混合物和0.7ml N₂或H₂或CO，在1.2x 10⁵ Pa下，如(Huang等，2012)描述。

CO脱氢酶、甲酸盐脱氢酶、亚甲基-THF脱氢酶和亚甲基-THF还原酶都如(Huang等，2012)描述来评估。

使用试验混合物测量CO脱氢酶，所述试验混合物包含100mM Tris/HCl(pH 7.5)、2mM DTT和约30μM铁氧还蛋白和/或1mM NAD⁺或1mM NADP⁺。气相是100％的CO。

如描述测量氢化酶活性，添加用H₂的NADP⁺依赖性铁氧还蛋白还原测量。反应混合物补充铁氧还蛋白(30μM)和1mM NADP。气相是100％H₂。在用酶铁氧还蛋白开始反应之后，接着是在430nm下的还原(ε_Δox-red≈13.1mM^-1cm^-1)。

在5-ml厌氧血清瓶子中测量甲酸盐-氢裂解酶活性，所述瓶子用橡胶塞子密封，填充0.8ml反应混合物和4.2ml N2，在1.2x 10⁵Pa下。反应混合物包含100mM Tris-HCl pH7.5和20mM甲酸盐。在通过添加酶开始反应之后，通过气相色谱分析监测H₂产生。用试验混合物测量用H₂将CO₂还原成甲酸盐的甲酸盐-氢裂解酶活性，所述试验混合物包含100mM磷酸钾、2mM DTT和30mM[¹⁴C]K₂CO₃(24,000dpm/μmol)。气相是100％H₂。在200rpm下连续振荡血清瓶子，以确保气相与液相的平衡。在开始用酶的反应之后，每1.5min回收100μl液体样品并且添加至1.5-ml安全密封微管，其包含100μL的150mM乙酸，以通过通过酸化终止反应。200μl的混合物然后在40℃下孵育10min，在1,400rpm下热混合器中振荡以去除所有的¹⁴CO₂，留下形成的¹⁴C-甲酸盐。随后，100μL的混合物添加至5ml的Quicksave A闪烁流体(ZinsserAnalytic，Frankfurt，德国)并且和分析Beckman LS6500液体闪烁计数器(Fullerton，CA)中的¹⁴C放射活性。

用试验混合物进行甲酸盐脱氢酶测量，所述试验混合物包含100mM Tris/HCl(pH7.5)或100mM磷酸钾、2mM DTT、20mM甲酸盐和，其指示25μM铁氧还蛋白、1mM NADP⁺、1mM NAD⁺和/或10mM甲基紫罗碱。气相是100％N₂。

使用试验混合物测量亚甲基-H₄F脱氢酶，所述试验混合物包含100mM MOPS/KOH(pH 6.5)、50mM 2-巯基乙醇、0.4mM四氢叶酸、10mM甲醛和0.5mM NADP⁺或0.5mM NAD⁺。气相是100％N₂。

在下列条件下试验亚甲基-H4F还原酶。试验混合物包含100mM Tris/HCl(pH7.5)、20mM抗坏血酸、10μM FAD、20mM苄基紫罗碱和1mM甲基-H4F。在开始与酶的反应之前，苄基紫罗碱用连二硫酸钠被还原至ΔA555为0.3。

使用混合物评估醛：铁氧还蛋白氧化还原酶，所述混合物包含100mM Tris/HCl(pH7.5)、2mM DTT、1.1mM乙醛和约25μM铁氧还蛋白。气相是100％N2。

使用混合物测量CoA乙酰化乙醛脱氢酶，所述混合物包含100mM Tris/HCl(pH7.5)、2mM DTT、1.1mM乙醛、1mM辅酶A和1mM NADP+或1mM NAD+。气相是100％N2。

在试验中分别用100mM磷酸钾(pH 6)、2mM DTT、1.1mM乙醛或乙偶姻和1mM NADPH或1mM NADH测量醇和丁二醇脱氢酶。气相是100％N2。

从巴氏芽孢梭菌纯化铁氧还蛋白，如( &Thauer，1978)描述。

结果

氢化酶：该酶对于作为能源的氢吸收是重要的并且本质是用于一氧化碳营养微生物在CO₂上的生长。该酶也能够产生氢并且可结合作为甲酸盐氢裂解酶的甲酸盐脱氢酶起作用。

在自产乙醇梭菌存在7个氢化酶基因(6个仅仅Fe氢化酶和1个NiFe氢化酶；Seq.ID5-20)。这些基因的5个同系物存在于杨氏梭菌的基因组中(等，2010)(YP_003781016/CLJU_c26060、YP_003781017/CLJU_c26070、CLJU_c07070/YP_003778879、CLJU_c14700/YP_003779640、CLJU_c17280/YP_003779893、CLJU_c20290/YP_003780193)并且可也在拉氏梭菌的基因组中鉴定(Seq.ID 21-32)(表3)。

表3

使用单个辅助因子，用NADPH(0.2U/mg)观察活性，同时用NADH(0.05U/mg)或铁氧还蛋白(＜0.01U/mg)观察到零或更低的活性。这表明氢化酶是NADPH特异性的。

使用辅助因子的组合发现了最高活性。在存在铁氧还蛋白0.68U/mg的情况下测量NADPH。相反，用NADH(＜0.01U/mg)没有观察到可测量的活性，再次确认该酶对NADPH的高特异性。该数据指示存在分支氢化酶，如在海栖热袍菌(Schut&Adams，2009)或伍氏乙酸杆菌(Schuchmann&Mueller，2012)或热醋穆尔氏菌(Huang等，2012)中。但是，在这些其他生物体中，酶是NADH依赖性的。这样，这是第一个发现的NADPH依赖性分支氢化酶。

甲酸盐脱氢酶：在Wood-Ljungdahl途径的甲基分支中该酶催化CO2还原成甲酸盐并且对于产乙酸菌在CO或CO₂和H₂的自养生长是必需的。

三个基因编码硒和非硒甲酸盐脱氢酶并且存在于自产乙醇梭菌的基因组中(AEI90721、AEI90723、AEI90725；HQ876015、HQ876017、HQ876019)，杨氏梭菌(YP_003779063、YP_003778871、YP_003780168；CLJU_c08930、CLJU_c06990、CLJU_c20040)和拉氏梭菌(AEI90722、AEI90724、AEI90726；HQ876016、HQ876018、HQ876020)(等，2010，2011)。

使用仅仅一个辅助因子，检测对于NADPH而不是NAD的特异性：0.2U/mg，超过非常小的0.03U/mg

但是使用两个辅助因子的组合：NADPH和铁氧还蛋白，检测到显著更高的活性，检测到1.10U/mg，但是用NADH代替NADPH，仅仅0.07。这指示分支NADP甲酸盐脱氢酶的存在，其是之前从未描述的酶。

甲酸盐-氢裂解酶：使用H₂，检测到2.4U/mg的高活性，指示分支NADP甲酸盐脱氢酶可与NADPH分支氢化酶形成甲酸盐-氢复合物。

发现分支NADP甲酸盐脱氢酶的蛋白质编码基因(AEI90721、HQ876015；YP_003778871、CLJU_c08930；AEI90722、HQ876016)和分支NADP仅仅Fe氢化酶的蛋白质编码基因(Seq.ID 9-10；CLJU_c07070，YP_003778879；SeqID 25-26)在一个基因簇中，以及用于具有NADP结合位点的铁硫黄素蛋白、铁硫(FeS)蛋白质和包含硒代半胱氨酸和亚钼嘌呤的甲酸盐脱氢酶的基因(图3)。通过对于两个酶的基因肩并肩位于基因组中并且可形成转录单位的发现反映了功能复合物形成。

之前未描述在从CO₂和H₂至甲酸盐的该方向作用的甲酸盐-氢裂解酶并且对于一氧化碳营养梭菌是新的(图1)。也已经表明了该反应的可逆性，从甲酸盐释放氢和CO₂。该酶的使用使得使用氢以甲酸盐的形式捕获CO₂，其可然后再次释放。利用纯化的酶，已经测量了用于从CO₂+H₂形成甲酸盐的41U/mg的甲酸盐氢裂解酶活性和用于从甲酸盐氢形成的40U/mg的甲酸盐氢裂解酶活性(表4)。

表4：由自产乙醇梭菌甲酸盐氢裂解酶催化的反应

底物	比活性(U/mg)
		H₂+NADP⁺+Fd_ox	32，pH 6.5(29.2，pH 7.5)
H₂+NAD⁺+Fd_ox	＜0.2
		H₂+NADP⁺	1.6
H₂+Fd_ox	＜0.2
		H₂+NAD⁺	＜0.1
NADPH+Fd_red ^2-(H₂形成)	26.5，pH 6(8.7，pH 7.5)
		NADPH(H₂形成)	＜0.1

Fd_red ^2-(H₂形成)	0.9
		甲酸盐+NADP⁺+Fd_ox	15.2，pH 7.5(13，pH 6.5)
甲酸盐+NAD⁺+Fd_ox	0.2
		甲酸盐+NADP⁺	2
甲酸盐+Fd_ox	0.2
		甲酸盐+NAD⁺	＜0.1
CO₂+Fd_red ^2-+NADPH(甲酸盐形成)	7，pH 7.5(见正文)
		CO₂+H₂(甲酸盐形成)	41，pH 7.0(35，pH 7.5)
CO₂+H₂+Fd_ox+NADP⁺(甲酸盐形成)	40
		甲酸盐(H₂形成)	40，pH 6(23，pH 7.5)
H₂+MV	18,000，pH 7.5
		甲酸盐+MV	170
NADPH+MV	27
		NADH+MV	＜0.1

参考表4，在严格厌氧条件在室温下，进行自产乙醇梭菌的甲酸盐氢裂解酶复合物的纯化。遍及整个过程使用厌氧50mM Tris-HCl(pH7.6)，其包含2mM DTT、5μM FAD和5μMFMN(缓冲液A)。用硫酸铵使包含具有约47mg蛋白质ml^-1的细胞质部分的150,000×g上清液分层。通过以30,000×g和4℃离心30min，收集40和55％硫酸铵饱和度部分。沉淀溶解在包含0.8M硫酸铵的7ml缓冲液A中。通过离心去除未溶解的蛋白质之后，上清液上样在用包含0.8M硫酸铵缓冲液A平衡的苯基琼脂糖高效柱上(2.6cm乘12cm)。用逐步硫酸铵梯度(0.80、0.64、0.48、0.32、0.16和0M；缓冲液A中每个100ml)，以5ml min^-1的流速洗脱蛋白质。在0.48M硫酸铵的峰处洗脱了氢化酶活性。浓缩汇集的部分的并且用具有50-kDa-截取膜的Amicon槽脱盐。然后将浓缩物施加在用缓冲液A平衡的Q琼脂糖高效柱(1.6cm乘13cm)上。然后用90ml缓冲液A冲洗柱。用0至1M NaCl线性梯度，以5ml min^-1的流速洗脱蛋白质。以约0.4M NaCl的单峰洗脱恢复氢化酶活性。浓缩该部分，用50-kDa-截取Amicon过滤器脱盐，并且然后在95％N₂/5％H₂的气氛下，储存在-20℃下缓冲液A中，直到使用。

在37℃下100mM磷酸钾中在指示的pH测量活性。当遵照从甲酸盐(甲酸盐氢裂解酶活性)形成H₂时，试验混合物包含100mM Tris-HCl(pH 7.5)(表1)或100mM磷酸钾(如指示的pH)(表3)，2mM DTT和20mM甲酸钠。气相是100％的N₂。以200rpm持续震荡血清瓶子以确保H₂从液相转移至气相。每1min回收气体样品(0.2ml)，并且通过气相色谱分析量化H₂。当测量CO₂用H₂还原成甲酸盐时，试验混合物包含100mM磷酸钾(如指示的终pH)，2mM DTT，和30mM[¹⁴C]K₂CO₃(24,000dpm/μmol)。气相是100％的H₂。以200rpm持续震荡血清瓶子，以确保气相与液相的平衡。在开始与酶反应之后，每1.5min回收100μl液体样品并且添加至包含100μL的150mM乙酸的1.5-ml安全密封微管，以通过酸化终止反应。然后在40℃下孵育200μl混合物10min，以1,400rpm在热混合器(5436型，Eppendorf，德国)中震荡，以去除所有的¹⁴CO₂，留下形成的¹⁴C-甲酸盐。随后，100μL的混合物添加至5ml的Quicksave A闪烁流体(ZinsserAnalytic，Frankfurt，德国)并且在Beckman LS6500液体闪烁计数器(Fullerton，CA，USA)中分析¹⁴C放射活性。当遵循CO₂用还原的铁氧还蛋白和NADPH还原成甲酸盐时，试验混合物包含100mM磷酸钾(如指示的终)、2mM DTT、30mM[¹⁴C]K₂CO₃(24,000dpm/μmol)、1mM NADPH，和还原的铁氧还蛋白-再生系统(10mM丙酮酸盐、0.1mM硫胺素焦磷酸、1mM辅酶A、25μM巴氏芽孢梭菌铁氧还蛋白、1U丙酮酸盐：铁氧还蛋白氧化还原酶，和5U磷酸转乙酰酶)。气相是100％的N₂。以200rpm持续震荡血清瓶子，以确保气相与液相的平衡。在开始与酶反应之后，每1.5min回收100μl液体等分试样，并且分析甲酸盐。当遵循CO₂用还原的铁氧还蛋白和NADPH还原成甲酸盐时，试验混合物包含100mM磷酸钾(如指示的终)、2mM DTT、30mM[¹⁴C]K₂CO₃(24,000dpm/μmol)、1mM NADPH，和还原的铁氧还蛋白-再生系统(10mM丙酮酸盐、0.1mM硫胺素焦磷酸、1mM辅酶A、25μM巴氏芽孢梭菌铁氧还蛋白、1U丙酮酸盐：铁氧还蛋白氧化还原酶，和5U磷酸转乙酰酶)。气相是100％的N₂。以200rpm持续震荡血清瓶子，以确保气相与液相的平衡。在开始与酶反应之后，每1.5min回收100μl液体等分试样，并且如上述分析甲酸盐。根据等(Rapid procedure for purification of ferredoxin fromclostridia udinh polyethyleneimine.FEBS Lett.1978，89：219-222)使用制备来自巴氏芽孢梭菌DSM 525的纯化的铁氧还蛋白(Fd)。一个单位(U)等于每分钟转移2μmol电子。

亚甲基-THF-脱氢酶：该酶催化从5，10-亚甲基四氢叶酸至5，10-亚甲基四氢叶酸的反应并且对于自养生长是必要的。其是Wood-Ljungdahl途径的一部分并且发现是明显NADPH特异性的(用NADPH，1.12U/mg，但是用NADH或铁氧还蛋白，没有可检测的活性)。

已经在自产乙醇梭菌(AEI90753；HQ876031，GI：338225353)，杨氏梭菌(YP_003781891；CLJU_c37630)和拉氏梭菌(AEI90771；HQ876032，GI：338225372)中鉴定了该酶和各自基因，作为双功能亚甲基-四氢叶酸脱氢酶/甲酰-四氢叶酸环化水解酶。

该酶先前显示在热醋穆尔氏菌中是NADPH-依赖性的，而在该生物体中的其他反应是NADH或铁氧还蛋白依赖性的(Huang等，2012)。

对于体外试验，用辅助因子(仅仅用合成染料)未检测到亚甲基-THF还原酶可检测的活性。但是，发明人认为该结果可解释为酶需要未知的结合位点，如另外的酶之前未其他酶比如杨氏梭菌或伍氏乙酸杆菌所建议的(等，2010；Poehlein等，2012)。该结合机制可以是NADPH依赖性的。发现CO脱氢酶反应是铁氧还蛋白依赖性的，如先前为该类的酶所报道。

从一氧化碳营养梭菌自产乙醇梭菌中Wood-Ljungdahl途径的所有五个测试的氧化还原酶反应，令人吃惊地没有发现NADH依赖性的，而是发现大部分是NADPH依赖性的。这与例如糖利用细菌，如大肠杆菌(图2)的糖酵解完全相反。因此存在用于大肠杆菌的策略，使用NADH依赖性反应和绕过NADPH依赖性反应(其产生产物产生的还原和需要广泛的修饰)在一氧化碳营养梭菌中是非产生性的。如本文所描述的本发明提供了通过优选在一氧化碳营养梭菌中选择NADPH依赖性反应克服此的策略，以实现代谢工程化的最大的产物产率。NADPH依赖性反应的能力和潜能以及与糖利用大肠杆菌的差异显示在实施例3中。类似地，该策略可用于异源途径，以实现最大的产物产率和通量。

实施例2

使用实时定量的PCR分析超过200个基因自产乙醇梭菌基因的相对表达，以确定具有最高表达的基因。

发酵

在1.5L生物反应器中，37℃下进行用自产乙醇梭菌DSM23693的发酵，并且包含CO的钢厂气体作为唯一的能源和碳源，如下所描述。每升包含下述的限定的培养基用于培养物生长：MgCl、CaCl₂(0.5mM)、KCl(2mM)、H₃PO₄(5mM)、Fe(100μM)、Ni、Zn(5μM)、Mn、B、W、Mo、Se(2μM)。将培养基转移至生物反应器并且在121℃下高压灭菌45分钟。高压灭菌之后，培养基补充硫胺素、泛酸盐(0.05mg)、生物素(0.02mg)并且用3mM半胱氨酸-HCl还原。为了实现厌氧反应，器容器用通过0.2μm过滤器的氮吹洗。然后接种，将气体切换至包含CO的钢厂气体，持续进料至反应器。气流初始设置为80ml/min，在中间指数期增加至200ml/min，同时搅拌从200rpm增加至350。将Na₂S以0.25ml/hr进料至生物反应器。一旦OD600达到0.5，生物反应器以1.0ml/min的速度(稀释速度0.96d^-1)切换至连续模式。对培养基取样，以测量生物质和代谢分子并且常规进行流入和流出气体的顶部空间分析。

qRT-PCR

使用适当的引物进行用超过200个基因的qRT-PCR研究。在整个生长期间(4天)，如上述从典型的1.5L流加发酵实验取样。通过离心(6,000x g，5min，4℃)收获样品并且将细胞小球迅速冷冻在液氮中并且储存在-80℃下直到使用。通过在冰上融解细胞小球并且将其悬浮在100μL的溶菌酶溶液(50,000U溶菌酶，0.5μL 10％SDS，10mM Tris-HCl，0.1mMEDTA；pH 8)中分离RNA。5min之后，添加350μL的裂解缓冲液(包含10μL的2-巯基乙醇)。通过五次经过18-21规格针，机械破坏细胞悬液。然后使用PureLink^TM RNA Mini试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA 92008，USA)分离RNA并且在100μL的无核糖核酸酶的水中洗脱。经PCR和凝胶电泳检查RNA并且分光光度量化，以及如果需要用DNase I(Roche)处理。使用SuperScript III逆转录酶试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA 92008，USA)进行可逆转录步骤。在具有25ng的cDNA模板、67nM每个引物和1x iQ SYBR Green Supermix(Bio-RadLabratories，Hercules，CA 94547，USA)的15μL反应体积中，在MyiQ单色实时PCR探测系统(Bio-Rad Labratories，Hercules，CA 94547，USA)中进行RT-PCR反应。鸟苷酸激酶(GnK)和甲酸盐四氢叶酸连接酶(FoT4L)用作管家基因并且包括非模板对照。反应条件是95℃，3min，随后40个循环的95℃，15s，55℃，15s和72℃，30s。在完成qRT PCR(38个循环的58℃至95℃，以1℃/s)立即进行熔解曲线分析，用于探测引物二聚化或扩增的其他人工制品。以阈值循环(C_t)值基于PCR基线减去曲线拟合方法计算有关表达水平的数据，如通过BioradiQ5 2.0软件计算。使用Relative表达软件工具2008V2.0.7进一步分析原始Ct值。

结果

当自养生长时，一氧化碳营养微生物吸收气体，同时用作碳源和能源。图4显示自产乙醇梭菌中表达的基因的相对表达。鉴定了三个酶参与自养生长和气体吸收，并且发明人发现它们是微生物中最高表达的基因。如在实施例1中所显示，发现这些相同的酶展示相比NADH高或独特的NADPH利用。NADH-依赖性酶的表达以相当更低的水平。假设这些基因编码的酶是NADPH依赖性的，这指示NADPH库是非常重要的(与糖利用生物体，如大肠杆菌相对照)并且NADPH依赖性反应不是瓶颈。对于一氧化碳营养梭菌细胞中的工程化途径，这是大的优势，因为可能选择NADPH依赖性反应，并且这些反应不必被避免或绕过。另外，NADPH库是更大的，从而性能不下降并且过度的工程化是不必要的。

实施例3

伯醇-仲醇脱氢酶(ADH)是严格NADPH-依赖性酶，其将丙酮转化成异丙醇。使用酶试验用来自包含丙酮以及0.2mM的NADH或NADPH(Ismaiel，Zhu，Colby，&Chen，1993)的发酵液的粗提取物制品表明其活性。

进行用自产乙醇梭菌的反应器研究，以表明丙酮至异丙醇以高速度有效的NADPH依赖性转化。在具有稳定生物质和代谢物生产的连续模式中，丙酮添加至生物反应器和进料培养基。丙酮掺入反应器至然后通过连续进料获得的某些水平。起初，添加1g/L的丙酮，一旦代谢物浓度稳定，浓度增加至5g/L、15g/l，并且在第二实验中增加至20g/L。

材料和方法

代谢分子的分析

使用配备在35℃下操作的RID(折射率检测器)和保持在下的60℃的Alltech IOA-2000有机酸柱(150x 6.5mm，颗粒大小5μm)的Agilent1100Series HPLC系统进行丙酮、异丙醇和其他代谢分子的HPLC分析。使用稍微酸化的水(0.005M H₂SO₄)，作为流速为0.7ml/min的流动相。为了去除蛋白质和其他细胞残渣，400μl样品混合100μL的2％(w/v)5-Sulfo水杨酸并且以14,000x g离心3min，以分开沉淀残渣。然后将10μL的上清液注入HPLC用于分析。

使用配备Supelco PDMS 1001cm纤维、Alltech EC-1000(30m x0.25mm x 0.25μm)柱，和火焰电离检测器(FID)的Agilent 6890N顶部空间GC进行丙酮、异丙醇和其他代谢分子的GC分析。5ml样品转移至Hungate管，在水浴中加热至40℃并且暴露至纤维精确的5min。注射器保持在250℃并且以1ml/min恒定流的氦用作载气。炉程序是40℃，5min，随后以10℃/min升高至多200℃。以50℃/min的速度温度进一步升高至220℃，随后保持该温度5min，然后以50℃/min的速度温度下降至40℃并且保持最后1min。FID保持在250℃，用40ml/min氢、450ml/min空气和15ml/min氮作为组成气体。

顶部空间分析

在具有两个安装的通道的Varian CP-4900micro GC上进行测量。通道1是以70℃、200kPa氩运行并且逆流时间为4.2s的10m Mol-筛柱，而通道2是在90℃下，150kPa氦运行并且没有逆流的10m PPQ。用于两个通道的注射器温度是70℃。运行时间设置为120s，但是所有感兴趣的峰通常在100s之前洗脱。

收获细胞

来自1.5L生物反应器、利用CO和H2，光密度(OD)为4并且产生乙醇、乙酸盐和2，3-丁二醇的细胞经管缓慢转移至用橡胶塞密封和初始填充N₂的2升瓶子。通过穿过塞子的针释放超压。瓶子保持在低于0℃的温度并且缓慢进行培养物的转移，以便将培养物在转移之后尽可能快速冷却至0℃。当转移结束时，将瓶子放入厌氧幕中。使管离心，然后轻轻倒出上清液并且用滤纸去除残留液体。小球悬浮在50mM包含10mM二硫苏糖醇的缺氧磷酸钾中，pH7。混合数个瓶子的悬液、离心、干燥、称重并且储存在干冰上。

酶试验

根据Huang(Huang等，2012)和Ismaiel(Ismaiel等，1993)描述的方法进行酶试验。

结果

显示丙酮还原成异丙醇是严格NADPH依赖性仲醇脱氢酶的功能，如图5中所显示。仅仅用NADPH而不是NADH测量到活性，表明该酶是严格NADPH依赖性的。

为了表明在CO上自养生长期间NADPH库的容量，丙酮连续进料至在丙酮上生长的反应器。发现丙酮经该NADPH依赖性仲醇脱氢酶高速有效转化成异丙醇。图6显示丙酮在引入生物反应器之后转化成异丙醇。即使以20g/L的高浓度，培养物将所有丙酮酮转化异丙醇，表明NADPH库是足够的即使在高速下足够维持这。

该实验表明一氧化碳营养梭菌微生物具有用于驱动维持的NADPH-依赖性反应的容量。在大肠杆菌中，NADPH容量相当低，如在糠醛研究中显示(E N Miller等，2009；ElliotN Miller等，2009)。

实施例4

存在提供NADH和NADPH依赖性的酶选择的数个途径，例如，丁醇途径。迄今为止，大部分工程化努力已经聚焦使用NADH依赖性反应，而避免NADPH依赖性反应。这限制途径的选择并且忽略NADPH提供的另外的驱动力。

为丁醇生物合成设计的新的、完全NADPH依赖性的途径由下述组成：硫解酶(EC2.3.1.9；btkB，例如来自Ralstonia eutropha：YP_725948.1，Gene ID：4248815；phaA，例如来自Ralstonia eutropha：YP_725941.1，Gene ID：4249783)，NADPH依赖性R-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(EC：1.1.1.36；phaB GO：0018454；例如来自Ralstonia eutropha：YP_725942.1，Gene ID：4249784)和3-羟基丁酰-CoA dehydrotase(EC 4.2.1.119；phaJ例如来自点状产气单胞菌：BAA21816.1)，NADPH依赖性巴豆酰-CoA羧化酶/还原酶(EC 1.3.1.86；ccr例如来自山丘链霉菌；EC 1.3.1.85；ccr_Rs，例如来自类球红细菌：YP_354044.1，Gene ID：3720751)和对于丁酰-CoA的NADPH依赖性乙基丙二酰-CoA脱羧酶(EC 4.1.1.41；例如来自Musmusculus：NP_001103665.1，Gene ID：52665)，其然后可直接通过醛/醇脱氢酶或经丁酸盐经磷酸转乙酰酶和丁酸激酶转化成丁醇，可使用醛铁氧还蛋白氧化还原酶和醇脱氢酶.，NADPH依赖性的丁酰-CoA还原酶(EC 1.1.2.10；bldh例如来自Clostridiumsaccharoperbutylacetonicm N1-4：AGF59413.1，Gene ID：Cspa_c56880)和醛还原酶(EC1.1.1.1；adhA例如来自Synechocystis sp。PCC 6803：NP_443028.1，Gene ID：951896)(图7)。

两个分子的乙酰辅酶A通过来自Ralstonia eutropha的phaABJ编码的三个酶转化成巴豆酰-CoA。两个乙酰辅酶A通过硫解酶缩合成乙酰乙酰-CoA，随后通过NADPH特异性R-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶还原成R-3羟基丁酰-CoA。R-3-羟基丁酰-CoA然后通过R-3-羟基丁酰-CoA脱水酶转化成巴豆酰-CoA。

来自类球红细菌(Erb等，2007)的组合巴豆酰-CoA羧化酶/还原酶和来自Musmusculus(小鼠)(Linster等，2011)的乙基丙二酰-CoA脱羧酶首先催化巴豆酰-CoA与二氧化碳的缩合，以消耗NADPH形成乙基丙二酰-CoA，随后乙基丙二酰-CoA脱羧成丁酰-CoA。

来自Clostridium saccharoperbutylacetonicum NI-4的丁酰-CoA还原酶切割来自丁酰-CoA的CoA部分形成丁醛基。酶被推测是NADPH依赖性的，因为来自Clostridiumbeijerinkii NRRL B592的同系物用NADPH最有活性(Yan和Chen，1990)。

蓝细菌Synechocystis sp。PCC 6803的醛还原酶对中等链长度和芳族醛至醇的NADPH还原具有强的偏好(Vidal等，2009)。对于丁醛基还原成丁醇的偏好相对于丁醇的氧化是251∶1利于还原。

实施例5

在葡萄糖糖上生长的大肠杆菌细胞中，已经表明NADH库超过NADPH库20倍(B.D.Bennett等，2009)，其限制尤其在发酵过程中许多生物合成反应和生物转化(RPoulsen等，2005)。一氧化碳营养产乙酸梭菌中测量NADPH和NADH库。

对来自用自产乙醇梭菌如实施例2描述的持续发酵的样品取样并且分析。通过离心(13000rpm，在-10℃下5分钟)使5mL培养物样品快速成球，去除上清液，细胞小球快速冷冻在液氮中并且然后储存在-80℃下直到分析。对微生物小球进行代谢物分析，如(B。D。Bennett等，2009；Yang等，Clostridium thermocellum ATCC27405transcriptomic，metabolomic and proteomic profiles after ethanol stress.BMC Genomics2012，13：336；Marcellin E，Quantitative analysis of intracellular sugar phosphates andsugar nucleotides in encapsulated streptococci using HPAEC-PAD，Biotechnol J2009，4，58-63)描述。

与大肠杆菌相对照，在自产乙醇梭菌中，发现NADPH库大于NADH库(图77)，NADPH+H⁺和NADP与NADH+H⁺和NADH的2.2∶1，分别NADPH+H⁺与NADH+H⁺36.8∶1表明以CO作为底物的产乙酸一氧化碳营养型梭菌的NADPH的驱动力。

标准法律段落

本文参考某些优选的实施方式已经描述了本发明，以便确保读者实施本发明而不过多的实验。但是，本领域技术人员容易认识许多组分和参数可被改变或修饰至某些程度或替换已知的等价物而不背离本发明的精神。应当认识到，这样的修饰和等价物并入本文如同单独阐释。提供题目、标题等，以加强读者对该文档的理解，并且不应解释为限制本发明的范围。

如果存在，上面和下面引用的所有申请、专利和出版物通过引用并入。但是，本说明书中对任何申请、专利和出版物的参考不能并且不应解释为、承认或任何形式的提示它们构成现有技术或形成任何国家的公知常识。

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Claims

1.一种重组一氧化碳营养梭菌微生物，其适于表达至少一种外源烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)-依赖性酶。

2.权利要求1所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述NADPH-依赖性酶选自氢化酶、甲酸盐脱氢酶、亚甲基-四氢叶酸(THF)-脱氢酶、羟甲基戊二酸(HMG)-CoA还原酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、反式-2-烯酰-CoA还原酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)共依赖酶或NADH/NADPH分支酶。

3.权利要求2所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述氢化酶是分支烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)仅仅Fe氢化酶。

4.权利要求2所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述甲酸盐脱氢酶是分支NADP甲酸盐脱氢酶。

5.权利要求2所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述乙酰乙酰-CoA还原酶是phaB(EC 1.1.1.36)。

6.权利要求5所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述微生物还包括外源3-羟基丁酰-CoA脱水酶是phaJ(EC 4.2.1.119)。

7.权利要求5所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述微生物还包括外源NADH依赖性3-羟基丁酰-CoA脱氢酶是hbd(EC 1.1.1.157)。

8.权利要求2所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述反式-2-烯酰-CoA还原酶是巴豆酰-CoA还原酶。

9.权利要求8所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述巴豆酰-CoA还原酶是ccr(EC 1.3.1.86)或ccr_Rs(EC 1.3.1.85)。

10.权利要求9所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述微生物还包括外源NADH依赖性巴豆酰-CoA还原酶ter(EC 1.3.1.44)。

11.权利要求1所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中微生物的NADPH的利用相对于亲代微生物增加。

12.权利要求1所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中微生物的至少一种发酵产物的生产相对于亲代微生物增加。

13.权利要求1所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述NADPH依赖性酶的NADH-依赖性同种型相对于亲代微生物减弱或敲除。

14.权利要求1所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述微生物源自选自下述的亲代微生物：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、臭味梭菌、乙酸梭菌、甲酸乙酸梭菌和大梭菌。

15.权利要求14所述的重组一氧化碳营养梭菌微生物，其中所述自产乙醇梭菌是自产乙醇梭菌DSM23693。