JP2022046478A5 - - Google Patents
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Claims (28)
- ヌクレオチド；
前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子；および
前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグ、
を含む標識ヌクレオチドであって、
前記レドックス活性電荷タグは、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元され、
前記連結分子は、前記レドックス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む、標識ヌクレオチド。 - 前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項１に記載の標識ヌクレオチド。
- 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領域と相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む、請求項１または２に記載の標識ヌクレオチド。
- 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合した前記テザー上の前記アクセプター領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは、
ｉ）１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列、または１ペプチド核酸～１０ペプチド核酸を含有するペプチド核酸配列；または
ｉｉ）互いに対する親和性または疎水性ポリマーに対する親和性を有するペプチドを含む非核酸部分
を含む、請求項３に記載の標識ヌクレオチド。 - 前記特異性領域は、前記ヌクレオチド配列の両側に隣接するイノシンを含む、請求項４に記載の標識ヌクレオチド。
- 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ
前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、１～１００の電荷を含む、請求項１～５の何れかに記載の標識ヌクレオチド。 - ポリメラーゼがつながった電気伝導性チャネルに鋳型核酸を導入するステップ；
前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチドを導入するステップであって、前記標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチド、前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子、およびそれに付着したヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含み、それにより、前記標識ヌクレオチドの１つが前記ポリメラーゼと会合するステップ；
前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合している間に、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間のレドックス反応を開始するステップ；および
前記レドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ
を含む核酸のシークエンシング方法であって、
前記連結分子は、前記レドックス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む、核酸のシークエンシング方法。 - 前記レドックス反応を開始するステップは、前記電気伝導性チャネルに充電電圧を印加することを含み；かつ
前記応答を検出するステップは、前記電気伝導性チャネルに読み取り電圧を印加することを含む、請求項７に記載の方法。 - 以下のステップを更に含む、請求項７または８に記載の方法：
前記電気伝導性チャネルの前記応答を、前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つの前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付けるステップ；および
前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記会合している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドを識別するステップ。 - 前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つから、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記会合している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な新生鎖に取り込まれるステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
- 請求項１０に記載の方法であって、
前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合するステップ、前記レドックス反応を開始するステップ、前記検出するステップ、前記関連付けるステップ、および前記識別するステップは合わせて、シークエンシングサイクルであり、
前記方法は、以下によって、次のシークエンシングサイクルを行うステップを更に含む：
前記標識ヌクレオチドの次の１つを前記ポリメラーゼと会合させること；
前記標識ヌクレオチドの前記次の１つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間の他のレドックス反応を開始すること；
前記他のレドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの他の応答を検出すること；
前記電気伝導性チャネルの前記他の応答を、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付けること；および
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記標識ヌクレオチドの前記次の１つの前記ヌクレオチドを識別すること。 - 以下のステップを更に含む、請求項１１に記載の方法：
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記標識ヌクレオチドの前記次の１つの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な前記新生鎖に取り込まれるステップ；および
前記シークエンシングサイクルを繰り返すステップ。 - 前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項７～１２の何れかに記載の方法。
- 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ
前記レドックス活性電荷タグは、変更された電荷状態で、１～１００の電荷を含む、請求項７～１３の何れかに記載の方法。 - 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領域と相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む、請求項１４に記載の方法。
- 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合した前記テザー上の前記アクセプター領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは、
ｉ）１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列、または１ペプチド核酸～１０ペプチド核酸を含有するペプチド核酸配列；または
ｉｉ）互いに対する親和性または疎水性ポリマーに対する親和性を有するペプチドを含む非核酸部分
を含む、請求項１５に記載の方法。 - 前記特異性領域は、前記ヌクレオチド配列の両側に隣接するイノシンを含む、請求項７～１６の何れかに記載の方法。
- 前記標識ヌクレオチドは以下を含む、請求項７～１７の何れかに記載の方法：
前記ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第１標識ヌクレオチド；
前記ヌクレオチドとしてのデオキシグアノシンポリホスフェートおよび第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第２標識ヌクレオチド;
前記ヌクレオチドとしてのデオキシシチジンポリホスフェートおよび第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第３標識ヌクレオチド；ならびに
前記ヌクレオチドとしてのデオキシチミジンポリホスフェートおよび第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第４標識ヌクレオチド；
ここで、前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。 - 前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち２つは、変更された電荷状態で、正に帯電していて；かつ前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち他の２つは、前記変更された電荷状態で、負に帯電している、請求項１８に記載の方法。
- 前記標識ヌクレオチドは、低塩緩衝液中に存在する、請求項７～１９の何れかに記載の方法。
- 前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項７～２０の何れかに記載の方法。
- 電気伝導性チャネルであって、それに付着したテザーを有する電気伝導性チャネルと、
前記テザーを介して、前記電気伝導性チャネルに付着したポリメラーゼと、
を含むフローセル；
前記フローセルに導入される鋳型核酸；
前記フローセルに導入される試薬であって、前記試薬は標識ヌクレオチドを含み、前記標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、
ヌクレオチドと、
前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子と、
電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグと、
を含む、試薬；および
レドックス反応が前記レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間で起こるとき、前記電気伝導性チャネルからの応答を検出する検出器
を備えるキットであって、
前記連結分子は、前記レドックス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む、キット。 - 前記レドックス活性電荷タグは、フェロセン、亜鉛テトラベンゾポルフィリン、コバルトフタロシアニン、トリス－（２，２’－ビピリミジン）ルテニウム、４－フェロセニルベンジルアルコール、５－（４－ヒドロキシメチルフェニル）－１０，１５，２０－トリメシチルポルフィナト亜鉛（ＩＩ）、およびレドックス活性カリックスアレーンからなる群から選択される、請求項２２に記載のキット。
- 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ
前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、１～１００の電荷を含む、請求項２２または２３に記載のキット。 - 前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項２２～２４の何れかに記載のキット。
- 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領域と相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む、請求項２２～２５の何れかに記載のキット。
- 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合した前記テザー上の前記アクセプター領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは、
ｉ）１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列、または１ペプチド核酸～１０ペプチド核酸を含有するペプチド核酸配列；または
ｉｉ）互いに対する親和性または疎水性ポリマーに対する親和性を有するペプチドを含む非核酸部分
を含む、請求項２６に記載のキット。 - 前記特異性領域は、前記ヌクレオチド配列の両側に隣接するイノシンを含む、請求項２７に記載のキット。
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