JP6987898B2 - 標識ヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents
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Description
式中、Fe2+は酸化によりFe3+になることができ、したがって各「Fe」に正電荷が導入される。
式中、Rは、C2H5、C6H13、またはC12H25である。Zn1+は酸化によりZn2+になることができ、したがって正電荷が導入される。
および
上記のいずれも溶液中において正味中性(net neutral)の分子である。酸化されると、Co2+はCo3+になり、各「Co」に正電荷が導入される(例えば、最初の構造には1つの正電荷、2番目の構造には5つの正電荷)。−3〜+5の範囲の酸化状態を有する他のコバルト含有化合物が知られており、負に帯電可能なレドックス活性電荷タグ18または正に帯電可能なレドックス活性電荷タグ18として使用され得る。
式中、Ru2+は酸化によりRu3+になることができ、したがって正電荷が導入される。
式中、Zn2+は還元によりZn1+になることができ、したがって負電荷が導入される。
Claims (24)
- ヌクレオチド;
前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子;および
前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグであって、前記レドックス活性電荷タグは、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、レドックス活性電荷タグ
を含み、
前記連結分子は、アルキル鎖、アミド基、ポリ(エチレングリコール)鎖、およびトリアゾールを含む、標識ヌクレオチド。 - 前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項1に記載の標識ヌクレオチド。
- 前記連結分子は、前記レドックス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む、請求項1または2に記載の標識ヌクレオチド。
- 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領域と相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む、請求項3に記載の標識ヌクレオチド。
- 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合した前記テザー上の前記アクセプター領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは1ヌクレオチド〜10ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列、または1ペプチド核酸〜10ペプチド核酸を含有するペプチド核酸配列を含む、請求項4に記載の標識ヌクレオチド。
- 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含み;かつ
前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、1〜100の電荷を含む、請求項1〜5の何れかに記載の標識ヌクレオチド。 - 前記アルキル鎖は、少なくとも6個の炭素原子を含む、請求項1〜6の何れかに記載の標識ヌクレオチド。
- 前記ポリ(エチレングリコール)鎖は、少なくとも3個のエチレングリコール単位を含む、請求項1〜7の何れかに記載の標識ヌクレオチド。
- 以下のステップを含む、核酸のシークエンシング方法:
ポリメラーゼがつながった電気伝導性チャネルに鋳型核酸を導入するステップ;
前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチドを導入するステップであって、前記標識ヌクレオチドの少なくとも1つは、ヌクレオチド、前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子およびそれに付着したヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含み、それにより、前記標識ヌクレオチドの1つが前記ポリメラーゼと会合し、前記連結分子は、アルキル鎖、アミド基、ポリ(エチレングリコール)鎖、およびトリアゾールを含む、ステップ;
前記標識ヌクレオチドの前記1つが会合している間に、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間のレドックス反応を開始するステップ;および
前記レドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ。 - 前記レドックス反応を開始するステップは、前記電気伝導性チャネルに充電電圧を印加することを含み;かつ
前記応答を検出するステップは、前記電気伝導性チャネルに読み取り電圧を印加することを含む、請求項9に記載の方法。 - 以下のステップを更に含む、請求項9または10に記載の方法:
前記電気伝導性チャネルの前記応答を、前記標識ヌクレオチドの前記会合している1つの前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付けるステップ;および
前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記会合している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドを識別するステップ。 - 前記標識ヌクレオチドの前記会合している1つから、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記会合している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な新生鎖に取り込まれるステップを更に含む、請求項11に記載の方法。
- 請求項12に記載の方法であって、
前記標識ヌクレオチドの前記1つが会合するステップ、前記レドックス反応を開始するステップ、前記検出するステップ、前記関連付けるステップ、および前記識別するステップは合わせて、シークエンシングサイクルであり、
前記方法は、以下によって、次のシークエンシングサイクルを行うステップを更に含む:
前記標識ヌクレオチドの次の1つを前記ポリメラーゼと会合させること;
前記標識ヌクレオチドの前記次の1つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間の他のレドックス反応を開始すること;
前記他のレドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの他の応答を検出すること;
前記電気伝導性チャネルの前記他の応答を、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付けること;および
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記標識ヌクレオチドの前記次の1つの前記ヌクレオチドを識別すること。 - 以下のステップを更に含む、請求項13に記載の方法:
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記標識ヌクレオチドの前記次の1つの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な前記新生鎖に取り込まれるステップ;および
前記シークエンシングサイクルを繰り返すステップ。 - 前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項9〜14の何れかに記載の方法。
- 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含み;かつ
前記レドックス活性電荷タグは、変更された電荷状態で、1〜100の電荷を含む、請求項9〜15の何れかに記載の方法。 - 前記標識ヌクレオチドは以下を含む、請求項9〜16の何れかに記載の方法:
前記ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第1標識ヌクレオチド;
前記ヌクレオチドとしてのデオキシグアノシンポリホスフェートおよび第2ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第2標識ヌクレオチド;
前記ヌクレオチドとしてのデオキシシチジンポリホスフェートおよび第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第3標識ヌクレオチド;ならびに
前記ヌクレオチドとしてのデオキシチミジンポリホスフェートおよび第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第4標識ヌクレオチド;
ここで、前記第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第2ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。 - 前記第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第2ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち2つは、変更された電荷状態で、正に帯電していて;かつ前記第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第2ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち他の2つは、前記変更された電荷状態で、負に帯電している、請求項17に記載の方法。
- 前記標識ヌクレオチドは、低塩緩衝液中に存在する、請求項9〜18の何れかに記載の方法。
- 前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項9〜19の何れかに記載の方法。
- 以下を備える、キット:
電気伝導性チャネルであって、それに付着したテザーを有する電気伝導性チャネルと、
前記テザーを介して、前記電気伝導性チャネルに付着したポリメラーゼと、
を含むフローセル;
前記フローセルに導入される鋳型核酸;
前記フローセルに導入される試薬であって、前記試薬は標識ヌクレオチドを含み、前記標識ヌクレオチドの少なくとも1つは、
ヌクレオチドと、
前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子であって、前記連結分子は、アルキル鎖、アミド基、ポリ(エチレングリコール)鎖、およびトリアゾールを含む、連結分子と、
電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグと、
を含む、試薬;および
レドックス反応が前記レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間で起こるとき、前記電気伝導性チャネルからの応答を検出する検出器。 - 前記レドックス活性電荷タグは、フェロセン、亜鉛テトラベンゾポルフィリン、コバルトフタロシアニン、トリス−(2,2’−ビピリミジン)ルテニウム、4−フェロセニルベンジルアルコール、5−(4−ヒドロキシメチルフェニル)−10,15,20−トリメシチルポルフィナト亜鉛(II)、およびレドックス活性カリックスアレーンからなる群から選択される、請求項21に記載のキット。
- 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含み;かつ
前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、1〜100の電荷を含む、請求項21または22に記載のキット。 - 前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項21〜23の何れかに記載のキット。
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