BR112019025493A2 - nucleotídeos marcados e seus usos - Google Patents

Abstract

  Um nucleotídeo marcado inclui um nucleotídeo, uma molécula de ligação acoplada a um grupo fosfato do nucleotídeo e um marcador de carga redox-ativo conectado à molécula de ligação. O marcador de carga redox-ativo deve ser oxidado ou reduzido por um canal eletricamente condutor quando mantido na proximidade de uma zona de detecção do canal eletricamente condutor.

Description

NUCLEOTÍDEOS MARCADOS E SEUS USOS REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano Número de Série US 62/710.465, depositado em 16 de fevereiro, 2018, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Vários protocolos de pesquisa biológica ou química envolvem a execução de um grande número de reações controladas em superfícies de apoio ou locais no interior das câmaras de reação pré-definidas. As reações designadas podem então ser observadas ou detectadas e análise subsequente pode ajudar a identificar ou revelar propriedades dos produtos químicos envolvidos na reação. Em alguns exemplos, as reações controladas geram fluorescência, e, assim, um sistema ótico pode ser usado para a detecção. Em outros exemplos, as reações controladas alteram a carga, condutividade, ou alguma outra propriedade elétrica, e, assim, um sistema eletrônico pode ser usado para a detecção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0003] Um primeiro aspecto aqui descrito é um nucleotídeo marcado. Números 1 - 6 referem-se a este primeiro aspecto.

[0004] 1. Em um exemplo, o nucleotídeo marcado compreende um nucleotídeo; uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato do nucleotídeo; e um marcador de carga redox-ativo ligado à molécula de ligação, o marcador de carga redox-ativo a ser oxidado ou reduzido por um canal condutor de eletricidade, quando mantido na proximidade de uma zona de detecção do canal condutor de eletricidade.

[0005] 2. No exemplo (1) do nucleotídeo marcado, o marcador de carga redox-ativo inclui um átomo de metal de coordenada que é submetido a uma reação redox.

[0006] 3. No exemplo (1) ou (2), do nucleotídeo marcado, a molécula de ligação compreende uma região especificidade anexado ao marcador de carga redox-ativo.

[0007] No exemplo 4. (3), a região de especificidade é para interagir com uma região aceitadora em um tirante ligado ao canal condutor de eletricidade, e a região de especificidade inclui um marcador de afinidade.

[0008] No exemplo 5. (4), a região de especificidade é para hibridar com a região do aceitador no tirante ligado ao canal condutor da eletricidade, e o marcador de afinidade compreende uma sequência de nucleotídeos incluindo uma de cerca do nucleotídeo até cerca de dez ou nucleotídeos uma sequência de ácido nucleico de peptídeo incluindo desde cerca de ido nucleico um peptídeo de cerca de ácidos nucleicos de peptídeos de dez.

[0009] 6. Em qualquer um dos exemplos (1) a (5) do nucleotídeo marcado, o marcador de carga redox-ativo inclui 10 cargas ou menos em um estado não-oxidada ou não-reduzidas; e a marcador de carga redox-ativo inclui de cerca de uma carga de cerca de 100 encargos em um estado oxidado ou reduzido.

[0010] É para ser entendido que quaisquer características do nucleotídeo marcado aqui revelados, incluindo os exemplos (1) a (6), podem ser combinados em conjunto em qualquer forma e / ou configuração desejável.

[0011] Um segundo aspecto aqui descrito é um método. Números 7 - 18 referem-se a este segundo aspecto.

[0012] 7. Em um exemplo, o método compreende a introdução de um ácido nucleico molde para um canal eletricamente condutor tendo uma polimerase amarrada ao mesmo; introdução de nucleotídeos marcados ao canal eletricamente condutor, pelo menos um dos nucleotídeos marcados, incluindo um nucleotídeo e um marcador de carga redox-ativo a ele ligado específica de nucleotídeo, em que um dos nucleotídeos marcados associa-se com a polimerase; enquanto que a um dos nucleotídeos marcados está associado, iniciando uma reação redox entre o marcador de carga redox- ativo específico do nucleotídeo e o canal condutor de eletricidade para alterar um estado de carga do marcador de carga redox-ativo específico do nucleotídeo; e, em resposta à reação redox, detectar uma resposta do canal condutor de eletricidade.

[0013] 8. No exemplo (7) do processo, iniciando a reação redox envolve a aplicação de uma voltagem de carregamento para o canal condutor de eletricidade; e detectar a resposta do canal condutor eléctrico envolve a aplicação de uma tensão de leitura para o canal condutor de eletricidade.

[0014] 9. Um exemplo do método (7) ou (8) compreende, ainda, que associam a resposta do canal condutor de eletricidade com o marcador de carga redox-ativo específica de nucleotídeo de um associado dos nucleotídeos marcados; e com base no específicidade de nucleotídeos marcador de carga redox-ativo , identificando as sequências de nucleotídeos do nucleotídeo marcado associado.

[0015] O exemplo 10. (9) podem também ainda compreender a clivagem do marcador de carga específica do nucleotídeo redox-ativo a partir do um associado dos nucleotídeos marcados, pelo que as sequências de nucleotídeos do nucleotídeo marcado associado é incorporado numa cadeia complementar nascente para o molde de ácido nucleico.

[0016] No exemplo 11. (10), a associar por um dos nucleotídeos marcados, o início da reação redox, a detecção, a associando, e a identificação são em conjunto um ciclo de sequenciamento; e o método compreende ainda a realização de um novo ciclo de sequenciamento, permitindo que um lado de um dos nucleotídeos marcados ao associado com a polimerase; enquanto o próximo dos nucleotídeos marcados está associado, iniciar outra reação redox entre outro marcador de carga redox-ativo específico do nucleotídeo e o canal condutor de eletricidade para alterar um estado de carga da outra marcador com carga específica de nucleotídeo redox-ativo; em resposta ao outro reação redox, detectando uma outra resposta do canal condutor de eletricidade; associando a outra resposta do canal condutor de eletricidade com o outro marcador de carga específica de nucleotídeo redox-ativo; e com base no outro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeos, para identificar o nucleotídeo do próximo um dos nucleotídeos marcados.

[0017] O exemplo 12. (11) pode também compreender ainda clivar o outro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo do próximo um dos nucleotídeos marcados, pelo que as sequências de nucleotídeos do próximo um do que os nucleotídeos marcados são incorporados no nascente cadeia complementar ao ácido nucleico modelo; e repetir o ciclo de sequenciamento.

[0018] 13. Em qualquer um dos exemplos (7) a (12) do método, o marcador de carga redox-ativo inclui um átomo de coordenada de metal que é submetida a uma reação redox.

[0019] 14. Em qualquer um dos exemplos (7) a (13) do método, o marcador de carga redox-ativo inclui 10 cargas ou menos em um estado não-oxidada ou não-reduzidas; e o marcador de carga redox-ativo inclui de cerca de uma carga de cerca de 100 encargos em um estado de carga alterada.

[0020] 15. Em qualquer um dos exemplos (7) a (14) do método, o marcador de nucleotídeos inclui um nucleotídeo marcado primeiro incluindo polifosfato desoxiadenosina como as sequências de nucleotídeos e um primeiro marcador de carga redox-ativo específico do nucleotídeo; um segundo nucleotídeo marcado incluindo polifosfato desoxiguanosina como as sequências de nucleotídeos e um marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeos segundo; um terceiro nucleotídeo marcado incluindo polifosfato de desoxicitidina como as sequências de nucleotídeos e um terceiro marcador de carga de nucleotídeos específicos de redox-ativo carga; e um quarto nucleotídeo marcado incluindo polifosfato desoxitimidina como as sequências de nucleotídeos e um quarto marcador de carga redox-ativo específico do nucleotídeo; e os primeiro, segundo, terceiro, e quarto marcadores de carga redox-ativo específicos de nucleotídeos são diferentes uns dos outros.

[0021] No exemplo 16. (15), dois dos primeiro, segundo, terceiro, e quarto marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeos são carregados positivamente em um estado de carga alterada, e em que o outro dois do primeiro, segundo, terceiro e quarto marcador de carga redox-ativo específica de nucleotídeo são carregadas negativamente no estado de carga alterada.

[0022] 17. Em qualquer um dos exemplos (7) a (16) do método, os marcadores de nucleotídeos estão presentes em um tampão de baixa salinidade.

[0023] 18. Em qualquer um dos exemplos (7) a (17) do método, o canal condutor de eletricidade é um canal de um transistor de efeito de campo.

[0024] É para ser entendido que quaisquer características do método, incluindo exemplos (7) a (17), podem ser combinados em conjunto de qualquer maneira desejável. Além disso, é para ser entendido que qualquer combinação de características deste método e / ou do nucleotídeo marcado pode ser utilizado em conjunto, e / ou em combinação com qualquer dos exemplos aqui descritos.

[0025] Um terceiro aspecto aqui descrito é um kit. Números 19 - 22 referem-se a este terceiro aspecto.

[0026] 19. Num exemplo, o kit compreende uma célula de fluxo, incluindo um canal condutor de eletricidade tendo um tirante ligado ao mesmo e uma polimerase ligada ao canal condutor de eletricidade através do tirante; um ácido nucleico molde para ser introduzida na célula de fluxo; reagentes para ser introduzida na célula de fluxo, os reagentes, incluindo nucleotídeos marcados, pelo menos um dos nucleotídeos marcados, incluindo: um nucleotídeo; uma molécula de ligando ligado a um grupo fosfato do nucleotídeo;

e um marcador de carga redox-ativo ligado à molécula de ligando, o marcador de carga redox-ativo a ser oxidado ou reduzido pelo canal condutor de eletricidade, quando mantido na proximidade de uma zona de detecção do canal condutor de eletricidade; e um detector para detectar uma resposta do canal condutor de eletricidade, quando uma reação redox ocorre entre a marcador de carga redox-ativo e o canal condutor de eletricidade.

[0027] No exemplo 20. (19) do kit, o marcador de carga redox-ativo é selecionado de entre o grupo consistindo de ferroceno, zinco tetrabenzoporfirina, cobalto ftalocianina, tris (2,2'-bipirimidino) ruténio, 4- álcool ferrocenilbenzil, 5- (4-hidroximetilfenil) -10,15,20- trimesitylporphinatozinc (ll), e um calixareno redox-ativo.

[0028] 21. Em qualquer um dos exemplos (19) ou (20) do kit, o marcador de carga redox-ativo inclui 10 cargas ou menos em um estado não-oxidada ou não-reduzida; e o marcador de carga redox-ativo inclui de cerca de uma carga de cerca de 100 encargos em um estado oxidado ou reduzido.

[0029] 22. Em qualquer um dos exemplos (19) a (21) do kit, o canal condutor de eletricidade é um canal de um transistor de efeito de campo.

[0030] É para ser entendido que quaisquer características deste kit, incluindo exemplos (19) a (22), podem ser combinados em conjunto de qualquer maneira desejável. Além disso, é para ser entendido que qualquer combinação de características deste kit e / ou do método e / ou do nucleotídeo marcado pode ser utilizado em conjunto, e / ou em combinação com qualquer dos exemplos aqui descritos.

[0031] Mais ainda, é para ser entendido que quaisquer características de qualquer dos nucleotídeos marcados e ou de qualquer um dos métodos e ou de qualquer um dos kits / / podem ser combinados em conjunto de qualquer maneira desejável, e / ou podem ser combinados com qualquer dos exemplos aqui descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0032] Características de exemplos da presente divulgação tornar-se- evidentes por referência à descrição detalhada que se segue e dos desenhos, em que números de referência iguais correspondem a semelhantes, embora talvez não idênticos, os componentes. Por questão de brevidade, os numerais de referência ou características que têm uma função previamente descrita pode ou não pode ser descrito em ligação com outros desenhos nos quais aparecem.

[0033] A figura 1 é uma ilustração esquemática de um exemplo de um nucleotídeo marcado;

[0034] A Fig. 2 é uma vista esquemática e parcialmente vista em perspectiva de um exemplo de um sistema aqui revelado;

[0035] A Fig. 3 é um diagrama esquemático de polimerases ligados a um canal eletricamente condutor de um sensor de carga e associados com nucleotídeos marcados que podem ser distinguidos com base na carga;

[0036] A Fig. 4 é um diagrama de fluxo que ilustra um exemplo de um processo aqui descrito;

[0037] A Fig. 5A é um diagrama esquemático de um exemplo de um nucleotídeo marcado a ser usado num método de sequenciamento; e

[0038] A Fig. 5B é uma ilustração esquemática de um exemplo da interação entre um cabo e uma região de especificidade de um exemplo do nucleotídeo marcado aqui divulgado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0039] Nucleotídeos marcados são aqui divulgados, que possam ser utilizados para a detecção de moléculas isoladas em procedimentos de sequenciamento de ácidos nucleicos. Um sensor utilizado na detecção de uma única molécula pode ter um canal condutor de eletricidade com uma polimerase a ele ligado. Isso permite que um evento de incorporação (isto é, a incorporação de uma base numa cadeia nascente pela polimerase) a ser detectado numa altura em cada sensor individual. Os nucleotídeos marcados proporcionar uma modalidade de detecção único, que podem ser utilizados para sequenciamento de ácido nucleico e para a detecção de ácidos nucleicos e de outros analitos em geral.

[0040] Um exemplo do nucleotídeo marcado 10 está esquematicamente representado na Fig. 1. Como mostrado, o nucleotídeo marcado 10 inclui um nucleotídeo 12, uma molécula de ligação 14 ou 14' ligada a um grupo fosfato 16 do nucleotídeo 12, e um marcador de carga redox-ativo 18, ligado à molécula de ligação 14 ou 14' , o marcador de carga redox -ativo 18 a ser oxidado ou reduzido por um canal condutor de eletricidade (número de referência 32, Fig. 2), quando mantido na proximidade de uma zona de detecção (número de referência 31, Fig. 3) do canal condutor de eletricidade 32. O nucleotídeo marcado 10 pode ser considerado um nucleotídeo não natural ou sintético, uma vez que é estruturalmente ou quimicamente distinto de um nucleotídeo natural.

[0041] O nucleotídeo 12 do nucleotídeo marcado 10 pode ser um nucleotídeo natural. Os nucleotídeos naturais incluem uma base contendo nitrogênio heterocíclico 20, um açúcar 22, e um ou mais grupos de fosfato 16. Exemplos de nucleotídeos naturais incluem, por exemplo, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Em um ribonucleotídeo, o açúcar 22 é uma ribose, e em desoxirribonucleotídeos, o açúcar 22 é uma desoxirribose, ou seja, um açúcar que falta um grupo hidroxilo que está presente na posição 2' na ribose. Em um exemplo, o nucleotídeo 12 é na forma de polifosfato porque inclui vários grupos de fosfato 16 (por exemplo, tri-fosfato (isto é, fosfato de gama), de tetra-fosfato, penta-fosfato, hexa-fosfato, etc). A base heterocíclica 20 (ou seja, de nucleobases) pode ser uma base de purina ou uma base de pirimidina. bases purinas incluem adenina (A) e guanina (G), e derivados modificados ou análogos. bases de pirimidina incluem citosina (C), timina (T) e uracila (U), e derivados modificados ou análogos. O C-1 átomo de desoxirribose está ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina. Um análogo de ácido nucleico pode ter qualquer um dos esqueletos de fosfato, o açúcar, ou a nucleobase modificada. Exemplos de análogos de ácidos nucleicos incluem, por exemplo, bases universais ou análogos de esqueleto fosfato-acar, tais como ácidos nucleicos peptídicos (PNA).

[0042] O nucleotídeo marcado 10 também inclui a molécula de ligação 14 ou 14'. Em alguns exemplos, a molécula de ligação (mostrada como 14 na Fig. 1) não inclui uma região de especificidade 24. Em outros exemplos, a molécula de ligação (mostrada como 14' na Fig. 1) não incluem a região de especificidade 24. Como é representado esquematicamente na Fig. 1, quando a região de especificidade 24 é parte da molécula de ligação 14', a região 24 pode estar localizada na extremidade que liga quimicamente ao marcador de carga redox-ativo 18. A região de especificidade 24 será descrita mais abaixo.

[0043] A molécula de ligação 14 ou 14' do nucleotídeo marcado 10 pode ser qualquer molécula de cadeia longa que podem ligar quimicamente, em uma extremidade, para o grupo fosfato 16 do nucleotídeo 12 e que pode quimicamente ligação, na outra extremidade, para o marcador de carga redox-ativo

18. A molécula de ligação 14 ou 14' pode também ser selecionada de modo que ela não interagem com uma polimerase de 26 utilizado no sistema 30 (ver Fig. 2) aqui divulgado. A molécula de ligação 14 ou 14' é selecionado de modo que seja suficientemente longo para permitir que a marcador de carga redox-ativo de 18 a residir dentro da zona de detecção 31 (Fig. 3) do canal condutor eléctrico 32 (Fig. 2). Como exemplos, a molécula de ligação 14 ou 14' pode incluir uma cadeia de alquilo, uma cadeia poli (etileno glicol), um grupo amido, um grupo fosfato, um heterocíclico, tal como um triazol, nucleotídeos, ou combinações dos mesmos. Exemplos da cadeia alquilo pode incluir, pelo menos, 6 átomos de carbono e exemplos do poli (etileno-glicol) de cadeia pode incluir, pelo menos, 3 unidades de etilenoglicol.

[0044] O exemplo seguinte ilustra um exemplo do nucleotídeo marcado 10, em que a molécula de ligação 14, 14'

compreende uma cadeia alquil, um grupo amida, um poli (etileno glicol) de cadeia, e um triazol:

O seguinte exemplo ilustra mais um exemplo do nucleotídeo marcado 10, em que a molécula de ligação 14, 14' compreende cadeias alquil, um grupo amida, as cadeias de polietilenoglicol), um triazole, e um grupo fosfato de:

O exemplo a seguir ilustra ainda outro exemplo do nucleotídeo marcado 10, em que a molécula de ligação 14, 14' compreende alquilo, cadeias de grupos amida, o poli (etileno glicol) cadeias, um triazol, e um grupo fosfato de:

O exemplo a seguir ilustra ainda mais um exemplo do nucleotídeo marcado 10, em que a molécula de ligação 14, 14' compreende uma cadeia de alquilo, um grupo amida, o poli (etileno glicol) cadeias, um triazol, um grupo fosfato e uma cadeia polinucleotídica:

[0045] Embora várias moléculas de ligando exemplo 14, 14' têm sido descritos, é para ser entendido que outras moléculas de ligação 14, 14' podem ser usadas.

[0046] Como mostrado na Fig. 1 e os exemplos anteriores, alguns dos nucleotídeos marcados 10 pode também incluir a região de especificidade 24 como parte da molécula de ligação 14'. A região de especificidade 24 é capaz de interagir com uma região aceitador em um tirante 28 (Fig. 2) que está ligado ao canal eletricamente condutora 32. A região de especificidade 24 pode incluir um marcador de afinidade, que pode temporariamente anexar a região do aceitador de o tirante 28. a afinidade de ligação do marcador de afinidade pode ser forte o suficiente para se ligar a região de especificidade 24 para a região do aceitador no tirante 28, quando o nucleotídeo marcado 10 é realizada através da polimerase de 26, mas pode também ser bastante fraca para libertar o região especificidade 24 da região de aceitador após um evento de incorporação (por exemplo, quando a polimerase 26, naturalmente, cliva a ligação entre o fosfato e alfa da molécula de ligação 14, 14' ou entre o fosfato de alfa e beta fosfato). Em outras palavras, as taxas on e off- da região de especificidade 24 (por exemplo, marcador de afinidade) para e a partir da região do aceitador pode ser selecionado para melhorar a detecção global única molécula. A taxa on do marcador de afinidade / interação região aceitador pode ser elevada, por exemplo, devido a uma concentração eficaz alta da região de especificidade 24, e, assim, o marcador de afinidade, antes de incorporação de nucleotídeos. Esta elevada taxa on-aumenta a fracção de tempo em que o marcador de afinidade está ligado a região do aceitador. Após clivagem, a taxa de dissociação da interação também pode ser selecionada para ser elevada o suficiente para que o complexo (entre o marcador de afinidade e a região do aceitador) dissocia-se rapidamente o suficiente para que haja uma baixa probabilidade de um estado ligado (entre o marcador de afinidade do nucleotídeo anteriormente incorporado e na região do aceitador) quando o nucleotídeo marcado próxima 10 entra no local ativo da polimerase 26.

[0047] Num exemplo específico, a região de especificidade 24 é para hibridar com a região do aceitador no tirante 28, e de modo que o marcador de afinidade pode incluir uma sequência de nucleotídeos ou um peptídeo de sequência de ácido nucleico que é capaz de unir temporariamente a região do aceitador sobre o tirante 28 (Fig. 2). Em um exemplo, o marcador de afinidade compreende uma sequência de nucleotídeos, incluindo entre cerca de um nucleotídeo a cerca de dez nucleotídeos ou de cerca de ido nucleico um peptídeo de cerca de ácidos nucleicos de peptídeos de dez. Em outros exemplos, o marcador de afinidade inclui até seis nucleotídeos ou ácidos nucleicos peptídicos. Em ainda outro exemplo, (como mostrado e descrito na Fig. 5B), a região de especificidade 24 pode incluir ainda inosina

(s) que flanqueiam ambos os lados da sequência de nucleotídeos. Em ainda outros exemplos, o marcador de afinidade pode ser um radical de ácido não nucleico, tais como peptídeos que possuem afinidade para o outro ou de polímeros hidrofóbicos. Um exemplo específico de proteína inclui uma espiral enrolada, que é um motivo estrutural em proteínas em que 2-7 alfa-hélices são enroladas em conjunto como os fios de uma corda. Em outras palavras, as bobinas enroladas são construídas por duas ou mais alfa-hélices que se estendem em torno de cada outro para formar um superenrolamento. Exemplos de espirais enroladas incluem oncoproteínas como c-fos e c-jun

[0048] O marcador de carga redox-ativo 18 pode ser qualquer marcador de carga que é capaz de aumentar a sua carga quando oxidado (perder um electrão) ou reduzida (ganhando um electrão) pelo canal condutor eléctrico 32, por exemplo, quando mantido na proximidade de uma zona sensora 31 do canal condutor de eletricidade 32. a carga marcador 18 pode ser líquido (carga zero) neutro, ou próximo a este estado (10 cargas ou menos), antes da reação de redox se realiza. Em outras palavras, no estado não-oxidada ou não- reduzida, o marcador de carga redox-ativo 18 transporta cargas 10 ou menos. As cargas transportadas pelo marcador de carga redox-ativo 18 não incluem qualquer carga do fosfato 16 ou da molécula de ligação 14, 14' do nucleotídeo marcado

10. Após a reação redox tem lugar, a carga líquida global do marcador de carga redox-ativo 18 muda (isto é, leva mais cargas positivas ou cargas negativas mais). Em um exemplo, o marcador de carga redox-ativo 18 inclui 10 cargas ou menos em um não-oxidada ou não-estado reduzido, e a marcador de carga redox-ativo 18 inclui desde cerca de uma carga de cerca de 100 encargos em um estado oxidado ou reduzido. É para ser compreendido que o número de cargas do marcador de carga redox-ativo 18 no estado não-oxidada ou não reduzida é menor do que o número de cargas do marcador de carga redox-ativo 18 no estado oxidado ou reduzido. Em outro exemplo, o marcador de carga redox-ativo 18 inclui 10 cargas ou menos em um estado não-oxidada ou não reduzida, e o marcador de carga redox-ativo 18 inclui desde cerca de 20 cargas de cerca de 50 cargas em um estado oxidado ou reduzido.

[0049] O marcador de carga redox-ativo 18 pode incluir qualquer átomo de metal coordenado (isto é, mantido no lugar) que pode sofrer uma reação redox. Exemplos dos átomos de metais incluem ferro, cobalto, ruténio, zinco, cobre, lítio, prata, etc. Como alguns exemplos específicos, o marcador de carga redox-ativo 18 é selecionado a partir do grupo que consiste de ferroceno, zinco tetrabenzoporfirina, cobalto ftalocianina, tris - (2,2'-bipirimidino) ruténio, o álcool 4-ferrocenylbenzyl, 5- (4-hidroximetilfenil) -10, 15,20- trimesitylporphinatozinc (ll), e um calixareno redox-ativo.

[0050] Ferroceno pode ser qualquer composto organometálico que inclui a fórmula Fe(C5H5)2. Um exemplo específico é o dendrímero ferroceno:

em que Fe2+ pode tornar-se Fe3+ sobre oxidação, introduzindo assim uma carga positiva em cada “Fe”.

[0051] O zinco tetrabenzoporfirina tem a estrutura: em que R = C2H5, C6H13, ou C12H25. O Zn 1 + pode tornar-se Zn 2+ por oxidação, introduzindo assim uma carga positiva.

[0052] Exemplos de ftalocianina de cobalto incluem:

e ambas as quais são moléculas de líquido-neutros em solução.

Após a oxidação, o Co 2+ torna-se Co3+, introduzindo, assim,

uma carga positiva em cada “Co” (por exemplo, uma carga positiva para a primeira estrutura e cinco cargas positivas para a segunda estrutura). Outros compostos contendo cobalto com estados de oxidação variam entre -3 e 5 são conhecidos e podem ser utilizados como negativamente a cargo redox- ativo marcadors de carga 18 ou positivamente a cargo marcadores carga redox-ativo 18.

[0053] tris- (2,2'-bipirimidino) ruténio tem a estrutura: em que Ru 2 + pode tornar-se Ru 3 + sobre oxidação, introduzindo assim uma carga positiva.

[0054] de álcool 4-ferrocenylbenzyl tem a estrutura: em que Fe 2 + pode tornar-se Fe 3 + sobre oxidação, introduzindo assim uma carga positiva.

[0055] 5- (4-hidroximetilfenil) -10, 15,20- trimesitylporphinatozinc (II) tem a estrutura:

em que Zn 2 + pode tornar-se Zn 1 + após redução, introduzindo assim uma carga negativa.

[0056] Alguns exemplos de calixarenos redox-ativo incluem:

[0057] Cada uma das reações redox anteriormente descritas é reversível e, assim, os compostos podem ser utilizados no seu estado de oxidação mais elevado e pode ser reduzido quando na zona de detecção canal condutor eléctrico 31, ou podem ser utilizados no seu estado de oxidação mais baixo e pode ser oxidado quando no canal eletricamente condutor sensor da zona 31.

[0058] Como mencionado acima, o marcador de carga redox- ativo 18 aqui divulgado pode ser neutro ou quase neutro, em solução, e não possuem uma carga maior, até que sofra uma reação redox. Como tal, os nucleotídeos marcados 10 em solução não são considerados moléculas altamente carregadas, e a aglomeração entre os nucleotídeos marcados com cargas opostas 10 (contendo cargas opostas próximo de neutro marcadores carga redox-ativo 18) é menos provável de ocorrer.

[0059] Os nucleotídeos marcados 10 pode ser usado em conjunto e / ou em um sistema de 30 (um exemplo do último dos quais é mostrado na Fig. 2). O kit ou sistema 30 pode incluir o canal eletricamente condutora 32. O canal condutor de eletricidade 32 podem estar dentro ou parte de um recipiente, tal como um poço, tubo, canal, cuvete, placa de

Petri, garrafas, ou outros semelhantes. Outro exemplo de um recipiente adequado é uma célula de fluxo 34. Qualquer célula de fluxo pode ser utilizada uma configuração adequada para as implementações aqui descritos. Algumas células exemplo de fluxo são aqueles que estão comercialmente disponíveis a partir de lllumina, Inc. (San Diego, CA). Fluxo de células 34 são convenientes para a entrega de reagentes a granel para uma matriz de canais individualmente endereçáveis eletricamente condutoras 32, durante a fixação dos componentes de reação (por exemplo, ácidos nucleicos moldes, nucleotídeos marcados com 10, etc.) para os respectivos canais eletricamente condutoras 32 ou durante as reações subsequentes realizadas com os componentes da reação em respectivos canais eletricamente condutoras 32. os processos cíclicos, tais como as reações de sequenciamento de ácidos nucleicos, são particularmente bem adequados para células de fluxo 34. Outro recipiente particularmente útil é um poço numa placa de microtitulação ou a placa com múltiplas cavidades.

[0060] No exemplo mostrado na Fig. 2, a célula de fluxo 34 inclui o canal condutor eléctrico 32. Como aqui utilizado, o termo “eletricamente canal condutor” pretende-se significar uma porção de um dispositivo de detecção que se traduz perturbações na sua superfície ou na sua envolvente campo eléctrico num sinal eléctrico. Por exemplo, um canal condutor de eletricidade 32 pode traduzir a chegada ou de partida de um componente de reação (por exemplo, o nucleotídeo marcado 10) num sinal eléctrico. Nos exemplos aqui descritos, o canal condutor de eletricidade 32 pode também traduzir interações entre os dois componentes de reação (o ácido nucleico molde e uma nucleotídeos 20 do nucleotídeo marcado 10) num sinal detectável através da sua interação com a marcador de carga redox-ativo 18 de o nucleotídeo marcado 10.

[0061] O canal eletricamente condutor 32 pode ser o canal de um sensor de carga 35. A carga 35 de sensor pode incluir terminais de fonte e de dreno S, D e o canal 32 que liga os terminais S, D. O canal 32 pode ter qualquer geometria adequada, tais como, por exemplo, um tubo, um cabo, uma placa, etc.

[0062] Os terminais S, D pode ser de qualquer material condutor apropriado. Exemplos de materiais de base e de drenagem adequados incluem cobalto, silicieto de cobalto, o níquel, o silicieto de níquel, de alumínio, tungsténio, cobre, titânio, molibdénio, óxido de índio e estanho (ITO), óxido de índio zin, ouro, platina, carbono, etc.

[0063] O canal condutor de eletricidade 32 pode incluir qualquer material condutor ou semicondutor que pode oxidar ou reduzir a carga redox-ativo marcador 18. O material pode compreender um material orgânico, um material inorgânico, ou ambos. Alguns exemplos de materiais adequados incluem canal de silício, carbono (por exemplo, carbono vítreo, grafeno, etc.), polímeros, tais como polímeros condutores (por exemplo, polipirrol, polianilina, politiofeno, poli (3,4- etilenodioxitiofeno) dopado com poli (4 -estirenossulfonato) (PEDOT-PSS), etc.), metais, etc.

[0064] Em alguns exemplos, o canal condutor de eletricidade 26 podem também ser uma nanoestrutura que tem pelo menos uma dimensão na escala nanométrica (que varia de 1 nm a menos de 1:00). Num exemplo, esta dimensão refere-se à maior dimensão. Como exemplos, o canal condutor de eletricidade 26 pode ser uma nanoestrutura semi-condutora, uma nanoestrutura grafeno, uma nanoestrutura metálico, e um polímero condutor de nanoestrutura. A nanoestrutura pode ser um nanotubo multi- ou de parede única, um nanofio, um nanoribbon, etc.

[0065] Um sensor de carga 35 exemplificativo é um transístor de efeito de campo (FET), tal como um nanotubo de carbono (CNT) baseado FET, de nanotubos de carbono de parede única (SWNT) com base FET, nanofios de silício (SiNW) FET, um FET nanofio polímero , um nanoribbon grafeno FET (e FETs nanoribbon relacionados fabricada a partir de materiais 2D tais como MoS2, siliceno, etc), FET túnel (TFET), e dispositivos de sublimiar declive íngreme.

[0066] O exemplo de sensor carga 35 mostrado na Fig. 2 é um FET de nanoestrutura incluindo a fonte S, o terminal de drenagem D, e o canal condutor eléctrico 32 entre a fonte S e a drenagem D. O canal eletricamente condutor 32 pode ser um átomo de carbono nanotubo, uma parede única de nanotubos de carbono, um nanofio de silício, um nanofio polímero, etc. o canal condutor eléctrico 32 funciona como o terminal de porta, e, portanto, é também mostrada como “L” na Fig. 2. nos exemplos aqui descritos, a porta G / do canaç condutor eletricamente 32 pode servir como um eletrodo redox (oferecendo ou aceitar eletrons) para a marcação de carga redox-ativo 18 do nucleotídeo marcado 10. Mais especificamente, a porta G / eletricamente condutora canal

32 pode ser utilizado para transferência electrões para ou a partir do marcador de transferência de carga 18. Eletron redox-ativo pode ocorrer por meio de encapsulamento por meio de um óxido de porta (não mostrado) em pelo menos uma porção da superfície da porta G / canal condutor eléctrico 32. Em alguns exemplos, a espessura do o óxido de porta pode ser utilizado para modular a eficiência da transferência de corrente de tal modo que uma quantidade mínima de tempo de contato passa antes do marcador de carga redox-ativo 18, torna-se suficientemente ativado.

O tempo de contato pode referir-se o tempo que marcador de carga redox-ativo 18 seja mantido dentro de proximidade suficiente do portão L / canal condutor eléctrico 32 para a transferência de elétrons a ocorrer com uma alta probabilidade.

Este período de tempo dependerá de muitos fatores, incluindo o tipo de marcador de carga redox-ativo 18, a espessura do óxido de portão, e a distância entre a marcador de carga 18 a partir da porta G / do canal eletricamente condutor 32. Isto pode ser utilizado para assegurar que o sensor de carga 35 suficientemente diferencia entre difusor 10 nucleotídeos marcados que transientemente em contato com a porta G / do canal eletricamente condutor 32, mas que não está realmente associado com a polimerase 26 ligado ao terminal de porta G / canal condutor eléctrico 32. Os nucleotídeos 10 são esperados que estão associados com o local ativo da polimerase de 26 para permanecer no estado associado para um período de tempo que é significativamente maior do que o tempo que uma interação transiente ocorre.

Por exemplo, o nucleotídeo 10 marcado pode permanecer associado com o local ativo da polimerase (por exemplo, a polimerase 26) para centenas de microssegundos a centenas de milissegundos. A interação transitória iria ocorrer em escalas de tempo de difusão que são ordens de magnitude mais rápidos.

[0067] Neste exemplo, a polimerase 26 é imobilizada na porta G / canal condutor de eletricidade 32 da sensor de carga 32 com um tirante 28. O tirante 28 é utilizado como uma âncora para a polimerase 26. O tirante 28 pode apresentar electrões capacidade de transporte. Exemplos de amarras adequados 28 incluem cadeias de ácidos nucleicos (por exemplo, contendo 5 a 25 nucleotídeos), peptídeos, cadeias de carbono simples, não condutores ou baixas oligômeros condutores ou polímeros, etc.

[0068] Em alguns exemplos, o tirante 28 mantém a polimerase 26 de pelo menos 10 nm de distância do terminal de porta G / canal condutor eléctrico 32 do sensor de carga

35. Isto pode ser desejável, por exemplo, quando não é desejável detectar o cargas da polimerase 26 e / ou as cargas negativas do molde de ácido nucleico 36 realizada pela polimerase 26. no entanto, se é desejável detectar a carga da polimerase 26 e / ou ácido nucleico molde 36, em seguida, o tirante 28 pode ser a polimerase 26 de menos do que cerca de 10 nm, inferior a cerca de 9 nm, inferior a cerca de 8 nm, inferior a cerca de 7 nm, inferior a cerca de 6 nm, inferior a cerca de 5 nm, inferior a cerca de 4 nM, menos de cerca de 3 nm, menos do que cerca de 2 nM, ou cerca de 1 nm a partir da porta G do sensor de carga 32.

[0069] O uso do sensor de carga à base de FET 35 pode permitir a seguinte: (1) sensibilidade única molécula pode ser conseguida com um FET apropriadamente concebido, e (2) elevado grau de paralelização (também chamado “multiplexability”) lata ser facilitada uma vez que a alteração detectada na carga está localizada na proximidade da porta G / canal eletricamente condutor 32, evitando, assim, a diafonia entre vizinhos, locais FET endereçáveis individualmente (por exemplo, em uma matriz). Além disso, de nanoestrutura de silício FET pode ser fabricada usando processos que são compatíveis com instalações de fabrico de semicondutores.

[0070] Exemplos do kit e / ou o sistema 30 pode também incluir um ácido nucleico molde 36 que está a ser introduzida na célula de fluxo 34 e reagentes (não mostrado na Fig. 2) que está a ser introduzida na célula de fluxo 34.

[0071] O ácido nucleico molde 36 pode ser qualquer amostra que está a ser sequenciado, e pode ser composta de ADN, ARN, ou seus análogos. A fonte do molde (ou alvo) 36 ácidos nucleicos podem ser DNA genômico, RNA mensageiro, ou outros ácidos nucleicos a partir de fontes nativas. Em alguns casos, os ácidos nucleicos do molde 36, que são derivados a partir de tais fontes pode ser amplificado antes de ser utilizado num método ou sistema 30 como aqui. Qualquer um de uma variedade de técnicas de amplificação conhecidas, podem ser utilizados, incluindo, mas não limitados a, reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação círculo rolante (RCA), amplificação por deslocamento múltiplo (MDA), ou a amplificação com iniciadores aleatórios (RPA). É para ser entendido que a amplificação de ácidos nucleicos alvo 26 antes de utilização no método ou sistema 30 aqui contidas são opcionais. Como tal, os ácidos nucleicos do molde 36 não será amplificado antes da sua utilização em alguns exemplos. ácidos nucleicos molde / alvo pode, opcionalmente, ser derivados de bibliotecas sintéticas. ácidos nucleicos sintéticos podem ter composições de DNA ou RNA nativos ou podem ser análogos dos mesmos.

[0072] As amostras biológicas a partir de qual o modelo ácidos nucleicos 36 podem ser derivados incluem, por exemplo, aqueles a partir de um mamífero, tal como um roedor, ratinho, rato, coelho, cobaia, ungulados, cavalo, ovelha, porco, cabra, vaca, gato, cão, primata, humano ou primata não humano; uma planta, tais como Arabidopsis thaliana, milho, sorgo, aveia, trigo, arroz, canola, ou soja; uma alga tal como Chlamydomonas reinhardtii; um nematóide Caenorhabditis elegans, tais como; um inseto, tais como Drosophila melanogaster, mosquitos, mosca da fruta, da abelha do mel ou aranha; um peixe, tais como peixe-zebra; um réptil; um anfíbio tais como um sapo ou de Xenopus laevis; um Dictyostelium discoideunr, uma fungos tais como Pneumocystis carinii, rubripes Takifugu, levedura, Saccharamoyces cerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe; ou um plasmodium falciparum. Modelo de ácidos nucleicos também podem ser 36 derivadas de procariotas, tais como uma bactéria, Escherichia coli, Staphylococcus ou Mycoplasma pneumoniae; um arquebactéria; um vírus tal como o vírus da Hepatite C, vírus Ebola ou vírus da imunodeficiência humana; ou um viróide. Modelo de ácidos nucleicos 36 pode ser derivado a partir de uma cultura homogênea ou uma população de organismos acima ou, alternativamente, a partir de uma coleção de diversos organismos diferentes, por exemplo, em uma comunidade ou ecossistema.

[0073] Além disso, os ácidos nucleicos molde / alvo 36 não pode ser derivada a partir de fontes naturais, mas sim podem ser sintetizados utilizando técnicas conhecidas. Por exemplo, sondas de expressão de genes ou sondas de genotipagem podem ser sintetizados e utilizados nos exemplos aqui estabelecidos.

[0074] Em alguns exemplos, os ácidos nucleicos molde / alvo 36 podem ser obtidos como fragmentos de um ou mais ácidos nucleicos maiores. A fragmentação pode ser levada a cabo utilizando qualquer de uma variedade de técnicas conhecidas na arte, incluindo, por exemplo, nebulização, sonicação, clivagem quica, clivagem enzimática, ou cisalhamento físico. A fragmentação pode também resultar do uso de uma técnica de amplificação particular, que produz produtos de amplificação, copiando apenas uma parte de um ácido nucleico maior. Por exemplo, a amplificação por PCR produz fragmentos com um tamanho definido pelo comprimento da sequência de nucleotídeos no molde original que se encontra entre os locais onde os iniciadores de flanqueamento hibridizam durante a amplificação.

[0075] Uma população de molde / ácidos nucleicos alvo, 36 ou amplicons dos mesmos, podem ter um comprimento médio de cadeia que é desejado ou apropriado para uma aplicação particular dos métodos, kits, ou sistema 30 aqui estabelecidos. Por exemplo, o comprimento mio de cadeia pode ser inferior a cerca de 100.000 nucleotídeos, 50.000 nucleotídeos, de 10.000 nucleotídeos, 5000 nucleotídeos, de

1000 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, ou 50 nucleotídeos. Alternativamente ou adicionalmente, o comprimento médio de cadeia pode ser maior do que cerca de 10 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 1, 000 nucleotídeos, 5000 nucleotídeos, 10.000 nucleotídeos, 50.000 nucleotídeos, ou 100.000 nucleotídeos. O comprimento médio de cadeia, para uma população de ácidos nucleicos alvo, ou amplicons da mesma, pode estar numa gama entre um conjunto mínimo valor máximo apresentado acima e.

[0076] Em alguns casos, uma população de molde / ácidos nucleicos alvo 36 podem ser produzidas sob condições ou configurados de modo a ter um comprimento máximo para os seus membros. Por exemplo, o comprimento máximo para os membros pode ser inferior a cerca de 100.000 nucleotídeos,

50.000 nucleotídeos, de 10.000 nucleotídeos, 5000 nucleotídeos, de 1000 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 100 nucleotídeos ou 50 nucleotídeos. Em alternativa ou adicionalmente, uma população de ácidos nucleicos molde 36, ou amplicons dos mesmos, podem ser produzidas sob condições ou configurados de modo a ter um comprimento mínimo para os seus membros. Por exemplo, o comprimento mínimo para os membros podem ser mais do que cerca de 10 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 1, 000 nucleotídeos, 5000 nucleotídeos, 10.000, 50.000 nucleotídeos, nucleotídeos ou nucleotídeos 100.000. O comprimento mínimo da cadeia de máximo e para os ácidos nucleicos molde 36 numa população pode ser numa faixa entre um conjunto mínimo e valor máximo apresentado acima.

[0077] Como mostrado na Fig. 2, o ácido nucleico molde

36 (por exemplo, uma cadeia simples do DNA de cadeia simples) a ser sequenciado é obrigado a polimerase 26, depois de ter sido introduzido num fluido, juntamente com ou separar a partir de reagentes, tais como o anteriormente descrito nucleotídeos marcados 10 (não mostrado na Fig. 2).

[0078] O ácido nucleico molde 36 e / ou os reagentes (por exemplo, nucleotídeos marcados 10) pode estar presente num fluido e introduzida na célula de fluxo 34. O fluido pode incluir um tampão de baixa salinidade. Como exemplos, o tampão de baixo teor salino pode incluir desde mais de 0 mM a cerca de 50 mM de sal. Como um exemplo, o tampão de baixo teor salino pode incluir até 5 mM de Mg 2+ no tampão Tris (pH 8,0). O uso de um tampão de baixo teor salino pode ser tão desejável que a zona de detecção 31 (ou seja, comprimento de Debye) não é afetado de forma adversa, ou seja, não é demasiado longo, de modo que se opõem a uma detecção das marcas de carga 18. O fluido também pode incluir catalisadores , tais como enzimas, que facilitam uma reação, outros aditivos, e os solventes (por exemplo, água, dimetil sulfóxido (DMSO), betaína, formamida, etc.).

[0079] Em alguns exemplos, vários diferentes nucleotídeos marcados 10 podem ser utilizados em conjunto no fluido que é introduzido para o sensor de carga 35. Nestes exemplos, é para ser entendido que a molécula de ligação 14, 14' pode ser quer idêntico para todos os tipos de nucleotídeos marcado, ou pode ser diferente. Propriedades da molécula de ligação 14, 14', tais como o comprimento e rigidez, pode ser alterado de modo a afetar a taxa da reação redox. Tais propriedades podem ser ajustadas individualmente para um nucleotídeo marcado 10 e as suas associadas redox- ativo carga marcador 18. Propriedades da região de especificidade 24 da molécula de ligação 14' pode também ser alterado para afetar a taxa da reação redox. A molécula de ligação 14, 14' pode ser alterada para aumentar ou diminuir a quantidade de tempo que o marcador de carga redox-ativo 18 está em proximidade com o canal condutor de eletricidade 32. Tais alterações podem ser usadas para afetar a velocidade de transferência electrónica. Ao fazê-lo, interações transiciais entre o marcador de carga 18 e o canal condutor de eletricidade 32 que se difundem a partir de 10 nucleotídeos marcados podem ser feitas com menos probabilidade de resultar em transferência de electrões. Alternativamente, segurando o marcador de carga redox-ativo 18, para um período mais longo em estreita proximidade com o canal condutor de eletricidade 32 pode resultar em uma maior probabilidade de transferência de electrões.

[0080] Em um exemplo, quatro diferentes nucleotídeos marcados 10 são utilizados no fluido que é introduzido para o sensor de carga 35, cada um incluindo um nucleotídeo diferente 12 (em particular, uma base diferente 20) e uma carga de redox-ativo específico do nucleotídeo diferente. marcação 18. um exemplo disto é mostrado na Fig 3. Neste exemplo, os nucleotídeos marcados 10 incluem: um primeiro nucleotídeo marcado 10A incluindo polifosfato desoxiadenosina como as sequências de nucleotídeos e um primeiro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeos (mostrado com quatro cargas positivas na Fig. 3); um segundo nucleotídeo marcado 10G incluindo polifosfato desoxiguanosina como as sequências de nucleotídeos e um segundo marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeos (mostrado com quatro cargas negativas na Fig. 3); um terceiro nucleotídeo marcado 10C incluindo polifosfato de desoxicitidina como as sequências de nucleotídeos e um terceiro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeos (mostrado com duas cargas negativas na Fig. 3); e um quarto nucleotídeo marcado 10T incluindo polifosfato desoxitimidina como as sequências de nucleotídeos e um quarto marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeos (mostrado com uma carga positiva na Fig. 3). Neste exemplo, os primeiro, segundo, terceiro, e quarto marcador de carga redox-ativo específicos de nucleotídeos são diferentes uns dos outros.

[0081] No exemplo mostrado na Fig. 3, dois dos primeiro, segundo, terceiro, e quarto marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeos são carregados positivamente (por exemplo, dATP e dTTP), no estado de carga alterada (isto é, depois a reação redox tem lugar), e os outros dois dos primeiro, segundo, terceiro, e quarto marcador de carga redox-ativo específicos de nucleotídeos (por exemplo, dGTP e dCTP) são carregadas negativamente no estado de carga alterada (isto é, após o redox reação tem lugar).

[0082] No exemplo mostrado na Fig. 3, embora as cargas em duas das marcas de carga redox-ativo específico de nucleotídeos são os mesmos (positivo ou negativo), as marcas 18 podem ainda ser utilizados para distinguir os diferentes tipos de nucleotídeos, porque os encargos têm dosagens diferentes (por exemplo, após a ativação redox). O exemplo da concretização mostrado na Fig. 3 apresenta a discriminação de quatro estado com base em uma única posição de hibridação tirante e quatro marcas diferentes de carga redox-ativo 18. Especificamente, dGTP e dCTP ambos contêm carregados negativamente carga marcador redox-ativo 18 que os distinguem dos dATP e dTTP; e dGTP pode ser distinguida de dCTP devido a uma carga que é distintamente mais elevada do que a carga de dCTP. Da mesma forma, dATP e dTTP podem ser distinguidos uns dos outros devido à maior carga positiva na porção de dATP em comparação com a porção de dTTP.

[0083] Em alguns exemplos, pode não ser possível ter a marcadores de carga redox-ativo 18 de ambas magnitudes positivos e negativas que operam no mesmo fluido, porque a tensão necessária para carregar um marcador negativo pode descarregar uma marcação positiva, e vice-versa. Como tal, em outros exemplos, pode ser desejável utilizar exemplos de nucleotídeos marcados 10 aqui descritos que incluem marcadores de carga redox-ativo 18 de uma polaridade, e a utilização de outros nucleotídeos marcados que incluem permanentemente carregadas (isto é, marcador não redox). Exemplos de marcadores carregados permanentemente incluem marcadores, tais como, carregado negativamente, por exemplo, um grupo fosfato, DMT e / ou FMOC; ou marcadores carregados positivamente, tal como uma amina primária. Como um exemplo, a partir de um a três diferentes nucleotídeos marcados 10 (incluindo os marcadores de carga redox-ativo 18) pode ser usado, e uma parte restante dos nucleotídeos marcados que incluem marcadores carregadas permanentemente e marcações de carga não-redox ativas 18. Isto é especialmente útil no caso,

em que a redução ou condições de oxidação (mas, não ambos) são usadas. É para ser compreendido que a aglomeração não deve ocorrer nestes casos, porque não existe uma concentração relativamente elevada de grandes porções de ambos os tipos de carga em solução ao mesmo tempo.

[0084] A Fig. 3 também ilustra a zona de detecção 31 (a área sombreada em torno da porta G / canal condutor eléctrico 32). Os sensores de carga 35 pode ser operado em condições de sal biologicamente relevantes, por exemplo, na cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de gama. O comprimento de rastreio de Debye de tais soluções salinas pode estar numa gama de cerca de 0,3 nm a cerca de 10 nm, o que pode limitar a zona de detecção 31 para alguns nm fora da superfície da porta G e muitas vezes podem reduzir os níveis de sinal para o limite de detectabilidade.

[0085] Embora várias polimerases amarradas 28 são mostradas no canal eletricamente condutor 32 na Fig. 3, é para ser entendido que, em particular, um sensor de carga 35, uma polimerase 28 está preso a um canal condutor elétrico

32. Como tal, o exemplo mostrado na Fig. 3 ilustra a polimerase 28 durante quatro eventos de incorporação de nucleotídeos diferentes, e o efeito sobre as diferentes marcas de carga redox-ativo 18 durante os respectivos eventos de incorporação.

[0086] Referindo-se agora à Fig. 4, um exemplo de um método é descrito. O método 100 inclui a introdução de um ácido nucleico molde 36 para um canal condutor de eletricidade 32 que tem uma polimerase 26 amarrada aos mesmos (numeral de referência 102); introdução de nucleotídeos marcados 10 para o canal condutor de eletricidade 32, pelo menos um dos nucleotídeos marcados 10, incluindo um nucleotídeo 12 e um marcador de carga redox-ativo específica de nucleotídeo 18 a ela ligada, através do qual um dos nucleotídeos marcados 10 associados com a polimerase 26 (numeral de referência 104); enquanto que a um dos nucleotídeos marcados 10 está associada, iniciando uma reação redox entre o marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo 18 e o canal condutor de eletricidade 32 para alterar um estado de carga do marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo 18 (número de referência 106); e em resposta à reação redox, detectar uma resposta do sensor de carga 32 (Número de referência 108). As Figs. 5A e 5B irão também ser referenciadas em toda a discussão do método

100.

[0087] Como mostrado na Fig. 5A, o ácido nucleico molde 36 introduzido para o sensor de carga 32 pode ser mantido no lugar pela polimerase 26, que está presa ao sensor de carga

32. O ácido nucleico molde 36 mostrado na Fig. 5A pode ser uma cadeia molde de DNA.

[0088] Além disso, como mostrado na Fig. 5A, o nucleotídeo marcado 10 pode incluir uma base 20 que é complementar a um ácido nucleico alvo do ácido nucleico molde marcado 36. O nucleotídeo 10 irá ser mantido no lugar, em parte, pela polimerase 26 que também é ligada ao molde de ácido nucleico 36. Se estiver presente, a região de especificidade 24 da molécula de ligação 14' do nucleotídeo marcado 10 pode interagir com o tirante 28.

[0089] Um exemplo do nucleotídeo marcado 10 associado com o tirante 28 é mostrado na Fig. 5B.

Neste exemplo, a molécula de ligação 14' do nucleotídeo marcado 10 inclui a região de especificidade 24 (por exemplo, A 'B', C '), que tem uma afinidade para uma parte (por exemplo, A, B, C) do tirante 28. neste exemplo particular, a região de especificidade 24 (por exemplo, a 'B', C ') inclui nucleotídeos ou ácidos nucleicos peptídicos que são complementares aos nucleotídeos ou ácidos nucleicos peptídicos da porção (por exemplo, a, B, C) do tirante 28. Em outro exemplo, a região de especificidade 24 e a região de aceitar o tirante 28 podem ser radicais de ácidos nucleicos que não têm uma afinidade entre si.

Em ainda outro exemplo, a região de especificidade 24 pode ser uma porção de ácido nucleico que não possui uma afinidade para um polímero hidrofóbico (um exemplo do tirante 28). A ligação entre essas regiões específica pode resultar de padrão de emparelhamento de bases de Watson-Crick.

A região de especificidade 24, neste exemplo, também pode incluir inosinas (I) que flanqueia o A 'B', de sequências de nucleotídeos C'. Inosinas são bases universais, e, portanto, pode emparelhar com todos os quatros nucleotídeos nativos do DNA.

Como tal, as interações de ligação adicionais podem resultar de interações das bases universais (por exemplo, inosina I) com nucleotídeos nativos sobre o tirante 28. Deste modo, quando o nucleotídeo marcado 10 é obrigado a polimerase 26 durante a incorporação, sinérgica a ligação ocorre entre a região de especificidade 24 do nucleotídeo marcado 10 e o tirante 28, o que aumenta grandemente a estabilidade da interação entre o nucleotídeo marcado 10 e o tirante 28.

[0090] Quando a molécula de ligação 14 do nucleotídeo marcado 10 não inclui a região de especificidade 24, é para ser entendido que o nucleotídeo marcado 10 vai ser mantido no seu lugar pela interação com a polimerase 26. O comprimento da molécula de ligação 14 pode ajudar a garantir que a marcador de carga redox-ativo 18 seja mantido dentro da zona de detecção 31 da porta G / do canal eletricamente condutor 32.

[0091] A interação entre o nucleotídeo marcado 10 e a polimerase 26, ou entre o nucleotídeo marcado 10 e a polimerase 26 e o tirante 28 faz com que a marcador de carga redox-ativo 18 para entrar no interior da zona sensor 31 do canal condutor elétrico 32. A interação (s) também ajuda a manter a marcador de carga redox-ativo 18, dentro da zona sensor 31 durante um tempo suficiente para a transferência de carga eficiente e completo. O tempo pode ser de até dezenas de milissegundos. Esta interação é relativamente longa ao contrário de outros nucleotídeos marcados 10 presente na solução, que pode difundir-se e brevemente o canal condutor de eletricidade 32. A interação breve não é tempo suficiente para a transferência de carga suficiente para ter lugar, e, assim, nestes casos, o marcador de carga redox-ativo 18 não é carregado e não há resposta detectada pelo sensor de carga 32.

[0092] No exemplo mostrado na Fig. 5A, o marcador de carga redox-ativo ftalocianina de cobre 18 do nucleotídeo marcado entra num campo (por exemplo, a zona de detecção 31) que está dentro de cerca de 1 nm a cerca de 2 nm do canal eletricamente condutor 32. Uma vez que o nucleotídeo marcado

10 é mantido no lugar, o marcador de carga redox-ativo 18 está em condições de ser carregado pela porta G / canal eletricamente condutor 32.

[0093] Para iniciar a reação redox entre o terminal de porta G / canal eletricamente condutor 32 (por exemplo, o nanofio de silício, nanotubos de carbono, etc.) e o marcador de carga redox-ativo 18, a tensão aplicada ao terminal de porta G / canal eletricamente condutor 32 pode ser ajustado a uma tensão de oxidação ou uma redução da tensão do marcador de carga redox-ativo 18. Quando oxidado, o marcador de carga redox-ativo 18 perde elétrons e, assim, a porta G / canal eletricamente condutor 32 cria cargas positivas líquidas para o marcador de carga redox-ativo 18. Quando reduzido, o marcador de carga redox-ativo 18 ganha elétrons, e, assim, a porta G / canal eletricamente condutor 32 injeta cargas negativas líquida para o marcador de carga redox-ativo 18. Como um resultado da reação redox, o estado de carga do marcador de carga redox-ativo 18 é alterada. Este estado alterado altamente carregada (por exemplo, em comparação com o estado do marcador de carga redox-ativo 18, antes de ser carregado, que é o estado não-oxidado ou não-reduzido) perturba o campo em torno do canal condutor de eletricidade 32 e produz um sinal detectável.

[0094] A tensão aplicada ao canal eletricamente condutor 32 durante a reação redox e durante a detecção pode depender do marcador de carga redox-ativo 18, que é usado. Por exemplo, a voltagem de carregamento pode ser diferente da tensão de leitura, e, portanto, o canal condutor de eletricidade 32 pode ciclar entre a tensão de carga (s) e a tensão (s) de leitura. Em um exemplo, iniciando a reação redox envolve a aplicação de uma voltagem de carregamento para o canal condutor de eletricidade 32, e detectar a resposta do canal condutor de eletricidade 32 envolve a aplicação de uma tensão de leitura para o canal eletricamente condutor 32.

[0095] A resposta do canal condutor de eletricidade 32, após a reação redox é indicativa do estado de carga alterada da marcador de carga redox-ativo 18. A resposta do canal condutor de eletricidade 32, após a reação redox pode também ser indicativo da base 20 do nucleotídeo marcado 10, porque o marcador de carga redox-ativo 18 é específico de sequências de nucleotídeos (isto é, um marcador específico 18 é selecionado para uma base específica 20). Como tal, o processo 100 pode também envolver associar a resposta do canal condutor elétrico 32 com o marcador de carga redox- ativo específico de nucleotídeo 18, associado dos nucleotídeos marcados 10 (isto é, o nucleotídeo marcado 10 que tem associado com a polimerase 26), e com base na marcador de carga redox-ativo específica de nucleotídeo 18, identificando as sequências de nucleotídeos (por exemplo, a base 20) do nucleotídeo marcado associado 10 (ou seja, o nucleotídeo marcado 10 que tem associado com a polimerase 26).

[0096] A base 20 do nucleotídeo marcado associado 10 será incorporada uma nascente vertente 38 que é hibridada com o ácido nucleico molde 36. Esta vontade, por sua vez, naturalmente quebrar a ligação entre o grupo fosfato 16 do nucleotídeo marcado 10 e o base de nucleotídeo 20 recém-

incorporada. Por exemplo, após a incorporação da base de nucleotídeo 20 na cadeia nascente 38, a ligação entre o fosfato alfa e a molécula de ligação 16 ou entre o alfa fosfato e beta fosfato é clivada naturalmente. Como resultado, o restante do nucleotídeo marcado 10 (por exemplo, componentes 14 ou 14' e 18) está livre para dissociar a partir da base nucleotídeo 20 e difundir para longe do canal condutor de eletricidade 32, retornando, assim, o campo em torno do canal condutor de eletricidade 32 para o estado em que estava antes da associação do nucleotídeo marcado 10 com a polimerase 26. O aparecimento e o desaparecimento do sinal como o campo em torno do canal condutor eléctrico 32 é perturbado e devolvido para o estado não perturbado, respectivamente, pode ser correlacionada com a incorporação de uma base de nucleotídeo 20 para a cadeia nascente 38 do ácido nucleico molde 36. Como tal, os exemplos do processo 100 também incluem clivagem (por exemplo, no grupo fosfato 16) do marcador de carga redox-ativo específico do nucleotídeo 18 e a molécula de ligação 14, 14' do associado um dos nucleotídeos marcados 10, pelo que a base nucleotídeo 20 do nucleotídeo marcado associado 10 é incorporado num cadeia nascente 38 complementar ao ácido nucleico molde 36. clivagem pode envolver espera para a clivagem natural a ocorrer. Uma vez que o sinal de retorno a um estado de linha de base entre sucessivas de bases de nucleotídeos marcados 20 incorporações, a detecção de segmentos homopoliméricos dentro da cadeia nascente 38 ao longo da cadeia molde 36 é possível.

[0097] Alguns exemplos aqui revelados exploram a sinérgica de ligação do nucleotídeo marcado 10 para a polimerase 26, sozinho ou em combinação com o tirante 28, a fim de trazer e manter o marcador de carga redox-ativo 18 na proximidade da zona de detecção 31 do canal eletricamente condutor 32. A estabilidade do complexo formado entre o tirante 28 e a região de especificidade 24 pode ser relativamente baixo, de tal modo que o complexo (entre a região de especificidade 24 e o tirante 28) não formam por nucleotídeos marcados 10 também que estão ligados a polimerase 26 (isto é, nucleotídeos marcados 10 que estão livres em solução não se liga substancialmente ao tirante 28). Em outras palavras, a taxa de deslocamento do complexo pode ser suficientemente elevada para que o tempo de vida seja curto. No entanto, quando uma associação estável é formada entre o nucleotídeo marcado 10 e a polimerase 26, a concentração local da molécula de ligação 14, 14' aumenta em torno do tirante 28, resultando, assim, em uma alta na taxa da região de especificidade 24 para o tirante 28. Deste modo, o tempo total de associação é muito maior no estado polimerase-associado de um nucleotídeo marcado 10 em comparação com o estado de não-associado de nucleotídeos marcados 10. O efeito sinérgico das afinidades do nucleotídeo marcado 10 para a polimerase 30 de flutuação livre, sozinho ou em combinação com o tirante 28, permitem a ligação substancial de afinidade geral. Depois de clivagem natural, a polimerase 26 após a incorporação do nucleotídeo de base 20, o efeito sinergístico é perdido e o marcador de carga 18 também irá dissociar a partir do canal eletricamente condutor

32.

[0098] No exemplo de processo 100, o qual associa um dos nucleotídeos marcado 10 com a polimerase 28, o início da reação redox, a detecção, associação da resposta, e a identificação das bases incorporadas de nucleotídeos 20 juntos são um ciclo de sequenciamento. O método 100 pode ainda incluir a realização de um novo ciclo de sequenciamento com outro nucleotídeo marcado 10 que se associa com a polimerase 26. Executando o próximo ciclo de sequenciamento podem incluir permitindo um lado um dos nucleotídeos marcados 10 para associar com a polimerase 26; enquanto o próximo dos nucleotídeos marcados 10 está associada, de iniciar outra reação redox entre um outro marcador de carga redox-ativo específica de nucleotídeo 18 e a sensor de carga 32 para alterar um estado de carga do outro marcador de carga redox- ativo específica de nucleotídeo 18; em resposta a outra reação redox, detectando uma outra resposta do sensor de carga 32; associando a outra resposta do sensor de carga 32 com o outro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo; e com base no outro marcador de carga redox- ativo específico de nucleotídeo 18, a identificação de um nucleotídeo (base 20) do lado de um dos nucleotídeos marcados 10 (isto é, que tem associado com a polimerase 26). O outro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo pode ser clivado, e as sequências de nucleotídeos (base 20) do lado de um dos nucleotídeos marcados 10 são incorporadas na cadeia nascente 38 complementar ao ácido nucleico molde 36. O ciclo de sequenciamento pode ser repetido.

[0099] Nos exemplos descritos aqui, uma forma de onda pode também ser utilizado. A forma de onda pode ser monitorada para determinar quando atinge uma ou mais tensões de limiar para o potencial redox dos marcadores de carga redox-ativo 18 que têm diferentes potenciais redox. Nestes casos, a mudança na corrente resultante através da porta G / canal eletricamente condutor 32 pode ser utilizada como informação para identificar a base 20 do nucleotídeo marcado 10, incluindo o marcador de carga redox-ativo 18, que está associada com a tensão de limiar específica.

[00100] Nos exemplos aqui descritos, o número de elétrons transferidos para ou a partir do marcador de carga redox-ativo 18 pode também ser monitorado. O número de elétrons transferidos podem ser usado para identificar a base nucleotídeo 20 associada com a polimerase 26, e que a polimerase 26 incorpora na cadeia nascente 38.

[00101] Os nucleotídeos marcados 10 e o sistema 10 aqui descritos podem ser utilizados para qualquer um de uma variedade de aplicações. Como descrito em referência às Figs. 4, 5A e 5B, uma aplicação particularmente útil é sequenciamento de ácido nucleico, tal como um sequenciamento por síntese de uma única molécula (SBS). No SBS de única molécula, a extensão de um iniciador de ácido nucleico ao longo de um ácido nucleico 36 (por exemplo, um ácido nucleico alvo ou amplicon do mesmo) modelo é monitorada para determinar a sequência de nucleotídeos no molde 36. O processo químico subjacente pode ser de polimerização (por exemplo, catalisada por uma enzima polimerase 26, tal como aqui descrito). Em um exemplo particular SBS de única molécula à base de polimerase, nucleotídeos (por exemplo, bases de 20) são adicionados a um iniciador (ampliando,

assim, o iniciador e a formação de uma cadeia nascente 38) de uma forma dependente do molde, de tal modo que a detecção da ordem e tipo de nucleotídeos adicionado ao iniciador pode ser usado para determinar a sequência do molde. Uma pluralidade de diferentes modelos 36, em diferentes canais eletricamente condutores 32 de uma matriz pode ser submetida à técnica de SBS de molécula única, sob condições onde os acontecimentos que ocorrem em diferentes modelos 36 podem ser distinguidos por detectores individuais que estão operativamente ligados a cada um dos canais eletricamente condutores 32. Cada canal eletricamente condutor (e os seus terminais de fonte e de dreno S, D) pode ser posicionado dentro de uma depressão ou poço da célula de fluxo, o que ajuda a isolar fisicamente um canal 32 a partir de um canal 32 adjacente em uma matriz.

[00102] Outras aplicações adequadas para os nucleotídeos marcados 10, kit, e sistema 30 aqui divulgados incluem-sequenciamento por-ligação e sequenciamento-por- hibridação. Outra aplicação útil para os nucleotídeos marcados 10 e o sistema 30 aqui divulgados é a análise de expressão gênica. A expressão do gene pode ser detectada ou quantificada utilizando técnicas de sequenciamento de RNA, tais como os referidos como sequenciamento digital de RNA. As técnicas de sequenciamento de RNA podem ser realizadas utilizando metodologias de sequenciamento conhecidas no estado da técnica, tais como aqueles indicados acima, exceto que a detecção de fluorescência de nucleotídeos oticamente marcados pode ser substituídos com os métodos de detecção baseados em carga aqui estabelecidos. A expressão gênica também pode ser detectada ou quantificada utilizando técnicas de hibridação realizadas por hibridação direta a uma matriz ou utilizando um ensaio multiplex, os produtos em que são detectados em uma matriz. Estes métodos podem ser facilmente adaptados por substituição de marcadores ópticos e detecção de fluorescência com as técnicas de detecção à base de carga, e marcadores de carga redox-ativo 18 aqui estabelecidos.

[00103] Deve ser apreciado que todas as combinações dos conceitos anteriores e conceitos adicionais discutidos em maior detalhe abaixo (desde que tais conceitos não são mutuamente incompatíveis) estão contemplados como sendo parte da matéria inventiva aqui divulgada. Em particular, todas as combinações de matéria reivindicada aparecendo até o final do presente relatório descritiva são contemplados como sendo parte do assunto da matéria inventiva aqui divulgada. Também deve ser entendido que a terminologia empregada explicitamente aqui também pode aparecer em qualquer divulgação incorporada por referência que deve ser atribuído um significado mais consistente com os conceitos particulares aqui revelados.

[00104] As referência ao longo do relatório descritivo para “um exemplo”, “outro exemplo”, “o exemplo”, e, assim por diante, significa que um elemento particular (por exemplo, recurso, estrutura, e / ou a característica) descrita em ligação com o exemplo está incluída em, pelo menos, um exemplo aqui descrito, e pode ou pode não estar presente em outros exemplos. Além disso, é para ser entendido que os elementos descritos para qualquer exemplo podem ser combinados de qualquer modo adequado nos vários exemplos, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[00105] Os termos “substancialmente” e “cerca de” utilizado ao longo desta divulgação, incluindo as reivindicações, são usados para descrever e contam para as pequenas flutuações, tais como devido a variações no processamento. Por exemplo, eles podem referir-se a menos do que ou igual a ± 5%, tal como menos do que ou igual a ± 2%, tal como menos do que ou igual a ± 1%, tal como menos do que ou igual a ± 0,5%, tal como menos do que ou igual a ± 0,2%, tal como menos do que ou igual a ± 0,1%, tal como menos do que ou igual a ± 0,05%.

[00106] Além disso, é para ser entendido que as gamas aqui proporcionadas incluem o intervalo indicado e qualquer valor ou sub-intervalo dentro do intervalo indicado, como se tal valor ou sub-faixa foram explicitamente recitados. Por exemplo, uma gama representado por desde cerca de 1 carga de cerca de 100 cargas, deve ser interpretado para incluir não apenas os limites explicitamente citados de entre cerca de uma carga de cerca de 100 cargas, mas também a incluir valores individuais, tais como cerca de 5 cargas, 50 cargas, 75 cargas, etc., e sub-intervalos, tal como de cerca de 15 a cerca de 85 cargas cargas, etc.

[00107] Durante vários exemplos foram descritos em detalhe, é para ser entendido que os exemplos descritos podem ser modificados. Portanto, a descrição anterior é para ser considerado não limitante.

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES

1. Nucleotídeo marcado caracterizado pelo fato de que compreende: um nucleotídeo; uma molécula de ligação conectada a um grupo fosfato do nucleotídeo; e um marcador de carga redox-ativo ligado à molécula de ligação, o marcador de carga redox-ativo a ser oxidado ou reduzido por um canal eletricamente condutor, quando mantido na proximidade de uma zona de detecção do canal eletricamente condutor.

2. Nucleotídeo marcado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador de carga redox- ativo inclui um átomo de metal coordenado que deve sofrer uma reação redox.

3. Nucleotídeo marcado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação compreende uma região de especificidade ligada ao marcador de carga redox-ativo.

4. Nucleotídeo marcado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a região de especificidade é para interagir com uma região aceptora em um tirante ligado ao canal eletricamente condutor, e a região de especificidade inclui um marcador de afinidade.

5. Nucleotídeo marcado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região de especificidade é para hibridizar com a região aceptora no tirante ligada ao canal eletricamente condutor, e o marcador de afinidade inclui uma sequência de nucleotídeos incluindo de cerca de um nucleotídeo a cerca de dez nucleotídeos ou uma sequência de ácido nucleico peptídico incluindo de cerca de um ácido nucleico peptídico a cerca de dez ácidos nucleicos peptídicos.

6. Nucleotídeo marcado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que: o marcador de carga redox-ativo inclui 10 cargas ou menos em um estado não oxidado ou não reduzido; e o marcador de carga redox-ativo inclui de cerca de 1 carga a cerca de 100 cargas em um estado oxidado ou reduzido.

7. Método caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir um ácido nucleico modelo em um canal eletricamente condutor com uma polimerase amarrada a ele; introduzir nucleotídeos marcados no canal eletricamente condutor, pelo menos um dos nucleotídeos marcados, incluindo um nucleotídeo e um marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo anexada ao mesmo, em que um dos nucleotídeos marcados se associa à polimerase; enquanto que um dos nucleotídeos marcados está associado, iniciando uma reação redox entre o marcador e carga redox-ativo específica de nucleotídeo e o canal eletricamente condutor para alterar um estado de carga do marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo; e em resposta à reação redox, detectar uma resposta do canal eletricamente condutor.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: iniciar a reação redox envolve a aplicação de uma tensão de carga ao canal eletricamente condutor; e detectar a resposta envolve a aplicação de uma tensão de leitura no canal eletricamente condutor.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de compreender ainda: associar a resposta do canal eletricamente condutor com o marcador de carga redox-ativo específico do associado dos nucleotídeos marcados; e com base no marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo, identificar o nucleotídeo do nucleotídeo marcado associado.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender ainda a clivagem do marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo do um dos nucleotídeos marcados associados, em que o nucleotídeo do nucleotídeo marcado associado é incorporado em uma fita nascente complementar ao ácido nucleico molde.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: a associação de um dos nucleotídeos marcados, o início da reação redox, a detecção, a associação e a identificação juntos são um ciclo de sequenciamento; e o método compreende ainda: executar um próximo ciclo de sequenciamento por: permitir que um próximo nucleotídeo marcado se associe à polimerase; enquanto o próximo dos nucleotídeos marcados estiver associado, iniciando uma outra reação redox entre um outro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo e o canal eletricamente condutor para alterar um estado de carga do outro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo; em resposta à outra reação redox, detectar uma outra resposta do canal eletricamente condutor; associar a outra resposta do canal eletricamente condutor com o outro marcador de carga redox-ativo específica de nucleotídeo; e com base no outro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo, identificar o nucleotídeo do próximo nucleotídeo marcado.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender ainda: clivar o outro marcador de carga redox-ativo específico de nucleotídeo, em que o nucleotídeo do próximo dos nucleotídeos marcados é incorporado na fita nascente complementar ao ácido nucleico molde; e repetir o ciclo de sequenciamento.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que o marcador de carga redox-ativo inclui um átomo de metal coordenado que deve sofrer uma reação redox.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que: o marcador de carga redox-ativo inclui 10 cargas ou menos em um estado não oxidado ou não reduzido; e o marcador de carga redox-ativo inclui de cerca de 1 carga a cerca de 100 cargas em um estado de carga alterado.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que:

os nucleotídeos marcados incluem: um primeiro nucleotídeo marcado incluindo polifosfato de desoxiadenosina como o nucleotídeo e um primeiro marcador de carga redox-ativo específico do nucleotídeo; um segundo nucleotídeo marcado incluindo polifosfato de desoxiganosina como o nucleotídeo e um segundo marcador de carga redox-ativo específico do nucleotídeo; um terceiro nucleotídeo marcado, incluindo polifosfato de desoxicitidina como nucleotídeo e um terceiro marcador de carga redox-ativo específico para nucleotídeo; e um quarto nucleotídeo marcado incluindo polifosfato de desoxitimidina como nucleotídeo e um quarto marcador de carga redox-ativo específico para nucleotídeo; e o primeiro, o segundo, o terceiro e o quarto marcadores de carga redox-ativos específicos para nucleotídeos são diferentes um do outro.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que dois dos primeiro, segundo, terceiro e quarto marcadores de carga redox-ativos específicos para nucleotídeos são carregadas positivamente em um estado de carga alterado, e, em que outros dois do primeiro, do segundo, do terceiro e do quarto marcadores de carga redox-ativos específicos de nucleotídeo são carregados negativamente no estado de carga alterado.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 16, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados estão presentes em um tampão com pouco sal.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 17, caracterizado pelo fato de que o canal eletricamente condutor é um canal de um transistor de efeito de campo.

19. Kit caracterizado pelo fato de que compreende: uma célula de fluxo, incluindo: um canal eletricamente condutor com um tirante ligado a ele; e uma polimerase ligada ao canal eletricamente condutor via o tirante; um ácido nucleico molde a ser introduzido na célula de fluxo; reagentes a serem introduzidos na célula de fluxo, os reagentes incluindo nucleotídeos marcados, pelo menos um dos nucleotídeos marcados, incluindo: um nucleotídeo; uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato do nucleotídeo; e uma marcador de carga redox-ativo anexado à molécula de ligação, o marcador de carga redox-ativo a ser oxidado ou reduzido pelo canal eletricamente condutor quando mantido na proximidade de uma zona de detecção do canal eletricamente condutor; e um detector para detectar uma resposta do canal eletricamente condutor quando uma reação redox ocorre entre o marcador de carga redox-ativo e o canal eletricamente condutor.

20. Kit, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o marcador de carga redox-ativo é selecionado do grupo que consiste em ferroceno,

tetrabenzoporfirina de zinco, ftalocianina de cobalto, tris- (2,2'-bipirimidina) rutênio, álcool 4-ferrocenilbenzílico, 5 - (4-hidroximetilfenil) -10,15,20- trimesitilporfinatozinco (II) e um calixareno redox ativo.

21. Kit, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que: o marcador de carga redox-ativo inclui 10 cargas ou menos em um estado não oxidado ou não reduzido; e o marcador de carga redox-ativo inclui de cerca de 1 carga a cerca de 100 cargas em um estado oxidado ou reduzido.

22. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o canal eletricamente condutor é um canal de um transistor de efeito de campo.