KR20200023281A - 표지된 뉴클레오티드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뉴클레오티드, 뉴클레오티드의 포스페이트기에 부착된 연결 분자, 및 연결 분자에 부착된 산화환원-활성 전하 태그를 포함하는 표지된 뉴클레오티드에 관한 것이다. 산화환원-활성 전하 태그는 전기 전도성 채널의 감지 구역에 근접하여 유지될 때 전기 전도성 채널에 의해 산화되거나 또는 환원된다.

Description

표지된 뉴클레오티드 및 이의 용도
본 발명은 표지된 뉴클레오티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
생물학적 또는 화학적 연구에서의 다양한 프로토콜은 국소 지지체 표면 또는 사전 정의된 반응 챔버 내에서 다수의 제어된 반응을 수행하는 것을 수반한다. 이후 지정된 반응이 관찰 또는 검출될 수 있고, 후속 분석은 반응에 관여하는 화학 물질의 특성을 식별 또는 밝히는 것을 도울 수 있다. 일부 예에서, 제어된 반응은 형광을 생성하므로, 광학 시스템이 검출에 사용될 수 있다. 다른 예에서, 제어된 반응은 전하, 전도성 또는 일부 다른 전기적 특성을 변경하므로, 전자 시스템이 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명에 개시된 제 1 양태는 표지된 뉴클레오티드이다. 숫자 1-6은 이 제 1 양태에 관한 것이다.
1. 일 예에서, 표지된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드; 뉴클레오티드의 포스페이트기에 부착된 연결 분자; 및 연결 분자에 부착된 산화환원-활성(redox-active) 전하 태그(charge tags)를 포함하고, 산화환원-활성 전하 태그는 전기 전도성 채널의 감지 구역에 근접하여 유지될 때 전기 전도성 채널에 의해 산화되거나 또는 환원된다.
2. 표지된 뉴클레오티드의 예 (1)에서, 산화환원-활성 전하 태그는 산화환원 반응을 겪는 배위 금속 원자를 포함한다.
3. 표지된 뉴클레오티드의 예 (1) 또는 (2)에서, 연결 분자는 산화환원-활성 전하 태그에 부착된 특이성 영역(specificity region)을 포함한다.
4. 예 (3)에서, 특이성 영역은 전기 전도성 채널에 결합된 테더(tether)상의 수용체 영역과 상호 작용하고, 특이성 영역은 친화성 태그를 포함한다.
5. 예 (4)에서, 특이성 영역은 전기 전도성 채널에 결합된 테더상의 수용체 영역에 혼성화되고, 친화성 태그는 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 약 1개의 펩타이드 핵산 내지 약 10개의 펩타이드 핵산을 포함하는 펩타이드 핵산 서열을 포함한다.
6. 표지된 뉴클레오티드의 예 (1) 내지 (5) 중 임의의 것에서, 산화환원-활성 전하 태그는 비-산화 또는 비-환원 상태에서 10개 이하의 전하를 포함하고; 및 산화환원-활성 전하 태그는 산화 또는 환원 상태에서 약 1개의 전하 내지 약 100개의 전하를 포함한다.
예 (1) 내지 (6)을 포함하여, 본 발명에 개시된 표지된 뉴클레오티드의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식 및/또는 구성으로 함께 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명에 개시된 제 2 양태는 방법이다. 숫자 7-18은 이 제 2 양태에 관한 것이다.
7. 일 예에서, 방법은 폴리머라제가 테더링된 전기 전도성 채널에 주형 핵산을 도입하는 단계; 표지된 뉴클레오티드를 전기 전도성 채널에 도입하는 단계로, 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 뉴클레오티드 및 이에 부착된 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하여, 표지된 뉴클레오티드 중 하나가 폴리머라제와 연계된다(associate); 표지된 뉴클레오티드 중 하나가 연계되는 동안, 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그의 전하 상태를 변경하기 위해 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그와 전기 전도성 채널 사이에서 산화환원 반응을 개시하는 단계; 및 산화환원 반응에 응답하여, 전기 전도성 채널의 응답을 검출하는 단계를 포함한다.
8. 방법의 예 (7)에서, 산화환원 반응을 개시하는 단계는 전기 전도성 채널에 충전 전압을 인가하는 것을 포함하며; 및 전기 전도성 채널의 응답을 검출하는 단계는 전기 전도성 채널에 판독 전압을 인가하는 것을 포함한다.
9. 방법 (7) 또는 (8)의 예는 전기 전도성 채널의 응답을 표지된 뉴클레오티드 중 관련된 하나의 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그와 연계시키는 단계; 및 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그에 기초하여, 관련된 표지된 뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
10. 예 (9)는 또한 표지된 뉴클레오티드 중 관련된 하나로부터 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 절단하는 단계를 추가로 포함하여, 관련된 표지된 뉴클레오티드의 뉴클레오티드가 주형 핵산에 상보적인 초기 가닥에 통합된다.
11. 예 (10)에서, 표지된 뉴클레오티드 중 하나의 연계, 산화환원 반응의 개시, 검출, 연계, 및 식별은 함께 시퀀싱 사이클이며; 및 방법은 표지된 뉴클레오티드 중 다음 하나가 폴리머라제와 연계되도록하는 단계; 표지된 뉴클레오티드 중 다음 하나가 연계되는 동안, 다른 뉴클레오타이드-특이적 산화환원-활성 전하 태그의 전하 상태를 변경하기 위해 다른 뉴클레오타이드-특이적 산화환원-활성 전하 태그와 전기 전도성 채널 사이에서 다른 산화환원 반응을 개시하는 단계; 다른 산화환원 반응에 응답하여, 전기 전도성 채널의 다른 응답을 검출하는 단계; 전기 전도성 채널의 다른 응답을 다른 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그와 연계시키는 단계; 및 다른 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그에 기초하여, 표지된 뉴클레오티드의 다음 하나의 뉴클레오티드를 식별하는 단계에 의해 다음 시퀀싱 사이클을 수행하는 것을 추가로 포함한다.
12. 예 (11)은 또한 표지된 뉴클레오티드의 다음 하나의 다른 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 절단하는 단계로, 이에 의해 뉴클레오티드가 주형 핵산에 상보적인 초기 가닥에 통합된다; 및 시퀀싱 사이클을 반복하는 단계를 추가로 포함한다.
13. 방법의 예 (7) 내지 (12) 중 임의의 것에서, 산화환원-활성 전하 태그는 산화환원 반응을 겪는 배위 금속 원자를 포함한다.
14. 방법의 예 (7) 내지 (13) 중 임의의 것에서, 산화환원-활성 전하 태그는 비-산화 또는 비-환원 상태에서 10개 이하의 전하를 포함하고; 및 산화환원-활성 전하 태그는 변경된 전하 상태에서 약 1개의 전하 내지 약 100개의 전하를 포함한다.
15. 방법의 예 (7) 내지 (14) 중 임의의 것에서, 표지된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드로서 데옥시아데노신 폴리포스페이트 및 제 1 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하는 제 1 표지된 뉴클레오티드; 뉴클레오티드로서 데옥시구아노신 폴리포스페이트 및 제 2 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하는 제 2 표지된 뉴클레오티드; 뉴클레오티드로서 데옥시시티딘 폴리포스페이트 및 제 3 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하는 제 3 표지된 뉴클레오티드; 및 뉴클레오티드로서 데옥시티미딘 폴리포스페이트 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하는 제 4 표지된 뉴클레오티드를 포함하고; 및 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그는 서로 상이하다.
16. 예 (15)에서, 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그 중 2개가 변경된 전하 상태에서 양으로 하전되고, 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그 중 다른 2개가 변경된 전하 상태에서 음으로 하전된다.
17. 방법의 예 (7) 내지 (16) 중 임의의 것에서, 표지된 뉴클레오티드는 저염 완충액에 존재한다.
18. 방법의 예 (7) 내지 (17) 중 임의의 것에서, 전기 전도성 채널은 전계 효과 트랜지스터의 채널이다.
예 (7) 내지 (17)을 포함하여, 방법의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식으로 함께 연계될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 이 방법 및/또는 표지된 뉴클레오티드의 특징의 임의의 조합이 함께 사용될 수 있고/있거나 본 발명에 개시된 임의의 예와 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명에 개시된 제 3 양태는 키트이다. 숫자 19-22는 이 제 3 양태에 관한 것이다.
19. 일 예에서, 키트는 테더가 부착된 전기 전도성 채널 및 테더를 통해 전기 전도성 채널에 부착된 폴리머라제를 포함하는 플로우 셀; 플로우 셀에 도입되는 주형 핵산; 플로우 셀 내로 도입되는 시약으로, 시약은 표지된 뉴클레오티드를 포함하며, 표지된 뉴클레오티드의 적어도 하나는 다음을 포함한다: 뉴클레오티드; 뉴클레오티드의 포스페이트기에 부착된 연결 분자; 및 연결 분자에 부착된 산화환원-활성 전하 태그, 산화환원-활성 전하 태그는 전기 전도성 채널의 감지 구역에 근접하여 유지될 때 전기 전도성 채널에 의해 산화되거나 또는 환원된다; 및 산화환원-활성 전하 태그 및 전기 전도성 채널 사이에서 산화환원 반응이 일어날 때 전기 전도성 채널로부터의 응답을 검출하기 위한 검출기를 포함한다.
20. 키트의 예 (19)에서, 산화환원-활성 전하 태그는 페로센, 아연 테트라벤조포르피린, 코발트 프탈로시아닌, 트리스-(2,2'-바이피리미딘)루테늄, 4-페로세닐벤질 알코올, 5-(4-하이드록시메틸페닐)-10,15,20-트리메시틸포르피나토아연(II), 및 산화환원-활성 칼릭사렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
21. 키트의 예 (19) 또는 (20) 중 임의의 것에서, 산화환원-활성 전하 태그는 비-산화 또는 비-환원 상태에서 10개 이하의 전하를 포함하고; 및 산화환원-활성 전하 태그는 산화 또는 환원 상태에서 약 1개의 전하 내지 약 100개의 전하를 포함한다.
22. 키트의 예 (19) 내지 (21) 중 임의의 것에서, 전기 전도성 채널은 전계 효과 트랜지스터의 채널이다.
예 (19) 내지 (22)를 포함하여, 이 키트의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식으로 함께 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 이 키트 및/또는 방법 및/또는 표지된 뉴클레오티드의 특징의 임의의 조합이 함께 사용될 수 있고/있거나 본 발명에 개시된 임의의 예와 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
또한, 임의의 표지된 뉴클레오티드 및/또는 임의의 방법 및/또는 임의의 키트의 특징은 임의의 바람직한 방식으로 함께 조합될 수 있고/있거나 또는 본 발명에 개시된 임의의 예와 조합될 수 있다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명의 예의 특징은 다음의 상세한 설명 및 도면을 참조함으로써 명백해질 것이며, 유사한 도면 부호는 유사하지만 동일하지는 않은 구성 요소에 대응한다. 간결성을 위해, 전술한 기능을 갖는 도면 부호 또는 특징은 이들이 나타나는 다른 도면과 관련하여 설명될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
도 1은 표지된 뉴클레오티드의 예의 개략도이다.
도 2는 본 발명에 개시된 시스템의 예의 개략적인 부분 사시도이다.
도 3은 전하 센서의 전기 전도성 채널에 부착되고 전하에 기초하여 구별될 수 있는 표지된 뉴클레오티드와 연계된 폴리머라제의 개략도이다.
도 4는 본 발명에 개시된 방법의 예를 나타내는 흐름도이다.
도 5a는 시퀀싱 방법에 사용되는 표지된 뉴클레오티드의 예의 개략도이다.
도 5b는 본 발명에 개시된 표지된 뉴클레오티드의 예의 테더 및 특이성 영역 사이의 상호 작용의 예의 개략도이다.
핵산 서열 분석 절차에서 단일 분자 검출에 사용될 수 있는 표지된 뉴클레오티드가 본 발명에 개시된다. 단일 분자 검출에 사용되는 센서는 하나의 폴리머라제가 부착된 하나의 전기 전도성 채널을 가질 수 있다. 이는 하나의 통합 이벤트(즉, 폴리머라제에 의해 염기를 초기(nascent) 가닥으로 통합)가 각각의 개별 센서에서 한 번에 검출될 수 있게 한다. 표지된 뉴클레오티드는 핵산 시퀀싱 및 일반적으로 핵산 및 다른 분석물의 검출에 사용될 수 있는 독특한 검출 양식을 제공한다.
표지된 뉴클레오티드(10)의 예는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 표지된 뉴클레오티드(10)는 뉴클레오티드(12), 뉴클레오티드(12)의 포스페이트기(16)에 부착된 연결 분자(14 또는 14'), 및 연결 분자(14 또는 14')에 부착된 산화환원-활성 전하 태그(18)를 포함하며, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 전기 전도성 채널(32)의 감지 구역(도면 부호 31, 도 3)에 근접하여 유지될 때 전기 전도성 채널(도면 부호 32, 도 2)에 의해 산화되거나 또는 환원된다. 표지된 뉴클레오티드(10)는 비-천연 또는 합성 뉴클레오티드로 여겨질 수 있으며, 이는 천연 뉴클레오티드와 구조적으로 또는 화학적으로 구별되기 때문이다.
표지된 뉴클레오티드(10)의 뉴클레오티드(12)는 천연 뉴클레오티드일 수 있다. 천연 뉴클레오티드는 질소-함유 헤테로사이클릭 염기(20), 당(22) 및 하나 이상의 포스페이트기(16)를 포함한다. 천연 뉴클레오티드의 예는, 예를 들어, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 리보뉴클레오티드에서, 당(22)은 리보스이고, 데옥시리보뉴클레오티드에서, 당(22)은 데옥시리보스, 즉 리보스에서 2' 위치에 존재하는 히드록실기가 없는 당이다. 일 예에서, 뉴클레오티드(12)는 여러 포스페이트기(16)(예를 들어, 트리-포스페이트(즉, 감마 포스페이트), 테트라-포스페이트, 펜타-포스페이트, 헥사-포스페이트 등)를 포함하기 때문에 폴리포스페이트 형태이다. 헤테로사이클릭 염기(20)(즉, 핵염기)는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 이의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 사이토신(C), 티민(T), 및 우라실(U), 및 이의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 핵산 유사체는 포스페이트 골격, 당 또는 변형된 핵염기 중 임의의 것을 가질 수 있다. 핵산 유사체의 예는, 예를 들어, 범용 염기 또는 포스페이트-당 골격 유사체, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다.
표지된 뉴클레오티드(10)는 또한 연결 분자(14 또는 14')를 포함한다. 일부 예에서, 연결 분자(도 1에서 14로 도시됨)는 특이성 영역(24)을 포함하지 않는다. 다른 예에서, 연결 분자(도 1에서 14'로 도시됨)는 특이성 영역(24)을 포함한다. 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이, 특이성 영역(24)이 연결 분자(14')의 일부인 경우, 영역(24)은 산화환원-활성 전하 태그(18)에 화학적으로 결합하는 말단에 위치할 수 있다. 특이성 영역(24)은 이하에서 추가로 설명될 것이다.
표지된 뉴클레오티드(10)의 연결 분자(14 또는 14')는 하나의 말단에서 뉴클레오티드(12)의 포스페이트기(16)에 화학적으로 결합할 수 있고 다른 말단에서 산화환원-활성 전하 태그(18)에 화학적으로 결합할 수 있는 임의의 긴 사슬 분자일 수 있다. 연결 분자(14 또는 14')는 또한 본 발명에 개시된 시스템(30)(도 2 참조)에 사용된 폴리머라제(26)와 상호 작용하지 않도록 선택될 수 있다. 연결 분자(14 또는 14')는 산화환원-활성 전하 태그(18)가 전기 전도성 채널(32)(도 2)의 감지 구역(31)(도 3) 내에 머물 수 있도록 충분히 길도록 선택된다. 예로서, 연결 분자(14 또는 14')는 알킬 사슬, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬, 아미도기, 포스페이트기, 헤테로사이클, 예컨대 트리아졸, 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 알킬 사슬의 예는 적어도 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있고, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬의 예는 적어도 3개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함할 수 있다.
다음의 예는 연결 분자(14, 14')가 알킬 사슬, 아미드기, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬 및 트리아졸을 포함하는 표지된 뉴클레오티드(10)의 예를 도시한다:
Figure pct00001
다음의 예는 연결 분자(14, 14')가 알킬 사슬, 아미드기, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬, 트리아졸 및 포스페이트기를 포함하는 표지된 뉴클레오티드(10)의 다른 예를 도시한다:
Figure pct00002
다음의 예는 연결 분자(14, 14')가 알킬 사슬, 아미드기, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬, 트리아졸 및 포스페이트기를 포함하는 표지된 뉴클레오티드(10)의 또 다른 예를 도시한다:
Figure pct00003
다음의 예는 연결 분자(14, 14')가 알킬 사슬, 아미드기, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬, 트리아졸, 포스페이트기 및 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 표지된 뉴클레오티드(10)의 또 다른 예를 도시한다:
Figure pct00004
몇몇 예시적인 연결 분자(14, 14')가 기술되었지만, 다른 연결 분자(14, 14')가 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
도 1 및 이전 예에서 도시된 바와 같이, 표지된 뉴클레오티드(10) 중 일부는 또한 연결 분자(14')의 일부로서 특이성 영역(24)을 포함할 수 있다. 특이성 영역(24)은 전기 전도성 채널(32)에 결합된 테더(28)(도 2)상의 수용체 영역과 상호 작용할 수 있다. 특이성 영역(24)은 친화성 태그를 포함할 수 있으며, 이는 테더(28)의 수용체 영역에 일시적으로 부착할 수 있다. 친화성 태그의 결합 친화력은 표지된 뉴클레오티드(10)가 폴리머라제(26)에 의해 유지될 때 특이성 영역(24)을 테더(28)의 수용체 영역에 결합하기에 충분히 강할 수 있지만, 또한 통합(incorporation) 이벤트 후에 (예를 들어, 폴리머라제(26)가 자연적으로 알파 포스페이트와 연결 분자(14, 14') 사이 또는 알파 포스페이트와 베타 포스페이트 사이의 결합을 절단할 때) 수용체 영역으로부터 특이성 영역(24)을 놓아주기에 충분히 약할 수 있다. 다시 말해서, 수용체 영역으로의 그리고 그로부터의 특이성 영역(24)(예를 들어, 친화성 태그)의 온- 및 오프- 레이트(rate)는 전체적인 단일 분자 감지를 개선하기 위해 선택될 수 있다. 친화성 태그/수용체 영역 상호 작용의 온-레이트는, 예를 들어, 뉴클레오티드 통합 전에 특이성 영역(24)의 효과적으로 높은 농도, 따라서 친화성 태그로 인해 높을 수 있다. 이러한 높은 온-레이트는 친화성 태그가 수용체 영역에 결합되는 시간의 단편(fraction of time)을 증가시킨다. 절단 후, 상호 작용의 오프-레이트는 또한 다음(next) 표지된 뉴클레오티드(10)가 폴리머라제(26) 활성 부위에 들어갈 때 결합 상태(이전에 통합된 뉴클레오티드의 친화성 태그와 수용체 영역 사이)의 가능성이 낮을 정도로 복합체(친화성 태그와 수용체 영역 사이)가 신속하게 해리될 정도로 충분히 높게 선택될 수 있다.
특정 예에서, 특이성 영역(24)은 테더(28)상의 수용체 영역에 혼성화되므로, 친화성 태그는 테더(28)상의 수용체 영역에 일시적으로 부착될 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 펩타이드 핵산 서열을 포함할 수 있다(도 2). 예에서, 친화성 태그는 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 10개의 뉴클레오티드 또는 약 1개의 펩타이드 핵산 내지 약 10개의 펩타이드 핵산을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 예에서, 친화성 태그는 최대 6개의 뉴클레오티드 또는 펩타이드 핵산을 포함한다. 또 다른 예에서(도 5b에 추가로 도시되고 기술된 바와 같이), 특이성 영역(24)은 뉴클레오티드 서열의 양쪽에 위치하는(flanking) 이노신(들)을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 친화성 태그는 서로에 대해 또는 친수성 폴리머에 대해 친화성을 갖는 펩타이드와 같은 비-핵산 모이어티일 수 있다. 특정 단백질 예는 나선형 코일(coiled coil)을 포함하며, 이는 로프의 가닥과 같은 2-7개의 알파-헬릭스가 함께 코일링된 단백질의 구조적 모티프이다. 다시 말하면, 나선형 코일은 서로 감겨서 슈퍼 코일을 형성하는 2개 이상의 알파-헬릭스에 의해 만들어진다. 나선형 코일의 예는 c-Fos 및 c-jun과 같은 종양 단백질(oncoproteins)을 포함한다.
산화환원-활성 전하 태그(18)는, 예를 들어, 전기 전도성 채널(32)의 감지 구역(31)에 근접하여 유지될 때, 전기 전도성 채널(32)에 의해 산화되거나(전자 손실) 또는 환원되는(전자 획득) 경우, 이의 전하를 증가시킬 수 있는 임의의 전하 태그일 수 있다. 전하 태그(18)는 산화환원 반응이 일어나기 전에 전체적으로 중성(제로 전하)이거나 이 상태에 근접할 수 있다(10개 전하 이하). 다시 말하면, 비-산화 또는 비-환원 상태에서, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 10개 이하의 전하를 운반한다. 산화환원-활성 전하 태그(18)에 의해 운반되는 전하는 표지된 뉴클레오티드(10)의 포스페이트(16) 또는 연결 분자(14, 14')의 임의의 전하를 포함하지 않는다. 산화환원 반응이 일어난 후, 산화환원-활성 전하 태그(18)의 순 전체 전하는 변한다(즉, 더 많은 양의 전하 또는 더 많은 음의 전하를 운반한다). 일 예에서, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 비-산화 또는 비-환원 상태에서 10개 이하의 전하를 포함하며, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 산화 또는 환원 상태에서 약 1개의 전하 내지 약 100개의 전하를 포함한다. 비-산화 또는 비-환원 상태에서의 산화환원-활성 전하 태그(18)의 전하의 수는 산화 또는 환원 상태에서의 산화환원-활성 전하 태그(18)의 전하의 수보다 작다는 것을 이해해야 한다. 다른 예에서, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 비-산화 또는 비-환원 상태에서 10개 이하의 전하를 포함하고, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 산화 또는 환원 상태에서 약 20개의 전하 내지 약 50개의 전하를 포함한다.
산화환원-활성 전하 태그(18)는 산화환원 반응을 겪을 수 있는 임의의 배위된(즉, 제자리에 유지된) 금속 원자를 포함할 수 있다. 금속 원자의 예는 철, 코발트, 루테늄, 아연, 구리, 리튬, 은 등을 포함한다. 일부 특정 예로서, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 페로센, 아연 테트라벤조포르피린, 코발트 프탈로시아닌, 트리스-(2,2'-바이피리미딘)루테늄, 4-페로세닐벤질 알코올, 5-(4-하이드록시메틸페닐)-10,15,20-트리메시틸포르피나토아연(II), 및 산화환원-활성 칼릭사렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
페로센은 화학식 Fe(C5H5)2를 포함하는 임의의 유기금속 화합물일 수 있다. 구체적인 예는 페로센 덴드리머이다:
Figure pct00005
여기서 Fe2+는 산화시 Fe3+가 될 수 있고, 따라서 각각의 "Fe"에서 양전하를 도입한다.
아연 테트라벤조포르피린은 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00006
여기서 R=C2H5, C6H13 또는 C12H25. Zn1+는 산화시 Zn2+가 될 수 있고, 따라서 양전하를 도입한다.
코발트 프탈로시아닌의 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00007
및
Figure pct00008
, 둘 모두 용액에서 전체적으로 중성(net-neutral)인 분자이다. 산화시, Co2+는 Co3+가 되고, 따라서 각각의 "Co"에서 양전하(예를 들어, 제 1 구조에 대해 1개의 양전하 및 제 2 구조에 대해 5개의 양전하)를 도입한다. -3 내지 +5 범위의 산화 상태를 갖는 다른 코발트 함유 화합물이 공지되어 있으며, 음으로 대전 가능한 산화환원-활성 전하 태그(18) 또는 양으로 대전 가능한 산화환원-활성 전하 태그(18)로서 사용될 수 있다.
트리스-(2,2'-바이피리미딘)루테늄은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00009
여기서 Ru2+는 산화시 Ru3+가 될 수 있고, 따라서 양전하를 도입한다.
4-페로세닐벤질 알코올은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00010
여기서 Fe2+는 산화시 Fe3+가 될 수 있고, 따라서 양전하를 도입한다.
5-(4-하이드록시메틸페닐)-10,15,20-트리메시틸포르피나토아연(II)은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00011
여기서 Zn2+는 환원시 Zn1+가 될 수 있고, 따라서 음전하를 도입한다.
산화환원-활성 칼릭사렌의 일부 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
전술한 각각의 산화환원 반응은 가역적이므로, 화합물은 더 높은 산화 상태에서 사용될 수 있고 전기 전도성 채널 감지 구역(31)에 있을 때 환원될 수 있거나, 또는 더 낮은 산화 상태에서 사용될 수 있고 전기 전도성 채널 감지 구역(31)에 있을 때 산화될 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 개시된 산화환원-활성 전하 태그(18)는 용액에서 중성 또는 거의-중성일 수 있으며, 산화환원 반응을 겪을 때까지 더 큰 전하를 운반하지 않는다. 이와 같이, 용액 중 표지된 뉴클레오티드(10)는 고하전된(highly charged) 분자로 간주되지 않으며, 반대로 하전된(oppositely charged) 표지된 뉴클레오티드(10)(반대로 하전된 거의-중성인 산화환원-활성 전하 태그(18)를 함유함) 사이의 응집은 덜 발생할 수 있다.
표지된 뉴클레오티드(10)는 키트 및/또는 시스템(30)에서 사용될 수 있다(후자의 예는 도 2에 도시됨). 키트 또는 시스템(30)은 전기 전도성 채널(32)을 포함할 수 있다. 전기 전도성 채널(32)은 웰, 튜브, 채널, 큐벳, 페트리 플레이트, 병 등과 같은 용기 내에 있거나 또는 용기의 일부일 수 있다. 적합한 용기의 다른 예는 플로우 셀(34)이다. 본 발명에 기재된 구현에 적합한 임의의 플로우 셀 구성이 사용될 수있다. 일부 예시적인 플로우 셀은 일루미나 사(Illumina, Inc.)(샌디에고, CA)에서 시판되는 플로우 셀이다. 플로우 셀(34)은 반응 성분(예를 들어, 주형 핵산, 표지된 뉴클레오티드(10) 등)을 각각의 전기 전도성 채널(32)에 부착하는 동안 또는 전기 전도성 채널(32)상의 반응 성분을 사용하여 수행되는 이후 후속 반응 동안 벌크 시약을 개별적으로 주소 지정 가능한 전기 전도성 채널(32)의 어레이로 전달하는데 편리하다. 핵산 시퀀싱 반응과 같은 사이클 공정은 플로우 셀(34)에 특히 적합하다. 다른 특히 유용한 용기는 멀티웰 플레이트 또는 마이크로타이터 플레이트의 웰이다.
도 2에 도시된 예에서, 플로우 셀(34)은 전기 전도성 채널(32)을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "전기 전도성 채널"은 그 표면에서 또는 주변 전기장에서 전기 신호로의 섭동을 번역하는 검출 장치의 일부를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 전기 전도성 채널(32)은 반응 성분(예를 들어, 표지된 뉴클레오티드(10))의 도착 또는 출발을 전기 신호로 번역할 수 있다. 본 발명에 개시된 실시예에서, 전기 전도성 채널(32)은 또한 2개의 반응 성분(주형 핵산 및 표지된 뉴클레오티드(10)의 뉴클레오티드(20)) 사이의 상호 작용을 표지된 뉴클레오티드(10)의 산화환원-활성 전하 태그(18)와의 상호 작용을 통해 검출 가능한 신호로 번역할 수 있다.
전기 전도성 채널(32)은 전하 센서(35)의 채널일 수 있다. 전하 센서(35)는 소스 및 드레인 단자(S, D) 및 단자(S, D)를 연결하는 채널(32)을 포함할 수 있다. 채널(32)은 예를 들어, 튜브, 와이어, 플레이트 등과 같은 임의의 적절한 기하학적 구조를 가질 수 있다.
단자(S, D)는 임의의 적절한 전도성 재료일 수 있다. 적합한 소스 및 드레인 물질의 예는 코발트, 코발트 실리사이드, 니켈, 니켈 실리사이드, 알루미늄, 텅스텐, 구리, 티타늄, 몰리브덴, 인듐 주석 산화물(ITO), 인듐 아연 산화물, 금, 백금, 탄소 등을 포함한다.
전기 전도성 채널(32)은 산화환원-활성 전하 태그(18)를 산화 또는 환원시킬 수 있는 임의의 전도성 또는 반-전도성 물질을 포함할 수 있다. 물질은 유기 물질, 무기 물질 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 적합한 채널 물질의 일부 예는 실리콘, 탄소(예를 들어, 유리질 탄소, 그래핀 등), 폴리머, 예컨대 전도성 폴리머(예를 들어, 폴리피롤, 폴리아닐린, 폴리티오펜, 폴리(4-스티렌설포네이트)로 도핑된 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(PEDOT-PSS) 등), 금속 등을 포함한다.
일부 예에서, 전기 전도성 채널(26)은 또한 나노 스케일상의 적어도 하나의 치수(1nm 내지 1μm 미만)를 갖는 나노구조일 수 있다. 일 예에서, 이 치수는 가장 큰 치수를 지칭한다. 예로서, 전기 전도성 채널(26)은 반-도체 나노구조, 그래핀 나노구조, 금속 나노구조 및 전도성 폴리머 나노구조일 수 있다. 나노구조는 다중- 또는 단일-벽 나노튜브, 나노와이어, 나노리본 등일 수 있다.
예시적인 전하 센서(35)는 탄소 나노튜브(CNT) 기반 FET, 단일-벽 탄소 나노튜브(SWNT) 기반 FET, 실리콘 나노와이어(SiNW) FET, 폴리머 나노와이어 FET, 그래핀 나노리본 FET(및 예컨대 MoS2, 실리센(silicene) 등과 같은 2D 물질로 제조된 관련 나노리본 FET), 터널 FET(TFET)와 같은 전계 효과 트랜지스터(FET) 및 가파른 서브 임계값 기울기 장치(steep subthreshold slope devices)이다.
도 2에 도시된 예시적인 전하 센서(35)는 소스(S), 드레인(D) 및 소스(S)와 드레인(D) 사이의 전기 전도성 채널(32)을 포함하는 나노구조 FET이다. 전기 전도성 채널(32)은 탄소 나노튜브, 단일-벽 탄소 나노튜브, 실리콘 나노와이어, 폴리머 나노와이어 등일 수 있다. 전기 전도성 채널(32)은 게이트 단자로서 기능하므로, 도 2에서 "G"로도 도시되어 있다. 본 발명에 개시된 예에서, 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)은 표지된 뉴클레오타이드(10)의 산화환원-활성 전하 태그(18)에 대한 산화환원 전극(전자 제공 또는 수용)으로서 역할할 수 있다. 보다 구체적으로, 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)은 전자를 산화환원-활성 전하 태그(18)로 또는 그로부터 전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 전자 전달은 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)의 표면의 적어도 일부상에서 게이트 산화물(도시되지 않음)을 통한 터널링을 통해 일어날 수 있다. 일부 예에서, 게이트 산화물의 두께는 전류 전달 효율을 조절하는데 사용될 수 있어서 산화환원-활성 전하 태그(18)가 충분히 활성화되기 전에 최소량의 접촉 시간이 경과하도록 한다. 접촉 시간은 전자 전달이 높은 가능성으로 발생하기 위해 산화환원-활성 전하 태그(18)가 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)의 충분한 근처 내에 유지되는 시간을 지칭할 수 있다. 이 기간은 산화환원-활성 전하 태그(18)의 유형, 게이트 산화물 두께, 및 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)로부터의 전하 태그(18)의 거리를 포함하는 많은 요인에 의존할 것이다. 이는 전하 센서(35)가 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)과 일시적으로 접촉하지만 실제로 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)에 부착된 폴리머라제(26)와는 연계되지 않는 확산된 표지된 뉴클레오티드(10) 사이를 충분히 구별하는 것을 보증하기 위해 사용될 수 있다. 폴리머라제(26)의 활성 부위와 연계된 뉴클레오티드(10)는 일시적인 상호 작용이 발생하는 시간보다 상당히 긴 시간 동안 연계된 상태로 유지될 것으로 예상된다. 예를 들어, 표지된 뉴클레오티드(10)는 수백 마이크로 초 내지 수백 밀리 초 동안 폴리머라제 활성 부위(예를 들어, 폴리머라제(26))와 연계된 상태로 유지될 수 있다. 일시적인 상호 작용이 수십 배(orders of magnitude) 빠른 확산 시간 스케일에서 발생할 것이다.
이 예에서, 폴리머라제(26)는 테더(28)에 의해 전하 센서(32)의 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)에 고정된다. 테더(28)는 폴리머라제(26)를 위한 앵커로서 사용된다. 테더(28)는 전자 전달 능력을 나타낼 수 있다. 적합한 테더(28)의 예는 핵산 사슬(예를 들어, 5개 내지 25개의 뉴클레오티드를 가짐), 펩타이드, 단일 탄소 사슬, 비-전도성 또는 저 전도성 올리고머 또는 폴리머 등을 포함한다.
일부 예에서, 테더(28)는 폴리머라제(26)를 전하 센서(35)의 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)로부터 적어도 10nm 떨어져서 유지한다. 이는, 예를 들어, 폴리머 라제(26)의 전하 및/또는 폴리머라제(26)에 의해 유지되는 주형 핵산(36)의 음전하를 감지하는 것이 바람직하지 않을 경우, 바람직 할 수 있다. 그러나, 만약 폴리머라제(26) 및/또는 주형 핵산(36)의 전하를 감지하는 것이 바람직하면, 테더(28)는 폴리머라제(26)를 전하 센서(32)의 게이트(G)로부터 약 10nm 미만, 약 9nm 미만, 약 8nm 미만, 약 7nm 미만, 약 6nm 미만, 약 5nm 미만, 약 4nm 미만, 약 3nm 미만, 약 2nm 미만, 또는 약 1nm로 유지할 수 있다.
FET-기반 전하 센서(35)의 사용은 다음을 가능하게 할 수 있다: (1) 단일-분자 감도는 적절하게 설계된 FET로 달성될 수 있고, 및 (2) 검출된 전하의 변화가 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)의 근처에 국한되며, 이에 의해 이웃하는 개별적으로 어드레스 가능한 FET 사이트(예를 들어, 어레이) 사이의 크로스-토크를 피하기 때문에, 높은 수준의 병렬화("멀티플렉서빌리티"라고도 함)가 촉진될 수 있다. 더불어, 실리콘 나노구조 FET는 반도체 제조 설비와 호환되는 프로세스를 사용하여 제조될 수 있다.
키트 및/또는 시스템(30)의 예는 또한 플로우 셀(34) 내로 도입될 주형 핵산(36) 및 플로우 셀(34) 내로 도입될 시약(도 2에 도시되지 않음)을 포함할 수 있다.
주형 핵산(36)은 서열 분석될 임의의 샘플일 수 있으며, DNA, RNA 또는 이의 유사체로 구성될 수 있다. 주형(또는 표적) 핵산(36)의 소스는 게놈 DNA, 메신저 RNA, 또는 천연 소스로부터의 다른 핵산일 수 있다. 일부 경우에, 이러한 소스로부터 유래된 주형 핵산(36)은 본 발명의 방법 또는 시스템(30)에 사용되기 전에 증폭될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 롤링 서클 증폭(RCA), 다중 변위 증폭(MDA) 또는 랜덤 프라이머 증폭(RPA)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 임의의 공지된 증폭 기술이 사용될 수 있다. 본 발명에 제시된 방법 또는 시스템(30)에 사용하기 전에 표적 핵산(26)의 증폭은 선택적임을 이해해야 한다. 이와 같이, 일부 예에서 사용하기 전에 주형 핵산(36)은 증폭되지 않을 것이다. 주형/표적 핵산은 합성 라이브러리로부터 선택적으로 유래될 수 있다. 합성 핵산은 천연 DNA 또는 RNA 조성물을 가질 수 있거나 이의 유사체일 수 있다.
주형 핵산(36)이 유래될 수 있는 생물학적 샘플은, 예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 유제류, 말, 양, 돼지, 염소, 소, 고양이, 개, 영장류, 인간 또는 비-인간 영장류와 같은 포유류; 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 옥수수, 수수, 귀리, 밀, 쌀, 카놀라 또는 대두와 같은 식물; 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii)와 같은 조류; 예쁜꼬마 선충(Caenorhabditis elegans)과 같은 선충; 노랑 초파리(Drosophila melanogaster), 모기, 초파리, 꿀벌 또는 거미와 같은 곤충; 제브라피쉬와 같은 물고기; 파충류; 개구리 또는 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)와 같은 양서류; 딕티오스텔리움 디스코이데움(dictyostelium discoideum); 폐렴 구균(pneumocystis carinii), 타키푸구 루브리프(Takifugu rubripes), 효모, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharamoyces cerevisiae) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 곰팡이; 또는 플라스모듐 팔시파룸(plasmodium falciparum)으로부터의 것들을 포함한다. 주형 핵산(36)은 또한 원핵 생물, 예컨대 박테리아, 대장균, 포도상구균(staphylococci) 또는 마이코플라즈마 뉴모니애(mycoplasma pneumoniae); 고세균(archae); C형 간염 바이러스, 에볼라 바이러스 또는 인간 면역결핍 바이러스와 같은 바이러스; 또는 바이로이드로부터 유래할 수 있다. 주형 핵산(36)은 상기 유기체의 균질한 배양액 또는 집단 또는 대안적으로, 예를 들어, 공동체 또는 생태계에서, 여러 다른 유기체의 집합으로부터 유래될 수 있다.
더욱이, 주형/표적 핵산(36)은 천연 소스로부터 유래되지 않고, 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현 프로브 또는 유전자형 프로브는 본 발명에 제시된 예에서 합성되고 사용될 수 있다.
일부 예에서, 주형/표적 핵산(36)은 하나 이상의 큰 핵산의 단편으로 얻을 수 있다. 단편화는, 예를 들어, 분무, 초음파 처리, 화학적 절단, 효소 절단 또는 물리적 전단을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
단편화는 또한 큰 핵산의 일부만을 복사함으로써 앰플리콘을 생성하는 특정 증폭 기술의 사용에 기인할 수 있다. 예를 들어, PCR 증폭은 증폭 동안 플랭킹(flanking) 프라이머가 혼성화하는 위치 사이에 있는 원래 주형상의 뉴클레오티드 서열의 길이에 의해 정의된 크기를 갖는 단편을 생성한다.
주형/표적 핵산(36)의 집단 또는 이의 앰플리콘은 본 발명에 제시된 방법, 키트 또는 시스템(30)의 특정 적용에 바람직하거나 적합한 평균 가닥 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 평균 가닥 길이는 약 100,000개 뉴클레오티드, 50,000개 뉴클레오티드, 10,000개 뉴클레오티드, 5,000개 뉴클레오티드, 1,000개 뉴클레오티드, 500개 뉴클레오티드, 100개 뉴클레오티드 또는 50개 뉴클레오티드 미만일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 평균 가닥 길이는 약 10개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 100개 뉴클레오티드, 500개 뉴클레오티드, 1,000개 뉴클레오티드, 5,000개 뉴클레오티드, 10,000개 뉴클레오티드, 50,000개 뉴클레오티드 또는 100,000개 뉴클레오티드보다 클 수 있다. 표적 핵산의 집단 또는 이의 앰플리콘에 대한 평균 가닥 길이는 상기 기재된 최대 값과 최소 값 사이의 범위에 있을 수 있다.
일부 경우에, 주형/표적 핵산(36)의 집단은 조건 하에서 생성되거나 그 구성원에 대한 최대 길이를 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 구성원의 최대 길이는 약 100,000개 뉴클레오티드, 50,000개 뉴클레오티드, 10,000개 뉴클레오티드, 5,000개 뉴클레오티드, 1,000개 뉴클레오티드, 500개 뉴클레오티드, 100개 뉴클레오티드 또는 50개 뉴클레오티드 미만일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 주형 핵산(36)의 집단 또는 이의 앰플리콘은 조건 하에서 생성되거나 그 구성원에 대해 최소 길이를 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 구성원의 최소 길이는 약 10개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 100개 뉴클레오티드, 500개 뉴클레오티드, 1,000개 뉴클레오티드, 5,000개 뉴클레오티드, 10,000개 뉴클레오티드, 50,000개 뉴클레오티드 또는 100,000개 초과의 뉴클레오티드일 수 있다. 집단에서 주형 핵산(36)에 대한 최대 및 최소 가닥 길이는 상기 기재된 최대 값 및 최소 값 사이의 범위일 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 시퀀싱될 주형 핵산(36)(예를 들어, 단일 가닥 DNA 가닥)은, 이전에 기재한 표지된 뉴클레오티드(10)(도 2에는 도시되지 않음)와 같이, 시약과 함께 또는 시약으로부터 분리된 후 유체에 도입된 후 폴리머라제(26)에 결합된다.
주형 핵산(36) 및/또는 시약(예를 들어, 표지된 뉴클레오티드(10))은 유체 내에 존재할 수 있고 플로우 셀(34) 내로 도입될 수 있다. 유체는 저염 완충액을 포함할 수 있다. 예로서, 저염 완충액은 0mM 초과 내지 약 50mM 염을 포함할 수 있다. 일 예로서, 저염 완충액은 트리스 완충액(pH 8.0) 중에 5mM까지의 Mg+2를 포함할 수 있다. 저염 완충액의 사용은 감지 구역(31)(즉, 디바이 길이(Debye length))이 악영향을 받지 않도록, 즉 전하 태그(18)의 감지를 방해하기에 너무 길지 않도록 하는데 바람직할 수 있다. 유체는 또한 반응을 촉진하는 효소와 같은 촉매, 다른 첨가제 및 용매(예를 들어, 물, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 베타인, 포름아미드 등)를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 전하 센서(35)에 도입된 유체에서 여러 상이한 표지된 뉴클레오티드(10)가 함께 사용될 수 있다. 이들 예에서, 연결 분자(14, 14')는 모든 표지된 뉴클레오티드 유형에 대하여 동일하거나 또는 상이할 수 있음을 이해해야 한다. 길이 및 강성(rigidity)과 같은 연결 분자(14, 14')의 특성은 산화환원 반응 속도에 영향을 미치도록 변경될 수 있다. 이러한 특성은 표지된 뉴클레오티드(10) 및 이의 관련 산화환원-활성 전하 태그(18)에 대해 개별적으로 조정될 수 있다. 연결 분자(14')의 특이성 영역(24)의 특성은 또한 산화환원 반응 속도에 영향을 미치도록 변경될 수 있다. 연결 분자(14, 14')는 산화환원-활성 전하 태그(18)가 전기 전도성 채널(32)에 근접한 시간의 양을 증가시키거나 감소시키도록 변경될 수 있다. 이러한 변경은 전자 전달 속도에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 그렇게 함으로써, 확산된 표지된 뉴클레오티드(10)로부터의 전하 태그(18)와 전기 전도성 채널(32) 사이의 일시적인 상호 작용은 전자 전달을 야기할 가능성이 줄어든다. 대안 적으로, 전기 전도성 채널(32)에 근접하여 산화환원-활성 전하 태그(18)를 더 오랫동안 유지하면 전자 전달 가능성이 높아질 수 있다.
일 예에서, 4개의 상이한 표지된 뉴클레오티드(10)가 전하 센서(35)에 도입되는 유체에 사용되며, 각각은 상이한 뉴클레오티드(12)(특히 상이한 염기(20)) 및 상이한 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18)를 포함한다. 이의 예는 도 3에 도시되어 있다. 이 예에서, 표지된 뉴클레오티드(10)는 뉴클레오티드로서 데옥시아데노신 폴리포스페이트 및 제 1 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(도 3에서 4개의 양전하로 도시됨)를 포함하는 제 1 표지된 뉴클레오티드(10A); 뉴클레오티드로서 데옥시구아노신 폴리포스페이트 및 제 2 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(도 3에 4개의 음전하로 도시됨)를 포함하는 제 2 표지된 뉴클레오티드(10G); 뉴클레오티드로서 데옥시시티딘 폴리포스페이트 및 제 3 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(도 3에 2개의 음전하로 도시됨)를 포함하는 제 3 표지된 뉴클레오티드(10C); 및 뉴클레오티드로서 데옥시티미딘 폴리포스페이트 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(도 3에서 1개의 양전하로 도시됨)를 포함하는 제 4 표지된 뉴클레오티드(10T)를 포함한다. 이 예에서, 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그는 서로 상이하다.
도 3에 도시된 예에서, 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그 중 2개는 변경된 전하 상태(즉, 산화환원 반응이 일어난 이후)에서 양으로 대전되며(예를 들어, dATP 및 dTTP), 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그 중 다른 2개(예를 들어, dGTP 및 dCTP)는 변경된 전하 상태에서(즉, 산화환원 반응이 일어난 이후) 음으로 대전된다.
도 3에 도시된 예에서, 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그 중 2개의 전하가 동일하더라도(양성 또는 음성), 태그(18)는 전하가 상이한 강도를 가지기 때문에(예를 들어, 산화환원 활성화 후) 상이한 유형의 뉴클레오티드를 구별하기 위해 여전히 사용될 수 있다. 도 3에 도시된 예시적 구성은 단일 테더 혼성화 위치 및 4개의 상이한 산화환원-활성 전하 태그(18)에 기초한 4-상태 식별을 제공한다. 구체적으로, dGTP 및 dCTP는 모두 이들을 dATP 및 dTTP와 구별하는 음으로 하전된 산화환원-활성 전하 태그(18)를 포함하며; dGTP는 dCTP의 전하보다 현저히 높은 전하로 인해 dCTP와 구별될 수 있다. 유사하게, dATP 및 dTTP는 dTTP 모이어 티에 비해 dATP 모이어티상의 더 높은 양전하로 인해 서로 구별될 수 있다.
일부 예에서, 음의 태그를 충전하는데 필요한 전압이 양의 태그를 방출할 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지이기 때문에, 동일한 유체에서 작동하는 양 및 음 크기의 산화환원-활성 전하 태그(18)를 갖는 것이 실현 가능하지 않을 수 있다. 이와 같이, 다른 예에서, 하나의 극성의 산화환원-활성 전하-태그(18)를 포함하는 본 발명에 개시된 표지된 뉴클레오티드(10)의 예를 사용하고, 영구적으로 하전된(즉, 산화환원하지 않음) 태그를 포함하는 다른 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 영구적으로 하전된 태그의 예는, 예를 들어, 포스페이트기, DMT 및/또는 FMOC와 같은 음으로 하전된 태그; 또는 1차 아민과 같은 양으로 하전된 태그를 포함한다. 예로서, 1개 내지 3개의 상이한 표지된 뉴클레오티드(10)(산화환원-활성 전하 태그(18) 포함)가 사용될 수 있으며, 표지된 뉴클레오티드의 나머지는 산화환원-활성 전하 태그(18)가 아닌 영구적으로 하전된 태그를 포함할 것이다. 이는 환원 또는 산화 조건(둘다는 아님)이 사용되는 경우에 특히 유용하다. 이러한 경우에 용액에서 두 전하 유형의 큰 모이어티의 비교적 높은 농도가 동시에 존재하지 않기 때문에, 응집이 발생해서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
도 3은 또한 감지 구역(31)(게이트(G)/전기 전도성 채널(32) 주위의 음영 영역)을 도시한다. 전하 센서(35)는 생물학적으로 관련된 염 조건, 예를 들어 약 1mM 내지 약 100mM 범위에서 작동될 수 있다. 이러한 염 용액의 디바이(Debye) 스크리닝 길이는 약 0.3nm 내지 약 10nm의 범위일 수 있으며, 이는 게이트(G)의 표면 외부의 감지 구역(31)을 수 nm로 제한할 수 있고 종종 신호 레벨을 탐지 한계로 줄일 수 있다.
여러 테더링된 폴리머라제(28)가 도 3의 전기 전도성 채널(32)에 도시되어 있지만, 특정 전하 센서(35)에서 하나의 폴리머라제(28)는 하나의 전기 전도성 채널(32)에 테더링되어 있음을 이해해야 한다. 이와 같이, 도 3에 도시된 예는 4개의 상이한 뉴클레오티드 통합 이벤트 동안의 폴리머라제(28) 및 각각의 통합 이벤트 동안 상이한 산화환원-활성 전하 태그(18)에 대한 영향을 도시한다.
이제 도 4를 참조하면, 방법의 예가 도시되어 있다. 방법(100)은 주형 핵산(36)을 폴리머라제(26)가 테더링된 전기 전도성 채널(32)에 도입하는 단계(도면 부호 102); 표지된 뉴클레오티드(10)를 전기 전도성 채널(32)에 도입하는 단계로, 표지된 뉴클레오티드(10) 중 적어도 하나는 뉴클레오티드(12) 및 이에 부착된 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18)를 포함하여, 표지된 뉴클레오티드(10) 중 하나가 폴리머라제(26)와 연계된다(도면 부호 104); 표지된 뉴클레오티드(10) 중 하나가 연계되는 동안, 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18)의 전하 상태를 변경하기 위해 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18)와 전기 전도성 채널(32) 사이에서 산화환원 반응을 개시하는 단계(도면 부호 106); 및 산화환원 반응에 응답하여, 전하 센서(32)의 응답을 검출하는 단계(도면 부호 108)를 포함한다. 도 5a 및 5b는 또한 방법(100)에 대한 논의 전반에 걸쳐 참조될 것이다.
도 5a에 도시된 바와 같이, 전하 센서(32)에 도입된 주형 핵산(36)은 전하 센서(32)에 테더링된 폴리머라제(26)에 의해 제자리에 유지될 수 있다. 도 5a에 도시된 주형 핵산(36)은 DNA의 주형 가닥일 수 있다.
또한, 도 5a에 도시된 바와 같이, 표지된 뉴클레오티드(10)는 주형 핵산(36)의 표적 핵산에 상보적인 염기(20)를 포함할 수 있다. 표지된 뉴클레오티드(10)는, 부분적으로, 주형 핵산(36)에 결합된 폴리머라제(26)에 의해 제자리에 유지될 것이다. 존재하는 경우, 표지된 뉴클레오티드(10)의 연결 분자(14')의 특이성 영역(24)은 테더(28)와 상호작용할 수 있다.
테더(28)와 연계된 표지된 뉴클레오티드(10)의 예가 도 5b에 도시되어 있다. 이 예에서, 표지된 뉴클레오티드(10)의 연결 분자(14')는 테더(28)의 일부(예를 들어, A, B, C)에 대해 친화성을 갖는 특이성 영역(24)(예를 들어, A', B', C')를 포함한다. 이 특정 예에서, 특이성 영역(24)(예를 들어, A', B', C')은 테더(28)의 일부(예를 들어, A, B, C)의 뉴클레오티드 또는 펩타이드 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 또는 펩타이드 핵산을 포함한다. 다른 예에서, 테더(28)의 특이성 영역(24) 및 수용체 영역은 서로 친화성을 갖는 비-핵산 모이어티일 수 있다. 또 다른 예에서, 특이성 영역(24)은 소수성 폴리머(테더(28)의 일례)에 친화성을 갖는 비-핵산 모이어티일 수 있다. 이들 영역들 간의 특정 결합은 표준 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 페어링으로부터 기인할 수 있다. 이 예에서, 특이성 영역(24)은 또한 A', B', C' 뉴클레오티드 서열 옆에 있는(flanking) 이노신(I)을 포함할 수 있다. 이노신은 보편적인 염기이므로, DNA의 모든 4개의 천연 뉴클레오티드와 페어링할 수 있다. 이와 같이, 추가적인 결합 상호 작용은 테더(28)상의 천연 뉴클레오티드와 보편적인 염기(예를 들어, 이노신(I))의 상호 작용에 기인할 수 있다. 따라서, 통합 동안 표지된 뉴클레오티드(10)가 폴리머라제(26)에 결합될 때, 표지된 뉴클레오티드(10)의 특이성 영역(24)과 테더(28) 사이에 상승적(synergistic) 결합이 발생하고, 이는 표지된 뉴클레오티드(10)와 테더(28) 사이의 상호 작용의 안정성을 현저하게 증가시킨다.
표지된 뉴클레오티드(10)의 연결 분자(14)가 특이성 영역(24)을 포함하지 않는 경우, 표지된 뉴클레오티드(10)는 폴리머라제(26)와의 상호 작용에 의해 제자리에 유지될 것으로 이해된다. 연결 분자(14)의 길이는 산화환원-활성 전하 태그(18)가 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)의 감지 구역(31) 내에 유지되도록 보장하는 것을 도와줄 수 있다.
표지된 뉴클레오티드(10)와 폴리머라제(26) 사이, 또는 표지된 뉴클레오티드(10)와 폴리머라제(26)와 테더(28) 사이의 상호 작용은 산화환원-활성 전하 태그(18)가 전기 전도성 채널(32)의 감지 구역(31) 내에 들어오게 한다. 상호 작용(들)은 또한 효율적이고 완전한 전하 전달에 충분한 시간 동안 감지 구역(31) 내에 산화환원-활성 전하 태그(18)를 유지하는 것을 돕는다. 시간은 수십 밀리초(tens of miliseconds)가 될 수 있다. 이러한 비교적 긴 상호 작용은 확산하여 전기 전도성 채널(32)을 일시적으로 접촉할 수 있는 용액에 존재하는 다른 표지된 뉴클레오티드(10)와는 다르다. 짧은 상호 작용은 충분한 전하 전달이 일어나기에 충분히 길지 않아서, 이러한 경우에는, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 하전되지 않으며 전하 센서(32)에 의해 응답이 검출되지 않는다.
도 5a에 도시된 예에서, 표지된 뉴클레오티드의 구리 프탈로시아닌 산화환원-활성 전하 태그(18)는 전기 전도성 채널(32)의 약 1nm 내지 약 2nm 내에 있는 필드(예를 들어, 감지 구역(31))로 들어간다. 표지된 뉴클레오티드(10)가 제자리에 유지되기 때문에, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)에 의해 하전될 위치에 있다.
게이트(G)/전기 전도성 채널(32)(예를 들어, 실리콘 나노와이어, 탄소 나노튜브 등)과 산화환원-활성 전하 태그(18) 사이의 산화환원 반응을 개시하기 위해, 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)에 인가되는 전압은 산화환원-활성 전하 태그(18)의 산화 전압 또는 환원 전압으로 조정될 수 있다. 산화되는 경우, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 전자를 잃고, 따라서 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)은 산화환원-활성 전하 태그(18)에 전체적으로(net) 양전하를 생성한다. 환원되는 경우, 산화환원-활성 전하 태그(18)는 전자를 얻고, 따라서 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)은 전체적으로(net) 음전하를 산화환원-활성 전하 태그(18)에 주입한다. 산화환원 반응의 결과, 산화환원-활성 전하 태그(18)의 전하 상태가 변경된다. 이러한 변경된 고 하전된 상태(예를 들어, 비-산화 또는 비-환원 상태인 하전되기 이전의 산화환원-활성 전하 태그(18)의 상태와 비교하여)는 전기 전도성 채널(32) 주위의 필드를 교란시키고 검출 가능한 신호를 생성한다.
산화환원 반응 동안 및 검출 동안 전기 전도성 채널(32)에 인가되는 전압은 사용되는 산화환원-활성 전하 태그(18)에 의존할 수 있다. 예를 들어, 충전 전압은 판독 전압과 상이할 수 있고, 따라서 전기 전도성 채널(32)은 충전 전압(들)과 판독 전압(들) 사이에서 순환할 수 있다. 일 예에서, 산화환원 반응의 개시는 전기 전도성 채널(32)에 충전 전압을 인가하는 것을 수반하고, 전기 전도성 채널(32)의 응답을 검출하는 것은 전기 전도성 채널(32)에 판독 전압을 인가하는 것을 수반한다.
산화환원 반응 후 전기 전도성 채널(32)의 응답은 산화환원-활성 전하 태그(18)의 변경된 전하 상태를 나타낸다. 산화환원 반응 후 전기 전도성 채널(32)의 응답은 또한 산화환원-활성 전하 태그(18)가 뉴클레오티드-특이적(즉, 특정 태그(18)가 특정 염기(20)에 대해 선택됨)이기 때문에 표지된 뉴클레오티드(10)의 염기(20)를 나타낼 수 있다. 이와 같이, 방법(100)은 또한 전기 전도성 채널(32)의 응답을 표지된 뉴클레오티드(10)(즉, 폴리머라제(26)와 연계된 표지된 뉴클레오티드(10)) 중 관련된 하나의 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18)와 연계시키는 것; 및 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18)에 기초하여, 관련된 표지된 뉴클레오티드(10)(즉, 폴리머라제(26)와 연계된 표지된 뉴클레오티드(10))의 뉴클레오티드(예를 들어, 염기(20))를 식별하는 것을 수반한다.
관련된 표지된 뉴클레오티드(10)의 염기(20)는 주형 핵산(36)에 혼성화될 초기 가닥(38)에 도입될 것이다. 이는 차례로 표지된 뉴클레오티드(10)의 포스페이트기(16)와 새롭게 통합된 뉴클레오티드 염기(20) 사이의 결합을 자연스럽게 끊을 것이다. 예를 들어, 뉴클레오티드 염기(20)를 초기 스트랜드(38)에 통합한 후, 알파 포스페이트와 연결 분자(16) 사이의 결합 또는 알파 포스페이트와 베타 포스페이트 사이의 결합은 자연적으로 절단된다. 결과적으로, 표지된 뉴클레오티드(10)의 나머지(예를 들어, 성분 14 또는 14' 및 18)는 뉴클레오티드 염기(20)로부터 자유롭게 분리되고 전기 전도성 채널(32)로부터 확산되어, 전기 전도성 채널(32) 주위의 필드를 표지된 뉴클레오티드(10)와 폴리머라제(26)의 연계 전의 상태로 되돌린다. 전기 전도성 채널(32) 주위의 필드가 각각 교란되고, 교란되지 않은 상태로 복귀될 때 신호의 출현 및 소멸은 각각 뉴클레오티드 염기(20)의 주형 핵산(36)의 초기 가닥(38)으로의 통합과 상관될 수 있다. 이와 같이, 방법(100)의 예는 또한 표지된 뉴클레오티드(10)의 관련된 하나로부터의 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18) 및 연결 분자(14, 14')의 절단(예를 들어, 포스페이트기(16)에서)을 포함하여, 관련 표지된 뉴클레오티드(10)의 뉴클레오티드 염기(20)는 주형 핵산(36)에 상보적인 초기 가닥(38)에 통합된다. 절단은 자연 절단이 일어나기를 기다리는 것을 포함할 수 있다. 신호는 연속적인 표지된 뉴클레오티드 염기(20) 통합들 사이의 기저선 상태(baseline state)로 복귀하기 때문에, 주형 가닥(36)을 따라 초기 가닥(38) 내에서 동종 폴리머 세그먼트(homopolymeric segments)의 검출이 가능하다.
본 발명에 개시된 일부 예는 산화환원-활성 전하 태그(18)를 전기 전도성 채널(32)의 감지 구역(31)에 근접하여 유지하기 위해, 단독으로 또는 테더(28)와 함께, 표지된 뉴클레오티드(10)의 폴리머라제(26)에 대한 상승적 결합을 이용한다. 테더(28)와 특이성 영역(24) 사이에 형성된 복합체의 안정성은 비교적 낮을 수 있어서, (특이성 영역(24)과 테더(28) 사이의) 복합체는 또한 폴리머라제(26)에 결합되지 않은(즉, 용액이 없는 표지된 뉴클레오티드(10)는 테더(28)에 실질적으로 결합하지 않음) 표지된 뉴클레오티드(10)에 대해 형성되지 않는다. 다시 말하면, 복합체의 오프 레이트는 수명이 짧을 정도로 충분히 높을 수 있다. 하지만, 표지된 뉴클레오타이드(10)와 폴리머라제(26) 사이에 안정적인 연계가 형성될 때, 연결 분자(14, 14')의 국소 농도는 테더(28) 주위에서 증가하여, 테더(28)에 대한 특이성 영역(24)의 높은 온 레이트를 초래한다. 이러한 방식으로, 자유-유동(free-floating) 표지된 뉴클레오티드(10)의 비-연계된 상태와 비교하여 표지된 뉴클레오티드(10)의 폴리머라제-연계된 상태에서 전체적인 연계 시간이 크게 증가된다. 단독으로 또는 테더(28)와 함께, 폴리머라제(30)에 대한 표지된 뉴클레오티드(10)의 친화성의 상승적 효과는 전체적으로 실질적인 결합 친화성을 허용한다. 뉴클레오타이드 염기(20) 통합 후 폴리머라제(26)에 의한 자연 절단 후, 상승적 효과가 상실되고 전하 태그(18)는 또한 전기 전도성 채널(32)로부터 분리될 것이다.
예시적인 방법(100)에서, 표지된 뉴클레오티드(10) 중 하나를 폴리머라제(28)와 연계시키고, 산화환원 반응을 개시하고, 검출하고, 응답을 연계시키고, 및 통합된 뉴클레오티드 염기(20)를 식별하는 것은 모두 시퀀싱 사이클이다. 방법(100)은 폴리머라제(26)와 연계된 다른 표지된 뉴클레오티드(10)로 또 다른 시퀀싱 사이클을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다음 시퀀싱 사이클을 수행하는 단계는 표지된 뉴클레오티드(10) 중 다음 하나가 폴리머라제(26)와 연계되도록하는 것; 표지된 뉴클레오티드(10) 중 다음 하나가 연계되는 동안, 다른 뉴클레오타이드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18)의 전하 상태를 변경하기 위해 다른 뉴클레오타이드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18)와 전하 센서(32) 사이에서 다른 산화환원 반응을 개시하는 것; 다른 산화환원 반응에 응답하여, 전하 센서(32)의 다른 응답을 검출하는 것; 전하 센서(32)의 다른 응답을 다른 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그와 연계시키는 것; 및 다른 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그(18)에 기초하여, (즉, 폴리머라제(26)와 연계된) 표지된 뉴클레오티드(10)의 다음 하나의 뉴클레오티드(염기(20))를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 다른 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그가 절단될 수 있고, 표지된 뉴클레오티드(10) 중 다음 하나의 뉴클레오티드(염기(20))가 주형 핵산(36)에 상보적인 초기 가닥(38)에 통합된다. 시퀀싱 사이클은 반복될 수 있다.
본 발명에 개시된 예에서, 파형(waveform)이 또한 이용될 수 있다. 상이한 산화환원 전위를 갖는 산화환원-활성 전하 태그(18)의 산화환원 전위에 대한 하나 이상의 임계 전압에 도달하는 때를 결정하기 위해 파형이 모니터링될 수 있다. 이들 경우에서, 게이트(G)/전기 전도성 채널(32)을 통한 최종 전류의 변화는 특정 임계 전압과 관련된 산화환원-활성 전하 태그(18)를 포함하는 표지된 뉴클레오티드(10)의 염기(20)를 식별하기 위한 정보로서 사용될 수 있다.
본 발명에 개시된 예에서, 산화환원-활성 전하 태그(18)로 또는 그로부터 전달된 전자의 수 또한 모니터링될 수 있다. 전달된 전자의 수는 폴리머라제(26)와 연계된 뉴클레오타이드 염기(20)를 식별하고 폴리머라제(26)가 초기 가닥(38)에 통합되는 것을 식별하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 개시된 표지된 뉴클레오티드(10) 및 시스템(10)은 임의의 다양한 용도에 사용될 수 있다. 도 4, 5a 및 5b를 참조하여 설명된 바와 같이, 특히 유용한 적용은 핵산 시퀀싱, 예컨대 단일 분자 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis; SBS)이다. 단일 분자 SBS에서, 주형 핵산(36)(예를 들어, 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘)을 따른 핵산 프라이머의 연장이 모니터링되어 주형(36)에서의 뉴클레오티드의 서열을 결정한다. 기본 화학 공정은 (예를 들어, 본 발명에 기술된 바와 같은 폴리머라제 효소(26)에 의해 촉매화된 바와 같이) 중합(polymerization)일 수 있다. 특정 폴리머라제-기반 단일 분자 SBS 예에서, 뉴클레오타이드(예를 들어, 염기(20))는 주형에 의존하는 방식으로 프라이머에 첨가되어(따라서 프라이머를 연장하고 초기 가닥(38)를 형성한다) 프라이머에 첨가된 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출은 주형의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 어레이의 상이한 전기 전도성 채널(32)에서 복수의 상이한 템플릿(36)은 상이한 템플릿(36)에 대해 발생하는 이벤트가 각각의 전기 전도성 채널(32)에 작동가능하게 연결된 개별 검출기에 의해 구별될 수 있는 조건 하에서 단일 분자 SBS 기술에 적용될 수 있다. 각각의 전기 전도성 채널(32)(및 이의 소스 및 드레인 단자(S, D))은 플로우 셀의 함몰 부(depression) 또는 웰(well) 내에 위치될 수 있으며, 이는 어레이에서 하나의 채널(32)을 인접한 채널(32)로부터 물리적으로 격리시키는 것을 돕는다.
본 발명에 개시된 표지된 뉴클레오티드(10), 키트 및 시스템(30)에 대한 다른 적합한 적용은 결찰에 의한 시퀀싱(sequencing-by-ligation) 및 하이브리드화에 의한 시퀀싱(sequencing-by-hybridization)을 포함한다. 본 발명에 개시된 표지된 뉴클레오티드(10) 및 시스템(30)에 대한 또 다른 유용한 적용은 유전자 발현 분석이다. 유전자 발현은 RNA 시퀀싱 기술, 예를 들어, 디지털 RNA 시퀀싱으로 지칭되는 기술을 사용하여 검출 또는 정량화될 수 있다. RNA 시퀀싱 기술은 광학적으로 표지된 뉴클레오티드의 형광 검출이 본 발명에 제시된 전하-기반 검출 방법으로 대체될 수 있다는 점을 제외하고는 상기 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 시퀀싱 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 유전자 발현은 또한 어레이로의 직접적인 혼성화에 의해 수행되거나 또는 생성물이 어레이에서 검출되는 다중 분석법을 사용하여 수행되는 혼성화 기술을 사용하여 검출 또는 정량될 수 있다. 이들 방법은 광학 표지 및 형광 검출을 전하-기반 검출 기술 및 본 발명에 제시된 산화환원-활성 전하 태그(18)로 대체함으로써 용이하게 적용될 수 있다.
이하에서 더 상세히 논의되는 전술한 개념 및 추가 개념의 모든 조합은(이러한 개념이 서로 일치하지 않는 경우) 본 발명에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 특히, 본 발명의 마지막에 나타나는 청구 된 주제의 모든 조합은 본 발명에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다. 또한 본 발명에 참고로 포함된 임의의 개시에서 나타날 수 있는 본 발명에서 명시적으로 사용된 용어는 본 발명에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미가 부여되어야 함을 이해해야 한다.
명세서 전체에 걸쳐 "일 예", "다른 예", "예" 등의 언급은, 예와 관련하여 설명된 특정 요소(예를 들어, 특징, 구조 및/또는 특성)가 본 발명에 설명된 적어도 하나의 예에 포함되며, 또는 다른 예에는 존재할 수도 있고 없을 수도 있다. 또한, 임의의 예에 대해 설명된 요소는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 다양한 예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
청구항을 포함하여 본 발명 전반에 걸쳐 사용된 용어 "실질적으로" 및 "약"은 처리의 차이로 인한 작은 변동을 기술하고 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 이들은 ±5% 이하, 예컨대 ±2% 이하, 예컨대 ±1% 이하, 예컨대 ±0.5% 이하, ±0.2% 이하, 예컨대 ±0.1% 이하, 예컨대 ±0.05% 이하를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에 제공된 범위는, 이러한 값 또는 하위 범위가 명시적으로 언급된 것처럼, 언급된 범위 및 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 약 1개 전하 내지 약 100개 전하으로 표시되는 범위는 약 1개 전하 내지 약 100개 전하의 명시적으로 언급된 한계를 포함할뿐만 아니라 약 5개 전하, 50개 전하, 75개 전하 등과 같은 개별 값, 및 하위 범위, 예컨대 약 15개 전하 내지 약 85개 전하 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
몇몇 예들이 상세하게 설명되었지만, 개시된 예들은 수정될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 상기 설명은 비-제한적인 것으로 간주되어야 한다.

Claims (22)

  1. 뉴클레오티드;
    뉴클레오티드의 포스페이트기에 부착된 연결 분자; 및
    연결 분자에 부착된 산화환원-활성 전하 태그(redox-active charge tag)를 포함하고, 산화환원-활성 전하 태그는 전기 전도성 채널의 감지 구역에 근접하여 유지될 때 전기 전도성 채널에 의해 산화되거나 또는 환원되는 것인 표지된 뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    산화환원-활성 전하 태그가 산화환원 반응을 겪는 배위 금속 원자를 포함하는 것인 표지된 뉴클레오티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    연결 분자가 산화환원-활성 전하 태그에 부착된 특이성 영역(specificity region)을 포함하는 것인 표지된 뉴클레오티드.
  4. 제 3 항에 있어서,
    특이성 영역이 전기 전도성 채널에 결합된 테더(tether)상의 수용체 영역과 상호 작용하고, 특이성 영역이 친화성 태그를 포함하는 것인 표지된 뉴클레오티드.
  5. 제 4 항에 있어서,
    특이성 영역이 전기 전도성 채널에 결합된 테더상의 수용체 영역에 혼성화되고, 친화성 태그가 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 약 1개의 펩타이드 핵산 내지 약 10개의 펩타이드 핵산을 포함하는 펩타이드 핵산 서열을 포함하는 것인 표지된 뉴클레오티드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화환원-활성 전하 태그는 비-산화 또는 비-환원 상태에서 10개 이하의 전하를 포함하고; 및
    산화환원-활성 전하 태그는 산화 또는 환원 상태에서 약 1개의 전하 내지 약 100개의 전하를 포함하는 것인 표지된 뉴클레오티드.
  7. 주형 핵산을 폴리머라제가 테더링된 전기 전도성 채널에 도입하는 단계;
    표지된 뉴클레오티드를 전기 전도성 채널에 도입하는 단계로, 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 뉴클레오티드 및 이에 부착된 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하여, 표지된 뉴클레오티드 중 하나가 폴리머라제와 연계된다;
    표지된 뉴클레오티드 중 하나가 연계되는 동안, 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그의 전하 상태를 변경하기 위해 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그와 전기 전도성 채널 사이에서 산화환원 반응을 개시하는 단계; 및
    산화환원 반응에 응답하여, 전기 전도성 채널의 응답을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    산화환원 반응을 개시하는 단계는 전기 전도성 채널에 충전 전압을 인가하는 것을 포함하며; 및
    응답을 검출하는 단계는 전기 전도성 채널에 판독 전압을 인가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    전기 전도성 채널의 응답을 표지된 뉴클레오티드 중 관련된 하나의 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그와 연계시키는 단계; 및
    뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그에 기초하여, 관련된 표지된 뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 식별하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    표지된 뉴클레오티드 중 관련된 하나로부터 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 절단하는 단계를 추가로 포함하여, 관련된 표지된 뉴클레오티드의 뉴클레오티드가 주형 핵산에 상보적인 초기 가닥에 통합되는 것인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    표지된 뉴클레오티드 중 하나의 연계, 산화환원 반응의 개시, 검출, 연계, 및 식별은 함께 시퀀싱 사이클이며; 및
    방법은 다음:
    아래에 의해 다음 시퀀싱 사이클을 수행한다:
    표지된 뉴클레오티드 중 다음 하나가 폴리머라제와 연계되도록하는 단계;
    표지된 뉴클레오티드 중 다음 하나가 연계되는 동안, 다른 뉴클레오타이드-특이적 산화환원-활성 전하 태그의 전하 상태를 변경하기 위해 다른 뉴클레오타이드-특이적 산화환원-활성 전하 태그와 전기 전도성 채널 사이에서 다른 산화환원 반응을 개시하는 단계;
    다른 산화환원 반응에 응답하여, 전기 전도성 채널의 다른 응답을 검출하는 단계;
    전기 전도성 채널의 다른 응답을 다른 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그와 연계시키는 단계; 및
    다른 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그에 기초하여, 표지된 뉴클레오티드의 다음 하나의 뉴클레오티드를 식별하는 단계
    을 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    다른 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 절단하는 단계로, 이에 의해 표지된 뉴클레오티드의 다음 하나의 뉴클레오티드가 주형 핵산에 상보적인 초기 가닥에 통합된다; 및
    시퀀싱 사이클을 반복하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화환원-활성 전하 태그가 산화환원 반응을 겪는 배위 금속 원자를 포함하는 것인 방법.
  14. 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화환원-활성 전하 태그는 비-산화 또는 비-환원 상태에서 10개 이하의 전하를 포함하고; 및
    산화환원-활성 전하 태그는 변경된 전하 상태에서 약 1개의 전하 내지 약 100개의 전하를 포함하는 것인 방법.
  15. 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표지된 뉴클레오티드는 다음:
    뉴클레오티드로서 데옥시아데노신 폴리포스페이트 및 제 1 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하는 제 1 표지된 뉴클레오티드;
    뉴클레오티드로서 데옥시구아노신 폴리포스페이트 및 제 2 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하는 제 2 표지된 뉴클레오티드;
    뉴클레오티드로서 데옥시시티딘 폴리포스페이트 및 제 3 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하는 제 3 표지된 뉴클레오티드; 및
    뉴클레오티드로서 데옥시티미딘 폴리포스페이트 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그를 포함하는 제 4 표지된 뉴클레오티드를 포함하고; 및
    제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그는 서로 상이한 것인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그 중 2개가 변경된 전하 상태에서 양으로 하전되고, 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드-특이적 산화환원-활성 전하 태그 중 다른 2개가 변경된 전하 상태에서 음으로 하전되는 것인 방법.
  17. 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표지된 뉴클레오티드가 저염 완충액에 존재하는 것인 방법.
  18. 제 7 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전기 전도성 채널은 전계 효과 트랜지스터의 채널인 방법.
  19. 다음을 포함하는 플로우 셀:
    테더가 부착된 전기 전도성 채널; 및
    테더를 통해 전기 전도성 채널에 부착된 폴리머라제;
    플로우 셀에 도입되는 주형 핵산;
    플로우 셀 내로 도입되는 시약으로, 시약은 표지된 뉴클레오티드를 포함하며, 표지된 뉴클레오티드의 적어도 하나는 다음을 포함한다:
    뉴클레오티드;
    뉴클레오티드의 포스페이트기에 부착된 연결 분자; 및
    연결 분자에 부착된 산화환원-활성 전하 태그, 산화환원-활성 전하 태그는 전기 전도성 채널의 감지 구역에 근접하여 유지될 때 전기 전도성 채널에 의해 산화되거나 또는 환원된다; 및
    산화환원-활성 전하 태그 및 전기 전도성 채널 사이에서 산화환원 반응이 일어날 때 전기 전도성 채널로부터의 응답을 검출하기 위한 검출기
    를 포함하는 키트.
  20. 제 19 항에 있어서,
    산화환원-활성 전하 태그는 페로센, 아연 테트라벤조포르피린, 코발트 프탈로시아닌, 트리스-(2,2'-바이피리미딘)루테늄, 4-페로세닐벤질 알코올, 5-(4-하이드록시메틸페닐)-10,15,20-트리메시틸포르피나토아연(II), 및 산화환원-활성 칼릭사렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    산화환원-활성 전하 태그는 비-산화 또는 비-환원 상태에서 10개 이하의 전하를 포함하고; 및
    산화환원-활성 전하 태그는 산화 또는 환원 상태에서 약 1개의 전하 내지 약 100개의 전하를 포함하는 것인 키트.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전기 전도성 채널이 전계 효과 트랜지스터의 채널인 키트.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20210133708A (ko) * 2020-04-29 2021-11-08 경희대학교 산학협력단 전도성 태그를 이용한 dna 염기서열을 식별하는 방법 및 장치

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020039738A1 (en) * 2000-06-07 2002-04-04 Williams John G.K. Nucleic acid sequencing using charge-switch nucleotides
US20090170716A1 (en) * 2007-12-31 2009-07-02 Xing Su Electronic sensing for nucleic acid sequencing
US20100167938A1 (en) * 2008-12-31 2010-07-01 Xing Su Nucleic acid sequencing and electronic detection
US20130109577A1 (en) * 2011-10-14 2013-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time redox sequencing

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19533093C1 (de) 1995-09-07 1996-12-05 Deutsches Krebsforsch Metallocen-Phosphoramidit-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie deren Verwendung
WO2001094609A1 (en) * 2000-06-07 2001-12-13 Li-Cor, Inc. Charge-switch nucleotides
US20030104386A1 (en) 2001-08-31 2003-06-05 The Regents Of The University Of California Methods for the specific detection of redox-active tags and the use thereof for capillary gel electrophoresis and DNA sequencing
US9151751B2 (en) 2007-06-29 2015-10-06 Applied Biosystems, Llc Systems and methods for electronic detection with nanoFETS
AU2015289828B2 (en) 2014-07-15 2019-12-19 Illumina, Inc. Biochemically activated electronic device
SG11201708854PA (en) * 2015-05-12 2017-11-29 Illumina Inc Field-effect apparatus and methods for sequencing nucelic acids
EP3332032B1 (en) * 2015-08-06 2023-12-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated circuits for selectively addressing sparsely arranged electronic measurement devices
EP3376996B1 (en) * 2015-11-20 2022-09-07 Pacific Biosciences of California, Inc. Protected dye-labeled reagents
RU2637310C1 (ru) 2016-06-08 2017-12-04 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Флуоресцентно-меченые дезоксиуридинтрифосфаты
WO2018065299A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acid sequencing using nanotransistors

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020039738A1 (en) * 2000-06-07 2002-04-04 Williams John G.K. Nucleic acid sequencing using charge-switch nucleotides
US20090170716A1 (en) * 2007-12-31 2009-07-02 Xing Su Electronic sensing for nucleic acid sequencing
US20100167938A1 (en) * 2008-12-31 2010-07-01 Xing Su Nucleic acid sequencing and electronic detection
US20130109577A1 (en) * 2011-10-14 2013-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time redox sequencing

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210133708A (ko) * 2020-04-29 2021-11-08 경희대학교 산학협력단 전도성 태그를 이용한 dna 염기서열을 식별하는 방법 및 장치

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Publication number Publication date
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