JP2022046478A - 標識ヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents

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Abstract

【解決手段】標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド、前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子、および前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグを含む。前記レドックス活性電荷タグは、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される。【効果】単一分子検出において使用されるセンサーは、１つのポリメラーゼが付着した１つの電気伝導性チャネルを有し得る。これにより、個々の各センサーで一度に１つの取り込みイベント（即ち、ポリメラーゼによる新生鎖への塩基の取り込み）を検出することが可能になる。標識ヌクレオチドは、核酸シークエンシング用ならびに核酸および一般的な他の分析物の検出用に使用することができる独自の検出様式を提供する。【選択図】図３

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７１０，４６５
号に対する優先権を主張し、前述の出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用
される。
生物学的または化学的研究における様々なプロトコルは、局所的な支持面上または所定
の反応チャンバー内において多数の制御された反応を実施することを含む。指定された反
応は次いで観察または検出され得、その後の分析は当該反応に関与する化学物質の特性を
特定または明らかにするのに役立ち得る。いくつかの例では、当該制御された反応は蛍光
を発生し、したがって光学システムが検出のために使用され得る。他の例では、当該制御
された反応は電荷、伝導性、またはその他の電気的特性を変化させ、したがって電子回路
システムが検出のために使用され得る。
本明細書で開示される第１の態様は、標識ヌクレオチドである。番号１～６は、この第
１の態様に関する。
１．一例では、前記標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド；前記ヌクレオチドのリン酸基
に付着した連結分子；および前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグを含み、前
記レドックス活性電荷タグは、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき
、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される。
２．前記標識ヌクレオチドの例（１）では、前記レドックス活性電荷タグは、レドック
ス反応を受ける配位金属原子を含む。
３．前記標識ヌクレオチドの例（１）または（２）では、前記連結分子は、前記レドッ
クス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む。
４．例（３）では、前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合したテザー上の
アクセプター領域と相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む。
５．例（４）では、前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合した前記テザー
上の前記アクセプター領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは約１ヌク
レオチド～約１０ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列、または約１ペプチド核酸～
約１０ペプチド核酸を含有するペプチド核酸配列を含む。
６．前記標識ヌクレオチドの例（１）～（５）の何れかでは、前記レドックス活性電荷
タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ前記レドックス活
性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、約１～約１００の電荷を含む。
例（１）～（６）を含む、本明細書に開示される標識ヌクレオチドの任意の特徴は、任
意の所望の方法および／または構成で組み合わされ得るを理解されたい。
本明細書で開示される第２の態様は、方法である。番号７～１８は、この第２の態様に
関する。
７．一例では、前記方法は、以下のステップを含む：ポリメラーゼがつながった電気伝
導性チャネルに鋳型核酸を導入するステップ；前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチ
ドを導入するステップであって、前記標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチ
ドおよびそれに付着したヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含み、それにより
、前記標識ヌクレオチドの１つが前記ポリメラーゼと会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ステップ；前記標識ヌクレオチドの前記１つ
が会合している間に、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更
するために、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネル
との間のレドックス反応を開始するステップ；および前記レドックス反応に応じて、前記
電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ。
８．前記方法の例（７）では、前記レドックス反応を開始するステップは、前記電気伝
導性チャネルに充電電圧を印加することを含み；かつ前記応答を検出するステップは、前
記電気伝導性チャネルに読み取り電圧を印加することを含む。
９．前記方法（７）または（８）の例は、以下のステップを更に含む：前記電気伝導性
チャネルの前記応答を、前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つの前記ヌクレオチ
ド特異的レドックス活性電荷タグに関連付ける（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）ステップ；お
よび前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記会合している標識
ヌクレオチドの前記ヌクレオチドを識別するステップ。
１０．例（９）は、前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つから、前記ヌクレオ
チド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記会合
している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な新生鎖に取り
込まれるステップを更に含む。
１１．例（１０）では、前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合するステップ、前記レ
ドックス反応を開始するステップ、前記検出するステップ、前記関連付けるステップ、お
よび前記識別するステップは合わせて、シークエンシングサイクルであり、前記方法は、
以下によって、次のシークエンシングサイクルを行うステップを更に含む：前記標識ヌク
レオチドの次の１つを前記ポリメラーゼと会合させること；前記標識ヌクレオチドの前記
次の１つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状
態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝
導性チャネルとの間の他のレドックス反応を開始すること；前記他のレドックス反応に応
じて、前記電気伝導性チャネルの他の応答を検出すること；前記電気伝導性チャネルの前
記他の応答を、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付ける（ａｓ
ｓｏｃｉａｔｉｎｇ）こと;および前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ
に基づいて、前記標識ヌクレオチドの前記次の１つの前記ヌクレオチドを識別すること。
１２．例（１１）は、以下のステップを更に含む：前記他のヌクレオチド特異的レドッ
クス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記標識ヌクレオチドの前
記次の１つの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な前記新生鎖に取り込まれるス
テップ；および前記シークエンシングサイクルを繰り返すステップ。
１３．前記方法の例（７）～（１２）の何れかでは、前記レドックス活性電荷タグは、
レドックス反応を受ける配位金属原子を含む。
１４．前記方法の例（７）～（１３）の何れかでは、前記レドックス活性電荷タグは、
非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ前記レドックス活性電荷タ
グは、変更された電荷状態で、約１～約１００の電荷を含む。
１５．前記方法の例（７）～（１４）の何れかでは、前記標識ヌクレオチドは以下を含
む：前記ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第１ヌクレオ
チド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第１標識ヌクレオチド;前記ヌクレオチドと
してのデオキシグアノシンポリホスフェートおよび第２ヌクレオチド特異的レドックス活
性電荷タグを含む、第２標識ヌクレオチド;前記ヌクレオチドとしてのデオキシシチジン
ポリホスフェートおよび第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第３標
識ヌクレオチド;ならびに前記ヌクレオチドとしてのデオキシチミジンポリホスフェート
および第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第４標識ヌクレオチド；
ここで、前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特
異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、お
よび前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。
１６．例（１５）では、前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第
２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス
活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち２つは
、変更された電荷状態で、正に帯電していて；かつ前記第１ヌクレオチド特異的レドック
ス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレ
オチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活
性電荷タグのうち他の２つは、前記変更された電荷状態で、負に帯電している。
１７．前記方法の例（７）～（１６）の何れかでは、前記標識ヌクレオチドは、低塩緩
衝液中に存在する。
１８．前記方法の例（７）～（１７）の何れかでは、前記電気伝導性チャネルは、電界
効果トランジスタのチャネルである。
例（７）～（１７）を含む、前記方法の任意の特徴は、任意の所望の方法で組み合わさ
れ得ることを理解されたい。更に、この方法および／または前記標識ヌクレオチドの特徴
の任意の組み合わせが一緒に使用され得、かつ／または本明細書に開示される例の何れか
と組み合わされ得ることを理解されたい。
本明細書で開示される第３の態様は、キットである。番号１９～２２は、この第３の態
様に関する。
１９．一例では、前記キットは、以下を備える：電気伝導性チャネルであって、それに
付着したテザーを有する電気伝導性チャネルと、前記テザーを介して、前記電気伝導性チ
ャネルに付着したポリメラーゼと、を含むフローセル；前記フローセルに導入される鋳型
核酸；前記フローセルに導入される試薬であって、前記試薬は標識ヌクレオチドを含み、
前記標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチドと、前記ヌクレオチドのリン酸
基に付着した連結分子と、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前
記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、前記連結分子に付着したレドック
ス活性電荷タグと、を含む、試薬；およびレドックス反応が前記レドックス活性電荷タグ
と前記電気伝導性チャネルとの間で起こるとき、前記電気伝導性チャネルからの応答を検
出する検出器。
２０．前記キットの例（１９）では、前記レドックス活性電荷タグは、フェロセン（ｆ
ｅｒｒｏｃｅｎｅ）、亜鉛テトラベンゾポルフィリン（ｚｉｎｃ ｔｅｔｒａｂｅｎｚｏ
ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、コバルトフタロシアニン（ｃｏｂａｌｔ ｐｈｔｈａｌｏｃｙａ
ｎｉｎｅ）、トリス－（２，２’－ビピリミジン）ルテニウム（ｔｒｉｓ－（２，２’－
ｂｉｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）、４－フェロセニルベンジルアルコー
ル（４－ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、５－（４－ヒドロキシ
メチルフェニル）－１０，１５，２０－トリメシチルポルフィナト亜鉛（ＩＩ）（５－（
４－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１０，１５，２０－ｔｒｉｍｅｓｉｔ
ｙｌｐｏｒｐｈｉｎａｔｏｚｉｎｃ（ＩＩ））、およびレドックス活性カリックスアレー
ン（ｒｅｄｏｘ－ａｃｔｉｖｅ ｃａｌｉｘａｒｅｎｅ）からなる群から選択される。
２１．前記キットの例（１９）または（２０）では、前記レドックス活性電荷タグは、
非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み；かつ前記レドックス活性電荷タ
グは、酸化状態または還元状態で、約１～約１００の電荷を含む。
２２．前記キットの例（１９）～（２１）の何れかでは、前記電気伝導性チャネルは、
電界効果トランジスタのチャネルである。
例（１９）～（２２）を含む、前記キットの任意の特徴は、任意の所望の方法で組み合
わされ得るを理解されたい。更に、このキットおよび／または前記方法および／または前
記標識ヌクレオチドの特徴の任意の組み合わせが一緒に使用され得、かつ／または本明細
書に開示される例の何れかと組み合わされ得ることを理解されたい。
更に、前記標識ヌクレオチドの何れかおよび／または前記方法の何れかおよび／または
前記キットの任意の特徴が、任意の所望の方法で組み合わされ得、かつ／または本明細書
に開示される例の何れかと組み合わされ得ることを理解されたい。
本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照することにより明らかになる
であろう。以下の詳細な説明および図面において、同様の参照番号は、おそらく同一では
ないが類似の構成要素に対応する。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号また
は特徴は、それらが現れる他の図面に関連して説明されてもされなくてもよい。
標識ヌクレオチドの一例の概略図である。 本明細書に開示されるシステムの一例の概略的な部分斜視図である。 電荷センサーの電気伝導性チャネルに付着し、且つ電荷に基づいて区別され得る標識ヌクレオチドと会合したポリメラーゼの概略図である。 本明細書で開示される方法の一例を示すフロー図である。 シークエンシング法において使用中の標識ヌクレオチドの一例の概略図である（図５Ａ）。テザーと本明細書に開示される標識ヌクレオチドの一例の特異性領域との間の相互作用の一例の概略図である（図５Ｂ）。
核酸シークエンシング手順における単一分子検出のために使用され得る標識ヌクレオチ
ドが、本明細書に開示される。単一分子検出において使用されるセンサーは、１つのポリ
メラーゼが付着した１つの電気伝導性チャネルを有し得る。これにより、個々の各センサ
ーで一度に１つの取り込みイベント（即ち、ポリメラーゼによる新生鎖への塩基の取り込
み）を検出することが可能になる。標識ヌクレオチドは、核酸シークエンシング用ならび
に核酸および一般的な他の分析物の検出用に使用することができる独自の検出様式を提供
する。
標識ヌクレオチド１０の一例が、図１に概略的に示されている。示されているように、
標識ヌクレオチド１０は、ヌクレオチド１２、ヌクレオチド１２のリン酸基１６に付着し
た連結分子１４または１４’、および連結分子１４または１４’に付着したレドックス活
性電荷タグ１８を含み、レドックス活性電荷タグ１８は、電気伝導性チャネル３２の感知
ゾーン（参照番号３１、図３）の近くに維持されるとき、電気伝導性チャネル（参照番号
３２、図２）によって酸化または還元される。標識ヌクレオチド１０は、天然ヌクレオチ
ドとは構造的または化学的に異なるため、非天然ヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドと
みなすことができる。
標識ヌクレオチド１０のヌクレオチド１２は、天然ヌクレオチドであり得る。天然ヌク
レオチドは、窒素含有複素環塩基２０、糖２２、および１つ以上のリン酸基１６を含む。
天然のヌクレオチドの例は、例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド
を含む。リボヌクレオチドでは、糖２２はリボースであり、デオキシリボヌクレオチドで
は、糖２２はデオキシリボース、即ちリボースの２’位に存在するヒドロキシル基を欠く
糖である。一例では、ヌクレオチド１２は、いくつかのリン酸基１６（例えば、３リン酸
（即ち、γリン酸）、４リン酸、５リン酸、６リン酸など）を含むため、ポリリン酸形態
である。複素環塩基２０（即ち、核酸塩基）は、プリン塩基またはピリミジン塩基である
ことができる。プリン塩基は、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにそれらの
修飾誘導体または類似体を含む。ピリミジン塩基は、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およ
びウラシル（Ｕ）、ならびにそれらの修飾誘導体または類似体を含む。デオキシリボース
のＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合している。核酸類似体
では、リン酸骨格、糖、および核酸塩基のいずれかが変化し得る。核酸類似体の例は、例
えば、ユニバーサル塩基またはペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸－糖骨格類似体を含
む。
標識ヌクレオチド１０はまた、連結分子１４または１４’を含む。いくつかの例では、
連結分子（図１において１４として表示）は特異性領域２４を含まない。他の例では、連
結分子（図１において１４’として表示）は特異性領域２４を含む。図１に概略的に示さ
れるように、特異性領域２４が連結分子１４’の一部である場合、該領域２４は、レドッ
クス活性電荷タグ１８に化学的に結合する端部に位置し得る。特異性領域２４については
、以下で更に説明する。
標識ヌクレオチド１０の連結分子１４または１４’は、一端でヌクレオチド１２のリン
酸基１６に化学的に結合でき、他端でレドックス活性電荷タグ１８に化学的に結合できる
任意の長鎖分子であり得る。連結分子１４または１４’はまた、本明細書に開示されるシ
ステム３０（図２を参照）で使用されるポリメラーゼ２６と相互作用しないように選択さ
れ得る。連結分子１４または１４’は、レドックス活性電荷タグ１８が電気伝導性チャネ
ル３２（図２）の感知ゾーン３１（図３）内に存在することを可能にするほど十分に長い
ように選択される。例として、連結分子１４または１４’は、アルキル鎖、ポリ（エチレ
ングリコール）鎖、アミド基、リン酸基、トリアゾールなどの複素環、ヌクレオチド、ま
たはそれらの組み合わせを含み得る。アルキル鎖の例は、少なくとも６個の炭素原子を含
み得、ポリ（エチレングリコール）鎖の例は、少なくとも３個のエチレングリコール単位
を含み得る。
以下の例は、連結分子１４、１４’がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコー
ル）鎖、およびトリアゾールを含む、標識ヌクレオチド１０の一例を示す：
Figure 2022046478000002
以下の例は、連結分子１４、１４’がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコー
ル）鎖、トリアゾール、およびリン酸基を含む、標識ヌクレオチド１０の別の例を示す：
Figure 2022046478000003
以下の例は、連結分子１４、１４’がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコー
ル）鎖、トリアゾール、およびリン酸基を含む、標識ヌクレオチド１０の更に別の例を示
す：
Figure 2022046478000004
以下の例は、連結分子１４、１４’がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコー
ル）鎖、トリアゾール、リン酸基、およびポリヌクレオチド鎖を含む、標識ヌクレオチド
１０の更なる例を示す：
Figure 2022046478000005
いくつかの例示的な連結分子１４、１４’を説明したが、他の連結分子１４、１４’を
使用しもよいことを理解されたい。
図１および前の例に示されるように、標識ヌクレオチド１０のいくつかは、連結分子１
４’の一部として特異性領域２４も含み得る。特異性領域２４は、電気伝導性チャネル３
２に結合したテザー２８（図２）上のアクセプター領域と相互作用することができる。特
異性領域２４は、テザー２８のアクセプター領域に一時的に付着することができるアフィ
ニティータグを含み得る。アフィニティータグの結合親和性は、標識ヌクレオチド１０が
ポリメラーゼ２６によって保持されているときに、テザー２８上のアクセプター領域に特
異性領域２４を結合させるほど十分に強いかもしれないが、取り込みイベント後に（即ち
、ポリメラーゼ２６が、αリン酸および連結分子１４、１４’の間、またはαリン酸およ
びβリン酸の間の結合を自然に切断するときに）アクセプター領域から特異性領域２４を
リリースするほど十分に弱いかもしれない。換言すれば、アクセプター領域への特異性領
域２４（例えば、アフィニティータグ）のオン速度、およびアクセプター領域からの特異
性領域２４（例えば、アフィニティータグ）のオフ速度は、全体的な単一分子感知を改善
するために選択され得る。アフィニティータグ／アクセプター領域の相互作用のオン速度
は、ヌクレオチド取り込みの前、例えば、特異性領域２４、したがってアフィニティータ
グの効果的な高濃度のために高くなり得る。この高いオン速度は、アフィニティータグが
アクセプター領域に結合している時間の割合を増加させる。切断後、次の標識ヌクレオチ
ド１０がポリメラーゼ２６の活性部位に入るときに、（以前に取り込まれたヌクレオチド
のアフィニティータグとアクセプター領域の間の）結合状態が存在する可能性が低いよう
に十分に速く、（アフィニティータグとアクセプター領域の間の）複合体が解離するよう
に、相互作用のオフ速度は十分に高く選択され得る。
特定の例では、特異性領域２４はテザー２８上のアクセプター領域にハイブリダイズす
るため、アフィニティータグは、テザー２８上のアクセプター領域に一時的に付着するこ
とができるヌクレオチド配列またはペプチド核酸配列を含み得る（図２）。一例では、ア
フィニティータグは、約１ヌクレオチド～約１０ヌクレオチド、または約１ペプチド核酸
～約１０ペプチド核酸を含有するヌクレオチド配列を含む。他の例では、アフィニティー
タグは、最大６個のヌクレオチドまたはペプチド核酸を含む。更に別の例では（図５Ｂで
更に表示および説明されるように）、特異性領域２４は、ヌクレオチド配列の両側に隣接
するイノシンを更に含み得る。更に他の例では、アフィニティータグは、互いに対する親
和性または疎水性ポリマーに対する親和性を有するペプチドなどの非核酸部分であり得る
。具体的なタンパク質の例はコイルドコイルを含み、当該コイルドコイルは２～７個のα
－ヘリックスがロープの鎖のように一緒にコイル状になっているタンパク質中の構造モチ
ーフである。換言すると、コイルドコイルは、互いに巻き付いてスーパーコイルを形成す
る２つ以上のα－ヘリックスによって構築される。コイルドコイルの例は、ｃ－Ｆｏｓや
ｃ－ｊｕｎなどの腫瘍性タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。
レドックス活性電荷タグ１８は、例えば、電気伝導性チャネル３２の感知ゾーン３１の
近くに維持されたときに、電気伝導性チャネル３２によって酸化（電子を失う）または還
元（電子を獲得）されると、その電荷を増加させることができる任意の電荷タグであり得
る。電荷タグ１８は、レドックス反応が起こる前に、正味中性（ｎｅｔ ｎｅｕｔｒａｌ
）（ゼロ電荷）、またはこの状態に近い（１０電荷以下）場合がある。換言すれば、非酸
化状態または非還元状態において、レドックス活性電荷タグ１８は１０以下の電荷を運ぶ
。レドックス活性電荷タグ１８によって運ばれる電荷は、標識ヌクレオチド１０のリン酸
１６または連結分子１４、１４’のいずれの電荷も含まない。レドックス反応が起こった
後、レドックス活性電荷タグ１８の正味の全体電荷（ｎｅｔ ｏｖｅｒａｌｌ ｃｈａｒ
ｇｅ）が変化する（即ち、レドックス活性電荷タグ１８は、より多くの正電荷またはより
多くの負電荷（ｍｏｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｓ ｏｒ ｍｏｒｅ ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｓ）を運ぶ）。一例では、レドックス活性電荷タグ１８は、非
酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み、レドックス活性電荷タグ１８は、
酸化状態または還元状態で、約１～約１００の電荷を含む。非酸化状態または非還元状態
におけるレドックス活性電荷タグ１８の電荷数は、酸化状態または還元状態におけるレド
ックス活性電荷タグ１８の電荷数よりも低いことを理解されたい。別の例では、レドック
ス活性電荷タグ１８は、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含み、レドッ
クス活性電荷タグ１８は、酸化状態または還元状態で、約２０～約５０の電荷を含む。
レドックス活性電荷タグ１８は、レドックス反応を受けることができる任意の配位（す
なわち、所定の位置に保持された）金属原子を含み得る。金属原子の例は、鉄、コバルト
、ルテニウム、亜鉛、銅、リチウム、銀などを含む。いくつかの具体的な例として、レド
ックス活性電荷タグ１８は、フェロセン（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ）、亜鉛テトラベンゾポル
フィリン（ｚｉｎｃ ｔｅｔｒａｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、コバルトフタロシア
ニン（ｃｏｂａｌｔ ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、トリス－（２，２’－ビピリミ
ジン）ルテニウム（ｔｒｉｓ－（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉ
ｕｍ）、４－フェロセニルベンジルアルコール（４－ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｂｅｎｚｙｌ
ａｌｃｏｈｏｌ）、５－（４－ヒドロキシメチルフェニル）－１０，１５，２０－トリ
メシチルポルフィナト亜鉛（ＩＩ）（５－（４－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙ
ｌ）－１０，１５，２０－ｔｒｉｍｅｓｉｔｙｌｐｏｒｐｈｉｎａｔｏｚｉｎｃ（ＩＩ）
）、およびレドックス活性カリックスアレーンからなる群から選択される。
フェロセンは、式Ｆｅ（Ｃ５Ｈ５）２を含む任意の有機金属化合物であり得る。具体例
は、フェロセンデンドリマーである：
Figure 2022046478000006
式中、Ｆｅ２＋は酸化によりＦｅ３＋になることができ、したがって各「Ｆｅ」に正電荷
が導入される。
亜鉛テトラベンゾポルフィリン（ｚｉｎｃ ｔｅｔｒａｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ
）は、以下の構造を有する：
Figure 2022046478000007
式中、Ｒは、Ｃ２Ｈ５、Ｃ６Ｈ１３、またはＣ１２Ｈ２５である。Ｚｎ１＋は酸化により
Ｚｎ２＋になることができ、したがって正電荷が導入される。
コバルトフタロシアニン（ｃｏｂａｌｔ ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）の例は、以
下を含む：
Figure 2022046478000008
および
Figure 2022046478000009
上記のいずれも溶液中において正味中性（ｎｅｔ ｎｅｕｔｒａｌ）の分子である。酸化
されると、Ｃｏ２＋はＣｏ３＋になり、各「Ｃｏ」に正電荷が導入される（例えば、最初
の構造には１つの正電荷、２番目の構造には５つの正電荷）。－３～＋５の範囲の酸化状
態を有する他のコバルト含有化合物が知られており、負に帯電可能なレドックス活性電荷
タグ１８または正に帯電可能なレドックス活性電荷タグ１８として使用され得る。
トリス－（２，２’－ビピリミジン）ルテニウム（Ｔｒｉｓ－（２，２’－ｂｉｐｙｒ
ｉｍｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）は、以下の構造を有する：
Figure 2022046478000010
式中、Ｒｕ２＋は酸化によりＲｕ３＋になることができ、したがって正電荷が導入される
。
４－フェロセニルベンジルアルコール（４－ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｂｅｎｚｙｌ ａｌ
ｃｏｈｏｌ）は、以下の構造を有する：
Figure 2022046478000011
式中、Ｆｅ２＋は酸化によりＦｅ３＋になることができ、したがって正電荷が導入される
。
５－（４－ヒドロキシメチルフェニル）－１０，１５，２０－トリメシチルポルフィナ
ト亜鉛（ＩＩ）（５－（４－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１０，１５，
２０－ｔｒｉｍｅｓｉｔｙｌｐｏｒｐｈｉｎａｔｏｚｉｎｃ（ＩＩ））は、以下の構造を
有する：
Figure 2022046478000012
式中、Ｚｎ２＋は還元によりＺｎ１＋になることができ、したがって負電荷が導入される
。
レドックス活性カリックスアレーンのいくつかの例は、以下を含む：
Figure 2022046478000013
前述の各レドックス反応は可逆的であり、したがって該化合物は、それらのより高い酸
化状態において使用されて、電気伝導性チャネルの感知ゾーン３１内にあるときに還元さ
れ得るか、あるいはそれらのより低い酸化状態において使用されて、電気伝導性チャネル
の感知ゾーン３１内にあるときに酸化され得る
上述のように、本明細書に開示されるレドックス活性電荷タグ１８は、溶液中で中性ま
たは中性付近（ｎｅａｒ－ｎｅｕｔｒａｌ）であり得、レドックス反応を受けるまでより
大きな電荷を運ばない。かくして、溶液中の標識ヌクレオチド１０は高度に帯電した分子
（ｈｉｇｈｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）とはみなされず、（反対に帯電
した中性付近のレドックス活性電荷タグ１８を含む）反対に帯電した標識ヌクレオチド１
０間の凝集は起こりにくい。
標識ヌクレオチド１０は、キットおよび／またはシステム３０（後者の一例は図２に示
されている）において使用され得る。キットまたはシステム３０は、電気伝導性チャネル
３２を含み得る。電気伝導性チャネル３２は、ウェル、チューブ、チャネル、キュベット
、ペトリ皿、ボトルなどの容器内にあってもよく、またはそれら容器の一部であってもよ
い。適切な容器の別の例は、フローセル３４である。本明細書に記載の実装に適した任意
のフローセル構成が使用され得る。いくつかの例示的なフローセルは、イルミナ社（カリ
フォルニア州サンディエゴ）から市販されているものである。フローセル３４は、反応成
分（例えば、鋳型核酸、標識ヌクレオチド１０など）のそれぞれの電気伝導性チャネル３
２への付着中に、またはそれぞれの電気伝導性チャネル３２上の反応成分を用いて行われ
る後続の反応中に、個々にアドレス可能な電気伝導性チャネル３２のアレイにバルク試薬
を送達するのに便利である。核酸シークエンシング反応などのサイクリックプロセス（ｃ
ｙｃｌｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）は、フローセル３４に特に適している。別の特に有用
な容器は、マルチウェルプレートまたはマイクロタイタープレート中のウェルである。
図２に示される例では、フローセル３４は電気伝導性チャネル３２を含む。本明細書で
使用する場合、「電気伝導性チャネル（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖ
ｅ ｃｈａｎｎｅｌ）」という用語は、その表面またはその周囲の電場における摂動を電
気信号に変換する検出デバイスの一部を意味することを意図している。例えば、電気伝導
性チャネル３２は、反応成分（例えば、標識ヌクレオチド１０）の到着または離脱を電気
信号に変換することができる。本明細書に開示される例では、電気伝導性チャネル３２は
、標識ヌクレオチド１０のレドックス活性電荷タグ１８との相互作用によって、２つの反
応成分（鋳型核酸と標識ヌクレオチド１０のヌクレオチド２０）の間の相互作用を検出可
能な信号に変換することもできる。
電気伝導性チャネル３２は、電荷センサー３５のチャネルであり得る。電荷センサー３
５は、ソース端部Ｓおよびドレイン端部Ｄ、ならびに端部Ｓ、Ｄを接続するチャネル３２
を含み得る。チャネル３２は、例えば、チューブ、ワイヤ、プレートなどの任意の適切な
形状を有し得る。
端部Ｓ、Ｄは、任意の適切な伝導性材料であり得る。適切なソースおよびドレインの材
料の例は、コバルト、ケイ化コバルト、ニッケル、ケイ化ニッケル、アルミニウム、タン
グステン、銅、チタン、モリブデン、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、酸化インジウム亜
鉛、金、プラチナ、カーボンなどを含む。
電気伝導性チャネル３２は、レドックス活性電荷タグ１８を酸化または還元することが
できる任意の伝導性（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）材料または半伝導性（ｓｅｍｉ－ｃｏｎｄ
ｕｃｔｉｖｅ）材料を含み得る。当該材料は、有機材料、無機材料、またはその両方を含
み得る。適切なチャネル材料のいくつかの例は、シリコン、カーボン（例えば、グラッシ
ーカーボン、グラフェンなど）、伝導性ポリマーなどのポリマー（例えば、ポリピロール
、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリ（４－スチレンスルホン酸）をドープしたポリ（
３，４－エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ－ＰＳＳ）など）、金属などを含む
。
いくつかの例では、電気伝導性チャネル２６はまた、少なくとも１つの寸法（ｄｉｍｅ
ｎｓｉｏｎ）をナノスケール（１ｎｍ～１μｍ未満の範囲）で有するナノ構造であり得る
。一例では、この寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）は最大寸法を指す。例として、電気伝導性
チャネル２６は、半伝導性ナノ構造、グラフェンナノ構造、金属ナノ構造、および伝導性
ポリマーナノ構造であり得る。ナノ構造は、多層または単層ナノチューブ、ナノワイヤ、
ナノリボンなどであり得る。
例示的な電荷センサー３５は、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）ベースのＦＥＴ、単層
カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）ベースのＦＥＴ、シリコンナノワイヤ（ＳｉＮＷ）Ｆ
ＥＴ、ポリマーナノワイヤＦＥＴ、グラフェンナノリボンＦＥＴ（およびＭｏＳ２、シリ
センなどの２Ｄ材料から製造された関連ナノリボンＦＥＴ）、トンネルＦＥＴ（ＴＦＥＴ
）、および急峻サブスレッショルドスロープデバイス（ｓｔｅｅｐ ｓｕｂｔｈｒｅｓｈ
ｏｌｄ ｓｌｏｐｅ ｄｅｖｉｃｅｓ）などの電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）である。
図２に示される例示的な電荷センサー３５は、ソースＳ、ドレインＤ、およびソースＳ
とドレインＤとの間の電気伝導性チャネル３２を含むナノ構造ＦＥＴである。電気伝導性
チャネル３２は、カーボンナノチューブ、単層カーボンナノチューブ、シリコンナノワイ
ヤ、ポリマーナノワイヤなどであり得る。電気伝導性チャネル３２はゲート端部として機
能するため、図２では「Ｇ」としても示されている。本明細書に開示される例では、ゲー
トＧ／電気伝導性チャネル３２は、標識ヌクレオチド１０のレドックス活性電荷タグ１８
のための（電子を供給または受容する）酸化還元電極として機能し得る。より具体的には
、レドックス活性電荷タグ１８に電子を移動させるか、またはレドックス活性電荷タグ１
８から電子を移動させるために、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２を使用することがで
きる。電子移動は、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２の少なくとも一部の表面上のゲー
ト酸化物（ｇａｔｅ ｏｘｉｄｅ）（図示せず）を通るトンネリングを介して起こり得る
。いくつかの例では、ゲート酸化物の厚さは、レドックス活性電荷タグ１８が十分に活性
化される前に最小量の接触時間が経過するように、電流移動効率を調整するために使用さ
れ得る。接触時間は、電子移動が高い可能性で発生するように、レドックス活性電荷タグ
１８がゲートＧ／電気伝導性チャネル３２の十分な近傍内に保持される時間を指し得る。
この時間は、レドックス活性電荷タグ１８の種類、ゲート酸化物の厚さ、およびゲートＧ
／電気伝導性チャネル３２からの電荷タグ１８の距離を含む多くの要因に依存する。ゲー
トＧ／電気伝導性チャネル３２に一時的に接触するが、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３
２に付着したポリメラーゼ２６と実際には会合していない拡散性の標識ヌクレオチド１０
を電荷センサー３５が十分に区別することを保証するために、このことは使用され得る。
ポリメラーゼ２６の活性部位と会合しているヌクレオチド１０は、一過性の相互作用が発
生する時間よりも有意に長い期間、会合状態にとどまると予想される。例えば、標識ヌク
レオチド１０は、数百マイクロ秒から数百ミリ秒の間、ポリメラーゼ活性部位（例えば、
ポリメラーゼ２６）と会合したままであり得る。一過性の相互作用は、桁違いに速い拡散
タイムスケールで発生する。
この例では、ポリメラーゼ２６は、テザー２８によって、電荷センサー３２のゲートＧ
／電気伝導性チャネル３２上に固定される。テザー２８は、ポリメラーゼ２６のアンカー
として用いられる。テザー２８は、電子輸送能を示し得る。適切なテザー２８の例は、（
例えば、５～２５のヌクレオチドを有する）核酸鎖、ペプチド、単一炭素鎖、非伝導性ま
たは低伝導性のオリゴマーまたはポリマーなどを含む。
いくつかの例では、テザー２８は、電荷センサー３５のゲートＧ／電気伝導性チャネル
３２から少なくとも１０ｎｍ離れてポリメラーゼ２６を保持する。例えば、ポリメラーゼ
２６の電荷および／またはポリメラーゼ２６によって保持された鋳型核酸３６の負電荷を
感知することが望ましくない場合に、これは望ましいかもしれない。しかしながら、ポリ
メラーゼ２６および／または鋳型核酸３６の電荷を感知することが望ましい場合、テザー
２８は、電荷センサー３２のゲートＧから約１０ｎｍ未満、約９ｎｍ未満、約８ｎｍ未満
、約７ｎｍ未満、約６ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約４ｎｍ未満、約３ｎｍ未満、約２ｎｍ
未満、または約１ｎｍ未満にポリメラーゼ２６を保持してもよい。
ＦＥＴベースの電荷センサー３５の使用は、以下を可能にし得る：（１）適切に設計さ
れたＦＥＴを用いて、単一分子の感度を達成することができる；および（２）検出された
電荷の変化はゲートＧ／電気伝導性チャネル３２の近傍に局在するため、高度な並列化（
「多重化可能性（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｉｌｉｔｙ）」とも呼ばれる）が容易になり、
（例えば、アレイ中の）隣接する個別にアドレス可能なＦＥＴサイト間のクロストークが
回避される。更に、シリコンナノ構造ＦＥＴは、半導体製造施設と適合する（ｃｏｍｐａ
ｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ）プロセスを使用して製造することができる。
キットおよび／またはシステム３０の例は、フローセル３４に導入される鋳型核酸３６
、およびフローセル３４に導入される試薬（図２には図示せず）も含み得る。
鋳型核酸３６は、配列決定される任意のサンプルであり得、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそ
れらの類似体から構成され得る。鋳型（または標的）核酸３６の供給源は、ゲノムＤＮＡ
、メッセンジャーＲＮＡ、または天然源由来の他の核酸であり得る。いくつかの場合、そ
のような供給源に由来する鋳型核酸３６は、本明細書の方法またはシステム３０で使用す
る前に増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増
幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、またはランダムプライマー増幅（ＲＰＡ）を含む
がこれらに限定されない様々な既知の増幅技術のいずれかを使用することができる。本明
細書に記載の方法またはシステム３０における使用前の標的核酸２６の増幅は任意である
ことを理解されたい。そのため、いくつかの例では、鋳型核酸３６は使用前に増幅されな
いであろう。鋳型／標的核酸は、任意で、合成ライブラリーに由来することができる。合
成核酸は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ組成物を有し得るか、またはその類似体であり得る
。
鋳型核酸３６が由来し得る生物学的試料には、例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウ
サギ、モルモット、有蹄動物、馬、羊、豚、ヤギ、牛、猫、犬、霊長類、ヒトまたは非ヒ
ト霊長類などの哺乳動物；シロイヌナズナ、トウモロコシ、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）
、エンバク、小麦、米、キャノーラ、または大豆などの植物；コナミドリムシ（Ｃｈｌａ
ｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）などの藻類；カエノラブディティス・エ
レガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）などの線虫；キイロショウ
ジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、蚊、ショウジョウバ
エ、ミツバチ、クモなどの昆虫；ゼブラフィッシュなどの魚；爬虫類；カエルやアフリカ
ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）などの両生類；キイロタマホコリカビ（ｄ
ｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）；ニューモシスチス・カリニ（ｐｎ
ｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐ
ｅｓ）、酵母、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または
分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などの菌類；または
熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来するものが
含まれる。鋳型核酸３６は、細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ブド
ウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）または肺炎マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの原核生物；古細菌；Ｃ型肝炎ウイルス、エボラウイル
スまたはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス；またはウイロイド（ｖｉｒｏｉｄ）に由
来することもできる。鋳型核酸３６は、上記の生物の均質な培養物または集団、または代
替的に、例えばコミュニティまたは生態系における、いくつかの異なる生物のコレクショ
ンに由来し得る。
更に、鋳型／標的核酸３６は天然源に由来しない場合があるが、既知の技術を使用して
合成することができる。本明細書に記載の例で、例えば、遺伝子発現プローブまたは遺伝
子型決定プローブ（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｐｒｏｂｅｓ）を合成および使用することが
できる。
いくつかの例では、鋳型／標的核酸３６は、１つ以上のより大きな核酸の断片として得
ることができる。断片化は、例えば、噴霧化、超音波処理、化学的切断、酵素的切断、ま
たは物理的せん断を含む、当技術分野で知られている様々な技術のいずれかを使用して実
行することができる。断片化はまた、より大きな核酸の一部のみをコピーすることにより
アンプリコンを生成する特定の増幅技術の使用から生じる場合がある。例えば、ＰＣＲ増
幅は、増幅中に隣接プライマーがハイブリダイズする位置の間にある元の鋳型上のヌクレ
オチド配列の長さによって規定されるサイズを有する断片を生成する。
鋳型／標的核酸３６の集団、またはそのアンプリコンは、本明細書に記載の方法、キッ
ト、またはシステム３０の特定のアプリケーションのために望ましいまたは適切な平均鎖
長を有することができる。例えば、平均鎖長は、約１００，０００ヌクレオチド未満、約
５０，０００ヌクレオチド未満、約１０，０００ヌクレオチド未満、約５，０００ヌクレ
オチド未満、約１，０００ヌクレオチド未満、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌク
レオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満であり得る。代替的または追加的に、平均
鎖長は、約１０ヌクレオチド超、約５０ヌクレオチド超、約１００ヌクレオチド超、約５
００ヌクレオチド超、約１，０００ヌクレオチド超、約５，０００ヌクレオチド超、約１
０，０００ヌクレオチド超、約５０，０００ヌクレオチド超、または約１００，０００ヌ
クレオチド超であり得る。標的核酸の集団またはそのアンプリコンの平均鎖長は、上記の
最大値と最小値の間の範囲内であり得る。
いくつかの場合、鋳型／標的核酸３６の集団は、そのメンバーの最大長を有する条件下
で生成され得るか、そうでなければそのメンバーの最大長を有するように構成され得る。
例えば、メンバーの最大長は、約１００，０００ヌクレオチド未満、約５０，０００ヌク
レオチド未満、約１０，０００ヌクレオチド未満、約５，０００ヌクレオチド未満、約１
，０００ヌクレオチド未満、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満また
は約５０ヌクレオチド未満であり得る。代替的または追加的に、鋳型核酸３６の集団、ま
たはそのアンプリコンは、そのメンバーの最小長を有する条件下で生成され得るか、そう
でなければそのメンバーの最小長を有するように構成され得る。例えば、メンバーの最小
長は、約１０ヌクレオチド超、約５０ヌクレオチド超、約１００ヌクレオチド超、約５０
０ヌクレオチド超、約１，０００ヌクレオチド超、約５，０００ヌクレオチド超、約１０
，０００ヌクレオチド超、約５０，０００ヌクレオチド超、または約１００，０００ヌク
レオチド超であり得る。集団中の鋳型核酸３６の最大鎖長および最小鎖長は、上記の最大
値と最小値の間の範囲内であり得る。
図２に示されるように、シークエンシングされる鋳型核酸３６（例えば、一本鎖ＤＮＡ
鎖）は、前述の標識ヌクレオチド１０（図２には表示せず）などの試薬とともに、または
該試薬とは別に流体中に導入された後、ポリメラーゼ２６に結合する。
鋳型核酸３６および／または試薬（例えば、標識ヌクレオチド１０）は、流体中に存
在し、フローセル３４に導入されてもよい。該流体は低塩緩衝液を含み得る。例として、
低塩緩衝液は、０ｍＭ超～約５０ｍＭの塩を含み得る。一例として、低塩緩衝液は、Ｔｒ
ｉｓバッファー（ｐＨ８．０）中に、最高で５ｍＭのＭｇ２＋を含む。低塩緩衝液の使用
は、感知ゾーン３１（すなわち、デバイ長）が悪影響を受けない、即ち、電荷タグ１８の
感知を妨げるほど長すぎないので望ましい場合がある。流体は、反応を促進する酵素など
の触媒、その他の添加剤、および溶媒（例えば、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
、ベタイン、ホルムアミドなど）も含み得る。
いくつかの例では、電荷センサー３５に導入される流体において、いくつかの異なる標
識ヌクレオチド１０が一緒に使用される場合がある。これらの例では、連結分子１４、１
４’が、すべての標識ヌクレオチドの種類で同一であっても、異なっていてもよいことを
理解されたい。連結分子１４、１４’の特性、例えば長さおよび剛性は、レドックス反応
の速度に影響を与えるように変更することができる。そのような特性は、標識ヌクレオチ
ド１０およびその関連レドックス活性電荷タグ１８（ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒ
ｅｄｏｘ－ａｃｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ ｔａｇ １８）に対して個別に調整され得る。
連結分子１４’の特異性領域２４の特性も、レドックス反応の速度に影響を与えるように
変更することができる。連結分子１４、１４’は、レドックス活性電荷タグ１８が電気伝
導性チャネル３２の近傍にある時間を増減するように変更することができる。そのような
変更を使用して、電子移動の速度に影響を与えることができる。そうすることで、拡散性
の標識ヌクレオチド１０による、電荷タグ１８と電気伝導性チャネル３２との間の一過性
の相互作用が、電子移動を引き起こす可能性を低くすることができる。あるいは、レドッ
クス活性電荷タグ１８を電気伝導性チャネル３２の近傍に、より長い期間、保持すること
は、電子移動のより高い可能性をもたらし得る。
一例では、電荷センサー３５に導入される流体において、４つの異なる標識ヌクレオチ
ド１０が使用され、４つの異なる標識ヌクレオチド１０のそれぞれは、異なるヌクレオチ
ド１２（特に、異なる塩基２０）および異なるヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タ
グ１８を含む。この一例を図３に示す。この例では、標識ヌクレオチド１０は、以下を含
む：ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第１ヌクレオチド
特異的レドックス活性電荷タグを含む、第１標識ヌクレオチド１０Ａ（図３では、４つの
正電荷で示されている）；ヌクレオチドとしてのデオキシグアノシンポリホスフェートお
よび第２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第２標識ヌクレオチド１０
Ｇ（図３では、４つの負電荷で示されている）；ヌクレオチドとしてのデオキシチジンポ
リホスフェートおよび第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第３標識
ヌクレオチド１０Ｃ（図３では、２つの負電荷で示されている）；およびヌクレオチドと
してのデオキシチミジンポリホスフェートおよび第４ヌクレオチド特異的レドックス活性
電荷タグを含む、第４標識ヌクレオチド１０Ｔ（図３では、１つの正電荷で示されている
）。この例では、第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第２ヌクレオチド特
異的レドックス活性電荷タグ、第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および
第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。
図３に示す例では、第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第２ヌクレオチ
ド特異的レドックス活性電荷タグ、第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、お
よび第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち２つ（例えば、ｄＡＴＰおよ
びｄＴＴＰ）は、変更された電荷状態で（例えば、レドックス反応が起こった後で）正に
帯電していて、第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第２ヌクレオチド特異
的レドックス活性電荷タグ、第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および第
４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち他の２つ（例えば、ｄＧＴＰおよび
ｄＣＴＰ）は、変更された電荷状態で（例えば、レドックス反応が起こった後で）負に帯
電している
図３に示す例では、ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち２つの上の電荷
が同じ（正または負）であっても、該電荷が（例えば、レドックス活性化後に）異なる強
度を有するため、ヌクレオチドの異なる種類を区別するためにタグ１８を依然として使用
することができる。図３に示す例示的な構成は、単一のテザーハイブリダイゼーション位
置および４つの異なるレドックス活性電荷タグ１８に基づく４状態の識別を提供する。具
体的には、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰはともに、それらをｄＡＴＰおよびｄＴＴＰと区別す
る負に帯電したレドックス活性電荷タグ１８を含む；ｄＧＴＰは、ｄＣＴＰの電荷よりも
明らかに高い（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｙ ｈｉｇｈｅｒ）電荷のため、ｄＣＴＰ
と区別することができる。同様に、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰは、ｄＴＴＰ部分と比較して
ｄＡＴＰ部分の正電荷が高いため、互いに区別することができる。
いくつかの例では、負のタグを充電するために必要な電圧が正のタグを放電する可能性
があり、その逆もまた然りであるため、同じ流体中で正および負の大きさの両方のレドッ
クス活性電荷タグ１８を使用することは実現不可能かもしれない。そのため、他の例では
、一方の極性のレドックス活性電荷タグ１８を含む本明細書に開示される標識ヌクレオチ
ド１０の例を利用すること、および永久帯電した（即ち、レドックスではない）タグを含
む他の標識ヌクレオチドを使用することが望ましいかもしれない。永久帯電したタグの例
は、例えばリン酸基、ＤＭＴおよび／またはＦＭＯＣなどの負に帯電したタグ；または第
一級アミンなどの正に帯電したタグを含む。一例として、１～３の異なる標識ヌクレオチ
ド１０（レドックス活性電荷タグ１８を含む）を使用することができ、標識ヌクレオチド
の残りは、レドックス活性電荷タグ１８ではなく永久帯電したタグを含む。これは、還元
条件または酸化条件（両方ではない）が使用される場合に特に有用である。溶液中に比較
的高濃度の両方の電荷タイプの大きな部分が同時に存在しないため、これらの場合には凝
集が起こらないはずであることを理解されたい。
図３はまた、感知ゾーン３１（ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２の周りの影付き領域
）を示す。電荷センサー３５は、生物学的に関連性のある塩条件（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓａｌｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、例えば約１ｍＭ～約１０
０ｍＭの範囲で操作され得る。そのような塩溶液のデバイスクリーニング長は、約０．３
ｎｍ～約１０ｎｍの範囲内であり得、感知ゾーン３１をゲートＧの表面の外側の数ｎｍに
制限し、しばしば信号レベルを検出限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔａｂｉｌｉｔ
ｙ）にまで低下させ得る。
図３では、電気伝導性チャネル３２上にいくつかのつながれたポリメラーゼ２８が示さ
れているが、特定の電荷センサー３５では、１つのポリメラーゼ２８が１つの電気伝導性
チャネル３２につながれることを理解されたい。したがって、図３に示す例は、４つの異
なるヌクレオチド取り込みイベント中のポリメラーゼ２８、およびそれぞれの取り込みイ
ベント中の異なるレドックス活性電荷タグ１８に対する影響を示している。
ここで図４を参照すると、方法の一例が示されている。方法１００は、ポリメラーゼ２
６がつながった電気伝導性チャネル３２に鋳型核酸３６を導入するステップ（参照番号１
０２）；前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチドを導入するステップであって、前記
標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチドおよびそれに付着したヌクレオチド
特異的レドックス活性電荷タグを含み、それにより、前記標識ヌクレオチドの１つが前記
ポリメラーゼと会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ）ステップ（参照番号１０４）；前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合している間
に、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記
ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間のレドック
ス反応を開始するステップ（参照番号１０６）；および前記レドックス反応に応じて、前
記電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ（参照番号１０８）を含む。方法１００
の議論を通して、図５Ａおよび５Ｂも参照される。
図５Ａに示すように、電荷センサー３２に導入された鋳型核酸３６は、電荷センサー３
２につながれたポリメラーゼ２６によって所定の位置に保持され得る。図５Ａに示される
鋳型核酸３６は、ＤＮＡの鋳型鎖であり得る。
また、図５Ａに示されるように、標識ヌクレオチド１０は、鋳型核酸３６の標的核酸に
相補的な塩基２０を含み得る。標識ヌクレオチド１０は、部分的に（ｉｎ ｐａｒｔ）、
鋳型核酸３６にも結合したポリメラーゼ２６によって所定の位置に保持される。存在する
場合、標識ヌクレオチド１０の連結分子１４’の特異性領域２４は、テザー２８と相互作
用し得る。
テザー２８と会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｔｈｅｒ ２
８）標識ヌクレオチド１０の一例を図５Ｂに示す。この例では、標識ヌクレオチド１０の
連結分子１４’は、テザー２８の一部（たとえば、Ａ、Ｂ、Ｃ）に対して親和性を有する
特異性領域２４（例えば、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’）を含む。この特定の例では、特異性領域２
４（例えば、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’）は、テザー２８の当該部分（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ）のヌ
クレオチドまたはペプチド核酸に相補的なヌクレオチドまたはペプチド核酸を含む。別の
例では、特異性領域２４およびテザー２８の受容領域は、互いに親和性を有する非核酸部
分であってもよい。更に別の例では、特異性領域２４は、疎水性ポリマー（テザー２８の
一例）に対して親和性を有する非核酸部分であってもよい。これらの領域間の特異的結合
は、標準的なワトソン－クリックの塩基対合から生じ得る。この例では、特異性領域２４
は、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’ヌクレオチド配列に隣接するイノシン（Ｉ）も含むことができる。
イノシンはユニバーサル塩基であるため、ＤＮＡの４つの天然ヌクレオチドのすべてと対
合することができる。かくして、追加の結合相互作用が、テザー２８上の天然ヌクレオチ
ドとユニバーサル塩基（例えば、イノシンＩ）との相互作用から生じ得る。したがって、
取り込み中に標識ヌクレオチド１０がポリメラーゼ２６に結合すると、標識ヌクレオチド
１０の特異性領域２４とテザー２８との間に相乗的な結合が起こり、標識ヌクレオチド１
０とテザー２８の間の相互作用の安定性が大幅に向上する。
標識ヌクレオチド１０の連結分子１４が特異性領域２４を含まない場合、標識ヌクレオ
チド１０はポリメラーゼ２６との相互作用により所定の位置に保持されるであろうことを
理解されたい。連結分子１４の長さは、レドックス活性電荷タグ１８がゲートＧ／電気伝
導性チャネル３２の感知ゾーン３１内に保持されることを確実にするのを助けることがで
きる。
標識ヌクレオチド１０とポリメラーゼ２６との間、または標識ヌクレオチド１０とポリ
メラーゼ２６およびテザー２８との間の相互作用は、レドックス活性電荷タグ１８が電気
伝導性チャネル３２の感知ゾーン３１内に入ることをもたらす。当該相互作用はまた、効
率的かつ完全な電荷移動に十分な時間の間、感知ゾーン３１内にレドックス活性電荷タグ
１８を維持することを助ける。当該時間は最長で数十ミリ秒であり得る。この比較的長い
相互作用は、拡散して電気伝導性チャネル３２に短時間だけ接触し得る、溶液中に存在す
る他の標識ヌクレオチド１０とは異なる。短時間の相互作用は、十分な電荷移動が起こる
ほど十分に長くないため、これらの例では、レドックス活性電荷タグ１８は帯電されず、
電荷センサー３２によって応答は検出されない。
図５Ａに示される例では、標識ヌクレオチドの銅フタロシアニンレドックス活性電荷タ
グ１８が、電気伝導性チャネル３２から約１ｎｍ～約２ｎｍ以内の場（ｆｉｅｌｄ）（例
えば、感知ゾーン３１）に入る。標識ヌクレオチド１０は所定の位置に保持されているた
め、レドックス活性電荷タグ１８は、ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２によって帯電さ
れる位置にある。
ゲートＧ／電気伝導性チャネル３２（例えば、シリコンナノワイヤ、カーボンナノチュ
ーブなど）とレドックス活性電荷タグ１８との間のレドックス反応を開始するために、ゲ
ートＧ／電気伝導性チャネル３２に印加される電圧は、レドックス活性電荷タグ１８の酸
化電圧または還元電圧に調整され得る。酸化されると、レドックス活性電荷タグ１８は電
子を失い、したがってゲートＧ／電気伝導性チャネル３２はレドックス活性電荷タグ１８
に正味の正電荷を生成する。還元されると、レドックス活性電荷タグ１８は電子を獲得し
、したがってゲートＧ／電気伝導性チャネル３２はレドックス活性電荷タグ１８に正味の
負電荷を注入する。レドックス反応の結果として、レドックス活性電荷タグ１８の電荷状
態は変更される。この変更されたより高い荷電状態（例えば、荷電される前のレドックス
活性電荷タグ１８の状態（非酸化または非還元状態）と比較して）は、電気伝導性チャネ
ル３２の周りの場（ｆｉｅｌｄ）を乱し、検出可能な信号を生成する。
レドックス反応中および検出中に電気伝導性チャネル３２に印加される電圧は、使用さ
れるレドックス活性電荷タグ１８に依存し得る。例えば、充電電圧（ｃｈａｒｇｉｎｇ
ｖｏｌｔａｇｅ）は読み取り電圧（ｒｅａｄｉｎｇ ｖｏｌｔａｇｅ）と異なっていても
よく、したがって、電気伝導性チャネル３２は充電電圧と読み取り電圧との間を循環（ｃ
ｙｃｌｅ）する場合がある。一例では、レドックス反応を開始するステップは、電気伝導
性チャネル３２に充電電圧を印加することを含み、電気伝導性チャネル３２の応答を検出
するステップは、電気伝導性チャネル３２に読み取り電圧を印加することを含む。
レドックス反応後の電気伝導性チャネル３２の応答は、レドックス活性電荷タグ１８の
変更された電荷状態を示している。レドックス活性電荷タグ１８はヌクレオチド特異的で
ある（即ち、特定のタグ１８が特定の塩基２０に対して選択される）ため、レドックス反
応後の電気伝導性チャネル３２の応答は、標識ヌクレオチド１０の塩基２０も示し得る。
したがって、方法１００は、電気伝導性チャネル３２の応答を、標識ヌクレオチド１０の
の前記会合している１つ（即ち、ポリメラーゼ２６と会合している標識ヌクレオチド１０
）のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８に関連付けるステップ、およびヌク
レオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８に基づいて、前記会合しているヌクレオチド
１０（即ち、ポリメラーゼ２６と会合している標識ヌクレオチド１０）のヌクレオチド（
例えば、塩基２０）を識別するステップも含み得る。
前記会合している標識ヌクレオチド１０の塩基２０は、鋳型核酸３６にハイブリダイズ
される新生鎖３８取り込まれる。このことは、標識ヌクレオチド１０のリン酸基１６と新
たに取り込まれたヌクレオチド塩基２０との間の結合を自然に（ｎａｔｕｒａｌｌｙ）切
断する。例えば、新生鎖３８へのヌクレオチド塩基２０の取り込み後、αリン酸と連結分
子１６の間の結合、またはαリン酸とβリン酸の間の結合が自然に切断される。その結果
、標識ヌクレオチド１０の残部（例えば、成分１４または１４’と１８）は、ヌクレオチ
ド塩基２０から自由に解離し、電気伝導性チャネル３２から自由に離れて拡散し、それに
より、電気伝導性チャネル３２の周りの場（ｆｉｅｌｄ）を標識ヌクレオチド１０のポリ
メラーゼ２６との結合前の状態に戻す。電気伝導性チャネル３２の周囲の場（ｆｉｅｌｄ
）がそれぞれ摂動されるとき、および非摂動状態に戻るときの信号の出現および消失は、
鋳型核酸３６の新生鎖３８へのヌクレオチド塩基２０の取り込みと相関させることができ
る。したがって、方法１００の例は、標識ヌクレオチド１０の前記会合している１つ（ｔ
ｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ １０）から、ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８および連結分子
１４、１４’を（例えば、リン酸基１６で）切断するステップであって、それにより、前
記会合している標識ヌクレオチド１０のヌクレオチド塩基２０が、鋳型核酸３６に相補的
な新生鎖３８に取り込まれるも含む。切断するステップは、自然な切断が起こるのを待つ
ことを含み得る。連続した標識ヌクレオチド塩基２０の取り込みの間に信号はベースライ
ン状態に戻るため、鋳型鎖３６に沿った新生鎖３８内のホモポリマーセグメント（ｈｏｍ
ｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔｓ）の検出が可能である。
本明細書に開示されるいくつかの例は、電気伝導性チャネル３２の感知ゾーン３１の近
くにレドックス活性電荷タグ１８を持ってきてかつ保持するために、単独でまたはテザー
２８と組み合わせて、標識ヌクレオチド１０のポリメラーゼ２６への相乗的な結合（ｓｙ
ｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）を利用する。テザー２８と特異性領域２４の間で
形成された複合体の安定性は比較的低いため、（特異性領域２４とテザー２８との間の）
複合体は、ポリメラーゼ２６にも結合しない標識ヌクレオチド１０では形成されない（即
ち、溶液中でフリーの標識ヌクレオチド１０は、テザー２８に実質的に結合しない場合が
ある）。換言すれば、該複合体のオフ速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）は十分に高く、寿命が短
くなり得る。しかしながら、標識ヌクレオチド１０とポリメラーゼ２６の間に安定した会
合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が形成されると、連結分子１４、１４’の局所濃度がテザ
ー２８の周りで増加し、したがってテザー２８に対する特異性領域２４のオン速度（ｏｎ
ｒａｔｅ）が高くなる。このようにして、標識ヌクレオチド１０のポリメラーゼ会合状
態（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）では、浮動性（ｆｒｅ
ｅ－ｆｌｏａｔｉｎｇ）標識ヌクレオチド１０の非会合状態と比較して、全体的な会合時
間（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）が大幅に増加する。ポリメラーゼ３０に対する
標識ヌクレオチド１０の親和性の相乗効果は、単独でまたはテザー２８と組み合わせて、
全体的にかなりの（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）結合親和性を可能にする。ヌクレオチド塩
基２０の取り込み後のポリメラーゼ２６による自然切断後、該相乗効果が失われ、電荷タ
グ１８も電気伝導性チャネル３２から解離するであろう。
例示的な方法１００では、標識ヌクレオチド１０の１つがポリメラーゼ２８と会合する
ステップ、前記レドックス反応を開始するステップ、前記検出するステップ、前記応答を
関連付けるステップ、および前記取り込まれたヌクレオチド塩基２０を識別するステップ
は合わせて、シークエンシングサイクルである。方法１００は、ポリメラーゼ２６と会合
している別の標識ヌクレオチド１０で、別のシークエンシングサイクルを行うステップを
更に含んでもよい。次のシークエンシングサイクルを行うステップは、標識ヌクレオチド
１０の次の１つをポリメラーゼ２６と会合させること；標識ヌクレオチド１０の前記次の
１つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８の電荷状
態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８と電荷セ
ンサー３２との間の他のレドックス反応を開始すること；前記他のレドックス反応に応じ
て、電荷センサー３２の他の応答を検出すること；電荷センサー３２の前記他の応答を、
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付ける（ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｎｇ）こと；および前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ１８に基づいて
、標識ヌクレオチド１０の前記次の１つ（即ち、ポリメラーゼ２６に結合している）のヌ
クレオチド（塩基２０）を識別すること、を含み得る。前記他のヌクレオチド特異的レド
ックス活性電荷タグは切断され得、標識ヌクレオチド１０の前記次の１つのヌクレオチド
（塩基２０）は、鋳型核酸３６に相補的な新生鎖３８に取り込まれる。シークエンシング
サイクルは繰り返され得る。
本明細書で開示される例では、波形も利用され得る。波形は、いつそれが異なる酸化還
元電位を有するレドックス活性電荷タグ１８の酸化還元電位についての１つ以上の閾値電
圧に達するかを決定するために、モニターされ得る。これらの例では、ゲートＧ／電気伝
導性チャネル３２を流れる結果として生じる電流の変化は、特定の閾値電圧に関連するレ
ドックス活性電荷タグ１８を含む標識ヌクレオチド１０の塩基２０を識別する情報として
使用され得る。
本明細書に開示される例では、レドックス活性電荷タグ１８に移動されるまたはレドッ
クス活性電荷タグ１８から移動される電子の数もモニターされ得る。移動された電子の数
を使用して、ポリメラーゼ２６と会合したヌクレオチド塩基２０、およびポリメラーゼ２
６が新生鎖３８に取り込むヌクレオチド塩基２０を同定することができる。
本明細書に開示される標識ヌクレオチド１０およびシステム１０は、様々なアプリケー
ションのいずれかに使用することができる。図４、図５Ａおよび図５Ｂを参照して説明し
たように、特に有用なアプリケーションは、単一分子の合成によるシークエンシング（Ｓ
ＢＳ）などの核酸シークエンシングである。単一分子のＳＢＳでは、鋳型核酸３６（例え
ば、標的核酸またはそのアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長がモニターされ、
鋳型３６内のヌクレオチド配列が決定される。基礎となる化学プロセスは、（例えば、本
明細書に記載のポリメラーゼ酵素２６により触媒されるような）重合であり得る。特定の
ポリメラーゼベースの単一分子のＳＢＳの例では、プライマーに付加されたヌクレオチド
の順番および種類の検出を使用して鋳型配列を決定できるように、ヌクレオチド（例えば
、塩基２０）が鋳型に依存する方法でプライマーに付加される（それにより、プライマー
を伸長し、新生鎖３８を形成する）。異なる鋳型３６について発生するイベントが電気伝
導性チャネル３２の各々に動作可能に接続された個々の検出器によって区別され得る条件
下で、アレイの異なる電気伝導性チャネル３２における複数の異なる鋳型３６を、単一分
子ＳＢＳ技術にかけることができる。各電気伝導性チャネル３２（ならびにそのソースお
よびドレイン端部Ｓ、Ｄ）は、フローセルの窪みまたはウェル内に配置することができ、
このことは、アレイ内において隣接するチャネル３２から１つのチャネル３２を物理的に
分離することを助ける。
本明細書に開示される標識ヌクレオチド１０、キット、およびシステム３０の他の適切
なアプリケーションは、ライゲーションによるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）およびハイブリダイゼーションによるシークエンシング（ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を含む。本明細書に開示され
る標識ヌクレオチド１０およびシステム３０の別の有用なアプリケーションは、遺伝子発
現解析である。遺伝子発現は、ＲＮＡシークエンシング技術、例えばデジタルＲＮＡシー
クエンシングと呼ばれるものを使用して検出または定量化することができる。ＲＮＡシー
クエンシング技術は、光学標識ヌクレオチドの蛍光検出が本明細書に記載の電荷ベースの
検出方法で置換され得ることを除いて、上記のような当技術分野で公知のシークエンシン
グ方法論を使用して実施することができる。遺伝子発現はまた、アレイへの直接ハイブリ
ダイゼーションによって実行されるハイブリダイゼーション技術を使用して、またはその
産物がアレイ上で検出される多重アッセイを使用して、検出または定量化することができ
る。これらの方法は、光学標識および蛍光検出を、電荷ベースの検出技術および本明細書
に記載のレドックス活性電荷タグ１８で置換することにより、容易に適合させることがで
きる。
前述の概念および以下でより詳細に説明される追加の概念の全ての組み合わせ（そのよ
うな概念が相互に矛盾しない場合）は、本明細書で開示された本発明の主題の一部として
企図されることを理解されたい。特に、本開示の最後に現れる特許請求の範囲に記載され
た主題の全ての組み合わせは、本明細書で開示された本発明の主題の一部として企図され
る。また、参照により援用される任意の開示にも現れ得る、本明細書で明示的に使用され
る用語には、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであ
ることも理解されたい。
本明細書全体にわたる「一例」、「別の例」、「例」などへの言及は、当該例に関連し
て説明される特定の要素（例えば、機能、構造、および／または特性）が本明細書に記載
される少なくとも１つの例に含まれ、他の例には存在しても存在しなくてもよいことを意
味する。加えて、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、任意の例について説明
された要素は、様々な例において任意の適切な方法で組み合わされ得ることを理解された
い。
特許請求の範囲を含む本開示全体で使用される「実質的に」および「約」という用語は
、処理のばらつきなどによる小さな変動を記載および説明するために使用される。例えば
、それらは、±５％以下、例えば±２％以下、例えば±１％以下、例えば±０．５％以下
、例えば±０．２％以下、例えば±０．１％以下、例えば±０．０５％以下を指すことが
できる。
更に、本明細書で提供される範囲には、あたかもそのような値または部分範囲が明示的
に列挙されているかのように、述べられた範囲および述べられた範囲内の任意の値または
部分範囲が含まれることを理解されたい。例えば、約１電荷～約１００電荷で表される範
囲は、明示的に記載された約１電荷～１００電荷の制限だけでなく、約５電荷、５０電荷
、７５電荷などの個々の値、および約１５電荷～約８５電荷などの部分範囲も含むと解釈
されるべきである。
いくつかの例を詳細に説明したが、開示された例は修正され得ることを理解されたい。
したがって、前述の説明は非限定的と見なされるべきである。

Claims (22)

  1. ヌクレオチド；
    前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子；および
    前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグ、
    を含む標識ヌクレオチドであって、
    前記レドックス活性電荷タグは、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持される
    とき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、標識ヌクレオチド。
  2. 前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項
    １に記載の標識ヌクレオチド。
  3. 前記連結分子は、前記レドックス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む、請求項１
    または２に記載の標識ヌクレオチド。
  4. 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領域と
    相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む、請求項３に記載の標識ヌ
    クレオチド。
  5. 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合した前記テザー上の前記アクセプタ
    ー領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは約１ヌクレオチド～約１０ヌ
    クレオチドを含有するヌクレオチド配列、または約１ペプチド核酸～約１０ペプチド核酸
    を含有するペプチド核酸配列を含む、請求項４に記載の標識ヌクレオチド。
  6. 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含
    み；かつ
    前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、約１～約１００の電荷を
    含む、請求項１～５の何れかに記載の標識ヌクレオチド。
  7. 以下のステップを含む、方法：
    ポリメラーゼがつながった電気伝導性チャネルに鋳型核酸を導入するステップ；
    前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチドを導入するステップであって、前記標識ヌ
    クレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチドおよびそれに付着したヌクレオチド特異的
    レドックス活性電荷タグを含み、それにより、前記標識ヌクレオチドの１つが前記ポリメ
    ラーゼと会合するステップ；
    前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合している間に、前記ヌクレオチド特異的レドッ
    クス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性
    電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間のレドックス反応を開始するステップ；および
    前記レドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ。
  8. 前記レドックス反応を開始するステップは、前記電気伝導性チャネルに充電電圧を印加
    することを含み；かつ
    前記応答を検出するステップは、前記電気伝導性チャネルに読み取り電圧を印加するこ
    とを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 以下のステップを更に含む、請求項７または８に記載の方法：
    前記電気伝導性チャネルの前記応答を、前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つ
    の前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付けるステップ；および
    前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記会合している標識ヌ
    クレオチドの前記ヌクレオチドを識別するステップ。
  10. 前記標識ヌクレオチドの前記会合している１つから、前記ヌクレオチド特異的レドック
    ス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記会合している標識ヌクレ
    オチドの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な新生鎖に取り込まれるステップを
    更に含む、請求項９に記載の方法。
  11. 請求項１０に記載の方法であって、
    前記標識ヌクレオチドの前記１つが会合するステップ、前記レドックス反応を開始する
    ステップ、前記検出するステップ、前記関連付けるステップ、および前記識別するステッ
    プは合わせて、シークエンシングサイクルであり、
    前記方法は、以下によって、次のシークエンシングサイクルを行うステップを更に含む
    ：
    前記標識ヌクレオチドの次の１つを前記ポリメラーゼと会合させること；
    前記標識ヌクレオチドの前記次の１つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的
    レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レド
    ックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間の他のレドックス反応を開始するこ
    と；
    前記他のレドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの他の応答を検出するこ
    と；
    前記電気伝導性チャネルの前記他の応答を、前記他のヌクレオチド特異的レドックス
    活性電荷タグに関連付けること;および
    前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記標識ヌクレオ
    チドの前記次の１つの前記ヌクレオチドを識別すること。
  12. 以下のステップを更に含む、請求項１１に記載の方法：
    前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、そ
    れにより、前記標識ヌクレオチドの前記次の１つの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に
    相補的な前記新生鎖に取り込まれるステップ；および
    前記シークエンシングサイクルを繰り返すステップ。
  13. 前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項
    ７～１２の何れかに記載の方法。
  14. 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含
    み；かつ
    前記レドックス活性電荷タグは、変更された電荷状態で、約１～約１００の電荷を含む
    、請求項７～１３の何れかに記載の方法。
  15. 前記標識ヌクレオチドは以下を含む、請求項７～１４の何れかに記載の方法：
    前記ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第１ヌクレオチ
    ド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第１標識ヌクレオチド;
    前記ヌクレオチドとしてのデオキシグアノシンポリホスフェートおよび第２ヌクレオチ
    ド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第２標識ヌクレオチド;
    前記ヌクレオチドとしてのデオキシシチジンポリホスフェートおよび第３ヌクレオチド
    特異的レドックス活性電荷タグを含む、第３標識ヌクレオチド;ならびに
    前記ヌクレオチドとしてのデオキシチミジンポリホスフェートおよび第４ヌクレオチド
    特異的レドックス活性電荷タグを含む、第４標識ヌクレオチド；
    ここで、前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド
    特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、
    および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。
  16. 前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第２ヌクレオチド特異的レ
    ドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前
    記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち２つは、変更された電荷状態で
    、正に帯電していて；かつ前記第１ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第
    ２ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第３ヌクレオチド特異的レドックス
    活性電荷タグ、および前記第４ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち他の２
    つは、前記変更された電荷状態で、負に帯電している、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記標識ヌクレオチドは、低塩緩衝液中に存在する、請求項７～１６の何れかに記載の
    方法。
  18. 前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項７～１７
    の何れかに記載の方法。
  19. 以下を備える、キット：
    電気伝導性チャネルであって、それに付着したテザーを有する電気伝導性チャネルと、
    前記テザーを介して、前記電気伝導性チャネルに付着したポリメラーゼと、
    を含むフローセル；
    前記フローセルに導入される鋳型核酸；
    前記フローセルに導入される試薬であって、前記試薬は標識ヌクレオチドを含み、前記
    標識ヌクレオチドの少なくとも１つは、
    ヌクレオチドと、
    前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子と、
    電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネル
    によって酸化または還元される、前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグと、
    を含む、試薬；および
    レドックス反応が前記レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間で起こ
    るとき、前記電気伝導性チャネルからの応答を検出する検出器。
  20. 前記レドックス活性電荷タグは、フェロセン、亜鉛テトラベンゾポルフィリン、コバル
    トフタロシアニン、トリス－（２，２’－ビピリミジン）ルテニウム、４－フェロセニル
    ベンジルアルコール、５－（４－ヒドロキシメチルフェニル）－１０，１５，２０－トリ
    メシチルポルフィナト亜鉛（ＩＩ）、およびレドックス活性カリックスアレーンからなる
    群から選択される、請求項１９に記載のキット。
  21. 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、１０以下の電荷を含
    み；かつ
    前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、約１～約１００の電荷を
    含む、請求項１９または２０に記載のキット。
  22. 前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項１９～２
    １の何れかに記載のキット。
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