JP2022046478A - 標識ヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
号に対する優先権を主張し、前述の出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用
される。
の反応チャンバー内において多数の制御された反応を実施することを含む。指定された反
応は次いで観察または検出され得、その後の分析は当該反応に関与する化学物質の特性を
特定または明らかにするのに役立ち得る。いくつかの例では、当該制御された反応は蛍光
を発生し、したがって光学システムが検出のために使用され得る。他の例では、当該制御
された反応は電荷、伝導性、またはその他の電気的特性を変化させ、したがって電子回路
システムが検出のために使用され得る。
1の態様に関する。
に付着した連結分子;および前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグを含み、前
記レドックス活性電荷タグは、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき
、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される。
ス反応を受ける配位金属原子を含む。
クス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む。
アクセプター領域と相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む。
上の前記アクセプター領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは約1ヌク
レオチド~約10ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列、または約1ペプチド核酸~
約10ペプチド核酸を含有するペプチド核酸配列を含む。
タグは、非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含み;かつ前記レドックス活
性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、約1~約100の電荷を含む。
意の所望の方法および/または構成で組み合わされ得るを理解されたい。
関する。
導性チャネルに鋳型核酸を導入するステップ;前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチ
ドを導入するステップであって、前記標識ヌクレオチドの少なくとも1つは、ヌクレオチ
ドおよびそれに付着したヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含み、それにより
、前記標識ヌクレオチドの1つが前記ポリメラーゼと会合する(associates
with the polymerase)ステップ;前記標識ヌクレオチドの前記1つ
が会合している間に、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更
するために、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネル
との間のレドックス反応を開始するステップ;および前記レドックス反応に応じて、前記
電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ。
導性チャネルに充電電圧を印加することを含み;かつ前記応答を検出するステップは、前
記電気伝導性チャネルに読み取り電圧を印加することを含む。
チャネルの前記応答を、前記標識ヌクレオチドの前記会合している1つの前記ヌクレオチ
ド特異的レドックス活性電荷タグに関連付ける(associating)ステップ;お
よび前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記会合している標識
ヌクレオチドの前記ヌクレオチドを識別するステップ。
チド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記会合
している標識ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な新生鎖に取り
込まれるステップを更に含む。
ドックス反応を開始するステップ、前記検出するステップ、前記関連付けるステップ、お
よび前記識別するステップは合わせて、シークエンシングサイクルであり、前記方法は、
以下によって、次のシークエンシングサイクルを行うステップを更に含む:前記標識ヌク
レオチドの次の1つを前記ポリメラーゼと会合させること;前記標識ヌクレオチドの前記
次の1つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状
態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝
導性チャネルとの間の他のレドックス反応を開始すること;前記他のレドックス反応に応
じて、前記電気伝導性チャネルの他の応答を検出すること;前記電気伝導性チャネルの前
記他の応答を、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付ける(as
sociating)こと;および前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ
に基づいて、前記標識ヌクレオチドの前記次の1つの前記ヌクレオチドを識別すること。
クス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記標識ヌクレオチドの前
記次の1つの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な前記新生鎖に取り込まれるス
テップ;および前記シークエンシングサイクルを繰り返すステップ。
レドックス反応を受ける配位金属原子を含む。
非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含み;かつ前記レドックス活性電荷タ
グは、変更された電荷状態で、約1~約100の電荷を含む。
む:前記ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第1ヌクレオ
チド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第1標識ヌクレオチド;前記ヌクレオチドと
してのデオキシグアノシンポリホスフェートおよび第2ヌクレオチド特異的レドックス活
性電荷タグを含む、第2標識ヌクレオチド;前記ヌクレオチドとしてのデオキシシチジン
ポリホスフェートおよび第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第3標
識ヌクレオチド;ならびに前記ヌクレオチドとしてのデオキシチミジンポリホスフェート
および第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第4標識ヌクレオチド;
ここで、前記第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第2ヌクレオチド特
異的レドックス活性電荷タグ、前記第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、お
よび前記第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。
2ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第3ヌクレオチド特異的レドックス
活性電荷タグ、および前記第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち2つは
、変更された電荷状態で、正に帯電していて;かつ前記第1ヌクレオチド特異的レドック
ス活性電荷タグ、前記第2ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第3ヌクレ
オチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前記第4ヌクレオチド特異的レドックス活
性電荷タグのうち他の2つは、前記変更された電荷状態で、負に帯電している。
衝液中に存在する。
効果トランジスタのチャネルである。
れ得ることを理解されたい。更に、この方法および/または前記標識ヌクレオチドの特徴
の任意の組み合わせが一緒に使用され得、かつ/または本明細書に開示される例の何れか
と組み合わされ得ることを理解されたい。
様に関する。
付着したテザーを有する電気伝導性チャネルと、前記テザーを介して、前記電気伝導性チ
ャネルに付着したポリメラーゼと、を含むフローセル;前記フローセルに導入される鋳型
核酸;前記フローセルに導入される試薬であって、前記試薬は標識ヌクレオチドを含み、
前記標識ヌクレオチドの少なくとも1つは、ヌクレオチドと、前記ヌクレオチドのリン酸
基に付着した連結分子と、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前
記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、前記連結分子に付着したレドック
ス活性電荷タグと、を含む、試薬;およびレドックス反応が前記レドックス活性電荷タグ
と前記電気伝導性チャネルとの間で起こるとき、前記電気伝導性チャネルからの応答を検
出する検出器。
errocene)、亜鉛テトラベンゾポルフィリン(zinc tetrabenzo
porphyrin)、コバルトフタロシアニン(cobalt phthalocya
nine)、トリス-(2,2’-ビピリミジン)ルテニウム(tris-(2,2’-
bipyrimidine)ruthenium)、4-フェロセニルベンジルアルコー
ル(4-ferrocenylbenzyl alcohol)、5-(4-ヒドロキシ
メチルフェニル)-10,15,20-トリメシチルポルフィナト亜鉛(II)(5-(
4-hydroxymethylphenyl)-10,15,20-trimesit
ylporphinatozinc(II))、およびレドックス活性カリックスアレー
ン(redox-active calixarene)からなる群から選択される。
非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含み;かつ前記レドックス活性電荷タ
グは、酸化状態または還元状態で、約1~約100の電荷を含む。
電界効果トランジスタのチャネルである。
わされ得るを理解されたい。更に、このキットおよび/または前記方法および/または前
記標識ヌクレオチドの特徴の任意の組み合わせが一緒に使用され得、かつ/または本明細
書に開示される例の何れかと組み合わされ得ることを理解されたい。
前記キットの任意の特徴が、任意の所望の方法で組み合わされ得、かつ/または本明細書
に開示される例の何れかと組み合わされ得ることを理解されたい。
であろう。以下の詳細な説明および図面において、同様の参照番号は、おそらく同一では
ないが類似の構成要素に対応する。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号また
は特徴は、それらが現れる他の図面に関連して説明されてもされなくてもよい。
ドが、本明細書に開示される。単一分子検出において使用されるセンサーは、1つのポリ
メラーゼが付着した1つの電気伝導性チャネルを有し得る。これにより、個々の各センサ
ーで一度に1つの取り込みイベント(即ち、ポリメラーゼによる新生鎖への塩基の取り込
み)を検出することが可能になる。標識ヌクレオチドは、核酸シークエンシング用ならび
に核酸および一般的な他の分析物の検出用に使用することができる独自の検出様式を提供
する。
標識ヌクレオチド10は、ヌクレオチド12、ヌクレオチド12のリン酸基16に付着し
た連結分子14または14’、および連結分子14または14’に付着したレドックス活
性電荷タグ18を含み、レドックス活性電荷タグ18は、電気伝導性チャネル32の感知
ゾーン(参照番号31、図3)の近くに維持されるとき、電気伝導性チャネル(参照番号
32、図2)によって酸化または還元される。標識ヌクレオチド10は、天然ヌクレオチ
ドとは構造的または化学的に異なるため、非天然ヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドと
みなすことができる。
レオチドは、窒素含有複素環塩基20、糖22、および1つ以上のリン酸基16を含む。
天然のヌクレオチドの例は、例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド
を含む。リボヌクレオチドでは、糖22はリボースであり、デオキシリボヌクレオチドで
は、糖22はデオキシリボース、即ちリボースの2’位に存在するヒドロキシル基を欠く
糖である。一例では、ヌクレオチド12は、いくつかのリン酸基16(例えば、3リン酸
(即ち、γリン酸)、4リン酸、5リン酸、6リン酸など)を含むため、ポリリン酸形態
である。複素環塩基20(即ち、核酸塩基)は、プリン塩基またはピリミジン塩基である
ことができる。プリン塩基は、アデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにそれらの
修飾誘導体または類似体を含む。ピリミジン塩基は、シトシン(C)、チミン(T)およ
びウラシル(U)、ならびにそれらの修飾誘導体または類似体を含む。デオキシリボース
のC-1原子は、ピリミジンのN-1またはプリンのN-9に結合している。核酸類似体
では、リン酸骨格、糖、および核酸塩基のいずれかが変化し得る。核酸類似体の例は、例
えば、ユニバーサル塩基またはペプチド核酸(PNA)などのリン酸-糖骨格類似体を含
む。
連結分子(図1において14として表示)は特異性領域24を含まない。他の例では、連
結分子(図1において14’として表示)は特異性領域24を含む。図1に概略的に示さ
れるように、特異性領域24が連結分子14’の一部である場合、該領域24は、レドッ
クス活性電荷タグ18に化学的に結合する端部に位置し得る。特異性領域24については
、以下で更に説明する。
酸基16に化学的に結合でき、他端でレドックス活性電荷タグ18に化学的に結合できる
任意の長鎖分子であり得る。連結分子14または14’はまた、本明細書に開示されるシ
ステム30(図2を参照)で使用されるポリメラーゼ26と相互作用しないように選択さ
れ得る。連結分子14または14’は、レドックス活性電荷タグ18が電気伝導性チャネ
ル32(図2)の感知ゾーン31(図3)内に存在することを可能にするほど十分に長い
ように選択される。例として、連結分子14または14’は、アルキル鎖、ポリ(エチレ
ングリコール)鎖、アミド基、リン酸基、トリアゾールなどの複素環、ヌクレオチド、ま
たはそれらの組み合わせを含み得る。アルキル鎖の例は、少なくとも6個の炭素原子を含
み得、ポリ(エチレングリコール)鎖の例は、少なくとも3個のエチレングリコール単位
を含み得る。
使用しもよいことを理解されたい。
4’の一部として特異性領域24も含み得る。特異性領域24は、電気伝導性チャネル3
2に結合したテザー28(図2)上のアクセプター領域と相互作用することができる。特
異性領域24は、テザー28のアクセプター領域に一時的に付着することができるアフィ
ニティータグを含み得る。アフィニティータグの結合親和性は、標識ヌクレオチド10が
ポリメラーゼ26によって保持されているときに、テザー28上のアクセプター領域に特
異性領域24を結合させるほど十分に強いかもしれないが、取り込みイベント後に(即ち
、ポリメラーゼ26が、αリン酸および連結分子14、14’の間、またはαリン酸およ
びβリン酸の間の結合を自然に切断するときに)アクセプター領域から特異性領域24を
リリースするほど十分に弱いかもしれない。換言すれば、アクセプター領域への特異性領
域24(例えば、アフィニティータグ)のオン速度、およびアクセプター領域からの特異
性領域24(例えば、アフィニティータグ)のオフ速度は、全体的な単一分子感知を改善
するために選択され得る。アフィニティータグ/アクセプター領域の相互作用のオン速度
は、ヌクレオチド取り込みの前、例えば、特異性領域24、したがってアフィニティータ
グの効果的な高濃度のために高くなり得る。この高いオン速度は、アフィニティータグが
アクセプター領域に結合している時間の割合を増加させる。切断後、次の標識ヌクレオチ
ド10がポリメラーゼ26の活性部位に入るときに、(以前に取り込まれたヌクレオチド
のアフィニティータグとアクセプター領域の間の)結合状態が存在する可能性が低いよう
に十分に速く、(アフィニティータグとアクセプター領域の間の)複合体が解離するよう
に、相互作用のオフ速度は十分に高く選択され得る。
るため、アフィニティータグは、テザー28上のアクセプター領域に一時的に付着するこ
とができるヌクレオチド配列またはペプチド核酸配列を含み得る(図2)。一例では、ア
フィニティータグは、約1ヌクレオチド~約10ヌクレオチド、または約1ペプチド核酸
~約10ペプチド核酸を含有するヌクレオチド配列を含む。他の例では、アフィニティー
タグは、最大6個のヌクレオチドまたはペプチド核酸を含む。更に別の例では(図5Bで
更に表示および説明されるように)、特異性領域24は、ヌクレオチド配列の両側に隣接
するイノシンを更に含み得る。更に他の例では、アフィニティータグは、互いに対する親
和性または疎水性ポリマーに対する親和性を有するペプチドなどの非核酸部分であり得る
。具体的なタンパク質の例はコイルドコイルを含み、当該コイルドコイルは2~7個のα
-ヘリックスがロープの鎖のように一緒にコイル状になっているタンパク質中の構造モチ
ーフである。換言すると、コイルドコイルは、互いに巻き付いてスーパーコイルを形成す
る2つ以上のα-ヘリックスによって構築される。コイルドコイルの例は、c-Fosや
c-junなどの腫瘍性タンパク質(oncoprotein)を含む。
近くに維持されたときに、電気伝導性チャネル32によって酸化(電子を失う)または還
元(電子を獲得)されると、その電荷を増加させることができる任意の電荷タグであり得
る。電荷タグ18は、レドックス反応が起こる前に、正味中性(net neutral
)(ゼロ電荷)、またはこの状態に近い(10電荷以下)場合がある。換言すれば、非酸
化状態または非還元状態において、レドックス活性電荷タグ18は10以下の電荷を運ぶ
。レドックス活性電荷タグ18によって運ばれる電荷は、標識ヌクレオチド10のリン酸
16または連結分子14、14’のいずれの電荷も含まない。レドックス反応が起こった
後、レドックス活性電荷タグ18の正味の全体電荷(net overall char
ge)が変化する(即ち、レドックス活性電荷タグ18は、より多くの正電荷またはより
多くの負電荷(more positive charges or more neg
ative charges)を運ぶ)。一例では、レドックス活性電荷タグ18は、非
酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含み、レドックス活性電荷タグ18は、
酸化状態または還元状態で、約1~約100の電荷を含む。非酸化状態または非還元状態
におけるレドックス活性電荷タグ18の電荷数は、酸化状態または還元状態におけるレド
ックス活性電荷タグ18の電荷数よりも低いことを理解されたい。別の例では、レドック
ス活性電荷タグ18は、非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含み、レドッ
クス活性電荷タグ18は、酸化状態または還元状態で、約20~約50の電荷を含む。
なわち、所定の位置に保持された)金属原子を含み得る。金属原子の例は、鉄、コバルト
、ルテニウム、亜鉛、銅、リチウム、銀などを含む。いくつかの具体的な例として、レド
ックス活性電荷タグ18は、フェロセン(ferrocene)、亜鉛テトラベンゾポル
フィリン(zinc tetrabenzoporphyrin)、コバルトフタロシア
ニン(cobalt phthalocyanine)、トリス-(2,2’-ビピリミ
ジン)ルテニウム(tris-(2,2’-bipyrimidine)rutheni
um)、4-フェロセニルベンジルアルコール(4-ferrocenylbenzyl
alcohol)、5-(4-ヒドロキシメチルフェニル)-10,15,20-トリ
メシチルポルフィナト亜鉛(II)(5-(4-hydroxymethylpheny
l)-10,15,20-trimesitylporphinatozinc(II)
)、およびレドックス活性カリックスアレーンからなる群から選択される。
は、フェロセンデンドリマーである:
式中、Fe2+は酸化によりFe3+になることができ、したがって各「Fe」に正電荷
が導入される。
)は、以下の構造を有する:
式中、Rは、C2H5、C6H13、またはC12H25である。Zn1+は酸化により
Zn2+になることができ、したがって正電荷が導入される。
下を含む:
および
上記のいずれも溶液中において正味中性(net neutral)の分子である。酸化
されると、Co2+はCo3+になり、各「Co」に正電荷が導入される(例えば、最初
の構造には1つの正電荷、2番目の構造には5つの正電荷)。-3~+5の範囲の酸化状
態を有する他のコバルト含有化合物が知られており、負に帯電可能なレドックス活性電荷
タグ18または正に帯電可能なレドックス活性電荷タグ18として使用され得る。
imidine)ruthenium)は、以下の構造を有する:
式中、Ru2+は酸化によりRu3+になることができ、したがって正電荷が導入される
。
cohol)は、以下の構造を有する:
式中、Fe2+は酸化によりFe3+になることができ、したがって正電荷が導入される
。
ト亜鉛(II)(5-(4-hydroxymethylphenyl)-10,15,
20-trimesitylporphinatozinc(II))は、以下の構造を
有する:
式中、Zn2+は還元によりZn1+になることができ、したがって負電荷が導入される
。
化状態において使用されて、電気伝導性チャネルの感知ゾーン31内にあるときに還元さ
れ得るか、あるいはそれらのより低い酸化状態において使用されて、電気伝導性チャネル
の感知ゾーン31内にあるときに酸化され得る
たは中性付近(near-neutral)であり得、レドックス反応を受けるまでより
大きな電荷を運ばない。かくして、溶液中の標識ヌクレオチド10は高度に帯電した分子
(highly charged molecules)とはみなされず、(反対に帯電
した中性付近のレドックス活性電荷タグ18を含む)反対に帯電した標識ヌクレオチド1
0間の凝集は起こりにくい。
されている)において使用され得る。キットまたはシステム30は、電気伝導性チャネル
32を含み得る。電気伝導性チャネル32は、ウェル、チューブ、チャネル、キュベット
、ペトリ皿、ボトルなどの容器内にあってもよく、またはそれら容器の一部であってもよ
い。適切な容器の別の例は、フローセル34である。本明細書に記載の実装に適した任意
のフローセル構成が使用され得る。いくつかの例示的なフローセルは、イルミナ社(カリ
フォルニア州サンディエゴ)から市販されているものである。フローセル34は、反応成
分(例えば、鋳型核酸、標識ヌクレオチド10など)のそれぞれの電気伝導性チャネル3
2への付着中に、またはそれぞれの電気伝導性チャネル32上の反応成分を用いて行われ
る後続の反応中に、個々にアドレス可能な電気伝導性チャネル32のアレイにバルク試薬
を送達するのに便利である。核酸シークエンシング反応などのサイクリックプロセス(c
yclic processes)は、フローセル34に特に適している。別の特に有用
な容器は、マルチウェルプレートまたはマイクロタイタープレート中のウェルである。
使用する場合、「電気伝導性チャネル(electrically conductiv
e channel)」という用語は、その表面またはその周囲の電場における摂動を電
気信号に変換する検出デバイスの一部を意味することを意図している。例えば、電気伝導
性チャネル32は、反応成分(例えば、標識ヌクレオチド10)の到着または離脱を電気
信号に変換することができる。本明細書に開示される例では、電気伝導性チャネル32は
、標識ヌクレオチド10のレドックス活性電荷タグ18との相互作用によって、2つの反
応成分(鋳型核酸と標識ヌクレオチド10のヌクレオチド20)の間の相互作用を検出可
能な信号に変換することもできる。
5は、ソース端部Sおよびドレイン端部D、ならびに端部S、Dを接続するチャネル32
を含み得る。チャネル32は、例えば、チューブ、ワイヤ、プレートなどの任意の適切な
形状を有し得る。
料の例は、コバルト、ケイ化コバルト、ニッケル、ケイ化ニッケル、アルミニウム、タン
グステン、銅、チタン、モリブデン、酸化インジウムスズ(ITO)、酸化インジウム亜
鉛、金、プラチナ、カーボンなどを含む。
できる任意の伝導性(conductive)材料または半伝導性(semi-cond
uctive)材料を含み得る。当該材料は、有機材料、無機材料、またはその両方を含
み得る。適切なチャネル材料のいくつかの例は、シリコン、カーボン(例えば、グラッシ
ーカーボン、グラフェンなど)、伝導性ポリマーなどのポリマー(例えば、ポリピロール
、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリ(4-スチレンスルホン酸)をドープしたポリ(
3,4-エチレンジオキシチオフェン)(PEDOT-PSS)など)、金属などを含む
。
nsion)をナノスケール(1nm~1μm未満の範囲)で有するナノ構造であり得る
。一例では、この寸法(dimension)は最大寸法を指す。例として、電気伝導性
チャネル26は、半伝導性ナノ構造、グラフェンナノ構造、金属ナノ構造、および伝導性
ポリマーナノ構造であり得る。ナノ構造は、多層または単層ナノチューブ、ナノワイヤ、
ナノリボンなどであり得る。
カーボンナノチューブ(SWNT)ベースのFET、シリコンナノワイヤ(SiNW)F
ET、ポリマーナノワイヤFET、グラフェンナノリボンFET(およびMoS2、シリ
センなどの2D材料から製造された関連ナノリボンFET)、トンネルFET(TFET
)、および急峻サブスレッショルドスロープデバイス(steep subthresh
old slope devices)などの電界効果トランジスタ(FET)である。
とドレインDとの間の電気伝導性チャネル32を含むナノ構造FETである。電気伝導性
チャネル32は、カーボンナノチューブ、単層カーボンナノチューブ、シリコンナノワイ
ヤ、ポリマーナノワイヤなどであり得る。電気伝導性チャネル32はゲート端部として機
能するため、図2では「G」としても示されている。本明細書に開示される例では、ゲー
トG/電気伝導性チャネル32は、標識ヌクレオチド10のレドックス活性電荷タグ18
のための(電子を供給または受容する)酸化還元電極として機能し得る。より具体的には
、レドックス活性電荷タグ18に電子を移動させるか、またはレドックス活性電荷タグ1
8から電子を移動させるために、ゲートG/電気伝導性チャネル32を使用することがで
きる。電子移動は、ゲートG/電気伝導性チャネル32の少なくとも一部の表面上のゲー
ト酸化物(gate oxide)(図示せず)を通るトンネリングを介して起こり得る
。いくつかの例では、ゲート酸化物の厚さは、レドックス活性電荷タグ18が十分に活性
化される前に最小量の接触時間が経過するように、電流移動効率を調整するために使用さ
れ得る。接触時間は、電子移動が高い可能性で発生するように、レドックス活性電荷タグ
18がゲートG/電気伝導性チャネル32の十分な近傍内に保持される時間を指し得る。
この時間は、レドックス活性電荷タグ18の種類、ゲート酸化物の厚さ、およびゲートG
/電気伝導性チャネル32からの電荷タグ18の距離を含む多くの要因に依存する。ゲー
トG/電気伝導性チャネル32に一時的に接触するが、ゲートG/電気伝導性チャネル3
2に付着したポリメラーゼ26と実際には会合していない拡散性の標識ヌクレオチド10
を電荷センサー35が十分に区別することを保証するために、このことは使用され得る。
ポリメラーゼ26の活性部位と会合しているヌクレオチド10は、一過性の相互作用が発
生する時間よりも有意に長い期間、会合状態にとどまると予想される。例えば、標識ヌク
レオチド10は、数百マイクロ秒から数百ミリ秒の間、ポリメラーゼ活性部位(例えば、
ポリメラーゼ26)と会合したままであり得る。一過性の相互作用は、桁違いに速い拡散
タイムスケールで発生する。
/電気伝導性チャネル32上に固定される。テザー28は、ポリメラーゼ26のアンカー
として用いられる。テザー28は、電子輸送能を示し得る。適切なテザー28の例は、(
例えば、5~25のヌクレオチドを有する)核酸鎖、ペプチド、単一炭素鎖、非伝導性ま
たは低伝導性のオリゴマーまたはポリマーなどを含む。
32から少なくとも10nm離れてポリメラーゼ26を保持する。例えば、ポリメラーゼ
26の電荷および/またはポリメラーゼ26によって保持された鋳型核酸36の負電荷を
感知することが望ましくない場合に、これは望ましいかもしれない。しかしながら、ポリ
メラーゼ26および/または鋳型核酸36の電荷を感知することが望ましい場合、テザー
28は、電荷センサー32のゲートGから約10nm未満、約9nm未満、約8nm未満
、約7nm未満、約6nm未満、約5nm未満、約4nm未満、約3nm未満、約2nm
未満、または約1nm未満にポリメラーゼ26を保持してもよい。
れたFETを用いて、単一分子の感度を達成することができる;および(2)検出された
電荷の変化はゲートG/電気伝導性チャネル32の近傍に局在するため、高度な並列化(
「多重化可能性(multiplexability)」とも呼ばれる)が容易になり、
(例えば、アレイ中の)隣接する個別にアドレス可能なFETサイト間のクロストークが
回避される。更に、シリコンナノ構造FETは、半導体製造施設と適合する(compa
tible with)プロセスを使用して製造することができる。
、およびフローセル34に導入される試薬(図2には図示せず)も含み得る。
れらの類似体から構成され得る。鋳型(または標的)核酸36の供給源は、ゲノムDNA
、メッセンジャーRNA、または天然源由来の他の核酸であり得る。いくつかの場合、そ
のような供給源に由来する鋳型核酸36は、本明細書の方法またはシステム30で使用す
る前に増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増
幅(RCA)、多置換増幅(MDA)、またはランダムプライマー増幅(RPA)を含む
がこれらに限定されない様々な既知の増幅技術のいずれかを使用することができる。本明
細書に記載の方法またはシステム30における使用前の標的核酸26の増幅は任意である
ことを理解されたい。そのため、いくつかの例では、鋳型核酸36は使用前に増幅されな
いであろう。鋳型/標的核酸は、任意で、合成ライブラリーに由来することができる。合
成核酸は、天然のDNAまたはRNA組成物を有し得るか、またはその類似体であり得る
。
サギ、モルモット、有蹄動物、馬、羊、豚、ヤギ、牛、猫、犬、霊長類、ヒトまたは非ヒ
ト霊長類などの哺乳動物;シロイヌナズナ、トウモロコシ、モロコシ(sorghum)
、エンバク、小麦、米、キャノーラ、または大豆などの植物;コナミドリムシ(Chla
mydomonas reinhardtii)などの藻類;カエノラブディティス・エ
レガンス(Caenorhabditis elegans)などの線虫;キイロショウ
ジョウバエ(Drosophila melanogaster)、蚊、ショウジョウバ
エ、ミツバチ、クモなどの昆虫;ゼブラフィッシュなどの魚;爬虫類;カエルやアフリカ
ツメガエル(Xenopus laevis)などの両生類;キイロタマホコリカビ(d
ictyostelium discoideum);ニューモシスチス・カリニ(pn
eumocystis carinii)、トラフグ(Takifugu rubrip
es)、酵母、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)または
分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)などの菌類;または
熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)に由来するものが
含まれる。鋳型核酸36は、細菌、大腸菌(Escherichia coli)、ブド
ウ球菌(staphylococci)または肺炎マイコプラズマ(mycoplasm
a pneumoniae)などの原核生物;古細菌;C型肝炎ウイルス、エボラウイル
スまたはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス;またはウイロイド(viroid)に由
来することもできる。鋳型核酸36は、上記の生物の均質な培養物または集団、または代
替的に、例えばコミュニティまたは生態系における、いくつかの異なる生物のコレクショ
ンに由来し得る。
合成することができる。本明細書に記載の例で、例えば、遺伝子発現プローブまたは遺伝
子型決定プローブ(genotyping probes)を合成および使用することが
できる。
ることができる。断片化は、例えば、噴霧化、超音波処理、化学的切断、酵素的切断、ま
たは物理的せん断を含む、当技術分野で知られている様々な技術のいずれかを使用して実
行することができる。断片化はまた、より大きな核酸の一部のみをコピーすることにより
アンプリコンを生成する特定の増幅技術の使用から生じる場合がある。例えば、PCR増
幅は、増幅中に隣接プライマーがハイブリダイズする位置の間にある元の鋳型上のヌクレ
オチド配列の長さによって規定されるサイズを有する断片を生成する。
ト、またはシステム30の特定のアプリケーションのために望ましいまたは適切な平均鎖
長を有することができる。例えば、平均鎖長は、約100,000ヌクレオチド未満、約
50,000ヌクレオチド未満、約10,000ヌクレオチド未満、約5,000ヌクレ
オチド未満、約1,000ヌクレオチド未満、約500ヌクレオチド未満、約100ヌク
レオチド未満、または約50ヌクレオチド未満であり得る。代替的または追加的に、平均
鎖長は、約10ヌクレオチド超、約50ヌクレオチド超、約100ヌクレオチド超、約5
00ヌクレオチド超、約1,000ヌクレオチド超、約5,000ヌクレオチド超、約1
0,000ヌクレオチド超、約50,000ヌクレオチド超、または約100,000ヌ
クレオチド超であり得る。標的核酸の集団またはそのアンプリコンの平均鎖長は、上記の
最大値と最小値の間の範囲内であり得る。
で生成され得るか、そうでなければそのメンバーの最大長を有するように構成され得る。
例えば、メンバーの最大長は、約100,000ヌクレオチド未満、約50,000ヌク
レオチド未満、約10,000ヌクレオチド未満、約5,000ヌクレオチド未満、約1
,000ヌクレオチド未満、約500ヌクレオチド未満、約100ヌクレオチド未満また
は約50ヌクレオチド未満であり得る。代替的または追加的に、鋳型核酸36の集団、ま
たはそのアンプリコンは、そのメンバーの最小長を有する条件下で生成され得るか、そう
でなければそのメンバーの最小長を有するように構成され得る。例えば、メンバーの最小
長は、約10ヌクレオチド超、約50ヌクレオチド超、約100ヌクレオチド超、約50
0ヌクレオチド超、約1,000ヌクレオチド超、約5,000ヌクレオチド超、約10
,000ヌクレオチド超、約50,000ヌクレオチド超、または約100,000ヌク
レオチド超であり得る。集団中の鋳型核酸36の最大鎖長および最小鎖長は、上記の最大
値と最小値の間の範囲内であり得る。
鎖)は、前述の標識ヌクレオチド10(図2には表示せず)などの試薬とともに、または
該試薬とは別に流体中に導入された後、ポリメラーゼ26に結合する。
在し、フローセル34に導入されてもよい。該流体は低塩緩衝液を含み得る。例として、
低塩緩衝液は、0mM超~約50mMの塩を含み得る。一例として、低塩緩衝液は、Tr
isバッファー(pH8.0)中に、最高で5mMのMg2+を含む。低塩緩衝液の使用
は、感知ゾーン31(すなわち、デバイ長)が悪影響を受けない、即ち、電荷タグ18の
感知を妨げるほど長すぎないので望ましい場合がある。流体は、反応を促進する酵素など
の触媒、その他の添加剤、および溶媒(例えば、水、ジメチルスルホキシド(DMSO)
、ベタイン、ホルムアミドなど)も含み得る。
識ヌクレオチド10が一緒に使用される場合がある。これらの例では、連結分子14、1
4’が、すべての標識ヌクレオチドの種類で同一であっても、異なっていてもよいことを
理解されたい。連結分子14、14’の特性、例えば長さおよび剛性は、レドックス反応
の速度に影響を与えるように変更することができる。そのような特性は、標識ヌクレオチ
ド10およびその関連レドックス活性電荷タグ18(its associated r
edox-active charge tag 18)に対して個別に調整され得る。
連結分子14’の特異性領域24の特性も、レドックス反応の速度に影響を与えるように
変更することができる。連結分子14、14’は、レドックス活性電荷タグ18が電気伝
導性チャネル32の近傍にある時間を増減するように変更することができる。そのような
変更を使用して、電子移動の速度に影響を与えることができる。そうすることで、拡散性
の標識ヌクレオチド10による、電荷タグ18と電気伝導性チャネル32との間の一過性
の相互作用が、電子移動を引き起こす可能性を低くすることができる。あるいは、レドッ
クス活性電荷タグ18を電気伝導性チャネル32の近傍に、より長い期間、保持すること
は、電子移動のより高い可能性をもたらし得る。
ド10が使用され、4つの異なる標識ヌクレオチド10のそれぞれは、異なるヌクレオチ
ド12(特に、異なる塩基20)および異なるヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タ
グ18を含む。この一例を図3に示す。この例では、標識ヌクレオチド10は、以下を含
む:ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第1ヌクレオチド
特異的レドックス活性電荷タグを含む、第1標識ヌクレオチド10A(図3では、4つの
正電荷で示されている);ヌクレオチドとしてのデオキシグアノシンポリホスフェートお
よび第2ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第2標識ヌクレオチド10
G(図3では、4つの負電荷で示されている);ヌクレオチドとしてのデオキシチジンポ
リホスフェートおよび第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第3標識
ヌクレオチド10C(図3では、2つの負電荷で示されている);およびヌクレオチドと
してのデオキシチミジンポリホスフェートおよび第4ヌクレオチド特異的レドックス活性
電荷タグを含む、第4標識ヌクレオチド10T(図3では、1つの正電荷で示されている
)。この例では、第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第2ヌクレオチド特
異的レドックス活性電荷タグ、第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および
第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。
ド特異的レドックス活性電荷タグ、第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、お
よび第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち2つ(例えば、dATPおよ
びdTTP)は、変更された電荷状態で(例えば、レドックス反応が起こった後で)正に
帯電していて、第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、第2ヌクレオチド特異
的レドックス活性電荷タグ、第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および第
4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち他の2つ(例えば、dGTPおよび
dCTP)は、変更された電荷状態で(例えば、レドックス反応が起こった後で)負に帯
電している
が同じ(正または負)であっても、該電荷が(例えば、レドックス活性化後に)異なる強
度を有するため、ヌクレオチドの異なる種類を区別するためにタグ18を依然として使用
することができる。図3に示す例示的な構成は、単一のテザーハイブリダイゼーション位
置および4つの異なるレドックス活性電荷タグ18に基づく4状態の識別を提供する。具
体的には、dGTPおよびdCTPはともに、それらをdATPおよびdTTPと区別す
る負に帯電したレドックス活性電荷タグ18を含む;dGTPは、dCTPの電荷よりも
明らかに高い(distinguishably higher)電荷のため、dCTP
と区別することができる。同様に、dATPおよびdTTPは、dTTP部分と比較して
dATP部分の正電荷が高いため、互いに区別することができる。
があり、その逆もまた然りであるため、同じ流体中で正および負の大きさの両方のレドッ
クス活性電荷タグ18を使用することは実現不可能かもしれない。そのため、他の例では
、一方の極性のレドックス活性電荷タグ18を含む本明細書に開示される標識ヌクレオチ
ド10の例を利用すること、および永久帯電した(即ち、レドックスではない)タグを含
む他の標識ヌクレオチドを使用することが望ましいかもしれない。永久帯電したタグの例
は、例えばリン酸基、DMTおよび/またはFMOCなどの負に帯電したタグ;または第
一級アミンなどの正に帯電したタグを含む。一例として、1~3の異なる標識ヌクレオチ
ド10(レドックス活性電荷タグ18を含む)を使用することができ、標識ヌクレオチド
の残りは、レドックス活性電荷タグ18ではなく永久帯電したタグを含む。これは、還元
条件または酸化条件(両方ではない)が使用される場合に特に有用である。溶液中に比較
的高濃度の両方の電荷タイプの大きな部分が同時に存在しないため、これらの場合には凝
集が起こらないはずであることを理解されたい。
)を示す。電荷センサー35は、生物学的に関連性のある塩条件(biological
ly relevant salt conditions)、例えば約1mM~約10
0mMの範囲で操作され得る。そのような塩溶液のデバイスクリーニング長は、約0.3
nm~約10nmの範囲内であり得、感知ゾーン31をゲートGの表面の外側の数nmに
制限し、しばしば信号レベルを検出限界(limit of detectabilit
y)にまで低下させ得る。
れているが、特定の電荷センサー35では、1つのポリメラーゼ28が1つの電気伝導性
チャネル32につながれることを理解されたい。したがって、図3に示す例は、4つの異
なるヌクレオチド取り込みイベント中のポリメラーゼ28、およびそれぞれの取り込みイ
ベント中の異なるレドックス活性電荷タグ18に対する影響を示している。
6がつながった電気伝導性チャネル32に鋳型核酸36を導入するステップ(参照番号1
02);前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチドを導入するステップであって、前記
標識ヌクレオチドの少なくとも1つは、ヌクレオチドおよびそれに付着したヌクレオチド
特異的レドックス活性電荷タグを含み、それにより、前記標識ヌクレオチドの1つが前記
ポリメラーゼと会合する(associates with the polymera
se)ステップ(参照番号104);前記標識ヌクレオチドの前記1つが会合している間
に、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記
ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間のレドック
ス反応を開始するステップ(参照番号106);および前記レドックス反応に応じて、前
記電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ(参照番号108)を含む。方法100
の議論を通して、図5Aおよび5Bも参照される。
2につながれたポリメラーゼ26によって所定の位置に保持され得る。図5Aに示される
鋳型核酸36は、DNAの鋳型鎖であり得る。
相補的な塩基20を含み得る。標識ヌクレオチド10は、部分的に(in part)、
鋳型核酸36にも結合したポリメラーゼ26によって所定の位置に保持される。存在する
場合、標識ヌクレオチド10の連結分子14’の特異性領域24は、テザー28と相互作
用し得る。
8)標識ヌクレオチド10の一例を図5Bに示す。この例では、標識ヌクレオチド10の
連結分子14’は、テザー28の一部(たとえば、A、B、C)に対して親和性を有する
特異性領域24(例えば、A’、B’、C’)を含む。この特定の例では、特異性領域2
4(例えば、A’、B’、C’)は、テザー28の当該部分(例えば、A、B、C)のヌ
クレオチドまたはペプチド核酸に相補的なヌクレオチドまたはペプチド核酸を含む。別の
例では、特異性領域24およびテザー28の受容領域は、互いに親和性を有する非核酸部
分であってもよい。更に別の例では、特異性領域24は、疎水性ポリマー(テザー28の
一例)に対して親和性を有する非核酸部分であってもよい。これらの領域間の特異的結合
は、標準的なワトソン-クリックの塩基対合から生じ得る。この例では、特異性領域24
は、A’、B’、C’ヌクレオチド配列に隣接するイノシン(I)も含むことができる。
イノシンはユニバーサル塩基であるため、DNAの4つの天然ヌクレオチドのすべてと対
合することができる。かくして、追加の結合相互作用が、テザー28上の天然ヌクレオチ
ドとユニバーサル塩基(例えば、イノシンI)との相互作用から生じ得る。したがって、
取り込み中に標識ヌクレオチド10がポリメラーゼ26に結合すると、標識ヌクレオチド
10の特異性領域24とテザー28との間に相乗的な結合が起こり、標識ヌクレオチド1
0とテザー28の間の相互作用の安定性が大幅に向上する。
チド10はポリメラーゼ26との相互作用により所定の位置に保持されるであろうことを
理解されたい。連結分子14の長さは、レドックス活性電荷タグ18がゲートG/電気伝
導性チャネル32の感知ゾーン31内に保持されることを確実にするのを助けることがで
きる。
メラーゼ26およびテザー28との間の相互作用は、レドックス活性電荷タグ18が電気
伝導性チャネル32の感知ゾーン31内に入ることをもたらす。当該相互作用はまた、効
率的かつ完全な電荷移動に十分な時間の間、感知ゾーン31内にレドックス活性電荷タグ
18を維持することを助ける。当該時間は最長で数十ミリ秒であり得る。この比較的長い
相互作用は、拡散して電気伝導性チャネル32に短時間だけ接触し得る、溶液中に存在す
る他の標識ヌクレオチド10とは異なる。短時間の相互作用は、十分な電荷移動が起こる
ほど十分に長くないため、これらの例では、レドックス活性電荷タグ18は帯電されず、
電荷センサー32によって応答は検出されない。
グ18が、電気伝導性チャネル32から約1nm~約2nm以内の場(field)(例
えば、感知ゾーン31)に入る。標識ヌクレオチド10は所定の位置に保持されているた
め、レドックス活性電荷タグ18は、ゲートG/電気伝導性チャネル32によって帯電さ
れる位置にある。
ーブなど)とレドックス活性電荷タグ18との間のレドックス反応を開始するために、ゲ
ートG/電気伝導性チャネル32に印加される電圧は、レドックス活性電荷タグ18の酸
化電圧または還元電圧に調整され得る。酸化されると、レドックス活性電荷タグ18は電
子を失い、したがってゲートG/電気伝導性チャネル32はレドックス活性電荷タグ18
に正味の正電荷を生成する。還元されると、レドックス活性電荷タグ18は電子を獲得し
、したがってゲートG/電気伝導性チャネル32はレドックス活性電荷タグ18に正味の
負電荷を注入する。レドックス反応の結果として、レドックス活性電荷タグ18の電荷状
態は変更される。この変更されたより高い荷電状態(例えば、荷電される前のレドックス
活性電荷タグ18の状態(非酸化または非還元状態)と比較して)は、電気伝導性チャネ
ル32の周りの場(field)を乱し、検出可能な信号を生成する。
れるレドックス活性電荷タグ18に依存し得る。例えば、充電電圧(charging
voltage)は読み取り電圧(reading voltage)と異なっていても
よく、したがって、電気伝導性チャネル32は充電電圧と読み取り電圧との間を循環(c
ycle)する場合がある。一例では、レドックス反応を開始するステップは、電気伝導
性チャネル32に充電電圧を印加することを含み、電気伝導性チャネル32の応答を検出
するステップは、電気伝導性チャネル32に読み取り電圧を印加することを含む。
変更された電荷状態を示している。レドックス活性電荷タグ18はヌクレオチド特異的で
ある(即ち、特定のタグ18が特定の塩基20に対して選択される)ため、レドックス反
応後の電気伝導性チャネル32の応答は、標識ヌクレオチド10の塩基20も示し得る。
したがって、方法100は、電気伝導性チャネル32の応答を、標識ヌクレオチド10の
の前記会合している1つ(即ち、ポリメラーゼ26と会合している標識ヌクレオチド10
)のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ18に関連付けるステップ、およびヌク
レオチド特異的レドックス活性電荷タグ18に基づいて、前記会合しているヌクレオチド
10(即ち、ポリメラーゼ26と会合している標識ヌクレオチド10)のヌクレオチド(
例えば、塩基20)を識別するステップも含み得る。
される新生鎖38取り込まれる。このことは、標識ヌクレオチド10のリン酸基16と新
たに取り込まれたヌクレオチド塩基20との間の結合を自然に(naturally)切
断する。例えば、新生鎖38へのヌクレオチド塩基20の取り込み後、αリン酸と連結分
子16の間の結合、またはαリン酸とβリン酸の間の結合が自然に切断される。その結果
、標識ヌクレオチド10の残部(例えば、成分14または14’と18)は、ヌクレオチ
ド塩基20から自由に解離し、電気伝導性チャネル32から自由に離れて拡散し、それに
より、電気伝導性チャネル32の周りの場(field)を標識ヌクレオチド10のポリ
メラーゼ26との結合前の状態に戻す。電気伝導性チャネル32の周囲の場(field
)がそれぞれ摂動されるとき、および非摂動状態に戻るときの信号の出現および消失は、
鋳型核酸36の新生鎖38へのヌクレオチド塩基20の取り込みと相関させることができ
る。したがって、方法100の例は、標識ヌクレオチド10の前記会合している1つ(t
he associated one of the labeled nucleot
ides 10)から、ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ18および連結分子
14、14’を(例えば、リン酸基16で)切断するステップであって、それにより、前
記会合している標識ヌクレオチド10のヌクレオチド塩基20が、鋳型核酸36に相補的
な新生鎖38に取り込まれるも含む。切断するステップは、自然な切断が起こるのを待つ
ことを含み得る。連続した標識ヌクレオチド塩基20の取り込みの間に信号はベースライ
ン状態に戻るため、鋳型鎖36に沿った新生鎖38内のホモポリマーセグメント(hom
opolymeric segments)の検出が可能である。
くにレドックス活性電荷タグ18を持ってきてかつ保持するために、単独でまたはテザー
28と組み合わせて、標識ヌクレオチド10のポリメラーゼ26への相乗的な結合(sy
nergistic binding)を利用する。テザー28と特異性領域24の間で
形成された複合体の安定性は比較的低いため、(特異性領域24とテザー28との間の)
複合体は、ポリメラーゼ26にも結合しない標識ヌクレオチド10では形成されない(即
ち、溶液中でフリーの標識ヌクレオチド10は、テザー28に実質的に結合しない場合が
ある)。換言すれば、該複合体のオフ速度(off rate)は十分に高く、寿命が短
くなり得る。しかしながら、標識ヌクレオチド10とポリメラーゼ26の間に安定した会
合(association)が形成されると、連結分子14、14’の局所濃度がテザ
ー28の周りで増加し、したがってテザー28に対する特異性領域24のオン速度(on
rate)が高くなる。このようにして、標識ヌクレオチド10のポリメラーゼ会合状
態(polymerase-associated state)では、浮動性(fre
e-floating)標識ヌクレオチド10の非会合状態と比較して、全体的な会合時
間(association time)が大幅に増加する。ポリメラーゼ30に対する
標識ヌクレオチド10の親和性の相乗効果は、単独でまたはテザー28と組み合わせて、
全体的にかなりの(substantial)結合親和性を可能にする。ヌクレオチド塩
基20の取り込み後のポリメラーゼ26による自然切断後、該相乗効果が失われ、電荷タ
グ18も電気伝導性チャネル32から解離するであろう。
ステップ、前記レドックス反応を開始するステップ、前記検出するステップ、前記応答を
関連付けるステップ、および前記取り込まれたヌクレオチド塩基20を識別するステップ
は合わせて、シークエンシングサイクルである。方法100は、ポリメラーゼ26と会合
している別の標識ヌクレオチド10で、別のシークエンシングサイクルを行うステップを
更に含んでもよい。次のシークエンシングサイクルを行うステップは、標識ヌクレオチド
10の次の1つをポリメラーゼ26と会合させること;標識ヌクレオチド10の前記次の
1つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ18の電荷状
態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ18と電荷セ
ンサー32との間の他のレドックス反応を開始すること;前記他のレドックス反応に応じ
て、電荷センサー32の他の応答を検出すること;電荷センサー32の前記他の応答を、
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付ける(associati
ng)こと;および前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ18に基づいて
、標識ヌクレオチド10の前記次の1つ(即ち、ポリメラーゼ26に結合している)のヌ
クレオチド(塩基20)を識別すること、を含み得る。前記他のヌクレオチド特異的レド
ックス活性電荷タグは切断され得、標識ヌクレオチド10の前記次の1つのヌクレオチド
(塩基20)は、鋳型核酸36に相補的な新生鎖38に取り込まれる。シークエンシング
サイクルは繰り返され得る。
元電位を有するレドックス活性電荷タグ18の酸化還元電位についての1つ以上の閾値電
圧に達するかを決定するために、モニターされ得る。これらの例では、ゲートG/電気伝
導性チャネル32を流れる結果として生じる電流の変化は、特定の閾値電圧に関連するレ
ドックス活性電荷タグ18を含む標識ヌクレオチド10の塩基20を識別する情報として
使用され得る。
クス活性電荷タグ18から移動される電子の数もモニターされ得る。移動された電子の数
を使用して、ポリメラーゼ26と会合したヌクレオチド塩基20、およびポリメラーゼ2
6が新生鎖38に取り込むヌクレオチド塩基20を同定することができる。
ションのいずれかに使用することができる。図4、図5Aおよび図5Bを参照して説明し
たように、特に有用なアプリケーションは、単一分子の合成によるシークエンシング(S
BS)などの核酸シークエンシングである。単一分子のSBSでは、鋳型核酸36(例え
ば、標的核酸またはそのアンプリコン)に沿った核酸プライマーの伸長がモニターされ、
鋳型36内のヌクレオチド配列が決定される。基礎となる化学プロセスは、(例えば、本
明細書に記載のポリメラーゼ酵素26により触媒されるような)重合であり得る。特定の
ポリメラーゼベースの単一分子のSBSの例では、プライマーに付加されたヌクレオチド
の順番および種類の検出を使用して鋳型配列を決定できるように、ヌクレオチド(例えば
、塩基20)が鋳型に依存する方法でプライマーに付加される(それにより、プライマー
を伸長し、新生鎖38を形成する)。異なる鋳型36について発生するイベントが電気伝
導性チャネル32の各々に動作可能に接続された個々の検出器によって区別され得る条件
下で、アレイの異なる電気伝導性チャネル32における複数の異なる鋳型36を、単一分
子SBS技術にかけることができる。各電気伝導性チャネル32(ならびにそのソースお
よびドレイン端部S、D)は、フローセルの窪みまたはウェル内に配置することができ、
このことは、アレイ内において隣接するチャネル32から1つのチャネル32を物理的に
分離することを助ける。
なアプリケーションは、ライゲーションによるシークエンシング(sequencing
-by-ligation)およびハイブリダイゼーションによるシークエンシング(s
equencing-by-hybridization)を含む。本明細書に開示され
る標識ヌクレオチド10およびシステム30の別の有用なアプリケーションは、遺伝子発
現解析である。遺伝子発現は、RNAシークエンシング技術、例えばデジタルRNAシー
クエンシングと呼ばれるものを使用して検出または定量化することができる。RNAシー
クエンシング技術は、光学標識ヌクレオチドの蛍光検出が本明細書に記載の電荷ベースの
検出方法で置換され得ることを除いて、上記のような当技術分野で公知のシークエンシン
グ方法論を使用して実施することができる。遺伝子発現はまた、アレイへの直接ハイブリ
ダイゼーションによって実行されるハイブリダイゼーション技術を使用して、またはその
産物がアレイ上で検出される多重アッセイを使用して、検出または定量化することができ
る。これらの方法は、光学標識および蛍光検出を、電荷ベースの検出技術および本明細書
に記載のレドックス活性電荷タグ18で置換することにより、容易に適合させることがで
きる。
うな概念が相互に矛盾しない場合)は、本明細書で開示された本発明の主題の一部として
企図されることを理解されたい。特に、本開示の最後に現れる特許請求の範囲に記載され
た主題の全ての組み合わせは、本明細書で開示された本発明の主題の一部として企図され
る。また、参照により援用される任意の開示にも現れ得る、本明細書で明示的に使用され
る用語には、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであ
ることも理解されたい。
て説明される特定の要素(例えば、機能、構造、および/または特性)が本明細書に記載
される少なくとも1つの例に含まれ、他の例には存在しても存在しなくてもよいことを意
味する。加えて、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、任意の例について説明
された要素は、様々な例において任意の適切な方法で組み合わされ得ることを理解された
い。
、処理のばらつきなどによる小さな変動を記載および説明するために使用される。例えば
、それらは、±5%以下、例えば±2%以下、例えば±1%以下、例えば±0.5%以下
、例えば±0.2%以下、例えば±0.1%以下、例えば±0.05%以下を指すことが
できる。
に列挙されているかのように、述べられた範囲および述べられた範囲内の任意の値または
部分範囲が含まれることを理解されたい。例えば、約1電荷~約100電荷で表される範
囲は、明示的に記載された約1電荷~100電荷の制限だけでなく、約5電荷、50電荷
、75電荷などの個々の値、および約15電荷~約85電荷などの部分範囲も含むと解釈
されるべきである。
したがって、前述の説明は非限定的と見なされるべきである。
Claims (22)
- ヌクレオチド;
前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子;および
前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグ、
を含む標識ヌクレオチドであって、
前記レドックス活性電荷タグは、電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持される
とき、前記電気伝導性チャネルによって酸化または還元される、標識ヌクレオチド。 - 前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項
1に記載の標識ヌクレオチド。 - 前記連結分子は、前記レドックス活性電荷タグに付着した特異性領域を含む、請求項1
または2に記載の標識ヌクレオチド。 - 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合したテザー上のアクセプター領域と
相互作用し、かつ前記特異性領域はアフィニティータグを含む、請求項3に記載の標識ヌ
クレオチド。 - 前記特異性領域は、前記電気伝導性チャネルに結合した前記テザー上の前記アクセプタ
ー領域にハイブリダイズし、かつ前記アフィニティータグは約1ヌクレオチド~約10ヌ
クレオチドを含有するヌクレオチド配列、または約1ペプチド核酸~約10ペプチド核酸
を含有するペプチド核酸配列を含む、請求項4に記載の標識ヌクレオチド。 - 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含
み;かつ
前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、約1~約100の電荷を
含む、請求項1~5の何れかに記載の標識ヌクレオチド。 - 以下のステップを含む、方法:
ポリメラーゼがつながった電気伝導性チャネルに鋳型核酸を導入するステップ;
前記電気伝導性チャネルに標識ヌクレオチドを導入するステップであって、前記標識ヌ
クレオチドの少なくとも1つは、ヌクレオチドおよびそれに付着したヌクレオチド特異的
レドックス活性電荷タグを含み、それにより、前記標識ヌクレオチドの1つが前記ポリメ
ラーゼと会合するステップ;
前記標識ヌクレオチドの前記1つが会合している間に、前記ヌクレオチド特異的レドッ
クス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記ヌクレオチド特異的レドックス活性
電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間のレドックス反応を開始するステップ;および
前記レドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの応答を検出するステップ。 - 前記レドックス反応を開始するステップは、前記電気伝導性チャネルに充電電圧を印加
することを含み;かつ
前記応答を検出するステップは、前記電気伝導性チャネルに読み取り電圧を印加するこ
とを含む、請求項7に記載の方法。 - 以下のステップを更に含む、請求項7または8に記載の方法:
前記電気伝導性チャネルの前記応答を、前記標識ヌクレオチドの前記会合している1つ
の前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに関連付けるステップ;および
前記ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記会合している標識ヌ
クレオチドの前記ヌクレオチドを識別するステップ。 - 前記標識ヌクレオチドの前記会合している1つから、前記ヌクレオチド特異的レドック
ス活性電荷タグを切断するステップであって、それにより、前記会合している標識ヌクレ
オチドの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に相補的な新生鎖に取り込まれるステップを
更に含む、請求項9に記載の方法。 - 請求項10に記載の方法であって、
前記標識ヌクレオチドの前記1つが会合するステップ、前記レドックス反応を開始する
ステップ、前記検出するステップ、前記関連付けるステップ、および前記識別するステッ
プは合わせて、シークエンシングサイクルであり、
前記方法は、以下によって、次のシークエンシングサイクルを行うステップを更に含む
:
前記標識ヌクレオチドの次の1つを前記ポリメラーゼと会合させること;
前記標識ヌクレオチドの前記次の1つが会合している間に、他のヌクレオチド特異的
レドックス活性電荷タグの電荷状態を変更するために、前記他のヌクレオチド特異的レド
ックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間の他のレドックス反応を開始するこ
と;
前記他のレドックス反応に応じて、前記電気伝導性チャネルの他の応答を検出するこ
と;
前記電気伝導性チャネルの前記他の応答を、前記他のヌクレオチド特異的レドックス
活性電荷タグに関連付けること;および
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグに基づいて、前記標識ヌクレオ
チドの前記次の1つの前記ヌクレオチドを識別すること。 - 以下のステップを更に含む、請求項11に記載の方法:
前記他のヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグを切断するステップであって、そ
れにより、前記標識ヌクレオチドの前記次の1つの前記ヌクレオチドが、前記鋳型核酸に
相補的な前記新生鎖に取り込まれるステップ;および
前記シークエンシングサイクルを繰り返すステップ。 - 前記レドックス活性電荷タグは、レドックス反応を受ける配位金属原子を含む、請求項
7~12の何れかに記載の方法。 - 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含
み;かつ
前記レドックス活性電荷タグは、変更された電荷状態で、約1~約100の電荷を含む
、請求項7~13の何れかに記載の方法。 - 前記標識ヌクレオチドは以下を含む、請求項7~14の何れかに記載の方法:
前記ヌクレオチドとしてのデオキシアデノシンポリホスフェートおよび第1ヌクレオチ
ド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第1標識ヌクレオチド;
前記ヌクレオチドとしてのデオキシグアノシンポリホスフェートおよび第2ヌクレオチ
ド特異的レドックス活性電荷タグを含む、第2標識ヌクレオチド;
前記ヌクレオチドとしてのデオキシシチジンポリホスフェートおよび第3ヌクレオチド
特異的レドックス活性電荷タグを含む、第3標識ヌクレオチド;ならびに
前記ヌクレオチドとしてのデオキシチミジンポリホスフェートおよび第4ヌクレオチド
特異的レドックス活性電荷タグを含む、第4標識ヌクレオチド;
ここで、前記第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第2ヌクレオチド
特異的レドックス活性電荷タグ、前記第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、
および前記第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグは互いに異なる。 - 前記第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第2ヌクレオチド特異的レ
ドックス活性電荷タグ、前記第3ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、および前
記第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち2つは、変更された電荷状態で
、正に帯電していて;かつ前記第1ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第
2ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグ、前記第3ヌクレオチド特異的レドックス
活性電荷タグ、および前記第4ヌクレオチド特異的レドックス活性電荷タグのうち他の2
つは、前記変更された電荷状態で、負に帯電している、請求項15に記載の方法。 - 前記標識ヌクレオチドは、低塩緩衝液中に存在する、請求項7~16の何れかに記載の
方法。 - 前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項7~17
の何れかに記載の方法。 - 以下を備える、キット:
電気伝導性チャネルであって、それに付着したテザーを有する電気伝導性チャネルと、
前記テザーを介して、前記電気伝導性チャネルに付着したポリメラーゼと、
を含むフローセル;
前記フローセルに導入される鋳型核酸;
前記フローセルに導入される試薬であって、前記試薬は標識ヌクレオチドを含み、前記
標識ヌクレオチドの少なくとも1つは、
ヌクレオチドと、
前記ヌクレオチドのリン酸基に付着した連結分子と、
電気伝導性チャネルの感知ゾーンの近くに維持されるとき、前記電気伝導性チャネル
によって酸化または還元される、前記連結分子に付着したレドックス活性電荷タグと、
を含む、試薬;および
レドックス反応が前記レドックス活性電荷タグと前記電気伝導性チャネルとの間で起こ
るとき、前記電気伝導性チャネルからの応答を検出する検出器。 - 前記レドックス活性電荷タグは、フェロセン、亜鉛テトラベンゾポルフィリン、コバル
トフタロシアニン、トリス-(2,2’-ビピリミジン)ルテニウム、4-フェロセニル
ベンジルアルコール、5-(4-ヒドロキシメチルフェニル)-10,15,20-トリ
メシチルポルフィナト亜鉛(II)、およびレドックス活性カリックスアレーンからなる
群から選択される、請求項19に記載のキット。 - 前記レドックス活性電荷タグは、非酸化状態または非還元状態で、10以下の電荷を含
み;かつ
前記レドックス活性電荷タグは、酸化状態または還元状態で、約1~約100の電荷を
含む、請求項19または20に記載のキット。 - 前記電気伝導性チャネルは、電界効果トランジスタのチャネルである、請求項19~2
1の何れかに記載のキット。
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