JP2022043056A - Ｐｓｃａを標的とするキメラ抗原受容体 - Google Patents

Abstract

【課題】 ＰＳＣＡを標的とする、キメラ膜貫通免疫受容体に関する。【解決手段】 細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ膜貫通免疫受容体に関する。【選択図】図１

Description

前立腺がん（ＰＣａ）は、米国で３番目に多いがんの種類であり、今年診断されると予測される新規症例は２００，０００件を超える。ＰＣａ患者の約８０％において、腫瘍表現型は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）の過剰発現を含む。さらに、ＰＳＣＡは骨転移性前立腺がんのほぼ１００％で発現されるため、理論的に魅力的な免疫療法の標的である。Ｂ細胞悪性腫瘍（Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）に対するＣＤ１９を標的とするＣＡＲｓを用いた最近の臨床試験では、著しい結果を示すが、他の抗原標的でこのレベルの成果を得られるかどうかは不明である。固形腫瘍に対する免疫療法では、当該拘束性抗原発現（すなわち、Ｂ細胞悪性腫瘍についてのＣＤ１９）が欠如しており、かつ、ＣＡＲ効果を有意に妨げ得る免疫抑制微小環境が存在するため、腫瘍攻撃がより困難となる。重要なことに、正常組織上での抗原発現が低レベルであることによる、標的上（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）、腫瘍外（ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ）で毒性があったという実例が存在する。

所望の標的に結合することができるＣＡＲの作製に必要な基本的な構成要素は、合理的によく理解されているが、安全で効果的な治療で用いうるのに必要な品質を備えるＣＡＲを設計することは困難である。例えば、標的の発現が低レベルであるか又は標的を全く発現しない非がん性細胞に対する過剰な活性を回避することは、重要である。望ましくない腫瘍外の影響を誘発し得るサイトカインの産生を高レベルに誘発することを避けることも、重要である。治療可能性に影響を及ぼし得る他の因子としては、ＣＡＲを発現するＴ細胞の複製機能及び生存期間、並びに強力な抗腫瘍応答に必要なＣＡＲを発現するＴ細胞の全体的なエフェクター機能を含むが、これらに限定されない。

本明細書は、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ膜貫通免疫受容体（キメラ抗原受容体又は「ＣＡＲｓ」という）。細胞外ドメインは、ＰＳＣＡを標的とするｓｃＦｖを開示する。本明細書で開示されるＣＡＲは、前立腺がん及び前立腺がん骨転位の治療に有用である。

ＰＳＣＡを標的とするｓｃＦｖに加えて、細胞外ドメインは、例えば、ヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインの一部分を含む、スペーサーを含む。ＣＡＲの膜貫通部分は、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３膜貫通ドメイン又は４－１ＢＢ膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖（ＣＤ３ζ）からのシグナル伝達ドメイン及び共刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメイン（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＣＤ２８ｇｇ又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン）を含む。細胞外ドメインは、Ｔ細胞の表面上に発現された場合、ＣＡＲにより、ＰＳＣＡを発現している当該細胞にＴ細胞活性を、指向させることができる。当該細胞には、前立腺がん細胞が含まれる。細胞内領域内にＣＤ３ζと直列に（ただし必ずしも隣接してなくてよい）共刺激ドメインを含むことにより、Ｔ細胞は共刺激シグナルを受けることができる。Ｔ細胞、例えば患者特異的な、自己Ｔ細胞は、本明細書で開示されるＣＡＲｓを発現するように組換えられてよく、組換えられた細胞は、ＡＣＴで増殖されて、用いられることができる。様々なＴ細胞サブセットを用いることができる。さらに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞等の他の免疫細胞においても発現することができる。患者が本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞を用いて治療される場合、当該細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）又は同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）のＴ細胞であってよい。ある場合では、用いられる細胞は、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋、又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）である、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）であり、当該細胞を用いると、他の種類の患者特異的Ｔ細胞を用いる場合と比較して、養子移植後の細胞の長期持続性を改善することができる。重要なことに、ＣＡＲの全体的な設計は、比較的低レベルのＰＳＣＡしか発現しない非がん性細胞を含む、非がん性細胞に対する不要な活性を避ける。

ＰＳＣＡ ｓｃＦｖは、以下の：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＲＦＩＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＧＳＳＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＹＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＤＰＥＮＧＤＴＥＦＶＰＫＦＱＧＲＡＴＭＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＫＴＧＧＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３８）
で表される配列、又は最大で５個のアミノ酸が置換されたその変異体を含むことができる。

本明細書では、ＣＡＲをコードする核酸分子であって：ＰＳＣＡに指向されたｓｃＦｖ（例えば、配列番号１）又は１～５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～１０個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１～１０個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、から選択される、膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）；並びに、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又は１～５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、を含む、核酸分子が開示される。スペーサー領域（ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）は、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間に位置する。スペーサー領域は、以下に詳細に記載されるが、ヒトＦｃ領域（ｈｕｍａｎ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ）の全て又はその部分を含んでよい。

ある実施形態では、核酸分子は、配列番号２６～３７から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する；キメラ抗原受容体は、１～５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾された（例えば、置換）、配列番号２６～３７から選択されるアミノ酸配列を含む。

また、キメラ抗原受容体をコードする発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を含むベクターによって形質導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）ヒトＴ細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）も開示され、キメラ抗原受容体は、ＰＳＣＡに指向されたｓｃＦＶを含み、それは４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含む。様々な実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、配列番号２６～３７から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むキメラ抗原受容体発現するベクターを含む；ヒトＴ細胞の集団は、中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）を含む（例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴ_ＣＭ細胞であり；Ｔ_ＣＭ細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、Ｔ_ＣＭ細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）。

また、患者のがんを治療する方法であって、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入された自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団（例えば、Ｔ細胞を含む自己又は同種異系のＴ細胞であり、例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴ_ＣＭ細胞であり；Ｔ_ＣＭ細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、Ｔ_ＣＭ細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）を、投与する工程を含む方法が開示され、ここで、キメラ抗原受容体は、配列番号２６～３７から選択されるアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では：ヒトＴ細胞の集団は、中央記憶Ｔ細胞を含み；がんは、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）であり；形質導入されたヒトＴ細胞は、患者からＴ細胞を採取する工程、Ｔ細胞を処理して中央記憶Ｔ細胞を単離する工程、及びキメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて、中央記憶Ｔ細胞の少なくとも一部分を形質導入する工程を含む方法によって調製され、ここで、キメラ抗原受容体は、配列番号２６～３７から選択されるアミノ酸配列を含む。

また：配列番号２６～３７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、核酸分子；５個以下のアミノ酸が置換、削除又は挿入されたものを除いて配列番号２６～３７から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、核酸分子；５個以下のアミノ酸が置換されたものを除いて配列番号２６～３７から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、核酸分子；並びに、２個以下のアミノ酸が置換されたものを除いて配列番号２６～３７から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、核酸分子、も開示される。

ＰＳＣＡを標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞は、ホルモン不応性前立腺がん、骨、肝臓及び肺転移を含む前立腺がんの転移、並びに、膵臓、膀胱、結腸及び神経膠芽腫（原発性脳）を含むがこれらに限定されない、ＰＳＣＡを発現する他のがんを含む、前立腺がんの治療で有用であることができる。したがって、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を用いてがんを治療する方法を含む。

本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲｓのいずれかをコードする核酸分子（例えば、ＣＡＲｓのうちの一つをコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書に記載のＣＡＲｓのいずれかを発現する単離されたＴリンパ球を含む。

本明細書に記載のＣＡＲは、ＰＳＣＡ標的ドメイン（すなわち、ＰＳＣＡを認識するｓｃＦｖ又はその変異体）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含んでよい。様々な異なるスペーサーが用いられてよい。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部分、例えばヒトＦｃ領域のヒンジ部分若しくはＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載のＣＡＲｓにおいて用いることができる様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例

いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に入る配列、例えばＩｇＧ４ヒンジ又はＣＤ８ヒンジの全て又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメインとＣＨ２ドメインをともに含む。免疫グロブリンに由来する配列は、１又はそれ以上のアミノ酸が修飾された、例えば１、２、３、４又は５個の置換、例えば標的外結合（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）を低減するように置換されてよい。

「アミノ酸が修飾された」は、タンパク質若しくはペプチド配列におけるアミノ酸が置換、挿入及び／又は削除されることをいう。“アミノ酸置換”若しくは“置換”は、元の（ｐａｒｅｎｔ）ペプチド若しくはタンパク質配列における特定の位置のアミノ酸の、他のアミノ酸による交換をいう。置換は、非保存的（ｎｏｎ－ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特徴で分類された、あるアミノ酸から、他の分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることにより）、あるいは、保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特徴で分類された、あるアミノ酸から、同じ分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることにより）、結果として生じるタンパク質中のアミノ酸を変化させるように行われてよい。当該保存的な変化により、概して、結果として生じるタンパク質の構造及び機能の変化がより小さくなる。以下はアミノ酸の種々の分類の例である：１）無極性Ｒ基があるアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電極性Ｒ基があるアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基があるアミノ酸（ｐＨ６．０で負に帯電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別の分類は、フェニル基があるアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンであってよい。

特定の実施形態では、スペーサーは、修飾されていないスペーサーに存在するアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基によって置換された１又はそれ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。１又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置第２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９番目又はそれらの組み合わせの、１又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下でさらに詳細に記載されるこの番号付け体系では、表１のＩｇＧヒンジ配列及びＩｇＧ４ヒンジリンカー（ＨＬ）配列の最初のアミノ酸が第２１９番目であるように、表１のＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）スペーサーの最初のアミノ酸は第２１９番目であり、表１のＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）スペーサーの最初のアミノ酸は第２１９番目である。

ある実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下の：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ又はそれらの組み合わせ、であるアミノ酸残基置換の１又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来する。

特定の実施形態では、修飾されたスペーサーは、修飾されていないスペーサーに存在するアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基によって置換された１又はそれ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４領域に由来する。１又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置第２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９番目又はそれらの組み合わせの、１又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。

ある実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下の：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ又はそれらの組み合わせ、であるアミノ酸残基置換の１又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ４領域に由来する。ここで、修飾されていないスペーサーのアミノ酸は、提示された位置で上記の同定されたアミノ酸によって置換される。

本明細書に記載される免疫グロブリン中のアミノ酸位置について、番号付けは、ＥＵインデックス又はＥＵ番号付け体系（参照により全体が本明細書に参照されるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ｈｅｒｅｂｙ ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）に従う。ＥＵインデックス若しくはＫａｂａｔのＥＵインデックス又はＥＵ番号付け体系は、ＥＵ抗体の番号付け（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９６９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５）を参照する。

様々な膜貫通ドメインが用いられてよい。表２は、適当な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサードメインに対してカルボシキ末端に位置する。
表２：膜貫通ドメインの例

本明細書に記載のＣＡＲの多くは、１又はそれ以上の（例えば、二つの）共刺激ドメインを含む。（複数の）共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び適当な共刺激ドメインの例を含む。
表３：ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインの例

本明細書に記載の研究に用いられるＰＳＣＡ‐ＣＡＲは、表４に概説され（未成熟、ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を含む）、その中で、各ＣＡＲのスペーサードメイン及び（複数の）共刺激ドメインが示される。これらの全ては、Ａ１１ ＰＳＣＡ ｓｃＦｖを含む。ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）スペーサーはまた、ＩｇＧ４ΔＣＨ２スペーサーともいう。配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１についての成熟配列（ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を欠失する）は、配列番号３２、３３、４３、３５、３６及び３７である。
表４：ＰＳＣＡを標的とするＣＡＲの例

（上記された）様々なスペーサー領域を備え：ＣＤ２８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメイン；又は、ＣＤ４膜貫通ドメイン及び４‐１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかを備える、ＣＡＲ構築物の模式図である。当該構築物は、ＭＢ１ ｓｃＦｖ又はＡ１１ ｓｃＦｖを用いた。全ての構築物はＣＤ３ζ細胞溶解性（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ）ドメインを用いた。Ｔ２Ａスキップ配列は、構築物の発現を評価するために用いられる切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質からＣＡＲを分離する。

図１の様々な構築物についてのｔＣＤ１９及びｓｃＦｖ（プロテインＬ）発現データの測定の結果を示す図である。

ヒト前立腺がん細胞株に対する二つの異なるＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞の生体外での特徴付けを示す。（Ａ）ＰＳＣＡを発現するように操作された腫瘍細胞（ＬＣＬ、ＰＣ‐３、及びＤＵ１４５）におけるＰＳＣＡの発現。（Ｂ‐Ｃ）フローサイトメトリで測定された、腫瘍標的との５時間の共培養後のＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）及びＩＦＮγ産生。（Ｄ－Ｅ）ＥＬＩＳＡによって測定された、組換えＰＳＣＡタンパク質又は腫瘍標的を用いた２４時間の培養後のＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を各々示すグラフである。

４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは、特異性に優れ、増殖及び腫瘍細胞死滅機能が示される。フローサイトメトリで測定された、腫瘍標的（ＤＵ１４５、ＰＣ‐３、ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ）との７２時間の共培養後のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ｚ又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞における腫瘍死滅（Ａ）及びＰＤ‐１誘導（Ｂ）、（Ｃ）エフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比が０．２５：１から４：１での、腫瘍死滅；（Ｄ）腫瘍標的との７２時間の共培養後のＣＡＲ Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖；（Ｅ）腫瘍標的（ＤＵ１４５、左；ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ、右）との１、２又は３日間の共培養後のＣＡＲ Ｔ細胞における腫瘍死滅及びＰＤ‐１誘導の動態を示すグラフである。

細胞外スペーサーは、生体外のＰＳＣＡ‐ＣＡＲ機能性を規定する。（Ａ）フローサイトメトリで測定された、腫瘍標的（ＤＵ１４５及びＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ）との５時間の共培養後の、ＰＳＣＡ（ＥＱ）ＢＢｚ、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢｚ及びＰＳＣＡ（Ｌ）ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγ産生；（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定された、組換えＰＳＣＡタンパク質又は腫瘍標的を用いた２４時間の培養後のＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩＦＮγを示すグラフである。

ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞は、前立腺がん異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）及び同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）モデルにおいて抗腫瘍効果を示す。（Ａ）ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２×１０^６）細胞は、ＮＳＧ雄マウスに皮下注射され、腫瘍が約３０（～３０）‐５０ｍｍ^３に達した場合、ＣＡＲ Ｔｃｍ（５×１０^６）は腫瘍内に注射され、腫瘍成長をキャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）測定でモニタし；（Ｂ）ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ（２×１０^６）細胞を、ＮＳＧ雄に皮下注射し、ＣＡＲ ＰＢＭＣ細胞（５×１０^６）細胞を静脈内送達し；（Ｃ）ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２×１０^５）細胞を、ＮＳＧ雄に脛骨内に（ｉｎｔｒａｔｉｂｉａｌｌｙ）注射して、ＣＡＲ ＰＢＭＣ細胞（２×１０^６又は５×１０^６）を、静脈内送達し；（Ｄ）各群における腫瘍注射後５８日目の、血液中のＣＡＲ Ｔ細胞持続性を示すグラフである。

ＣＤ２８又は４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞。（Ａ）ＰＳＣＡを標的とするヒト化ｓｃＦｖ（Ａ１１クローン）を含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓがあるレンチウイルス発現カセットの図であり、第１２９番目のアミノ酸が修飾されたヒトＩｇＧ４ Ｆｃリンカー（ＣＨ２ドメインの欠失、ΔＣＨ２）、膜貫通ドメイン（ＣＤ２８又はＣＤ４のいずれか）、細胞質ＣＤ２８又は４‐１ＢＢ共刺激ドメイン、及び細胞溶解性ＣＤ３ｚドメインがある。切断型非シグナル伝達ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）は、ＣＡＲ発現細胞をモニタするためのＴ２Ａリボソームスキップ配列によってＣＡＲから分離される。（Ｂ）モック（非導入）、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ、又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲｓのレンチウイルス導入を検出するために、ＣＤ１９ｔ発現について（上端）、又は、ｓｃＦｖを検出するために、タンパク質Ｌについて（下端）、フローサイトメトリで評価した。（Ｃ）２５日間の培養期間における、モック及びＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞のエクスビボ増殖動態（Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）。（Ｄ）フローサイトメトリで決定された、エクスビボ増殖終期の、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞の表示された細胞表面マーカーの細胞表面発現。全てのデータは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。

生体外のＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓにおいて、４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは、ＣＤ２８共刺激と比較して、優れた腫瘍標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を示す。（Ａ）フローサイトメトリで決定された、ヒト前立腺がん細胞株におけるＰＳＣＡ発現のヒストグラム。ＤＵ１４５及びＰＣ‐３細胞株は、ＥＦ１αプロモーターの制御下で、ヒトＰＳＣＡを過剰発現するようにレンチウイルスで導入された（材料及び方法を参照）。ＰＣ‐３‐ＰＧＫ１００ｐ細胞株は、表示されたＰＧＫプロモーター変異体の制御下でヒトＰＳＣＡを発現させて生成された。ＬＡＰＣ‐９細胞は内因的にヒトＰＳＣＡを発現する。（Ｂ）ＰＣ‐３又はＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞との３日間の共培養に続いて光学顕微鏡で評価した、１：１のエフェクター：標的比でのモック、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ、又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を比較する腫瘍死滅アッセイのスナップショット画像。（Ｃ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養後にフローサイトメトリで評価した、（Ｂ）と同様の腫瘍死滅アッセイ。（Ｄ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養後の、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＰＤ‐１発現の代表的なゼブラプロット。（Ｅ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養後の、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＰＤ‐１発現の定量化。（Ｆ）ＤＵ１４５との共培養の１、２又は３日目におけるＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞を比較する腫瘍死滅アッセイ。腫瘍標的なく培養されたＴ細胞と比較した、Ｔ細胞におけるＰＤ‐１発現。（Ｇ）ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ又はＰＣ‐３‐ＰＧＫ１００ｐとの３日間の共培養後にフローサイトメトリで評価した、異なるエフェクター：標的比を用いた腫瘍死滅アッセイ。データは、群当たりｎ＝２±ＳＤとして示す。全てのデータは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。

ＰＳＣＡ‐ＢＢζ ＣＡＲｓは、生体外で抗原依存性サイトカイン産生を示す。（Ａ）ＤＵ１４５又はＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞と一晩共培養されたＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞からの上清中の、ＥＬＩＳＡで定量化されたＩＦＮγ産生。（Ｂ）ＰＣ‐３、ＰＣ‐３‐ＰＧＫ１００ｐ又はＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞と一晩共培養されたＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞からの、（Ａ）と同じもの。（Ｃ）様々なタンパク質濃度のプレート結合組換えヒトＰＳＣＡ上で一晩培養されたＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞からの上清中の、ＥＬＩＳＡで定量化されたＩＦＮγ産生。（Ｄ）表示された腫瘍標的との４～６時間の共培養後の、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ脱顆粒を示す代表的なゼブラプロット。（Ｅ）（Ｄ）からのＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ脱顆粒の定量化。（Ｆ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養後の、モック、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ、又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞における、ＣＤ１３７発現の代表的なゼブラプロット。 データは、群当たりｎ＝２±ＳＤとして示される。全てのデータは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。

前立腺がんの皮下及び同所骨転移性ヒト異種移植モデルにおけるＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の頑健な治療効果。（Ａ）第３４日目に腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射によって、表示された投与量（ｄｏｓｅｓ）のモック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて治療された、第０日目の皮下ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２．５×１０^６）腫瘍があるＮＳＧマウスにおける腫瘍体積（ｍｍ^３）。群あたりＮ＝４匹のマウス。データは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。（Ｂ）大きな腫瘍（約５００ｍｍ^３）があるマウスは、第５１日目に静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって５×１０^６のモック又はＣＡＲ Ｔ細胞を用いて治療された。群あたりＮ＝３匹のマウス。データは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。（Ｃ）ヒトＣＤ３（上方のパネル）及びグランザイムＢ（下方のパネル）によって染色された、静脈内Ｔ細胞治療の１１日後に採取されたＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍の免疫組織化学。（Ｄ）右後肢にＰＣ‐３（野生型）細胞（０．２×１０^６）、左後肢にＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ細胞（０．２×１０^６）による、脛骨内（ｉｎｔｒａｔｉｂｉａｌ）腫瘍があるマウス。第１４日目に、マウスは、静脈内注射によって、５×１０^６のホタルルシフェラーゼ陽性（約３０％）モック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて治療された。Ｔ細胞輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）は、４時間、１日、２日及び４日目に、非侵襲的光学的画像化（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって監視された。フラックス画像の定量化は、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ／ＰＣ‐３（野生型）の比を示す。群あたりＮ＝４‐６匹のマウス。（ｅ）脛骨内（左後肢）ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ（０．２×１０^６）があるＮＳＧマウス。腫瘍成長動態は、非侵襲的光学的画像化（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって監視された。第１４日目に、マウスは、５×１０^６のモック又は様々な投与量のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて、静脈内注射された。第１３日目（治療前）及び第３３日目のマウスの代表的なフラックス画像が示される。（Ｆ）腫瘍のみ、モックＴ細胞（５×１０^６）及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞（５×１０^６、２．５×１０^６、１×１０^６、０．５×１０^６）群からの、（腫瘍注射部位における関心領域（ＲＯＩ）を用いた）フラックス画像の定量化。ＣＡＲ群について、群あたりＮ＝４匹のマウス。データは、少なくとも二つの独立した実験の代表である。

前立腺がん患者由来骨転位異種移植モデルにおける、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の耐久性のある抗腫瘍効果。（Ａ）脛骨内（左後肢）ＬＡＰＣ‐９‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ（０．１５×１０^６）があるＮＳＧマウス。腫瘍成長動態は、非侵襲的光学的画像化（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって監視された。第１４日目に、マウスは、５×１０^６個のモック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて、静脈内注射された。表示された日におけるマウスの代表的なフラックス画像が示される。（Ｂ）各治療群からの、脛骨におけるＲＯＩを用いた（上方のパネル）、又は全身からの（下方のパネル）、フラックス画像の定量化。（Ｃ）腫瘍注射後７６日目に治療マウス（群あたりｎ＝２‐３）から採取された血清からの、ＥＬＩＳＡによって決定されたＰＳＡレベル。（Ｄ）腫瘍注射後の２４日目及び７６日目のマウスの末梢血のフローサイトメトリ分析（群あたりｎ＝２‐３）。データは、二つの独立した生体内実験から収集した。

ＰＢＭＣ及びＴＣＭ集団の細胞表面表現型。（ａ）ＰＢＭＣ及びＴＣＭの開始集団は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ１４、ＣＤ２５及びＣＤ９５の発現についてフローサイトメトリで分析された。代表的なＦＡＣＳプロットが示される。

腫瘍細胞株におけるＰＳＣＡのｍＲＮＡ発現分析。（ａ）ＰＳＣＡ発現を定量化するために、様々な前立腺及び非前立腺がん細胞株で実施されたｑＰＣＲ。ＰＳＣＡ ｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化された。

ＭＢ１ ｓｃＦｖ‐含有とＡ１１ ｓｃＦｖ‐含有のＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓの比較。（Ａ）ＰＳＣＡを標的とするヒト化ＭＢ１又はＡ１１ ｓｃＦｖを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓがあるレンチウイルス発現カセットの図であり、第１２９番目のアミノ酸が修飾されたヒトＩｇＧ４ Ｆｃリンカー（ＣＨ２ドメインの欠失、ΔＣＨ２）、ＣＤ４膜貫通ドメイン、細胞質４‐１ＢＢ共刺激ドメイン、及び細胞溶解性ＣＤ３ζドメインがある。切断型非シグナル伝達ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）は、ＣＡＲ発現細胞をモニタするためのＴ２Ａリボソームスキップ配列によってＣＡＲから分離される。（Ｂ）フローサイトメトリで決定された、ＣＡＲｓのレンチウイルス導入を検出するためのＣＤ１９（上端）又はｓｃＦｖを検出するためのタンパク質Ｌ（下端）を発現する、モック（導入されていない）、ＰＳＣＡ‐ＭＢ１‐（ΔＣＨ２）ＢＢζ、又はＰＳＣＡ‐Ａ１１‐（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞。（Ｃ）表示された腫瘍標的との３日間の共培養に続いてフローサイトメトリで評価した腫瘍死滅アッセイ。

ＰＢＭＣ又はＴＣＭのいずれかに導入されたＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカイン産生。様々なタンパク質濃度のプレート結合組換えヒトＰＳＣＡ上で培養されたＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞からの上清中の、ＥＬＩＳＡで定量化されたＩＦＮγ産生。

プレート結合ＯＫＴ３に対するモック、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ、及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化及び消耗性表現型。プレート結合ＯＫＴ３（１０μｇ／ｍＬ）との２日間のインキュベーションに続く、Ｔ細胞における、フローサイトメトリによるＣＤ１３７及びＰＤ１の発現。

ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞によるＰＳＣＡ陰性腫瘍再発の治療。（Ａ）ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ治療された、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍があるマウスにおける腫瘍再発の動態。各線は、各群の個別のマウスを表す。一群あたりＮ＝４。データは、少なくとも二つの独立した研究の代表である。（Ｂ）ヒトＰＳＣＡ、ＣＤ３及びＨＥＲ２によって染色された、モック治療（主要終点）又は再発性ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ治療腫瘍から採取されたＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍の免疫組織化学。（Ｃ）フローサイトメトリで評価した、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞におけるＨＥＲ２発現。（Ｄ）第２４日目（「第１回目ｔ×」）に５×１０^６のモック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて静脈内に治療された、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍があるマウス（群あたりＮ＝６）における腫瘍体積（ｍｍ^３）。ＣＡＲ Ｔ細胞治療マウスが腫瘍再発（５０‐１００ｍｍ^３）を示した第８１日目に、マウスは、５×１０^６のモック、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ、又はＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかの腫瘍内注射を受ける第２の治療（“第２回ｔ×”）に割り当てられた（群あたりＮ＝２）。

図１８：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ４ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列番号２６）。

図１９：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列番号２７）。

図２０：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐Ｌ‐ＣＤ４ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列番号２８）。

図２１：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列番号２９）

図２２：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ４ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列番号３０）

図２３：ＰＳＣＡｓｃＦｖ‐Ｌ‐ＣＤ２８ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列（配列番号３１）

以下に、ＰＳＣＡを標的とする様々なキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の構造、構築及び特徴付けを開示する。キメラ抗原（ＣＡＲ）は、最低限、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換え生体分子である。したがって、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができるいかなる分子である。例えば、ＣＡＲは、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドを含んでよい。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメイン又は単にそれが含む認識要素により示される）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜中にＣＡＲをつなぐ。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、場合によっては、１又はそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲｓは、ＭＨＣ拘束から独立して、抗原に結合し、かつ、Ｔ細胞活性化を導入する。したがって、ＣＡＲｓは、そのＨＬＡ遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍がある患者の集団を治療することができる「普遍的な」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を用いる養子免疫療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は、がんの治療の強力な治療戦略でありうる。

発明者らは、適当な活性及び特異性があり、かつ、サイトカイン産生を過剰誘発しないＣＡＲを同定するため、多種多様なＰＳＣＡ ＣＡＲを生成し、いくつかのアッセイで試験した。

ある場合では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列、及び細胞質シグナルシグナル伝達テールが欠失（アミノ酸３２３で切断された）する切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）が続くベクターを用いて産生されることができる。この配置では、ＣＤ１９ｔの同時発現により、不活性で非免疫原性の表面マーカーが提供され、それにより、遺伝子修飾細胞を正確に測定することができ、遺伝子修飾細胞の正の選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、並びに、養子移植後の生体内での効率的な細胞モニタ及び／又は治療用Ｔ細胞を画像化ができる。ＣＤ１９ｔの同時発現により、治療用細胞を選択的に除去し、それにより自殺スイッチとして機能する、臨床的に利用可能な抗体及び／又は免疫毒素試薬を用いる、形質導入された細胞の生体内での免疫学的標的化用マーカーを提供する。

本明細書に記載のＣＡＲは当業界で公知のいかなる手段で産生されうるが、好ましくは、組換えＤＮＡ技術を用いて産生される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、便利には、当業界で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助ライゲーション、部位特異的突然変異誘発等）により、調製され、完全なコード配列に組み立てられてよい。結果として生じるコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、適当な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株の変換に用いられる。

選択されていないＰＢＭＣ又は富化ＣＤ３ Ｔ細胞又は富化ＣＤ３又はメモリーＴ細胞サブセットを含む、患者から単離された様々なＴ細胞サブセットは、ベクターを用いて形質導入されてＣＡＲ発現する。中央記憶Ｔ細胞は、一つの有用なＴ細胞サブセットである。中央記憶Ｔ細胞は、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的選択用に、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択して、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離されてよい。中央記憶Ｔ細胞に関する富化細胞は、例えば、ＣＡＲ、並びに、生体内検出及び潜在的な生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）選択用の非免疫原性の表面マーカーである切断型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）の発現を指示するＳＩＮレンチウイルスベクターを用いて形質導入された、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化されてよい。活性化／遺伝的に修飾された中央記憶Ｔ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５を用いて生体外で増殖した後、凍結保存されてよい。

ＰＳＣＡを標的とするＣＡＲの構築
図１は、様々なＣＡＲ発現するために用いられる、発現ベクターの翻訳領域内の要素（上方のパネル）及び結果として生じるＣＡＲ（下方のパネル）を模式に描写する。ＣＡＲは、ＰＳＣＡを標的とするＭＢ１ ｓｃＦｖを用いた。Ａ１１ ｓｃＦｖは用いなかったが、適当な代替物である。３つの異なるスペーサー：ＩｇＧ４（ＥＱ）は、ＣＨ３、ＣＨ４及びヒンジ領域を含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含み、ネイティブなＦｃ受容体への結合を低下させる二つのアミノ酸置換がある；ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）は、ＩｇＧ４（ＥＱ）に類似するが、ＣＨ２ドメインがなく、ヒンジ領域とＣＨ３領域との間に位置する短いリンカー配列がある；短いリンカー配列であるＬ；を用いた。全３つのスペーサーは、表１に詳細に記載される。二つの代替的な膜貫通ドメイン：ＣＤ４及びＣＤ２８を用いたが、ともに表２に詳細に記載される。二つの代替的な共刺激ドメイン：ＣＤ２８共刺激ドメインの変異体であるＣＤ２８ｇｇ、及び４‐１ＢＢ；を用いた。ともに表３に詳細に記載される。ＣＡＲの全ては、表３にも記載される、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含んだ。ＣＡＲコード配列の次に、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列、及び表面の、シグナル伝達において機能しない、マーカーとしての切断型ＣＤ１９を同時発現させる切断型ＣＤ１７配列が続いた。

ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を含むバルクの中央記憶Ｔ細胞は、表４に示す６つの異なるＣＡＲのうちの一つを発現するレンチウイルスを用いて導入された。したがって、ＣＡＲは、４‐１ＢＢ共刺激ドメイン（及びＣＤ４膜貫通ドメイン）又はＣＤ２２ｇｇ共刺激ドメイン（及びＣＤ２８膜貫通ドメイン）のいずれか、及び３つの異なるスペーサードメイン：ＩｇＧ４（ＥＱ）、ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）又はＬ（図２においてＥＱ、ΔＣＨ２又はＬと表わされる）のうちの一つ、を含んだ。ＦＡＣＳは、ＣＡＲの検出用のＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）及び安定性を決定するｓｃＦｖの検出用タンパク質Ｌを発現するＴ細胞を測定するために、実行された。この分析の結果を図２に示す。

ＰＳＣＡを発現する前立腺がん細胞
二つの異なる前立腺がん腫瘍細胞株、ＰＣ‐３及びＤＵ１４５を、ＰＳＣＡを発現するように組換えた。図３Ａは、元の細胞及び組換え細胞並びにＬＣＬ細胞に関するＰＳＣＡ発現データを提供する。

様々なＰＳＣＡ標的Ｔ細胞によるＩＮＦγ産生
図３Ｂ‐Ｅは、フローサイトメトリで測定された、腫瘍標的（ＤＵ１４５細胞、ＰＣ３細胞、ＰＳＣＡ発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＤＵ１４５細胞、又はＰＳＣＡ発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＰＣ３細胞）との５時間の共培養後の、二つの異なるＣＡＲのＩＦＮγ産生データ及びＣＤ１０７ａ脱顆粒データを提供する。図４Ｄ‐Ｅは、ＥＬＩＳＡによって測定された、組換えＰＳＣＡ又は腫瘍標的を用いた２４時間の培養後のＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生のデータを提供する。ここでも、４‐１ＢＢ共刺激ドメインがあるＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメインがあるＣＡＲよりも、ＩＦＮγの産生量が少なく、かつ、脱顆粒マーカーのレベルが低レベルであった。

脱顆粒及び細胞内ＩＦＮγ産生のこの評価は、ＣＤ２２ｇｇ共刺激ドメインを含む全てのＣＡＲは、野生型ＤＵ１４５細胞及び野生型ＰＣ３細胞に対して、非特異的活性を提示し、４‐１ＢＢ共刺激ドメインがあるＣＡＲｓは、非特異的活性は極めて低いことが明らかになった。さらに、ＣＤ２２ｇｇ共刺激ドメインを含むＣＡＲは、全体的として４‐１ＢＢ共刺激ドメインがあるＣＡＲｓよりも多くのサイトカインを産生する。

様々なＣＡＲによる細胞死滅
ＣＤ２８共刺激ドメインがあるＣＡＲと４‐１ＢＢ共刺激ドメインがあるＣＡＲの比較（図３Ａに記載）により、４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは優れた特異性、増殖及び腫瘍細胞死滅能力を示すことが示された。この分析の結果を図４Ａ‐Ｅに示す。ＰＳＣＡ発現構築物でトランスフェクトされていない細胞の死滅がより少ないことから（図４Ａ）、腫瘍死滅は、ＣＤ２８共刺激ドメインがあるＣＡＲよりも、４‐１ＢＢ共刺激ドメインがあるＣＡＲに関して、より特異的であった。４‐１ＢＢがあるＣＡＲのＰＤ‐１誘導は低いレベルであった（図４Ｂ）。腫瘍標的（ＤＵ１４５、ＰＣ‐３、ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ）との７２時間の共培養後に死滅及びＰＤ‐１誘導を測定した。図４Ｃは、０．２５：１～４：１のエフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比を用いた腫瘍死滅の分析の結果を示す。図４Ｄは、腫瘍標的との７２時間の共培養後の、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖の分析の結果を示し、図４Ｅは、腫瘍標的（ＤＵ１４５、左；ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ、右）との１、２又は３日間の共培養後のＣＡＲ Ｔ細胞における腫瘍死滅及びＰＤ‐１誘導の動態を示す。

ＣＡＲ機能に対するスペーサーの影響
図５Ａ‐Ｂに示す実験は、スペーサー領域がＣＤ１０７ａ発現（脱顆粒）及びＩＦＮ－γ産生に影響を与え得ることを示す。ＣＡＲは全て、ＣＤ４膜貫通ドメイン及び４‐１ＢＢ共刺激ドメインを含む。

前立腺がん異種移植及び同所性モデルにおける抗腫瘍効果
上記二つのＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔは、前立腺がん異種移植及び同所性モデルで効能のある抗腫瘍効果を示す。ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２×１０^６）細胞を、ＮＳＧ雄マウスに皮下注射し、腫瘍が約３０‐５０ｍｍ^３に達したときに、ＣＡＲ Ｔｃｍ（５×１０^６）を腫瘍内に注射し、腫瘍成長をキャリパー測定でモニタした（図６Ａ）。ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ（２×１０^６）細胞を、ＮＳＧ雄に皮下注射し、ＣＡＲ ＰＢＭＣ細胞（５×１０^６）細胞を静脈内に送達した（図６Ｂ）。同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）モデルの作出のため、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（２×１０^５）細胞を、ＮＳＧ雄に脛骨内注射し、ＣＡＲ ＰＢＭＣ細胞（２×１０^６又は５×１０^６）を、静脈内に送達した（図６Ｃ）。パネルＢで各群における腫瘍注射後５８日目における、血液中のＣＡＲ Ｔ細胞持続性を評価した（図６Ｄ）。

４‐１ＢＢドメインを含むＰＳＣＡ標的ＣＡＲは、ＣＤ２８ドメインと比較して、優れた選択性を示し、Ｔ細胞消耗（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）を低減する
１Ｇ８（Ａ１１クローン）由来のヒト化ＰＳＣＡｓｃＦｖ（Ｌｅｐｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ３７：５２９）、ΔＣＨ２細胞外スペーサー、ＣＤ３ζ細胞溶解性ドメイン及びＣＤ１９ｔ細胞トラッカーを含み、共刺激ドメインのみが異なる（４‐１ＢＢ対ＣＤ２８）二つのＰＳＣＡ‐ＣＡＲ構築物を比較した（図７Ａ）。本実施例及び実施例８～１１は、特に明示しない限り、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞で組換えＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓを用いた研究を記載する。例えば、開始細胞表面Ｔ細胞表現型が異なる中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）をいくつかの研究で用いた（図１２）。

２つのＰＳＣＡ－ＣＡＲｓは、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζと比較してＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζに関してより低いレベルであるにもかかわらず、ｓｃＦｖ及びＣＤ１９ｔのフローサイトメトリ検出で決定されるように安定発現した（図７Ｂ）。これらのＣＡＲ Ｔ細胞は、匹敵するエクスビボＴ細胞増殖動態（図７Ｃ）及び類似の細胞表面Ｔ細胞表現型（図７Ｄ）を提示した。

次に、ＥＦ１αプロモーターの制御下でヒトＰＳＣＡ遺伝子を発現するように安定に組換えられたいくつかのヒト前立腺がん細胞株、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍死滅機能（図８Ａ）。ＰＣ‐３腫瘍細胞もまた、変異体ＰＧＫプロモーター（Ｆｒｉｇａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ３：３５６）によって駆動されるＰＳＣＡを用いて組換えて、低抗原密度細胞株（ＰＧＫ１００ｐと表す）を導出した。ＬＡＰＣ‐９は、内因的にＰＳＣＡを発現する、骨転移性前立腺がん罹患患者由来の原発腫瘍異種移植片（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）である（Ｃｒａｆｔ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：５０３）。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を、様々な腫瘍標的と共培養した。細胞イメージングにより、両方のＣＡＲｓが類似の動態で死滅したことが定性的に示された（図８Ｂ）。他の腫瘍死滅アッセイでは、フローサイトメトリを用いて、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞による腫瘍死滅を定量化した。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞はともに、同様の効能でＰＳＣＡ発現腫瘍細胞を死滅させたが、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζは、野生型非ＰＳＣＡ発現ＤＵ１４５及びＰＣ‐３腫瘍細胞の標的化を示した（図８Ｃ）。ＰＳＣＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析は、全ての腫瘍標的に対して実行され、野生型ＤＵ１４５及びＰＣ‐３細胞におけるＰＳＣＡタンパク質の発現は、フローサイトメトリで検出できなかったが、これらの株でｍＲＮＡ発現が検出され（図１３）、それがＣＤ２８含有ＣＡＲｓによる標的化に寄与しえたことが示された。

代替的なＰＳＣＡ ｓｃＦｖ、ＭＢ１［３３］の影響を検討した（図１４Ａ）。ＭＢ１及びＡ１１系の４‐１ＢＢを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓはともに、同様に安定発現された（図１４Ｂ）が、ＭＢ１ ｓｃＦｖ含有ＣＡＲｓは、Ａ１１ ｓｃＦｖ含有ＣＡＲｓと比較して、野生型腫瘍細胞で有意に標的化された（図１４Ｃ）。当該データは、抗原標的化及び共刺激ドメインがＣＡＲｓの腫瘍選択性を提供するために協働すること、並びに一つのドメインの非選択性が、他のドメインによって駆動される選択性に優先し得ることを示唆する。

選択性が強化され、かつ、野生型非ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞の非死滅に加えて、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、プログラム死‐１（ＰＤ‐１）の発現が低減することで示されるように、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、消耗の形跡は低下した（図８Ｄ）。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζとＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζとの間のＰＤ‐１発現の差異は、主にＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ８＋サブセットにおいて見られた（図８Ｅ）。さらに、同様の傾向は、頑健性がより低いにもかかわらず、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３を含む他の消耗マーカーによっても観察された（データ非表示）。

腫瘍細胞との共培養の１、２及び３日における、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζの死滅能を用いてＰＤ‐１発現の動態を調べた、時系変化死滅アッセイ（図８Ｆ）である。これらのデータは、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζがＤＵ１４５‐ＰＳＣＡを等しく死滅させることを定量的に確認したが、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζのＰＤ‐１発現はより高かった。

他の研究では、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζを、低ＰＳＣＡ発現腫瘍株（ＰＣ‐３‐ＰＧＫ１００ｐ）及び高ＰＳＣＡ発現腫瘍株（ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ）に対して、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養した。この研究は、Ｅ：Ｔ比がより低い場合、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζは、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζと比較して、高ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞に関してより選択的であったことを示した（図８Ｇ）。同様の知見は、ＰＢＭＣ由来又はＴ_ＣＭ由来のＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれを用いても観察された（データ非表示）。あわせて、当該データは、４‐１ＢＢ共刺激が、ＰＳＣＡ発現が低い方の細胞に対する活性を最小化しつつ、高ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞の効能を備え、かつ選択的な死滅をもたらすが、ＣＤ２８含有ＣＡＲｓには当該標的化選択性がないことを示唆する。

４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは、ＣＤ２８含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓと比較して、減衰されるが選択的なサイトカイン産生を示す
ＣＤ２８含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓと４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓとの間の差異を更に調べるため、各々Ｔ細胞活性化及びサイトカイン産生を比較するための研究が行われた。当該研究は、ＤＵ１４５‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞との一晩の共培養後の、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較した場合、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生は有意な減衰したことが示された（図９Ａ）。サイトカイン産生の同様の減衰は、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡに対する４‐１ＢＢ含有ＣＡＲｓについても観察された。ＣＤ２８含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞は、低ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞及び高ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞に対して同等のＩＦＮγレベルで産生されたが、４‐１ＢＢ含有ＣＡＲ Ｔ細胞のＩＦＮγ産生は、低ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞に対してより低かった（図９Ｂ）。腫瘍細胞によるサイトカイン産生に対する潜在的な非ＣＡＲ媒介効果を除外するために、プレート結合組換えヒトＰＳＣＡタンパク質に対するＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞による同様のＩＦＮγ測定が実行された。ＣＤ２８含有ＣＡＲ Ｔ細胞は、低レベル又は高レベルのＰＳＣＡに対して飽和応答を示したが、４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生は、抗原密度に左右された（図９Ｃ）。同様のサイトカイン応答は、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために用いられるＴ細胞サブセットから独立して観察された（図１５）。

４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは、ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞に対するＣＤ１０７ａ脱顆粒では、ＣＤ２８含有ＣＡＲｓと比較してわずかに低減した（図９Ｄ及び図９Ｅ）。ＣＤ１０７ａ発現によって測定される、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζによる非ＰＳＣＡ発現腫瘍細胞の有意な標的化が観察された。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化状態は、３日間の腫瘍死滅アッセイにおける４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）発現によって測定されたときに匹敵した（図９Ｆ）。ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞の差異がＴ細胞活性の固有欠失ではなく抗原標的化によるものであることを確かにするために、我々は、プレート結合抗ヒトＣＤ３抗体、ＯＫＴ３を用いて刺激されたＴ細胞における同様の活性化（ＣＤ１３７）及び消耗（ＰＤ‐１）を確認した（図１６）。

ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、皮下前立腺がんモデルにおいて頑健な治療効果を示す
本研究では、皮下ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍があるマウスは、５×１０^６のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一の腫瘍内注射を用いて治療された。腫瘍内Ｔ細胞注射後、２週間以内に完全な腫瘍退縮が観察された。腫瘍退縮は３０日以上にわたって明白であったが、原発腫瘍と同様の動態がある動物の大部分ではその後腫瘍が再発した（図１７Ａ）。これについては後述する。ＣＡＲ Ｔ細胞の全身療法がこの固形腫瘍モデルで達成しうるかを確立するため、様々な投与量のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内送達した。５×１０^６のＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍の完全な退縮を示したが、０．２５ｘ１０^６の少量ＣＡＲ投与量では、同様であるが治療効果の遅延が観察された（図１０Ａ）。この知見を大きな腫瘍負荷に拡張すべく、大きなＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍（約５００ｍｍ^３）を、５×１０^６のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一の静脈内注射で治療した。ここで、急速な腫瘍退縮が観察された（図１０Ｂ）。ヒトＴ細胞の有意な腫瘍浸潤はＣＡＲ Ｔ細胞注入後１１日目に観察され（図１０Ｃ、上方のパネル）、Ｔ細胞活性のマーカーであるグランザイムＢも発現した（図１０Ｄ、下方のパネル）。モック処理されたマウスからの腫瘍は、同じ時点でヒトＴ細胞又はグランザイムＢはほとんど発現されなかった。

単一の抗原特異的ＣＡＲ Ｔ細胞治療後の再発は、固形腫瘍の抗原プロファイル（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）が不均一になると予想される現象でありうるが、抵抗／再発の根底にある機構は未だ解明中である。図１０Ａで観察された腫瘍再発遅延をより深く理解するため、免疫組織化学を用いて、腫瘍細胞上の抗原の継続的な存在及びＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性を評価した。興味深いことに、モック治療された腫瘍はＰＳＣＡに関して高度に陽性であったが、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞治療後に再発した腫瘍はＰＳＣＡ陰性であった（図１７Ｂ、上方のパネル）。しかしながら、同じ再発腫瘍では、ヒトＴ細胞を、腫瘍へのＣＡＲ Ｔ細胞注入の少なくとも２ヶ月後に採取したにもかかわらず、豊富であった（図１７Ｂ、中間のパネル）。ＰＣ‐３細胞も生体外でＨＥＲ２を発現し（図１７Ｃ）、モック治療及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ治療された再発腫瘍がともに、生体内で同等のレベルでＨＥＲ２を発現したことが確認された（図１７Ｂ、下方のパネル）。腫瘍がＰＳＣＡ陰性であり、かつ依然としてＣＡＲ Ｔ細胞治療に対して感受性であるかを決定するため、再発腫瘍は、モック、ＰＳＣＡ指向性又はＨＥＲ２指向性のＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを用いた腫瘍内注射で治療した。再発性のＰＳＣＡ陰性腫瘍はＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓに対して非応答性であったが、それらはＨＥＲ２‐ＣＡＲ Ｔ細胞治療に対して感受性であった（図１７Ｄ）。

ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は、骨転移し、骨転移性前立腺がんで抗腫瘍効果を提示する
細胞免疫療法の主要な障害の一つは、固形腫瘍におけるＴ細胞の有効な輸送及び生存を妨げる免疫抑制的な微小環境である。骨転移性前立腺腫瘍における輸送及び抗原依存性ＣＡＲ Ｔ細胞増殖を直接的に評価するために、ホタルルシフェラーゼ標識されたＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を、脛骨内野生型ＰＣ‐３（解剖学的右脛骨）腫瘍及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ（解剖学的左脛骨）腫瘍があるマウスに静脈内注射した。興味深いことに、モック及びＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞はともに腫瘍に対して等しい初期輸送を示したが（Ｔ細胞注入の４時間後）、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞注射後第１日目にＰＳＣＡ発現腫瘍で優勢に見出され、４日間の動的イメージングでは増大し（図１０Ｄ）、ＰＳＣＡ陽性腫瘍における抗原依存性の輸送及び／又はＣＡＲ Ｔ細胞増殖を示す。次に、ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ腫瘍細胞が脛骨内空間の中に注入された研究が行われた。腫瘍移植後１４日目に、これらのがんがあるマウスは、投与量を段階的に減少させて、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞（０．５×１０^６～５×１０^６）を用いて静脈内治療した（図１０Ｅ）。５×１０^６又は２．５×１０^６のＣＡＲ Ｔ細胞を用いて治療した大多数のマウスは完全な腫瘍退縮を示したが、１×１０^６又は０．５×１０^６のＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを用いて治療されたマウスは、治療応答はより不均一であった（図１０Ｆ）。同所性研究からの有効な投与量を、０．２５×１０^６の少量ＣＡＲ Ｔ細胞投与量を用いて完全な退縮が観察された皮下モデルで用いられる投与量と比較した場合、このモデルの臨床的関連性は明らかである。当該モデルで観察される全体的な治療における不整合は、これらの腫瘍微小環境におけるＣＡＲ Ｔ細胞の浸潤及び生存の差である可能性が高い。

４‐１ＢＢ共刺激は、臨床的に関連する骨転移性前立腺がんモデルにおいて、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓは持続性に優れ、かつ耐久性のある抗腫瘍応答を提供する
上記の研究を、内因性ＰＳＣＡ発現骨転移性前立腺がん患者由来の腫瘍異種移植片、ＬＡＰＣ‐９を用いて拡張した。腫瘍移植後１４日目に、５×１０^６のＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一の静脈内注射で治療されたマウスは、脛骨内の腫瘍部位で腫瘍がほぼ完全に退縮した（図１１Ａ）。脛骨内の腫瘍は効果的に標的化されたが、ＬＡＰＣ‐９腫瘍は体内の他の部位に播種され、免疫組織化学で確認すると、様々なリンパ節（腋窩部及び鼠径部）並びに胸腺で特に明白であることが見出された（データ非表示）。これらは、骨における初期の腫瘍退縮後数週間にわたって見かけ上成長したが、最終的にＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞によって根絶された。

ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓの完全な抗腫瘍活性のための持続性のＴ細胞に対する要求に基づいて、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４‐１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかを含むＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓを比較する研究が行われた。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ及びＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞はともに骨転移が劇的に退縮したが、ＣＤ２８含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓを受容したマウスは転移性疾患に加えて原発腫瘍部位で再発し、一方では４‐１ＢＢ含有ＰＳＣＡ‐ＣＡＲで治療されたマウスは完全な抗腫瘍応答を示した（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）２８ζ ＣＡＲ Ｔ細胞治療されたマウスにおける腫瘍再発は、ＣＡＲ Ｔ細胞治療後７６日目に血液中のＰＳＡレベルを定量化することで確認された（図１０Ｃ）。ＣＡＲ Ｔ細胞を治療した動物の血液中で定量化し、ＣＡＲ Ｔ細胞は腫瘍注射後２４日目に両方の群で観察されたが、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζＣＡＲ Ｔ細胞は７６日目に有意に富化され、持続性が高まった（図１０Ｄ）。全体的に、これらの研究は、前立腺がんの同所性骨転移モデルを含む、複数の腫瘍系で、ＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞による、効能があり且つ耐久性のある抗腫瘍効果を示す。

ＣＡＲの発現のために使用されたｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは、シティ・オブ・ホープ（ＣＯＨ）のＴ細胞治療研究所（ＴＣＴＲＬ）で導出された様々なＣＡＲ発現ベクターの元のプラスミドである。ＣＡＲの発現に用いられたｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから産生された。重要なことに、このベクターは、ＣＡＲの発現を駆動するためにヒトＥＦ１プロモーターを用いる。ベクターの５’配列及び３’配列はともに、以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから導き出されたように、ｐｖ６５３ＲＳＮから導出された。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＨＩＶ‐１系統ｐＮＬ４‐３から導出された。ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列は上記した。

ｐＨＩＶ７の構築は、以下のように実行された。簡潔には、介在ＳＬ３－ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）とともにｇａｇ－ｐｏｌプラス５’及び３’末端反復配列（ＬＴＲｓ）から６５３ｂｐを含む、ｐｖ６５３ＲＳＮは、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングされた：工程１では、５’ＬＴＲからｒｅｖ‐応答配列（ＲＲＥ）までの配列でｐ５’ＨＩＶ－１５１を作製し、次いで５’ＬＴＲでＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去して修飾し、最初にＣＭＶエンハンサーに連結され、次いでＳＶ４０複製開始点で連結された（ｐ５’ＨＩＶ‐２）。工程２では、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ－１を作製後、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターで４００ｂｐが削除され、ＨＩＶ Ｕ３におけるシス調節エレメントを除去し、ｐ３’ＨＩＶ‐２を形成した。工程３では、ｐ５’ＨＩＶ‐３及びｐ３’ＨＩＶ‐２から単離された断片を結合して、ｐＨＩＶ‐３を作製した。工程４では、ｐ３’ＨＩＶ‐２により余分な上流のＨＩＶ配列が除去されてさらに修飾されてｐ３’ＨＩＶ‐３が生成され、かつ、ｐ３’ＨＩＶ‐３にＷＰＲＥを含む６００ｂｐのＢａｍＨＩ‐ＳａｌＩ断片を加えることで、ｐ３’ＨＩＶ‐４が作製された。工程５では、ｐＨＩＶ‐３ＲＲＥはＰＣＲによりサイズが縮小され、ｐＨＩＶ‐３からの５’断片（示さず）及びｐ３’ＨＩＶ‐４に連結されてｐＨＩＶ‐６が作製された。工程６では、ＨＩＶ‐１ ｐＮＬ４‐３（５５）由来のｃＰＰＴ ＤＮＡフラップ配列を含む１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ‐ＢａｍＨＩ断片が、ｐＮＬ４‐３から増幅され、ｐＨＩＶ６のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置されて、ｐＨＩＶ‐７が作製された。この元のプラスミドｐＨＩＶ７‐ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を用いて、４プラスミド系を用いて元のベクターをパッケージングした。

パッケージングシグナル、ｐｓｉΨ、は、ベクターへのウイルスゲノムの効率的なパッケージングのために必要である。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの導入効率を増強することが実証されている。

ヘルパー機能（ウイルスベクターの産生のために必要である）は、組換えにより、複製コンピテントレンチウイルスが生成する可能性を低減させるため、３つの別個のプラスミド：１）ｐＣｇｐはウイルスベクターアセンブリに必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする；２）ｐＣＭＶ‐Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージング用のウイルスゲノムの輸送のためにＲＲＥ配列に作用する、Ｒｅｖタンパク質をコードする；３）ｐＣＭＶ‐Ｇは、ウイルスベクターの感染性に必要な、水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌｏ－ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする；に分割された。

ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小限のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性領域は、ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する、約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；全３種のヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び、ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列を含む。複数の組換え事象が必要であるため、これらの領域の相同性に複製コンピテント組換えウイルスが生成される可能性は極めて低い。加えて、いかなる結果として生じる組換え体も、レンチウイルス複製に必要な機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列がないであろう。

ＣＭＶプロモーターがＥＦ１α‐ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）で置換された、新規なプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した。ＥＦ１ｐは、５６３ｂｐであり、ＣＭＶプロモーターの切除後に、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７に導入された。

野生型ウイルスの病原性に必要な、標的細胞の増殖性感染に必要なｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖが欠失されたレンチウイルスゲノムは、この系から除外される。加えて、ＣＬＲＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ゼータ‐Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクター構築物は完全３’ＬＴＲプロモーターを含まないため、標的細胞における、結果として生じ発現及び逆転写されるＤＮＡプロウイルスゲノムのＬＴＲｓは不活性であろう。この設計の結果、ＨＩＶ‐１由来の配列は決してプロウイルスから転写されず、治療用の配列のみがそれぞれのプロモーターから発現されるであろう。ＳＩＮベクターにおいてＬＴＲプロモーター活性が除去されると、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性が有意に低減されると予想される。

Ｔ細胞の導入用ベクターの産生
ＣＡＲを発現する各プラスミドについて、十分な量のプラスミドＤＮＡを産生するために発酵槽への接種に用いられる、シードバンクが生成された。プラスミドＤＮＡを、レンチウイルスベクターの産生に用いる前に、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験した。

簡潔に、細胞は、無菌性及びウイルス汚染が存在しないこと確認するために試験された２９３Ｔ作業細胞（ＷＣＢ）から増殖した。２９３Ｔ ＷＣＢ由来の２９３Ｔ細胞のバイアルを解凍した。ベクター産生及び細胞株維持のため適当数の１０層細胞ファクトリー（ＣＦｓ）を播種するのに十分な数の細胞数になるまで、細胞を生育し増殖させた。単一の細胞株を産生に用いてよい。

レンチウイルスベクターは、１０ＣＦｓまでのサブバッチで産生した。同じ週に２つのサブバッチを産生してよく、約２０Ｌのレンチウイルス上清／週の産生につなげた。１ロットの産物を産生するため、全てのサブバッチから生成された物質を、下流の処理段階の間プールした。２９３Ｔ細胞うぃ、２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中でＣＦｓ中に播種した。ファクトリーは、３７℃のインキュベーター内にあり、ＣＦの全層上で細胞が均一に分布するように水平にならされた。２日後、細胞は、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ ＣａＣｌ_２、２Ｘ ＨＢＳ、及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を伴う、ＣａＰＯ_４法を用いて、上記４つのレンチウイルスプラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含む上清を、回収し、精製し、濃縮した。上清をＣＦｓから除去後、生産最終細胞を各ＣＦから回収した。細胞は各ファクトリーからトリプシン処理され、遠心分離により回収された。細胞は凍結培地に再懸濁され、凍結保存された。これらの細胞は、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）試験用に後で用いた。

ベクターを精製及び製剤化（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）するため、粗製上清を、細胞片を除去する膜濾過で清澄化された。宿主細胞ＤＮＡ及び残留プラスミドＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ消化（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））で分解した。ウイルス上清は０．４５μｍのフィルターを用いて細胞片から清澄化した。清澄化された上清は予め秤量した容器に回収し、その中にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を加えた（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残留プラスミドＤＮＡ及び宿主ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼ消化は、３７℃で６時間実行された。最初の接線流限外濾過（ＴＦＦ）濃度のエンドヌクレアーゼ処理された上清を、ウイルスを約２０倍濃縮しながら、粗製上清から残留低分子量成分を除去するために用いた。清澄化されたエンドヌクレアーゼ処理ウイルス上清は、フラックス速度（ｆｌｕｘ ｒａｔｅ）を最大化しながら、せん断速度を約４，０００秒^－１又はそれ以下に維持するように設計された流速で、５００ｋＤのＮＭＷＣＯがある中空繊維カートリッジを通して循環した。濃縮プロセスの間にヌクレアーゼ処理された上清の透析ろ過を開始して、カートリッジの性能を維持した。透析ろ過緩衝液としてのＰＢＳ中に４％ラクトースを用いて、８０％ろ過液置換率が確立された。透析ろ過は１００％の透析液置換率で４回の追加交換容量にわたって続けられ、ウイルス上清を標的体積にして、粗製上清の２０倍濃度とした。

高速遠心分離技術を用いて、ウイルス産物のさらに濃縮した。レンチウイルスの各サブバッチを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ－２６ ｐｌｕｓ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを６０００ＲＰＭ（６，０８８ＲＣＦ）、６℃、１６‐２０時間で用いてペレット化した。次いで、各サブバッチからのウイルスペレットを、ＰＢＳ中の４％ラクトースで５０ｍＬ体積に再構成した。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製用の最終製剤とする。ベクター濃縮プロセス全体で、体積は約２００倍減少した。全てのサブバッチを完了させた後、物質を－８０℃に保存した間に各サブバッチ由来の試料の無菌性を試験した。試料の無菌性を確認した後、サブバッチを頻繁に撹拌しながら３７℃で急速に解凍した。次いで、物質をプールし、クラスＩＩ型Ａ／Ｂ３バイオセーフティーキャビネット内でウイルスベクタースイートに手動で分注した。無菌ＵＳＰクラス６、雄ネジＯリングクリオバイアル内の、１ｍＬの濃縮レンチウイルスの充填構成を用いた。ＣＯＨの応用技術開発センター（ＣＡＴＤ）の品質システム（ＱＳ）により、ＣＢＧのための方針と標準的な運用手順に従い、現在のグッド・マニュファクチャリング・プラクティス（ｃＧＭＰｓ）に従って全ての資料をリリースした。

レンチウイルスベクター調製物の純度を確実にするために、残留宿主ＤＮＡ汚染物質、並びに残留宿主及びプラスミドＤＮＡの移入について試験された。他の試験の中でも、所望のベクターが確実に存在させるため、ＲＴ‐ＰＣＲでベクター同一性を評価した。この研究での使用を意図したベクターは、全ての放出基準を満たした。

ＰＳＣＡを標的とするＣＡＲの発現に適するＴ細胞の調製
Ｔリンパ球は、白血球溶解によって患者から得られ、適当な同種異系又は自己のＴ細胞サブセット、例えば中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）がＣＡＲを発現するように遺伝的に操作し、いかなる臨床的に許容される手段によって患者に投与した後に、戻された後、抗がん治療を達成した。

適当なＴ_ＣＭは、以下のように生成されてよい。合意された研究参加者から得られた溶解産物を、フィコール処理し、洗浄し、一晩インキュベートする。その後、細胞は、ＧＭＰ等級の抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ４５ＲＡ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置を用いて、単球、調節性Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞集団を枯渇させる。枯渇後、陰性画分細胞（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌｓ）は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置上でＤＲＥＧ５６‐ビオチン（ＣＯＨ臨床等級）及び抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_ＣＭ細胞について富化される（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）。

富化後、Ｔ_ＣＭ細胞は、完全Ｘ－Ｖｉｖｏ１５プラス５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ‐２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ‐１５中に処方され、テフロン（登録商標）細胞培養バッグに移され、Ｄｙｎａｌ Ｃｌｉｎ（商標）Ｖｉｖｏ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて刺激される。刺激後の最大５日目まで、細胞は、１．０～０．３の感染多重度（ＭＯＩ）で所望のＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを用いて導入される。培養は、細胞増殖に必要な完全Ｘ‐Ｖｉｖｏ１５並びにＩＬ‐２及びＩＬ‐１５サイトカインを追加して（細胞密度を３×１０^５と２×１０^６生存細胞／ｍＬの間に保ち、サイトカイン補充は培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日）、最大で４２日間維持される。細胞は、通常、２１日以内にこれらの条件下で約１０^９細胞まで増殖する。培養期間終了後、細胞を採取し、２回洗浄し、臨床等級の凍結保存培地（Ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ ＣＳ５， ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）で処方する。

Ｔ細胞注入日に、凍結保存及び放出された産物を、解凍し、洗浄し、再輸液用に処方する。放出された細胞産物を含む低温保存バイアルを、液体窒素貯蔵から取り出し、解凍し、冷却し、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄する。遠心分離後、上清を除去し、細胞は保存料無添加の通常生理食塩水（ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈液に再懸濁される。品質管理試験用の試料を取り出す。

実施例７‐１１で用いられる技術
細胞株：ヒト転移性前立腺がん細胞株ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ ＨＴＢ‐８１）及びＰＣ‐３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐１４３５）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ‐１６４０（Ｌｏｎｚａ）、並びに１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのファンギゾンを含む１Ｘ抗生物質―抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）（完全ＲＰＭＩ）中で培養された。ヒト線維肉腫細胞株、ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ‐１２１）、及びヒト胎性腎臓細胞、２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）は、１０％ＦＢＳ、１Ｘ抗生物質―抗真菌剤、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び２ｍＭ Ｌ‐グルタミン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））（完全ＤＭＥＭ）中で培養された。ヒト前立腺がん異種移植片ＬＡＰＣ‐９（Ｒｏｂｅｒｔ Ｒｅｉｔｅｒ博士、ＵＣＬＡからの贈与）は、２０％ＦＢＳ及び１Ｘ抗生物質―抗真菌剤含有イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（完全ＩＭＤＭ）中で培養された。ＬＡＰＣ‐９細胞は雄のＮＯＤ．Ｃｇ‐Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊ１／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス内で継代培養され、単一細胞懸濁液は、以前に記載されたように調製された（Ｃｒａｆｔら、１９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：５０３０）。簡潔には、腫瘍組織が採取され、ペトリ皿で細かく刻まれ、１％プロナーゼＥ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて消化された。完全ＩＭＤＭによる洗浄に続き、単一細胞懸濁液は、４０μｍ細胞ストレーナ（Ｆａｌｃｏｎ）を通して濾過され、再度洗浄され、直ちに凍結された。ＥＢＣＬ転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）、並びに膜係留ＣＤ３イプシロン特異的ｓｃＦｖアゴニストＯＫＴ３（ＬＣＬ‐ＯＫＴ３（Ｗａｎｇら、２０１１ Ｂｌｏｏｄ １１７：１８８８）を含むＬＣＬ細胞は、完全ＲＰＭＩ中で培養された。全ての細胞は３７℃、５％ＣＯ_２で培養された。ＤＵ１４５及びＰＣ‐３細胞は、ＳＴＲプロファイリングによって認証され、マイコプラズマ陰性を確認された（ＤＤＣ Ｍｅｄｉｃａｌ、オハイオ）。

ＤＮＡ構築物及びレンチウイルスの産生：ＤＵ１４５及びＰＣ‐３腫瘍細胞は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でヒトＰＳＣＡ遺伝子（受託番号：ＮＭ＿００５６７２．４）を備えるｅｐＨＩＶ７レンチウイルスを用いて導入することにより、ＰＳＣＡを発現するように操作された。ＰＳＣＡ^＋細胞は、以下に記載するように、マウス抗ヒトＰＳＣＡ抗体（１Ｇ８）で染色され（「細胞内／細胞外染色及びフローサイトメトリ」の節を参照）、次いでＦＡＣＳはＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）特別注文Ｓｐｅｃｉａｌ Ｏｒｄｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ （ＳＯＲＰ） ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒを用いて選別された。低ＰＳＣＡ発現の腫瘍細胞の生成のために、ＰＳＣＡ遺伝子は、以前に記載されたように（Ｆｒｉｇａｕｌｔら、２０１５ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ３：３５６）、ＰＧＫプロモーターの変異型の制御下に置かれた。Ａ１１ ｓｃＦｖ（Ｌｅｐｉｎら、２０１０ Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ３７：５２９）配列は、Ａｎｎａ Ｗｕ及びＲｏｂｅｒｔ Ｒｅｉｔｅｒ両博士（ＵＣＬＡ）からの贈与。ＭＢ１ ｓｃＦｖ配列は、以前に公開された（Ｆｅｌｄｍａｎｎら、２０１２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８９：３２４９）。Ｔ２Ａリボソームスキップ配列によって分離された切断型ＣＤ１９遺伝子（ＣＤ１９ｔ）があるＣＡＲ構築物は、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスバックボーン中にクローニングされた。抗原標的化ドメインは、Ａ１１又はＭＢ１ ｓｃＦｖのいずれかを含んでいた。細胞外スペーサードメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃスペーサーの第１２９番目のアミノ酸における長ＣＨ２決失型（ΔＣＨ２）を含んでいた（Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａら、２０１５ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３：７５７）。細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインがあるＣＤ２８又はＣＤ４膜貫通ドメインがある４‐１ＢＢのいずれかのそれを含んでいた。ＣＤ３ζ細胞溶解性ドメインは以前に記載されている（Ｃｏｏｐｅｒら、２００３ Ｂｌｏｏｄ １０１：１６３７）。

レンチウイルスは、パッケージングプラスミド及び所望のＣＡＲレンチウイルスバックボーンプラスミドでのトランスフェクションの１日前に、Ｔ－２２５組織培養フラスコに２９３Ｔ細胞をプレーティングすることにより生成された。上清は３日から４日後に回収され、濾過され、遠心分離して細胞片を除去され、混入している核酸を除去するために２ｍＭのマグネシウム及び２５Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共にインキュベートされた。上清は合わせられ、４℃で一晩の高速遠心分離（６０８０ｇ）によって濃縮された。次いでレンチウイルスペレットは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）‐ラクトース溶液（ＰＢＳの１００ｍＬあたり４ｇのラクトース）に再懸濁され、アリコートに分けられ、後で用いるために－８０℃で保存された。ＣＤ１９ｔ発現によって決定されるレンチウイルス力価は、ＨＴ１０８０細胞を用いて定量化された。

Ｔ細胞単離、レンチウイルス導入及びエクスビボ増殖：白血球アフェレーシス産物（Ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、シティ・オブ・ホープ（ＣＯＨ）の内部審査委員会（ＩＲＨ）の承認を受けたプロトコルの下で、合意された研究参加者（健常ドナー）から得られた。白血球アフェレーシスの当日、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での密度勾配遠心分離、続いてＰＢＳ／ＥＤＴＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中での複数回の洗浄によって、単離された。細胞は、室温（ＲＴ）で回転機上に一晩休められ、続いて洗浄され、完全Ｘ－ＶＩＶＯ中に再懸濁された。全ＰＢＭＣを利用する研究のために、細胞は、直ちにＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５凍結保存培地（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で凍結された。最大で５ｘ１０^９のＰＢＭＣは、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５、及び抗ＣＤ４５ＲＡマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とともに、ＲＴで３０分間インキュベートされ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者のプロトコルに従って用いて磁気的に枯渇させられた。次いで枯渇したＰＢＭＣは、ビオチン化抗ＣＤ６２Ｌ抗体（シティ・オブ・ホープの生物医学・遺伝センター製）とともに室温で３０分間インキュベートされ、次いで抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とともに室温で３０分間更にインキュベートされることにより、中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）について富化。次いでＴ_ＣＭは、ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて製造者のプロトコルに従って用いて、磁気的に富化。Ｔ_ＣＭを利用する研究のために、細胞は、上述のように直ちに凍結された。ＰＢＭＣ及びＴ_ＣＭの純度及び表現型は、フローサイトメトリで確認された。

新たに解凍されたＰＢＭＣ又はＴ_ＣＭは、１回洗浄され、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ‐２（ｒｈＩＬ－２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）及び０．５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ‐１５（ｒｈＩＬ－１５、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含む１０％ＦＢＳを含むＸ‐ＶＩＶＯ‐１５（Ｌｏｎｚａ）（完全Ｘ‐ＶＩＶＯ）中で培養された。ＣＡＲレンチウイルス導入のために、Ｔ細胞は、ビーズ刺激の当日か又は翌日のいずれかに、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、硫酸プロタミン（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、（上述のような）サイトカイン混合物、及び様々なＭＯＩの所望のレンチウイルスと共に培養された。スピンオキュレーション（Ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）は、ブレーキなしで３２℃、２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって実行された。次いで細胞は、２～３日毎に新しいサイトカインを含む完全Ｘ‐ＶＩＶＯ中で培養及び補充された。７‐９日後に、ビーズは磁気的に除去され、所望の細胞収率を達成するために、細胞は、サイトカインを含む完全Ｘ‐ＶＩＶＯ中で更に増やされた。ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＣＤ１９ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ＫｉｔＩ又はＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者のプロトコルに従って用いて、ＣＤ１９ｔについて正に選択された。更なる増殖に続いて、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）機能アッセイ及び生体内腫瘍モデルに先立って、細胞は凍結された。ＣＡＲ Ｔ細胞の純度及び表現型は、フローサイトメトリで確認された。

細胞内／細胞外染色及びフローサイトメトリ：フローサイトメトリ分析のために、細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ及び１×抗生物質－抗真菌剤を含み、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、又はフェノールレッド（ＨＢＳＳ－／－， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有しないハンクス平衡塩類溶液）中に再懸濁された。ＰＳＣＡ染色のために、Ｒｏｂｅｒｔ Ｒｅｉｔｅｒ博士、ＵＣＬＡによってマウス抗ヒトＰＳＣＡ抗体（１Ｇ８）が親切にも提供された。ＣＡＲ ｓｃＦｖを検出するために、ビオチン化タンパク質Ｌ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ）が以前に記載されたように使用された［３５］。細胞は、二次染色に進む前に、暗所で一次抗体とともに４℃で３０分間インキュベートされた。細胞外及び二次染色のために、細胞は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入された、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＰｅｒＣＰ‐Ｃｙ５．５、ＰＥ‐Ｃｙ７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びＡＰＣ－Ｃｙ７（又はＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０）抱合型（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５、マウス又はヒト特異的ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１３７、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＰＤ‐１（ＣＤ２７９）、ＴＩＭ３（ＣＤ３６６）、ＣＣＲ７、ＩＦＮγ、ヤギ抗マウスＩｇ及びストレプトアビジン）を用いた暗所での４℃、３０分間のインキュベーションに先立って、２回洗浄された。細胞生存率は、４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）を用いて測定された。細胞内染色のために、細胞は、固定され、透過処理され（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）、ＰＥ Ａｃｔｉｖｅ－Ｃａｓｐａｓｅ－３ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製造者のプロトコルに従って処理された。次いで細胞は、フルオロフォア抱合抗体と共に暗所で４℃、３０分間インキュベートされ、ＦＡＣＳ緩衝液中での再懸濁及びＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上での取得に先立って、２回洗浄された。データは、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ１０， ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析された。

生体外細胞機能アッセイ：脱顆粒アッセイ及び細胞内サイトカインアッセイのために、ＣＡＲ Ｔ細胞及び腫瘍標的は、丸底９６ウェル組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において外因性サイトカインを含まない完全Ｘ－ＶＩＶＯ中で、様々なエフェクター：標的比で共培養された。ＦＩＴＣ－ＣＤ１０７ａが培養物に添加され、３７℃で４‐６時間インキュベートした後、細胞は固定され、上述のようなフローサイトメトリによる分析の前に透過処理された。腫瘍死滅アッセイのために、ＣＡＲ Ｔ細胞及び腫瘍標的は、１～５日間にわたり、９６ウェルプレートにおいて外因性サイトカインを含まない完全Ｘ－ＶＩＶＯ中で様々なエフェクター：標的比で共培養され、上述のようなフローサイトメトリで分析された。ＣＡＲ Ｔ細胞による腫瘍死滅は、ＣＤ４５陰性細胞計測数をモックＴ細胞によって観察されたものに対して比較することにより計算された。

ＥＬＩＳＡ及びマルチプレックスサイトカインアッセイ：様々な濃度の組換えヒトＰＳＣＡタンパク質（アミノ酸２３‐９５；Ａｂｎｏｖａ）は、高親和性９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で４℃、１ＸＰＢＳ中で一晩コーティングされた。ウェルは１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄され、１０％ＦＢＳで１時間ブロックされ、再度洗浄された。ＣＡＲ Ｔ細胞（２００μＬ中５×１０^３）は、コートされたウェルに加えられた。指定されている場合、腫瘍標的（５×１０^３）が非コートウェル中のＴ細胞とともにインキュベートされた（最終容量２００μＬ）。３７℃で一晩のインキュベーションに続いて、上清が採取され、ヒトＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－ＧＯ！（登録商標）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製造者プロトコルに従って処理された。プレートは、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）及びＷａｌｌａｃ １４２０ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、４５０ｎｍで読み取られた。代替的に、上清は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｂｅａｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って用いて、複数のサイトカインについて分析された。マウス血清に対するヒトＰＳＡ／ＫＬＫ３ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）は製造者のプロトコルに従って行われた。

定量的ＰＣＲ：腫瘍細胞（０．２５×１０^６／ｍＬでプレーティングされた）は、ＲＮＡ単離の前に１日間培養された。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ ｃｏｌｕｍｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出された。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製された。ＲＮＡプライマーは、ＰＳＣＡ（Ｈｓ０４１６６２２４＿ｇ１， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかに特異的な、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを用いて生成された。ｑＰＣＲは、ＶｉｉＡ（商標）７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で実行された。プライマーセットは、単一の融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）ピークがある特定のダイナミックレンジにわたる標準曲線を用いて検証された。
標的遺伝子の発現は、ＧＡＰＤＨに対して正規化された。

生体内腫瘍研究：全ての動物実験は、シティ・オブ・ホープの施設動物ケア及び使用委員会の承認を受けたプロトコルの下で実行された。皮下腫瘍研究のために、ＰＣ‐３及びＤＵ１４５細胞（２．５×１０^６）は、ＨＢＳＳ^－／－中に調製され、雄ＮＳＧマウスの左脱毛腹部に皮下注射した。腫瘍成長は、キャリパー測定を介して週３回監視された。ひとたび腫瘍体積が５０‐５００ｍｍ^３に達すると、ＣＡＲ Ｔ細胞はＰＢＳ中に調製され、腫瘍内（ｉ．ｔ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）のいずれかに注射された。ひとたび腫瘍が直径１５ｍｍに達するとマウスは安楽死させられ、腫瘍は採取され、後述されるように免疫組織化学のために処理された。皮下腫瘍が再発した場合、マウスは、ＰＳＣＡ‐ＣＡＲｓ又はＨＥＲ２‐ＣＡＲｓのいずれかを用いた腫瘍内注射によって治療された。末梢血は、ヘパリン処理されたた毛細管（Ｃｈａｓｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して、ヘパリン／ＰＢＳ溶液（１０００単位／ｍＬ、Ｓａｇｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含むポリスチレンチューブの中に、イソフルラン麻酔したマウスの後眼窩（ＲＯ）出血から収集された。マウス１匹あたり約１５０μＬの血液が収集された。血液は、製造者のプロトコルに従って１Ｘ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いて溶解され、次いで洗浄され、染色され、上述されたようにフローサイトメトリで分析された。

同所性脛骨内腫瘍研究のために、ＬＡＰＣ‐９及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡは、強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）／ホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）があるレンチウイルスを用いて導入され、ひとたびマウスに移植されると非侵襲的光学的画像化（Ｘｅｎｏｇｅｎ）することを可能にした（結果として生じた株は、ＬＡＰＣ‐９‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ及びＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃと命名された）。簡潔に、これらの株は、ポリブレン（４ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）及びｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃレンチウイルス（上記参照）とともにインキュベートされ、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標） ＳＯＲＰ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒを用いたＧＦＰ^＋細胞についての細胞選別が続いた。新たに選別されたＬＡＰＣ‐９‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ細胞は、上述されたようにＮＳＧマウス内で継代培養された。ＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ細胞（２×１０^５）又はＬＡＰＣ‐９‐ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃ細胞（１．５×１０^５）は、皮下モデルと同様に調製された。マウスは、腫瘍注射に先立ってケタミン／キシラジン及び気体イソフルランの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって麻酔された。腫瘍細胞（３０μＬのＨＢＳＳ^－／－中）は、マウス後肢の脛骨内空間に注射された。１４日後に、マウスは、ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて静脈内注射された。腫瘍成長は、隔週の光学的画像化（ＩＶＩＳ， Ｘｅｎｏｇｅｎ）を介して監視され、フラックスシグナルはＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて分析された。画像化のために、マウスは、ＰＢＳ中に懸濁された１５０μＬのＤ‐ルシフェリンカリウム塩（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、４．２９ｍｇ／マウスで腹腔内注射された。

Ｔ細胞輸送研究のために、マウスは、右脛骨内空間に野生型ＰＣ‐細胞（２×１０^５）を用いて、またび左脛骨内空間にＰＣ‐３‐ＰＳＣＡ細胞（２×１０^５）を用いて、移植された。１４日後に、マウスは、ｅＧＦＰ‐ｆｆｌｕｃがあるレンチウイルスで同時導入された（ｃｏ－ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）５×１０^６のモック又はＰＳＣＡ（ΔＣＨ２）ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて静脈内注射された。Ｔ細胞は、ＣＡＲ富化され、フローサイトメトリで約３０％ｅＧＦＰ^＋であると決定された。Ｔ細胞輸送は、Ｔ細胞注入の４時間後、１日後、２日後及び４日後に、非侵襲的光学的画像化（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって監視された。フラックスシグナルは、上述のように分析された。

免疫組織化学：腫瘍組織は、４％パラホルムアルデヒド（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）中で最大で３日間まで固定され、更なる処理まで７０％エタノール中に保存された。組織学は、シティ・オブ・ホープの組織学コアによって実行された。簡潔に、パラフィン包埋切片（１０μｍ）は、マウス抗ヒトＣＤ３（ＤＡＫＯ）、マウス抗ヒトＰＳＣＡ（Ａｂｃａｍ）、ラット抗ヒトＨＥＲ２（ＤＡＫＯ）、及びラット抗ヒトグランザイムＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色された。画像は、Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ ２．０ＨＴ ｄｉｇｉｔａｌ ｓｌｉｄｅ ｓｃａｎｎｅｒ及び関連するＮＤＰ．ｖｉｅｗ２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｈａｍａｍａｔｚｕ）を用いて取得された。

統計学的分析：特に断らない限り、データは平均±ＳＥＭとして示される。複数の群の間での統計的比較は、ｐ値を計算するために、不対両側スチューデントｔ検定を用いて実行された。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意ではない。

Claims (16)

1. 配列番号２６、２８、３０、３２、３４及び３６から選択されるアミノ酸配列を含み、そのうち、５個までの単一のアミノ酸が置換された、ポリペプチド。
2. 配列番号２６、２８、３０、３２、３４及び３６から選択されるアミノ酸配列を含み、そのうち、２個までの単一のアミノ酸が置換された、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 配列番号２６、２８、３０、３２、３４及び３６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 配列番号２６、２８、３０、３２、３４及び３６から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
5. 配列番号２６又は３２で表されるアミノ酸配列を含み、そのうち、５個までの単一のアミノ酸が置換された、ポリペプチド。
6. 配列番号２８又は３４で表されるアミノ酸配列を含み、そのうち、５個までの単一のアミノ酸が置換された、ポリペプチド。
7. 配列番号３０又は３６で表されるアミノ酸配列を含み、そのうち、５個までの単一のアミノ酸が置換された、ポリペプチド。
8. 配列番号２６又は３２で表されるアミノ酸配列を含み、そのうち、２個までの単一のアミノ酸が置換された、ポリペプチド。
9. 配列番号２８又は３４で表されるアミノ酸配列を含み、そのうち、２個までの単一のアミノ酸が置換された、ポリペプチド。
10. 配列番号３０又は３６で表されるアミノ酸配列を含み、そのうち、２個までの単一のアミノ酸が置換された、ポリペプチド。
11. 配列番号２６又は３２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
12. 配列番号２８又は３４で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
13. 配列番号３０又は３６で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
14. 配列番号２６又は３２で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
15. 配列番号２８又は３４で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
16. 配列番号３０又は３６で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。

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