JP2022031140A - External preparation for skin - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、皮膚（頭皮も含む）外用剤に配合可能な酵母培養抽出物及び植物発酵物を組み合わせた組成物に関するものである。 The present invention relates to a composition in which a yeast culture extract and a fermented plant product that can be blended in an external preparation for skin (including scalp) are combined.
従来、皮膚外用剤に配合する有効成分として天然物由来の成分が研究開発されている。しかし、それらの天然物由来の成分は、皮膚外用剤の有効成分として利用する場合に、有効性や安定性等の点で課題があった。 Conventionally, natural product-derived ingredients have been researched and developed as active ingredients to be added to external skin preparations. However, these natural product-derived components have problems in terms of effectiveness and stability when used as active ingredients for external skin preparations.
上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、本発明者らは、酵母培養物抽出物、ハス属植物の発酵物及びワスレグサ属植物の組み合わせが、美白及び抗酸化等の相乗効果を有し、皮膚外用剤の有効成分として有用であることを新たに見出した。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have found that the combination of yeast culture extract, lotus plant fermented product and daylily plant has synergistic effects such as whitening and antioxidant, and skin. We have newly found that it is useful as an active ingredient of external preparations.
従来、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）を皮膚外用剤の美白成分として使用することは、例えば、特許文献１，２により知られていた。また、ハス属植物の発酵物、又はワスレグサ属植物の発酵物を化粧料に配合することは、特許文献３，４により知られていた。しかし、ササユリ由来酵母の培養物抽出物、ハス属植物の乳酸菌発酵物及びワスレグサ属植物の酵母発酵物の組み合わせが、美白及び抗酸化等の相乗効果を有し、皮膚外用剤の有効成分として有用であることについては知られていなかった。
本発明は、ササユリ由来酵母の培養物抽出物或いはその濃縮物又は乾燥粉末と、ハス科ハス属に属するハスの乳酸菌発酵物と、ユリ科ワスレグサ属のホンカンゾウ及び／又はヤブカンゾウの酵母発酵物とを有効成分とする皮膚外用剤である。 The present invention comprises a culture extract of Sasayuri-derived yeast or a concentrate or dry powder thereof, a fermented lotus lactic acid bacterium belonging to the genus Lotuses of the family Lotuses, and a yeast fermented product of the genus Daylilies and / or the genus Daylilies of the family Liliaceae. It is an external skin preparation used as an active ingredient.
本発明は、ササユリ由来酵母の培養物抽出物或いはその濃縮物又は乾燥粉末と、ハス科ハス属に属するハスの乳酸菌発酵物と、ユリ科ワスレグサ属のホンカンゾウ及び／又はヤブカンゾウの酵母発酵物を有効成分として組み合わせて配合することで、格段にすぐれた美白効果及び抗酸化効果等を有する皮膚外用剤を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is effective for a culture extract of Sasayuri-derived yeast or a concentrate or a dry powder thereof, a fermented lotus lactic acid bacterium belonging to the Lotuses family Lotuses, and a yeast fermented product of the Liliaceae daylilies and / or the daylilies. By blending them in combination as ingredients, it is possible to provide a skin external preparation having remarkably excellent whitening effect, antioxidant effect and the like.
以下、本発明について詳細に説明する。本発明で用いる酵母は、サッカロマイセス属の酵母であって、ユリ科(Liliaceae)ユリ属（Lilium）にササユリ（Lilium japonicum）の花由来の酵母である。ササユリの花由来の酵母としては、特許6175697に記載のササユリの花より採取された酵母「サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）」（特許微生物寄託センター受託番号NITE P－01947）が挙げられる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The yeast used in the present invention is a yeast of the genus Saccharomyces, which is derived from the flowers of the lily family (Liliaceae), the genus Lily (Lilium), and the lily (Lilium japonicum). Examples of the yeast derived from Sasayuri flowers include the yeast "Saccharomyces cerevisiae" (Patent Microorganism Depositary Center Accession No. NITE P-01947) collected from Sasayuri flowers described in Patent 6175697.
酵母培養物抽出物或いはその濃縮物又は乾燥物は、以下のようにして調製することができる。酵母培養物抽出物の製造方法は、酵母を培養液で培養する方法、培養した酵母を酸やアルカリで菌体成分を可溶化する加水分解法、酵母菌体内にあるタンパク質分解酵素などを利用する自己消化法、タンパク質分解酵素等の酵素剤を利用する酵素法、これらを組み合わせた方法により得ることができる。 The yeast culture extract or its concentrate or dried product can be prepared as follows. As a method for producing a yeast culture extract, a method of culturing yeast in a culture solution, a hydrolysis method of solubilizing the bacterial cell components of the cultured yeast with an acid or an alkali, a proteolytic enzyme in the yeast cells, etc. are used. It can be obtained by an autolysis method, an enzyme method using an enzyme agent such as a proteolytic enzyme, or a method combining these methods.
酵母を培養する際の炭素源は、特に限定はなく、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース又はガラクトース或いはそれらを構成糖とするオリゴ糖、多糖が挙げられる。また、炭素源に加えて、窒素源を添加することでも良く、例えば、窒素源としては、アミノ酸やペプトン等が挙げられる。 The carbon source for culturing yeast is not particularly limited, and examples of the carbon source include glucose, fructose or galactose, oligosaccharides having them as constituent sugars, and polysaccharides. Further, a nitrogen source may be added in addition to the carbon source. For example, examples of the nitrogen source include amino acids and peptones.
酵母の培養温度は、２５℃～４０℃の範囲で、好ましくは２８℃～３５℃の範囲である。また、ｐＨは、３．０～８．０の範囲で、好ましくは、３．５～７．０の範囲である。 The yeast culture temperature is in the range of 25 ° C to 40 ° C, preferably in the range of 28 ° C to 35 ° C. The pH is in the range of 3.0 to 8.0, preferably in the range of 3.5 to 7.0.
酵母培養物抽出物の濃縮物は、酵母の培養液、或いは加水分解方法、酵母の自己消化法又は酵素法にて得られる液を、減圧濃縮器等で濃縮することで得ることが出来る。 The concentrate of the yeast culture extract can be obtained by concentrating the yeast culture solution or the solution obtained by the hydrolysis method, the yeast autolysis method or the enzyme method with a vacuum concentrator or the like.
また、酵母培養物抽出物の乾燥物は、酵母の培養液又はその濃縮液を、真空乾燥法、スプレードライ法などにより乾燥することで得ることができる。 Further, the dried product of the yeast culture extract can be obtained by drying the yeast culture solution or the concentrated solution thereof by a vacuum drying method, a spray drying method or the like.
また、酵母培養物抽出物乾燥物は、化学安定性、低吸湿性を目的として、賦形剤を加えた乾燥物としても良い。賦形剤は、澱粉、ブドウ糖、結晶セルロース、乳糖、デキストリン等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マンニトール、マルチトール、ラクチトール、等の糖アルコールなどを用いることができるが、酵母培養物抽出物と混合して乾燥粉末化できるものであればいずれの物質でもよい。 Further, the dried yeast culture extract may be a dried product to which an excipient is added for the purpose of chemical stability and low hygroscopicity. As the excipient, sugars such as starch, glucose, crystalline cellulose, lactose, and dextrin, sugar alcohols such as sorbitol, xylitol, erythritol, mannitol, maltitol, and lactitol can be used, but with yeast culture extracts. Any substance may be used as long as it can be mixed and made into a dry powder.
また、本発明に係るハス発酵物の素材として使用する植物は、ハス科（Nelumbonaceae）ハス属（Nelumbo）に属するハス（Nelumbo nucifera)であり、発酵に用いる部位はその種子である。 The plant used as a material for the fermented lotus product according to the present invention is Nelumbo nucifera, which belongs to the family Lotuses (Nelumbonaceae) and the genus Lotuses (Nelumbo), and the site used for fermentation is its seeds.
また、本発明に係るユリ科ワスレグサ属の植物の発酵物素材として使用するものは、ホンカンゾウ（Hemerocallis fulva var. fulva）又はヤブカンゾウ（Hemerocallis fulva var. kwanso）或いはそれら２種の混合物であり、発酵に用いる部位は、その蕾又は花弁及び蕾である。 Further, what is used as a fermented material of the plant of the genus Daylily of the Liliaceae according to the present invention is Honkanzo (Hemerocallis fulva var. Fulva) or Yabukanzo (Hemerocallis fulva var. The sites used are its buds or petals and buds.
発酵処理は、以下のようにして行うことができる。まず、発酵の資化源としては植物部位（種子、蕾又は花弁）自体（以下、植物体ということがある）を用いてもよく、又は植物体を適宜の媒体で抽出して得られる抽出物を用いてもよい。また、抽出物を用いる場合には、被抽出物の植物体を固液分離によって除去することなく、植物体を含んだままで発酵を行うことも可能である。ここで、植物は、生のままであっても、又予め乾燥若しくは半乾燥したものであってもよい。また、形状としては採取したものをそのまま用いることも可能である。 The fermentation process can be carried out as follows. First, as an assimilation source for fermentation, a plant part (seed, bud or petal) itself (hereinafter, may be referred to as a plant) may be used, or an extract obtained by extracting the plant with an appropriate medium. May be used. In addition, when an extract is used, it is also possible to carry out fermentation with the plant contained in the extract without removing the plant to be extracted by solid-liquid separation. Here, the plant may be raw or pre-dried or semi-dried. Moreover, it is also possible to use the collected one as it is as the shape.
本発明において、ハス種子の発酵に用いる微生物は乳酸菌であり、例えば、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum)、ラクトバシルス ブレビス（Lactobacillus brevis)、ラクトバシルス カゼイ（Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii）等のラクトバシルス（Lactobacillus）属の乳酸菌；カルノバクテリウム ディバージェンス（Carnobacterium divergens)、カルノバクテリウム ピシコーラ(Carnobacterium piscicola)等のカルノバクテリウム（Carnobacterium）属の乳酸菌；ロイコノストック メセンテロイズ（Leuconostoc mesenteroides)、ロイコノストック ラクティス（Leuconostoc lactis)、ロイコノストック シトレウム（Leuconostoc citreum)等のロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌； ストレプトコッカス フェーカリス（Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス ピオジェネス（Streptococcus pyogenes)等のストレプトコッカス属の乳酸菌；エンテロコッカス カゼリフラバス（Enterococcus caseliflavus)、エンテロコッカス サルフレウス（Enterococcus sulfreus)等のエンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌；ラクトコッカス プランタラム（Lactococcus plantarum) ラクトコッカス ラフィノラクティス（Lactococcus rafinolactis)等のラクトコッカス属の乳酸菌；ヴェイセラ コンフューザ（Weissella confusa)、ヴェイセラ カンドウレリ（Weissella kandleri)等のヴェイセラ属の乳酸菌；アトポビウム ミニュタム（Atopobium minutum)、アトポビウム パービュラス（Atopobiumparvulus)等のアトポビウム（Atopobium）属の乳酸菌；バゴコッカス フルビアリス（Vagococcus fluvialis）、バゴコッカス サーモニナラム（Vagococcus salmoninarum)等のバゴコッカス（Vagococcus）属の乳酸菌；ペディオコッカス ダムノサス（Pediococcus damnosus)、ペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus)等のペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌等が挙げられる。 In the present invention, the microorganism used for fermenting hass seeds is a lactic acid bacterium, for example, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbeck, etc. Lactobacillus genus Lactobacillus; Carnobacterium divergens, Carnobacterium piscicola and other Carnobacterium genus lactic acid bacteria; Leuconostoc mesenteroides, Leuco Lactobacillus of the genus Leuconostoc such as Nostock lactis (Leuconostoc lactis) and Leuconostoc citreum; Streptococcus faecalis, Streptococcus piogenes (Streptococcus pyogenes), etc. (Enterococcus caseliflavus), lactic acid bacteria of the genus Enterococcus such as Enterococcus sulfreus; Lactococcus plantarum (Lactococcus plantarum) Lactococcus rafinolactis (Lactococcus rafinolactis) Lactobacillus conf ), Lactobacillus of the genus Weissella such as Weissella kandleri; Lactobacillus of the genus Atopobium such as Atopobium minutum, Atopobium parvulus; Lactic acid bacteria of the genus Vagococcus such as Vagococcus salmoninarum; lactic acid bacteria of the genus Pediococcus such as Pediococcus damnosus and Pediococcus pentosaceus.
また、本発明において、ホンカンゾウ及び／又はヤブカンゾウの蕾又は蕾及び花弁の発酵に用いる酵母とは、例えば、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス アワモリ(Saccharomyces awamori)、サッカロミセス チェバリエリ(Saccharomyces chevalieri)、サッカロミセス カールスバージェンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス バヨナス（Saccharomyces bayonus)等のサッカロミセス属の酵母、ガラクトミセス（Galactomyces）属の酵母、ラカンセア属（Lachancea）の酵母（Lachancea kluyveri等）、トルラスポラ デルブルエキ(Torulaspora delbruekii)、トルラスポラ ファーメンタチ(Torulaspora fermentati)、トルラスポラ ロゼイ(Torulaspora rosei)等のトルラスポラ属の酵母、ジゴサッカロミセス ローキシ(Zygosaccharomyces rouxii)、ジゴサッカロミセス ソーヤ(Zygosacchar omyces soya)、ジゴサッカロミセス サケ(Zygosaccharomyces sake)、ジゴサッカロミセス ミソ(Zygosaccharomyces miso)、ジゴサッカロミセス ラクティス(Zygosaccharomyces lactis)等のジゴサッカロミセス属の酵母、カンディダ ベルサチリス(Candida versatilis)、カンディダ エチェリシイ(Candida etchellsii)、カンディダ ケフィール（Candida kefyr）、カンディダ サケ（Candida sake）、カンディダ スコッティ（Candida scottii）等のカンディダ属の酵母、オーレオバシディウムプルランス（Aureobasidium Pullulans）、オーレオバシディウム マンソニー（Aureobasidium mansonii）、オーレオバシディウム マイクロスティクタム（Aureobasideium microstictum）等のオーレオバシディウム属の酵母、等が挙げられる。また、本発明に係る酵母としては、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、植物の花（バラ、ユリ、サクラ等）由来の酵母、海由来の酵母の何れであっても良い。 Further, in the present invention, the yeast used for fermenting the buds or buds and petals of Saccharomyces cerevisiae and / or Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces awamori, Saccharomyces awamori, Saccharomyces saccharomyces che Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces bayonus and other Saccharomyces bayonus, Saccharomyces bayonus and other Saccharomyces yeasts, Galactomyces yeasts, Lachancea yeasts (Lachancea kluyveri, etc.) Torulaspora fermentati, Torulaspora rosei and other yeasts of the genus Torulaspora, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces soya, Zygosacchar omyces soya Miso, Zygosaccharomyces lactis and other yeasts of the genus Zygosaccharomyces, Candida versatilis, Candida etchellsii, Candida kefyr, Candida kefyr, Candida Yeasts of the genus Candida such as scottii), Aureobasidium Pullulans, Aureobasidium mansonii, Aureobasideium microstictum and other yeasts of the genus Aureobasideium Yeast, etc. may be mentioned. Further, the yeast according to the present invention may be any of sake yeast, wine yeast, brewer's yeast, yeast derived from plant flowers (rose, lily, cherry, etc.), and yeast derived from the sea.
上述の懸濁液又は抽出物を微生物により発酵させるときには、発酵工程前に、殺菌を行って発酵の障害となる雑菌を除去することが必要である。この雑菌の殺菌除去方法としては、発酵素材を予め殺菌用エタノール等で洗浄した後無菌水等の無菌溶媒に懸濁する方法を用いてもよく、又発酵素材を溶媒に懸濁した後、懸濁液を加熱殺菌等により殺菌するようにしてもよい。加熱殺菌処理としては、懸濁液を１２０～１３０℃で１０～２０分間加熱するオートクレーブ殺菌法や、８０～９０℃に６０～１２０分間保持することを１日１回２～３日間繰り返す間断殺菌法といった加熱殺菌法が一般に用いられる。 When the above-mentioned suspension or extract is fermented by microorganisms, it is necessary to perform sterilization to remove germs that hinder fermentation before the fermentation step. As a method for sterilizing and removing the germs, a method may be used in which the fermented material is previously washed with sterilizing ethanol or the like and then suspended in a sterile solvent such as sterile water, or the fermented material is suspended in the solvent and then suspended. The turbid liquid may be sterilized by heat sterilization or the like. The heat sterilization treatment includes an autoclave sterilization method in which the suspension is heated at 120 to 130 ° C. for 10 to 20 minutes, and intermittent sterilization in which the suspension is held at 80 to 90 ° C. for 60 to 120 minutes once a day for 2 to 3 days. A heat sterilization method such as a method is generally used.
無菌化した懸濁液を発酵タンクに入れ、これに微生物を植菌して発酵させる。微生物の接種量は１０７～１０８個／ｍＬが適量である。接種量が上記の範囲より多くなっても発酵の進行時間は殆ど変わらず、一方上記の範囲より少なくなると発酵完了までに長時間を要することとなって好ましくない。 The sterilized suspension is placed in a fermentation tank, in which microorganisms are inoculated and fermented. The appropriate amount of microorganisms to be inoculated is 107 to 108 cells / mL. Even if the inoculation amount is larger than the above range, the fermentation progress time is almost unchanged, while if it is smaller than the above range, it takes a long time to complete the fermentation, which is not preferable.
発酵温度は一般に５～５０℃の範囲、好ましくは各微生物の生育至適温度である２０℃～４０℃（例えば、乳酸菌であれば３０℃～４０℃、酵母であれば２５℃～３０℃）の範囲である。発酵日数は、至適温度に於いて一般に１～１０日、好ましくは２～５日の範囲である。発酵日数が上記の一般的範囲より短くなると発酵が十分に行われず発酵物の有効性が低下する傾向にあり、一方１０日を越えて長くしても有効性のそれ以上の上昇は認められないだけでなく、着色や発酵臭の増加が生ずることとなっていずれも好ましくない。 Fermentation temperature is generally in the range of 5 to 50 ° C, preferably 20 ° C to 40 ° C, which is the optimum temperature for growth of each microorganism (for example, 30 ° C to 40 ° C for lactic acid bacteria, 25 ° C to 30 ° C for yeast). Is the range of. The number of fermentation days is generally in the range of 1 to 10 days, preferably 2 to 5 days at the optimum temperature. When the number of fermentation days is shorter than the above general range, fermentation tends to be insufficient and the effectiveness of the fermented product tends to decrease, while even if it is longer than 10 days, no further increase in effectiveness is observed. Not only that, coloring and an increase in fermented odor occur, which is not preferable.
発酵物を調製する際には、対象使用部位の成分が乳酸菌又は酵母の資化源としてより有効に利用されるようにするため、それらの植菌前又は同時に前記の懸濁液又は抽出物溶液に対して、酸、アルカリ又は酵素（糖分解酵素、繊維分解酵素、タンパク質分解酵素又は脂肪分解酵素等）による加水分解処理を行ってもよい。 When preparing the fermented product, the above-mentioned suspension or extract solution before or at the same time as inoculation thereof so that the components of the target use site can be more effectively used as an assimilation source of lactic acid bacteria or yeast. May be hydrolyzed with an acid, an alkali or an enzyme (glycolytic enzyme, fiber degrading enzyme, proteolytic enzyme, lipolytic enzyme, etc.).
上述のように調製した抽出物、加水分解物又は発酵物は、一般にはｐＨを３～９に調製した上で、これをそのままの状態で使用しても良く、又減圧濃縮等により所望の濃度として使用しても良い。また、スプレードライ法等の常法により乾燥物としても良い。 The extract, hydrolyzate or fermented product prepared as described above may generally have a pH adjusted to 3 to 9 and then used as it is, or may be used as it is, or may have a desired concentration by concentration under reduced pressure or the like. May be used as. Further, it may be a dried product by a conventional method such as a spray drying method.
また、上述のように調製した抽出物、加水分解物又は発酵物は、保存安定性等を高めるために、一定時間冷蔵保存した上で、上清を使用しても良い。 Further, the extract, hydrolyzate or fermented product prepared as described above may be stored in a refrigerator for a certain period of time and then the supernatant may be used in order to improve storage stability and the like.
本発明に係る酵母培養物抽出物或いはその濃縮物又は乾燥物と上記植物発酵物を組み合わせた組成物は、皮膚外用剤（化粧料、医薬部外品、外用医薬品）に配合することができる。皮膚外用剤としては、例えば、乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉、洗顔料、ボディシャンプー、頭皮，頭髪用シャンプー、頭髪用コンディショナー、育毛，養毛用のシャンプー又はトニック、石けん等の清浄用化粧料、さらには浴剤等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The composition obtained by combining the yeast culture extract or the concentrate or dried product thereof according to the present invention with the above-mentioned fermented plant product can be blended in a skin external preparation (cosmetics, quasi-drugs, external pharmaceuticals). Examples of external skin preparations include emulsions, creams, lotions, essences, packs, lipsticks, foundations, liquid foundations, makeup press powders, cheeks, white powders, facial cleansers, body shampoos, scalp, hair shampoos, and hair conditioners. , Shampoo or tonic for hair growth and hair growth, cleansing cosmetics such as soap, and bathing agents, but the present invention is not limited thereto.
皮膚外用剤には、本発明に係る組成物の他に、皮膚外用剤に用いられる成分、例えば油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明に係る組成物の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分を組み合わせて配合することも何ら差し支えない。 In addition to the composition according to the present invention, the skin external preparation includes components used in the skin external preparation, such as oily components, surfactants (synthetic and natural products), moisturizers, thickeners, preservatives and sterilizers. Agents, powder components, ultraviolet absorbers, antioxidants, pigments, fragrances and the like can be appropriately blended as needed. Further, as long as the effectiveness and features of the composition according to the present invention are not impaired, other physiologically active ingredients may be combined and blended at all.
ここで、油性成分としては、例えば、ハス油、オリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米糠油、米胚芽油、ヤシ油、カミツレ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、ベルガモット油、ローズヒップ油、アラビアコーヒーノキ種子油、ランベンダー油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、バニラ油、植物由来スクワラン等の植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油等の動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリン等のロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン等の炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、エイコセン酸等の脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、イソオクタン酸セチル、２－エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）等の合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。 Here, examples of the oily component include lotus oil, olive oil, jojoba oil, castor oil, soybean oil, rice oil, rice bran oil, rice germ oil, palm oil, chamomile oil, palm oil, cacao oil, and meadowfoam oil. Plant-derived oils and fats such as bergamot oil, rosehip oil, Arabic coffee tree seed oil, lanbender oil, sheer butter, tea tree oil, avocado oil, macadamia nut oil, vanilla oil, and plant-derived squalane; mink oil, turtle oil, etc. Animal-derived oils and fats; waxes such as beeswax, carnauba wax, rice wax, lanolin; hydrocarbons such as liquid paraffin, vaseline, paraffin wax, squalane; myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, isostearic acid, eikosen Fatty oils such as acids; higher alcohols such as lauryl alcohol, cetanol, stearyl alcohol; isopropyl myristate, isopropyl palmitate, butyl oleate, cetyl isooctanoate, 2-ethylhexyl glyceride, higher fatty acids octyldodecyl (octyldodecyl stearate, etc.) ) Etc., synthetic esters and synthetic triglycerides and the like can be mentioned.
また、界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α－スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩等のアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級～第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２－アルキル－１－アルキル－１－ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ－ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩等のカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－アルキル－Ｎ－カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリアルキル－Ｎ－アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ－アシルアミドプロピル－Ｎ′，Ｎ′－ジメチル－Ｎ′－β－ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタイン等の両性界面活性剤等を使用することができる。 Examples of the surfactant include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, and poly. Nonionic surfactants such as oxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester; fatty acid salts, alkyl sulfates, alkylbenzene sulfonates, polyoxyethylene alkyl ether sulfates, polyoxyethylene fatty amine sulfates, polyoxy Anionic surfactants such as ethylene alkyl phenyl ether sulfate, polyoxyethylene alkyl ether phosphate, α-sulfonated fatty acid alkyl ester salt, polyoxyethylene alkyl phenyl ether phosphate; quaternary ammonium salt, primary to secondary. Tertiary fatty amine salt, trialkylbenzylammonium salt, alkylpyridinium salt, 2-alkyl-1-alkyl-1-hydroxyethylimidazolinium salt, N, N-dialkylmorphonium salt, polyethylene polyamine fatty acid amide salt, etc. Cationic surfactants; N, N-dimethyl-N-alkyl-N-carboxymethylammoniobetaine, N, N, N-trialkyl-N-alkylene ammoniocarboxybetaine, N-acylamidepropyl-N', N An amphoteric surfactant such as'-dimethyl-N'-β-hydroxypropylammoniosulfobetaine can be used.
また、乳化剤又は乳化助剤としては、酵素処理ステビア等のステビア誘導体、サポニン又はその誘導体、カゼイン又はその塩（ナトリウム等）、糖と蛋白質の複合体、ショ糖又はそのエステル、ラクトース、大豆由来の水溶性多糖、大豆由来蛋白質と多糖の複合体、ラノリン又はその誘導体、コレステロール、ステビア誘導体（ステビア酵素発酵物等）、ケイ酸塩（アルミニウム、マグネシウム等）、炭酸塩（カルシウム、ナトリウム等）、サポニン及びその誘導体、レシチン及びその誘導体（水素添加レシチン等）、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀等）等を配合することもできる。 The emulsifier or emulsifying aid is derived from a stevia derivative such as enzyme-treated stevia, saponin or a derivative thereof, casein or a salt thereof (sodium or the like), a complex of sugar and protein, sucrose or an ester thereof, lactose, and soybean. Water-soluble polysaccharide, complex of soybean-derived protein and polysaccharide, lanolin or its derivative, cholesterol, stevia derivative (stevia enzyme fermented product, etc.), silicate (aluminum, magnesium, etc.), carbonate (calcium, sodium, etc.), saponin And its derivatives, lecithin and its derivatives (hydrogenated lecithin, etc.), lactic acid bacteria fermented rice, lactic acid bacteria fermented sprouted rice, lactic acid bacteria fermented grains (wheat, beans, miscellaneous grains, etc.) and the like can also be blended.
また、保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体液等があり、さらにトレハロース等の糖類、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体等）、チューベロース多糖体、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、ＮＭＦ関連物質、加水分解コンキオリン、加水分解シルク、スフィンゴモナス培養物、スフィンゴ糖脂質、セラミド、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、海藻抽出物、柑橘系由来のフラボノイド又はその配糖体、シラン根（白及）抽出物、各種アミノ酸及びそれらの誘導体が挙げられる。 Examples of the moisturizing agent include glycerin, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, polyethylene glycol, sorbitol, xylitol, sodium pyrrolidone carboxylate, and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine / butyl methacrylate copolymer solution. Etc., saccharides such as trehalose, mucopolysaccharides (eg, hyaluronic acid and its derivatives, chondroitin and its derivatives, heparin and its derivatives, etc.), tuberose polysaccharides, elastin and its derivatives, collagen and its derivatives, NMF-related Substances, hydrolyzed conchiolin, hydrolyzed silk, spingomonas culture, spingoglycolipid, ceramide, lactic acid, urea, higher fatty acid octyldodecyl, seaweed extract, citrus-derived flavonoid or its glycoside, silane root (white and white) ) Extracts, various amino acids and derivatives thereof.
また、増粘剤としては、例えば、アルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン等の褐藻、緑藻又は紅藻由来成分；シラン根（白及）抽出物；ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体、アルカリゲネス産生多糖体等の多糖類；キサンタンガム、トラガントガム、ローストビーンガム、グアーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、マスチック樹脂、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体；ポリグルタミン酸及びその誘導体等が挙げられる。 Examples of the thickener include brown algae such as alginic acid, agar, carrageenan, and fucoidan, components derived from green algae or red algae; silane root (white and) extract; pectin, locust bean gum, aloe polysaccharide, and alkaligenes-producing polysaccharide. Polysaccharides such as body; gums such as xanthan gum, tragant gum, roast bean gum, guar gum; cellulose derivatives such as carboxymethyl cellulose and hydroxyethyl cellulose; polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, mastic resin, alginic acid / methacrylic acid co-weight Examples thereof include synthetic polymers such as coalescence; hyaluronic acid and its derivatives; polyglutamic acid and its derivatives, and the like.
また、防腐・殺菌剤としては、例えば、尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャマール（イミダゾデイニールウレア）、ポリリン酸、プロパンジオール、１，２－ペンタンジオール、各種精油類、樹皮乾留物、大根発酵液、サトウキビ等の植物由来のエタノール又は１，３－ブチレングリコール等がある。 Examples of antiseptic / bactericidal agents include urea; paraoxybenzoic acid esters such as methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, and butyl paraoxybenzoate; phenoxyethanol, dichlorophene, hexachlorophene, and chlorhexidine hydrochloride. , Benzalconium chloride, salicylic acid, ethanol, undecylenic acid, phenols, jamar (imidazodeini ruurea), polyphosphate, propanediol, 1,2-pentanediol, various essential oils, dried bark, radish fermented liquid, sugar cane Etc., such as plant-derived ethanol or 1,3-butylene glycol.
また、粉体成分としては、例えば、セリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビ等）のパウダー、豆類（大豆、小豆等）のパウダー等がある。 The powder components include, for example, sericite, titanium oxide, talc, kaolin, bentonite, zinc oxide, magnesium carbonate, magnesium oxide, zirconium oxide, barium sulfate, silicic acid anhydride, mica, nylon powder, polyethylene powder, and silk. There are powders, cellulose-based powders, grains (rice, wheat, corn, millet, etc.) powders, beans (soybeans, red beans, etc.) powders, and the like.
また、紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２－エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４－ジヒドロキシベンゾフェノン、２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン－５－スルホン酸塩、４－ターシャリーブチル－４－メトキシベンゾイルメタン、２－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。 Examples of the ultraviolet absorber include ethyl paraaminobenzoate, ethylhexyl paradimethylaminobenzoate, amyl salicylate and its derivatives, 2-ethylhexyl paramethoxycinnamate, octyl silicate, oxybenzoyl, 2,4-dihydroxybenzophenone, and 2-. Hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonate, 4-tertiary butyl-4-methoxybenzoylmethane, 2- (2-hydroxy-5-methylphenyl) benzotriazole, urocanic acid, ethyl urocanate, aloe extract And so on.
また、消泡剤とは、例えば、エタノール、イソプロパノール、ジシロキサン、ジメチルポリシクロサン、ジメチコンケイ酸シリカ、トリシロキサン、シリル化シリカ、ジメチコン、トリメチルシロキシケイ酸、ＤＰＧイソボルニルエーテル等がある。 Examples of the defoaming agent include ethanol, isopropanol, disiloxane, dimethylpolycyclosan, silica dimethicone silicate, trisiloxane, silylated silica, dimethicone, trimethylsiloxysilicic acid, DPG isobornyl ether and the like.
また、抗酸化剤としては、例えば、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ムラサキシキブの抽出物、シラン根の抽出物、シャクヤク抽出物、ビタミンＥ及びその誘導体（例えば、ビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等）等がある。 Examples of antioxidants include butylhydroxyanisole, butylhydroxytoluene, propyl gallate, beautyberry extract, silane root extract, shakuyaku extract, vitamin E and its derivatives (eg, vitamin E nicotinate, vitamin). E-renolate, etc.).
また、キレート剤としては、例えば、エチレンジアミンヒドロキシエチル三酢酸三ナトリウム、エデト酸又はその塩類、グルコン酸、フィチン酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、ヒドロキシエタンジホスホン酸四ナトリウム等がある。 Examples of the chelating agent include ethylenediamine hydroxyethyl triacetate trisodium, edetonic acid or salts thereof, gluconic acid, phytic acid, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, tetrasodium hydroxyetane diphosphonate and the like.
また、ｐＨ調整剤としては、例えば、クエン酸又はその塩類、乳酸又はその塩類、グリコール酸、コハク酸、塩酸、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等がある。 Examples of the pH adjuster include citric acid or salts thereof, lactic acid or salts thereof, glycolic acid, succinic acid, hydrochloric acid, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, sodium hydroxide, potassium hydroxide and the like.
次に、製造例、試験例及び実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下において、部はすべて重量部を、また、％はすべて重量％を意味する。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to Production Examples, Test Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto. In the following, all parts mean parts by weight, and% means all parts by weight.
製造例１．酵母培養物抽出物の調製（１）
滅菌したＧＰ液体培地2700gに、予め同培地で培養しておいたササユリ由来の酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）の前培養液300gを添加し、30℃で通気しながら24時間培養した培養した。加熱殺菌した後、水酸化ナトリウム水溶液でpH8.5に調整し、3時間、攪拌しながら90℃で加熱処理した。この液をpH調整した後、濾過し1610gの酵母培養液抽出物を得た（固形分濃度1.13％）。
Production example 1. Preparation of yeast culture extract (1)
To 2700 g of sterilized GP liquid medium, 300 g of a preculture solution of yeast derived from Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae) previously cultured in the same medium was added, and the cells were cultured for 24 hours while aerating at 30 ° C. After heat sterilization, the pH was adjusted to 8.5 with an aqueous sodium hydroxide solution, and the mixture was heat-treated at 90 ° C. with stirring for 3 hours. After adjusting the pH of this solution, it was filtered to obtain 1610 g of yeast culture solution extract (solid content concentration 1.13%).
製造例２．酵母培養物抽出物の調製（２）
滅菌したＧＰ液体培地2700gに、予め同培地で培養しておいたササユリ由来の酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）の前培養液300g添加し、30℃で通気しながら24時間培養した。加熱殺菌した後、塩酸水溶液でpH2.5に調整し、3時間、攪拌しながら90℃で加熱処理した。この液をpH調整した後、濾過し1215gの酵母培養液抽出物を得た（固形分濃度1.07％）。
Production example 2. Preparation of yeast culture extract (2)
To 2700 g of sterilized GP liquid medium, 300 g of a preculture solution of yeast derived from Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae) previously cultured in the same medium was added, and the cells were cultured for 24 hours while aerating at 30 ° C. After heat sterilization, the pH was adjusted to 2.5 with an aqueous hydrochloric acid solution, and the mixture was heat-treated at 90 ° C. with stirring for 3 hours. After adjusting the pH of this solution, it was filtered to obtain 1215 g of yeast culture solution extract (solid content concentration 1.07%).
製造例３．酵母培養物抽出物の調製（３）
滅菌したＧＰ液体培地2700gに、予め同培地で培養しておいたササユリ由来の酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）の前培養液300g添加し、30℃で通気しながら24時間培養した。加熱殺菌した後、3時間、90℃で加熱処理した。この液をpH調整した後、濾過し1540gの酵母培養液抽出物を得た（固形分濃度0.62％）。
Production example 3. Preparation of yeast culture extract (3)
To 2700 g of a sterilized GP liquid medium, 300 g of a preculture solution of Sasayuri-derived yeast (Saccharomyces cerevisiae) previously cultivated in the same medium was added, and the mixture was cultured at 30 ° C. for 24 hours while being aerated. After heat sterilization, it was heat-treated at 90 ° C. for 3 hours. After adjusting the pH of this solution, it was filtered to obtain 1540 g of yeast culture solution extract (solid content concentration 0.62%).
製造例４．酵母培養物抽出物の調製（４）
製造例１で示した方法で作製した酵母培養液抽出物を濃縮し、酵母培養液抽出物粉末を17g得た。これに水を少量加え溶解した後、少量のエタノール、及びD-マンニット833gを加え、撹拌しながら真空乾燥し、D-マンニット賦形化酵母培養液抽出物粉末850gを得た。
Production example 4. Preparation of yeast culture extract (4)
The yeast culture solution extract prepared by the method shown in Production Example 1 was concentrated to obtain 17 g of yeast culture solution extract powder. A small amount of water was added to the solution to dissolve it, and then a small amount of ethanol and 833 g of D-mannitol were added and dried under vacuum with stirring to obtain 850 g of the D-mannitol-formed yeast culture solution extract powder.
製造例５．ハス種子発酵物
ハスの種子（渋皮を除去したもの）100gを粉砕し、精製水1900gを加えて懸濁液を調製し、加熱殺菌した。この懸濁液に乳酸菌（ラクトバチルス プランタラム）を108個／ｍＬ接種し、窒素気流下に37℃で3日間静置培養した。培養終了後加熱殺菌し、培養液をろ過して、ハス種子の乳酸菌発酵物溶液1415g（固形分濃度2.53％）を得た。
Production example 5. Fermented lotus seeds 100 g of lotus seeds (without astringent skin) were crushed, 1900 g of purified water was added to prepare a suspension, and the suspension was sterilized by heating. This suspension was inoculated with lactic acid bacteria (Lactobacillus plantarum) at 108 cells / mL and statically cultured at 37 ° C for 3 days under a nitrogen stream. After the culture was completed, the cells were sterilized by heating, and the culture solution was filtered to obtain 1415 g (solid content concentration 2.53%) of a fermented lactic acid bacterium solution of lotus seeds.
製造例６．ヤブカンゾウ花発酵物
ヤブカンゾウの花部（蕾及び花弁を含む）の細切物150gに精製水1500gを加えて混合し、40℃で3時間抽出処理を行った。次に、抽出懸濁液を加熱殺菌後、酵母（サッカロミセス セレビシエ）を108個／ｍＬ接種し、窒素気流下に30℃で3日間静置培養した。培養終了後加熱殺菌し、培養液をろ過して、脱臭、脱色処理を行い、褐色透明の酵母発酵物溶液1110g（固形分濃度4.0％）を得た。これを精製水で3倍に希釈し、酵母発酵物溶液とした。
Production example 6. Fermented Yabukanzo flower 1500 g of purified water was added to 150 g of shredded Yabukanzo flower parts (including buds and petals), mixed, and extracted at 40 ° C for 3 hours. Next, the extract suspension was sterilized by heating, inoculated with 10 8 yeasts (Saccharomyces cerevisiae) / mL, and statically cultured at 30 ° C. for 3 days under a nitrogen stream. After completion of the culture, the cells were sterilized by heating, the culture solution was filtered, and deodorized and decolorized to obtain 1110 g (solid content concentration 4.0%) of a brown transparent yeast fermented product solution. This was diluted 3-fold with purified water to obtain a yeast fermented product solution.
実施例１．組成物の調製
製造例１の抽出物溶液、製造例５の発酵物溶液及び製造例６の発酵物溶液を等量混合後、不溶物を濾過し、褐色透明の抽出物溶液混合溶液2920ｇを得た（固形分濃度2.53％）。
Example 1. Preparation of composition After mixing equal amounts of the extract solution of Production Example 1, the fermented solution of Production Example 5 and the fermented solution of Production Example 6, the insoluble material is filtered to obtain 2920 g of a brown transparent extract solution mixed solution. (Solid content concentration 2.53%).
上述のように調整した実施例１に係る組成物を本発明試料１として以下の通り有効性を評価した。また、本発明試料１の比較試料として、製造例１の酵母培養抽出物を比較試料１として、製造例５のハス種子発酵物を比較試料２として、製造例６のヤブカンゾウ花部の発酵物を比較試料３として使用した。 The composition according to Example 1 adjusted as described above was used as the sample 1 of the present invention, and its effectiveness was evaluated as follows. Further, as a comparative sample of the sample 1 of the present invention, the yeast culture extract of the production example 1 was used as the comparative sample 1, the fermented hass seed of the production example 5 was used as the comparative sample 2, and the fermented product of the flower part of the elephant elephant of the production example 6 was used. It was used as a comparative sample 3.
試験例１．表皮細胞ＳＣＦ合成抑制効果
正常ヒト皮膚由来表皮細胞（NHEK）を、HuMedia KG2培地（クラボウ社製）を入れた９６穴マイクロプレートに8×103個／穴播種し、37℃，5.0％CO2の条件下に１日間プレ培養した後、試料溶液として本発明試料１、比較試料１～３を含むHuMedia KG2培地を添加した。ここで、各試料の濃度は培地中の溶液としての終濃度が1.2％となるように調整した。その後、培養器底面からＵＶ－Ｂランプ（Philips社製TL20W/12RS）を用いて約10mJ/cm2の紫外線照射を行い、同条件でさらに２日間培養した。
細胞膜上に発現したＳＣＦの判定は以下の様にして行った。すなわち、培養上清を除去・洗浄後、細胞を固定し、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）ラベルされた抗ＳＣＦ抗体を用いて細胞膜表面上のＳＣＦの検出を行った。検出結果は、基質とＨＲＰの反応によって得られた反応溶液の450nmにおける吸光度を測定し、ＳＣＦ量とした。また、比較のために、上記試料溶液を含まない培地で細胞を培養したコントロール区も設定し、紫外線照射したコントロール（ＵＶ照射control）と、ＵＶ未照射のコントロール（ＵＶ未照射control）についても、ＳＣＦ量を測定した。結果は、ＵＶ照射コントロールでのＳＣＦ値を100％として相対値で示した。
Test example 1. Epidermal SCF synthesis inhibitory effect Normal human skin-derived epidermal cells (NHEK) were seeded in 96-well microplates containing HuMedia KG2 medium (manufactured by Kurabo) at 8 × 10 3 pieces / hole, 37 ° C, 5.0% CO 2 After pre-culturing for 1 day under the above conditions, HuMedia KG2 medium containing Sample 1 of the present invention and Comparative Samples 1 to 3 was added as a sample solution. Here, the concentration of each sample was adjusted so that the final concentration of the solution in the medium was 1.2%. Then, from the bottom of the incubator, ultraviolet irradiation of about 10 mJ / cm 2 was performed using a UV-B lamp (TL20W / 12RS manufactured by Philips), and the cells were cultured under the same conditions for another 2 days.
The SCF expressed on the cell membrane was determined as follows. That is, after removing and washing the culture supernatant, the cells were fixed, and SCF on the cell membrane surface was detected using an anti-SCF antibody labeled with HRP (horseradish peroxidase). As the detection result, the absorbance of the reaction solution obtained by the reaction between the substrate and HRP at 450 nm was measured and used as the amount of SCF. In addition, for comparison, a control group in which cells were cultured in a medium not containing the above sample solution was also set, and the control irradiated with ultraviolet rays (UV irradiation control) and the control not irradiated with UV (UV unirradiated control) were also set. The amount of SCF was measured. The results are shown as relative values with the SCF value in UV irradiation control as 100%.
試験例1の結果を図１に示す。
図１に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、比較試料１～３と比較して、格段にすぐれたＳＣＦ合成抑制効果を有することが確認された。ＳＣＦは表皮細胞の表面で発現するタンパク質であり、これがメラノサイトの受容体と結合するとメラニンの合成が促進されることから、本発明に係る組成物はＳＣＦ合成を抑制することで、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。
The results of Test Example 1 are shown in FIG.
As shown in FIG. 1, it was confirmed that the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) has a significantly superior effect of suppressing SCF synthesis as compared with Comparative Samples 1 to 3. SCF is a protein expressed on the surface of epidermal cells, and when it binds to a melanocyte receptor, melanin synthesis is promoted. Therefore, the composition according to the present invention is remarkably excellent by suppressing SCF synthesis. It is suggested that it exerts a whitening effect.
試験例２．プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）抑制効果試験
正常ヒト表皮細胞（NHEK）を、専用培地Humedia-KG2（クラボウ社製）に懸濁して96ウェルプレートに4×103個／穴播種し、37℃で１日間培養した後、培地に本発明に係る組成物（本発明試料１）を試料溶液として、当該培地の全量に対して溶液としての最終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるように添加し、さらに24時間培養した。次に培養器の底面から100ｍJ／cm2の紫外線Ｂ波を照射し、さらに２日間培養後、培養上清に分泌されたＰＧＥ２の量を、ＰＧＥ２測定キット（カイマンケイミカル社製）を用いて測定した。なお、比較のために、上記試料溶液に代えてＰＢＳ（－）を添加し、かつ、紫外線を照射したコントロール（ＵＶ照射control）と、上記試料溶液に代えてＰＢＳ（－）を添加し、かつ、紫外線を照射しない未照射コントロール（ＵＶ未照射control）も設定した。試験結果の値は、ＵＶ照射controlでのＰＥＧ２量を100としたときのＵＶ未照射control区と各試料添加区でのＰＥＧ２量の相対値を求め、各値をＰＧＥ２合成率（％）とした。
Test example 2. Prostaglandin E2 (PGE2) inhibitory effect test Normal human epidermal cells (NHEK) were suspended in a special medium Humedia-KG2 (manufactured by Kurabo) and seeded in 96-well plates at 4 × 10 3 cells / hole at 37 ° C. After culturing for 1 day, the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) was used as a sample solution in a medium, and the final concentration as a solution was 0.3%, 0.45%, 0.6%, 0.9%, based on the total amount of the medium. It was added to 1.2% and cultured for another 24 hours. Next, the bottom surface of the incubator was irradiated with an ultraviolet B wave of 100 mJ / cm 2 , and after further culturing for 2 days, the amount of PGE2 secreted into the culture supernatant was measured using a PGE2 measurement kit (manufactured by Kaiman Keimical Co., Ltd.). It was measured. For comparison, PBS (-) was added in place of the sample solution, and a control irradiated with ultraviolet rays (UV irradiation control) and PBS (-) were added in place of the sample solution. , A non-irradiation control that does not irradiate ultraviolet rays (UV non-irradiation control) was also set. For the value of the test result, the relative value of the PEG2 amount in the UV unirradiated control group and each sample addition group when the PEG2 amount in the UV irradiation control was 100 was obtained, and each value was taken as the PGE2 synthesis rate (%). ..
試験例２の結果を図２に示す。
図２に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたプロスタグランジンＥ２抑制効果を有することが確認された。プロスタグランジンは、色素細胞におけるメラニンの合成を刺激する炎症因子であることから、本発明に係る組成物は、プロスタグランジンＥ２を抑制することで、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。
The results of Test Example 2 are shown in FIG.
As shown in FIG. 2, it was confirmed that the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) has a remarkably excellent prostaglandin E2 inhibitory effect in a concentration-dependent manner. Since prostaglandin is an inflammatory factor that stimulates the synthesis of melanin in pigment cells, the composition according to the present invention can exert a remarkably excellent whitening effect by suppressing prostaglandin E2. It is suggested.
試験例３．チロシナーゼ活性抑制試験
正常ケラチノサイトNHEKを、Humedia KG2培地（クラボウ社製）を入れた24ウェルプレートに6×104個／穴播種し、翌日上清をＰＢＳ(－)に交換して紫外線照射（50mJ/cm2）を行った。紫外線照射後、上清をHumedia KB2培地（クラボウ社製）に交換し、培養を継続した。次に培養１日後の培養上清を分取した（紫外線照射上清）。また、比較として紫外線照射を行わない区を設定し、その他の操作は同様に行った区の培養上清も分取しておいた（紫外線未照射上清）。
一方、正常メラノサイトNHEMを、DermaLife培地（クラボウ社社製）を入れた96穴マイクロプレートに5×103個／穴播種し、37℃，5.0％CO2の条件下に１日間プレ培養した後、本発明に係る組成物（本発明試料１）を試料溶液として、当該培地の全量に対して溶液としての最終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるように添加し、さらに上記ケラチノサイトの紫外線照射上清も添加した。３日間培養後上清を捨て、ＰＢＳ(－)で1回洗浄後、界面活性剤（Triton X-100）と5mM Ｌ－ドーパ溶液を添加して37℃で反応を行った後、マイクロプレートリーダー（Model 450、バイオラッド社製）を用い、波長490nmでドーパ値を測定した。なお、比較のために、上記試料溶液に代えてＰＢＳ（－）を添加し、かつ、紫外線を照射した上清を用いるコントロール（ＵＶ照射control）と、上記試料溶液に代えてＰＢＳ（－）を添加し、かつ、紫外線未照射の上清を使用するコントロール（ＵＶ未照射control）も設定した。試験結果の値は、ＵＶ照射controlでドーパ値を１００としたときのＵＶ未照射control区と各試料添加区でのドーパ値の相対値を求め、各値をチロシナーゼ活性率（％）とした。
Test example 3. Tyrosinase activity suppression test Normal keratinocyte NHEK was seeded in 6 × 10 4 pieces / hole on a 24-well plate containing Humedia KG2 medium (manufactured by Kurabo Industries Ltd.), and the next day, the supernatant was replaced with PBS (-) and irradiated with ultraviolet light (50 mJ). / cm 2 ) was performed. After irradiation with ultraviolet rays, the supernatant was replaced with Humedia KB2 medium (manufactured by Kurabo Industries Ltd.), and the culture was continued. Next, the culture supernatant one day after the culture was separated (ultraviolet irradiation supernatant). In addition, as a comparison, a group not irradiated with ultraviolet rays was set, and the culture supernatants of the groups performed in the same manner for other operations were also separated (ultraviolet unirradiated supernatant).
On the other hand, normal melanocyte NHEM was seeded in 5 × 10 3 pieces / hole on a 96-well microplate containing DermaLife medium (manufactured by Kurabo), and pre-cultured under the conditions of 37 ° C and 5.0% CO 2 for 1 day. , The composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) was added as a sample solution so that the final concentration as a solution was 0.3%, 0.45%, 0.6%, 0.9%, 1.2% with respect to the total amount of the medium. Further, the ultraviolet irradiation supernatant of the above-mentioned keratinocyte was also added. After culturing for 3 days, discard the supernatant, wash once with PBS (-), add detergent (Triton X-100) and 5 mM L-dopa solution, react at 37 ° C, and then microplate reader. The dopa value was measured at a wavelength of 490 nm using (Model 450, manufactured by Biorad). For comparison, a control (UV irradiation control) in which PBS (-) was added instead of the sample solution and the supernatant was irradiated with ultraviolet rays, and PBS (-) was used instead of the sample solution. A control (UV unirradiated control) was also set in which the supernatant was added and was not irradiated with ultraviolet rays. As the value of the test result, the relative value of the dopa value in the UV unirradiated control group and each sample addition group when the dopa value was set to 100 by the UV irradiation control was obtained, and each value was taken as the tyrosinase activity rate (%).
試験例３の結果を図３に示す。
図３に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたチロシナーゼ活性抑制効果を有することが確認されたことから、本発明に係る組成物組成物は、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。
The results of Test Example 3 are shown in FIG.
As shown in FIG. 3, it was confirmed that the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) has a significantly excellent effect of suppressing tyrosinase activity in a concentration-dependent manner. Therefore, the composition composition according to the present invention. It is suggested that the object exerts a remarkably excellent whitening effect.
試験例４．遺伝子解析
線維芽細胞NB1RGBを２４ウェルプレートに6×104個／穴播種した。24時間培養後、本発明に係る組成物（本発明試料１）を試料溶液として添加し、底面より紫外線照射を行った。さらに２４時間培養を行った。ここで、本発明試料１は、溶液としての最終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるように添加した。その後、それぞれの試験区の細胞をＴｒｉｚｏｌ試薬（Invitrogen社製）500μLで回収した。回収した細胞に対してクロロホルム100μL添加して撹拌混合し12,500rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離した後、水層のみを200μL分取した。回収した水層にイソプロパノール250μLを添加して撹拌混合し、12,500rpm、4℃の条件下で10分間遠心分離してtotalＲＮＡの沈殿物を得た。totalＲＮＡに75％冷エタノールを1mL添加して撹拌して洗浄し、12,500rpm、4℃条件下で10分間遠心分離して沈殿を回収した。回収したtotal ＲＮＡを所定のキット（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Erase (Perfect Real Time)（タカラバイオ社製））を用いて逆転写反応し、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをサンプルとして、Thermal Cycler Dice Real Time System Single（タカラバイオ社製）、及びＳＹＢＲ Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)［タカラバイオ社製］を用いて、ターゲット遺伝子の発現と、内部標準物質βアクチン遺伝子の発現の検出を行った。試験結果は、βアクチン遺伝子の発現量に対するターゲット遺伝子の相対発現量を算出した。本試験例４では、ヘパラン硫酸プロテオグリカン遺伝子（HSPG）の発現と、Hepatocyte Growth Factor (HGF)遺伝子の発現を評価した。
Test example 4. Genetic analysis Fibroblast NB1 RGB was seeded on a 24-well plate at 6 × 10 4 cells / hole. After culturing for 24 hours, the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) was added as a sample solution, and ultraviolet irradiation was performed from the bottom surface. Incubation was further carried out for 24 hours. Here, the sample 1 of the present invention was added so that the final concentration as a solution was 0.3%, 0.45%, 0.6%, 0.9%, 1.2%. Then, the cells of each test group were collected with 500 μL of Trizol reagent (manufactured by Invitrogen). After adding 100 μL of chloroform to the collected cells, stirring and mixing, and centrifuging under the conditions of 12,500 rpm and 4 ° C. for 15 minutes, 200 μL of the aqueous layer alone was taken. 250 μL of isopropanol was added to the recovered aqueous layer, and the mixture was stirred and mixed, and centrifuged at 12,500 rpm and 4 ° C. for 10 minutes to obtain a total RNA precipitate. 1 mL of 75% cold ethanol was added to the total RNA, stirred and washed, and the precipitate was collected by centrifugation at 12,500 rpm for 10 minutes at 4 ° C. The recovered total RNA was reverse-transcribed using a predetermined kit (PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Erase (Perfect Real Time) (manufactured by Takara Bio Inc.)) to synthesize cDNA. Using the synthesized cDNA as a sample, the expression of the target gene and the internal standard using Thermal Cycler Dice Real Time System Single (manufactured by Takara Bio Inc.) and SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time) [manufactured by Takara Bio Inc.] The expression of the substance β-actin gene was detected. From the test results, the relative expression level of the target gene to the expression level of the β-actin gene was calculated. In Test Example 4, the expression of the heparan sulfate proteoglycan gene (HSPG) and the expression of the hepatocyte growth factor (HGF) gene were evaluated.
試験例４の結果を図４と図５に示す。
図４に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、紫外線によって発現低下するHSPG遺伝子に対して、濃度依存的に格段にすぐれたＨＳＰＧ遺伝子の発現亢進効果を有することが確認された。ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、真皮からのメラニン合成刺激物質をブロックする役割が知られていることから、本発明に係る組成物組成物は、ＨＳＰＧ遺伝子の発現を亢進することで、基底膜を健全に保ち、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。
The results of Test Example 4 are shown in FIGS. 4 and 5.
As shown in FIG. 4, the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) has a significantly superior effect of enhancing the expression of the HSPG gene on the HSPG gene whose expression is decreased by ultraviolet rays, depending on the concentration. confirmed. Since heparan sulfate proteoglycan (HSPG) is known to have a role of blocking melanin synthesis stimulants from the dermis, the composition composition according to the present invention has a basement membrane by enhancing the expression of the HSPG gene. It is suggested that it keeps healthy and exerts a remarkably excellent whitening effect.
また、図５に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたＨＧＦ遺伝子発現抑制効果を有することが確認された。ＨＧＦはメラニン合成刺激物質であることから、本発明に係る組成物組成物は、ＨＧＦ遺伝子の発現を抑制することで、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。 Further, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) has a significantly excellent effect of suppressing HGF gene expression in a concentration-dependent manner. Since HGF is a melanin synthesis stimulant, it is suggested that the composition composition according to the present invention exerts a remarkably excellent whitening effect by suppressing the expression of the HGF gene.
試験例５．ＳＯＤ様作用の評価試験
1Mトリス－塩酸緩衝液0.15mL、1mM エチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩溶液0.30mL、1mM キサンチン溶液0.30mL、0.75mM ニトロブル-テトラゾリウム溶液0.20mL、本発明に係る組成物（本発明試料１）0.10mL及び精製水1.90mLを混合して試験溶液を調製した。本発明試料１の濃度は、試験溶液中の溶液としての終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるように調製した。また、試験溶液において、本発明試料１に代えて30％ 1,3－ブチレングリコール0.10mLを用いる他は上記試験溶液と同様の組成からなる混合液（コントロール）を調製した。又試験液において本発明試料１（0.10mL）に代えて、0.875Unit／mLのスーパーオキシドジスムターゼ溶液0.10mLを用いる他は上記試験溶液と同様の組成からなる混合液（陽性対照）を調製した。
上記試験溶液、又は試料無添加の混合液をそれぞれ37℃でインキュベートした後、これに1Unit／mL キサンチンオキシダーゼ溶液0.05mLを添加し、一定時間経過後（５分）、各被験液の570nmにおける吸光度（被験液中のスーパーオキシドアニオン量の指標）を測定した。結果は、コントロールの混合液の吸光度を100とした時の各試験溶液の吸光度の相対値（％）で示した。
Test example 5. Evaluation test of SOD-like action
1M Tris-hydrochloric acid buffer 0.15mL, 1mM ethylenediamine tetraacetic acid / disodium salt solution 0.30mL, 1mM xanthin solution 0.30mL, 0.75mM nitroble-tetrazolium solution 0.20mL, composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) 0.10mL And 1.90 mL of purified water were mixed to prepare a test solution. The concentration of the sample 1 of the present invention was adjusted so that the final concentration as a solution in the test solution was 0.3%, 0.45%, 0.6%, 0.9%, 1.2%. Further, in the test solution, a mixed solution (control) having the same composition as the above test solution was prepared except that 30% 1,3-butylene glycol 0.10 mL was used instead of the sample 1 of the present invention. A mixed solution (positive control) having the same composition as the above test solution was prepared except that 0.10 mL of 0.875 Unit / mL superoxide dismutase solution was used in place of the sample 1 (0.10 mL) of the present invention.
After incubating the above test solution or the mixed solution without sample added at 37 ° C, 0.05 mL of 1 Unit / mL xanthine oxidase solution is added thereto, and after a certain period of time (5 minutes), the absorbance of each test solution at 570 nm. (Index of the amount of superoxide anion in the test solution) was measured. The results are shown by the relative value (%) of the absorbance of each test solution when the absorbance of the control mixture is 100.
試験例５の結果を図６に示す。
図６に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたＳＯＤ様活性を有することが確認された。
The results of Test Example 5 are shown in FIG.
As shown in FIG. 6, it was confirmed that the composition according to the present invention (sample 1 of the present invention) has significantly excellent SOD-like activity in a concentration-dependent manner.
試験例６．糖化抑制効果の評価試験
本試験では、グルコースを介したＢＳＡ（アルブミン）の蛍光の発生により、ＡＧＥの発生抑制効果、すなわち、タンパク質糖化抑制効果を評価した。まず、本発明に係る組成物（本発明試料１）40μLと、50mg／mLのＢＳＡ水溶液40μLと、2.5Ｍのグルコース水溶液40μLと、ＰＢＳ（－）溶液80μLを混合、攪拌して試料溶液を調製した。試料溶液は本発明試料１の終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるようにとなるよう調製した。次に、試料溶液を50℃で7日間静置し、7日後、各試料溶液について、蛍光発生（励起：355nm、放射：460nm：蛍光マイクロプレートリーダー（フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製））を測定した。また、本発明試料１に代えて30％の1,3－ブチレングリコール溶液を用いた試料無添加（コントロール）の場合について同様の操作を行い、ここで得られた蛍光測定値に対する各試料溶液の蛍光測定値の相対値（％）を求め、タンパク質糖化率（％）とした。
Test Example 6. Evaluation test of glycation inhibitory effect In this test, the AGE generation inhibitory effect, that is, the protein glycation inhibitory effect was evaluated by the generation of BSA (albumin) fluorescence mediated by glucose. First, 40 μL of the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention), 40 μL of a 50 mg / mL BSA aqueous solution, 40 μL of a 2.5 M glucose aqueous solution, and 80 μL of a PBS (-) solution are mixed and stirred to prepare a sample solution. did. The sample solution was prepared so that the final concentration of the sample 1 of the present invention was 0.3%, 0.45%, 0.6%, 0.9%, and 1.2%. Next, the sample solution was allowed to stand at 50 ° C. for 7 days, and after 7 days, fluorescence was generated for each sample solution (excitation: 355 nm, radiation: 460 nm: fluorescent microplate reader (Fluoroscan Ascent, manufactured by Thermo Fisher Scientific)). Was measured. Further, the same operation was performed in the case of no sample addition (control) using a 30% 1,3-butylene glycol solution instead of the sample 1 of the present invention, and each sample solution with respect to the fluorescence measured value obtained here was subjected to the same operation. The relative value (%) of the fluorescence measurement value was obtained and used as the protein saccharification rate (%).
試験例６の結果を図７に示す。
図７に示す通り、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれた糖化抑制効果を有することが確認された。
The results of Test Example 6 are shown in FIG.
As shown in FIG. 7, it was confirmed that the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) has a remarkably excellent saccharification inhibitory effect in a concentration-dependent manner.
試験例７．メラノサイトのETBR合成抑制効果の評価試験
試験例７では、メラノサイトの刺激因子として知られるエンドセリン-1（ET-1）の受容体であるETBRの合成抑制効果を評価する。
正常ヒト表皮メラニン細胞を増殖添加剤含有DermaLife(登録商標)[クラボウ社製]にて96穴マイクロプレートに1×104個/穴播種し、37℃，5.0％CO2の条件下に１日間プレ培養した後、本発明に係る組成物（本発明試料１）を規定の濃度（溶液としての終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％）となるように調整した(登録商標)[クラボウ社製]を添加した。その後、培養器底面からUV-Bランプ（Philips社製TL20W/12RS）を用いて約15ｍJ/cm2の紫外線照射を行った。その後同条件でさらに2日間培養した。その後ETBR抗体を用いた免疫的検出を行った。すなわち、PBS(-)洗浄後、15％中性緩衝ホルマリン液を用いて細胞を30分処理して固定、0.2％Triton X-100溶液で1時間浸透処理、5倍希釈ブロッキングワンP（ナカライテスク社）溶液で2時間処理によるブロッキングを行った後、ETBR抗体を添加し、4℃で一昼夜静置した。その後PBS(-)洗浄し、蛍光ラベルした二次抗体を添加してさらに暗所で一定時間静置した。そのPBS(-)後洗浄し、蛍光強度の測定を行った。先ず二次抗体の蛍光ラベル（Alexa Fluor546）をEx=544nm、Em=590nmで測定し（蛍光マイクロプレートリーダー（フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製））、その後、Hoechst33342によるDNA染色を行い、Ex=355nm、Em=460nmの測定を行った。それぞれの試験区のAlexa Fluor546の蛍光強度をHoechst33342の蛍光強度で割ることで、ETBRの生成度合いを求めた。試料溶液に代えてPBS(-)を添加した試料無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作を行い、紫外線照射した区のETBR生成度合いに対する各試料添加時のETBR生成度合いの相対値を求め、ETBR生成量（％）とした。
Test Example 7. Evaluation test of ETBR synthesis inhibitory effect of melanocytes In Test Example 7, the synthesis inhibitory effect of ETBR, which is a receptor for endothelin-1 (ET-1) known as a stimulator of melanocytes, is evaluated.
Normal human epidermal melanocytes were seeded in 1 × 10 4 cells / hole on a 96-well microplate using DermaLife® [registered trademark] containing a growth additive for 1 day under the conditions of 37 ° C and 5.0% CO 2 . After pre-culture, the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) was adjusted to a specified concentration (final concentration as a solution was 0.3%, 0.45%, 0.6%, 0.9%, 1.2%) (the final concentration as a solution was 0.3%, 0.45%, 0.6%, 0.9%, 1.2%). Registered trademark) [manufactured by Kurabou] was added. Then, from the bottom of the incubator, ultraviolet irradiation of about 15 mJ / cm2 was performed using a UV-B lamp (TL20W / 12RS manufactured by Philips). After that, the cells were cultured under the same conditions for another 2 days. After that, immunological detection using ETBR antibody was performed. That is, after washing with PBS (-), cells were treated with 15% neutral buffered formalin solution for 30 minutes and fixed, permeated with 0.2% Triton X-100 solution for 1 hour, and 5-fold diluted blocking one P (Nacalai Tesque). After blocking by treatment with a solution for 2 hours, ETBR antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 24 hours. Then, it was washed with PBS (-), a fluorescently labeled secondary antibody was added, and the mixture was allowed to stand in a dark place for a certain period of time. After the PBS (-), it was washed and the fluorescence intensity was measured. First, the fluorescent label (Alexa Fluor546) of the secondary antibody was measured at Ex = 544 nm and Em = 590 nm (fluorescent microplate reader (Fluoroscan Ascent, manufactured by Thermo Fisher Scientific)), and then DNA staining with Hoechst33342 was performed, and Ex. Measurements were made at = 355 nm and Em = 460 nm. The degree of ETBR formation was determined by dividing the fluorescence intensity of Alexa Fluor 546 in each test group by the fluorescence intensity of Hoechst 33342. In the case of no sample addition (control) in which PBS (-) was added instead of the sample solution, the same operation as above was performed, and the relative value of the ETBR generation degree at the time of adding each sample to the ETBR generation degree in the ultraviolet-irradiated group. Was calculated and used as the ETBR production amount (%).
試験例７の結果を図８に示す。図８に示す通り、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたメラノサイトのETBR合成抑制効果を有することが確認された。これにより、エンドセリンによる刺激が伝わりにくくなることで、エンドセリンによるメラニン合成を抑制し、色素沈着を防ぐ効果につながる。 The results of Test Example 7 are shown in FIG. As shown in FIG. 8, it was confirmed that the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) has a significantly excellent effect of suppressing ETBR synthesis of melanocytes in a concentration-dependent manner. This makes it difficult for the stimulation by endothelin to be transmitted, which leads to the effect of suppressing melanin synthesis by endothelin and preventing pigmentation.
試験例８．メラノサイトのMC1R合成抑制評価試験
試験例８では、メラノサイト刺激ホルモンであるαMSHの受容体MC1Rの合成抑制効果を評価した。
正常ヒト表皮メラニン細胞を増殖添加剤含有DermaLife(登録商標)[クラボウ社製]にて96穴マイクロプレートに1×104個/穴播種し、37℃，5.0％CO2の条件下に１日間プレ培養した後、試料溶液を規定の濃度（溶液として）となるように調整したDermaLife(登録商標)[クラボウ社製]を添加した。その後、培養器底面からUV-Bランプ（Philips社製TL20W/12RS）を用いて約15ｍJ/cm2の紫外線照射を行った。その後同条件でさらに2日間培養した。その後MC1R抗体を用いた免疫的検出を行った。すなわち、PBS(-)洗浄後、15％中性緩衝ホルマリン液を用いて細胞を30分処理して固定、0.2％Triton X-100溶液で１時間浸透処理、５倍希釈ブロッキングワンP（ナカライテスク社）溶液で2時間処理によるブロッキングを行った後、MC1R抗体を添加し、4℃で一昼夜静置した。その後PBS(-)洗浄し、蛍光ラベルした二次抗体を添加してさらに暗所で一定時間静置した。そのPBS(-)後洗浄し、蛍光強度の測定を行った。先ず二次抗体の蛍光ラベル（Alexa Fluor546）をEx=544nm、Em=590nmで測定し（蛍光マイクロプレートリーダー（フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製））、その後、Hoechst33342によるDNA染色を行い、Ex=355nm、Em=460nmの測定を行った。それぞれの試験区のAlexa Fluor546の蛍光強度をHoechst33342の蛍光強度で割ることで、MC1Rの生成度合いを求めた。試料溶液に代えてPBS(-)を添加した試料無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作を行い、紫外線照射した区のMC1R生成度合いに対する各試料添加時のMC1R生成度合いの相対値を求め、MC1R生成量（％）とした。
Test Example 8. Evaluation test for suppressing MC1R synthesis of melanocytes In Test Example 8, the effect of suppressing the synthesis of MC1R, a receptor for αMSH, which is a melanocyte-stimulating hormone, was evaluated.
Normal human epidermal melanocytes were seeded in 1 × 10 4 cells / hole on a 96-well microplate using DermaLife® [registered trademark] containing a growth additive for 1 day under the conditions of 37 ° C and 5.0% CO 2 . After pre-culturing, DermaLife (registered trademark) [manufactured by Kurabou Co., Ltd.] prepared by adjusting the sample solution to a specified concentration (as a solution) was added. Then, from the bottom of the incubator, ultraviolet irradiation of about 15 mJ / cm2 was performed using a UV-B lamp (TL20W / 12RS manufactured by Philips). After that, the cells were cultured under the same conditions for another 2 days. After that, immunological detection using MC1R antibody was performed. That is, after washing with PBS (-), cells were treated with 15% neutral buffered formalin solution for 30 minutes to fix them, and then permeated with 0.2% Triton X-100 solution for 1 hour, and 5-fold diluted blocking one P (Nacalai Tesque). After blocking with a solution for 2 hours, MC1R antibody was added and the cells were allowed to stand at 4 ° C for 24 hours. Then, it was washed with PBS (-), a fluorescently labeled secondary antibody was added, and the mixture was allowed to stand in a dark place for a certain period of time. After the PBS (-), it was washed and the fluorescence intensity was measured. First, the fluorescent label (Alexa Fluor546) of the secondary antibody was measured at Ex = 544 nm and Em = 590 nm (fluorescent microplate reader (Fluoroscan Ascent, manufactured by Thermo Fisher Scientific)), and then DNA staining with Hoechst33342 was performed, and Ex. Measurements were made at = 355 nm and Em = 460 nm. The degree of MC1R formation was determined by dividing the fluorescence intensity of Alexa Fluor 546 in each test group by the fluorescence intensity of Hoechst 33342. In the case of no sample addition (control) in which PBS (-) was added instead of the sample solution, the same operation as above was performed, and the relative value of the MC1R generation degree at the time of adding each sample to the MC1R generation degree in the ultraviolet-irradiated group. Was calculated and used as the amount of MC1R produced (%).
試験例８の結果を図９に示す。図９に示す通り、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたメラノサイトのMC1R合成抑制効果を有することが確認された。これにより、αＭＳＨによる刺激が伝わりにくくなることで、αＭＳＨによるメラニン合成を抑制し、色素沈着を防ぐ効果につながる。 The results of Test Example 8 are shown in FIG. As shown in FIG. 9, it was confirmed that the composition according to the present invention (Sample 1 of the present invention) has a significantly excellent effect of suppressing MC1R synthesis of melanocytes in a concentration-dependent manner. This makes it difficult for the stimulation by αMSH to be transmitted, which leads to the effect of suppressing melanin synthesis by αMSH and preventing pigmentation.
処方例１．化粧水
［成分］ 部
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール ５．０
メチルパラベン ０．１
製造例１の酵母培養物抽出物 １．０
製造例５の発酵物 １・０
製造例６の発酵物 １・０
グリセリン ５．０
１，３－ブチレングリコール ５．０
クエン酸ナトリウム ０．２
精製水 全量が１００部となる量
Prescription example 1. Toner [Ingredients] Jojoba oil 1.0
Polyoxyethylene (5.5) cetyl alcohol 5.0
Methylparaben 0.1
Yeast culture extract of Production Example 1 1.0
Fermented product of Production Example 5 1.0
Fermented product of Production Example 6 1.0
Glycerin 5.0
1,3-butylene glycol 5.0
Sodium citrate 0.2
Amount of purified water that makes 100 copies
処方例２．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の酵母培養物抽出物に代えて、製造例２の酵母培養物抽出物１．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。
Prescription example 2. Toner A lotion was obtained in the same manner as in Formulation 1, except that 1.0 part of the yeast culture extract of Production Example 2 was used in place of the yeast culture extract of Production Example 1 contained in Formulation Example 1. rice field.
処方例３．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の酵母培養物抽出物に代えて、製造例３の酵母培養物抽出物２．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。
Prescription example 3. Toner A lotion was obtained in the same manner as in Formulation 1, except that 2.0 parts of the yeast culture extract of Production Example 3 was used in place of the yeast culture extract of Production Example 1 contained in Formulation Example 1. rice field.
処方例４．乳液
［成分］ 部
スクワラン ５．０
ヘキサラン ３．０
ホホバ油 １．０
ツバキ油 １．５
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート １．０
親油型ステアリン酸グリセリル １．０
水添大豆レシチン １．５
製造例１の酵母培養物抽出物 ０．５
製造例５の発酵物 ０．５
製造例６の発酵物 ０．５
グリセリン ３．０
１，３－ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
キサンタンガム ０．２
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
精製水 全量が１００部となる量
Prescription example 4. Emulsion [Ingredients] Part Squalene 5.0
Hexalan 3.0
Jojoba oil 1.0
Camellia oil 1.5
Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate 1.0
Oil-based glyceryl stearate 1.0
Hydrogenated soy lecithin 1.5
Yeast culture extract of Production Example 1 0.5
Fermented product of Production Example 5 0.5
Fermented product of Production Example 6 0.5
Glycerin 3.0
1,3-butylene glycol 2.0
Carboxymethyl cellulose 0.3
Xanthan gum 0.2
Sodium hyaluronate 0.01
Amount of purified water that makes 100 copies
処方例５．クリーム
［成分］ 部
オリーブ油 ５．０
ホホバ油 ５．０
スクワラン ５．０
ベヘニルアルコール ２．０
パルミチン酸 ２．５
製造例２の酵母培養物抽出物粉末 ０．５
製造例５の発酵物 ０．５
製造例６の発酵物 ０．５
乳酸菌発酵米 ２．０
水素添加レシチン ０．５
カルボキシビニルポリマー ０．３
アルギン酸ナトリウム ０．２
海藻抽出物 ２．０
メチルパラベン ０．１５
エチルパラベン ０．０３
精製水 全量が１００部となる量
Prescription example 5. Cream [Ingredients] Part Olive oil 5.0
Jojoba oil 5.0
Squalene 5.0
Behenyl alcohol 2.0
Palmitic acid 2.5
Yeast culture extract powder of Production Example 2 0.5
Fermented product of Production Example 5 0.5
Fermented product of Production Example 6 0.5
Lactic acid bacteria fermented rice 2.0
Hydrogenated lecithin 0.5
Carboxyvinyl polymer 0.3
Sodium alginate 0.2
Seaweed extract 2.0
Methylparaben 0.15
Ethylparaben 0.03
Amount of purified water that makes 100 copies
処方例７．リキッドファンデーション
［成分］ 部
ステアリン酸 ２．４
モノステアリン酸プロピレングリコール ２．０
セトステアリルアルコール ０．２
液状ラノリン ２．０
流動パラフィン ３．０
ミリスチン酸イソプロピル ８．５
プロピルパラベン ０．０５
製造例３の酵母培養物抽出物粉末 ０．５
製造例５の発酵物 ０．５
製造例６の発酵物 ０．５
カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．２
ベントナイト ０．５
プロピレングリコール ４．０
トリエタノールアミン １．１
メチルパラベン ０．１
酸化チタン ８．０
タルク ４．０
着色顔料 適量
精製水 全量が１００部となる量
Prescription example 7. Liquid Foundation [Ingredients] Part Stearic Acid 2.4
Propylene glycol monostearate 2.0
Setostearyl alcohol 0.2
Liquid lanolin 2.0
Liquid paraffin 3.0
Isopropyl myristate 8.5
Propylparaben 0.05
Yeast culture extract powder of Production Example 3 0.5
Fermented product of Production Example 5 0.5
Fermented product of Production Example 6 0.5
Sodium Carboxymethyl Cellulose 0.2
Bentonite 0.5
Propylene glycol 4.0
Triethanolamine 1.1
Methylparaben 0.1
Titanium oxide 8.0
Talc 4.0
Appropriate amount of coloring pigment Amount of purified water totaling 100 parts
処方例８．ボディシャンプー
［成分］ 部
Ｎ－ラウロイルメチルアラニンナトリウム ２５．０
ヤシ油脂肪酸カリウム液（４０％） ２６．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ３．０
メチルパラベン ０．１
製造例１の酵母培養物抽出物粉末 ０．５
製造例５の発酵物 ０．５
製造例６の発酵物 ０．５
１，３－ブチレングリコール ２．０
精製水 全量が１００部となる量
Prescription example 8. Body shampoo [Ingredients] Part N-lauroylmethylalanine sodium 25.0
Coconut oil fatty acid potassium solution (40%) 26.0
Coconut oil fatty acid diethanolamide 3.0
Methylparaben 0.1
Yeast culture extract powder of Production Example 1 0.5
Fermented product of Production Example 5 0.5
Fermented product of Production Example 6 0.5
1,3-butylene glycol 2.0
Amount of purified water that makes 100 copies
処方例９．ヘアシャンプー
［成分］ 部
Ｎ－ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム １０．０
ポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸ナトリウム ２０．０
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン １０．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ４．０
メチルパラベン ０．１
クエン酸 ０．１
製造例１の酵母培養物抽出物粉末 ０．５
製造例５の発酵物 ０．５
製造例６の発酵物 ０．５
１，３－ブチレングリコール ２．０
精製水 全量が１００部となる量
Prescription example 9. Hair Shampoo [Ingredients] Part N-Palm Oil Fatty Acid Methyl Taurine Sodium 10.0
Polyoxyethylene (3) Alkyl Ether Sodium Sulfate 20.0
Betaine Lauryldimethylaminoacetic Acid 10.0
Coconut oil fatty acid diethanolamide 4.0
Methylparaben 0.1
Citric acid 0.1
Yeast culture extract powder of Production Example 1 0.5
Fermented product of Production Example 5 0.5
Fermented product of Production Example 6 0.5
1,3-butylene glycol 2.0
Amount of purified water that makes 100 copies
処方例１０．ヘアコンディショナー
［成分］ 部
ポリオキシエチレン（１０）硬化ヒマシ油 １．０
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム １．５
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム ２．０
２－エチルヘキサン酸グリセリル １．０
セタノール ３．０
ステアリルアルコール １．０
メチルパラベン ０．１
製造例４の酵母培養物抽出物粉末 ０．５
製造例５の発酵物 ０．５
製造例６の発酵物 ０．５
１，３－ブチレングリコール ５．０
精製水 全量が１００部となる量
Prescription example 10. Hair Conditioner [Ingredients] Part Polyoxyethylene (10) Hardened Castor Oil 1.0
Distearyl dimethylammonium chloride 1.5
Stearyl Trimethylammonium Chloride 2.0
Glyceryl 2-ethylhexanoate 1.0
Cetanol 3.0
Stearyl alcohol 1.0
Methylparaben 0.1
Yeast culture extract powder of Production Example 4 0.5
Fermented product of Production Example 5 0.5
Fermented product of Production Example 6 0.5
1,3-butylene glycol 5.0
Amount of purified water that makes 100 copies
処方例１１．シートマスク
不織布に下記の成分を含浸させてシートマスクを得る。
［成分］ 部
グリセリン ３．０
１、３－ブチレングリコール ２．０
メチルパラベン ０．２
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．３
キサンタンガム １．０
水溶性コラーゲン １．０
ヒアルロン酸ナトリウム １．０
製造例１の酵母培養物抽出物 ０．５
製造例５の発酵物 ０．５
製造例６の発酵物 ０．５
精製水 全量が１００部となる量
Prescription example 11. Sheet mask A sheet mask is obtained by impregnating a non-woven fabric with the following components.
[Ingredients] Part Glycerin 3.0
1,3-butylene glycol 2.0
Methylparaben 0.2
Citric acid 0.1
Sodium citrate 0.3
Xanthan gum 1.0
Water-soluble collagen 1.0
Sodium hyaluronate 1.0
Yeast culture extract of Production Example 1 0.5
Fermented product of Production Example 5 0.5
Fermented product of Production Example 6 0.5
Amount of purified water that makes 100 copies
Claims (1)
The active ingredients are a culture extract of Sasayuri-derived yeast or a concentrate or dry powder thereof, a fermented lotus lactic acid bacterium belonging to the Lotuses family Lotuses, and a yeast fermented product of the Liliaceae daylilies and / or the daylilies. External skin preparation.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| JP2020135323 | 2020-08-07 | ||
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116473901A (en) * | 2023-06-12 | 2023-07-25 | 广州丽彦妆生物科技有限公司 | Moisturizing and repairing freeze-dried mask and preparation method thereof |
-
2021
- 2021-07-02 JP JP2021111135A patent/JP2022031140A/en active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116473901A (en) * | 2023-06-12 | 2023-07-25 | 广州丽彦妆生物科技有限公司 | Moisturizing and repairing freeze-dried mask and preparation method thereof |
| CN116473901B (en) * | 2023-06-12 | 2023-11-07 | 广州丽彦妆生物科技有限公司 | Moisturizing and repairing freeze-dried mask and preparation method thereof |
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