JP2022028656A - 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法 - Google Patents

半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022028656A
JP2022028656A JP2021168757A JP2021168757A JP2022028656A JP 2022028656 A JP2022028656 A JP 2022028656A JP 2021168757 A JP2021168757 A JP 2021168757A JP 2021168757 A JP2021168757 A JP 2021168757A JP 2022028656 A JP2022028656 A JP 2022028656A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
plant
amino acid
seq
cenpc
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021168757A
Other languages
English (en)
Inventor
デン キャンプ， リク ヒューベルトゥス マルティニュス オプ
Hubertus Martinus Op Den Camp Rik
ダイク， ピーター ヨハネス ファン
Johannes Van Dijk Peter
アンソニー ギャラード，
Gallard Anthony
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keygene NV
Original Assignee
Keygene NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keygene NV filed Critical Keygene NV
Publication of JP2022028656A publication Critical patent/JP2022028656A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A01H1/08—Methods for producing changes in chromosome number
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【課題】半数体植物、又は異常な倍数性を有する植物を効率的に生成する方法を提供する。【解決手段】ＣＥＮＰＣタンパク質の機能に影響を及ぼし、修飾されたＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物がなお生存することを可能とする、１つ又は複数のアクティブ変異を含む、修飾されたＣＥＮＰＣタンパク質、及び、修飾されたＣＥＮＰＣタンパク質を含む植物が、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を含む野生型植物との交配後に半数体子孫、又は異常な倍数性を有する植物を誘導する方法を提供する。【選択図】なし

Description

本開示は、農業分野に関する。特に、本開示は、半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生に関する。
育種材料の高度なヘテロ接合性は、植物育種及び有益な形質の選択を非常に時間のかかるプロセスにする可能性がある。広範な集団のスクリーニングは、最新の分子育種ツールを用いたとしても、労力と費用の両方を要する。
半数体植物の創出とそれに続く化学的又は自発的ゲノム倍加は、高いヘテロ接合性の問題を解決するための効率的な方法である。そのような倍加半数体は、そうでなければ許容できるレベルまでヘテロ接合性を低減させるために必要とされる、少なくとも７世代の自殖を回避する。半数体植物は、小胞子培養によって一部の作物において産生されうる。しかしながら、これは、費用と時間がかかる。多くの作物において小胞子培養法が機能しないことは、より重要である。一部の作物種において、（倍加）半数体植物は、卵細胞の単為生殖又は親ゲノムのうちの一方の排除により得られうる。しかしながら、これらの方法も選ばれたわずかな作物に限定され、倍加半数体植物の産生率は低い。
国際公開第ＷＯ２０１１／０４４１３２号は、半数体植物を産生する方法を開示する。採用された方法のうちの１つは、ＣｅｎＨ３タンパク質を不活性化又はノックアウトすることである。これは、Ｎ末端ＧＦＰをＣｅｎＨ３タンパク質に付加し、それによってＧＦＰ－ＣｅｎＨ３を創出することによって行われた。これは、「テールスワップ（ｔａｉｌｓｗａｐ）」とも呼ばれる。テールスワップは、ＣｅｎＨ３タンパク質のそのような修飾Ｎ末端部分を含まない植物への交配に際して、片親ゲノムの排除を誘導するのに十分であった。片親ゲノムの排除は、半数体植物の産生をもたらした。これまで、このプロセスは、モデル植物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）においてのみ実証され、作物植物においては実証されていない。加えて、異なる遺伝子導入により修飾されたＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端部分からなる別の人工構築物が、内在性ＣｅｎＨ３を欠く遺伝的背景を有する植物に導入された場合、これは、片親ゲノムの排除及びそれに続く半数体植物の産生をもたらさないようであった（国際公開第ＷＯ２０１４／１１０２７４号）。したがって、ＣｅｎＨ３タンパク質のどの修飾が片親ゲノムの排除に十分であるかは不明確なままである。
よって、本分野においては、後に倍加されて、倍加半数体植物を産生することのできる半数体植物の効率的な生成を可能とする方法に対する必要が残っている。倍加半数体産生系により、ホモ接合性が一世代で達成される。
ここに、本発明者らは、修飾されたＣＥＮＰＣタンパク質を有する植物がいずれも、独特の一塩基多型によって、これらの特別な独特の一塩基多型を欠く野生型植物への又はそれとの交配後に半数体子孫を誘導できることを見出した。一方の多型は、単一の植物に４つのヌクレオチド変化を含み、（１）ＣＥＮＰＣタンパク質におけるＨアミノ酸の挿入につながる、ＣＥＮＰＣゲノムＤＮＡ配列のスプライス受容部位のＧからＴヌクレオチドへの修飾、（２）ＣＥＮＰＣタンパク質におけるＤからＫへのアミノ酸修飾及び（３）ＣＥＮＰＣタンパク質におけるＮからＹへのアミノ酸修飾をもたらす。他方の独特の一塩基多型は、ＣＥＮＰＣタンパク質におけるＭからＶへのアミノ酸修飾をもたらした。対照植物との相反交配は、半数体子孫をまったくもたらさなかった。
本発明は、１つ又は複数のアクティブ変異（ａｃｔｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む植物起源のＣＥＮＰＣタンパク質に関する。１つ又は複数のアクティブ変異は、配列番号２、３、４又は１５～１９のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質中に存在しうる。１つ又は複数のアクティブ変異は、配列番号２、３、４若しくは１５～１９のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号２、３、４若しくは１５～１９のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むタンパク質において引き起こされてもよい。
ある実施形態において、１つ又は複数のアクティブ変異は、配列番号５又は６のいずれかに示されるアミノ酸配列によって表される倍加半数体インデューサードメイン中に存在する。
上記１つ又は複数のアクティブ変異は、配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列における、５５２～５５３位の間のアミノ酸残基の変異、５５４位のアミノ酸残基の変異、５５５位のアミノ酸残基の変異及び５５６位のアミノ酸残基の変異若しくはその任意の組合せからなる群から選択されるか；又は配列番号２のアミノ酸配列における、５５５～５５６位の間のアミノ酸残基の変異、５５７位のアミノ酸残基の変異、５５８位のアミノ酸残基の変異及び５５９位のアミノ酸残基の変異若しくはその任意の組合せからなる群から選択されうる。
ある実施形態において、配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５４位において、又は配列番号２のアミノ酸配列の５５７位において変異したアミノ酸は、アスパラギン酸であり、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５５位において、又は配列番号２のアミノ酸配列の５５８位において変化したアミノ酸は、アスパラギンであり、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５６位において又は配列番号２のアミノ酸配列の５５９位において変化したアミノ酸は、メチオニンである。
ある実施形態において、配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５４位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５７位のアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸残基、好ましくはリシンに変化しており、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５５位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５８位のアミノ酸が、チロシンに変化しており、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５６位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５７位のアミノ酸が、バリンに変化しており、並びに／或いは正電荷を有する残基、好ましくはヒスチジンが、配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列のアミノ酸残基５５２～５５３の間に又は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基５５５～５５６の間に挿入されている。
ある実施形態において、ヒスチジンが、配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列のアミノ酸残基５５２～５５３の間に又は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基５５５～５５６の間に挿入され、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５４位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５７位のアスパラギン酸が、リシンに変化しており、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかの５５５位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５８位のアスパラギンが、チロシンに変化している。
ある実施形態において、上記タンパク質は、配列番号８又は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
上記タンパク質は、配列番号７若しくは１２のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよく、又は上記タンパク質は、配列番号９若しくは１３のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。
ある実施形態において、上記タンパク質は、アクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされ、これは、植物の内在性ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／又は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が生存することを可能とし、上記植物が野生型植物と交配される場合、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
生成された後代の少なくとも０．１、０．５、１又は５％が、半数体であるか、又は異常な倍数性を有することが好ましい。
上記タンパク質は、標的ヌクレオチド交換を使用して又はエンドヌクレアーゼを適用することにより、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入することによって、上記内在性ＣＥＮＰＣタンパク質から誘導されてもよい。
ある実施形態において、１つ又は複数のアクティブ変異は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質ドメイン中に存在しない。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明は、配列番号１１若しくは１４のいずれかの核酸配列、又は、配列番号１１若しくは１４のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチドであって、その中の配列番号１１の核酸配列の２４４９～２４５０位及び／又は２４５４～２４６２位或いは配列番号１４の１６６０～１６６８位の１つ又は複数のヌクレオチドが、その中で、配列番号３のアミノ酸配列が５５４位及び／又は５５５位及び／又は５５６位に変更された残基を有し、並びに／或いは配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸残基５５２～５５３の間にヒスチジンのようなアミノ酸残基の挿入をその中に有するＣＥＮＰＣタンパク質を、上記核酸がコードするように修飾されている、ポリヌクレオチドにも関する。
加えて、配列番号７又は１２のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドが本明細書において教示される。
配列番号９又は１３のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドも本明細書において教示される。
本明細書に教示されるポリヌクレオチドは単離されうる。
本発明は、さらに、本明細書に教示されるポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子、本明細書に教示されるポリヌクレオチド又はキメラ遺伝子を含むベクター、及び本明細書に教示されるポリヌクレオチド、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されるベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、植物細胞、好ましくはトマト植物細胞でありうる。
本発明は、本明細書に教示されるポリヌクレオチド、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されるベクターを含む植物も提供する。
ある実施形態において、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質は、上記植物において発現されない。
植物は、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）植物、好ましくはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物でありうる。
本発明は、さらに、本明細書に教示される植物を作製するための方法であって：
ａ）植物細胞内の内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、アクティブ変異を有する植物ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るステップと；
ｂ）アクティブ変異を有する植物ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと；
ｃ）任意選択で、上記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法に関する。
また、本発明は、本明細書に教示される植物を作製するための方法であって：
ａ）本明細書に教示されるポリヌクレオチド、本明細書に教示されるキメラ遺伝子又は本明細書に教示されるベクターを使用して植物細胞を形質転換するステップと；
ｂ）上記ポリヌクレオチド、キメラ遺伝子又はベクターを含む植物細胞を選択するステップと；
ｃ）任意選択で、上記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法にも関する。
上記方法は、上記植物細胞を改変して、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現を防止するステップをさらに含んでもよい。
上記植物細胞内の内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドが修飾されて、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現を防止してもよい。
本発明は、さらに、半数体植物、又は異常な倍数性を有する植物を生成する方法であって：
ａ）内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物を、本明細書に教示される植物に交配するステップであって、本明細書に教示される植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現しない、ステップと；
ｂ）種子を採取するステップと；
ｃ）上記種子から、少なくとも１つの実生、小植物又は植物を生育させるステップと；
ｄ）半数体実生、小植物若しくは植物；異常な倍数性を有する実生、小植物若しくは植物；又は倍加半数体実生、小植物若しくは植物を選択するステップと
を含む、方法に関する。
本開示は、倍加半数体植物を生成する方法であって、ステップｄ）において得られた半数体植物を倍加半数体植物に転換するステップを含む、方法をさらに教示する。
転換は、コルヒチンによる処理により実施されてもよい。
ある実施形態において、内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する上記植物は、Ｆ１植物である。
内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物は、交配種の花粉親でありうるか又は交配種の胚珠親でありうる。
ある実施形態において、交配は、約２４～約３０℃の範囲の温度において実施される。
ある実施形態において、本明細書に教示される方法は、上記植物の全ゲノムを有性交配する（ｓｅｘｕａｌｌｙ ｃｒｏｓｓｉｎｇ）ステップを含まない。
本明細書に教示されるポリヌクレオチドは、半数体インデューサー系統を産生するために使用されうる。
本明細書に教示されるポリヌクレオチド、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されるベクターを含むトマト植物も提供される。
加えて、配列番号８又は１０のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトマト植物が提供される。
さらに、配列番号７、１２、９又は１３のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むトマト植物が本明細書に教示される。
本発明は、本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトマト植物をさらに提供する。
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド中に１つ又は複数のアクティブ変異を含むトマト植物も提供される。
本明細書に教示されるトマト植物は、半数体トマト植物を産生するため、及び／又は倍加半数体トマト植物を産生するために使用されうる。
ある実施形態において、本明細書に教示されるトマト植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現しない。
最終的な態様において、本発明は、半数体又は倍加半数体植物を生成する方法であって、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物及び本明細書に教示される植物を同定するステップを含み、本明細書に教示される植物は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現しない、方法に関する。
ある実施形態において、上記方法は、上記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない。
ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異体の四分染色体を示す。矢印は、微小核を示す。
定義
略語「ＣＥＮＰＣ」又は「ＣＥＮＰ－Ｃ」は、セントロメアタンパク質Ｃを意味する。セントロメアタンパク質Ｃは、任意の生物由来のＣＥＮＰＣタンパク質を定義するタンパク質配列であるＣＥＮＰＣモチーフを特徴とする。ＣＥＮＰＣモチーフは、動物、酵母及び植物の間で高度に保存されている（Ｔａｌｂｅｒｔら、２００４年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻（４号）、１８ページ）。ヒト；マウス；ウシ；ニワトリ；エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）；出芽酵母；シゾサッカロミセス・ポンべ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；ニセツリガネコケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）；トウモロコシ；コメ；シロイヌナズナ；ブラックコットンウッド；ダイズ及びトマト由来のコンセンサスＣＥＮＰＣモチーフが、配列番号１として提供される。
「変異」は、生物、ウイルスのゲノム又は染色体外ＤＮＡ又は他の遺伝要素のヌクレオチド配列の恒久的変化である。（放射線又は化学的変異原により典型的に引き起こされる）修復されないＤＮＡ、若しくはＲＮＡゲノムに対する損傷、複製の過程におけるエラーにより、又は可動遺伝因子によるＤＮＡのセグメントの挿入若しくは欠失によりもたらされる。変異は、生物の観察可能な特徴（表現型）において認識できる変化を生じても生じなくてもよい。変異は、配列に数種の異なるタイプの変化をもたらすことができる。遺伝子における変異は、影響を及ぼさないか、遺伝子産物を変化させるか、又は遺伝子が適切に若しくは完全に機能することを阻むことのいずれかでありうる。変異は、非遺伝子領域においても発生しうる。
「アクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチド」は、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質をコードする、変異したＣＥＮＰＣをコードする非内在性のポリヌクレオチドを指し、これは、そのＣＥＮＰＣをコードする内在性ポリヌクレオチド及び／又は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の非存在下で植物中に存在する場合、上記植物が生存することを可能とし、上記植物が野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配させられる場合、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。アクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチドを含む植物は、「改変植物」と呼ばれうる。野生型植物との交配に際して生成される半数体後代又は異常な倍数性を有する後代のパーセンテージは、例えば、少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ以上であることができる。ＣＥＮＰＣをコードする内在性ポリヌクレオチドから、アクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチドへの移行を引き起こす変異は、本明細書において「アクティブ変異」と呼ばれる。ＣＥＮＰＣタンパク質の関係におけるアクティブ変異は、中でも、細胞分裂の間の染色体の分離において、低減されたセントロメア負荷、より少ない機能的ＣＥＮＰＣタンパク質及び／又は低減された機能性をもたらしうる。アクティブ変異は、当業者に周知の数種の方法のいずれかにより、例えば、化学物質若しくは放射線による種子若しくは植物細胞の処理により誘発されるような、ランダム変異誘発、標的変異誘発、エンドヌクレアーゼの適用により、部分的若しくは完全なタンパク質ドメインの欠失により、又は異種配列との融合により、ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチドに導入されうる。代替的には、１つ又は複数のアクティブ変異を導入するために、これらの技術のうちの数種が使用されてもよい。
「アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質」は、アクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる。ＣＥＮＰＣをコードする内在性ポリヌクレオチドは、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質をコードする。
植物は、ＣＥＮＰＣをコードする内在性ポリヌクレオチドをノックアウトするか又は不活性化することによって、上記ＣＥＮＰＣをコードする内在性ポリヌクレオチドを欠如させうる。代替的には、上記ＣＥＮＰＣをコードする内在性ポリヌクレオチドが、不活性の又は非機能的ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするように修飾されてもよい。
本明細書に教示されるアクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチドを含む改変植物は、花粉親又は胚珠親のいずれかとして、野生型植物と交配されうる。ある実施形態において、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質は、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０又はそれ以上のアミノ酸の変化を含みうる。ある実施形態において、アクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチドは、ＣＥＮＰＣをコードする内在性ポリヌクレオチドに対して、好ましくは全長にわたって、７０、７５、８０、８５、９０，９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％の配列同一性を有する。
当業者は、本明細書に教示される改変植物が、アクティブ変異を有するか否かを容易に確認することができる。例えば、当業者は、そのようなアクティブ変異を提案するために、ＳＩＦＴ（Ｋｕｍａｒ Ｐ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ、Ｎｇ ＰＣ．（２００９年）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ｎｏｎ－ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＳＩＦＴ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ；４巻（７号）；１０７３～８１ページ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．８６）のような予測ツールを使用しうる。次いで、植物においてアクティブ変異が引き起こされ、上記植物における内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現がノックアウトされるはずである。この植物は、野生型植物との交配に際して生成される半数体後代又は異常な倍数性を有する後代のパーセンテージが少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ以上である場合に、アクティブ変異を含むと考えられうる。
花粉又は胚珠親のいずれかとしての、ＣＥＮＰＣをコードする内在性ポリヌクレオチドを欠く又は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現を欠く植物であり、且つアクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物と、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物を交配することは、ある特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ以上）の半数体であるか又は異常な倍数性を示す後代をもたらす。そのような植物は、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する親の染色体のみを含み、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物の染色体を含まない。
交配される２つの植物は、性的に適合性でなければならない。これらは同じ属又は同じ種のものであってもよい。
本発明の状況においてタンパク質又は遺伝子と組み合わせて使用される用語「内在性」は、上記タンパク質又は遺伝子が、それが今もなお含有される植物に起源を有することを意味する。内在性遺伝子は、植物中でその正常な遺伝学的状況に存在することが多い。
本開示の状況において使用される用語「半数体インデューサー系統」は、非インデューサー系統と少なくとも１つの一塩基多型において異なる植物系統を指す。雌株又は花粉ドナーのいずれかとして使用される半数体インデューサー系統が交配される場合、半数体インデューサー系統のゲノムの片親ゲノムの排除をもたらす。
本明細書中で使用される用語「片親ゲノムの排除」は、交配後に、交配の方向に関わりなく一方の親のすべての染色体を意味するすべての遺伝情報を失うという効果を指す。これは、そのような交配の子孫が、排除されない親ゲノムの染色体のみを含有するような方法で起こる。排除されるゲノムは、常に半数体インデューサーである親に起源を有する。
「倍加半数体」は、半数体細胞が染色体倍加を受けるときに形成される遺伝子型である。これは、半数体細胞からの誘導された又は自発的な染色体倍加により産生されうる。二倍体植物にとって、半数体細胞は一倍体であり、用語「倍加一倍体」も、倍加半数体について使用されうる。
「ナス科ＣＥＮＰＣ ＤＨ－インデューサードメインタンパク質配列」は、ナス科植物に属する種由来のＣＥＮＰＣタンパク質の特異的領域であって、ナス科の種の間で高度に保存されている領域を定義する。これは、トマト、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）及びソラヌム・フルテセンス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｃｅ）のＣＥＮＰＣ ＤＨ－インデューサードメインのコンセンサスタンパク質配列を表し、そのアミノ酸配列が配列番号５に示される。
「ナス属ＣＥＮＰＣ ＤＨ－インデューサードメインタンパク質配列」は、ナス属植物に属する種由来のＣＥＮＰＣタンパク質の特定の領域を定義する。これは、ナス属の種間で高度に保存されている。トマト、ソラヌム・ピンピネリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）、ソラヌム・ペルウィアヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、ソラヌム・クミエレウィスキイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｉｅｍｌｉｅｗｓｋｉｉ）、ソラヌム・ケエスマニアエ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ）、ソラヌム・ネオリキイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ）、ソラヌム・アルカヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ Ａｒｃａｎｕｍ）、ソラヌム・ペルウィアヌム、ソラヌム・フアユラセンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈｕａｙｌａｓｅｎｓｅ）、ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｉｌｅｎｓｅ）、ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）、ソラヌム・ペンネリイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）、ソラヌム・ガラパゲンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅ）及びジャガイモのＣＥＮＰＣ ＤＨ－インデューサードメインのコンセンサスタンパク質配列のアミノ酸配列が配列番号６に示される。
本明細書中で使用される用語「未定の」は、確定の又は未定のとして一般に分類される、トマト植物の生育習性のタイプを指す。この分類は、持続的な仮軸成長（ｓｙｍｐｏｄｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ）のためのシュート系の能力によることが好ましい。この用語は、当該技術分野において承認されている意味で使用される。
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書中で互換的に使用される。
「キメラ遺伝子」（又は組換え遺伝子）は、通常、ある種において自然界で見られない任意の遺伝子、特に、自然界で互いに関連し合わない核酸配列の１つ又は複数の部分がその中に存在する遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、自然界で転写領域の一部若しくはすべて、又は別の調節領域とは関連し合わない。用語「キメラ遺伝子」は、その中のプロモーター又は転写調節配列が、１つ若しくは複数のコード配列に又はアンチセンス（センス鎖の逆相補体）若しくは逆位反復配列（それによって、転写に際してＲＮＡトランスクリプトが二本鎖ＲＮＡを形成する、センス及びアンチセンス）に操作可能に連結される、発現構築物を含むと理解される。
「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムを使用する２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアライメントにより決定されうる。その結果、配列は、それらが（例えばデフォルトパラメータを使用するＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより最適に整列化された場合に）少なくとも（以下に定義される）ある特定の最小限のパーセンテージの配列同一性を共有する場合に、「実質的に同一」又は「本質的に類似する」と呼ばれうる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小としつつ、２つの配列をその長さ全体にわたって整列化する。一般に、ギャップクリエーションペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップエクステンションペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）でＧＡＰデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、デフォルトスコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ ８９巻、９１５～９１９ページ）。配列アライメント及び配列同一性パーセンテージのためのスコアが、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡからのＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３又は（「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを使用する）ＥｍｂｏｓｓＷｉｎ バージョン２．１０．０などのコンピュータプログラムを使用して決定されうる。代替的には、類似性又は同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用してデータベースを検索することによって決定されうる。
「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」又は「形質転換細胞」は、特に所望のタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含む、少なくとも１つの核酸分子の導入の結果として生じる新しい個別の細胞（又は生物）を指す用語である。宿主細胞は、植物細胞又は細菌細胞であることが好ましい。宿主細胞は、染色体外で（エピソームの）複製する分子として核酸分子若しくはキメラ遺伝子を含有してもよく、又はより好ましくは、宿主細胞の核若しくはプラスチドゲノム中に集積された核酸分子若しくはキメラ遺伝子を含む。
本明細書において使用される場合、用語「植物」は、植物細胞、植物組織又は器官、植物プロトプラスト、そこから植物が再生されることのできる植物細胞組織培養、植物カルス、植物細胞凝集塊、及び植物中で無傷である植物細胞、又は胚、花粉、胚珠、果実（例えば、収穫されたトマト）、花、葉、種子、根、毛根などのような植物の部分を含む。
この文書において及びその請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用形は、その非限定的な意味で使用されて、この単語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されない項目が除外されないことを意味する。これは、動詞「から本質的になる」及び「からなる」を包含する。
加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、要素のうちの１つ及び１つのみが存在することを文脈が明らかに要求しない限り、要素のうちの複数が存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。さらに、本明細書において「配列」に言及する場合、一般に、サブユニット（例えば、アミノ酸）のある特定の配列を含む実際の物理的な分子が言及される。
発明の詳細な説明
本発明者らは、植物における、アクティブ変異を有する非内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現と組み合わせた内在性ＣＥＮＰＣの排除が、育種のために有用な性質を有する植物をもたらすことを見出した。そのような植物が半数体インデューサー系統として機能しうることが見出された。そのような半数体インデューサー系統が、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を有する植物と交配される場合、結果として生じる後代の一部は、半数体インデューサー系統由来の染色体を欠いており、それによって半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の産生を可能とする。半数体植物は、育種を改善するために有用である。
有糸分裂におけるＤＮＡの等しい分配は、キネトコアと呼ばれる大きなタンパク質性集合体のセントロメアＤＮＡ上への構築を必要とする。キネトコアは、セントロメア上に集合して、紡錘体微小管を結合し、細胞分裂の間の正確な染色体分離を促進するマルチサブユニットの複合体である。構成的セントロメア関連ネットワーク（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＣＣＡＮ）と名付けられた１６サブユニットの複合体が、セントロメア－キネトコア界面を作り出す。ＣＣＡＮサブユニットであるＣＥＮＰＣは、セントロメアをキネトコアの微小管結合界面と連結するため、キネトコアの構築にとって極めて重要である。ＣＣＡＮ機構におけるＣＥＮＰＣの正確な役割はいまだ完全に理解されていないが、ある特定のデータは、キネトコア構築のための青写真としてＣＥＮＰＣを挙げる。ＣＥＮＰＣが枯渇すると、セントロメア及びキネトコア両方の適切な形成が妨害される。
アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質
本発明は、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質を提供する。そのようなアクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質は、１つ又は複数のアクティブ変異を含む。アクティブ変異を有し、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現を欠く又は発現の抑制されたそのようなＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物が、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する野生型植物に交配された場合、比較的高い頻度で半数体植物が形成される。アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質は、当業者に公知の様々な手段により創出されうる。これらは、制限なく、ランダム変異誘発、単一又は複数アミノ酸標的変異誘発、完全な又は部分的なタンパク質ドメイン欠失の生成、異種アミノ酸配列との融合などを含む。典型的に、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ノックアウトされるか又は不活性化される。半数体植物は、少なくとも、０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ以上のような、正常な頻度を超えて形成される。アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質は、例えば、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を欠く植物におけるアクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質の組換え発現、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物にトランスジェニック植物を交配すること、次いで、半数体後代の産生についてスクリーニングすることによって試験されうる。
アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質を生成するために、任意の数の変異が内在性ＣＥＮＰＣタンパク質に導入されうる。例えば、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上のアミノ酸以外は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質と同一であってもよい。
アクティブ変異は、ＣＥＮＰＣモチーフ中に存在しないことが好ましい。
ＣＥＮＰＣタンパク質は、植物ＣＥＮＰＣタンパク質であることが好ましい。植物は任意の植物であってもよいが、ナス科に、より好ましくはナス属に、さらにより好ましくはトマト種に属することが好ましい。
ある実施形態において、１つ又は複数のアクティブ変異は、配列番号２、３、４、若しくは１５～１９のいずれかに示すアミノ酸配列によって表される内在性ＣＥＮＰＣタンパク質、又は配列番号２、３、４、若しくは１５～１９のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上、例えば、１００％のアミノ酸配列同一性を、好ましくは長さ全体にわたって有するその変異体において引き起こされる。アミノ酸配列同一性は、上で定義されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム並びにＧＡＰデフォルトパラメータを使用するペアワイズアライメントにより決定される。
アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質内のアクティブ変異は、タンパク質のあらゆる場所に位置する可能性がある。ある実施形態において、アクティブ変異は、配列番号３若しくは４のいずれかに示されるアミノ酸配列により表される内在性ＣＥＮＰＣタンパク質、又は本明細書に教示される配列番号３若しくは４に示されるアミノ酸配列を有するＣＥＮＰＣタンパク質の変異体のアミノ酸残基Ｇｌｕ５４８～Ｐｒｏ５６２の間に位置する。
アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質内のアクティブ変異は、配列番号２、又は本明細書に教示される配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＥＮＰＣタンパク質の変異体のアミノ酸残基Ｇｌｕ５５１～Ｈｉｓ５６５の間に位置しうる。
ある実施形態において、（そのアミノ酸配列が配列番号４に示される）内在性トマトＣＥＮＰＣタンパク質のアミノ酸残基５５２、５５３、５５４、５５５又は５５６に対応する位置のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が変異している。例えば、配列番号４、又は本明細書に教示される配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＥＮＰＣタンパク質の変異体の５５４位のアスパラギン酸、５５５位のアスパラギン、若しくは５５６位のメチオニン、或いは配列番号２若しくは３のいずれかにおける対応するアミノ酸残基が変異していてもよい。
配列番号２又は本明細書に教示されるその変異体において、Ａｓｐ５５７は配列番号４のアミノ酸配列のＡｓｐ５５４に対応し、Ａｓｎ５５８は配列番号４のアミノ酸配列のＡｓｎ５５５に対応し、Ｍｅｔ５５９は配列番号４のアミノ酸配列のＭｅｔ５５６に対応する。配列番号３又は本明細書に教示されるその変異体において、Ａｓｐ５５４は配列番号４のアミノ酸配列のＡｓｐ５５４に対応し、Ａｓｎ５５５は配列番号４のアミノ酸配列のＡｓｎ５５５に対応し、Ｍｅｔ５５６は配列番号４のアミノ酸配列のＭｅｔ５５６に対応する。
配列番号４若しくはその変異体のアミノ酸配列の５５４位のアミノ酸残基、或いは配列番号２若しくは３のいずれか又は本明細書に教示されるその変異体におけるこのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基、例えば、アスパラギン酸は、例えば、ヒスチジン、リシン若しくはアルギニン、好ましくはリシンのような正電荷を有するアミノ酸残基に変異していてもよい。配列番号４若しくはその変異体のアミノ酸配列の５５５位のアミノ酸残基、或いは配列番号２若しくは３のいずれか又は本明細書に教示されるその変異体におけるこのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基、例えば、アスパラギンは、例えば、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン、好ましくはチロシンのような芳香族アミノ酸残基に変異していてもよい。配列番号４若しくはその変異体のアミノ酸配列の５５６位のアミノ酸残基、或いは配列番号２若しくは３のいずれか又は本明細書に教示されるその変異体におけるこのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基、例えば、メチオニンは、例えば、グリシン、セリン、システイン、アラニン、スレオニン又はバリン、好ましくはバリンのような小さな側鎖を有するアミノ酸残基に変異していてもよい。
ある実施形態において、配列番号３若しくは４のいずれかに示されるアミノ酸配列により表される内在性ＣＥＮＰＣタンパク質、又は本明細書に教示されるその変異体のアミノ酸残基Ｇｌｕ５４８～Ｐｒｏ５６２の間、特にアミノ酸残基５５２～５５３の間、或いは配列番号２に示されるアミノ酸配列により表されるＣＥＮＰＣタンパク質、又は本明細書に教示されるその変異体のアミノ酸残基Ｇｌｕ５６１～Ｐｒｏ５６５の間のドメインにアミノ酸残基が挿入されていてもよい。
例えば、配列番号３若しくは４に示されるアミノ酸配列、又は本明細書に教示されるその変異体のアミノ酸残基５５２～５５３の間、或いは配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は本明細書に教示されるその変異体のアミノ酸残基５５５～５５６の間に、Ｈｉｓ残基のような正電荷を有する残基が挿入されていてもよい。
ある実施形態において、配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基５５２～５５３の間に挿入されているアミノ酸残基は、グルタミン残基ではない。
ある実施形態において、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質をもたらすために、配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列を有する内在性ＣＥＮＰＣタンパク質、又はその変異体において引き起こされるアクティブ変異は、アミノ酸残基５５２～５５３の間のＨｉｓの挿入（５５２＿５５３ｉｎｓＨ）、並びに変異Ｄ５５４Ｋ、Ｎ５５５Ｙ、Ｍ５５６Ｖ、又は５５２＿５５３ｉｎｓＨ／Ｄ５５４Ｋ／Ｎ５５５Ｙ／Ｍ５５６Ｖ、５５２＿５５３ｉｎｓＨ／５５４Ｋ／Ｎ５５５Ｙ、５５２＿５５３ｉｎｓＨ／Ｄ５５４Ｋ／Ｍ５５６Ｖ、５５２＿５５３ｉｎｓＨ／Ｎ５５５Ｙ／Ｍ５５６Ｖ、５５２＿５５３ｉｎｓＨ／Ｄ５５４Ｋ、５５２＿５５３ｉｎｓＨ／Ｎ５５５Ｙ、５５２＿５５３ｉｎｓＨ／Ｍ５５６Ｖ、Ｄ５５４Ｋ／Ｎ５５５Ｙ、Ｄ５５４Ｋ／Ｍ５５６Ｖ、及びＮ５５５Ｙ／Ｍ５５６Ｖのようなその任意の組合せ、或いは配列番号２、又はその変異体における対応する変異（Ｄ５５７Ｋ、Ｎ５５８Ｙ、Ｍ５５９Ｖ及び５５５＿５５６ｉｎｓＨ）からなる群から選択される。
アクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ベクター、宿主細胞
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ分子のような、上記タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドも提供される。遺伝コードの縮重により、様々な核酸配列が同じアミノ酸配列をコードしうる。ＣＥＮＰＣタンパク質又はその変異体をコードする任意のポリヌクレオチドは、本明細書において「ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチド」と呼ばれる。提供されるポリヌクレオチドは、自然起源の、人工の又は合成の核酸配列を含む。配列がＤＮＡ配列として示されるが、ＲＮＡが言及される場合、ＲＮＡ分子の実際の塩基配列は、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換されているという相違以外は同一であると理解される。
本発明は、さらに、本明細書に教示されるアクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。上記ポリヌクレオチドは、合成、組換え及び／又は単離されたポリヌクレオチドであってもよい。ある実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１１若しくは１４の核酸配列、又は配列番号１１若しくは１４の核酸配列に対して、好ましくは全長にわたって、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９５％のような、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含む、内在性ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチドに由来し、これは、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの内在性ＣＥＮＰＣ活性を共有する。対照的に、本明細書に教示されるアクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、それが由来する内在性ＣＥＮＰＣタンパク質のＣＥＮＰＣ活性の９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０％未満まで、内在性ＣＥＮＰＣ活性を低減又は除去する、１つ又は複数のアクティブ変異を含む。ＣＥＮＰＣ活性は、例えば、蛍光のレベルがＣＥＮＰＣ活性の尺度である、ＧＦＰ融合を使用して、染色体の分離中のセントロメアの局在を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されうる。代替的には、酵母ツーハイブリッド相互作用が、ＣＥＮＰＣタンパク質と相互作用するすべての公知のタンパク質及び／又はセントロメアＤＮＡを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されうる。この相互作用が損なわれると、ＣＥＮＰＣの機能が損なわれる。
ある実施形態において、配列番号１４の核酸配列を含むポリヌクレオチドの１６６０～１６６８位における１つ又は複数のヌクレオチドは、その中で配列番号４のアミノ酸配列が、変更された５５４位及び／又は５５５位及び／又は５５６位のアミノ酸残基を有するＣＥＮＰＣタンパク質をこのポリヌクレオチドがコードするように、修飾されている。
ある実施形態において、配列番号１１の核酸配列を含むポリヌクレオチドの２２４９～２４５０位及び／又は２４５４～２４６２位における１つ又は複数のヌクレオチドは、その中で配列番号４のアミノ酸配列が残基５５２～５５３の間に挿入されたアミノ酸残基を有し、並びに／或いは５５４位及び／又は５５５位及び／又は５５６位に変更されたアミノ酸残基を有するＣＥＮＰＣタンパク質をこのポリヌクレオチドがコードするように、修飾されている。
例えば、配列番号４、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＥＮＰＣタンパク質の本明細書に教示される変異体のいずれかの５５４位のアスパラギン酸、５５５位のアスパラギン若しくは５５６位のメチオニン、或いは配列番号２若しくは３のいずれか又は本明細書に教示されるその変異体の対応するアミノ酸残基は変異されてもよい。配列番号４又はその変異体のアミノ酸配列の５５４位のアミノ酸残基、或いは、配列番号２若しくは３のいずれか又は本明細書に教示されるその変異体のこのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基、例えば、アスパラギン酸は、例えば、ヒスチジン、リシン若しくはアルギニン、好ましくはリシンのような正電荷を有するアミノ酸残基に変異されてもよい。配列番号４又はその変異体のアミノ酸配列の５５５位のアミノ酸残基、或いは、配列番号２若しくは３のいずれか又は本明細書に教示されるその変異体のこのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基、例えば、アスパラギンは、例えば、フェニルアラニン、トリプトファン若しくはチロシン、好ましくはチロシンのような芳香族アミノ酸残基に変異されてもよい。配列番号４又はその変異体のアミノ酸配列の５５６位のアミノ酸残基、或いは、配列番号２若しくは３のいずれか又は本明細書に教示されるその変異体のこのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基、例えば、メチオニンは、例えば、グリシン、セリン、システイン、アラニン、スレオニン若しくはバリン、好ましくはバリンのような小さな側鎖を有するアミノ酸残基に変異されてもよい。
ある実施形態において、活性に変異したＣＥＮＰＣタンパク質をもたらすために、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質において引き起こされるアクティブ変異は、５５２＿５５３ｉｎｓＨ、Ｄ５５４Ｋ、Ｎ５５５Ｙ、Ｍ５５６Ｖ、又は本明細書に教示される任意のその組合せからなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号７、９、１２又は１３のいずれかの核酸配列を含む。
本発明の一実施形態において、上記の（アクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣタンパク質又はその変異体若しくは断片を含む）ＣＥＮＰＣタンパク質をコードする核酸配列は、ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への導入及び形質転換された細胞（複数可）に由来する細胞、組織、器官又は生物のような宿主細胞におけるＣＥＮＰＣタンパク質（複数可）の産生のためのキメラ遺伝子及び／又はベクターを作製するために使用される。植物細胞における本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質（又はそのタンパク質断片若しくは変異体）の産生のためのベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
ＣＥＮＰＣタンパク質の発現のための好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母又は高等真核細胞が挙げられる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主とともに使用するのに適したクローニング及び発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８５年）に記載されている。本明細書に記載の核酸配列由来のＲＮＡを使用して本発明のタンパク質を産生するために、無細胞翻訳システムも採用されうる。
好適な原核生物宿主細胞としては、グラム陰性及びグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又は桿菌が挙げられる。別の好適な原核生物宿主細胞は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が挙げられる。
本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質は、例えば、サッカロミセス属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の酵母宿主細胞においても発現されうる。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）又はクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の酵母属も採用されうる。
代替的には、本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質は、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞、任意選択で非ヒト細胞を含む、高等真核生物宿主細胞において発現されてもよい。
本発明の一実施形態は、本明細書に教示されるポリヌクレオチドを含むように改変された非ヒト生物である。非ヒト生物及び／又は宿主細胞は、例えば、脂質及びウイルスベクターのような送達デバイスの使用、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、化学的方法及び粒子媒介性遺伝子導入を含む、遺伝子導入のための本分野で公知の任意の方法により改変されてもよい。有利な実施形態において、非ヒト生物は植物である。
任意の植物細胞が好適な宿主細胞でありうる。好適な植物細胞としては、単子葉植物又は双子葉植物由来のものが挙げられる。例えば、植物は、（トマトを含む）ナス属、タバコ属、トウガラシ属、ペチュニア属及び他の属に属しうる。以下の宿主種：タバコ（タバコ種、例えば、Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、Ｎ．プルムバギニフォリア（Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）、Ｎ．タバクム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）など）、例えば、チェリートマト、セラシフォルム（ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ）変種又はカラントトマト、ピンピネリフォリウム（ｐｉｍｐｉｎｅｌｉｆｏｌｉｕｍ）変種又はツリートマト（タマリロ（Ｓ．ｂｅｔａｃｅｕｍ）、キフォマンドラ・ベタケア（Ｃｙｐｈｏｍａｎｄｒａ ｂｅｔａｃｅａｅ）の同義語）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ナス（ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ））、ペピーノ（ソラヌム・ムリカツム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｕｒｉｃａｔｕｍ））、ココナ（ソラヌム・セシリフロラム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒｕｍ））及びナランジラ（ソラヌム・キトエンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｑｕｉｔｏｅｎｓｅ））、ペッパー（トウガラシ、キダチトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｕｔｅｓｃｅｎｓ）、キイロトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｂａｃｃａｔｕｍ））のようなトマト（Ｌ．エスキュレンツム（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トマトの同義語）のような野菜種、観賞用種（例えば、ニチニチアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、ペチュニア・アキシラリス（Ｐｅｔｕｎｉａ ａｘｉｌｌａｒｉｅｓ）、Ｐ．インテグリフォリア（Ｐ．ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、コーヒーノキ（コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ））が好適に使用されうる。
代替的には、植物は、ウリ科又はイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）のような任意の他の科に属してもよい。好適な宿主植物としては、例えば、トウモロコシ／コーン（ゼア（Ｚｅａ）種）、コムギ（トリティクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）種）、オオムギ（例えば、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、エンバク（例えば、アベナ・サティバ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ））、モロコシ（タカキビ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ））、ライムギ（セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、ダイズ（グリキーネ種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐｐ．）、例えば、Ｇ．マックス（Ｇ．ｍａｘ））、ワタ（ゴシピウム種（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、Ｇ．ヒルスツム（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、Ｇ．バルバデンセ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ））、アブラナ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、芽キャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、カブ（Ｂ．ｒａｐａ）など）、ヒマワリ（ヘリアンサス・アヌース（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ））、紅花、ヤム、キャッサバ、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、コメ（オリザ種（Ｏｒｙｚａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、Ｏ．サティバ・インディカ栽培品種群（Ｏ．ｓａｔｉｖａ ｉｎｄｉｃａ ｃｕｌｔｉｖａｒ－ｇｒｏｕｐ）、又はジャポニカ栽培品種群（ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｕｌｒｉｖａｒ ｇｒｏｕｐ））、飼料草、パールミレット（ペニセツム種（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、トウジンビエ（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ））、樹木種（松果体、ポプラ、モミ、プラシテンなど）、チャノキ、コーヒーノキ、油やし、ココナッツ、エンドウ、ズッキーニ、マメ（例えば、インゲンマメ種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ Ｓｐｅｃｉｅｓ））、キュウリ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、ニンニク、リーク、レタス、タマネギ、ラディッシュ、カブ、芽キャベツ、ニンジン、カリフラワー、チコリ、セロリ、ホウレンソウ、エンダイブ、フェンネル、ビーツ、生果実を含む植物（ブドウ、モモ、プラム、イチゴ、マンゴー、リンゴ、プラム、サクランボ、アプリコット、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、ミカン、キーウィ、イチジク、レモン、ライム、ネクタリン、ラズベリー、スイカ、オレンジ、グレープフルーツなど）のような野菜種、観賞用種（例えば、バラ、ペチュニア、キク、ユリ、ガーベラ種）、ハーブ（ミント、パセリ、バジル、タイムなど）、木質性樹木（ｗｏｏｄｙ ｔｒｅｅ）（例えば、ハコヤナギ、シダレヤナギ、コナラ、ユーカリ）、繊維種、例えば、麻（アマ）及び大麻（カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ））、又はシロイヌナズナのようなモデル生物が挙げられる。
好ましい宿主細胞は、「作物植物」又は「栽培植物」、すなわち、ヒトにより栽培され、育種される植物種に由来する。作物植物は、食品若しくは飼料目的（例えば、農作物）のため、又は鑑賞目的（例えば、切り花、芝生のための草の生産など）のために栽培されうる。本明細書に定義される作物植物としては、燃料のための油、プラスチックポリマー、医薬品、コルク、（ワタのような）繊維などのような、非食品製品がそこから収穫される植物も挙げられる。
本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質をコードする核酸配列の宿主細胞のゲノムへの、好ましくは安定な、導入のためのキメラ遺伝子及びベクターの構築は、当分野で一般に公知である。キメラ遺伝子を生成するために、本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質をコードする核酸配列が、標準的な分子生物学の技術を使用して、宿主細胞における発現に好適なプロモーター配列に操作可能に連結される。ＣＥＮＰＣタンパク質をコードする核酸配列が、単純にプロモーター配列の下流のベクター中に挿入されるように、プロモーター配列はすでにベクター中に存在してもよい。次いで、ベクターは、宿主細胞を形質転換するために使用されることができ、キメラ遺伝子は、核ゲノム又はプラスチド、ミトコンドリア若しくは葉緑体ゲノム中に挿入されて、好適なプロモーターを使用して発現されることができる（例えば、Ｍｃ Ｂｒｉｄｅら、１９９５年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３巻、３６２ページ；米国特許第５，６９３，５０７号）。ある実施形態において、本明細書に教示されるキメラ遺伝子は、本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結された、植物細胞又は微生物細胞（例えば、細菌）における発現のための好適なプロモーターであって、任意選択で３’非翻訳核酸配列がその後に続く、プロモーターを含む。細菌はその後、植物の形質転換に使用されてもよい（アグロバクテリウム媒介性の植物形質転換）。
アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣポリペプチドを発現する植物
本発明は、本明細書に教示されるアクティブ変異を有するＣＥＮＰＣポリペプチドを発現する植物又は植物細胞を提供する。本発明は、本明細書に教示されるポリヌクレオチド、本明細書に教示されるキメラ遺伝子又は本明細書に教示されるベクターを含む植物も提供する。植物は、好ましくはナス科に、より好ましくはナス属に、なおより好ましくはトマト種に属する。
植物又は植物細胞は、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現しないか、又は低減したレベル（例えば、野生型レベルの９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０％未満）で発現することが好ましい。例えば、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の活性又は発現を低減させるか又は除去する変異を内在性ＣＥＮＰＣタンパク質に作り出すことができ、又は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質のノックアウトを作り出すことができる。この場合、遺伝子のノックアウト又は変異のためのヘテロ接合性植物を作り出すことができ、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質の発現のための発現ベクターを植物に導入することができる。次いで、変異又はノックアウトのためにホモ接合性であるが、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質を含む、ヘテロ接合体由来の後代が選択されうる。
したがって、本明細書に教示される植物又は植物細胞において、上記植物又は植物細胞が顕著に又は本質的に完全に、すなわち、本明細書に教示されるアクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質の補完的発現のない胚の致死性を誘導するのに十分に、内在性ＣＥＮＰＣ活性を欠くように、一方又は両方の内在性ＣＥＮＰＣアレルがノックアウトされるか又は変異させられることが好ましい。二倍体を超える染色体の組を有する植物において、すべての内在性ＣＥＮＰＣアレルは、不活性化され、変異させられ又はノックアウトされてもよい。代替的には、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現は、当分野で公知の任意の方法で、例えば、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現を低減させ又は排除するｓｉＲＮＡ又はマイクロＲＮＡを導入することにより、発現停止されてもよい。理想的には、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現停止させるが、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質は発現停止させない、発現停止剤が選択される。
植物の生成のための方法
（標的ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）又はオリゴ特異的変異誘発（ｏｌｉｇｏ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＯＤＭ）とも呼ばれる）標的変異誘発法を使用して、内在性ＣＥＮＰＣ遺伝子を修飾することは、本発明の一実施形態である。標的変異誘発法としては、制限なく、植物プロトプラストへの、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９様、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ若しくはＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲシステムを採用するもの、又はＣＥＮＰＣ遺伝子に相補的な配列により変異誘発を促進するための、化学修飾されたヌクレオチドを含有する可能性のある変異誘発性のオリゴヌクレオチドを採用する標的変異誘発（例えば、ＫｅｙＢａｓｅ（登録商標）又はＴＡＬＥＮ）が挙げられる。
代替的には、アクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質をコードするＣＥＮＰＣ遺伝子を含む植物系統を生成するために、ＴＩＬＬＩＮＧ（どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；ＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８巻：４５５ページ及びＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２３巻、４３９～４４２ページ）のような変異誘発システムが使用されてもよい。ＴＩＬＬＩＮＧは、伝統的な化学的変異誘発（例えば、ＥＭＳ変異誘発）、その後に続く変異に関するハイスループットスクリーニングを使用する。よって、所望の変異を有するＣＥＮＰＣ遺伝子を含む植物、種子及び組織が得られうる。
この方法は、植物種子に変異を起こさせるステップ（例えば、ＥＭＳ変異誘発）、植物個体又はＤＮＡをプールするステップ、目的の領域のＰＣＲ増幅ステップ、ヘテロ二本鎖の形成及びハイスループット検出ステップ、変異体植物の同定ステップ、変異体ＰＣＲ産物のシーケンシングステップを含みうる。そのような改変植物を生成するために、他の変異誘発及び選択方法が同等に使用されうることは理解される。例えば、種子が照射されるか又は化学処理されてもよく、植物が改変表現型に関してスクリーニングされてもよい。
改変植物は、非改変植物、すなわち、野生型植物から、ＤＮＡ中に存在する変異（複数可）のような分子的方法により及び改変表現型の特徴により識別することができる。改変植物は、変異に関してホモ接合性又はヘテロ接合性でありうる。
よって、本明細書に教示される植物を作製する方法が提供され、この方法は、ｉ）植物細胞内の内在性植物ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチドを修飾して、アクティブ変異を有する、植物ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチドを得るステップと；ｉｉ）アクティブ変異を有する、植物ＣＥＮＰＣをコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと；ｉｉｉ）任意選択で、上記植物細胞から植物を再生するステップとを含む。
本発明は、本明細書に教示される植物を作製するための方法であって、ｉ）本明細書に教示されるポリヌクレオチド、本明細書に教示されるキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されるベクターを使用して、植物細胞を形質転換するステップと；ｉｉ）上記ポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと；ｉｉｉ）任意選択で、上記植物細胞から植物を再生するステップとを含む、方法も提供する。
本明細書に教示される植物を作製するための方法は、内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド又は上記植物細胞内での上記ポリヌクレオチドの発現に関与する任意の他の内在性植物ポリヌクレオチドを修飾して、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現を防止するステップをさらに含んでもよい。
本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド、好ましくはＣＥＮＰＣタンパク質をコードするキメラ遺伝子は、従来の方法で単一の植物細胞の核ゲノム中に安定に挿入されることができ、そのようにして形質転換された植物細胞は、従来の方法において使用されて、ある特定の時点におけるある特定の細胞中の本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質の存在により、変更された表現型を有する形質転換された植物を生成することができる。これに関して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス中の本明細書に教示されるＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＴ－ＤＮＡベクターは、植物細胞を形質転換するために使用されることができ、その後、例えば、欧州特許第０１１６７１８号、同第０２７０８２２号、国際公開第８４／０２９１３号及び欧州特許出願公開第０２４２２４６号に、並びにＧｏｕｌｄら、（１９９１年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９５巻、４２６～４３４ページ）に記載の手順を使用して、形質転換された植物が再生されうる。アグロバクテリウム媒介性の植物形質転換のためのＴ－ＤＮＡベクターの構築は、当分野で周知である。Ｔ－ＤＮＡベクターは、欧州特許第０１２０５６１号及び同第０１２０５１５号に記載のバイナリーベクター又は欧州特許第０１１６７１８号に記載の相同組換えによりアグロバクテリウムＴｉプラスミド中に組み入れることのできる共挿入ベクターのいずれかであってもよい。
同様に、形質転換された植物細胞からの形質転換された植物の選択及び再生は、当分野で周知である。明らかに、異なる種ごとに、さらには単一の種の様々な亜種又は栽培品種ごとにも、高頻度で形質転換体が再生されるように具体的にプロトコールを適合させる。
結果として生じる形質転換された植物は、その後倍加半数体となりうる半数体植物を産生するために、従来の植物育種スキームにおいて使用されうる。
半数体植物及び／又は倍加半数体植物の生成のための方法
本発明は、半数体植物、異常な倍数性を有する植物又は倍加半数体植物を生成する方法であって、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物を、本明細書に教示される植物に交配するステップと、半数体植物、異常な倍数性を有する植物又は倍加半数体植物を選択するステップとを含む、方法にも関する。
当業者は、半数体植物を選択することができる。代表的な技術としては、フローサイトメトリー又は特異的なＳＮＰコーリングによるバリデーションが挙げられる。
内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する上記植物は、Ｆ１植物であってもよい。
内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物は、交配の花粉親であってもよく、又は交配の胚珠親であってもよい。
内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現を欠いてキネトコア複合体に加わり、本明細書に教示されるアクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質を発現する、本明細書に教示される植物を、野生型植物に交配することは、半数体であって内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物由来の染色体のみを含む、少なくともいくつかの後代をもたらす。よって、本発明は、目的の植物を本明細書に教示されるアクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物と交配し、生じた半数体種子を収集することによって、その染色体のすべてが目的の植物に由来する、半数体植物の生成を可能とする。
よって、親の遺伝子型に依存しない正確な分子変化により、ゲノム排除が操作されうる。ＣＥＮＰＣタンパク質はいかなる植物種にも見出される。これは、半数体細胞の組織培養及び遠縁交雑のような半数体植物産生のための従来の方法が成功しない種において半数体植物を作製することを可能とする。
本明細書に教示されるアクティブ変異を有するＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物は、雄親又は雌親のいずれかとして交配されてもよい。本明細書に教示される方法は、親染色体の母系細胞質への導入を可能にする。よって、単一のステップにおいて、所望の遺伝子型を有する細胞質雄性不稔系統を生成することができる。
加えて、本開示は、倍加半数体植物を生成する方法であって、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物を、本明細書に教示される改変植物に交配するステップと；半数体植物を選択するステップと；上記半数体植物を倍加半数体植物に転換するステップとを含む方法を教示する。
よって、半数体植物は、ひとたび生成されると、染色体の正確な二本鎖コピーを含む倍加半数体植物の生成に使用することができる。半数体生物から倍加半数体生物を生成するために多種多様な方法が公知である。半数体植物を倍加半数体植物に転換するために、例えば、コルヒチンのような化学物質が適用されてもよい。代替的には、倍数体は、胚発生の間又は植物の後期発生段階において自発的に倍加しうる。
ある実施形態において、本明細書に教示される半数体植物、異常な倍数性を有する植物及び／又は倍加半数体植物の生成のための方法は、上記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない。その代わりに、交配の間に一組の染色体が排除される。
Ｆ１、Ｆ２又は所望の形質を有する次世代の植物を生成するために、倍加半数体植物は他の植物にさらに交配されうる。
トランスジェニック又は変異誘発された遺伝子を保有しない倍加半数体植物が得られうる。加えて、倍加半数体植物は、ハイブリッドＦ１から速やかにホモ接合性のＦ２を創出することができる。
配列表
配列番号１：コンセンサスＣＥＮＰＣモチーフ、タンパク質配列
配列番号２：コンセンサスナス科ＣＥＮＰＣタンパク質配列
配列番号３：コンセンサスナス属ＣＥＮＰＣタンパク質配列
配列番号４：トマトＣＥＮＰＣタンパク質配列（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１２０３４０．２．１）
配列番号５：コンセンサスナス科ＣＥＮＰＣ ＤＨ－インデューサードメインタンパク質配列
配列番号６：コンセンサスナス属ＣＥＮＰＣ ＤＨ－インデューサードメインタンパク質配列
配列番号７：トマトＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙコード配列
配列番号８：トマトＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｈ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙタンパク質配列
配列番号９：トマトＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖコード配列
配列番号１０：トマトＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖタンパク質配列
配列番号１１：トマトＣＥＮＰＣゲノムＤＮＡ配列（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１２０３４０．２．１）
配列番号１２：トマトＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５ＹゲノムＤＮＡ配列
配列番号１３：トマトＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６ＶゲノムＤＮＡ配列
配列番号１４：トマトＣＥＮＰＣコード配列（Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１２０３４０．２．１）
配列番号１５：コンセンサスウリ科ＣＥＮＰＣタンパク質配列
配列番号１６：コンセンサスアブラナ科ＣＥＮＰＣタンパク質配列
配列番号１７：コンセンサスマメ科ＣＥＮＰＣタンパク質配列
配列番号１８：コンセンサスイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ＣＥＮＰＣタンパク質配列
配列番号１９：コンセンサスバラ科ＣＥＮＰＣタンパク質配列
材料及び方法
植物材料
２つのトマト栽培品種、すなわち、「ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋」及び「ＭｉｃｒｏＴｏｍ」を使用した。国際公開第２００７／０３７６７８号及び同第２００９／０４１８１０号に記載の方法に従って、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋トマトの変異体集団から、遺伝子ＣＥＮＰＣにおける２つの体細胞非同義変異体、すなわちＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ及びＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖを選択した。ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異は、スプライス受容部位の変異によるタンパク質の５５２～５５３位の間の追加のアミノ酸残基の挿入とともに、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質のアミノ酸残基５５４及び５５５にある。ＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖは、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質のアミノ酸残基５５６において変異している。国際公開第２００７／０３７６７８号及び同第２００９／０４１８１０号に記載の方法に従って、同じＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋トマト変異体集団から、遺伝子Ｍｓｉ２における体細胞同義変異体、すなわち、Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄを選択し、これはアミノ酸３３７位において変異している。選択した変異体植物を自家授粉させ、子孫において、それぞれ、変異した遺伝子座（複数又は単数）についてホモ接合性であった植物を選択した。
方法
片親ゲノムの排除及び結果として生じる半数体植物の産生を、いわゆる半数体インデューサー系統と別の非半数体インデューサー系統、例えば、育種系統又はＭｉｃｒｏＴｏｍの間の交配を行うことによって誘発した。高い温度が、一部の場合のみではあるが、片親ゲノムの排除を起こすのに好ましい効果を及ぼすことが分かっている（Ｓａｎｅｉら、ＰＮＡＳ １０８．３３（２０１１年）；Ｅ４９８～Ｅ５０５）ため、片親ゲノムの排除のためのトマト系統の交配を、比較的高温（２６～２８℃）で実施した。
結果
ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異体におけるＧからＴ、ＧからＡ、ＣからＡ及びＡからＴの非同義変異は、タンパク質レベルで３つの変化をもたらした。（１）野生型配列「ｔａｇｃａｇ＾ＧＴＴ」（小文字の状態のイントロン６、大文字の状態のエクソン７の最初のコドン、スプライス部位はキャレット記号で示される）を含むエクソン７の直前のスプライス受容部位は、ＧからＴへの変異を有し、これは、新規スプライス受容部位：「ｔａｇ＾ＣＡＴＧＴＴ」の創出をもたらした。これにより、ヒスチジンをコードする「ＣＡＴ」コドンが、アミノ酸５５２～５５３位の間に挿入され、５’末端においてエクソン７を伸長している（配列番号７）。（２）ＧからＡ及びＣからＡの変異は、タンパク質の５５４位におけるアスパラギン酸からリシンへのアミノ酸修飾をもたらした。（３）ＡからＴへの変異は、タンパク質の５５５位におけるアスパラギンからチロシンへの修飾をもたらした。ＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖ変異体におけるＡからＧの非同義変異は、タンパク質の５５６位におけるメチオニンからバリンへのアミノ酸修飾をもたらした。Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ変異体におけるＣからＴの同義変異は、アミノ酸修飾をもたらさなかった。さらに、この植物は、変異体集団からの選択の間、同様に取り扱われ、ＣＥＮＰＣ遺伝子におけるいかなる変異もなかった。したがって、Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ変異体を、片親ゲノム排除交配（ｕｎｉ－ｐａｒｅｎｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｒｏｓｓｅｓ）のための対照として使用した。
ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ、ＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖ又はＭｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ変異についてホモ接合性である変異体植物を、非変異野生型ＭｉｃｒｏＴｏｍ植物を雌株又は花粉ドナーとして使用する比較的高温（２６～２８℃）での交配における花粉ドナーとして及び雌株としてそれぞれ使用した。表１は、行ったすべての交配の概要及びＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型について評価した子孫植物の数を列挙する。
Figure 2022028656000001
表１に列挙したＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ、ＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖ、Ｍｓｉ＿Ｄ３３７ＤとＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋の交配に由来する種子を蒔き、フローサイトメトリーによってそのＤＮＡ含有量に関して植物を評価した。フローサイトメトリー分析は、異数性であることが分かった２０１５年のＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖ×ＭｉｃｒｏＴｏｍの交配から生じた１つの植物を除き、試験したすべての植物について、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋のような野生型トマト栽培品種と同様の正常な二倍体の倍数性レベルのみの決定をもたらした。栽培品種ＭｉｃｒｏＴｏｍは、劣性であることが公知の矮性表現型を有する（Ｍａｒｌｉら、Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ、５７巻、９号、２０３７～２０４７ページ、２００６年）。ＭｉｃｒｏＴｏｍの、例えば、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋野生型栽培品種への又はそれとの交配後、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋野生型栽培品種の不確定な非矮性表現型を有する子孫のみを認めた。Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ同義変異体とＭｉｃｒｏＴｏｍの交配について同じことが認められ；ＭｉｃｒｏＴｏｍとＭｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ変異体の交配のすべての子孫は、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋親の不確定な非矮性表現型を示した。注目すべきことに、雄親又は雌親としてＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙを使用して、全部で８つの植物が、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を示したことが分かった。さらに雄親としてＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖを使用して、全部で５つの植物が、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を示したことが分かった。ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を有する、言及した１３個すべての植物に関して、その表現型は、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋親の遺伝物質が、生じた子孫の一部ではないことを示しており、これは、これら１３個の子孫が、半数体ＭｉｃｒｏＴｏｍ起源であることを示している。ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を有する１３個すべての子孫植物の倍数性は、二倍体であることが分かり、これは、トマトにとっては例外的に高い出現頻度を有すると記載されている現象である、自発的な倍加が起こったことを示している（Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６２号－２０１２年１２月）。
ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を有するＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ子孫に関して、片親ゲノムの排除が起こったか否か、及びどの程度であったかを決定するために、２０１４年の子孫について、１２個のトマト染色体のそれぞれにわたって広がる、全４４の位置について一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイを行った（１、２、３、４、５、６、１０及び１２番染色体上の４つのＳＮＰ；８及び１１番染色体上の３つのＳＮＰ；９番染色体上の２つのＳＮＰ）。２０１５年の子孫について同じ分析を、ここでは、２２の位置（１、２、３、４、５、６、７、８、１０及び１２番染色体上の２つのＳＮＰ；９及び１１番染色体上の１つのＳＮＰ）について実施した。選択した一塩基多型は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ親に関して一塩基対についてホモ接合性であり、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋親におけるＭｉｃｒｏＴｏｍ塩基対以外はすべてについてホモ接合性であった。野生型ＭｉｃｒｏＴｏｍ栽培品種とＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋栽培品種の間の通常の交配は、ヘテロ接合性の一塩基多型スコアをもたらした。しかしながら、片親ゲノム排除のプロセスが起こった場合、半数体インデューサー系統ゲノムの損失が予想される。
一塩基多型試験は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型も示す８個の子孫植物のそれぞれについてＭｉｃｒｏＴｏｍ親由来のホモ接合性塩基対スコアのみのコールをもたらし、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋親のいずれもコールしなかった。一塩基多型スコアに基づいて、ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異体の完全なゲノムはもはや子孫に存在しないと結論付けた。したがって、ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異体は、高効率の半数体インデューサー系統として機能すると結論付けられる。ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異体が雌親として使用される交配においては、ＭｉｃｒｏＴｏｍの自殖は無視できる。ＭｉｃｒｏＴｏｍを雌親として使用する実験においては、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を示す子孫の数が非常に少なく（６５のうちわずか１つの種子、３０６のうち２つの種子）、ホモ接合性の塩基対のみが得点したことを考えると、自殖が起こった可能性は極めて低い。
ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を有するＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖ子孫に関して、片親ゲノムの排除が起こったか否か、及びどの程度であったかを決定するために、２０１４年における染色体あたり２つのＳＮＰ及び２０１５年における２２個の位置（１、２、３、４、５、６、７、８、１０及び１２番染色体上の２つのＳＮＰ；９及び１１番染色体上の１つのＳＮＰ）について、１２個のトマト染色体のそれぞれにわたって広がる、全部で２４の位置において一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイを行った。選択した一塩基多型は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ親に関して一塩基対についてホモ接合性であり、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋親におけるＭｉｃｒｏＴｏｍ塩基対以外はすべてについてホモ接合性であった。野生型ＭｉｃｒｏＴｏｍ栽培品種とＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋栽培品種の間の通常の交配は、ヘテロ接合性の一塩基多型スコアをもたらした。しかしながら、片親ゲノムの排除のプロセスが起こった場合、半数体インデューサー系統ゲノムの損失が予想される。
一塩基多型試験は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型も示す５個の子孫植物のそれぞれについてＭｉｃｒｏＴｏｍ親由来のホモ接合性塩基対スコアのみのコールをもたらし、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋親のいずれもコールしなかった。一塩基多型スコアに基づいて、ＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖ変異体の完全なゲノムはもはや子孫に存在しないと結論付けた。したがって、ＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖ変異体は、高効率の半数体インデューサー系統として機能すると結論付けられる。ＣＥＮＰＣ－Ｍ５５６Ｖ変異体が雌親として使用される交配においては、ＭｉｃｒｏＴｏｍの自殖は無視できる。ＭｉｃｒｏＴｏｍを雌親として使用する実験においては、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を示す子孫の数が非常に少なく（１８８のうちわずか４つの種子、３１７のうち１つの種子）、ホモ接合性の塩基対のみが得点したことを考えると、自殖が起こった可能性は極めて低い。
ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異体の表現型
ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異体及び変異していないＲＺ５２２０１対照植物の花粉四分染色体を異常の発生についてチェックした。４つの異なる花房から少なくとも１つの花を採取し、その葯をＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）で染色し、花粉四分染色体を検査するために、染色した葯を押しつぶした。ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異体については、２．３４±０．９０％の平均頻度で微小核を観察した（図１）。対照植物の花については、０．５８±０．３６％の平均頻度で微小核を観察した。対照と変異体の頻度の相違を、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定により評価し、２つの群の間のメジアン値の相違は、偶然から予測されるよりも大きいことが分かり、したがって、統計学的に有意な相違（Ｐ＝０．０１６）があったと結論付けられる。
したがって、ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異の結果として、減数分裂の間の染色体の分離は、対照と比較してずっと高頻度で妨害されると結論付けられる。異常な有糸分裂、例えば、微小核の所見は、作物における種間交配、種内交配における染色体排除及び半数体産生の直接証拠として使用されることが多い。例えば、異常な有糸分裂並びに異常な減数分裂、例えば、微小核を、トウモロコシＤＨ－インデューサー系統の研究において発見した（Ｑｉｕ、Ｆａｚｈａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻（２０１４年）：８３～９０ページ）。ＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ変異体における減数分裂時の微小核の所見は、有糸分裂の間に同様のプロセスが起こることを示唆している。野生型とＣＥＮＰＣ－５５２＿５５３ｉｎｓＨ－Ｄ５５４Ｋ－Ｎ５５５Ｙ接合体の融合後、最初の有糸分裂の間に片親ゲノムの排除のプロセスが起こり、これが観察した半数体の誘導をもたらした可能性がある。

Claims (51)

  1. １つ又は複数のアクティブ変異を含む、植物起源のＣＥＮＰＣタンパク質。
  2. 前記１つ又は複数のアクティブ変異が、配列番号２、３、４又は１５～１９のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質中に存在する、請求項１に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  3. 前記１つ又は複数のアクティブ変異が、配列番号２、３、４若しくは１５～１９のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号２、３、４若しくは１５～１９のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を有するその変異体を含むタンパク質において引き起こされている、請求項２に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  4. 前記１つ又は複数のアクティブ変異が、配列番号５又は６のいずれかに示されるアミノ酸配列により表される倍加半数体インデューサードメイン中に存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  5. 前記１つ又は複数のアクティブ変異が、配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列における、５５２～５５３位の間のアミノ酸残基の変異、５５４位のアミノ酸残基の変異、５５５位のアミノ酸残基の変異及び５５６位のアミノ酸残基の変異若しくはその任意の組合せからなる群から選択されるか；又は配列番号２のアミノ酸配列における、５５５～５５６位の間のアミノ酸残基の変異、５５７位のアミノ酸残基の変異、５５８位のアミノ酸残基の変異及び５５９位のアミノ酸残基の変異若しくはその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  6. 配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５４位において、又は配列番号２のアミノ酸配列の５５７位において変異したアミノ酸が、アスパラギン酸であり、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５５位において、又は配列番号２のアミノ酸配列の５５８位において変化したアミノ酸が、アスパラギンであり、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５６位において又は配列番号２のアミノ酸配列の５５９位において変化したアミノ酸が、メチオニンである、請求項５に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  7. 配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５４位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５７位のアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸残基、好ましくはリシンに変化しており、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５５位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５８位のアミノ酸が、チロシンに変化しており、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５６位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５７位のアミノ酸が、バリンに変化しており、並びに／或いは正電荷を有する残基、好ましくはヒスチジンが、配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列のアミノ酸残基５５２～５５３の間に又は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基５５５～５５６の間に挿入されている、請求項５又は６に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  8. ヒスチジンが、配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列のアミノ酸残基５５２～５５３の間に又は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基５５５～５５６の間に挿入されており、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５４位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５７位のアスパラギン酸が、リシンに変化しており、並びに／或いは配列番号３若しくは４のいずれかのアミノ酸配列の５５５位又は配列番号２のアミノ酸配列の５５８位のアスパラギンが、チロシンに変化している、請求項５～７のいずれか一項に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  9. 配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  10. 配列番号７又は１２のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされている、請求項９に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  11. 配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  12. 配列番号９又は１３のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされている、請求項１１に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  13. アクティブ変異を有する、ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされており、植物の内在性ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／又は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の非存在下で前記植物中に存在する場合、前記植物が生存することを可能とし、前記植物が野生型植物と交配される場合、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  14. 生成された後代の少なくとも０．１、０．５、１又は５％が、半数体であるか、又は異常な倍数性を有する、請求項１３に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  15. 標的ヌクレオチド交換を使用して又はエンドヌクレアーゼを適用することにより、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入することによって、前記内在性ＣＥＮＰＣタンパク質から誘導される、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  16. 前記１つ又は複数のアクティブ変異が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質ドメイン中に存在しない、請求項１に記載のＣＥＮＰＣタンパク質。
  17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＥＮＰＣタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  18. 配列番号１１若しくは１４のいずれかの核酸配列、又は、配列番号１１若しくは１４のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むポリヌクレオチドであって、その中で、配列番号１１の核酸配列の２４４９～２４５０位及び／又は２４５４～２４６２位或いは配列番号１４の１６６０～１６６８位の１つ又は複数のヌクレオチドが、配列番号３のアミノ酸配列が５５４位及び／又は５５５位及び／又は５５６位に変更された残基を有し、並びに／或いは配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸残基５５２～５５３の間にヒスチジンのようなアミノ酸残基の挿入をその中に有するＣＥＮＰＣタンパク質を、前記核酸がコードするように修飾されている、ポリヌクレオチド。
  19. 配列番号７又は１２のいずれかの核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
  20. 配列番号９又は１３のいずれかの核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
  21. 単離された、請求項１７～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  22. 請求項１７～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、キメラ遺伝子。
  23. 請求項１７～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項２２に記載のキメラ遺伝子を含む、ベクター。
  24. 請求項１７～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のキメラ遺伝子、又は請求項２３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  25. 植物細胞、好ましくはトマト植物細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
  26. 請求項１７～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のキメラ遺伝子、又は請求項２３に記載のベクターを含む、植物。
  27. 前記内在性ＣＥＮＰＣタンパク質が発現されていない、請求項２６に記載の植物。
  28. ナス属植物、好ましくはトマト植物である、請求項２６又は２７に記載の植物。
  29. 請求項２６～２８のいずれか一項に記載の植物を作製するための方法であって、
    ｄ）植物細胞内の内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、アクティブ変異を有する植物ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るステップと；
    ｅ）前記アクティブ変異を有する植物ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと；
    ｆ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
    を含む、方法。
  30. 請求項２６～２８のいずれか一項に記載の植物を作製するための方法であって：
    ｄ）請求項１７～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のキメラ遺伝子、又は請求項２３に記載のベクターを使用して植物細胞を形質転換するステップと；
    ｅ）前記ポリヌクレオチド、キメラ遺伝子又はベクターを含む植物細胞を選択するステップと；
    ｆ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
    を含む、方法。
  31. 前記植物細胞を改変して、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現を防止するステップをさらに含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 前記植物細胞内の内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドが修飾されて、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質の発現を防止する、請求項３１に記載の方法。
  33. 半数体植物、又は異常な倍数性を有する植物を生成する方法であって：
    ｅ）内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物を、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の植物に交配するステップであって、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現しない、ステップと；
    ｆ）種子を採取するステップと；
    ｇ）前記種子から、少なくとも１つの実生、小植物又は植物を生育させるステップと；
    ｈ）半数体実生、小植物若しくは植物；異常な倍数性を有する実生、小植物若しくは植物；又は倍加半数体実生、小植物若しくは植物を選択するステップと
    を含む、方法。
  34. 倍加半数体植物を生成する方法であって、請求項３３のステップｄ）において得られた半数体植物を倍加半数体植物に転換するステップを含む、方法。
  35. 前記転換が、コルヒチンによる処理により実施される、請求項３４に記載の方法。
  36. 内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する前記植物が、Ｆ１植物である、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する前記植物が、交配の花粉親である、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 内在性植物ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する前記植物が、交配の胚珠親である、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記交配が、約２４～約３０℃の範囲の温度で実施される、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 半数体インデューサー系統を産生するための、請求項１７～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
  42. 請求項１７～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のキメラ遺伝子、又は請求項２３に記載のベクターを含む、トマト植物。
  43. 配列番号８又は１０のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、トマト植物。
  44. 配列番号７、１２、９又は１３のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、トマト植物。
  45. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＥＮＰＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、トマト植物。
  46. 配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド中に１つ又は複数のアクティブ変異を含む、トマト植物。
  47. 半数体トマト植物を産生するための、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のトマト植物の使用。
  48. 倍加半数体トマト植物を産生するための、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のトマト植物の使用。
  49. 請求項４２～４６のいずれか一項に記載のトマト植物が、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間は内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現しない、請求項４７又は４８に記載の使用。
  50. 半数体又は倍加半数体植物を生成する方法であって、内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現する植物及び請求項２６～２８のいずれか一項に記載の植物を同定するステップを含み、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の植物が内在性ＣＥＮＰＣタンパク質を発現しない、方法。
  51. 前記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない、請求項５０に記載の方法。
JP2021168757A 2015-10-02 2021-10-14 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法 Pending JP2022028656A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL2015552 2015-10-02
NL2015552 2015-10-02
PCT/NL2016/050682 WO2017058022A1 (en) 2015-10-02 2016-10-03 Method for the production of haploid and subsequent doubled haploid plants
JP2018515801A JP2018529348A (ja) 2015-10-02 2016-10-03 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018515801A Division JP2018529348A (ja) 2015-10-02 2016-10-03 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022028656A true JP2022028656A (ja) 2022-02-16

Family

ID=55178277

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018515801A Pending JP2018529348A (ja) 2015-10-02 2016-10-03 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法
JP2021168757A Pending JP2022028656A (ja) 2015-10-02 2021-10-14 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018515801A Pending JP2018529348A (ja) 2015-10-02 2016-10-03 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11279947B2 (ja)
EP (1) EP3356392A1 (ja)
JP (2) JP2018529348A (ja)
CN (1) CN108290934A (ja)
AU (2) AU2016331020B2 (ja)
BR (1) BR112018006569A2 (ja)
CA (1) CA3000131A1 (ja)
IL (1) IL258473A (ja)
MX (1) MX2018003978A (ja)
WO (1) WO2017058022A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109936977A (zh) 2016-09-14 2019-06-25 孟山都技术公司 用于通过单倍体诱导来进行基因组编辑的方法和组合物
CA3112005A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Syngenta Crop Protection Ag Novel wheat cenh3 alleles
EP3689135A1 (en) * 2019-01-30 2020-08-05 KWS SAAT SE & Co. KGaA Haploid inducers
UY39237A (es) 2020-05-29 2021-12-31 Kws Saat Se & Co Kgaa Inducción de haploides en plantas

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US543949A (en) * 1895-08-06 Portable shelf
EP0320500B1 (en) 1983-01-13 2004-11-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Non-oncogenic ti plasmid vector system and recombinant DNA molecules for the introduction of expressible genes into plant cell genomes
JPH0714349B2 (ja) 1983-01-17 1995-02-22 モンサント カンパニ− 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子
DE3464841D1 (en) 1983-01-27 1987-08-27 Gen Foods Corp Water-agglomeration method for depeptide sweetened products
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
EP0265556A1 (en) 1986-10-31 1988-05-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Stable binary agrobacterium vectors and their use
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
JP5237099B2 (ja) 2005-09-29 2013-07-17 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 変異させた集団のハイスループットスクリーニング
EP2200424B1 (en) 2007-09-24 2014-03-05 Keygene N.V. Method for the selection of plants with specific mutations
ES2879599T3 (es) * 2009-06-08 2021-11-22 Nunhems Bv Plantas tolerantes a la sequía
MX2012003981A (es) 2009-10-06 2012-06-12 Univ California Generacion de plantas haploides y cruza de plantas mejorada.
EP2574234A1 (en) * 2011-09-29 2013-04-03 Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. Quartet breeding
WO2014110274A2 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Regents Of The University Of California A California Corporation Generation of haploid plants

Also Published As

Publication number Publication date
CA3000131A1 (en) 2017-04-06
IL258473A (en) 2018-05-31
WO2017058022A1 (en) 2017-04-06
AU2021206832B2 (en) 2024-01-18
MX2018003978A (es) 2018-08-15
BR112018006569A2 (pt) 2018-12-11
EP3356392A1 (en) 2018-08-08
JP2018529348A (ja) 2018-10-11
US11279947B2 (en) 2022-03-22
AU2016331020B2 (en) 2021-04-29
CN108290934A (zh) 2018-07-17
US20190078117A1 (en) 2019-03-14
AU2016331020A1 (en) 2018-04-19
AU2021206832A1 (en) 2021-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022028656A (ja) 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法
US11576318B2 (en) Method for the production of haploid and subsequent doubled haploid plants
CN102308000A (zh) 产生2n配子或未减数配子的植物
US20220106607A1 (en) Gene for parthenogenesis
US10674686B2 (en) Dominant mutation in the TDM gene leading to diplogametes production in plants
CN114641572A (zh) 来自香蕉的野生近缘种的抗性基因的鉴定及其在控制巴拿马病中的用途
EP4234700A2 (en) Compositions and methods comprising plants with modified anthocyanin content
US20190225657A1 (en) Method for the production of haploid and subsequent doubled haploid plants
JPWO2020111149A1 (ja) トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法
WO2022117024A1 (zh) 孤雌生殖单倍体诱导基因及其应用
US20220098607A1 (en) Haploid inducers
US20220361429A1 (en) Torradovirus resistance gene
Devanna et al. CRISPR/Cas mediated genome-editing for rice improvement.

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211115

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20211115

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221025

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230523