JP2021536235A - 超高速粒子ソーティング - Google Patents
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Abstract
1つまたはそれを超える技能要件および訪問滞在時間に関連する項目のデータベースを維持するため;1つまたはそれを超える技能熟練度、場所およびスケジュールに関連する専門家のデータベースを維持するため;データベース内の1つまたはそれを超える項目の専門家による消費者の住所への消費者からの送達の依頼を受け取るため;1つまたはそれを超える項目の技能要件に一致する技能熟練度を有し、かつ1つまたはそれを超える項目の訪問滞在時間の時間枠に利用可能なデータベース内の専門家を特定するため;1人またはそれを超える専門家が識別される時間枠を消費者に提示し消費者が時間枠を選択できるようにするため;および最も短い移動時間に基づくが選択された専門家の利用が所定の利用閾値を超えるという条件で、選択された時間枠において特定された専門家の中から1人の専門家を選択するためのプラットフォーム、システム、媒体および方法が記載される。
Description
相互参照
本願は、2018年8月31日出願の米国仮特許出願第62/725358号に基づく利益を主張する。この仮出願は、参照により本明細書中に援用される。
本願は、2018年8月31日出願の米国仮特許出願第62/725358号に基づく利益を主張する。この仮出願は、参照により本明細書中に援用される。
発明の背景
細胞療法は、再生医学および免疫療法の礎石である。この治療に持ち込まれる非治療用細胞の多くは無害であるが、特定の異常な細胞型は、小集団であっても患者において深刻な有害事象の原因となり得る。ゆえに、治療用細胞を患者に移植する前に、それらの細胞を有害な細胞から精製することが極めて重要となり得る。細胞ベースの再生医療技術を臨床に移行するのを加速させるためには、希少な幹細胞および他の免疫細胞型を表面マーカーの差次的発現に基づいて臨床に適用可能な無菌のフォーマットで単離するためのハイスループットかつ高純度の方法が必要であり得る。
細胞療法は、再生医学および免疫療法の礎石である。この治療に持ち込まれる非治療用細胞の多くは無害であるが、特定の異常な細胞型は、小集団であっても患者において深刻な有害事象の原因となり得る。ゆえに、治療用細胞を患者に移植する前に、それらの細胞を有害な細胞から精製することが極めて重要となり得る。細胞ベースの再生医療技術を臨床に移行するのを加速させるためには、希少な幹細胞および他の免疫細胞型を表面マーカーの差次的発現に基づいて臨床に適用可能な無菌のフォーマットで単離するためのハイスループットかつ高純度の方法が必要であり得る。
発明の要旨
本明細書中に開示される実施形態は、細胞をソーティングするためのシステム、方法およびデバイスを提供する。いくつかの場合において、それらの細胞は、レーザー(例えば、レーザー抽出)および/またはマイクロポアアレイの助けによりソーティングされ得る。そのマイクロポアアレイは、目的の細胞の抽出を助けるためにレーザーと相互作用できるコーティングを含み得る。そのコーティングは、場合によっては剥離し、それと同時にマイクロポアアレイ内に保持された液体のメニスカスを破壊できる。有益なことに、本明細書中に記載されるアプローチは、例えば、目的の粒子を保持している液体に対して直接ではなくアレイ表面にレーザーが向けられるので、細胞生存率および抽出効率を高めることができる。
本明細書中に開示される実施形態は、細胞をソーティングするためのシステム、方法およびデバイスを提供する。いくつかの場合において、それらの細胞は、レーザー(例えば、レーザー抽出)および/またはマイクロポアアレイの助けによりソーティングされ得る。そのマイクロポアアレイは、目的の細胞の抽出を助けるためにレーザーと相互作用できるコーティングを含み得る。そのコーティングは、場合によっては剥離し、それと同時にマイクロポアアレイ内に保持された液体のメニスカスを破壊できる。有益なことに、本明細書中に記載されるアプローチは、例えば、目的の粒子を保持している液体に対して直接ではなくアレイ表面にレーザーが向けられるので、細胞生存率および抽出効率を高めることができる。
いくつかの態様において、本開示は、第1の表面およびその第1の表面の反対側の第2の表面を有する基材を備えるアレイを提供し、その基材は、基材材料および表面材料を含み、その表面材料は、第1または第2の表面に位置または隣接し、その基材は、第1の表面から第2の表面に伸びる管腔を定義する複数のポアを含み、その基材は、複数のポアの各ポアが、500ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、複数のポアの各ポアが、10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、および表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されることを特徴とする。
いくつかの態様において、本開示は、第1の表面およびその第1の表面の反対側の第2の表面を有する基材を備えるアレイを提供し、その基材は、基材材料および表面材料を含み、その表面材料は、第1または第2の表面に位置または隣接し、その基材は、第1の表面から第2の表面に延びる複数のポアを含み、その基材は、1平方ミリメートルあたり100個またはそれを超えるポアというポアの密度、複数のポアの各ポアが、10を超えるアスペクト比を有すること、および表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されることを特徴とする。
ある特定の実施形態において、各ポアは、約0.008mm2またはそれ未満の最大断面積を有する。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、5ミクロン〜100ミクロンの範囲内のポア直径を有する。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、15ミクロン〜50ミクロンの範囲内のポア直径を有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約1mm〜約500mmの範囲から選択される長さを有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約1mm〜約100mmの範囲から選択される長さを有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約1mm〜約10mmの範囲から選択される長さを有する。
ある特定の実施形態において、ポアの密度は、1平方ミリメートルあたり100〜2500ポアの範囲内である。ある特定の実施形態において、ポアの密度は、1平方ミリメートルあたり500〜1500ポアの範囲内である。ある特定の実施形態において、表面材料は、基材材料と実質的に類似である。ある特定の実施形態において、表面材料は、基材材料と異なる。ある特定の実施形態において、基材材料は、ガラスであり、表面材料は、ガラスではない。ある特定の実施形態において、表面材料は、金属を含む。ある特定の実施形態において、表面材料は、0.4ミクロン〜2.5ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の10パーセント超を吸収する。ある特定の実施形態において、表面材料は、入射放射の50パーセント超を吸収する。ある特定の実施形態において、表面材料は、0.4ミクロン〜1.5ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の50パーセント超を吸収する。
ある特定の実施形態において、アスペクト比は、10〜100の範囲内である。ある特定の実施形態において、アスペクト比は、20またはそれを超える。ある特定の実施形態において、アスペクト比は、50またはそれを超える。ある特定の実施形態において、アスペクト比は、100またはそれを超える。ある特定の実施形態において、表面材料は、第2の表面を覆うかまたは部分的に覆う。ある特定の実施形態において、表面材料は、第1の表面を覆うかまたは部分的に覆う。ある特定の実施形態において、表面材料は、ポアの管腔へのアクセスを遮断しない。ある特定の実施形態において、表面材料は、約20nm〜500nmの平均厚さを有する。ある特定の実施形態において、表面材料は、約100nm〜500nmの平均厚さを有する。ある特定の実施形態において、表面材料は、疎水性である。
ある特定の実施形態において、第1の表面と第2の表面は、実質的に平行な面である。ある特定の実施形態において、上記複数のポアは、第1の表面から第2の表面まで表面法線に対して角度をなして延びている。ある特定の実施形態において、その角度は、より大きく0〜90度の範囲内である。ある特定の実施形態において、上記複数のポアは、第1の表面から第2の表面まで直角に延びている。ある特定の実施形態において、上記複数のポアは、第1の表面から第2の表面まで間接経路を通っている。
いくつかの態様において、本開示は、混合物の構成要素をソーティングするためのシステムシステムを提供し、そのシステムは、本開示の任意の態様のアレイ、およびそのアレイから放出された選ばれた内容物を受け取るように構成された内側表面を備えるハウジングを備える。ある特定の実施形態において、内側表面は、基材の第2の表面の下に位置する。
いくつかの態様において、本開示は、選ばれた内容物をアレイのポアから放出する方法を提供し、その方法は、選ばれた内容物を含むアレイのポアを識別する工程であって、そのアレイは、第1の表面およびその第1の表面の反対側の第2の表面を有する基材を備え、その基材は、基材材料および表面材料を含み、その表面材料は、第1または第2の表面に位置または隣接し、その基材は、第1の表面から第2の表面に延びる管腔を定義する複数のポアを含み、その基材は、(a)複数のポアの各ポアが、500ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、(b)複数のポアの各ポアが、10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、(c)1平方ミリメートルあたり100個またはそれを超えるポアというポアの密度、および(d)表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの1つまたはそれを超えることを特徴とする、工程、および識別されたポア内のまたは識別されたポアに隣接する表面材料に向けられた電磁放射によって、前記アレイの第1または第2の表面から表面材料の一部分を除去し、それにより、識別されたポアの内容物を放出する工程を含む。
ある特定の実施形態において、電磁放射は、0.2ミクロン〜2.5ミクロンの波長、内容物とポアとの接着を破壊するのに十分なフルエンスレベル、および1ns〜1ミリ秒の範囲内のパルス持続時間から選択される。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、アブレーションを含む。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、機械的除去を含む。ある特定の実施形態において、機械的除去が、チッピングを含む。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、光熱除去を含む。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、光化学的除去を含む。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、光音響的除去を含む。
ある特定の実施形態において、選ばれた内容物は、水溶液中の細胞を含む。ある特定の実施形態において、その細胞は、INKT細胞、Tmem、Treg、HSPCおよびそれらの組み合わせから選択される。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、約0.008mm2またはそれ未満の断面積を有する。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、5ミクロン〜100ミクロンの範囲内のポア直径を有する。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、15ミクロン〜50ミクロンの範囲内のポア直径を有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約1mm〜約500mmの範囲から選択される長さを有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約1mm〜約100mmの範囲から選択される長さを有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約1mm〜約10mmの範囲から選択される長さを有する。
ある特定の実施形態において、ポアの密度は、1つのアレイにおいて1平方ミリメートルあたり100〜2500ポアの範囲内である。ある特定の実施形態において、ポアの密度は、1つのアレイの1平方ミリメートルあたり500〜1500ポアの範囲内である。ある特定の実施形態において、アレイは、1000ポア/mm2を超えるポアの密度を含む。ある特定の実施形態において、ポアの密度は、5000ポア/mm2またはそれを超える。ある特定の実施形態において、アスペクト比は、10〜100の範囲内である。ある特定の実施形態において、ポアは、20またはそれを超えるアスペクト比を有する。ある特定の実施形態において、ポアは、50またはそれを超えるアスペクト比を有する。ある特定の実施形態において、ポアは、100またはそれを超えるアスペクト比を有する。ある特定の実施形態において、表面材料は、約0.4ミクロン〜約2.5ミクロンから選択される波長において10パーセント超を吸収する。ある特定の実施形態において、表面材料は、入射放射の50パーセント超を吸収する。ある特定の実施形態において、表面材料は、約0.4ミクロン〜約2.5ミクロンから選択される波長の入射放射の50パーセント超を吸収する。
ある特定の実施形態において、上記アレイは、(a)複数のポアの各ポアが、500ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、(b)複数のポアの各ポアが、10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、(c)1平方ミリメートルあたり100個またはそれを超えるポアというポアの密度、および(d)表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの2つまたはそれを超えることを特徴とする。ある特定の実施形態において、表面材料の一部分は、識別されたポアに隣接する。ある特定の実施形態において、表面の一部分は、識別されたポアの管腔表面を含む。ある特定の実施形態において、表面の一部分は、100ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去される。ある特定の実施形態において、表面の一部分は、50ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去される。ある特定の実施形態において、上記方法は、選ばれた内容物を含むポアを識別する工程の前に、選ばれた内容物を含む溶液をアレイにロードする工程をさらに含む。ある特定の実施形態において、選ばれた内容物を含むポアを識別する工程は、アレイのポアから放射された電磁放射を解析する工程を含む。ある特定の実施形態において、内容物を放出する工程は、1秒あたり約5,000〜約100,000,000ポアという速度で内容物を放出することを含む。
いくつかの態様において、本開示は、赤外線吸収コアおよび非赤外線吸収シェルを備えるビーズを提供し、その非赤外線吸収シェルの外径は、約10ミクロンに等しいかまたはそれ未満である。
ある特定の実施形態において、非赤外線吸収シェルは、アガロース、デキストランまたはその両方を含む。ある特定の実施形態において、赤外線吸収コアは、赤外線吸収色素を含む。ある特定の実施形態において、ビーズは、約20ミクロンに等しいかまたはそれ未満の直径を有する。
いくつかの態様において、本開示は、複数の、本開示の任意の態様のビーズ;および目的の粒子を含む溶液を提供する。ある特定の実施形態において、目的の粒子は、細胞である。ある特定の実施形態において、複数のビーズの数と複数の細胞の数との比は、約1:1〜10:1である。
参照による援用
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が明確かつ個別に参照により援用されると示されるのと同程度に、参照により本明細書中で援用される。
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が明確かつ個別に参照により援用されると示されるのと同程度に、参照により本明細書中で援用される。
本発明の新規特徴は、添付の請求項に詳細に示される。本発明の原理を利用した例証的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点がより理解される。
発明の詳細な説明
高速かつ無菌の細胞ソーティングシステムを提供する必要がある。したがって、マイクロポアアレイなどのアレイからレーザー抽出によって細胞をソーティングするためのシステム、デバイスおよび方法が、本明細書中に提供される。本明細書中のシステム、デバイスおよび方法が用いるマイクロポアソーティングは、約10,000細胞/秒という高ソーティング速度または最先端のものの速度よりも100〜1000倍速い速度を求めて形成され得る。さらに、本明細書中に記載される実施形態は、無菌性および操作者のバイオセイフティーを維持し、サンプル間の汚染を低減し、流速の時間的制約を無くしつつ、細胞生存率または細胞機能を損なわずにそのようなソーティング速度を可能にし得る。特に、マイクロポアアレイの表面材料、ならびにそれを使用するシステムおよび方法によって、ポアの内容物に対する熱的影響が無視できる状態でポアの内容物を放出することができる。
高速かつ無菌の細胞ソーティングシステムを提供する必要がある。したがって、マイクロポアアレイなどのアレイからレーザー抽出によって細胞をソーティングするためのシステム、デバイスおよび方法が、本明細書中に提供される。本明細書中のシステム、デバイスおよび方法が用いるマイクロポアソーティングは、約10,000細胞/秒という高ソーティング速度または最先端のものの速度よりも100〜1000倍速い速度を求めて形成され得る。さらに、本明細書中に記載される実施形態は、無菌性および操作者のバイオセイフティーを維持し、サンプル間の汚染を低減し、流速の時間的制約を無くしつつ、細胞生存率または細胞機能を損なわずにそのようなソーティング速度を可能にし得る。特に、マイクロポアアレイの表面材料、ならびにそれを使用するシステムおよび方法によって、ポアの内容物に対する熱的影響が無視できる状態でポアの内容物を放出することができる。
アレイ
アレイが本明細書中に提供される。本明細書中に記載されるアレイは、粒子をソーティングするために利用され得る。それらの粒子は、目的の粒子、例えば、治療で使用するために濃縮する必要がある細胞であり得る。そのアレイは、基材を備え得る。その基材は、第1の表面、例えば上面、第1の表面の反対側の第2の表面、例えば底面、および第1の表面から第2の表面に延びる複数のポアを含み得る。それらのポアは、本明細書中に記載されるような様々な形状を有し得る管腔を定義し得る。それらのポアは、マイクロポアまたはマイクロチャネルであり得る。
アレイが本明細書中に提供される。本明細書中に記載されるアレイは、粒子をソーティングするために利用され得る。それらの粒子は、目的の粒子、例えば、治療で使用するために濃縮する必要がある細胞であり得る。そのアレイは、基材を備え得る。その基材は、第1の表面、例えば上面、第1の表面の反対側の第2の表面、例えば底面、および第1の表面から第2の表面に延びる複数のポアを含み得る。それらのポアは、本明細書中に記載されるような様々な形状を有し得る管腔を定義し得る。それらのポアは、マイクロポアまたはマイクロチャネルであり得る。
1つの非限定的な例において、複数のポアを含む基材は、各ポアが500ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、各ポアが10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、および表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されることを特徴とし得る。さらなるまたは代替の非限定的な例において、複数のポアを含む基材は、1平方ミリメートルあたり100個またはそれを超えるポアというポアの密度、各ポアが10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、および表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されることを特徴とし得る。
図1〜13は、粒子をソーティングするためのアレイの非限定的な例を図示している。図1Aは、いくつかの実施形態に係る、粒子をソーティングするためのアレイの垂直方向のスライスである。図1によると、アレイ100は、第1の表面111および第1の表面111の反対側の第2の表面112;第1の表面111から第2の表面112に延びる複数のポア113を含む基材110を備え得る。それらの複数のポアは、互いに実質的に平行であり得、粒子を液体とともに保持するように形成されている場合がある。例えば、その液体は、表面張力によってポア内に保持され得、場合によってはメニスカスを形成し得る。
基材110は、基材材料を含み得る。その基材材料は、ガラス、例えば、ケイ酸塩ガラス、融解石英、溶融石英などであり得る。その基材材料は、プラスチック、例えば、PETG、PEEKなどであり得る。その基材は、金属、例えば、アルミニウム、鋼、クロムなどであり得る。
基材110は、複数のポア113を含み得る。いくつかの場合において、複数のポア113は、約10万個から約1000億個のポアを含む。いくつかの場合において、複数のポア113は、約1000個から約10億個のポアを含む。いくつかの場合において、複数のポア113は、約100万個から約1000億個のポアを含む。
基材110は、ある密度のポアを含み得る。そのポアの密度は、1つのアレイの1平方ミリメートルあたりのポアの数を含み得る。ポアの密度は、第1の表面111または第2の表面112において計測され得る。必要に応じて、いくつかの実施形態において、第1のアレイ100は、約66パーセントまたは約40パーセント〜約75パーセントのオープンアレイ割合(充填密度)を有する。いくつかの場合において、ポアの密度は、1平方ミリメートルあたり100〜2500ポアの範囲内であり得る。いくつかの場合において、ポアの密度は、1平方ミリメートルあたり500〜1500ポアの範囲内であり得る。高ポアの密度を製造する方法は、毛細管などの管を融合することによる方法であり得る。ポアの密度は、管の壁厚および中央の直径を変化させることによって変更され得る。
1つの非限定的な例において、第1のアレイ110は、幅および長さがそれぞれ10×10インチであり、直径がそれぞれ15umの2億4000万個のポア113を含む。
さらに、第1のアレイ100は、図1Aによると、第1の表面111と第2の表面112との間の垂直距離として計測されるアレイ高さ110aを有する。いくつかの実施形態において、アレイ高さ110aは、第1の表面111と第2の表面112との間の最大または最小の垂直距離として計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ110aは、ポア113の標準的な高さとして計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ110aは、ポア113の最大または最小の長さとして計測され得る。その長さは、ポア間で一様であり得るか、またはポアは、製造プロセス中の歪みまたは不規則さなどによって、ポアごとに異なり得る。必要に応じて、ポア113の各々は、約50mmと等しいかまたはそれ未満の長さを有する。いくつかの場合において、各ポアは、約1mm〜約500mmから選択される長さを有し得る。いくつかの場合において、各ポアは、約1mm〜約100mmから選択される長さを有し得る。いくつかの場合において、各ポアは、約1mm〜約10mmから選択される長さを有し得る。
必要に応じて、複数のポア113は、第1の表面111および第2の表面112に対して直角であり得る。いくつかの実施形態において、複数のポア113は、互いに実質的に平行であり得る。いくつかの実施形態において、第2の表面の反対側の第1の表面は、実質的に平行な面であり得る。複数のポアは、第1の表面から第2の表面に直角に延びていることがある。それらのポアは、第1の表面から第2の表面に垂直に延びていることがある。あるいは、複数のポアは、表面法線に対する角度で第1の表面から第2の表面に延びていることがある。その角度は、法線から90度未満であり得る。その角度は、60度未満、45度未満、30度未満またはそれ未満であり得る。その角度は、5〜90度の範囲内であり得る。
いくつかの実施形態において、複数のポアは、第1の表面から第2の表面まで間接経路を通っていることがある。そのような実施形態において、それらのポアは、入り組んでいるか、つづり合わさっているか、または差し込まれている状態であり得る。それらのポアは、ポアを通るパスが第1の表面から第2の表面への真っ直ぐな経路を基準として実質的に方向を変えるように1つまたは複数の湾曲部を含み得る。
図1Bは、粒子をソーティングするためのアレイ100の上面図である。いくつかの例において、アレイ100は、複数のポア113を有する。それらのポアの各々が、断面を含み得る。その断面は、円形であり得るか、楕円形であり得るか、多面形(例えば、正方形、六角形、八角形、十二角形など)であり得るか、または不規則な形状を有し得る。その形状は、ポア間で一様であり得るか、またはポアは、製造プロセス中の歪みまたは不規則さなどによって、ポアごとに異なり得る。
断面は、最大の断面寸法113bを含み得る。最大の断面寸法は、アレイの2つの表面のいずれかまたは中間の位置において計測され得る。最大の断面寸法は、単一の断面において計測され得る。追加的または代替的に、最大の断面寸法は、ポアに沿った多くの位置にわたって平均され得る。その寸法は、基準となるものを用いた顕微鏡下での方法、干渉計による方法、流量からの計算による方法などの多くの方法で計測され得る。いくつかの例において、アレイの各ポアは、5ミクロン〜100ミクロンの範囲内の断面寸法を含み得る。いくつかの例において、各ポアは、15ミクロン〜50ミクロンの範囲内の断面寸法を有し得る。
いくつかの場合において、最大の断面寸法は、直径であり得る。直径という用語は、円形、ほぼ円形または楕円形であるポアの端から端までの最大の断面距離を包含すると意図される。いくつかの例において、アレイの各ポアは、5ミクロン〜100ミクロンの範囲内のポア直径を含み得る。いくつかの例において、各ポアは、10ミクロン〜50ミクロンの範囲内の直径を有し得る。
各ポア113は、ある断面積を含み得る。その断面積は、単一の断面において計測され得る。追加的または代替的に、その断面積は、ポアに沿った多くの位置にわたって平均され得る。図1Bに示されるポア113の白色の領域は、ポアの第1の表面における断面積を定義し得る。必要に応じて、マイクロポア113の各々が、約1平方ミリメートルに等しいかまたはそれ未満の断面積を有する。いくつかの場合において、複数のポアの各ポアは、約0.008mm2またはそれ未満の最大断面積を有し得る。
アレイの各ポア113は、あるアスペクト比を含み得る。そのアスペクト比は、ポアの最大の断面寸法に対するポアの長さの割合であり得る。そのアスペクト比は、ポアの直径に対するポアの長さの割合であり得る。いくつかの場合において、アスペクト比は、10〜100の範囲内であり得る。いくつかの場合において、アスペクト比は、10またはそれを超えることがある。いくつかの場合において、アスペクト比は、20またはそれを超えることがある。いくつかの場合において、アスペクト比は、100またはそれを超えることがある。
図1Cは、細胞濃度が異なるアレイの画像例を示している。各ウェルは、例証の実施形態に示されているように、1つまたは複数の目的の粒子(例えば、細胞)を含み得る。その1つまたは複数の粒子は、1つまたは複数の細胞を含み得る。複数の細胞の数は、約1、約5、約25またはそれを超える数であり得る。いくつかの例において、複数の細胞の数は、約100未満または約1000未満であり得る。
いくつかの実施形態において、水性サンプル溶液は、水性サンプル溶液をアレイ100上に広げることなどによって、アレイ100上に堆積され得る。いくつかの実施形態において、アレイ100の親水性の第1の表面111は、水性サンプル溶液をポア113に吸い込む。いくつかの実施形態において、アレイ100の第1の表面111は、水性サンプル溶液内の目的の粒子(例えば、細胞)をマイクロポア113に分配する。いくつかの実施形態において、アレイ100の第1の表面111は、水性サンプル溶液内の目的の粒子をマイクロポア113にランダムに分配する。いくつかの実施形態において、目的の粒子は、各マイクロポア113の底に沈み得る。必要に応じて、いくつかの実施形態において、目的の粒子は、水性サンプル溶液の表面張力によって各ポア113に留め置かれ得る。
基材材料は、基材材料の一部分または一部分付近に向けられた電磁放射に応答して破壊されるように形成され得る。したがって、目的の粒子が、アレイの特定のマイクロチャネル内に保持されていると識別されると、電磁放射が、基材材料を破壊するように第1の表面に向けられ得、その結果、そのマイクロチャネル内に保持された液体のメニスカスが壊れて、目的の粒子が放出され得る。ある特定の実施形態において、電磁放射は、マイクロアレイにおけるポアの中のまたはポア付近の基材材料の一部分を除去、例えば、切除することにより、ポアのマイクロチャネル内に保持された液体のメニスカスが壊れる。
表面材料
図2〜17Bに示されている、表面材料を含むアレイ100の非限定的な例が、本明細書中に提供される。表面材料120は、コーティングを含み得る。そのコーティングは、第1の表面111に結合され得る。いくつかの実施形態において、表面材料は、基材材料の材料と異なる材料を含み得る。1つの例において、コーティングは、遷移金属、例えばクロムなどの金属を含み得る。表面材料またはコーティングは、表面材料の一部分または一部分付近に向けられた電磁放射に応答して第1の表面から破壊されるように形成され得る。したがって、目的の粒子が、アレイの特定のマイクロチャネル内に保持されていると識別されると、電磁放射が、コーティングを破壊および/または剥離するように表面に向けられ得、その結果、そのマイクロチャネル内に保持された液体のメニスカスが壊れて、目的の粒子が放出され得る。
図2〜17Bに示されている、表面材料を含むアレイ100の非限定的な例が、本明細書中に提供される。表面材料120は、コーティングを含み得る。そのコーティングは、第1の表面111に結合され得る。いくつかの実施形態において、表面材料は、基材材料の材料と異なる材料を含み得る。1つの例において、コーティングは、遷移金属、例えばクロムなどの金属を含み得る。表面材料またはコーティングは、表面材料の一部分または一部分付近に向けられた電磁放射に応答して第1の表面から破壊されるように形成され得る。したがって、目的の粒子が、アレイの特定のマイクロチャネル内に保持されていると識別されると、電磁放射が、コーティングを破壊および/または剥離するように表面に向けられ得、その結果、そのマイクロチャネル内に保持された液体のメニスカスが壊れて、目的の粒子が放出され得る。
図2Aは、いくつかの実施形態に係る、粒子をソーティングするためのアレイ例の垂直断面図である。図2Aに図示されているように、アレイ100は、基材110を備え得る。その基材は、複数のポア113を含み得る。基材110は、第2の表面112および第2の表面112の反対側の第1の表面111を含み得る。必要に応じて、複数のポア113は、第1の表面111から第2の表面112に延びていることがある。いくつかの実施形態において、コーティング120は、第1の表面111と作動可能に結合され得る。
いくつかの実施形態において、アレイ100は、約66パーセントというオープンアレイ割合(充填密度)を有する。いくつかの実施形態において、ポア113の各々は、約1平方ミリメートルに等しいかまたはそれ未満の断面積を有する。いくつかの実施形態において、ポア113の各々は、約50um〜約150umの直径を有する。いくつかの実施形態において、ポア113の各々は、約50mmに等しいかまたはそれ未満の長さを有する。いくつかの実施形態において、複数のポア113は、第2の表面112および第1の表面111に対して直角である。いくつかの実施形態において、複数のポア113におけるポア113の各々は、互いに実質的に平行であり得る。いくつかの実施形態において、複数のポア113は、約100万〜約1000億個のポアを含み得る。
さらに、アレイ100は、図2Aによると、第2の表面112から表面材料120までの距離として計測されるアレイ高さ110aを有する。いくつかの実施形態において、アレイ高さ110aは、第1の表面111と第2の表面112との間の垂直距離として計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ110aは、第1の表面111と第2の表面112との間の最大または最小の垂直距離として計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ110aは、ポア113の標準的な高さとして計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ110aは、ポア113の最大または最小の高さとして計測され得る。
図2Bは、いくつかの実施形態に係るアレイ例の上面図である。アレイ100内の複数のポア113は、図2Bによると、直角のパターン(orthogonal pattern)で配置されている。いくつかの実施形態において、そのパターンは、線形パターン、三角形パターン、六角形パターン、不規則なパターンまたはそれらの任意の組み合わせを含む。ポア113の直交パターンは、図2Bによると、第1の隔たり113bおよび第2の隔たり113cのうちの少なくとも1つを有し、第1の隔たり113bおよび第2の隔たりは、連続したポア1513の中心点の間で計測される。いくつかの実施形態において、第1の隔たり113bおよび第2の隔たりのうちの少なくとも1つは、連続したポア113の表面上の対向する点の間の垂直距離として計測される。いくつかの実施形態において、第1の隔たり113bおよび第2の隔たり113cのうちの少なくとも1つは、約10mm〜約40mmであり得る。
本明細書中に記載されるアレイは、コーティング120を含み得る。そのコーティングは、基材と作動可能に結合され得る。そのコーティングは、電磁放射に曝露されたとき、破壊されるように形成され得る。例えば、コーティングの一部分に向けられたレーザーからの電磁放射に応答して、そのコーティングは、チッピングし得るか、または剥離し得る。必要に応じて、そのコーティングは、基材の材料と異なる材料を含み得る。例えば、基材110は、第1の材料を含み得、コーティング120は、第1の材料と異なる第2の材料を含み得る。
いくつかの場合において、表面材料は、第2の表面を覆い得るかまたは部分的に覆い得る。追加のまたは代替の場合において、表面材料は、第1の表面を覆い得るかまたは部分的に覆い得る。いくつかの場合において、表面材料は、ポアの管腔へのアクセスを実質的に遮断しないことがある。しかしながら、製造中のコーティング厚のばらつきなどに起因して、いくつかのポアの封鎖が生じ得る。表面材料は、約20ナノメートル(nm)〜500nmの平均厚さを有し得る。表面材料は、約100nm〜500nmの平均厚さを有し得る。
いくつかの場合において、表面材料は、基材材料に実質的に類似であり得る。いくつかの場合において、アレイは、均一であり得る。いくつかの実施形態において、均一なアレイは、コーティングを含まない。いくつかの実施形態において、均一なアレイは、一様な集塊または合金材料を含む。1つの例において、アレイは、メタロイド、遷移金属、例えば、クロムまたはその両方を含む。いくつかの実施形態において、基材材料は、ガラス、プラスチック、アルミニウム、鋼、ステンレス鋼またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの場合において、表面材料は、基材材料と実質的に異なり得る。基材材料は、ガラスであり得、表面材料は、ガラス以外の材料であり得る。いくつかの場合において、表面材料は、金属を含み得る。いくつかの場合において、金属としては、クロム、銀、金、アルミニウムなどが挙げられ得る。いくつかの場合において、表面材料は、金属酸化物、例えば、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウム、二酸化ケイ素などを含み得る。表面材料は、反射または吸収などの個々に合わせた光学的特性を形成するように、金属および/または金属酸化物の層を含み得る。
いくつかの実施形態において、表面材料は、遷移金属、例えば、クロムを含む。いくつかの実施形態において、第2の材料は、メタロイドを含む。いくつかの実施形態において、第2の材料は、金属酸化物を含む。いくつかの実施形態において、第2の材料としては、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、白金、金、水銀、ニオブ、イリジウム、モリブデン、銀、カドミウム、タンタル、タングステン、アルミニウム、ケイ素、リン(Phosphorous)、スズ、任意の前述のものの酸化物またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態において、表面材料は、細胞生存率に悪影響を及ぼさない材料から選択される。例えば、表面材料は、生体適合性であり得る。表面材料は、無毒性であり得る。ある特定の実施形態において、表面材料は、電磁放射と接触したとき、細胞傷害または細胞死を引き起こさない材料から選択される。例えば、表面材料を電磁放射と接触させることによって生成される生成物自体が、細胞傷害または細胞死を引き起こしてはならない。つまり、例えば、表面材料のアブレーションによって生成される生成物は、生体適合性かつ/または細胞に対して無毒性であり得る。ある特定の実施形態において、細胞生存率に対する影響は、細胞を表面材料に曝露する前および後の細胞生存率を計測することによって評価される。ある特定の実施形態において、細胞生存率は、同じままであるか、または40%未満、30%未満、20%未満、15%未満、10%未満もしくは5%未満しか低下しない。ある特定の実施形態において、細胞生存率は、表面材料を電磁放射と接触させる前および後の細胞生存率を計測することによって評価され得る。例えば、細胞生存率は、細胞をアレイにロードする前、および表面材料と電磁放射との接触によってアレイのポアから細胞を放出した後に評価される。いくつかの例において、生存率は、表面材料を電磁放射と接触させた後も、同じままであるか、または40%未満、30%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満または1%未満しか低下しない。
アレイは、いくつかの場合において、個々に合わせた疎水性を有し得る。1つの例において、第2の表面112は、親水性であり得る。必要に応じて、第2の表面112は、それ自体が親水性である必要はないが、親水性コーティングに作動可能に結合され得る。いくつかの実施形態において、コーティング120の一部分は、第1の表面111から破壊されるように形成され得る。いくつかの実施形態において、コーティング120の一部分は、コーティングの一部分に向けられた電磁放射に応答して、第1の表面111から破壊されるように形成され得る。いくつかの実施形態において、コーティング120は、疎水性であり得る。
コーティングは、表面材料の一部分に向けられた電磁放射に応答して破壊されるように形成され得る。したがって、目的の粒子が、アレイの特定のマイクロチャネル内に保持されていると識別されると、電磁放射が、コーティングを破壊および/または剥離するようにコーティングに向けられ得、その結果、マイクロチャネル内に保持された液体のメニスカスが壊れて、目的の粒子が放出され得る。コーティングは、電磁放射源が放射する波長に対応する波長または波長範囲で吸収し得る。
したがって、目的の粒子が、アレイの特定のポア内に保持されていると識別されると、電磁放射が、その特定のポアの近くまたはその特定のポア付近に向けられて、目的の粒子を放出し得る。いくつかの実施形態において、第2の表面の破壊は、アレイ、アレイ上のコーティングまたはその両方の材料の少なくとも一部分を除去することを含む。
いくつかの実施形態において、アレイの破壊は、局所的な加熱によって引き起こされ得る。そのようなメカニズムは、パルス持続時間がより長いとき、ピーク出力密度がより低いとき、および/または入射放射の波長が赤外であるとき、起こる可能性があり得る。局所的な加熱は、表面材料またはアレイ材料の昇華を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、基材材料およびコーティングは、異なる熱膨張係数を含み、それにより、チッピングに至り得る。
追加的または代替的に、アレイの破壊は、アブレーションによって引き起こされ得る。そのようなメカニズムは、入射ピーク出力密度がより高いとき、パルス持続時間がより短いとき、放射電力がより高いとき、および/または入射放射が可視であるとき、起こる可能性があり得る。アブレーションは、アレイまたは基材材料の局所的な結合の切断および/または気化を含み得る。
追加的または代替的に、アレイの破壊は、プラズマ発生によって引き起こされ得る。このメカニズムは、入射放射のパルス持続時間が特に短いとき、入射放射の波長が多光子イオン化メカニズムと共鳴関係にあるとき、およびまたは入射放射の波長が非常に短いとき、起こる可能性があり得る。ピコ秒台からフェムト秒台のパルス持続時間によって、基材または表面材料(surface mater)の光学エッチングにつながる局所的な加熱よりも速いプラズマ発生がもたらされ得る。
追加的または代替的に、アレイの破壊は、衝撃波発生によって生じ得る。そのようなメカニズムは、ピーク出力密度がより高いとき、フォノンが共鳴しているとき、および/またはパルス持続時間がより短いとき、起こる可能性が高い場合があり得る。衝撃は、表面材料またはアレイ材料の物理的振動、チッピングまたは揺れを引き起こし得る。
ある例において、表面材料は、可視または赤外の範囲の波長を吸収する。いくつかの実施形態において、表面材料は、不透明であり得る。その表面材料は、可視および赤外の範囲内で選択される少なくとも5ナノメートルの帯域を吸収し得る。その表面材料は、0.4〜2.5ミクロンから選択される少なくとも5ナノメートルの帯域内の入射放射の10パーセント超を吸収し得る。その表面材料は、0.4ミクロン〜2.5ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の10パーセント超を吸収し得る。いくつかの場合において、その表面材料は、少なくとも5ナノメートルの帯域内の入射放射の50パーセント超を吸収し得る。その5ナノメートルの帯域は、0.4〜2.5ミクロンの波長の範囲内で選択され得る。その表面材料は、0.4ミクロン〜1.5ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の50パーセント超を吸収し得る。その表面材料は、ドープされたオルトバナジン酸イッテルビウムまたはイッテルビウム・アルミニウム・ガーネット固体レーザーの高調波から選択される波長の入射放射の10パーセント超を吸収し得る。その表面材料は、1064ナノメートルの入射放射の10パーセント超を吸収し得る。
1つの例において、アレイのコーティング、例えばクロムコーティングは、約500nmの平均厚さを有し、その平均厚さは、赤外(IR)レーザーによって約100nmまたはそれ未満(例えば、約75nmもしくはそれ未満、または約50nmもしくはそれ未満)だけ薄くされる。コーティングの厚さは、100〜500nmであり得る。
いくつかの実施形態において、電磁放射源は、コーティングの平均厚さを約1nm〜約5nm、約1nm〜約10nm、約1nm〜約20nm、約1nm〜約30nm、約1nm〜約40nm、約1nm〜約60nm、約1nm〜約70nm、約1nm〜約80nm、約1nm〜約90nmまたは約1nm〜約100nm薄くするように形成され得る。
いくつかの実施形態において、電磁放射源は、約1nm〜約5nm、約1nm〜約10nm、約1nm〜約20nm、約1nm〜約30nm、約1nm〜約40nm、約1nm〜約60nm、約1nm〜約70nm、約1nm〜約80nm、約1nm〜約90nmまたは約1nm〜約100nmの平均深さでアレイの一部分を切除するように形成され得る。
いくつかの実施形態において、電磁放射源は、コーティングまたはアレイの一部分を除去するように形成され得、その一部分は、約1μm2〜約30μm2、1μm2〜約20μm2、約1μm2〜約10μm2または約1μm2〜約5μm2の表面積を有する。
いくつかの実施形態において、電磁放射源は、マイクロポアの外周から約1nm〜約5nm、約1nm〜約10nm、約1nm〜約20nm、約1nm〜約30nm、約1nm〜約40nm、約1nm〜約60nm、約1nm〜約70nm、約1nm〜約80nm、約1nm〜約90nmまたは約1nm〜約100nmの平均距離でアレイの一部分を切除するように形成され得る。
図3Aは、いくつかの実施形態に係る、クロムコーティングを含む粒子をソーティングするためのアレイ例の上面図を示している。図3Bは、いくつかの実施形態に係る、レーザーによって除去されるクロムコーティングを含む粒子をソーティングするためのアレイの非限定的な例の上面図を示している。図3A〜Bによると、コーティング120は電磁エネルギーを吸収し、それにより、それが基材110から破壊され、各ポア113内の流体のメニスカスを壊し、内部の細胞が排出される。図3Bは、電磁エネルギーによって基材110から除去されたコーティング120の片を示している。図3Bに見られるように、レーザーは、単一のポアもしくは単一のポア付近、2つの隣接したポアの間、または3つのポアから等距離の場所に焦点が当てられ得る。いくつかの実施形態において、赤外レーザーを単一ポアの近く、2つの隣接したポアの間または3つのポアから等距離の場所に焦点を当てることにより、それぞれ1つ、2つまたは3つのポア113内の流体のメニスカスが壊れて、内部の細胞が排出される。いくつかの実施形態において、レーザーを特定のポアに近づけて焦点を当てることにより、付近のポア内の細胞を意図せず排出してしまう可能性が低下する。いくつかの実施形態において、赤外レーザーの強度および持続時間のうちの少なくとも1つは、1つ、2つまたは3つのポア内の細胞の排出を制御するように設定され得る。
いくつかの実施形態において、表面材料120は、100nm厚のクロムをガラスアレイ上にスパッタすることによって形成され得る。いくつかの実施形態において、スパッタリングは、真空下で行われ得る。いくつかの実施形態において、真空は、約0.08〜約0.02mbarであり得る。いくつかの実施形態において、スパッタリングは、約100V〜3kVの電圧において行われ得る。いくつかの実施形態において、スパッタリングは、0〜50mAの電流において行われ得る。必要に応じて、いくつかの実施形態において、クロムは、ガラスアレイの片側のみにスパッタされ得る。いくつかの実施形態において、クロムをコーティングされたアレイは、その後、塩基性溶液、例えば、NaOH溶液に浸漬され得る。いくつかの実施形態において、そのNaOH溶液は、約1Mの濃度を有する。いくつかの実施形態において、クロムをコーティングされたアレイは、約12時間にわたって浸漬され得る。いくつかの実施形態において、クロムをコーティングされたアレイは、その後、10パーセントの漂白剤に最大1時間浸漬され得、次いで、水の噴霧により、残留漂白剤を除去する。いくつかの実施形態において、クロムをコーティングされたアレイは、その後、細胞をロードする前にブロー乾燥され得る。
いくつかの実施形態において、PBMCの抽出は、クロムをコーティングされたアレイ上に界面活性剤および受け取り培地を加えること;組み立てられ得るアレイを、クロムをコーティングされた側を下向きにして受け取り培地に向かってカセットに挿入すること;PBMCをアレイ上に滴下すること、およびPBMCをポア内に静置させることを含む。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、細胞膜の完全性を守り、液体剪断下での頑健さを改善する。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は、0.1パーセントのプルロニック(登録商標)(pluoronic)F68を含む。いくつかの実施形態において、受け取り培地には、OptiPEAK T Cell培地を含む。いくつかの実施形態において、受け取り培地は、ストレプトアビジンをさらに含む。いくつかの実施形態において、PBMCは、約5分間にわたってマイクロポア内に静置される。
いくつかの実施形態において、レーザーから放射され、クロムコーティングによって吸収されるIRエネルギーは、各マイクロポアの底縁においてコーティングを膨張させ、剥離を起こさせて、各マイクロポアからPBMCを抽出し得る。各マイクロポアの底縁におけるクロムコーティングの分離により、その中の流体のメニスカスが壊れて、PBMCが放出される。
図4Aは、いくつかの実施形態に係る、クロムコーティングを備える第1のアレイの非限定的な例におけるIRエネルギー吸収蛍光色素で染色されたPBMCの上面図である。図4Bは、いくつかの実施形態に係る、PBMC抽出後の、クロムコーティングを備える第1のアレイ例の上面図である。
ビーズ
ある特定の実施形態において、アレイのポアは、電磁放射を吸収するビーズであって、ポア内の流体のメニスカス(miniscus)の破壊に影響するビーズを含み得る。いくつかの場合において、そのビーズ(beard)は、ポアの管腔表面に結合されていてもよいし、結合されていなくてもよい(液体混合物としてポアに加えられてもよい)。コアおよびシェルを含むビーズが、本明細書中に提供される。本開示のビーズは、「ミクロスフェア」と称され得る。コアは、赤外線(IR)吸収コアを含み得る。シェルは、非IR吸収シェルを含み得る。本開示のビーズは、アレイのポアに関連し得、ビーズは、電磁放射を吸収し得る。非IR吸収シェルは、IR吸収コアを近くの粒子、例えば、細胞から遮断することにより、IR吸収放射線によるコアの傷害作用からそれらの粒子を保護し得る。ビーズは、アガロースをさらに含み得る。非IR吸収シェルは、アガロースを含み得る。ビーズは、デキストランをさらに含み得る。ビーズは、IR吸収色素で染色され得る。ビーズは、約1μm〜約20μmまたは約5μm〜約20μmなどの約20μmに等しいかまたはそれ未満の直径を含み得る。ビーズは、約10ミクロンに等しいかまたはそれ未満であり得る吸収シェルを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるようなアレイの表面材料は、赤外線吸収コアおよび非赤外線吸収シェルを含むビーズを含み得、その非赤外線吸収シェルの外径は、約10ミクロンに等しいかまたはそれ未満である。
ある特定の実施形態において、アレイのポアは、電磁放射を吸収するビーズであって、ポア内の流体のメニスカス(miniscus)の破壊に影響するビーズを含み得る。いくつかの場合において、そのビーズ(beard)は、ポアの管腔表面に結合されていてもよいし、結合されていなくてもよい(液体混合物としてポアに加えられてもよい)。コアおよびシェルを含むビーズが、本明細書中に提供される。本開示のビーズは、「ミクロスフェア」と称され得る。コアは、赤外線(IR)吸収コアを含み得る。シェルは、非IR吸収シェルを含み得る。本開示のビーズは、アレイのポアに関連し得、ビーズは、電磁放射を吸収し得る。非IR吸収シェルは、IR吸収コアを近くの粒子、例えば、細胞から遮断することにより、IR吸収放射線によるコアの傷害作用からそれらの粒子を保護し得る。ビーズは、アガロースをさらに含み得る。非IR吸収シェルは、アガロースを含み得る。ビーズは、デキストランをさらに含み得る。ビーズは、IR吸収色素で染色され得る。ビーズは、約1μm〜約20μmまたは約5μm〜約20μmなどの約20μmに等しいかまたはそれ未満の直径を含み得る。ビーズは、約10ミクロンに等しいかまたはそれ未満であり得る吸収シェルを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるようなアレイの表面材料は、赤外線吸収コアおよび非赤外線吸収シェルを含むビーズを含み得、その非赤外線吸収シェルの外径は、約10ミクロンに等しいかまたはそれ未満である。
図5Aは、中にビーズが配置されたアレイ100を示している。いくつかの場合において、それらのビーズは、ポアの管腔の内部に配置され得る。いくつかの場合において、それらのビーズは、第1の表面111上に配置され得る。いくつかの場合において、それらのビーズは、ポアの管腔内に配置され得る。図5Bは、図5Aのアレイ例内の水性サンプル溶液の垂直断面図を示している。いくつかの実施形態において、水性サンプル溶液521をアレイ100上に堆積させることは、水性サンプル溶液521をアレイ100上に広げることを含む。いくつかの実施形態において、アレイ100の親水性の第1の表面111は、水性サンプル溶液521をポア113内に吸い込む。いくつかの実施形態において、アレイ100の親水性の第1の表面111は、水性サンプル溶液521中の第1の細胞522および第2の細胞523をポア113に均等に分配する。いくつかの実施形態において、アレイ100の親水性の第1の表面111は、水性サンプル溶液521中の第1の細胞522および第2の細胞523をポア113にランダムに分配する。いくつかの実施形態において、第1の細胞522および第2の細胞523は、各ポア113の底に沈む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、第1の細胞522および第2の細胞523は、水性サンプル溶液521の表面張力によって各ポア113に引き止められる。
図6Aは、いくつかの実施形態に係る、ミクロスフェアおよび細胞で満たされたマイクロポアのアレイの明視野像を示している。図6Aに見られるように、アレイ600内のマイクロポア601の各々は、それぞれの各マイクロポア601の中のマイクロビーズおよび細胞によって塞がれ得る。図6Bは、いくつかの実施形態に係る、単一のマイクロポアからの細胞抽出の明視野像を示している。図6Bに見られるように、アレイ600内のただ1つのマイクロポア601だけしか、細胞によって塞がれることができていないことから、単一のマイクロポア601における細胞だけが除去されたことが示唆される。図6Cは、いくつかの実施形態に係る、ミクロスフェアおよび細胞で満たされたマイクロポアのアレイ画像を示している。図6Cに見られるように、アレイ600内のただ1つのマイクロポア601だけしか、細胞を含まない。図6Dは、いくつかの実施形態に係る、単一のマイクロポアからの細胞抽出後のアレイ600の画像を示している。図6Dに見られるように、アレイ600内のマイクロポア601のいずれもが、細胞を含まないことから、単一のマイクロポア601における単一の細胞が除去されたことが示唆される。
図7Aは、いくつかの実施形態に係る、抽出された細胞の明視野像の一例を示している。図7Bは、いくつかの実施形態に係る、抽出された細胞の画像例を示している。
図8〜13によると、ビーズまたはミクロスフェアの例が本明細書中に提供される。図8は、アガロースおよびデキストランミクロスフェアの一例の明視野像を示している。いくつかの実施形態において、アガロースおよびデキストランミクロスフェア800は、赤外光を吸収するように形成されている。いくつかの実施形態において、アガロースおよびデキストランミクロスフェア800は、不透明、黒色またはその両方である。いくつかの実施形態において、アガロースおよびデキストランミクロスフェア800は、ポリマーシェル酸化鉄ミクロスフェア800を含む。いくつかの実施形態において、アガロースおよびデキストランミクロスフェア800は、約6um〜約20umの直径を有する。
図9は、アガロースおよびデキストランミクロスフェアの一例の高倍率の赤外線画像を示している。図9に見られるように、アガロースおよびデキストランミクロスフェア800は、赤外線(IR)吸収コア910および非IR吸収シェル920を含む。いくつかの実施形態において、IR吸収コア910は、IR吸収色素を含む。いくつかの実施形態において、IR吸収色素は、Epolight1178を含む。いくつかの実施形態において、非IR吸収シェル920は、アガロースおよびデキストランを含む。
IRコア着色粒子を使用することは、効率的な細胞抽出にとって有益であり得る。第1に、アガロースコアの分子構造に組み込まれた色素は、色素コーティングよりもIR吸収を増加させ得る。さらに、非IR吸収ソフトシェルは、任意の潜在的な熱吸収、体積膨張および/またはマイクロバブル形成に関連する応力および熱衝撃から細胞を守るための緩衝層として働き得る。その両方が、抽出効率の増大(成功した抽出事象の回数の増加)および細胞生存率の上昇を可能にし得る。
図10Aは、アガロースおよびIR色素ミクロスフェアの一例の明視野像を示している。図10Bは、アガロースおよびIR色素ミクロスフェアの一例の赤外線画像を示している。図10Bに見られるように、アガロースおよびIR色素ミクロスフェア1000は、赤外線(IR)を吸収するものであり得る。いくつかの実施形態において、アガロースおよびIR色素ミクロスフェア1000は、アガロースを含む。いくつかの実施形態において、アガロースおよびIR色素ミクロスフェア1000は、IR吸収色素を含む。いくつかの実施形態において、IR吸収色素は、Epolight1178を含む。いくつかの実施形態において、その色素は、緑色蛍光タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、その色素は、赤色蛍光タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、その色素は、シアニン色素、アクリジン色素、フルオロン(flourone)色素、オキサジン色素、ローダミン(rhodomine)色素、クマリン色素、フェナントリジン(pheanthridine)色素、BODIPY色素、ALEXA色素、ペリレン色素、アントラセン色素、ナフタリン色素などを含む。いくつかの実施形態において、アガロースおよびIR色素ミクロスフェア1000は、約2μm〜約16μmの直径を有する。
図11は、クロムを含むミクロスフェア例の赤外線画像を示している。図12は、アレイ例におけるクロムを含むミクロスフェア例の赤外線画像を示している。図13は、マイクロポアの中のクロムを含むミクロスフェア例の高倍率の赤外線画像を示している。いくつかの実施形態において、ミクロスフェア1100は、遷移金属、例えば、クロムを含む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、ミクロスフェア1100は、クロムコーティングを含む。
赤外線吸収ビーズを形成する方法が、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、その方法は、アガロースビーズを洗浄する工程;アガロースビーズを着色する工程;およびアガロースビーズのコアを形成する工程を含む。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを洗浄する工程は、アガロースビーズを第1の溶媒に懸濁し、アガロースビーズおよび第1の溶媒を遠心分離することを含む。いくつかの実施形態において、第1の溶媒は、有機溶媒、例えばアセトン、または水性溶媒、例えば水、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、遠心は、約1,000rpm〜約4,000rpmの速度で行われ得る。いくつかの実施形態において、遠心は、約2,000rpmの速度で行われ得る。いくつかの実施形態において、1mLの第1の溶媒が、50mgのアガロースビーズごとに使用され得る。いくつかの実施形態において、アガロースビーズは、Superdexビーズを含む。
いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、着色液を形成すること、その着色液を遠心分離すること、および着色液をアガロースビーズに加えることを含む。着色液は、Epolin1178および第2の溶媒を含み得る。いくつかの実施形態において、第2の溶媒は、アセトン、水、脱イオン水またはそれらの任意の組み合わせを含む。遠心は、約2,000rpm〜約10,000rpm、例えば、約5,000rpmの速度で行われ得る。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、アガロースビーズおよび着色液をインキュベートすることをさらに含む。インキュベーションは、約15分間〜約1時間、例えば、約30分間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、室温で行われ得る。インキュベーションは、絶えず混合しながら行われ得る。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、インキュベーション後に、例えば、約750rpm〜約3,000rpmの速度で、アガロースビーズを遠心分離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、色の濃いビーズを色の薄いビーズから分離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、アガロースビーズを0.2パーセントのBSA−PBSに懸濁することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、アガロースビーズのコアを形成する工程は、アガロースビーズを第3の溶媒に懸濁すること、およびアガロースビーズおよび第3の溶媒を遠心分離することを含む。いくつかの実施形態において、第3の溶媒は、1:1のアセトン−水混合物を含む。いくつかの実施形態において、遠心は、約500rpm〜約2,000rpmの速度で行われ得る。いくつかの実施形態において、遠心は、約10秒間〜約60秒間行われ得る。
あるいは、いくつかの実施形態において、アガロースビーズのコアを形成する工程は、ビーズを緩衝液中でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、緩衝液は、BSA−PBSを含む。いくつかの実施形態において、緩衝液は、約0.2パーセントの濃度を有する。いくつかの実施形態において、ビーズを緩衝液中でインキュベートすることは、約4℃の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、ビーズを緩衝液中でインキュベートすることは、少なくとも約5日間にわたって行われ得る。アガロースビーズのコアを形成する工程は、緩衝液を毎日交換することをさらに含み得る。
本明細書中に記載されるような複数のビーズおよび本明細書中に記載されるような目的の粒子を含む溶液が、本明細書中に提供される。いくつかの場合において、目的の粒子は、細胞である。いくつかの場合において、その溶液は、約1:1〜10:1である、複数のビーズの数と複数の細胞の数との比を含む。目的の粒子を含む溶液は、本明細書中に記載されるようなアレイの1つまたは複数のポアに挿入され得る。溶液の例は、実施例5および6に関してさらに記載される。
システム
本明細書中に提供される別の態様は、粒子をソーティングするためのシステムである。混合物の構成要素をソーティングするためのシステムが、本明細書中に提供される。そのシステムは、本明細書中に記載されるようなアレイの任意の実施形態、バリエーションまたは例を含み得る。
本明細書中に提供される別の態様は、粒子をソーティングするためのシステムである。混合物の構成要素をソーティングするためのシステムが、本明細書中に提供される。そのシステムは、本明細書中に記載されるようなアレイの任意の実施形態、バリエーションまたは例を含み得る。
図14Aは、アレイ100、ハウジング1431および内側表面1432を備えるシステムを示している。粒子をソーティングするためのシステムは、第1の表面111;第1の表面111の反対側の第2の表面112;および第1の表面111から第2の表面112に延びる複数のポア113を含む基材110を備えるアレイ100を備え得、ポア113の各々は、約1平方ミリメートルに等しいかまたはそれ未満の断面積および約10mmに等しいかまたはそれ未満の長さを含み、基材110は、第1の材料;および第2の表面112に作動可能に結合されたコーティング120(ここで、コーティング120は、第1の材料と異なる第2の材料を含み、コーティング120の一部分は、そのコーティング120の一部分に向けられた電磁放射に応答して第2の表面112から破壊されるように形成され得る);およびアレイ100の複数のポア113内の流体(ここで、複数のポア113内の流体のメニスカスは、コーティング120に実質的に隣接している)を備える。
いくつかの実施形態において、第1の表面111は、親水性であり得る。いくつかの実施形態において、第1の表面111は、親水性のコーティング120に作動可能に結合され得る。いくつかの実施形態において、コーティング120は、疎水性であり得る。いくつかの実施形態において、コーティング120は、1時間と等しいかまたはそれを超える時間にわたってポアからの漏れを防ぐことが可能であり得る。いくつかの実施形態において、コーティング120は、その全体が第2の表面112を覆っている。
いくつかの実施形態において、第2の材料は、クロムであり得る。いくつかの実施形態において、第2の材料は、銀、金、アルミニウム、チタン、銅、白金、ニッケルまたはコバルトを含む。いくつかの実施形態において、第1の材料は、ガラスであり得る。いくつかの実施形態において、断面積は、約0.03mm2に等しいかまたはそれ未満であり得る。いくつかの実施形態において、長さは、約1.5mmに等しいかまたはそれ未満であり得る。いくつかの実施形態において、コーティング120は、約200nmに等しいかまたはそれ未満の厚さを含む。いくつかの実施形態において、基材110は、約0.5m−1という表面積対体積比を含む。いくつかの実施形態において、コーティング120の一部分は、電磁放射を吸収するように、かつコーティング120の一部分に向けられた電磁放射に応答して第2の表面112から剥がれるように、形成され得る。いくつかの実施形態において、複数のマイクロポア113は、第1の表面111および第2の表面112に対して直角である。いくつかの実施形態において、複数のマイクロポア113は、互いに実質的に平行である。いくつかの実施形態において、複数のマイクロポア113は、約100万〜約1000億個のマイクロポア113である。いくつかの実施形態において、第2の材料は、不透明である。第2の材料は、赤外(IR)エネルギーを吸収するように形成され得る。基材110とコーティング120とは、異なる熱膨張係数を含み得る。
必要に応じて、上記システムは、アレイから放出された選ばれた内容物を受け取るように構成された内側表面1432を含むハウジング1431をさらに備え得る。上記システムは、本明細書中に記載されるようなアレイの任意の実施形態、バリエーションまたは例、および内側表面を含むハウジングを備え得る。その内側表面は、基材の第2の表面の下に位置し得る。上記システムは、セルソーターをさらに備え得る。アレイは、セルソーター上にマウントされ得る。
必要に応じて、粒子をソーティングするためのシステムは、電磁放射源を備え得る。
図14Bは、アレイ100、電磁放射源1451を備える、粒子をソーティングするためのシステムを示している。そのアレイは、第1または第2の表面の一部分に向けられた電磁放射に応答して第1の表面または第2の表面において破壊されるように形成され得る。いくつかの場合において、例えば、目的の粒子が細胞であるとき、細胞生存率の上昇を助けるために、目的の粒子を保持しているコンパートメントにレーザーまたは他のエネルギー源を直接向けることなくアレイの特定のコンパートメント内に保持された粒子をソーティングシステムが放出できることが有益であり得る。アレイのポアの内部ではなく、アレイの表面にレーザーエネルギーの焦点を合わせることにより、熱衝撃、熱膨張、マイクロバブル発生および局所的な剪断応力(sheer stress)からポア内容物が傷害を受ける可能性が回避または低減され得る。
電磁放射の発生源は、レーザーを含み得る。レーザーは、ドープされた固体レーザーであり得る。レーザーは、ファイバーレーザーであり得る。レーザーは、半導体ダイオードレーザーであり得る。レーザーは、ガスレーザー、例えば、HeNeレーザーまたはエキシマ(eximer)レーザーであり得る。レーザーは、ある範囲内の波長の電磁放射を放射し得る。いくつかの実施形態において、その電磁放射は、可視光線および/または赤外線として放射され得る。その電磁放射は、5ナノメートルの帯域内で放射され得、次いで、可視光線または赤外線として放射され得る。その電磁放射は、ドープされた固体レーザーの高調波(例えば、ドープされたオルトバナジン酸イッテルビウムまたはイッテルビウム・アルミニウム・ガーネット)で放射され得る。その電磁放射は、1064nmの放射線を含み得る。
上記電磁放射は、入射エネルギーを含み得る。その入射エネルギーは、1パルスあたり0.1マイクロジュール超であり得る。その入射エネルギーは、1パルスあたり1ミリジュール未満であり得る。その入射エネルギーは、1パルスあたり1ピコジュール〜1ジュールの範囲内であり得る。平均出力は、10ワット未満であり得る。平均電力は、100ミリワット未満であり得る。平均出力は、1マイクロワット超であり得る。
上記電磁放射は、ある入射ピーク出力密度を含み得る。そのピーク出力密度は、1平方センチメートルあたり10テラワット未満であり得る。そのピーク出力は、1平方センチメートルあたり10ギガワット未満であり得る。
上記電磁放射は、ある入射スポット径を含み得る。そのスポット径は、細胞の内容物が有意に照射されることなく、ポアに隣接する範囲が照射され得るように十分に小さいことがある。そのスポット径は、ポアのサイズおよびポアの間隔に基づいて調整され得る。そのスポット径は、管腔の内部の細胞などのポアの内容物が有意に照射されることなく、ポア管腔の内壁が照射され得るように十分に小さいことがある。そのスポット径は、10ミリメートル(mm)未満、1mm未満、100ミクロン(μm)未満、10μm未満またはそれ未満であり得る。
上記電磁放射は、ある入射パルス持続時間を含み得る。そのパルス持続時間は、約5フェムト秒超であり得る。そのパルス持続時間は、約100フェムト秒超であり得る。そのパルス持続時間は、約1ナノ秒超またはそれを超えることがある。そのパルス持続時間は、約1マイクロ秒未満であり得る。
電磁放射源の一例は、出力が0.1mJであり、出力密度が108〜109W/mm2である1064nmのイッテルビウムファイバーレーザーを含み、それにより、最大レーザー出力の10パーセント〜30パーセントにおいて4nsのパルス持続時間で20μmのスポット径が、アレイに30〜90J/cm2を提供することができる。
上記システムは、電磁放射源の焦点を合わせるための1つまたは複数のレンズをさらに備え得る。その1つまたは複数のレンズは、顕微鏡の対物レンズを含み得る。その顕微鏡の対物レンズは、アレイの特定の一部分を標的化するために、アレイの表面の端から端までラスタースキャンされ得る。上記システムは、アレイの表面に対する対物レンズの位置を制御し得る1つまたはそれを超える移動ステージを備え得る。
上記システムは、1つまたはそれを超えるビームスプリッター、フィルターまたは干渉フィルターを備え得る。そのシステムの1つまたはそれを超えるビームスプリッター、フィルターまたは干渉フィルターは、ユーザーが、電磁放射源をアレイの表面と一直線に並べるかまたは電磁放射源をアレイの表面に向けながら、アレイの表面をモニターできるようにし得る。その位置調整は、アレイを破壊し得る出力よりも低い出力または同じ出力の電磁放射で行われ得る。上記システムは、電磁放射源の位置調整をモニターするために、1つまたはそれを超える位置敏感型光学検出器(例えば、CCD)を備え得る。
上記システムは、第2の電磁放射源を備え得る。第2の電磁放射源は、位置調整のために使用され得る。第2の電磁放射源は、フルオロフォアなどの吸収体を励起させるために使用され得る。第2の電磁放射源は、干渉性であってもよいし、非干渉性であってもよい。第2の電磁放射源は、広帯域であってもよいし、狭帯域であってもよい。第2の電磁放射源は、電磁放射源に関する本明細書中に記載される任意の特性(例えば、力、パルス持続時間、波長など)を含み得る。
図15Aおよび図15Bは、アレイおよびハウジングを備えるシステム例1400を示している。図15Aは、0時間後における漏れ試験の初めの上面図である。図18Bは、5時間後におけるアレイ例の漏れ試験の初めの上面図である。図15A〜図15Bによると、フレーム1510におけるアレイ例100の漏れ試験を、脱イオン水を用いて約5時間にわたって行った。アレイのマイクロポアを通じた脱イオン水の漏れは無かった。いくつかの実施形態において、アレイ例100のコーティングは、約1時間と等しいかまたはそれを超える時間にわたってポアからの漏れを防ぐことが可能であり得る。いくつかの実施形態において、アレイ例100のコーティングは、約1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間または10時間と等しいかまたはそれを超える時間にわたってポアからの漏れを防ぐことが可能であり得る。
方法
本明細書中に記載されるアレイの実施形態、例およびバリエーションは、そのアレイのポアから粒子を放出するための方法において利用され得る。本明細書中に記載されるシステムの実施形態、例およびバリエーションは、アレイのポアから粒子を放出するための方法において利用され得る。アレイのポアから粒子を放出する方法が本明細書中に提供され、その方法は、ポアを満たす工程、溶液の一部をポアの中に保持する工程、電磁放射をアレイの一部分に向ける工程、アレイの一部分を破壊する工程、および目的の粒子を含む溶液の一部を放出する工程を含む。ポアは、ある溶液の少なくとも一部で満たされ得る。その溶液は、目的の粒子を含み得る。その溶液の一部は、表面張力によってポアの中に保持され得る。アレイの一部分を破壊する工程は、ポアの中に保持された溶液の一部の表面張力を破壊し得る。
本明細書中に記載されるアレイの実施形態、例およびバリエーションは、そのアレイのポアから粒子を放出するための方法において利用され得る。本明細書中に記載されるシステムの実施形態、例およびバリエーションは、アレイのポアから粒子を放出するための方法において利用され得る。アレイのポアから粒子を放出する方法が本明細書中に提供され、その方法は、ポアを満たす工程、溶液の一部をポアの中に保持する工程、電磁放射をアレイの一部分に向ける工程、アレイの一部分を破壊する工程、および目的の粒子を含む溶液の一部を放出する工程を含む。ポアは、ある溶液の少なくとも一部で満たされ得る。その溶液は、目的の粒子を含み得る。その溶液の一部は、表面張力によってポアの中に保持され得る。アレイの一部分を破壊する工程は、ポアの中に保持された溶液の一部の表面張力を破壊し得る。
本明細書では、選ばれた内容物をアレイのポアから放出する方法を提供し、その方法は、選ばれた内容物を含むアレイのポアを識別する工程であって、そのアレイは、第1の表面およびその第1の表面の反対側の第2の表面を有する基材を備え、その基材は、基材材料および表面材料を含み、その表面材料は、第1または第2の表面に位置または隣接し、その基材は、第1の表面から第2の表面に延びる管腔を定義する複数のポアを含み、その基材は、(a)複数のポアの各ポアが、500ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、(b)複数のポアの各ポアが、10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、(c)1平方ミリメートルあたり100個またはそれを超えるポアというポアの密度、および(d)表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの1つまたはそれを超えることを特徴とする、工程、および識別されたポア内のまたは識別されたポアに隣接する表面材料に向けられた電磁放射によって、前記アレイの第1または第2の表面から表面材料の一部分を除去し、それにより、識別されたポアの内容物を放出する工程を含む。
いくつかの例において、上記アレイは、(a)複数のポアの各ポアが、500ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、(b)複数のポアの各ポアが、10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、(c)1平方ミリメートルあたり100個またはそれを超えるポアというポアの密度、および(d)表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの2つまたはそれを超えることを特徴とし得る。
図16A〜Eは、本明細書中に記載されるように、図1のアレイ例を用いて細胞をソーティングする方法の一例の垂直断面図を示している。図16A〜Eによると、第1アレイ例100を用いて細胞をソーティングする方法例1600は、複数のポア113を備えるアレイ100を提供する工程1610を含む。いくつかの実施形態において、操作1610は、図5Aによると、ミクロスフェアを含むアレイ100の第1の表面111に最も近いポア113の一部分を覆う工程をさらに含み得る。方法1600の操作1620は、水溶液1621をアレイ内に堆積させる工程を含み得る。いくつかの場合において、そのアレイは、図16Bによると、第1の細胞1622および第2の細胞1623を第1のアレイ100上に堆積させることを含み得る。方法1600の操作1630は、図16Cによると、アレイ100をハウジング1631に挿入することを含み得る。いくつかの場合において、ハウジングは、カートリッジを備え得る。ハウジングは、内側表面1632を備え得る。方法100の操作1640は、選ばれた粒子のシグナルのプロットを捕捉する工程を含み得る。その選ばれた粒子は、図16Dによると、第1の細胞1622および第2の細胞1623を含み得る。図16Eによると、方法1600は、第1の細胞および第2の細胞1623のシグナルのプロット内の第1の細胞1622のシグナルのプロットの位置を突き止める工程1640をさらに含み得る。図16Fによると、方法1600は、第2の細胞1623をアレイ100から抽出する工程1640;および第2の細胞1623を回収する工程1650をさらに含み得る。細胞をアレイから抽出する工程は、アレイ100の表面上または表面近くのコーティングを破壊する工程を含み得る。破壊する工程は、電磁放射をアレイの表面の選択された位置に提供する工程を含み得る。図16Aは、その方法例に従って、コーティングを含む複数のポアを備えるアレイを提供しているところの垂直断面図を示している。
図16Bは、図1のアレイ例の中に水性サンプル溶液を堆積させているところの垂直断面図を示している。いくつかの実施形態において、水性サンプル溶液1621をアレイ100上に堆積させる工程1620は、水性サンプル溶液1621をアレイ100上に広げる工程を含む。いくつかの実施形態において、アレイ100の親水性の第1の表面111は、水性サンプル溶液1621をポア113に吸い込む。いくつかの実施形態において、アレイ100の親水性の第1の表面111は、水性サンプル溶液1621内の第1の細胞1622および第2の細胞1623をポア113に均等に分配する。いくつかの実施形態において、アレイ100の親水性の第1の表面111は、水性サンプル溶液1621内の第1の細胞1622および第2の細胞1623をポア113にランダムに分配する。いくつかの実施形態において、第1の細胞1622および第2の細胞1623は、各ポア113の底に沈む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、第1の細胞1622および第2の細胞1623は、水性サンプル溶液1621の表面張力によって各ポア113に引き止められる。いくつかの例において、それらの細胞は、INKT細胞、Tmem、Treg、HSPCおよびそれらの組み合わせから選択される。
図16Cは、いくつかの実施形態に係る、図1のアレイ例を閉鎖カートリッジまたはハウジングに挿入しているところの垂直断面図を示している。図16Cによると、カートリッジ1631は、アレイ100の上部に加湿膜1633を備え、第2の細胞1623を回収するための回収トレイ1632も備える。必要に応じて、いくつかの実施形態において、カートリッジ1631は、閉鎖カートリッジ1631を含む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、カートリッジ1631は、湿度が制御されたカートリッジ1631を含む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、加湿膜1633は、ポア113からの蒸発を減少させる。必要に応じて、いくつかの実施形態において、回収トレイ1632は、カートリッジ1631内のアレイ100の下に配置され得る。必要に応じて、いくつかの実施形態において、回収トレイ1632は、透明の回収トレイ1632を含む。
図16Dは、いくつかの実施形態に係る、第1の細胞および第2の細胞のシグナルのプロットの画像を示している。図16Dによると、第2の細胞のシグナルのプロット1641が測定され得る。いくつかの実施形態において、第1の細胞1642のシグナルのプロットが測定され得る。いくつかの実施形態において、それらのプロットは、自動蛍光走査システムによって撮影された画像を定量化することによって捕捉され得る。第1の細胞は、第1の波長において蛍光性であり得、第2の細胞は、第2の波長において蛍光性であり得る。いくつかの実施形態において、合わせた画像が測定され得る。図17は、細胞のアレイの生の蛍光像の非限定的な例を示している。図18は、図17に表された50万個のマイクロポアのアレイの散布図の非限定的な例を示している。
図16Eは、いくつかの実施形態に係る、第2の細胞を抽出しているところの垂直断面図を示している。図16Eによると、図16Dにおける第2の細胞1623のシグナルのプロットに従って、第2の細胞1623を含むポア113をレーザー1651によるパルスに曝露することによって、第2の細胞1623がアレイ100から抽出される。レーザーは、特定のポア113内にミクロスフェアを含み得るコーティングを励起させる。必要に応じて、いくつかの実施形態において、レーザー1651は、ナノ秒レーザー1651を含む。
図16Fは、いくつかの実施形態に係る、細胞を回収しているところの垂直断面図を示している。図16Fによると、レーザー1651によってアレイ100から抽出された第2の細胞1623は、回収トレイ1661に回収され得る。
本明細書中に提供される別の態様は、アレイのポアから粒子を放出する方法であり、その方法は、ある溶液の少なくとも一部でポアを満たす工程(ここで、その溶液の少なくとも一部は、目的の粒子を含む);ポアの中の溶液の一部を表面張力によって保持する工程;電磁放射をアレイの一部分に向ける工程;アレイの一部分を破壊し、それによって、ポアの中に保持された溶液の一部の表面張力を破壊する工程;および目的の粒子を含む溶液の一部を放出する工程を含む。いくつかの実施形態において、そのアレイは、基材、およびその基材に作動可能に結合されたコーティングを備える。いくつかの実施形態において、その基材は、第1の表面、第1の表面の反対側の第2の表面、およびポアを備え、そのポアは、第1の表面から第2の表面に延びている。いくつかの実施形態において、第1の表面は親水性であり、コーティングは疎水性である。いくつかの実施形態において、アレイの一部分は、アレイのコーティングである。いくつかの実施形態において、アレイの一部分は、ポアに近接したアレイのコーティングである。いくつかの実施形態において、コーティングは、クロムを含む。いくつかの実施形態において、アレイは、複数のポアを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、複数のポアを溶液で満たす工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、複数のポアのサブセットの中に保持された溶液を放出する工程をさらに含み、その複数のポアのサブセットは、目的の粒子を含む溶液を保持している。上記方法は、各粒子に対する複数の蛍光シグネチャを解析する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、その解析に基づいて、目的の粒子を含む溶液の一部を保持しているポアを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、それらの粒子は、1秒あたり約5,000〜約100,000,000個の目的の粒子という速度で放出される。いくつかの実施形態において、目的の粒子は、細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、60パーセントと等しいかまたはそれを超える生存率で放出される。いくつかの実施形態において、上記方法は、目的の粒子をハウジングにおいて受け取る工程をさらに含み、そのハウジングは、目的の粒子を受け取るための内側表面を備える。いくつかの実施形態において、内側表面は、受け取り培地を保持している。いくつかの実施形態において、受け取り培地は、プルロニック(登録商標)F68を含む。
いくつかの実施形態において、上記方法は、識別されたポア内のまたは識別されたポアに隣接する表面材料に向けられた電磁放射によって、アレイの第1または第2の表面から表面材料の一部分を除去し、それにより、識別されたポアの内容物を放出する工程をさらに含む。いくつかの例において、表面材料の一部分は、識別されたポアに隣接し得る。表面の一部分は、識別されたポアの管腔表面を含み得る。表面の一部分は、100ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去され得る。表面の一部分は、50ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去され得る。
いくつかの場合において、選ばれた内容物を含むポアを識別する前に、選ばれた内容物を含む溶液をアレイにロードする工程。いくつかの場合において、選ばれた内容物を含むポアを識別する工程は、アレイのポアから放射された電磁放射を解析する工程を含む。いくつかの場合において、内容物を放出する工程は、1秒あたり約5,000〜約100,000,000ポアという速度で内容物を放出することを含む。
電磁放射の発生源は、レーザーを含み得る。レーザーは、ドープされた固体レーザーであり得る。レーザーは、ファイバーレーザーであり得る。レーザーは、半導体ダイオードレーザーであり得る。レーザーは、ガスレーザー、例えば、HeNeレーザーまたはエキシマレーザーであり得る。レーザーは、ある範囲内の波長の電磁放射を放射し得る。いくつかの実施形態において、その電磁放射は、可視光線および/または赤外線で放射され得る。その電磁放射は、5ナノメートルの帯域内で放射され得、次いで、可視光線または赤外線として放射され得る。その電磁放射は、ドープされた固体レーザーの高調波(例えば、ドープされたオルトバナジン酸イッテルビウムまたはイッテルビウム・アルミニウム・ガーネット)で放射され得る。その電磁放射は、1064nmの放射線を含み得る。
電磁放射は、0.2ミクロン〜2.5ミクロンの波長、および内容物とポアとの接着を破壊するのに十分なフルエンスレベル、および1ns〜1ミリ秒の範囲内のパルス持続時間から選択され得る。
したがって、目的の粒子が、アレイの特定のポア内に保持されていると識別されると、電磁放射が、その特定のポアの近くまたは特定のポアに隣接したところに向けられて、目的の粒子を放出し得る。いくつかの実施形態において、第2の表面の破壊は、アレイの材料の少なくとも一部分、アレイ上のコーティングまたはその両方を除去することを含む。
いくつかの実施形態において、表面材料の一部分を除去する工程は、局所的な加熱によって引き起こされ得る。そのようなメカニズムは、パルス持続時間がより長いとき、ピーク出力密度がより低いとき、および/または入射放射の波長が赤外であるとき、起こる可能性があり得る。局所的な加熱は、表面材料またはアレイ材料の昇華を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、基材材料とコーティングとは、異なる熱膨張係数を含み、それにより、チッピングに至り得る。
いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、アブレーションによって引き起こされ得る。そのようなメカニズムは、入射ピーク出力密度がより高いとき、パルス持続時間がより短いとき、放射電力がより高いとき、および/または入射放射が可視であるとき、起こる可能性があり得る。アブレーションは、アレイまたは基材材料の局所的な結合の切断および/または気化を含み得る。
いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、プラズマ発生によって引き起こされ得る。このメカニズムは、入射放射のパルス持続時間が特に短いとき、入射放射の波長が多光子イオン化メカニズムと共鳴関係にあるとき、およびまたは入射放射の波長が非常に短いとき、起こる可能性があり得る。ピコ秒台からフェムト秒台のパルス持続時間により、基材または表面材料の光学エッチングにつながる局所的な加熱よりも速いプラズマ発生がもたらされ得る。
いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、衝撃波発生によって生じ得る。そのようなメカニズムは、ピーク出力密度がより高いとき、フォノンが共鳴しているとき、および/またはパルス持続時間がより短いとき、起こる可能性が高い場合がある。衝撃は、表面材料またはアレイ材料の物理的振動、チッピングまたは揺れを引き起こし得る。
いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、光イオン化などの光化学的除去である。いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、衝撃波の光学的発生などによる光音響的除去を含む。
用語および定義
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。
本明細書中で使用されるとき、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書中の「または」に対する任意の言及は、別段述べられない限り、「および/または」を包含すると意図されている。
本明細書中で使用されるとき、用語「約」とは、その中の増分を含めて、述べた量に10パーセント、5パーセントまたは1パーセント近い量のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「PBMC」とは、末梢血単核球のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「直角」とは、垂直の配置または関係性のことを指す。
以下の説明的な例は、本明細書中に記載されるソフトウェアアプリケーション、システムおよび方法の実施形態の代表であって、決して限定であることを意味しない。
実施例1−クロムコーティングされたマイクロポアアレイの調製:
Income Inc.から購入したガラスマイクロポアアレイ(C00113,3005722,20μmポア,60パーセントのポアカバー率)をLGA薄膜において100nm厚のクロムでスパッタした(Santa Clara,CA,真空:8xl0−2〜2xl0−2mbar、スパッタリング電圧:100V〜3kV、電流:0〜50mA)。そのクロムは、ポアプレートの片側だけにスパッタされた。その後、クロムコーティングされたマイクロポアアレイを、まず1M NaOH溶液に12時間、10パーセント漂白剤に最大1時間浸漬し、次いで、水を噴霧して残留漂白剤を除去し、細胞をロードする前にブロー乾燥した。
Income Inc.から購入したガラスマイクロポアアレイ(C00113,3005722,20μmポア,60パーセントのポアカバー率)をLGA薄膜において100nm厚のクロムでスパッタした(Santa Clara,CA,真空:8xl0−2〜2xl0−2mbar、スパッタリング電圧:100V〜3kV、電流:0〜50mA)。そのクロムは、ポアプレートの片側だけにスパッタされた。その後、クロムコーティングされたマイクロポアアレイを、まず1M NaOH溶液に12時間、10パーセント漂白剤に最大1時間浸漬し、次いで、水を噴霧して残留漂白剤を除去し、細胞をロードする前にブロー乾燥した。
実施例2−カセットアセンブリ:
カセットは、(上から下に向かって)カセットの上部に封着されたガラス;マイクロポアプレートを保持するためのアルミニウム合金フレーム;マイクロポアプレートから一定または不定の距離の間隔をあけた受け取りガラスプレートを含む。(カセットのサイズに応じて)異なる体積の0.1パーセントのプルロニック(登録商標)F68(Cat.24040032,ThermoFisher Scientific Inc.)を含む受け取り培地(OptiPEAK T Cell培地,InVitria,Junction City,KS)を受け取りプレートに加えた。クロムコーティングされたマイクロポアアレイを、クロムコーティングされた側を下向きにして(受け取り培地に面して)カセットに組み立てた。受け取り培地にプルロニック(登録商標)F68を加えることによって、ポアから抽出される細胞の生存率を0パーセントの生存率から>75パーセントの生存率へ大幅に高めることができる。
カセットは、(上から下に向かって)カセットの上部に封着されたガラス;マイクロポアプレートを保持するためのアルミニウム合金フレーム;マイクロポアプレートから一定または不定の距離の間隔をあけた受け取りガラスプレートを含む。(カセットのサイズに応じて)異なる体積の0.1パーセントのプルロニック(登録商標)F68(Cat.24040032,ThermoFisher Scientific Inc.)を含む受け取り培地(OptiPEAK T Cell培地,InVitria,Junction City,KS)を受け取りプレートに加えた。クロムコーティングされたマイクロポアアレイを、クロムコーティングされた側を下向きにして(受け取り培地に面して)カセットに組み立てた。受け取り培地にプルロニック(登録商標)F68を加えることによって、ポアから抽出される細胞の生存率を0パーセントの生存率から>75パーセントの生存率へ大幅に高めることができる。
実施例3−クロムコーティングされたマイクロポアアレイによる細胞ソーティング:
OptiPEAK T Cell培地中に200万/mLという密度を有するPBMCをマイクロポアアレイの上部に滴下し、5分間静置させて、表面張力によって単一細胞がマイクロポアの底に捕捉されるようにした。その後、カセットをセルソーターにマウントした。10〜100パーセントのレーザー出力を用いることにより、マイクロポアから細胞を抽出することができる。マイクロポアの底の縁のクロムコーティングがIRレーザーエネルギーを吸収し、クロムの薄層が除去された。メニスカスを壊し、所望のマイクロポアから細胞を放出した。
OptiPEAK T Cell培地中に200万/mLという密度を有するPBMCをマイクロポアアレイの上部に滴下し、5分間静置させて、表面張力によって単一細胞がマイクロポアの底に捕捉されるようにした。その後、カセットをセルソーターにマウントした。10〜100パーセントのレーザー出力を用いることにより、マイクロポアから細胞を抽出することができる。マイクロポアの底の縁のクロムコーティングがIRレーザーエネルギーを吸収し、クロムの薄層が除去された。メニスカスを壊し、所望のマイクロポアから細胞を放出した。
実施例4−IR吸収コアを有するアガロースビーズの製造:
この手順では、透明のシェルおよびIR吸収コアを有するアガロースビーズの調製を説明する。
この手順では、透明のシェルおよびIR吸収コアを有するアガロースビーズの調製を説明する。
工程1.50mgのSuperdexビーズ(Superdex 75 100/300 GL,GE Healthcare Life Sciences)を1mLのアセトンに懸濁する。2000rpmで遠心して、Superdexビーズを回収する。アセトンを廃棄する。アセトン中に1mLのIR吸収色素(Epolight1178,Epolin,New Jersey,USA)飽和溶液を作製する。5000rpmで遠心して、溶解していないIR色素を除去する。IR色素溶液をSuperdexビーズに加える。絶えず混合しながら室温で30分間インキュベートする。その混合物を1500rpmで遠心分離する。上部の液体を廃棄する。底に色の濃いペレットだけを残す。アセトンでさらに洗浄せずに、得られた色の濃いペレットを0.2パーセントBSA−PBSに懸濁する。これにより、均一にIR色素が組み込まれたSuperdexビーズが得られる。
工程2.ビーズの外側部分から色素を除去するために、ピペッティングによってビーズを1:1アセトン−水混合物で15秒未満、リンスする。その直後に、その混合物を1000rpmで30秒間遠心し、上部の液体を廃棄する。これにより、IRコア構造が得られる。
あるいは、IR吸収コアは、工程1から得られたビーズを4度の0.2パーセントBSA−PBS中で>5日間インキュベートすることによって作製することもできる。緩衝液を1日1回交換する。これにより、分子拡散のみによってIR色素がSuperdexビーズからゆっくり溶ける。
実施例5−培地サプリメントとしてプルロニック(登録商標)F68を用いたときの単一PBMCの生存率:
この手順では、細胞ソーティング中の細胞生存率を高めるための培地サプリメントを説明する。細胞のロードおよび収集に向けて、0.1パーセントのプルロニック(登録商標)F68および1×ペニシリン/ストレプトマイシンが補充されたOptiPEAK T Lymphocyte Complete Media(777OPT069)に細胞を懸濁し、収集した。この実施例では、20μmのマイクロポアサイズを有するアレイ例の場合、3つの各サンプルに対するパーセント生存率が、それぞれ81パーセント、74パーセントおよび65パーセントと計測された。
この手順では、細胞ソーティング中の細胞生存率を高めるための培地サプリメントを説明する。細胞のロードおよび収集に向けて、0.1パーセントのプルロニック(登録商標)F68および1×ペニシリン/ストレプトマイシンが補充されたOptiPEAK T Lymphocyte Complete Media(777OPT069)に細胞を懸濁し、収集した。この実施例では、20μmのマイクロポアサイズを有するアレイ例の場合、3つの各サンプルに対するパーセント生存率が、それぞれ81パーセント、74パーセントおよび65パーセントと計測された。
実施例6−PBMC抽出:
この手順では、目的の粒子およびビーズを含む溶液を説明する。
この手順では、目的の粒子およびビーズを含む溶液を説明する。
ヒトPBMC細胞を含む溶液をマイクロポアアレイの上部に滴下した。10分後、単一のPBMCがマイクロポアにロードしているところだった。その後、コントロールビーズ(IR色素でコーティングされたTiO2ビーズ)、またはアガロースおよびデキストランビーズ、またはアガロースおよびIR色素ミクロスフェアのいずれかを含む溶液を、マイクロポアアレイの上部にロードした。15〜30分後、ビーズが重力によってマイクロポア内にロードされた。細胞およびビーズを含むポアアレイを、細胞培養液を含む受け取りレザバーの上部にマウントした。ビーズがロードされたポアの底を標的化するようにIRパルスレーザーを向け、細胞を細胞培養液中に抽出した。抽出後、抽出された細胞を含む細胞培養液を生存率アッセイに向けて収集した。
実施例7−細胞生存率:
この手順では、細胞生存率の測定を説明する。
この手順では、細胞生存率の測定を説明する。
定量的サンドイッチELISAアッセイ(ヒトIFN−ガンマELISpot Kit,R&D Systems Inc.,No.EL285)によって、細胞生存率を測定した。このアッセイは、PVDFが塗布されたマイクロプレート上にプレコーティングされたヒトサイトカインインターフェロンγ(IFN−ガンマ)に特異的な捕捉抗体を使用する。収集された細胞をウェルに直接、ピペットで移すと、分泌細胞のすぐ近傍の固定化された抗体が、分泌されたヒトIFN−ガンマに結合する。洗浄工程およびビオチン化検出抗体とのインキュベーションの後、ストレプトアビジンに結合体化されたアルカリホスファターゼを加えた。その後、洗浄によって未結合の酵素を除去し、基質溶液を加えた。青色の沈殿物が、サイトカインの部位に現れ得、スポットとして出現し得る。各個別のスポットが、個々のヒトIFN−ガンマ分泌細胞に相当する。それらのスポットを数えた。生細胞数が既知である段階希釈の標準細胞サンプルも、収集された細胞サンプルと同じようにプレーティングした。各ウェル内の青色のスポットを数えることによって、検量線をプロットした。収集されたサンプル中の生細胞数を検量線によって決定した。
本発明の好ましい実施形態を本明細書中に示し、説明してきたが、そのような実施形態が例示のためだけに提供されていることは、当業者には明らかであろう。当業者は、数多くのバリエーション、変更および置換を本発明から逸脱することなく考え付くだろう。本明細書中に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明の実施において使用され得ることが理解されるべきである。
Claims (81)
- 第1の表面および前記第1の表面の反対側の第2の表面を有する基材を備えるアレイであって、
前記基材は、基材材料および表面材料を含み、前記表面材料は、前記第1または第2の表面に位置または隣接し、前記基材は、前記第1の表面から前記第2の表面に延びる管腔を定義する複数のポアを含み、前記基材は、
前記複数のポアの各ポアが、500ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、
前記複数のポアの各ポアが、10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、および
前記表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されること
を特徴とする、
アレイ。 - 第1の表面および前記第1の表面の反対側の第2の表面を有する基材を備えるアレイであって、
前記基材は、基材材料および表面材料を含み、前記表面材料は、前記第1または第2の表面に位置または隣接し、前記基材は、前記第1の表面から前記第2の表面に延びる複数のポアを含み、前記基材は、
1平方ミリメートルあたり100個またはそれを超えるポアというポアの密度、
前記複数のポアの各ポアが、10を超えるアスペクト比を有すること、および
前記表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されること
を特徴とする、
アレイ。 - 前記各ポアが、約0.008mm2またはそれ未満の最大断面積を有する、請求項1または2に記載のアレイ。
- 前記複数のポアの前記各ポアが、5ミクロン〜100ミクロンの範囲内のポア直径を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記複数のポアの前記各ポアが、15ミクロン〜50ミクロンの範囲内のポア直径を有する、請求項4に記載のアレイ。
- 前記各ポアが、約1mm〜約500mmの範囲から選択される長さを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記各ポアが、約1mm〜約100mmの範囲から選択される長さを有する、請求項6に記載のアレイ。
- 前記各ポアが、約1mm〜約10mmの範囲から選択される長さを有する、請求項7に記載のアレイ。
- 前記ポアの密度が、1平方ミリメートルあたり100〜2500ポアの範囲内である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記ポアの密度が、1平方ミリメートルあたり500〜1500ポアの範囲内である、請求項9に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、前記基材材料と実質的に類似である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、前記基材材料と異なる、請求項1〜10のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記基材材料が、ガラスであり、前記表面材料が、ガラスではない、請求項12に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、金属を含む、請求項13に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、0.4ミクロン〜2.5ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の10パーセント超を吸収する、請求項1〜14のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、入射放射の50パーセント超を吸収する、請求項1〜14のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、0.4ミクロン〜1.5ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の50パーセント超を吸収する、請求項16に記載のアレイ。
- 前記アスペクト比が、10〜100の範囲内である、請求項1〜17のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記アスペクト比が、20またはそれを超える、請求項1〜17のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記アスペクト比が、50またはそれを超える、請求項19に記載のアレイ。
- 前記アスペクト比が、100またはそれを超える、請求項20に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、前記第2の表面を覆うかまたは部分的に覆う、請求項1〜21のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、前記第1の表面を覆うかまたは部分的に覆う、請求項1〜22のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、前記ポアの前記管腔へのアクセスを遮断しない、請求項1〜23のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、約20nm〜500nmの平均厚さを有する、請求項1〜24のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、約100nm〜500nmの平均厚さを有する、請求項25に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、疎水性である、請求項1〜26のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記第1および前記第2の表面が、実質的に平行な面である、請求項1〜28のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記複数のポアが、前記第1の表面から前記第2の表面まで表面法線に対して角度をなして延びている、請求項28に記載のアレイ。
- 前記角度が、より大きく0〜90度の範囲内である、請求項29に記載のアレイ。
- 前記複数のポアが、前記第1の表面から前記第2の表面まで直角に延びている、請求項1〜30のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記複数のポアが、前記第1の表面から前記第2の表面まで間接経路を通っている、請求項1〜27のいずれか1項に記載のアレイ。
- 混合物の構成要素をソーティングするためのシステムであって、請求項1〜32のいずれか1項に記載のアレイ、および前記アレイから放出された選ばれた内容物を受け取るように構成された内側表面を備えるハウジングを備える、システム。
- 前記内側表面が、前記基材の前記第2の表面の下に位置する、請求項33に記載のシステム。
- 選ばれた内容物をアレイのポアから放出する方法であって、前記方法は、
選ばれた内容物を含むアレイのポアを識別する工程であって、前記アレイは、第1の表面および前記第1の表面の反対側の第2の表面を有する基材を備え、前記基材は、基材材料および表面材料を含み、前記表面材料は、前記第1または第2の表面に位置または隣接し、前記基材は、前記第1の表面から前記第2の表面に延びる管腔を定義する複数のポアを含み、前記基材は、(a)前記複数のポアの各ポアが、500ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、(b)前記複数のポアの各ポアが、10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、(c)1平方ミリメートルあたり100個またはそれを超えるポアというポアの密度、および(d)前記表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの1つまたはそれを超えることを特徴とする、工程、および
前記識別されたポア内のまたは前記識別されたポアに隣接する前記表面材料に向けられた電磁放射によって、前記アレイの前記第1または第2の表面から前記表面材料の一部分を除去し、それにより、前記識別されたポアの前記内容物を放出する工程
を含む、方法。 - 前記電磁放射が、0.2ミクロン〜2.5ミクロンの波長、前記内容物と前記ポアとの間の接着を破壊するのに十分なフルエンスレベル、および1ns〜1ミリ秒の範囲内のパルス持続時間から選択される、請求項35に記載の方法。
- 表面材料を除去する工程が、アブレーションを含む、請求項35または36に記載の方法。
- 表面材料を除去する工程が、機械的除去を含む、請求項35または36に記載の方法。
- 機械的除去が、チッピングを含む、請求項38に記載の方法。
- 表面材料を除去する工程が、光熱除去を含む、請求項35または36に記載の方法。
- 表面材料を除去する工程が、光化学的除去を含む、請求項35または36に記載の方法。
- 表面材料を除去する工程が、光音響的除去を含む、請求項35または36に記載の方法。
- 前記選ばれた内容物が、水溶液中の細胞を含む、請求項35〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、INKT細胞、Tmem、Treg、HSPCおよびそれらの組み合わせから選択される、請求項43に記載の方法。
- 前記複数のポアの前記各ポアが、約0.008mm2またはそれ未満の断面積を有する、請求項35〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のポアの前記各ポアが、5ミクロン〜100ミクロンの範囲内のポア直径を有する、請求項35〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のポアの前記各ポアが、15ミクロン〜50ミクロンの範囲内のポア直径を有する、請求項46に記載の方法。
- 前記各ポアが、約1mm〜約500mmの範囲から選択される長さを有する、請求項35〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記各ポアが、約1mm〜約100mmの範囲から選択される長さを有する、請求項48に記載の方法。
- 前記各ポアが、約1mm〜約10mmの範囲から選択される長さを有する、請求項49に記載の方法。
- 前記ポアの密度が、1平方ミリメートルあたり100〜2500ポアの範囲内である、請求項35〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポアの密度が、1平方ミリメートルあたり500〜1500ポアの範囲内である、請求項51に記載の方法。
- 前記アレイが、1000ポア/mm2を超えるポアの密度を含む、請求項35〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポアの密度が、5000ポア/mm2またはそれを超える、請求項53に記載の方法。
- 前記アスペクト比が、10〜100の範囲内である、請求項35〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポアが、20またはそれを超えるアスペクト比を有する、請求項35〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポアが、50またはそれを超えるアスペクト比を有する、請求項56に記載の方法。
- 前記ポアが、100またはそれを超えるアスペクト比を有する、請求項57に記載の方法。
- 前記表面材料が、約0.4ミクロン〜約2.5ミクロンから選択される波長において10パーセント超を吸収する、請求項35〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面材料が、入射放射の50パーセント超を吸収する、請求項35〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面材料が、約0.4ミクロン〜約2.5ミクロンから選択される波長の入射放射の50パーセント超を吸収する、請求項60に記載の方法。
- 前記アレイが、(a)前記複数のポアの各ポアが、500ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、(b)前記複数のポアの各ポアが、10またはそれを超えるアスペクト比を有すること、(c)1平方ミリメートルあたり100個またはそれを超えるポアというポアの密度、および(d)前記表面材料が、入射電磁放射の10パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの2つまたはそれを超えることを特徴とする、請求項35〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面材料の前記一部分が、前記識別されたポアに隣接する、請求項35〜62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面の前記一部分が、前記識別されたポアの管腔表面を含む、請求項35〜62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面の前記一部分が、100ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去される、請求項35〜64のいずれか1項の請求項に記載の方法。
- 前記表面の前記一部分が、50ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去される、請求項35〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 選ばれた内容物を含む前記ポアを識別する前記工程の前に、前記選ばれた内容物を含む溶液を前記アレイにロードする工程をさらに含む、請求項35〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 選ばれた内容物を含む前記ポアを識別する工程が、前記アレイの前記ポアから放射された電磁放射を解析する工程を含む、請求項35〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内容物を放出する工程が、1秒あたり約5,000〜約100,000,000ポアという速度で前記内容物を放出することを含む、請求項35〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 赤外線吸収コア;および
非赤外線吸収シェルであって、前記非赤外線吸収シェルの外径が、約10ミクロンに等しいかまたはそれ未満である、非赤外線吸収シェル
を備える、ビーズ。 - 前記非赤外線吸収シェルが、アガロース、デキストランまたはその両方を含む、請求項70に記載のビーズ。
- 前記赤外線吸収コアが、赤外線吸収色素を含む、請求項70または71に記載のビーズ。
- 約20ミクロンに等しいかまたはそれ未満の直径を有する、請求項70〜73のいずれか1項に記載のビーズ。
- 前記表面材料が、赤外線吸収コアおよび非赤外線吸収シェルを含むビーズをさらに備え、前記非赤外線吸収シェルの外径は、約10ミクロンに等しいかまたはそれ未満である、請求項1〜32のいずれか1項に記載のアレイ。
- (a)複数の、請求項70〜73のいずれか1項に記載のビーズ;および
(b)目的の粒子
を含む、溶液。 - 前記目的の粒子が、細胞である、請求項74に記載の溶液。
- 前記複数のビーズの数と複数の前記細胞の数との比が、約1:1〜10:1である、請求項75に記載の溶液。
- 前記表面材料が、細胞生存率に悪影響を及ぼさない材料から選択される、請求項1〜32のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記細胞生存率が、細胞を前記表面材料に曝露する前の細胞生存率と比べて、前記表面材料への曝露の後、同じままであるか、または20%未満しか低下しない、請求項78に記載のアレイ。
- 前記表面材料が、電磁放射と接触したとき、細胞傷害または細胞死を引き起こさない材料から選択される、請求項1〜32のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記細胞生存率が、細胞を前記アレイにロードする前の細胞生存率と比べて、前記表面材料を前記電磁放射と接触させた後、同じままであるか、または20%未満しか低下しない、請求項80に記載のアレイ。
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