JP2021523137A - 生体吸収性ポリエステル、親水性ポリマーおよびアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドを含むナノ粒子 - Google Patents

Abstract

本発明は、生体吸収性ポリエステルと該生体吸収性ポリエステルの一部であるかまたは別のポリマーである親水性ポリマーとを含むコア、および該コア上にアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドを含み、該アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列または配列番号１の配列と８より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドであり、該ヒトラクトフェリン由来ペプチドのＮ末端がＣ_１６−モノアシル基でアシル化されているナノ粒子に関する。
【選択図】なし

Description

本願は、生体吸収性ポリエステル、親水性ポリマーおよびアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドを含むナノ粒子に関する。

例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー（ＰＬＧＡ）のような乳酸ポリマーは生分解性ポリマーであり、当技術分野において例えば、ＥＰ１４６８０３５、ＵＳ６７０６８５４、ＷＯ２００７／００９９１９Ａ２、ＥＰ１９０７０２３Ａ、ＥＰ２２６３７０７Ａ、ＥＰ２１４７０３６、ＥＰ０４２７１８５またはＵＳ５６１０２６６から周知である。

本明細書に開示される配列番号１ ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列を有するヒトラクトフェリン由来ペプチドは、ＷＯ２００７／０４８５９９、ＷＯ２００７／０７６９０４Ａ１、ＷＯ２０１２／０６９０８９およびＷＯ２０１５１８１１３８Ａ１から既知である。

ＷＯ２０１５／１８１１３８Ａ１には、リン酸カルシウムナノ粒子コア、有効成分、乳酸ポリマーコーティングおよびヒトラクトフェリン由来ペプチドを含む陽イオンポリマーコーティングに基づくナノ粒子が記載されている。

Ｈａｓｓｅｒｔら（（２０１２）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ − Ｖｏｌ．９ ｐｐ．２６４８−２６５８）は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）の修飾のためのアシル化蛍光標識環状インテグリンリガンドの樹脂上合成」を記載している。ＰＬＧＡのコーティングのための第二の官能基を含めるために脂質化ｃ［ＲＧＤｆＫ］ペプチドが使用された。パルミトイル化インテグリン−リポペプチドは、ＰＬＧＡに対して高い親和性を示した。

本発明は、生体吸収性ポリエステルと該生体吸収性ポリエステルの一部であるかまたは別のポリマーである親水性ポリマーとを含むコア、および該コア上にアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドを含み、該アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列または配列番号１の配列と８より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドであり、該ヒトラクトフェリン由来ペプチドのＮ末端がＣ_１６−モノアシル基で置換されているナノ粒子に関する。

ヒトラクトフェリン由来ペプチド（ｈＬＦＦ）は一般に、医薬品有効成分（ＡＰＩ）と同時にヒト細胞に送達された際に、ヒトラクトフェリン由来ペプチドが細胞におけるＡＰＩの取り込みを補助および促進することを意味する生体細胞透過機能（細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）、例えば、ＷＯ２００７／０４８５９９またはＷＯ２００７／０７６９０４Ａ１）を示し得る。

本発明者らは意外にも、生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーに基づく、ナノ粒子におけるコーティングとしての、Ｃ_１６−アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドと配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列または配列番号１の配列と８より多いアミノ酸位置が異ならない配列の組合せが、アシル化されていないまたはアシル化の異なるヒトラクトフェリン由来ペプチドを含む、対応するナノ粒子よりも優れていることを見出した。特に、Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｆ３０５蛍光標識ナノ粒子の相対蛍光（Ａ５４９肺癌細胞１００個当たり）は、アシル化の異なるｈＬＦＦ−ペプチドによるコーティングを含む他のＬｕｍｏｇｅｎ Ｆ３０５蛍光標識ナノ粒子またはｈＬＦＦコーティングがないナノ粒子に比べて優れている。

発明の詳細な説明
ナノ粒子
本発明は、生体吸収性ポリエステルと該生体吸収性ポリエステルの一部であるかまたは別のポリマーである親水性ポリマーとを含むコア、および該コア上にコーティングを含んでなり、該コーティングがアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドを含み、該アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列または配列番号１の配列と８より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドであり、該ヒトラクトフェリン由来ペプチドのＮ末端がＣ_１６−モノアシル基でアシル化されているナノ粒子に関する。

親水性ポリマーは生体吸収性ポリエステルの一部としてまたは別のポリマーとして存在し得るので、生体吸収性ポリエステルと親水性ポリマーには４つの組合せの可能性が存在する。

生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーを含むナノ粒子は、
ｉ）親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーまたは
ｉｉ）親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルまたは
ｉｉｉ）親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーまたは
ｉｖ）親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステル、親水性ポリマー、および親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステル
であり得る。

生体吸収性ポリエステルと親水性ポリマーの比
アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドと生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーの量は、約１：１００重量％または５：７５重量％、好ましくは約２５：７５重量％である。

平均粒度
ナノ粒子は、約５０〜９００ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、好ましくは約２００〜３００ｎｍ、最も好ましくは約２２０〜２８０ｎｍの範囲の平均粒度（Ｚ−Ａｖｅ）を有し得る。ナノ粒子は通常、球形である。

粒度分布
ナノ粒子の粒度分布（ＰＤＩ）は、０．５以下、０．０５〜０．３、０．０８〜０．２、０．０９〜０．１９の範囲であり得る。ナノ粒子は通常、球形である。
ＭａｌｖｅｒｎによるＰｄＩの定義（ＩＳＯ １３３２１：１９９６ ｎｏｒｍを参照）は、相関関数：Ｌｎ（Ｃ（Τ））＝ａ＋ｂ^＊Τ＋ｃ^＊Τ²(ＰｄＩ＝２ｃ／ｂ²の場合、三次フィット)を満たすように行われるキュムラント分析に基づく。

ゼータ電位
当該ナノ粒子のゼータ電位（ＺＰ）は一般に、プラスまたは少なくとも中性、好ましくは約０〜５０、好ましくは約１〜４０、最も好ましくは５〜３０ｍＶである。平均粒度（Ｚ−Ａｖｅ）、粒度分布（ＰＤＩ）およびゼータ電位（ＺＰ）は、スモルコフスキー近似を用い、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ、レーザー：λ＝５３２ｎｍ）で測定され得る。

当該ナノ粒子は、生体吸収性ポリエステルがポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ブロック−コポリマー、乳酸−グリコール酸−カプロラクトンターポリマー、乳酸−カプロラクトンコポリマー、ポリジオキサノンまたは乳酸−炭酸トリメチレンコポリマーまたは該ポリマーの任意のブレンドであることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含むことを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー中のＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が７０：３０〜３０：７０、好ましくは６０：４０〜４０：６０、最も好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、親水性ポリマー部分を含まないまたはポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルが０．１〜０．５、好ましくは０．１〜０．３または０．３５〜０．５ｄＬ／ｇの固有粘度ＩＶを有することを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、親水性ポリマーまたは親水性ポリマー部分はポリエチレングリコールであることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルが、ブロック構造ＡＢ、ＢＡまたはＡＢＡを有するポリ（乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ブロックコポリマーを含み、Ａがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）であり、Ｂがポリ（エチレングリコール）であり、ポリ（エチレングリコール）ブロックが約０．１〜２５、好ましくは１０〜２０重量％のブロックコポリマーを含むことを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマー部分が、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が６０：４０〜４０：６０、好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーと、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が６０：４０〜４０：６０、好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ＡＢブロックコポリマー（ここで、Ａはポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）であり、Ｂはポリ（エチレングリコール）であり、ポリ（エチレングリコール）ブロックは約１０〜２０重量％のブロック−コポリマーを含む）の混合物に含まれることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーの重量とポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ＡＢブロックコポリマーの重量の比が６０：４０〜９９．９：０．１、好ましくは８０：２０〜９９．８：０．２、最も好ましくは９５：５〜９９．５：０．５であることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、少なくとも２個のシステイン残基がヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列中に存在することを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列が１４〜３０、好ましくは１８〜２６、最も好ましくは２０〜２４アミノ酸長を有することを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、生物活性成分が含まれることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、生物活性成分が鎮痛薬、抗生剤または抗感染薬、抗体、抗癲癇薬、植物由来抗原、抗リウマチ薬、β遮断薬、ベンズイミダゾール誘導体、β遮断薬、心血管薬、化学療法薬、ＣＮＳ薬、ジギタリス配糖体、胃腸薬、例えば、プロトンポンプ阻害剤、酵素、ホルモン、液体もしくは固体天然抽出物、無機栄養素、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ホルモン、タンパク質、ペプチド、タンパク質、微量元素、泌尿器薬、ビタミンおよびワクチンからなる群からまたはそれらの任意の混合物から選択されることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、診断マーカーを含むことを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、生体吸収性ポリエステルがＰＬＧＡ、すなわち、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）であることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー中のＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が７０：３０〜３０：７０、好ましくは６０：４０〜４０：６０、最も好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、生体吸収性ポリエステルが０．１〜０．５、好ましくは０．１〜０．３または０．３〜０．５ｄＬ／ｇの固有粘度ＩＶを有することを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルがポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸コポリマー、乳酸−グリコール酸−カプロラクトンターポリマー、乳酸−カプロラクトンコポリマー、ポリジオキサノンまたは乳酸−炭酸トリメチレンコポリマーまたは該ポリマーの任意のブレンドであることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、生体吸収性ポリエステルが、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーと、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が６０：４０〜４０：６０、好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ＡＢブロックコポリマー（ここで、Ａはポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）であり、Ｂはポリ（エチレングリコール）であり、ポリ（エチレングリコール）ブロックは約１０〜２０重量％のブロック−コポリマーを含む）の混合物であることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーとポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ＡＢブロックコポリマーの重量比が６０：４０〜９９：１、好ましくは８０：９８〜９８：２、最も好ましくは８５：１５〜９５：５であることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、少なくとも２個のシステイン残基がヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列中に存在することを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列が１４〜３０、好ましくは１８〜２６、最も好ましくは２０〜２４アミノ酸長を有することを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、生物活性成分が含まれることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、生物活性成分がＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とし得る。

当該ナノ粒子は、診断マーカーが含まれることを特徴とし得る。

開示されるナノ粒子は、エマルション技術、例えば、エマルション溶媒蒸発または抽出または沈澱によって調製され得る。開示されるナノ粒子は、沈澱技術によって調製され得る。二重エマルションは、好ましくは水相に生物活性成分または診断マーカーを、油相に生体吸収性ポリエステルを含む油中水滴で作製されてよい。安定剤を含み得る水の第２の余分な相を用いて、水中油中水滴を作出されてもよい。その後、ナノ粒子コアを、コアの表面に吸着するＣ１６−アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドでコーティングされてもよい。

開示されるナノ粒子は、コア内またはコア上に薬学上許容される賦形剤をさらに含んでもよい。例えば、当該ナノ粒子は、内部リン酸カルシウム構造を有してもよい。このようなナノ粒子構造は、ＷＯ２０１５／１８１１３８Ａ１から既知である。コア内の他の賦形剤は、ポリ−Ｌ−リシンまたはポリエチレンイミンであり得る。

Ａ５４９（ヒト肺癌）細胞を用いた相対蛍光
５０重量％のＣ_１６−アセチル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドおよび蛍光マーカーとしてのＬｕｍｏｇｅｎ Ｆ３０５を含む開示されるナノ粒子は、フローサイトメトリーにおいて、Ｃ_１６−アセチル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドの代わりにＣ２−アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドを含む匹敵するナノ粒子の相対蛍光の５倍以上または１０倍以上であるＡ５４９ヒト肺癌細胞１００個当たりの相対蛍光を示す。

５０重量％のＣ_１６−アセチル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドおよび蛍光マーカーとしてのＬｕｍｏｇｅｎ Ｆ３０５を含む、生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーを含む開示されるナノ粒子は、フローサイトメトリーにおいて、同じ生体吸収性ポリエステルを含むが親水性ポリマーを含まない匹敵するナノ粒子の相対蛍光の３倍以上である、Ａ５４９ヒト肺癌細胞１００個当たりの相対蛍光を示す。

相対蛍光は

として計算され得る。

好適な測定および計算手順は次の通りであり得る：非染色陰性対照のＡ５４９生細胞集団にゲートを設定し、Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｆ３０５ Ｒｅｄ陰性細胞とした。ヒストグラムは、全ての測定サンプルについて、ｘ軸を相対蛍光、y軸を生細胞数として設定した。ｘ軸の中央値は生細胞集団の蛍光強度、従って、ナノ粒子の結合および細胞取り込みの量を表す。細胞数の違いのために、相対蛍光は１００細胞当たりで計算した。

生体吸収性ポリエステル
当該ナノ粒子は、生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーを含むコアを含む。親水性ポリマーは、ポリマーの親水性部分として生体吸収性ポリエステルに共有結合されてもよいし、または別のポリマーとして存在してもよい。よって、生体吸収性ポリエステルは、親水性ポリマー部分を含むまたは含まない生体吸収性ポリエステルであり得る。親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルは、生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーとしてまたは親水性ポリマーを含む生体吸収性ポリエステルとして理解される。

生体吸収性ポリエステルは通常、疎水性ポリマーである。本発明の意味において生体吸収性ポリエステルは好ましくは、乳酸ポリマーまたは広義には乳酸系ポリマー、例えば、ラクチド（Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、ＤＬ−ラクチド、メソラクチド）、グリコリド、εカプロラクトン、ジオキサノン、炭酸トリメチレン、δ−バレロラクトン、γ−ブチロラクトンおよび類似の重合性複素環に基づくホモポリマーまたはコポリマーである。これらのポリマーは、例えば、エチレングリコールなどのポリマー鎖内の異なるモノマーモジュールの１つまたは複数から構成され得る。生体吸収性ポリエステルは、生体吸収性外科用インプラントの製造のため、およびまた非経口放出系の製剤のための医薬担体として広く使用される原料である。

生体吸収性ポリエステルは、好ましくは、乳酸ポリマー、あるいはａ）〜ｌ）
ａ）ＤおよびＬ−ラクチド、
ｂ）Ｌラクチドおよびグリコリド、
ｃ）Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリド、
ｄ）Ｌ−ラクチドおよびε−カプロラクトン、
ｅ）Ｌ−ラクチドおよびジオキサノン、
ｆ）Ｌ−ラクチドおよび炭酸トリメチレン、
ｇ）Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、メソ−ラクチドもしくはＤ，Ｌ−ラクチド、
ｈ）Ｌ−ラクチド、
ｉ）ＤＬ−ラクチド、
ｊ）統計的に分布したＬ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、メソ−ラクチドもしくはＤＬ−ラクチドおよびεカプロラクトンのモノマー単位
ｋ）統計的に分布したＬ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、メソ−ラクチドもしくはＤＬ−ラクチドおよびジオキサノンのモノマー単位、
ｌ）統計的に分布したＬ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、メソ−ラクチドもしくはＤＬ−ラクチドおよび炭酸トリメチレンのモノマー単位
からなる群から選択されるモノマー成分またはモノマー成分の混合物から合成されるコポリマーから選択される。

親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸コポリマー、乳酸−グリコール酸−カプロラクトンポリマー、乳酸−カプロラクトンコポリマー、ポリ−ジオキサノンまたは乳酸−炭酸トリメチレンコポリマーまたは該ポリマーの任意のブレンドであり得る。

好ましくは、親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルは、好ましくは、０．１〜２．０、０．１２〜１．２、０．１４〜１．０、０．１６〜０．４４、０．１６〜０．２４［ｄＬ／ｇ］の固有粘度ＩＶを有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーであり得る（固有粘度ＩＶは、ウベローデ型サイズ０ｃガラスキャピラリー粘度計で、２５℃にてＣＨＣｌ_３中０．１％ｗ／ｖで測定され得る）。

親水性ポリマー部分を含まない好適な生体吸収性ポリエステルは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー中のＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が８０：２０〜２０：８０、７０：３０〜３０：７０、６０：４０〜４０：６０ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー（ＰＬＧＡ）であり得る。固有粘度（ＩＶ）は、０．１〜０．５または０．１２〜０．４５［ｄＬ／ｇ］の範囲であり得る（固有粘度は、ウベローデ型サイズ０ｃガラスキャピラリー粘度計で、２５℃にてＣＨＣｌ_３中０．１％ｗ／ｖで測定され得る）。

親水性ポリマー部分を含まない好適な生体吸収性ポリエステルは、０．１６〜０．４４または０．１６〜０．２４［ｄＬ／ｇ］の固有粘度ＩＶを有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド／５０：５０コポリマーであるＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ ５０３またはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ ５０３ Ｈである。

親水性ポリマー部分を含まない別の好適な生体吸収性ポリエステルは、０．１６〜０．４４または０．１６〜０．２４［ｄＬ／ｇ］の固有粘度ＩＶを有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド／５０：５０（ｍｏｌ％））コポリマーであるＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ ５０２またはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ ５０２ Ｈである。

親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルは、ブロック構造ＡＢ、ＢＡまたはＡＢＡ（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＰＬＧＡまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）を有するポリ（乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ブロックコポリマー）であり得、Ａはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）であり、Ｂはポリ（エチレングリコール）であり、ポリ（エチレングリコール）ブロックは、約０．１〜４０、０．１〜２５、０．５〜４、好ましくは１０〜２０重量％のブロックコポリマーを含む。

約１５重量％のＰＥＧ含量を有する好適な対応する市販のＰＬＧＡ−ＰＥＧ ＡＢ−ブロックコポリマーは、例えば、ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧＰ ｄ ５０１５５またはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ ５０５０ ＤＬＧ ｍＰＥＧ ５０００である。

親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルと親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルの最も好ましい組合せは、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が６０：４０〜４０：６０、好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーと、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が６０：４０〜４０：６０、好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ＡＢ−ブロックコポリマー（ここで、Ａはポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）であり、Ｂはポリ（エチレングリコール）であり、ポリ（エチレングリコール）ブロックは、約１０〜２０重量％のブロックコポリマー（ＰＬＧＡ／ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）を含む）の混合物である。好ましくは、混合物中のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーとポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ＡＢブロックコポリマーの重量比は、６０：４０〜９９：１、好ましくは８０：２０〜９８：２、最も好ましくは８５：１５〜９５：５である。

「生体吸収性ポリエステル」中の「生体吸収性」という用語は、ポリエステル、好ましくは、乳酸系ポリマーが、ヒトの身体または動物の身体に体液と接触して移植または注射された後に緩慢な加水分解反応でオリゴマーへと分解されることを意味する。乳酸またはグリコール酸などの加水分解の最終生成物は二酸化炭素と水に代謝される。「生体吸収性ポリエステル」という用語のよく使用される他の互換的表現は、「吸収性ポリエステル」、「生分解性ポリエステル」または「吸着性ポリエステル」である。

これらの種の生体吸収性ポリエステルまたは生分解性ポリエステルポリマーは一般に、当技術分野で、例えば、ＥＰ１４６８０３５、ＵＳ６７０６８５４、ＷＯ２００７／００９９１９Ａ２、ＥＰ１９０７０２３Ａ、ＥＰ２２６３７０７Ａ、ＥＰ２１４７０３６、ＥＰ０４２７１８５またはＵＳ５６１０２６６から周知である。製造工程によって、これらのポリマーはエステルまたは酸末端基などの異なる末端基を有し得る。

親水性ポリマー
当該ナノ粒子は、生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーを含むコアを含む。親水性ポリマーは、ポリマーの親水性部分としての生体吸収性ポリエステルと共有結合されていてもよいし、または別のポリマーとして存在していてもよい。親水性ポリマーは、２５℃で少なくともｐＨ３〜ｐＨ１０の広いｐＨ範囲で水溶性または水膨潤性であるポリマーと定義することができる。好ましくは、親水性ポリマーは、直鎖ポリマーである。好ましくは、親水性ポリマーは、架橋されていない。

別のポリマーとしてまたは生体吸収性ポリマーの一部としての親水性(hydroplilic)ポリマー部分として存在する当該親水性ポリマーは、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ ３００、ＰＥＧ １０００、ＰＥＧ ２０００、ＰＥＧ ４０００、ＰＥＧ ５０００からＰＥＧ １０．０００またはＰＥＧ ２０．０００までの範囲のタイプのポリエチレングリコールが好適であり得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の別称は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）である。ＰＥＧという用語は、より低分子量、例えば、２０，０００ｇ／ｍｏｌ以下のポリマーに対して用いられる場合が多い。ＰＥＯという用語は、より高分子量、例えば、２０，０００ｇ／ｍｏｌ以上のポリマーに対して用いられる場合が多い。

Ｃ１６−モノアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチド（Ｃ１６−ｈＬＦＦ）
当該ナノ粒子は、生体吸収性ポリエステルと該生体吸収性ポリエステルの一部であるかまたは別のポリマーである親水性ポリマーとを含むコア、および該コア上にアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドを含んでいる。「コア上に」とは、アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドが、それぞれコア上にコーティングされてまたはコアの表面に吸着されて、コアの表面に存在することを意味するものとする。このコア上のアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドのコーティングまたは吸着は好ましくは、非共有結合的相互作用の結果である。

Ｃ_１６−モノアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列または配列番号１の配列と８より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドであり、該ペプチドはそのペプチドのＮ末端（アミノ酸骨格のＮＨ_２基）においてアシル化されているかまたはＣ_１６−モノアシル基（パルミトイル基）で置換されている。一例を挙げれば、配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲの配列の場合、Ｎ末端は、最初のアミノ酸「Ｋ」（リシン）のアミノ酸骨格のＮＨ_２基であり、Ｃ末端は、最後のアミノ酸「Ｒ」（アルギニン）のアミノ酸骨格のＣＯＯＨ基である。化学合成のため、Ｃ_１６−モノアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、Ｃ末端アミド（−ＣＯＮＨ_２）の形態で存在し得る。

当該ナノ粒子において、アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドと生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーの量は、約１〜１００重量％または５〜７５重量％、好ましくは約２５〜７５重量％である。

配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列を有するヒトラクトフェリン由来ペプチドまたは配列番号１の配列と８より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドは好ましくは、当技術分野で周知のように単一のアミノ酸から化学合成される。ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアシル化は、対応するＣ_１６−モノアシル分子を有するペプチドの標準的な化学アシル化により行われ得る。標準的な化学アシル化技術は、当業者に周知である。対応するＣ_１６−アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、要求に応じて商業的にも入手可能である。

Ｃ_１６−アシル化に使用されるヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１の配列と８、７、６、５、４、３、２または１より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドである。

Ｃ_１６−モノアシル化されるヒトラクトフェリン由来ペプチドは、１４〜３０、１９〜２８、２０〜２５、２１〜２３または最も好ましくは２２アミノ酸の長さであり得る。好ましくは、ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列は、２個以上または正確には２個のシステイン残基を含み得る。好ましくは、ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列は、内部システイン−システイン架橋（シスチン架橋）を形成し得る少なくとも２個のシステイン残基を含み得る。好ましくは、２個のシステイン残基は酸化形態で存在し、内部システイン架橋を形成する。好ましくは、２個のシステイン残基は、配列番号１のペプチド配列または配列番号１の配列と８より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列の２番と１９番に相当する。

アシル化されるヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１ ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１の配列と８、７、６、５、４、３、２または１より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドであり、好ましくは化学合成により作製または入手可能とされる。この場合、配列番号１ ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１の配列と８、７、６、５、４、３、２または１より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｃ末端アミドとしておよび／またはＮ末端アセチル基を伴って合成され得る。

「アミノ酸位置が異なる」という用語は、配列番号１の配列に比べて、ある位置に存在するアミノ酸が異なるか、またはある位置にアミノ酸が存在しないか、またはその配列内に付加的なアミノ酸が存在するか、またはその配列に付加されるか、またはこれらの任意の組合せであるという意味で理解されるべきである。

最も好ましくは、アシル化ペプチド内に含まれるヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１の配列と８、７、６、５、４、３、２または１より多いアミノ酸位置が異ならず、それにより、少なくとも２個のシステイン残基が存在する。好ましくは、配列番号１の２番と１９番の２個のシステインが存在する。好ましくは、システイン残基は酸化形態で存在し、内部システイン−システイン架橋（シスチン架橋）を形成する。効率的なジスルフィド架橋の形成のためには、これらのペプチドを２ｍＭの濃度で５０ｍＭ ＨｅｐｅｓバッファーｐＨ８に溶解させ、３７℃で２時間酸化すればよい(Wallbrecher et al., Cell Mol Life Sci. 2014 Jul;71(14):2717-29)。

ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、固相ペプチド合成（ＥＭＣ ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）を用い、Ｃ末端アミドとして合成され得る。効率的なジスルフィド架橋の形成のためには、これらのペプチドは、２ｍＭの濃度で５０ｍＭ ＨｅｐｅｓバッファーｐＨ８に溶かし、３７℃で２時間酸化すればよい(Wallbrecher et al., Cell Mol Life Sci. 2014 Jul;71(14):2717-29)。

生物活性成分
当該ナノ粒子は、１または複数の生物活性成分を含み得る。

「生物活性薬」という用語は、本明細書では、何らかの形態の治療効果を提供するまたは何らかの種類の生体応答もしくは活性を惹起するために薬学的または医学的目的で使用される医薬製剤または剤形中または上に含まれる対象化合物を含めて使用される。

本願の意味において生物活性成分は、治療効果を達成するためおよび／または疾患を治癒させるために哺乳動物またはヒトの身体に送達され得る物質である。好ましくは、生物活性成分は、２０℃で水溶性である。

「生物活性成分」という用語は、「医薬有効成分」の意味で使用してよく、これも「有効医薬成分（ＡＰＩ）」と同じ意味を有する。
ヒトラクトフェリン由来ペプチド、特に、開示されるようなＣ１６アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、例えば、ナノ粒子のゼータ電位特性の調和を保つため、または生物活性成分の細胞への送達を補助するための賦形剤と考えることができるか、生物活性成分それ自体とは見なされない。

本発明は、好ましくは、バイオアベイラビリティが改良された生物活性成分または送達診断マーカーの細胞送達が改善されたナノ粒子に有用である。
徐放性コーティング医薬剤形で使用される治療種および化学種の生物活性成分は、例えば、鎮痛薬、抗生剤または抗感染薬、抗体、抗癲癇薬、植物由来抗原、抗リウマチ薬、β遮断薬、ベンズイミダゾール誘導体、β遮断薬、心血管薬、化学療法薬、ＣＮＳ薬、ジギタリス配糖体、胃腸薬、例えば、プロトンポンプ阻害剤、酵素、ホルモン、液体もしくは固体天然抽出物、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチドホルモン、タンパク質、治療用細菌、ペプチド、タンパク質（金属）塩、例えば、アスパラギン酸塩、塩化物、オロト酸塩、泌尿器薬、ビタミン、微量元素、ミネラルまたはワクチンである。

生物活性成分または医薬活性剤の例は、アカンプロセート、エスシン、アミラーゼ、アセチルサリチル酸、アドレナリン、５−アミノサリチル酸、オーレオマイシン、バシトラシン、バルサラジン、βカロテン、ビカルタミドビサコジル、ブロメライン、ブロメライン、ブデソニド、カルシトニン、カルバマシピン(carbamacipine)、カルボプラチン、セファロスポリン、セトロレリクス、クラリスロマイシン、クロロマイセチン、シサプリド、クラドリビン、クロルアゼペート、クロマリン(cromalyn)、１−デアミノシステイン−８−Ｄ−アルギニン−バソプレシン、デラムシクラン(deramciclane)、デチレリックス(detirelix)、デクスランソプラゾール、ジクロフェナク、ジダノシン、ジギトキシンおよび他のジギタリス配糖体、ジヒドロストレプトマイシン、ジメチコン、ジバルプロックス、ドロスピレノン、デュロキセチン、酵素、エリスロマイシン、エソメプラゾール、エストロゲン、エトポシド、エキセナチド、ファモチジン、フッ化物、ニンニク油、グルカゴン、ＧＬＰ−１、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、イブプロフェン、イラプラゾール(ilaprazole)、インスリン、インターフェロン、インターロイキン、イントロンＡ、ケトプロフェン、ランソプラゾール、ロイプロリドアセタトリパーゼ(leuprolidacetat lipase)、リポ酸、リチウム、キニン、メマンチン、メサラジン、メテナミン、ミラメリン(milameline)、ミネラル、ミノプラゾール、ナプロキセン、ナタマイシン、ニトロフラントイン(nitrofurantion)、ノボビオシン、オルサラジン、オメプラゾール、オロト酸塩、パンクレアチン、パントプラゾール、副甲状腺ホルモン、パロキセチン、ペニシリン、ペルプラゾール、ピンドロール、ポリミキシン、カリウム、プラバスタチン、プレドニゾン、プレグルメタシンプロガビド(preglumetacin progabide)、プロソマトスタチン、プロテアーゼ、キナプリル、ラベプラゾール、ラニチジン、ラノラジン、レボキセチン、ルトシド(rutosid）、ソマトスタチンストレプトマイシン、スブチリン、スルファサラジン、スルファニラミド、タムスロシン、テナトプラゾール(tenatoprazole)、トリプシン(thrypsine)、バルプロ酸、バソプレシン、ビタミン、亜鉛（それらの塩、誘導体、多形体、同形体、またはそれらの任意の種類の混合物または組合せを含む）であり得る。

生物活性成分は、ヒトラクトフェリン由来ペプチドとは異なる「小分子」またはペプチドであり得る。好適なペプチドの例としては、例えば、ヒト成長ホルモンなどのペプチドホルモンである。生物活性成分は、タンパク質であり得る。好適なタンパク質の例は、例えば、抗体、インターロイキン、インターフェロンまたはタンパク質系ワクチンである。

生物活性成分は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸であり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）であり得る。

医薬有効成分は、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）であり得る。

「ｓｉＲＮＡ」という用語は当業者に周知である。典型的なｓｉＲＮＡは、一本鎖が３’末端でヌクレオチド２個が重複し得る約１９〜２３塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡと定義することができる。ｓｉＲＮＡは、生細胞においてウイルスからそれらの複製の際に生じる細胞ｍＲＮＡまたはＲＮＡなどの大きな二本鎖ＲＮＡに由来する切断産物である。これらの種のＲＮＡは、例えば、ＩＩＩ型ＲＮアーゼである酵素「Ｄｉｃｅｒ」によって切断されてｓｉＲＮＡとなり得る。ｓｉＲＮＡは、転写後遺伝子サイレンシングプロセスに重要な役割を果たす。例えば６０塩基対以上のより長いｓｉＲＮＡｒも、発現ベクターの手段によって合成することができる。よって、ｓｉＲＮＡは、特定の治療効果を達成するため、および／または特定の疾患を治癒させるために有効成分として使用されることに高い関心寄せられる。

生物有効成分または医薬有効成分のさらなる例は以下の通りである。
医薬有効物質は、ＡＣＥ阻害剤、アドレナリン作動薬、副腎皮質ステロイド、座瘡治療薬、アルドースレダクターゼ阻害剤、アルドステロン拮抗剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、α１拮抗剤、アルコール濫用のための治療薬、アミノ酸、殺アメーバ剤、同化作用薬、中枢神経興奮剤、麻酔薬添加、麻酔薬（非吸入）、麻酔薬（局所）、鎮痛薬、アンドロゲン、狭心症治療薬、拮抗剤、抗アレルギー薬、ＰＤＥ阻害剤などの抗アレルギー薬、喘息治療のための抗アレルギー薬、さらなる抗アレルギー薬（例えば、ロイコトリエン拮抗剤、抗貧血薬、抗アンドロゲン作用薬、抗不安薬、抗関節炎薬、抗不整脈薬、抗アテローム性動脈硬化症薬、抗生剤、抗コリン作動薬、抗痙攣薬、抗鬱薬、抗糖尿病薬、止瀉薬、抗利尿薬、解毒薬、制吐薬、抗癲癇薬、抗線維素溶解薬、抗癲癇薬、駆虫薬、抗ヒスタミン薬、抗低血圧薬、抗高血圧薬、抗高血圧薬、抗低血圧薬、抗凝固薬、抗真菌薬、抗エストロゲン作用薬、抗エストロゲン作用薬（非ステロイド系）、抗パーキンソン病薬、抗炎症薬、抗増殖性有効成分、抗原虫薬有効成分、抗リウマチ薬、抗住血吸虫薬、鎮痙薬、抗血栓薬、鎮咳薬、食欲抑制剤、動脈硬化症治療薬、静菌剤、β遮断薬、β受容体遮断薬、気管支拡張薬、炭酸脱水酵素阻害剤、化学療法薬、胆汁分泌促進薬、コリン作動薬、コリン作動性作用薬、コリンエステラーゼ阻害剤、潰瘍性大腸炎の治療のための薬剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤 利尿剤、外部寄生虫撲滅薬、催吐薬、酵素、酵素阻害剤、酵素阻害剤、嘔吐に対抗するための有効成分、線維素溶解薬、靜真菌薬、痛風治療薬、緑内障治療薬、グルココルチコイド、グルココルチコステロイド、止血薬、強心配糖体、ヒスタミンＨ２拮抗剤、ホルモンおよびそれらの阻害剤、免疫治療薬、強心薬、コクシジウム抑制薬、緩下薬、脂質降下薬、胃腸治療薬、マラリア治療薬、片頭痛治療薬、殺微生物薬、クローン病、転移阻害剤、片頭痛治療薬、ミネラル調製物、運動性増強有効成分、筋弛緩薬、神経抑制薬、エストロゲン処置のための有効成分、骨粗鬆症、耳鼻科薬、抗パーキンソン病薬、植物薬、プロトンポンプ阻害剤、プロスタグランジン、良性前立腺肥大を治療するための有効成分、そう痒症を治療するための有効成分、乾癬有効成分、抗精神薬、フリーラジカルスカベンジャー、レニン拮抗剤、甲状腺治療薬、脂漏性湿疹を治療するための有効成分、船酔いに対抗するための有効成分、鎮痙薬、αおよびβ−交感神経作用薬、血小板凝集阻害剤、トランキライザー、潰瘍治療薬、さらなる潰瘍治療薬、尿路結石症の治療のための薬剤、ウイルス増殖抑制剤、ビタミン、サイトカイン、細胞増殖抑制剤との併用療法のための有効成分、細胞増殖抑制剤などの１または複数の有効成分種に属し得る。

好適な有効成分の例は、アカルボース、アセチルサリチル酸、アバカビル、アセクロフェナク、アクラルビシン、アシクロビル、アクチノマイシン、アダリムマブ、アデホビル、アデホビルジピボキシル、アデノシルメチオニン、アドレナリンおよびアドレナリン誘導体、アガルシダーゼα、アガルシダーゼβ、アレムツズマブ、アルモトリプタン、アルファセプト、アロプリノール、アルモトリプタン、アロセトロン、アルプロスタジル、アマンタジン、アンブロキソール、アミスルプリド、アムロジピン、アモキシシリン、５ アミノサリチル酸、アミトリプチリン、アムロジピン、アモキシシリン、アンプレナビル、アナキンラ、アナストロゾール、アンドロゲンおよびアンドロゲン誘導体、アポモルフィン、アリピプラゾール、三酸化ヒ素、アルテメテル、アテノロール、アトルバスタチン、アトシバン、アザチオプリン、アゼライン酸、バルビツール酸誘導体、バルサラジド、バシリキシマブ、ベクラペルミン、ベクロメタゾン、ベミパリン、ベンゾジアゼピン、ベタヒスチン、ベキサロテン、ベザフィブラート、ビカルタミド、ビマトプロスト、ボセンタン、ボツリヌス毒素(botulinus toxim)、ブリモニジン、ブリンゾラミド、ブデソニド、ブジピン、ブフェキサマク、ブメタニド、ブプレノルフィン、ブプロピオン、ブチジン、カルシトニン、カルシウム拮抗剤、カルシウム塩、カンデサルタン、カペシタビン、カプトプリル、カルバマゼピン、カリフェナシン、カルベジロール、キャスポファンギン、セファクロール、セファドロキシル、セファレキシン セファロスポリン、セフジトレン、セフプロジル、セレコキシブ、セペシタビン、セリバスタチン(cerivastatim)、セチリジン、セトロレリクス、セツキシマブ、ケノデオキシコール酸、絨毛性性腺刺激ホルモン、シクロスポリン、シドフォビル、シメチジン、シプロフロキサシン、シスプラチン、クラドリビン、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クリンダマイシン、クロブチノール、クロニジン、クロピドグレル、コデイン、カフェイン、コレスチラミン、クロモグリク酸、コトリモキサゾール、クマリンおよびクマリン誘導体、ダルベポエチン、クリステアミン、システイン、シタラビン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダクリズマブ、ダルホプリスチン、ダナパロイド、ダピプラゾール、ダルベポエチン、デフェプリポン、デシプラミン、デシルジン、デスロアラタジン、デスモプレシン、デソゲストレル、デソニド、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、ジソプロキシル、ジアゼパムおよびジアゼパム誘導体、ジヒドララジン、ジルチアゼム、ジメンヒドリネート、ジメチルスルホキシド、ジメチコン、ジピボキシル、ジピリダモール(dipyridarnoi)、ドラセトロン、ドンペリドンおよびドンペリダン誘導体、ドネペジル(donepzil)、ドーパミン、ドキサゾシン、ドキソルビシン(doxorubizin)、ドキシラミン、ジクロフェナク、ジバルプロエクス、ドロナビノール、ドロスピレノン、ドロトレコギンアルファ、デュタステライド、エバスチン、エコナゾール、エファビレンツ、エレトリパン、エミダスチン、エムトリシタビン、エナラプリル、エンセプル、エンタカポン、エンフルビルチド、エフェドリン、エピネフリン、エプレレノン、エポエチンおよびエポエチン誘導体、エプロサルタン、エプチフィバチド、エルタペネム、エソメプラゾール、エストロゲンおよびエストロゲン誘導体、エタネルセプト、エテンザミド、エチンエストラジオール、エトフェナマート、エトフィブラート、エトフィリン、エトノゲストレル、エトポシド、エキセメスタン、エキセナチド、エキセチミブ、ファムシクロビル、ファモチジン、ファロペナンダロキセート、フェロジピン、フェノフィブラート、フェンタニル、フェンチコナゾール、フェキソフェナジン、フィナステリド、フルコナゾール、フルダラビン、フルナリジン、フルオロウラシル、フルオキセチン、フルルビプロフェン、フルピルチン、フルタミド、フルバスタチン、フォリトロピン、フォミビルセン、フォンダパリヌクス、フォルモテロール、フォスフォミシン、フロバトリプタン、フロセミド、フシジン酸、ガドベン酸塩、ガランタミン、ガロパミル、ガンシクロビル、ガニレリックス、ガチフロキサシン、ゲフィチニブ、ゲムフィブロジル、ゲンタマイシン、ゲピロン、ＧＬＰ−１、プロゲストゲンおよびプロゲストゲン誘導体、イチョウ、グラチラマー、グリベンクラミド、グリピジド、グルカゴン、グルシトールおよびグルシトール誘導体、グルコサミンおよびグルコサミン誘導体、配糖体抗生剤、グルタチオン、グリセロールおよびグリセロール誘導体、視床下部ホルモン、ゴセレリン、グレパフロキサシン、ジャイレース阻害剤、グアネチジン、ジャイレース阻害剤、ヘミン、ハロファントリン、ハロペリドール、経口抗糖尿病薬としての尿素誘導体、ヘパリンおよびヘパリン誘導体、強心配糖体、ヒアルロン酸、ヒドララジン、ヒドロクロロチアジドおよびヒドロクロロチアジド誘導体、ヒドロキシオメプラゾール、ヒドロキシジン、イブリツモマブ、イブプロフェン、イダルビシン、イフリキシマブ、イフォスファミド、イロプロスト、イマチニブ、イミダプリル、イミグルセラーゼ、イミプラミン、イミキモド、イミダプリル、インドメタシン、インドラミン、インフリキシマブ、インスリン、インスリングラルギン、インターフェロン、イルベサルタン、イリノテカン、イソコナゾール、イソプレナリン、イトラコナゾール、イバブラジン、ヨウ素およびヨウ素誘導体、セントジョンズワート、カリウム塩、ケトコナゾール、ケトプロフェン、ケトチフェン、ラシジピン、ランソプラゾール、ラロニダーゼ、ラテノプロスト、レフルノミド、レピルジン、レルカニジピン、レテプリニム(leteprinim)、レトロゾール、レバセチルメタドール、レベチラセタム、レボセチリジン、レボドパ、レボドルプロピシン(levodrpropicin)、レボメタドン、リコフェロン、リネゾリド、リピナビル、リポ酸およびリポ酸誘導体、リシノプリル、リスリド、ロフェプラミン、ロドキサミド、ロメフロキサシン、ロムスチン、ロペラミド、ロピナビル、ロラタジン、ロルノキシカム、ロサルタン、ルメファントリン、ルトロピン、マグネシウム塩、マクロライド抗生剤、マンガフォジピル、マプロチリン、メベンダゾール、メベベリン、メクロジン、メフェナム酸、メフロキン、メロキシカム、メマンチン、メピンドロール、メプロバメート、メロペネム、メサラジン、メスキシミド、メタミゾール、メトホルミン、メタドン、メトトレキサート、５−アミノ−４−オキソペンタン酸メチル、メチルナロキソン、メチルナロキソン、メチルナルトレキソン、メチルフェニデート、メチルプレドニゾロン、メチキセン、メトクロプラミド、メトプロロール、メトロニダゾール、ミアンセリン、ミベフラジル、ミコナゾール、ミフェプリストン、ミグリトール、ミグルスタッド、ミノサイクリン、ミノキシジル、ミソプロストル、マイトマイシン、ミゾラスチン、モダフィニル、モエキシプリル、モンテルカスト、モロクトコグ(moroctocog)、モルフィナン、モルヒネおよびモルヒネ誘導体、モキシフロキサシン、麦角アルカロイド、ナルブフィン、ナロキソン、ナプロキセン、ナラトリプタン、ナルコチン、ナタマイシン、ナテグリニド、ネビボロール、ネファゾドン、ネルフィナビル、ネオスチグミン、ネラメキサン、ネビラピン、ニセルゴリン、ニセタミド、ニフェジピン、ニフルム酸、ニモジピン、ニモラゾール、ニムスチン、ナシリチド、ニソルジピン、ノルフロキサシン、ノバミンスルホン、ノスカピン、ナイスタチン、オフロキサシン、オクトトリド、オランザピン、オルメサルタン、オルサラジン、オセルタミビル、オメプラゾール、オモコナゾール、オンダンセトロン、オルリスタット、オセルタミビル、オキサセプロール、オキサシリン、オキサリプラチン、オキサプロジン、オキシカルバセピン、オキシコドン、オキシコナゾール、オキシメタゾリン、パリビズマブ、パラノセトロン、パントプラゾール、パラセタモール、パレコキシブ、パロキセチン、ペグアスパラガーゼ、ペグインターフェロン、ペグフルグラストリム(pegfilgrastrim)、ペンシクロビル、経口ペニシリン、ペンタゾシン、ペンチフィリン、ペントキシフィリン、ペプチド抗生剤、ペリンドプリル、ペルフェナジン、ペンチジン、植物抽出物、フェナゾン、フェニラミン、フェニル酪酸、フェニトイン、フェノチアジン、フェンセリン、フェニルブタゾン、フェニトイン、ピメクロリムス、ピモジド、ピンドロール、ピオグリタゾン、ピペラジン、ピラセタム、ピレンゼピン、ピリベジル、ピルリンドール、ピロキシカム、プラミペキソール、プラムリンチド、プラバスタチン、プラゾシン、プロカイン、プロマジン、プロピベリン、プロプラノロール、プロピオン酸誘導体、プロピフェナゾン、プロスタグランジン、プロチオナミド、プロキシフィリン、クエチアピン、キナプリル、キナプリラト(quinaprilate)、キヌプリスチン、ラミプリル、ラニチジン、ラベプラゾール、ラロキシフェン、ラノラジン、ラスブリカーゼ、レボキセチン、レパクリニド、レプロテロール、レセルピン、レボフロキサシン、リバビリン、リファンピシン、リルゾール、リメキソロン、リセドロネート、リスペリドン、リトナビル、リツキシマブ、リバスチメン、リサトリプタン、ロフェコキシブ、ロピニロール、ロピバカイン、ロシグリタゾン、ロキサチジン、ロキシスロマイシン、ルスコゲニン、ロスバスタチン、ルトシドおよびルトシド誘導体、サバジラ、サルブタモール、サリチル酸塩、サルメテロール、サペルコナゾール、甲状腺ホルモン、スコポラミン、セレギリン、セルタコナゾール、セルチンドール、セルトラリン、セベラマー、シブトラミン、シルデナフィル、ケイ酸塩、シンバスタチン、シロリムス、シトステロール、ソタロール、スパグルム酸、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、スピラプリル、スピロノラクトン、スタブジン、ストレプトマイシン、スクラルファート、スフェンタニル、スルバクタム、スルホンアミド、スルファサラジン、スルピリド、スルタミシリン、スルチアム、スマトリプタン、塩化スキサメトニウム、タクリン、タクロリムス、タダラフィル、タリノロール(taliolol)、タルサクリジン、タモキシフェン、タソネルミン、タザロテン、テガフール、テガセロッド、テリスロマイシン、テルミサルタン、テモポルフィン、テモゾロミド、テナトプラゾール、テネクテプラーゼ、テニポシド、テノホビル、テノキシカム、テリパラチド、テラゾシン、テルビナフィン、テルブタリン、テルフェナジン、テリパラチド、テルリプレシン、テルタトロール、テストステロンおよびテストステロン誘導体、テトラサイクリン、テトリゾリン、テゾセンタン、テオブロミン、テオフィリン、テオフィリン誘導体、チアマゾール、チオテパ、ｔｈｒ．成長殖因子、チアガビン、チアプリド、チボロン、チクロピジン、チリジン、チモロール、チニダゾール、チオコナゾール、チオグアニン、チオトロピウム、チオキソロン、チラゼタム(tirazetam)、チロプラミド、トロフィバン、チザニジン、トラゾリン、トルブタミド、トルカポン、トルナフタート、トルペリゾン、トルテロジン、トピラメート、トポテカン、トラセミド、トラマドール、トラマゾロリン、トランドラプリル、トラニルシプラミン、トラピジル、トラスツズマブ、トラボプロスト、トラゾドン、トレポスチニル、トリアムシノロンおよびトリアムシノロン誘導体、トリアムテレン、トリフルペリドール、トリフルリジン、トリメタジジン、トリメトプリム、トリミプラミン、トリペレナミン、トリプロリジン、トリフォスファミド(trifosfamide)、トロマンタジン、トロメタモール、トロパルピン(tropalpine)、トロバフロキサシン、トロキセルチン、ツロブテロール、トリプシン、チラミン、チロスリシン、ウラピジル、ウルソデオキシコール酸、テオフィリンウルソデオキシコール酸、バラシクロビル、バルデコキシブ、バルガンシクロビル、バルプロ酸、バルサルタン、バンコマイシン、バルデナフィル、塩酸ベクロニウム、ベンラファキシン、ベラパミル、ベルテポルフィン
、ビダラビン、ビガバトリン、ビロキサジン、ビンブラスチン、ビンカミン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンポセチン、ビキジル、ビタミンＤおよびビタミンＤ誘導体、ボリコナゾール、ワーファリン、ニコチン酸キサンチノール、キシメラガトラン、キシパミド、ザフィルルカスト、ザルシタビン、ザレプロン、ザナミビル、ジドブジン、ジプラシドン、ゾレンドロン酸、ゾルミトリプタン、ゾルピデム、ゾプリコン(zoplicone)、ゾテピンなどである。

有効成分は、所望により、それらの薬学上許容される塩または誘導体の形態で使用することもでき、キラル有効成分の場合には、光学的に活性な異性体およびラセミ化合物またはジアステレオマーの混合物の両方を使用することができる。所望により、本発明の組成物はまた、２種類以上の有効医薬成分を含んでもよい。

診断マーカー
開示されるようなナノ粒子は、診断マーカーを含み得る。診断マーカーは、臨床診断に使用されるような、例えば、フルオレセインアミン（登録商標）、ローダミン（登録商標）−Ｂ−エチレン−ジアミンまたはＬｕｍｏｇｅｎ（登録商標）Ｆ３０５などの蛍光マーカーまたは放射性マーカーであり得る。ナノ粒子へのマーカーの結合は、化学反応による共有結合的結合、またはファンデルワールス力（水素架橋）もしくはイオン相互作用による非共有結合的結合（フルオレセインアミン（登録商標））であり得る。

剤形
１もしくは複数の生物活性成分または１もしくは複数の診断マーカーを含む多数のナノ粒子を含む医薬剤形が開示され、この剤形には、ペレット、錠剤、カプセル剤、スプレー、エアロゾル、散剤、サシェ剤、坐剤または注射溶液もしくは分散液が含まれる。

本願で特許請求される多層形態の薬剤は、主として多粒子剤形として意味をなす。よって、本明細書に記載されるような多数のナノ粒子を含む医薬剤形が開示され、この剤形には、ペレット、錠剤、カプセル剤または注射溶液もしくは分散液を含み得る。

ペレット含有錠剤または圧縮錠という用語は、当業者に周知である。このような錠剤は、例えば５〜２５ｍｍ前後の大きさであり得る。通常、周知の錠剤形態を得るために、規定の複数の小さな有効成分含有ペレットを、結合賦形剤とともに圧縮する。この錠剤形態は、経口摂取し体液と接触した後に崩壊し、ペレットが放出される。圧縮錠は、経口摂取のための単一剤形の利点と用量の精度など複数形態の利点を兼ね備えている。

ミニ錠剤という用語も、当業者に周知である。ミニ錠剤は従来の錠剤より小さく、１〜４ｍｍ前後の大きさであり得る。ミニ錠剤は、ペレットと同様に、多回投与に使用される単一剤形である。同じ大きさであり得るペレットに比べ、ミニ錠剤は通常、より正確かつより均一にコーティング可能なより規則的な表面を有するという利点がある。ミニ錠剤は、ゼラチンカプセルなどのカプセルに封入して提供され得る。このようなカプセルは、経口摂取し胃液または腸液と接触した後に崩壊し、ミニ錠剤が放出される。ミニ錠剤の別の適用は、有効成分用量の個々の精密調整である、この場合、患者は、治癒させるために疾患(decease)の重症度に適合し、また個々の体重にも適合する規定数のミニ錠剤を直接服用することができる。ミニ錠剤は、上述のようなペレット含有圧縮錠とは異なる。

サシェ剤という用語も、当業者に周知である。サシェ剤は、多くの場合、ペレットを含有する液体形態あるいはまたドライペレットまたはドライパウダー形態で有効成分を含有する小さな密封包装を指す。サシェ剤はそれ自体、服用されることを意図していない単なる包装形態である。サシェ剤の内容物は水に溶解し得るかまたは有利な特徴として浸漬されるかもしくはさらなる液体を用いずに直接服用されてよい。後者は、水が利用できない状況で剤形が服用される場合に、患者にとって有利な特徴である。サシェ剤は、錠剤、ミニ錠剤またはカプセル剤の代替的な剤形である。

カプセル剤という用語も、当業者に周知である。カプセル剤は、サシェ剤と同様に、液体を含有するペレットまたはさらにドライペレットまたはドライパウダーのための容器である。しかしながら、サシェ剤とは対照的に、カプセル剤は、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの薬学上許容される賦形剤から構成され、錠剤のように服用されることが意図される。カプセル剤は、経口摂取し胃液または腸液と接触した後に崩壊し、含有されている複数の単位が放出される。医薬目的のカプセルは、様々な標準サイズで市販されている。胃耐性および小腸または結腸での放出制御のために、カプセル剤は、陰イオンセルロースまたは陰イオン（メタ）アクリレートコポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ３０ Ｄ． ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＳまたはＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＦＳポリマータイプ）などの腸溶コーティングとともに提供してもよい。

使用
本願はさらに、ナノ粒子中に含まれる生物活性成分または診断マーカーの経口または非経口送達に好適な医薬組成物を調製する方法におけるナノ粒子の使用を開示する。

本明細書に記載されるような生物活性成分または診断マーカーを含むナノ粒子は、生物活性成分の経口、肺、鼻腔、口腔、膣もしくは非経口送達のための薬剤もしくは薬剤の一部として、または診断マーカーとして使用するために開示される。

項目
本発明は、以下の項目を特徴とする。
項目１：生体吸収性ポリエステルと該生体吸収性ポリエステルの一部であるかまたは別のポリマーである親水性ポリマーとを含むコア、および該コア上にアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドを含み、該アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列または配列番号１の配列と８より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドであり、該ヒトラクトフェリン由来ペプチドのＮ末端がＣ_１６−モノアシル基でアシル化されている、ナノ粒子。

２．該生体吸収性ポリエステルおよび該親水性ポリマーが、
ｉ）親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーまたは
ｉｉ）親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルまたは
ｉｉｉ）親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーまたは
ｉｖ）親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステル、親水性ポリマー、および親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステル
である、項目１に記載のナノ粒子。

３．該生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーに対するアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドの量が約１〜１００重量％または５〜７５重量％、好ましくは約２５〜７５重量％である、項目１または２の記載のナノ粒子。

４．該生体吸収性ポリエステルと親水性ポリマーの重量比が６０：４０〜９９．９：０．１、好ましくは８０：２０〜９９．８：０．２、最も好ましくは９５：５〜９９．５：０．５である、項目(Claims)１〜３の１項または複数項に記載のナノ粒子。

５．平均粒度（Ｚ−Ａｖｅ）が約５０〜９００、好ましくは約１００〜３５０、最も好ましくは約２００〜３００ｎｍの範囲である、項目１〜４の１項または複数項に記載のナノ粒子。

６．粒度分布（ＰＤＩ）が０．３未満、または０．０５〜０．３、０．０８〜０．２または０．０９〜０．１９の範囲である、項目１〜５の１項または複数項に記載のナノ粒子。

７．ナノ粒子のゼータ電位が約０〜５０、好ましくは約１〜４０、最も好ましくは５〜３０ｍＶである、項目１〜６の１項または複数項に記載のナノ粒子。

８．親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルがポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸コポリマー、乳酸−グリコール酸−カプロラクトンターポリマー、乳酸−カプロラクトンコポリマー、ポリジオキサノンまたは乳酸−炭酸トリメチレンコポリマーまたは該ポリマーの任意のブレンドである、項目１〜７の１項または複数項に記載のナノ粒子。

９．親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルがポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含む、項目１〜８の１項または複数項に記載のナノ粒子。

１０．該ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー中のＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が７０：３０〜３０：７０、好ましくは６０：４０〜４０：６０、最も好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌである、項目９に記載のナノ粒子。

１１．親水性ポリマー部分を含まないまたはポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルが０．１〜０．５、好ましくは０．１〜０．３または０．３〜０．５ｄＬ／ｇの固有粘度ＩＶを有する、項目１〜１０の１または複数項に記載のナノ粒子。

１２.該親水性ポリマーまたは該親水性ポリマー部分がポリエチレングリコールである、項目１〜１１の１または複数項に記載のナノ粒子。

１３．親水性ポリマー部分を含む該生体吸収性ポリエステルが、ブロック構造ＡＢ、ＢＡまたはＡＢＡを有するポリ（乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ブロックコポリマーを含み、Ａがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）であり、Ｂがポリ（エチレングリコール）であり、該ポリ（エチレングリコール）ブロックが約０．１〜４０、０．１〜２５または０，２〜４、好ましくは１０〜２０重量％のブロックコポリマーを含む、項目１〜１２の１項または複数項に記載のナノ粒子。

１４．該生体吸収性ポリエステルおよび該親水性ポリマー部分が、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が６０：４０〜４０：６０、好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーと、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が６０：４０〜４０：６０、好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ＡＢブロックコポリマー（ここで、Ａはポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）であり、Ｂはポリ（エチレングリコール）であり、該ポリ（エチレングリコール）ブロックは、約１０〜２０重量％のブロック−コポリマーを含む）の混合物に含まれる、項目１〜１３の１項または複数項に記載のナノ粒子。

１５．該ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーの重量と該ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ＡＢブロックコポリマーの重量の比が６０：４０〜９９．９：０．１、好ましくは８０：２０〜９９．８：０．２、最も好ましくは９５：５〜９９．５：０．５である、項目１４に記載のナノ粒子。

１６．該ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列に少なくとも２個のシステイン残基が存在する、項目１〜１５の１項または複数項に記載のナノ粒子。

１７．該ヒトラクトフェリン由来ペプチドのアミノ酸配列が１４〜３０、好ましくは１８〜２６、最も好ましくは２０〜２４アミノ酸長である、項目１〜１６の１項または複数項に記載のナノ粒子。

１８．生物活性成分が含まれる、項目１〜１７の１項または複数項に記載のナノ粒子。

１９．該生物活性成分が鎮痛薬、抗生剤または抗感染薬、抗体、抗癲癇薬、植物由来抗原、抗リウマチ薬、β遮断薬、ベンズイミダゾール誘導体、β遮断薬、心血管薬、化学療法薬、ＣＮＳ薬、ジギタリス配糖体、胃腸薬、例えば、プロトンポンプ阻害剤、酵素、ホルモン、液体もしくは固体天然抽出物、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ホルモン、タンパク質、ペプチド、タンパク質、泌尿器薬、ワクチン、ビタミン、微量元素、ミネラルからなる群からまたはそれらの任意の混合物から選択される、項目１８に記載のナノ粒子。

２０．診断マーカーを含む、項目１〜１９の１項または複数項に記載のナノ粒子。

２１．生物活性成分の経口、肺、鼻腔、口腔、膣もしくは非経口送達のための薬剤または薬剤の一部として、または診断マーカーとして使用するための、項目１８〜２０の１項または複数項に記載のナノ粒子。

２２．ペレット、錠剤、カプセル剤、スプレー、エアロゾル、散剤、坐剤または注射溶液もしくは分散液を含む、項目１８〜２０の１項または複数項に記載のナノ粒子を多数含む医薬剤形。

材料：

方法：
ペプチド
全てのペプチドは、固相ペプチド合成（ＥＭＣ ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）を用い、Ｃ末端アミドとして合成した。効率的なジスルフィド架橋のために、ｈＬＦＦペプチドを２ｍＭの濃度で５０ｍＭ ＨｅｐｅｓバッファーｐＨ８に溶解させ、３７℃で２時間酸化した(Wallbrecher et al., Cell Mol Life Sci. 2014 Jul;71(14):2717-29)。

実施例１：ＨＬＦＦ−ペプチド沈降試験
ｈＬＦＦ−ペプチドを、１回の凍結融解サイクル（−１８℃で凍結）による沈降に関して試験した。なお、ｈＬＦＦペプチドを２ｍＭの濃度で５０ｍＭ ＨｅｐｅｓバッファーｐＨ８に溶解させた。

フルオレセインアミン−ＰＬＧＡ粒子およびローダミン−Ｂ−エチレンジアミン−ＰＬＧＡ粒子の作製
フルオレセインアミン異性体Ｉ−ＰＬＧＡ（ＦＡ−ＰＬＧＡ）は、Horisawa et al. (Pharm Res. 2002 Feb;19(2):132-9)およびWeiss et al. (J Nanosci Nanotechnol. 2006 Sep-Oct;6(9-10):3048-56)からの方法を用い、ＰＬＧＡ（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ ５０３ Ｈ、Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダルムシュタット、ドイツ）とフルオレセインアミンを結合させることによって作製した。

フルオレセインアミン異性体Ｉ（ＦＡ）はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．（ミルウォーキー、ウィスコンシン州、米国）から入手した。ＰＬＧＡ（３．０７ｇ）およびＦＡ（０．０５８３ｇ）を０．０４０８ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）を含む３０ｍＬのアセトニトリルに完全に溶解させ、室温で２時間インキュベートした。得られたフルオレセインアミン結合ＤＬ−ラクチド／グリコリドコポリマー（ＦＡ−ＰＬＧＡ；ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ ５０３ Ｈ）を蒸留水次いで、ジクロロメタンで洗浄した後、ロータリーエバポレーター（ＲＥＮ−１Ｓ、Ｉｗａｋｉ、大阪、日本）を用いて乾燥させた。

粒子の作製のために、５０ｍｇのＦＡ−ＰＬＧＡを１．５ｍＬの酢酸エチルに溶解させた。（一次）ｗ／ｏエマルジョンをおよそ６Ｗで１分間の音波処理によって調製した。次に、このエマルジョンに２．５ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ ＰＶＡ（Ｍｏｗｉｏｌ ４−８８、Ｋｕｒａｒａｙ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、ハッタースハイム・アム・マイン、ドイツ）溶液を加えた。この混合物に再びおよそ１５Ｗで６０秒間の音波処理を施して二次エマルジョンを得た。このエマルジョンの容量を、ｍｉｌｌｉ−Ｑを加えることによって２０ｍＬに増した。容量増加時に、このエマルジョン滴中の酢酸エチルは、２つの部分的に可溶な溶媒の非混和境界を越え、エマルジョンからＦＡ−ＰＬＧＡナノ粒子が沈降した。

リサミンローダミン−Ｂ−エチレンジアミンは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ダルムシュタット、ドイツ）から入手し、Weiss et al. for Fluorescein amine and PLGA with minor changes (J Nanosci Nanotechnol. 2006 Sep-Oct;6(9-10):3048-56)の方法を用い、ＰＬＧＡ（ＲＥＳＯＭＥＲＶＲＧ ５０３ Ｈ）（Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ダルムシュタット、ドイツ）に共有結合させた。

粒子は、５０ｍｇのローダミン−Ｂ ＰＬＧＡ（ＲｈＢ−ＰＬＧＡ）を１．５ｍＬの酢酸エチルに溶解させることによって作製した。次に、２．５ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ ＰＶＡ溶液を加え、この混合物をおよそ１６Ｗで１分間の音波処理を施した。得られたエマルジョンの容量を、ｍｉｌｌｉ−Ｑを加えることによって２０ｍＬに増した。

Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｆ３０５ Ｒｅｄ標識ＰＬＧＡ粒子およびＰＬＧＡ／ＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子の作製
ＰＬＧＡ（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ ５０２ Ｈ、Ｅｖｏｎｉｋ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｃａｒｅ ＧｍｂＨ、ダルムシュタット、ドイツ）およびＰＬＧＡとＰＥＧ−ＰＬＧＡ（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ ５０５０ ＤＬＧ ｍＰＥＧ ５０００（１５％）、Ｅｖｏｎｉｋ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｃａｒｅ ＧｍｂＨ、ダルムシュタット、ドイツ）の混合物を用いた。この混合物（ＰＬＧＡ／ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）の比は、９０：１０ｗ／ｗである。各製剤において、２０ｍｇを使用した。

ポリマーを、ボルテックスミキサーを用いることにより、Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｒ３０５ Ｒｅｄ（０．０８ｍｇ ｍＬ^−１、２２５０μＬ）を含む酢酸エチル溶液に溶解させた。Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｆ３０５ Ｒｅｄ濃度はポリマー量に依存し、ポリマー量に基づき１％ｌｕｍｏｇｅｎとして使用する。これを有機溶液とした。水溶液１は硝酸カルシウム（６．２５ｍＭ、５５．８５μＬ）およびリン酸水素二ナトリウム（３．７４ｍＭ、５５．８５μＬ）から調製し、ボルテックスミキサー連続混合条件（１分、段階２〜３）下で加えた。この水溶液１とＢＳＡ溶液（２０ｍｇ ｍＬ^−１、２０μＬ）を有機溶液に加えた。

次に、冷却しながらＵｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５を２００００分^−１で４分間使用して第一の油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏ）を作製した。

次に、このＷ／Ｏ−エマルジョンを一定混合条件（ボルテックスミキサー）下で１％ＰＶＡ（９ｍＬ）に滴下した。添加後、エマルジョンを、氷浴中で冷却しながら、Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５にて４分間、１５０００分^−１でさらに乳化した。

次に、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョンの溶媒を、ロータリーエバポレーターにて１３０ｒｐｍで１５分間回転させながら４０℃および２４０ミリバールで、さらに９０分間、ドラフトチャンバー下、室温で、マグネチックスターラーにて３５０ｒｐｍで蒸発させた。その後、ナノ粒子分散液を４℃および１３０００ｘｇで１０分間の遠心分離によって洗浄した。得られたペレットを１０ｍＬのＲＮアーゼフリー水に再懸濁させた。

粒子のｈＬＦＦコーティングおよび凍結乾燥
Ｃ_２−ｈＬＦＦおよびＣ_１６−ｈＬＦＦペプチド（２０ｍｇ ｍＬ^−１）を、混合（ボルテックスミキサー、１分、段階１〜２）下で１．０ｍＬの粒子懸濁液に加え、ヒーティングサーモシェーカーＨＴＭＲ １３３にて１２０分間、２５℃および３００ｒｐｍでインキュベートした。Ｃ_２−ｈＬＦＦまたはＣ_１６−ｈＬＦＦの最終的なコーティングは、生体吸収性ポリエステルの量に対して１０重量％または５０重量％であった。余分なｈＬＦＦを除去するために、この懸濁液を４℃および１３０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを２．５ｍＬのＲＮアーゼフリー水に再懸濁させた。

サンプルを凍結乾燥するために、１５０μＬの５０％トレハロース溶液を３ｍＬの粒子懸濁液に加え、素早く混合し、４ｍＬのガラスバイアルに充填した。これらを液体窒素中で急速凍結させた後、ＣｈｒｉｓｔフリーズドライヤーΕ２−６Ｄ ＡＣを用いて凍結乾燥した。

粒度測定
粒度、粒度分布およびゼータ電位を分析するために、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ、レーザー：λ＝５３２ｎｍ）をスモルコフスキー近似とともに用いた。粒度データは散乱強度分布（ｚ−Ａｖｅ）を表す。

粒度および粒度分布は、ｈＬＦＦコーティングの前後に、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ、レーザー：λ＝５３２ｎｍ）を用いて分析した。

細胞取り込みアッセイ
ＨｅＬａ細胞およびＣａｃｏ−２細胞を、０．４ｍｇ ｍＬ^−１の濃度（ポリマー含量に基づく）のペプチドコーティングローダミン−ＰＬＧＡ粒子とともに３７℃にて２時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡により観察した。

Ａ５４９細胞を０．４６ｍｇ ｍＬ^−１の濃度（ポリマー含量に基づく）のペプチドコーティングＬｕｍｏｇｅｎ−ＰＬＧＡナノ粒子およびＰＬＧＡ／ＰＥＧ−ＰＧＬＡナノ粒子とともに３７℃にて２時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡により観察した。よって、凍結乾燥ナノ粒子をフェノールレット不含のＦＢＳフリーＭＥＭに再懸濁させ、ピルビン酸塩、ＮＥＡＡならびにゲンタマイシンを添加した。無処理の、従って無染色の細胞を陰性対照として使用した。

ＰＢＳで洗浄した後、顕微鏡写真を撮り、フローサイトメトリー分析（サンプル容量２００ｍＬ；流速１００μＬ分^−１；最大イベントカウント：５×１０^４）のために細胞を１ｍＬのＥＤＴＡ／ＰＢＳで解離させ、１，５ｍＬのマイクロ遠沈管に回収した。

顕微鏡写真は、Ｃ_１６−ｈＬＦＦを含むローダミン−ＰＬＧＡ−ナノ粒子は、高い細胞取り込みとＨｅＬａ細胞およびＣａＣＯ−２細胞と凝集がほとんどないことを兼ね備えていることを示した。結果は非コーティングナノ粒子およびＣ_２−ｈＬＦＦナノ粒子に比べて優れていた。

結果：
ペプチド沈降試験
アシル化および二アシル化ヒトラクトフェリンペプチドの溶液を、数回の凍結−融解サイクルで沈降に関して試験した。結果は、他の全ての供試ペプチドとは対照的にアセチル−ｈＬＦＦおよびＣ１６−ｈＬＦＦの溶液だけが沈降しないことを示す。

実施例２
コーティング粒子の粒度分布およびそれらのゼータ電位の変化
表８Ａ〜Ｆ：
表８Ａ、８Ｂ、８Ｃ：アシル化（Ｃ２、Ｃ１６）ヒトラクトフェリンペプチドを含むＦＡ−ＰＬＧＡ粒子（測定は全て２反復）。測定はコーティングの１日後、４日後および８日後に行った。

表８Ｄ、８Ｅ、８Ｆ：アシル化（Ｃ２、Ｃ１６）ヒトラクトフェリンペプチドを含むローダミン−ＰＬＧＡ粒子（測定は全て２反復）。測定はコーティングの１日後、４日後および８日後に行った。

表８Ａ、８Ｄは、粒度Ｚ−Ａｖｅ値をｎｍで示す；
表８Ｂ、８Ｅは、粒度分布（多分散性指数ＰＤＩ）値を示す；
表８Ｃ、８Ｆは、ゼータ電位（ＺＰ）値を示す。

結果：
安定した粒度分布（目標＜４００ｎｍ）、０．３未満のＰＤＩおよびゼータ電位（どの場合にもプラスの値に安定に変化するかどうか）の評価は、Ｃ_１６−ｈＬＦＦペプチドだけが好適な結果に至ったことを示す。ＰＬＧＡ粒子のＣ１６−ｈＬＦＦコーティングは、時間が経ってもプラスのゼータ電位を維持する均一な粒度の小粒子を生じる。

加えて、Ｃ１６−ｈＬＦＦコーティングＰＬＧＡ粒子は、高い細胞取り込みと凝集がほとんどないことを兼ね備え、標準的なアセチル化ｈＬＦＦよりも優れている。

実施例３

結果
さらに、Ｃ_１６−ｈＬＦＦコーティングをＰＥＧ−ＰＬＧＡ粒子で、ＰＬＧＡおよびＣ_２−ｈＬＦＦペプチドと比較して試験した。意外にも、Ｃ_１６−ｈＬＦＦは、Ｃ_２−ｈＬＦＦに比べてＰＥＧ−ＰＬＧＡの官能基化の改善をもたらす。長期間コーティングはやや高いゼータ電位をもたらすにすぎない。

実施例４：

実施例５
Ａ５４９細胞におけるナノ粒子取り込みのフローサイトメトリー結果
非染色陰性対照の生細胞集団にゲートを設定し、Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｆ３０５ Ｒｅｄ陰性細胞とした。ヒストグラムは、全ての測定サンプルについて、ｘ軸を相対蛍光、y軸を生細胞数として設定した。

ｘ軸の中央値は生細胞集団の蛍光強度、従って、ナノ粒子の結合および取り込みの量を表す。

細胞数の違いのために、相対蛍光は１００細胞当たりで計算した。

表に示されるように、Ｃ１６−ｈＬＦＦでのコーティングは、ＰＬＧＡ／ＰＥＧ−ＰＬＧＡポリマーとＰＬＧＡポリマーの両方に関して、最高の相対蛍光値、従って、最良のナノ粒子取り込みをもたらした。さらに、この取り込みは、ｈＬＦＦまたはＣ１６−ｈＬＦＦの量を１０％から５０％に増すことによって改善された。

Claims (15)

1. 生体吸収性ポリエステルと前記生体吸収性ポリエステルの一部であるかまたは別のポリマーである親水性ポリマーとを含むコア、および前記コア上にアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドを含み、前記アシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドは、配列番号１：ＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲのアミノ酸配列または配列番号１の配列と８より多いアミノ酸位置が異ならないアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記ヒトラクトフェリン由来ペプチドのＮ末端がＣ_１６−モノアシル基でアシル化されている、ナノ粒子。
2. 前記生体吸収性ポリエステルおよび前記親水性ポリマーが、
   ｉ）親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーまたは
   ｉｉ）親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルまたは
   ｉｉｉ）親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーまたは
   ｉｖ）親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステル、親水性ポリマー、および親水性ポリマー部分を含む生体吸収性ポリエステル
   である、請求項１に記載のナノ粒子。
3. 前記生体吸収性ポリエステルおよび親水性ポリマーに対するアシル化ヒトラクトフェリン由来ペプチドの量が約１〜１００重量％または５〜７５重量％、好ましくは約２５〜７５重量％である、請求項１または２の記載のナノ粒子。
4. 前記生体吸収性ポリエステルと親水性ポリマーの重量比が６０：４０〜９９．９：０．１、好ましくは８０：２０〜９９．８：０．２、最も好ましくは９５：５〜９９．５：０．５である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
5. 平均粒径（Ｚ−Ａｖｅ）が約５０〜９００、好ましくは約１００〜３５０、最も好ましくは約２００〜３００ｎｍの範囲である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
6. 粒度分布（ＰＤＩ）が０．５以下または約０．０５〜０．３、０．０８〜０．２または０．０９〜０．１９の範囲である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
7. ナノ粒子のゼータ電位が約０〜５０、好ましくは約１〜４０、最も好ましくは５〜３０ｍＶである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
8. 親水性ポリマー部分を含まない生体吸収性ポリエステルがポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸コポリマー、乳酸−グリコール酸−カプロラクトンターポリマー、乳酸−カプロラクトンコポリマー、ポリジオキサノンまたは乳酸−炭酸トリメチレンコポリマーまたは前記ポリマーの任意のブレンドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
9. 前記親水性ポリマーまたは親水性ポリマー部分がポリエチレングリコールである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子。
10. 親水性ポリマー部分を含む前記生体吸収性ポリエステルが、ブロック構造ＡＢ、ＢＡまたはＡＢＡを有するポリ（乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ブロックコポリマーを含み、Ａがポリ（乳酸−コ−グリコール酸）であり、Ｂがポリ（エチレングリコール）であり、前記ポリ（エチレングリコール）ブロックが約０．１〜２５、好ましくは１０〜２０重量％のブロックコポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
11. 前記生体吸収性ポリエステルおよび前記親水性ポリマーが、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が６０：４０〜４０：６０、好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーと、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドの比が６０：４０〜４０：６０、好ましくは５５：４５〜４５：５５ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｏｌであるポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）ＡＢブロックコポリマー（ここで、Ａはポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）であり、Ｂはポリ（エチレングリコール）であり、前記ポリ（エチレングリコール）ブロックは、約１０〜２０重量％のブロック−コポリマーを含む）の混合物に含まれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のナノ粒子。
12. １または複数の生物活性成分が含まれる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子。
13. １または複数の診断マーカーが含まれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のナノ粒子。
14. 生物活性成分の経口、肺、鼻腔、口腔、膣もしくは非経口送達のための薬剤または薬剤の一部としてのまたは診断マーカーとしての使用のための請求項１２または１３に記載のナノ粒子。
15. ペレット、錠剤、カプセル剤、スプレー、エアロゾル、散剤、サシェ剤、坐剤または注射溶液または分散液を含む、請求項１２または１３に記載の多数のナノ粒子を含む医薬投与形。