JP2021511814A - 細胞外小胞を単離するシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

細胞外小胞を単離するシステム及び方法。該方法は、濃縮システムの入力ポートに、血液又は骨髄のうちの１つ以上を充填し、遠心分離デバイスによって、血液又は骨髄のうちの１つ以上を遠心分離して、赤血球、乏血小板血漿、又は多血小板血漿／骨髄濃縮物分画のうちの１つ以上を分離することを含む。該方法はさらに、骨髄／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を、濃縮システムの容器にポンプ注入し、濃縮水性二相溶液を、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に加えることを含む。該方法は、濃縮水性二相溶液と、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離デバイスに戻し、細胞外小胞又は細胞外小胞及び多血小板血漿／骨髄濃縮物分画を単離することも含む。

Description

本開示は、細胞単離方法及びデバイスに関し、特に、骨髄又は血液から細胞外小胞を単離するためのシステム及び方法に関する。

細胞外小胞（エキソソームなど）は、分子の積み荷を他の細胞に効率よく移す細胞によって放出される。細胞外小胞の治療効果は、その積み荷（ｍｉＲＮＡ及びタンパク質など）及び表面分子から生じる。さらに、細胞外小胞は、組織化、細胞調節、及び結合組織と骨の物理的特性の決定に関与する細胞外マトリックスの機能要素になり得る。

多血小板血漿（ＰＲＰ）及び骨髄濃縮物（ＢＭＣ）の注射は臨床応用で使用されており、治癒を促進し、組織の再成長を刺激し、炎症を改善し、無傷の内因性組織を活性化する。細胞外小胞は、血液及び骨髄を含む全ての生体液に見られ、それらが産生する細胞の多くの効果をもたらすことが実証されている。例えば、臍帯又は骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からの細胞外小胞は、人間の皮膚の若返りを刺激したり、移植された脂肪移植片の生着を改善したりすることが実証されている。骨ＭＳＣからの細胞外小胞が同様の軟骨保護及び抗炎症機能を発揮し、変形性関節症の発症からマウスを保護することが実証されており、細胞外小胞がＭＳＣの主な治療効果を再現していることが示唆されている。実際、最近の科学的及び臨床的証拠によると、ＭＳＣは主に細胞内でその治療機能を発揮するのではなく、パラクリン的に発揮する可能性があることが示唆されており、細胞外小胞（エキソソーム及び微小胞など）は、これらのパラクリン効果の主要なメディエータとして認定されている。

密度が低く、サイズが小さいため、細胞外小胞は一般的に、ろ過、超遠心分離、免疫親和性、マイクロフルイディクス、又は高分子析出によって単離される。血液又は骨髄を（赤血球（ＲＢＣ）、乏血小板血漿（ＰＰＰ）、ＢＭＣ又はＰＲＰなどの分画に）分割するために使用されている現在のデバイスは、低速遠心分離を使用しており、細胞外小胞は効果的に分離、あるいは１つのパーティションに濃縮されることはない。したがって、全血又は骨髄を濃縮するデバイスは、治療効果のかなりの部分を生じさせる可能性のある細胞外小胞などの生物学的薬剤を濃縮していない。

本開示の例示的な一態様によれば、細胞外小胞を単離する方法は、血液又は骨髄のうちの１つ以上を濃縮システムの入力ポートに装填することと、濃縮システムの遠心分離デバイスを介して、血液又は骨髄のうちの１つ以上を遠心分離して、赤血球、乏血小板血漿、又は多血小板血漿／骨髄濃縮物分画のうちの１つ以上を分離することとを含む。該方法はさらに、骨髄／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を、濃縮システムの第１の容器にポンプ注入することと、ポリ（エチレングリコール）−デキストラン（ＰＥＧ−ＤＥＸ）溶液のような濃縮水性二相溶液を、骨髄濃縮／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に加えることとを含む。該方法はさらに、濃縮水性二相溶液と、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離デバイスに戻し、細胞外小胞及び多血小板血漿／骨髄濃縮物分画のうちの１つ以上を単離することを含む。該方法はまた、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び単離された細胞外小胞のうちの１つ以上を、注射用シリンジにポンプ注入することも含む。

本開示の別の態様によれば、細胞外小胞を単離する方法は、シリンジ又は容器に、濃縮二相ＰＥＧ−ＤＥＸ水溶液を配置し、乏血小板血漿分画又は骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を、濃縮水性二相溶液に加えることを含む。該方法はさらに、シリンジ又は容器に配置された濃縮水性二相溶液と、乏血小板血漿分画又は骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上とを遠心分離して、細胞外小胞及び骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を単離することを含む。該方法はまた、濃縮水性二相溶液と、乏血小板血漿分画及び骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上との遠心分離から、細胞外小胞及び骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を含むペレットを作成することであって、該ペレットが注射用である、作成することも含む。

本開示のさらに別の例によれば、細胞外小胞を単離するシステムは、血液又は骨髄のうちの１つ以上を受け入れる第１の入力ポートと、入力ポートに結合されて、赤血球、乏血小板血漿、及び／又は骨髄濃縮物／多血小板血漿のうちの１つ以上の分画を分離する遠心分離デバイスとを含む。該システムはさらに、遠心分離デバイスから遠心分離された骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を収集し、遠心分離デバイスに結合された容器と、第１の容器に結合されて、第２の入口ポートに結合されたシリンジを介して水性二相溶液を受け入れる第２の入口ポートとを含む。出口ポートは、遠心分離デバイスに結合され、遠心分離デバイスにおいて単離された細胞外小胞を受け入れる。このように構成されているので、遠心分離デバイスが、血液及び骨髄のうちの１つ以上を、赤血球、乏血小板血漿、及び／又は骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上に分離した後、水性二相溶液は、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿のうちの１つ以上が配置された第１の容器に加えられる。次に、水性二相溶液と、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とが、遠心分離デバイスに戻され、細胞外小胞又は骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上が、注射用に単離される。

さらに例示的な態様のうちのいずれか１つ以上によれば、細胞外小胞を単離するシステム又は本開示のいずれかの方法は、以下の好ましい形態のうちのいずれか１つ以上を含むことができる。

いくつかの態様では、該方法はさらに、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加える前に、水性二相溶液を所定の濃度で予混合することを含む。さらに、該方法は、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えた後に、室温インキュベーションのための時間を与えることを含んでもよい。さらに、該方法は、濃縮水性二相溶液と、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離のために遠心分離デバイスに戻した後、溶液及び乏細胞外小胞血漿を第１の容器にポンプ注入することを含んでもよい。

他の態様によれば、濃縮水性二相溶液と、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離のために前記遠心分離デバイスに戻すことが、乏血小板血漿分画から細胞外小胞を単離して、注射用の細胞外小胞ペレットを作成することを含んでもよい。さらに、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることが、第１の容器における、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上の量に基づいて、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることを含んでもよい。

さらに他の態様では、骨髄／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を、濃縮システムの第１の容器にポンプ注入することが、乏血小板血漿分画のみを前記第１の容器にポンプ注入し、その後骨髄／多血小板血漿分画をシリンジにポンプ注入することを含んでもよい。この例では、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることが、乏血小板血漿のみに濃縮水性二相溶液を加えることを含んでもよい。さらに、濃縮水性二相溶液と、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離のために遠心分離デバイスに戻すことが、濃縮水性二相溶液及び乏血小板血漿分画を、遠心分離のために遠心分離デバイスに戻すことを含んでもよい。さらに、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び細胞外小胞のうちの１つ以上を、注射用シリンジにポンプ注入することが、細胞外小胞を注射用シリンジにポンプ注入することを含んでもよい。

さらに他の態様では、該方法は、注射される水性二相溶液の量を、シリンジにおける単離された骨髄／多血小板血漿分画の量に基づいて決定し、使用される水性二相溶液の濃度を減少させ、骨髄／多血小板血漿分画中の有核細胞に対する水性二相溶液の影響を最小にすることをさらに含んでもよい。さらに、該方法は、細胞外小胞の量を、シリンジにおける単離された骨髄／多血小板血漿分画の量に基づいて決定することを含んでもよい。

他の態様では、該方法は、シリンジ又は容器内に配置する前に、水性二相溶液を所定の濃度で予混合することを含んでもよい。さらに、乏血小板血漿分画又は骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を、濃縮水性二相溶液に加えることが、一例において、約１．５％の濃縮水性二相溶液の希釈標準溶液に希釈されるなど、濃縮水性二相溶液の量が希釈されるように、ある量の乏血小板血漿を加えることを含んでもよい。さらに、該方法は、作成した細胞外小胞を、多血小板血漿、骨髄濃縮物、又は乏血小板血漿のうちの１つ以上を含む生体液と混合することを含んでもよい。

さらに他の態様では、該システムは、第２の入口ポート、したがって第２の容器に結合されたシリンジを含んでもよく、シリンジが、第１の容器内に配置された、骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に加えられる、予混合済みの水性二相溶液を含む。さらに、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画に加えられる水溶液の量は、容器に配置される骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上の出力量に基づいていてもよい。該システムは、出口ポートに結合され、単離された細胞外小胞、又は遠心分離デバイスでの遠心分離後に作成された骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画のうちのいずれか１つ以上を受け入れる単離シリンジをさらに含んでもよい。さらに、容器は第１の容器を含むことができ、システムは、遠心分離デバイスから遠心分離された赤血球分画を収集するための第２の容器をさらに含むことができ、第２の容器は遠心分離デバイスに結合される。

さらなる任意の態様及び特徴が開示されており、それらは、開示の教示と一致して、単独で、又はいずれかの機能的に実行可能な組み合わせで、いずれかの機能的に適切な方法で配置されてもよい。他の態様及び利点は、以下の詳細な説明を検討することにより、明らかになるであろう。

本開示は、添付の図面と併せて以下の説明から、より完全に理解されると考えられる。図面の中には、他の要素をより明確に示すために、選択された要素を省略して簡略化したものもある。いくつかの図面におけるこのような要素の省略は、対応する書面による説明で明示的に述べられている場合を除き、例示的な実施形態のうちのいずれにおいても必ずしも特定の要素の存否を示すものではない。また図面は、必ずしも一定の縮尺ではない。

本開示の一態様による細胞外小胞を単離するシステムの斜視図である。 図１のシステムの一部の別の斜視図である。 図１のシステムの上面図であり、本開示の一態様による、小胞を単離する例示的な方法を示している。 図１のシステムの別の上面図であり、本開示の別の態様による、小胞を単離する別の例示的な方法を示している。 図１のシステムとともに使用されるように適合されたシリンジの斜視図である。 乏血小板血漿がシリンジに加えられた状態の、図４のシリンジの斜視図である。 図１のシステムの遠心分離デバイスでの遠心分離後に作成された細胞外小胞ペレットを有する、図４のシリンジの斜視図である。 図１のシステムとともに使用されるように適合された別のシリンジの斜視図であり、シリンジは別の例示的な細胞外小胞ペレットを含む。 図１のシステムとともに使用されるように適合されたシリンジの斜視図であり、シリンジは、別の例示的な細胞外小胞ペレットと、骨髄濃縮物分画又は多血小板血漿分画のうちの１つ以上を含む。 図１のシステムに結合されるように適合された容器の斜視図である。 １０分間の遠心分離プロセス後の図９の容器の斜視図であり、容器は細胞外小胞ペレットを有する。 図１のシステムに結合されるように適合された容器の斜視図である。 図９の容器の斜視図であり、乏血小板血漿は残留細胞を完全に除去するために事前回転されている。 ２０倍の倍率で再懸濁した細胞外小胞ペレットを示す位相差写真である。

一般に、細胞外小胞を単離するシステム及び方法が開示される。システムは、血液又は骨髄のうちの１つ以上を受け入れる第１の入力ポートを含み、遠心分離デバイスは、入力ポートに結合されて、赤血球、乏血小板血漿、及び／又は骨髄濃縮物／多血小板血漿のうちの１つ以上の分画を分離させる。システムはまた、遠心分離デバイスから遠心分離された、骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を収集するための第１の容器も含んでおり、第１の容器は、遠心分離デバイスに結合されている。遠心分離デバイスから遠心分離された赤血球分画を収集するための第２の容器も含まれており、第２の容器は同様に遠心分離デバイスに結合される。第２の入口ポートは、第１の容器に結合され、第２の入口ポートに結合されたシリンジを介して、ポリ（エチレングリコール）−デキストラン（ＰＥＧ−ＤＥＸ）溶液などの濃縮水性二相溶液を受け入れ、出口ポートは、遠心分離デバイスに結合されて、遠心分離デバイスで単離された細胞外小胞を受け入れる。このように構成されているので、遠心分離デバイスが、血液及び骨髄のうちの１つ以上を、赤血球、乏血小板血漿、及び／又は骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上に分離した後、濃縮水性二相溶液は、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿のうちの１つ以上が配置された第１の容器に加えられる。次に、濃縮水性二相溶液と、骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とが、遠心分離デバイスに戻され、細胞外小胞又は骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上が、注射用に単離される。

より具体的には、水性二相溶液を使用して、１０分間の遠心分離プロセスなどの遠心分離プロセスにおいて、細胞外小胞を、乏血小板血漿から単離することができる。乏血小板血漿は、末梢血からのもの、又は骨髄からのものである可能性がある。次に、単離された細胞外小胞は、直接適用することができ、又は多血小板血漿又は骨髄濃縮物に懸濁して適用することができる。この単離プロトコルは、多血小板血漿／骨髄濃縮システムと組み合わせて使用できるので、これらの生物学的治療の治療上の可能性は大きく広がる。

ここで図１を参照すると、濃縮システムなどの細胞外小胞１０を単離するシステムが示されている。濃縮システムは通常、全血又は骨髄を濃縮するために使用される。例えば、骨髄濃縮物分画を生物学的注射に使用することができる。

より具体的には、システム１０は、コンパートメント１１と、コンパートメント１１の一部に隣接又は配置された血液又は骨髄のうちの１つ以上を受け入れるための第１の入力ポート１２とを含む。一例では、第１の入力ポート１２は、図１に示されるように、ハウジング１１の第１の側部１３に配置される。遠心分離デバイス１４は、入力ポート１２に結合され、コンパートメント１１の第２の側部分１５（図３Ａ）に隣接して配置される。遠心分離デバイス１４は、例えば、第１の入力ポート１２を介して遠心分離デバイス１４に移動させられる赤血球、乏血小板血漿、及び／又は骨髄濃縮物／多血小板血漿のうちの１つ以上の分画を分離する。さらに、システム１０はまた、遠心分離デバイス１４から遠心分離された骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を収集するための第１の容器１６を含む。第１の容器１６は、遠心分離デバイス１４に結合され、コンパートメント１１の第１の側部１３に隣接して配置される。第１の容器１６と同様に、第２の容器１８もまた、遠心分離デバイス１４に結合され、コンパートメント１１の第１の側部１３に隣接して配置される。第２の容器１８は、例えば、遠心分離デバイス１４から遠心分離された赤血球分画を収集する。

第２の入口ポート２０は、第１の容器１６に結合され、以下でさらに説明されるように、ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液などの濃縮水性二相溶液を受け入れる。一例において、図２に示されるように、シリンジ２２は、第２の入口ポート２０に結合され、第１の容器１６内に配置された乏血小板血漿及び／又は骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上に加えられる濃縮水性二相溶液を含む。

水性二相溶液には、遠心分離中に微小胞の分離と分割を可能にするいずれかの溶液が含まれる。より一般的には、水性（又は水系）溶液は、極性であり、非極性有機溶媒（クロロホルム、トルエン、ヘキサンなど）と非混和性であり、例えば、二相系を形成する。異なる相の形成は、２つの成分のｐＨ、温度、及びイオン強度の影響を受け、存在するポリマーの量が、これらの要因によって決定される一定の限界濃度を超えると、分離が生じる。一例において、そして上記のように、水性二相溶液は、濃縮ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を含む。この例では、「上相」は、より疎水性の高いポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって形成され、これは、より親水性が高く、高密度のデキストラン溶液からなる「下相」よりも密度が低い。

図１を再び参照すると、出口ポート２４は、コンパートメント１１の上部２５（図３Ａ）に配置され、遠心分離デバイス１４に結合されている。一例では、隔離シリンジ２６が出口ポート２４に結合される。単離シリンジ２６は、後述する遠心分離プロセスの１つに従って、少なくとも遠心分離デバイス１４によって分離された細胞外小胞、及び／又は遠心分離デバイスでの遠心分離後に作成された骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を受け入れる。

このように構成されているため、血液又は骨髄のうちの１つ以上を入力ポート１２に充填すると、遠心分離デバイス１４は、血液を赤血球に、骨髄を乏血小板血漿及び／又は骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上に分離する。乏血小板血漿又は骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上が、第１の容器１６にポンプ注入され、赤血球が、第２の容器１８に移動、例えばポンプ注入される。以下でさらに説明するように、第１の容器１６に配置された骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び／又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液が加えられる。その後、水性二相溶液と、骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とが、遠心分離デバイス１４に戻され、細胞外小胞又は骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上が、注射用に単離される。一般に、そして一例において、以下でもさらに説明するように、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画に加えられる水性二相溶液の量は、第１の容器１６に配置される骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上の出力量に基づいている。

ここで図３Ａを参照すると、図１及び２のシステム１０の上面図が示されており、本開示の一態様による、小胞を単離する例示的な方法１００を示している。より具体的には、細胞外小胞を単離する方法１００は、例えば図３Ａの点１に示されるように、血液又は骨髄のうちの１つ以上を濃縮システム１０の入力ポート１２に充填することを含む。次に、方法１００は、点２で示すように、濃縮システム１０の遠心分離デバイス１４によって、血液又は骨髄のうちの１つ以上を遠心分離して、赤血球、乏血小板血漿、又は多血小板血漿／骨髄濃縮物分画のうちの１つ以上を分離することを含む。より具体的には、例えば、図３Ａに示されるように、血液又は骨髄のうちの１つ以上が、管１７を介して、入力ポート１２から遠心分離デバイス１４に引き込まれる。管１７が示されているが、当業者は、他の機構及び／又はプロセスが、血液及び／又は骨髄のうちの１つ以上を遠心分離デバイス１４に移動させるために代替的及び／又は追加的に使用されてもよく、さらに本開示の範囲内に収まることを理解するであろう。

加えて、方法１００は、図３Ａの点３で示すように、遠心分離デバイス１４内での遠心分離後に作成された骨髄／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を、濃縮システム１０の第１の容器１６にポンプ注入することをさらに含む。同様に、該方法は、例えば、点４で示すように、赤血球分画を濃縮システム１０の第２の容器１８にポンプ注入することをさらに含んでもよい。

次に、方法１００は、点５で示すように、第１の容器１６に配置された骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることを含む。該方法はさらに、点６に示すように、濃縮水性二相溶液と、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離デバイス１４に戻し、細胞外小胞及び多血小板血漿／骨髄濃縮物分画のうちの１つ以上を単離することを含む。一例では、方法１００は、例えば図３Ａにおいて、点７で示すように、水性二相溶液及び乏細胞外小胞血漿（ＥＰＰ）を、第１の容器１６にポンプで戻すことをさらに含んでもよい。次に、方法１００は、点８に示すように、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び単離された細胞外小胞のうちの１つ以上を、注射用シリンジ２６にポンプ注入することを含む。

ここで図３Ｂを参照すると、図１のシステム１０の上面図が示されており、本開示の別の態様による、小胞を単離する例示的な方法２００を示している。一般に、及び図３Ａに関連して上記の方法１００の代替として、注射される水性二相溶液の量を最小限に抑えるため、細胞外小胞の単離の前に、骨髄濃縮物又は多血小板血漿濃縮物のうちの１つ以上を単離してもよい。有利にも、この例では、細胞外小胞の量を決定することができ、水性二相溶液の濃度が低下し、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画中の細胞に対する水性二相溶液の効果が、最小化される。

より具体的には、本開示のシステム１０を使用して小胞を単離する別の方法２００を以下に説明する。上記の方法１００と同様に、方法２００は、図３Ａの部分１に示されるように、濃縮システム１０の入力ポート１２に、血液又は骨髄のうちの１つ以上を装填することを含む。次に、方法２００は、部分２で示すように、濃縮システム１０の遠心分離デバイス１４を介して、血液又は骨髄のうちの１つ以上を遠心分離して、赤血球、乏血小板血漿、又は多血小板血漿／骨髄濃縮物分画のうちの１つ以上を、１回目の遠心分離のために分離することを含む。次に、方法１００とは異なり、方法２００は、図３Ａの部分３に示すように、骨髄／多血小板血漿分画のみを、コンパートメント１１の上部２５に隣接して配置された単離シリンジ２６などのシリンジにポンプ注入することを含む。当業者は、１回目の遠心分離後に作成された骨髄／多血小板血漿分画のみを、例えば、単離シリンジ２６とは異なる別のシリンジ又は容器にポンプ注入してもよく、それでも本開示の範囲内に収まることを理解するであろう。さらに、方法２００は、次に、部分４に示されているように、乏血小板血漿分画のみを、濃縮システム１０の第１の容器１６にポンプ注入することを含む。いくつかの例では、方法２００は、部分５に示されるように、赤血球分画を、第２の容器１８にポンプ注入することをさらに含んでもよい。

さらに図３Ｂを参照すると、方法２００は、例えば、部分６に示されるように、第１の容器１６内に配置された乏血小板血漿分画に濃縮水性二相溶液を加え、次いで、部分７に示すように、濃縮水性二相溶液及び乏血小板血漿を遠心分離デバイス１４に戻し、細胞外小胞のうちの１つ以上を単離することも含む。一例では、以下にさらに説明するように、２回目の遠心分離のために、濃縮水性二相溶液及び乏血小板血漿分画を遠心分離デバイス１４に戻すことは、乏血小板血漿分画から細胞外小胞を単離し、注射用の細胞外小胞ペレットを作成することを含む。

次に、方法２００は（方法１００と同様に）、部分８に示すように、濃縮水性二相溶液と、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離のために遠心分離デバイスに戻した後、水性二相溶液及び乏細胞外小胞血漿を第１の容器１６にポンプ注入することを含む。

さらに、方法２００はまた、図３Ｂの部分９に示すように、単離された細胞外小胞のみを、注射のために、コンパートメント１１の上部２５に隣接して配置されたシリンジ２６にポンプ注入することも含む。より具体的には、濃縮水性二相溶液の遠心分離により作成した細胞外小胞と、例えば２回目の遠心分離のために遠心分離デバイス１４に戻された乏血小板血漿分画とを、１回目の遠心分離で骨髄濃縮液／多血小板血漿分画で満たされたシリンジにポンプ注入してもよい。一例では、このシリンジは、図３Ａ及び３Ｂに示すように、コンパートメント１１の上部２５に隣接して配置された単離シリンジ２６であってもよい。したがって、この例では、濃縮水性二相溶液は細胞外小胞と一緒に加えられるだけなので、単離シリンジ２６内の残留濃縮水性二相は大幅に減少される。

例として、１ｍＬの細胞外小胞を、単離シリンジ３６内に既に配置されている、（例えば、注射される）４ｍＬの骨髄濃縮物に加えて、ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液などの残留濃縮水性二相溶液を５分の１に減少させることができる。そのため、（図３Ｂの部分６のように）ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液などの濃縮水性二相溶液を乏血小板血漿のみに加え、次に、例えば乏血小板血漿細胞外小胞などの、２回目の遠心分離で作成した細胞外小胞を、（図３Ｂの部分３のように）シリンジ２６にポンプ注入した骨髄濃縮物／多血小板血漿分画に加えることにより、残留濃縮水性二相溶液が減少する。さらに、細胞外小胞、例えば乏血小板血漿細胞外小胞が、単離シリンジ２６に加えられるので、追加の細胞外小胞の量を容易に決定することができる。

別の例では、方法２００は、シリンジ２６内の単離した骨髄／多血小板血漿分画の量に基づいて、注射するＰＥＧ−ＤＥＸ溶液の量を決定することをさらに含んでもよい。その結果、使用される水性二相溶液の濃度が低減され、例えば、骨髄／多血小板血漿分画中の有核細胞に対する水性二相溶液の影響が最小限に抑えられる。

ここで図４〜６を参照すると、上記のシステム１０とともに使用されるように適合されたシリンジの斜視図が示されている。より具体的には、そして一例では、図４〜６のシリンジは、図２に示すシリンジ２２であってもよく、これは上述のように、第１の容器１６に結合されている。この例では、図４に示されているように、濃縮水性二相溶液が最初にシリンジ２２に配置される。さらに、方法２００に関連して上述したように、例えば、乏血小板血漿（ＰＰＰ）は、水性二相溶液を有するシリンジ２２に加えられ、図５に示すように、ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液などの水性二相溶液と、ＰＰＰ溶液３２とがシリンジ２２内で作成される。より具体的には、そして一例では、最終的な１．５％のＰＥＧ−ＤＥＸ濃度を得るために、１５％のＰＥＧ−ＤＥＸの１ｍＬがシリンジ２２内にある場合、総量が１０ｍＬとなるよう、９ｍＬの乏血小板血漿がシリンジ２２に引き込まれる。より一般的には、シリンジ２２に引き込まれるなどして、ある量の乏血小板血漿を濃縮水性二相溶液に加えて、濃縮水性二相ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液の量を、約１．５％の濃縮水性二相溶液の希釈標準溶液にまで希釈することができる。さらに、そして別の例では、以下でさらに説明するように、濃縮水性二相溶液が乏血小板血漿に加えられ、約５分の室温インキュベーションが与えられる。

図６に示すように、シリンジ２２内の水性二相溶液とＰＰＰ溶液３２とが、遠心分離デバイスで遠心分離され、例えば、注射用、又は多血小板血漿又は骨髄濃縮物のうちの１つ以上に加えられる細胞外小胞のペレット３４が作成される。より具体的には、そして一例において、水性二相及びＰＰＰ溶液を有するシリンジ２２を、２００×ｇで約１０分間シリンジ２２を保持することができる遠心分離デバイス内で遠心分離にかけるので、細胞外小胞が単離され、細胞外小胞ペレット３４が作成される。

より一般的には、例えば、図４〜６に示されるシステム１０及びシリンジ２２を使用して細胞外小胞を単離する別の方法３００は、シリンジ２２などのシリンジ又はシステム１０の容器のうちの１つ以上に濃縮水性二相溶液を配置することを含む。方法３００は、例えば、図５のシリンジ２２に示すように、乏血小板血漿分画又は骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を、濃縮水性二相溶液に加えることをさらに含む。方法３００はまた、シリンジ２２内に配置された溶液と、乏血小板血漿分画又は骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上とを遠心分離して、細胞外小胞を単離することを含む。図６に示されるように、方法３００はさらに、単離された細胞外小胞を有するペレット３４を作成することを含み、ペレット３４は注射用である。別の例では、細胞外小胞ペレット３４は、例えば、骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上に加えられてもよい。

図７及び８に示されているように、代替のシリンジ４０は、図７に示すように、細胞外小胞ペレットのみ、又は図８に示すように、細胞外小胞ペレットと骨髄濃縮物又は多血小板血漿との組み合わせのうちの一方又は両方を収容するように設計されてもよい。より具体的には、図７を参照すると、シリンジ４０は、遠位端４４及び近位端４６を有する本体４２を含み得る。円筒状突起などの突起４８は、本体４２の遠位端４４から延在し、上述の遠心分離プロセスによって形成された細胞外小胞ペレット５０を含む。この例では、図４〜６のシリンジ２２とは異なり、図７及び８のシリンジ４０は、例えば図４〜６に示すように、本体４２内ではなく、シリンジ４０の本体４２の外側に配置された突起４８内で、細胞外小胞ペレット５０を受け入れる。同様に、図８は、細胞外小胞と、骨髄濃縮物又は多血小板血漿のうちの１つ以上とを両方含むペレット５２を有するシリンジ４０の突起４８を示す。細胞外ペレット５０、５２を、本体４２ではなく、シリンジ４０の突起４８内に配置することにより、例えば、シリンジ４０から排出される、乏細胞外小胞血漿及びＰＥＧ−ＤＥＸなどの水性二相溶液の量を最小にしつつ、細胞外小胞濃縮物をシリンジ４０からより容易に排出することができる。

上記の方法１００、２００、３００の全ては、濃縮性二相溶液を、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に加える前に、所定の濃度でＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を予混合することをさらに含んでもよい。一例では、所定の濃度でＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を予混合することは、１０倍濃度でＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を予混合することを含む。別の例では、所定の濃度でＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を予混合することは、５倍濃度でＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を予混合することを含む。さらに別の例では、所定の濃度でＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を予混合することは、８倍濃度でＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を予混合することを含む。他の例では、そして当業者が理解するように、所定の濃度は、３倍濃度〜１５倍濃度の範囲内のいずれかの濃度であってもよく、それでもなお本開示の範囲内に収まる。いくつかの例では、ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を予混合することは、迅速な細胞外小胞の単離にとって不可欠である。さらに、方法１００、２００、３００は、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えた後に、室温インキュベーションのための時間を与えることを含んでもよい。一例では、室温インキュベーションのための時間は約５分である。当業者は、時間が、５分よりも長いか、あるいは３分、４分、又は４分半のようにわずかに短くてもよく、それでもなお本開示の範囲内に収まることを理解するであろう。

さらに、方法１００、２００、３００のそれぞれにおいて、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることは、第１の容器１６内の、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上の量に基づいて、骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることを含んでもよい。

ここで図９〜１２を参照すると、本開示のシステム１０及び方法１００、２００、及び３００の様々な実験結果が示されている。より具体的には、図９は、遠心分離前の容器６０内の水性二相溶液と乏血小板血漿の組み合わせの斜視図である。そこに示されているように、遠心分離の前に、細胞外小胞は単離されていなかった。この例では、水性二相溶液はＰＥＧ−ＤＥＸである。さらに、乏血小板血漿に添加した場合の１．５％のＰＥＧ−ＤＥＸ濃度により、例えば、シリンジを保持できる遠心分離デバイスなどの卓上型遠心分離機を用いて、細胞外小胞を単離させることができた。さらに、分子量４５０ｋ〜６５０ｋのデキストランを使用し、遠心分離デバイスを１０００×ｇで１０分間運転した。理解されるように、ＰＥＧ−ＤＥＸ濃度の様々な他のパーセンテージ量、またより一般的には、水性二相溶液の第１の相を代わりに使用してもよく、それでも本開示の範囲内に収まる。同様に、デキストランの様々な他の重量、またより一般的には、水性二相溶液の第２の相も使用することができ、それでも本開示の範囲内に収まる。別の言い方をすると、ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液の様々な組み合わせを、乏血小板血漿に加えて、遠心分離中に細胞外小胞を単離することができる。より一般的には、水性二相溶液の第１の相と水性二相溶液の第２の相の様々な組み合わせを使用して、遠心分離中に細胞外小胞を単離することができ、それでもなお本開示の範囲内に収まる。

ここで図１０を参照すると、例えば１０分間の遠心分離プロセス後の、図９の容器６０の斜視図が示されている。上記のプロセスと前述の実験パラメータにより、細胞外小胞が単離され、細胞外小胞ペレット６２が作成された。

ここで図１１を参照すると、容器６０は、ＰＥＧ−ＤＥＸ濃度とｄｄＨ₂Ｏの組み合わせがその中に配置されている状態で示されている。遠心分離が行われ、細胞外小胞ペレットは作成されなかった。

ここで図１２を参照すると、遠心分離後の容器６０が示されている。この実験例では、遠心分離の前に、ＰＥＧ−ＤＥＸ濃縮溶液と乏血小板血漿の組み合わせを、再び容器６０内に配置した。乏血小板血漿をＰＥＧ−ＤＥＸ濃縮溶液とともに配置する前に、例えば、乏血小板血漿を１９００×ｇで３０分間事前回転させて、残留細胞を完全に除去した。遠心分離後も、図１２に示すように、細胞外小胞ペレット６４が作成され、回収された。

ここで図１３を参照すると、例示的な細胞外小胞ペレットの位相差写真が示されている。具体的には、細胞外小胞ペレットは、２０倍の倍率で再懸濁される。この図では細胞は示されていないが、細胞外小胞クラスタ６６が見られる。

前述を考慮し、当業者は、上述の本開示のシステム１０及び方法１００、２００、３００の以下の利点を理解するであろう。例えば、システム１０及び方法１００、２００、３００は、迅速に臨床の場で、細胞外小胞を乏血小板血漿から単離することができる。細胞外小胞を迅速に単離することにより、実用的、治療的、及び規制上の理由で重要な、血液又は骨髄のうちの１つ以上の収集を含む同じ臨床手順内で、細胞外小胞を適用することができる。例えば、血液又は骨髄から単離された細胞外小胞は、生物学的注射の有効性を高めるために、又は単独の生物学的治療法として使用することができる。

さらに、システム１０は、通常は使用されないが、従来のシステムにおいて量では遠心分離プロセスの出力のかなりの部分となる、乏血小板血漿分画からの細胞外小胞の収集を可能にする。さらに、例えば、システム１０のシリンジ２２、２６、４０は、シリンジ２２、２６、４０が遠心分離デバイス１４に装填されるように設計されていてもよいので、乏血小板血漿及びＰＥＧ−ＤＥＸ溶液などの水性二相溶液、又は細胞外小胞濃縮物を遠心分離管に移送する必要がない。このように構成すると、汚染のリスクが最小限に抑えられ、エラーやサンプルの損失のリスクが軽減され、手順が迅速になる。

さらに、システム１０は、上記でさらに説明したように、生物学的サンプルが２回の遠心分離サイクルにかけられても、１台の遠心分離デバイス１４のみが使用されるように設計されている。その結果、さらなる遠心分離デバイスとさらなる遠心分離シリンジとが不要になる。さらに、汚染のリスクがさらに軽減され、単離手順が迅速になる。

以下の追加の検討事項が、上記の考察に適用される。本明細書を通して、複数の事例は、単一の事例として記載された構成要素、動作、又は構造を実施し得る。１つ以上の方法の個々の動作が別個の動作として例示及び記載されたが、個々の動作のうちの１つ以上が同時に実行されてもよく、例示された順序で動作が実行される必要はない。例示的な構成内で別個の構成要素として提示された構造及び機能は、組み合わされた構造又は構成要素として実施されてもよい。同様に、単一構成要素として提示された構造及び機能は、別個の構成要素として実施されてもよい。これらの及び他の変形、修正、追加、及び改善は、本明細書の主題の範囲内にある。

いくつかの実施は、派生語とともに「結合された」という表現を用いて記載されてもよい。例えば、いくつかの実施は、２つ以上の要素が物理的又は電気的に直接接触していることを示すのに、「結合された」という用語を用いて記載されてもよい。しかしながら、「結合された」という語はまた、２つ以上の要素が互いに直接には接触してはいないが、それでも互いに協働又は相互作用していることも意味し得る。上記実施は、この文脈において限定されるものではない。

本明細書に使用される際、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ、ｈａｖｉｎｇ）」という用語、又はそれらの任意の他の変形は、非排他的な包含を網羅することを意図する。例えば、要素のリストを含むプロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されていないか、又はかかるプロセス、方法、物品若しくは装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、正反対に明示的に述べられない限り、「又は」は、排他的な又はではなく、包括的な又はであることを意味する。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真（又は存在）かつＢが偽（又は存在しない）、Ａが偽（又は存在しない）かつＢが真（又は存在する）、ならびにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）のうちのいずれか１つによって満たされる。

加えて、「ａ」又は「ａｎ」の使用は、本明細書の実施の要素及び構成要素を説明するために用いられる。これは単に便宜上、かつ本発明の一般的な観念を与えるために行われているにすぎない。この記述は、１つ又は少なくとも１つを含むと読み取るべきであり、別の意味であることが明らかでない限り、単数形は複数形も含む。

さらに、特定の実施及び応用が図示され、説明されているが、開示された実施は、本明細書に開示された正確な構造及び構成要素に限定されないことを理解されたい。当業者には明らかとなる、様々な修正、変更、及び変形が、添付の特許請求の範囲で定義される趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書で開示される方法及び装置の構成、動作、及び詳細において行われ得る。

Claims (25)

1. 細胞外小胞を単離する方法であって、
   血液又は骨髄のうちの１つ以上を、濃縮システムの入力ポートに装填することと、
   前記濃縮システムの遠心分離デバイスによって、前記血液又は骨髄のうちの１つ以上を遠心分離して、赤血球、乏血小板血漿、又は多血小板血漿／骨髄濃縮物分画のうちの１つ以上を分離することと、
   骨髄／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を、前記濃縮システムの第１の容器にポンプ注入することと、
   前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることと、
   前記濃縮水性二相溶液と、前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、前記遠心分離デバイスに戻し、細胞外小胞及び多血小板血漿／骨髄濃縮物分画のうちの１つ以上を単離することと、
   前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び単離された細胞外小胞のうちの１つ以上を、注射用シリンジにポンプ注入することと、を含む、方法。
2. 前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることが、前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液を加えることを含み、前記方法が、前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、前記濃縮水性二相溶液を加える前に、前記濃縮水性二相溶液を所定の濃度で予混合することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、前記濃縮水性二相溶液を加えた後に、室温インキュベーションのための時間を与えることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記濃縮水性二相溶液と、前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離のために前記遠心分離デバイスに戻した後、前記濃縮水性二相溶液と、乏細胞外小胞血漿とを、前記第１の容器にポンプ注入することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記濃縮水性二相溶液と、前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離のために前記遠心分離デバイスに戻すことが、前記乏血小板血漿分画から細胞外小胞を単離して、注射用の細胞外小胞ペレットを作成することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることが、前記第１の容器内の、前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上の量に基づいて、前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、前記濃縮水性二相溶液を加えることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 骨髄／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を、前記濃縮システムの第１の容器にポンプ注入することが、前記乏血小板血漿分画のみを前記第１の容器にポンプ注入し、その後前記骨髄／多血小板血漿分画をシリンジにポンプ注入することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に、濃縮水性二相溶液を加えることが、前記乏血小板血漿分画のみに濃縮水性二相溶液を加えることを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記濃縮水性二相溶液と、前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離のために前記遠心分離デバイスに戻すことが、前記濃縮水性二相溶液及び前記乏血小板血漿分画を、遠心分離のために前記遠心分離デバイスに戻すことと、前記濃縮水性二相溶液及び前記乏血小板血漿分画を、遠心分離することとを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画及び細胞外小胞のうちの１つ以上を、前記注射用シリンジにポンプ注入することが、前記細胞外小胞を前記注射用シリンジにポンプ注入することを含み、前記シリンジが、１回目の遠心分離の後の、前記血液濃縮物／多血小板血漿を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記乏血小板血漿のみに前記濃縮水性二相溶液を加え、次いで前記細胞外小胞を前記注射用シリンジにポンプ注入することと、前記シリンジが前記血液濃縮物／多血小板血漿を含むことにより、前記シリンジにおける残留濃縮水性二相溶液が希釈される、請求項１０に記載の方法。
12. 注射する水性二相溶液の量を、前記シリンジ内の単離した前記骨髄／多血小板血漿分画の前記量に基づいて決定し、使用する水性二相溶液の濃度を減少させ、前記骨髄／多血小板血漿分画中の有核細胞に対する前記水性二相溶液の影響を最小にすることをさらに含む、請求項７記載の方法。
13. 前記細胞外小胞の量を、前記シリンジ内の単離した前記骨髄／多血小板血漿分画の前記量に基づいて決定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 細胞外小胞を単離する方法であって、
    濃縮水性二相溶液を、シリンジ又は容器内に配置することと、
    乏血小板血漿分画又は骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を、前記濃縮水性二相溶液に加えることと、
    前記シリンジ又は前記容器内に配置された前記濃縮水性二相溶液と、前記乏血小板血漿分画又は前記骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上とを、遠心分離し、細胞外小胞及び骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を単離することと、
    前記濃縮水性二相溶液と、前記乏血小板血漿分画及び前記骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上との遠心分離から、細胞外小胞及び骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を含むペレットを作成することであって、前記ペレットが注射用である、作成することと、を含む、方法。
15. 濃縮水性二相溶液を、シリンジ又は容器内に配置することが、濃縮ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液をシリンジ又は容器内に配置することを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 乏血小板血漿分画又は骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を、前記濃縮水性二相溶液に加えることが、前記濃縮水性二相溶液の前記量が希釈されるように、ある量の乏血小板血漿を加えることを含む、請求項１４又は１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 乏血小板血漿分画又は骨髄／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を、前記濃縮水性二相溶液に加えた後に、室温インキュベーションのための時間を与えることをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 作成された前記細胞外小胞を、多血小板血漿、骨髄濃縮物、又は乏血小板血漿のうちの１つ以上を含む生体液と混合することをさらに含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
19. 細胞外小胞を単離するシステムであって、
    血液又は骨髄のうちの１つ以上を受け入れる第１の入力ポートと、
    赤血球、乏血小板血漿、及び／又は骨髄濃縮物／多血小板血漿のうちの１つ以上の分画を分離するために、前記第１の入力ポートに結合された遠心分離デバイスと、
    前記遠心分離デバイスから遠心分離された、骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上を収集するための容器であって、前記容器が、前記遠心分離デバイスに結合されている、容器と、
    前記第１の容器に結合され、第２の入力ポートに結合されたシリンジを用いて水性二相溶液を受け入れる第２の入力ポートと、を含み、
    前記遠心分離デバイスが、前記血液と前記骨髄のうちの１つ以上を、赤血球、乏血小板血漿、及び／又は骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上に分離した後、前記水性二相溶液が、前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上が配置された前記第１の容器に加えられ、前記水性二相溶液、及び前記骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの前記１つ以上が、遠心分離のために前記遠心分離デバイスに戻され、細胞外小胞又は前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上が注射用に単離される、システム。
20. 前記第２の入口ポート、したがって前記第１の容器に結合されたシリンジをさらに含み、前記シリンジが、前記第１の容器内に配置された、前記骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上に加えられる、予混合済みの水性二相溶液を含む、請求項１９に記載のシステム。
21. 前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画に加えられる前記水性二相溶液の量が、前記容器内に配置される前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画又は乏血小板血漿分画のうちの１つ以上の出力量に基づく、請求項１９又は２０のいずれか一項に記載のシステム。
22. 単離した前記細胞外小胞、又は遠心分離後に作成した前記骨髄濃縮物分画／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を受け入れる単離シリンジをさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のシステム。
23. 前記容器が第１の容器であり、前記システムが、前記遠心分離デバイスから遠心分離された赤血球分画を収集するための第２の容器をさらに含んでおり、前記第２の容器が前記遠心分離デバイスに結合される、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のシステム。
24. 前記遠心分離デバイスに結合された出口ポートと、単離した細胞外小胞、又は遠心分離後に作成した前記骨髄濃縮物／多血小板血漿分画のうちの１つ以上を受け入れるために前記出口ポートに結合された単離シリンジとをさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のシステム。
25. 前記水性二相溶液が、濃縮ＰＥＧ−ＤＥＸ溶液である、請求項１９〜２４のいずれか一項記載のシステム。

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