JP2021511794A - 核酸増幅のための方法 - Google Patents
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
Description
本出願は、2018年1月29日に出願された米国仮特許出願第62/623,471号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的且つ個別に示されるかのように、同じ程度まで引用により本明細書に組み込まれる。
図3Aおよび図3Bで示されるように、ジデオキシヌクレオチド(「可逆的」)のみを用いた増幅のマッピング率とマッピング品質のスコアはそれぞれ、15.0+/−2.2および0.8+/−0.08であり、エキソヌクレアーゼ耐性のα−チオジデオキシヌクレオチドターミネーター(「不可逆的」)の取り込みはそれぞれ、97.9+/−0.62および46.3+/−3.18のマッピング率と品質のスコアを結果としてもたらした。可逆的ddNTP、およびターミネーターの様々な濃度を使用して、実験をさらに実行した(図2A、下)。
一旦シーケンシングデータが獲得されると、各細胞のクロノタイプが確立される。これを達成するために、変異体をコールしてクロノタイプを決定する。PTAを利用することによって、現在使用されるWGA法の間に導入される対立遺伝子欠落(allelic dropout)およびカバレッジのバイアスが制限される。MDAを受けた単一細胞から変異体をコールするためのツールの体系的比較を実施し、最近開発されたツールMonovarは、最も高い感度および特異性を有することが分かった(Zafar et al., Nature Methods, 2016, 13:505−507)。一旦変異コールが行われると、対立遺伝子欠落により一部の変異コールが欠落しているにかかわらず、2つの細胞は同じクロノタイプを有しているかどうかが決定される。これを達成するために、多変量のBernoulli分布の混合モデルを使用してもよい(Gawad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2014, 111(50):17947−52)。細胞が同じクロノタイプを有することが立証された後に、カタログに含める変異体を決定する。以下の基準のいずれかを満たす遺伝子が含まれる:1)大規模な小児の癌ゲノムシーケンシングプロジェクトで識別された既知の癌抑制遺伝子に生じる、突然変異のホットスポットまたは機能喪失型変異体(フレームシフト、ナンセンス、スプライシング)のいずれかで検出された非同義変異体であること;2)再発性の癌サンプル中で繰り返し検出される変異体であること;および、3)ALL患者が6週間の処置を受けるため、残存病変の現在のバルクシーケンシング試験において正の選択を受ける再発性変異体であること。クローンは、これらの基準を満たす少なくとも2つの変異体を有しない場合、カタログに含まれない。処置抵抗あるいは疾患再発に関連したより多くの遺伝子が同定されると、クローンを「救出」し、カタログに含むことができる。クロノタイプが対照と薬剤処置の間の正または負の選択を受けたか否かを決定するために、フィッシャーの正確確率検定を使用して、対照とは有意に異なるクローンを同定する。突然変異の少なくとも2つの一致した組み合わせが特定の薬剤への暴露と同じ相関を有すると示される場合のみ、クローンをカタログに加える。癌遺伝子中の既知の活性化する突然変異あるいは同じ遺伝子中の腫瘍抑制因子中の機能喪失型突然変異は、クローン間で同等であると考えられる。クロノタイプが正確に一致していない場合、共通の突然変異をカタログに入れる。例えば、クロノタイプ1がA+B+Cであり、クロノタイプ2がB+C+Dである場合、B+Cクロノタイプをカタログに入れる。限られた数の同時に生じる突然変異を有する耐性細胞中で繰り返し変異する遺伝子が同定される場合、それらのクローンは崩壊して、機能的に同等なクロノタイプになる可能性がある。
Claims (138)
- 組成物であって、前記組成物は:
少なくとも1つの標的核酸分子およびアンプリコンライブラリを含み、
ここで、
アンプリコンライブラリは、少なくとも1つの標的核酸分子の増幅から得られた複数のポリヌクレオチドを含み、
ポリヌクレオチドの少なくともいくつかは、ターミネーターヌクレオチドを含み、
ポリヌクレオチドの少なくとも5%は、少なくとも1つの標的核酸分子の直接コピーである、
組成物。 - ポリヌクレオチドの少なくとも10%は、少なくとも1つの標的核酸分子の直接コピーである、請求項1に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくとも15%は、少なくとも1つの標的核酸分子の直接コピーである、請求項1または2に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくとも25%は、少なくとも1つの標的核酸分子の直接コピーである、請求項1−3のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくとも50%は、少なくとも1つの標的核酸分子の直接コピーである、請求項1−4のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの5〜50%は、少なくとも1つの標的核酸分子の直接コピーである、請求項1に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの5〜20%は、少なくとも1つの標的核酸分子の直接コピーである、請求項1に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの累積画分の50%以下が、少なくとも1つの標的核酸分子の配列の累積画分の少なくとも80%の配列を含む、請求項1−7のいずれか1つに記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドの累積画分の50%以下が、標的核酸配列の累積画分の少なくとも85%の配列を含む、請求項1−8のいずれか1つに記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドの累積画分の50%以下が、標的核酸配列の累積画分の少なくとも90%の配列を含む、請求項1−9のいずれか1つに記載の組成物。
- アンプリコンライブラリが0.5以下のジニ係数を有する、請求項1−9のいずれか1つに記載の組成物。
- アンプリコンライブラリが0.4以下のジニ係数を有する、請求項1−9のいずれか1つに記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドが約50〜約2000のヌクレオチド長さである、請求項1−12のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドが約400〜約600のヌクレオチド長さである、請求項1−13のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの数は100〜5000である、請求項1−14のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの数は250〜1250である、請求項1−14のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの数は少なくとも100である、請求項1−14のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの数は少なくとも500である、請求項1−14のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの数は少なくとも1000である、請求項1−14のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくともいくつかはバーコードを含む、請求項1−19のいずれか1つに記載の組成物。
- バーコードは細胞バーコードを含む、請求項16に記載の組成物。
- バーコードはサンプルバーコードを含む、請求項16または21に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくともいくつかは固有分子識別子を含む、請求項1−22のいずれか1つに記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドが、ゲノムを少なくとも部分的に表す配列を含む、請求項1−23のいずれか1つに記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドが、少なくとも2つのゲノムを少なくとも部分的に表す配列を含む、請求項1−23のいずれか1つに記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドがcDNAからの配列を含む、請求項1−23のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくとも90%がターミネーターヌクレオチドを含む、請求項1−26のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくとも98%がターミネーターヌクレオチドを含む、請求項1−27のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドが少なくともいくつかのポリヌクレオチドの3’末端に結合している、請求項1−28のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドは、α基への修飾を伴うヌクレオチド、C3スペーサーヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)、逆核酸、2’フルオロヌクレオチド、3’リン酸化ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、およびトランス核酸からなる群から選択される、請求項1−29のいずれか1つに記載の組成物。
- α基修への修飾を伴うヌクレオチドがα−チオジデオキシヌクレオチドである、請求項1−30のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドは、デオキシリボースの3’炭素のr基の修飾を含む、請求項1−31のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドは、3’ブロックされた可逆的ターミネーターを含有するヌクレオチド、3’ブロックされてない可逆的ターミネーターを含有するヌクレオチド、ターミネーターを含有する2’修飾のデオキシリボヌクレオチド、ターミネーターを含有する、窒素塩基への修飾を有するデオキシリボヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1−32のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド、逆ジデオキシヌクレオチド、3’ビオチン化ヌクレオチド、3’アミノヌクレオチド、3’−リン酸化ヌクレオチド、3’−O−メチルヌクレオチド、3’C3スペーサーヌクレオチドを含む3’炭素スペーサーヌクレオチド、3’C18ヌクレオチド、3’ヘキサンジオールスペーサーヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1−32のいずれか1つに記載の組成物。
- 組成物は液滴中に含まれている、請求項1−34のいずれか1つに記載の組成物。
- 組成物であって、前記組成物は:
少なくとも1つの標的核酸分子およびアンプリコンライブラリを含み、
ここで、
アンプリコンライブラリは、少なくとも1つの標的核酸分子の増幅から得られた複数のポリヌクレオチドを含み、
ポリヌクレオチドの少なくともいくつかは、ターミネーターヌクレオチドを含み、
ポリヌクレオチドの累積画分の50%以下が、少なくとも1つの標的核酸分子の配列の累積画分の少なくとも80%の配列を含む、
組成物。 - 複数のポリヌクレオチドの累積画分の50%以下が、標的核酸配列の累積画分の少なくとも85%の配列を含む、請求項36に記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドの累積画分の50%以下が、標的核酸配列の累積画分の少なくとも90%の配列を含む、請求項36または37に記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドが約50〜約2000のヌクレオチド長さである、請求項36−38のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドが約400〜約600のヌクレオチド長さである、請求項36−39のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくともいくつかはバーコードを含む、請求項36−40のいずれか1つに記載の組成物。
- バーコードは細胞バーコードを含む、請求項41に記載の組成物。
- バーコードはサンプルバーコードを含む、請求項41または42に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくともいくつかは固有分子識別子を含む、請求項36−43のいずれか1つに記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドが、ゲノムを少なくとも部分的に表す配列を含む、請求項36−44のいずれか1つに記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドが、少なくとも2つのゲノムを少なくとも部分的に表す配列を含む、請求項36−44のいずれか1つに記載の組成物。
- 複数のポリヌクレオチドがcDNAからの配列を含む、請求項36−44のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくとも90%はターミネーターヌクレオチドを含む、請求項36−47のいずれか1つに記載の組成物。
- ポリヌクレオチドの少なくとも98%はターミネーターヌクレオチドを含む、請求項36−48のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドが少なくともいくつかのポリヌクレオチドの3’末端に結合している、請求項36−49のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドは、α基修への修飾を伴うヌクレオチド、C3スペーサーヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)、逆核酸、2’フルオロヌクレオチド、3’リン酸化ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、およびトランス核酸からなる群から選択される、請求項36−50のいずれか1つに記載の組成物。
- α基修への修飾を伴うヌクレオチドは、α−チオジデオキシヌクレオチドである、請求項36−51のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドは、デオキシリボースの3’炭素のr基の修飾を含む、請求項36−52のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドは、3’ブロックされた可逆的ターミネーターを含有するヌクレオチド、可逆的ターミネーターを含有する3’ブロックされてないヌクレオチド、ターミネーターを含有する2’修飾のデオキシリボヌクレオチド、ターミネーターを含有する、窒素塩基への修飾を有するデオキシリボヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項36−53のいずれか1つに記載の組成物。
- ターミネーターヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド、逆ジデオキシヌクレオチド、3’ビオチン化ヌクレオチド、3’アミノヌクレオチド、3’−リン酸化ヌクレオチド、3’−O−メチルヌクレオチド、3’C3スペーサーヌクレオチドを含む3’炭素スペーサーヌクレオチド、3’C18ヌクレオチド、3’ヘキサンジオールスペーサーヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項36−53のいずれか1つに記載の組成物。
- 組成物は液滴中に含まれている、請求項36−54のいずれか1つに記載の組成物。
- 標的核酸分子を増幅する方法であって、前記方法は:
a.標的核酸分子、少なくとも1つの増幅プライマー、少なくとも1つの核酸ポリメラーゼ、およびヌクレオチドの混合物を含むサンプルを接触させる工程であって、ここで、ヌクレオチドの混合物は、ポリメラーゼによる核酸複製を停止する少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドを含む、工程と、
b.複数の停止増幅産物を生成するために標的核酸分子を増幅する工程であって、ここで、複製は鎖置換複製により進行する、工程と、
を含む、方法。 - 増幅は実質的に等温条件下で実施される、請求項37に記載の方法。
- 温度が10°C以下変動する条件下で増幅が実施される、請求項37または58に記載の方法。
- 温度が5°C以下変動する条件下で増幅が実施される、請求項37−59のいずれか1つに記載の方法。
- 核酸ポリメラーゼはDNAポリメラーゼである、請求項37−60のいずれか1つに記載の方法。
- DNAポリメラーゼは鎖置換DNAポリメラーゼである、請求項61に記載の方法。
- 核酸ポリメラーゼは、バクテリオファージphi29(Φ29)ポリメラーゼ、遺伝子改変phi29(Φ29)DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージphiPRD1 DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Bst ラージフラグメントDNAポリメラーゼ、exo(−)Bstポリメラーゼ、exo(−)Bca DNAポリメラーゼ、Bsu DNAポリメラーゼ、VentR DNAポリメラーゼ、VentR(exo−)DNAポリメラーゼ、Deep Vent DNAポリメラーゼ、Deep Vent(exo−)DNAポリメラーゼ、IsoPol DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、Therminator DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T7−シーケナーゼ、あるいはT4 DNAポリメラーゼである、請求項37−62のいずれか1つに記載の方法。
- 核酸ポリメラーゼは3’−>5’エキソヌクレアーゼ活性を含み、および、少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドは、3’−>5’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する、請求項37−63のいずれか1つに記載の方法。
- 核酸ポリメラーゼは3’−>5’エキソヌクレアーゼ活性を含まない、請求項37−63のいずれか1つに記載の方法。
- ポリメラーゼは、Bst DNAポリメラーゼ、exo(−)Bstポリメラーゼ、exo(−)Bca DNAポリメラーゼ、Bsu DNAポリメラーゼ、VentR(exo−)DNAポリメラーゼ、Deep Vent(exo−)DNAポリメラーゼ、クレノウ断片(exo−)DNAポリメラーゼ、あるいはTherminator DNAポリメラーゼである、請求項37−63のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドは、デオキシリボースの3’炭素のr基の修飾を含む、請求項37−66のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドは、可逆的ターミネーターを含有する3’ブロックされたヌクレオチド、可逆的ターミネーターを含有する3’ブロックされてないヌクレオチド、ターミネーターを含有する2’修飾のデオキシリボヌクレオチド、ターミネーターを含有する、窒素塩基への修飾を有するデオキシリボヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項37−67のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド、逆ジデオキシヌクレオチド、3’ビオチン化ヌクレオチド、3’アミノヌクレオチド、3’−リン酸化ヌクレオチド、3’−O−メチルヌクレオチド、3’C3スペーサーヌクレオチドを含む3’炭素スペーサーヌクレオチド、3’C18ヌクレオチド、3’ヘキサンジオールスペーサーヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項37−68のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドは、α基修への修飾を伴うヌクレオチド、C3スペーサーヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)、逆核酸、2’フルオロヌクレオチド、3’リン酸化ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、およびトランス核酸からなる群から選択される、請求項37−69のいずれか1つに記載の方法。
- α基修への修飾を伴うヌクレオチドは、α−チオジデオキシヌクレオチドである、請求項37−70のいずれか1つに記載の方法。
- 増幅プライマーが4〜70のヌクレオチド長さである、請求項37−71のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅プライマーが4〜20のヌクレオチド長さである、請求項37−72のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅プライマーはランダム化された領域を含む、請求項37−73のいずれか1つに記載の方法。
- ランダム化された領域は4〜20のヌクレオチド長さである、請求項74に記載の方法。
- ランダム化された領域は8〜15のヌクレオチド長さである、請求項74または75に記載の方法。
- 増幅産物は、約50〜約2000のヌクレオチド長さである、請求項37−76のいずれか1つに記載の方法。
- 増幅産物は、約200〜約1000のヌクレオチド長さである、請求項37−77のいずれか1つに記載の方法。
- 前記方法は、PCRを使用する追加の増幅工程をさらに含む、請求項37−78のいずれか1つに記載の方法。
- 標的核酸分子を配列決定する方法であって、前記方法は:
a.標的核酸分子、少なくとも1つの増幅プライマー、少なくとも1つの核酸ポリメラーゼ、およびヌクレオチドの混合物を含むサンプルを接触させる工程であって、ここで、ヌクレオチドの混合物は、ポリメラーゼによる核酸複製を停止する少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドを含む、工程と、
b.複数の停止増幅産物を生成するために標的核酸分子を増幅する工程であって、ここで、複製は鎖置換複製により進行する、工程と、
c.停止増幅産物から少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドを除去する工程と;
d.工程(c)で得られた分子をアダプターに連結し、それにより、増幅産物のライブラリを生成する工程と;
e.増幅産物のライブラリを配列決定する工程と、
を含む、方法。 - 末端およびAテーリングを修復する工程をさらに含む、請求項80に記載の方法。
- 標的核酸はDNAである、請求項80または81のいずれか1つに記載の方法。
- DNAはcDNAである、請求項82に記載の方法。
- DNAはゲノムDNAである、請求項82に記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅プライマーは2つ以上のプライマーを含む、請求項80−84のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅プライマーはランダムプライマーである、請求項80−85のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅プライマーはバーコードを含む、請求項80−86のいずれか1つに記載の方法。
- バーコードは細胞バーコードを含む、請求項87に記載の方法。
- バーコードはサンプルバーコードを含む、請求項87または88に記載の方法。
- 前記方法は、PCRを使用する追加の増幅工程をさらに含む、請求項80−89のいずれか1つに記載の方法。
- 増幅プライマーは固有分子識別子(UMI)を含む、請求項80−90のいずれか1つに記載の方法。
- 前記方法は、最初のプライマーアニーリングの前に、標的核酸またはゲノムDNAを変性させる工程をさらに含む、請求項80−91のいずれか1つに記載の方法。
- 変性はアルカリ性条件下で実施され、その後、中和される、請求項92に記載の方法。
- サンプル、増幅プライマー、核酸ポリメラーゼ、およびヌクレオチドの混合物が、マイクロ流体デバイスに含有されている、請求項80−93のいずれか1つに記載の方法。
- サンプル、増幅プライマー、核酸ポリメラーゼ、およびヌクレオチドの混合物が、液滴に含有されている、請求項80−94のいずれか1つに記載の方法。
- サンプルは、組織サンプル、細胞、生体液サンプル、骨髄サンプル、精液サンプル、生検サンプル、癌サンプル、腫瘍サンプル、細胞溶解サンプル、法医学サンプル、考古学サンプル、古生物学サンプル、感染サンプル、生成物サンプル、植物全体、植物部分、細菌叢サンプル、ウイルス調製物、土壌サンプル、海水サンプル、真水サンプル、家庭用あるいは工業用サンプル、およびそれらの組み合わせならびに分離物から選択される、請求項80−95のいずれか1つに記載の方法。
- 生体液は、血液、尿、唾液、リンパ液、脳脊髄液(CSF)、羊水、胸膜液、心膜液、腹水、および眼房水から選択される、請求項96に記載の方法。
- 単一細胞を配列決定する方法であって、前記方法は:
a.単一細胞からの細胞溶解物を提供する工程と;
b.細胞溶解物を、少なくとも1つの増幅プライマー、少なくとも1つの核酸ポリメラーゼ、およびヌクレオチドの混合物と接触させる工程であって、ここで、ヌクレオチドの混合物は、ポリメラーゼによる核酸複製を停止する少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドを含む、工程と、
c.複数の停止増幅産物を生成するために、標的核酸分子を増幅する工程であって、ここで、複製は鎖置換複製により進行する、工程と;
d.停止増幅産物から少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドを除去する工程と;e.工程(d)で得られた分子をアダプターに連結し、それにより、増幅産物のライブラリを生成する工程と;
f.増幅産物のライブラリを配列決定する工程と、
を含む、方法。 - 細胞溶解にはタンパク質分解が伴う、請求項98に記載の方法。
- サンプル、少なくとも1つの増幅プライマー、核酸ポリメラーゼ、およびヌクレオチドの混合物が、マイクロ流体デバイスに含有されている、請求項98または99に記載の方法。
- サンプル、少なくとも1つの増幅プライマー、核酸ポリメラーゼ、およびヌクレオチドの混合物が、液滴に含有されている、請求項98−100のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅プライマーが固体支持体に結合される、請求項98−101のいずれか1つに記載の方法。
- 固体支持体はビーズである、請求項102に記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅プライマーは切断可能なリンカーによって固体支持体に結合される、請求項102または103に記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅プライマーはバーコードを含む、請求項98−104のいずれか1つに記載の方法。
- 前記方法は、増幅前に切断可能なリンカーを切断する工程をさらに含む、請求項104に記載の方法。
- 前記方法は、PCRを使用する追加の増幅工程をさらに含む、請求項98−106のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、および原生動物細胞から選択される、請求項98−107のいずれか1つに記載の方法。
- 動物細胞はヒト細胞である、請求項108に記載の方法。
- 細胞は、着床前胚からの細胞、幹細胞、胎児細胞、腫瘍細胞、疑わしいい癌細胞、癌細胞、遺伝子編集手順を受けた細胞、病原体からの細胞、法医学サンプルから得られた細胞、考古学サンプルから得られた細胞、および古生物学サンプルから得られた細胞から選択される、請求項98−109のいずれか1つに記載の方法。
- 着床前胚細胞が割球である、請求項110に記載の方法。
- 割球は、体外受精によって生成された8つの細胞期の胚から得られる、請求項111に記載の方法。
- 胚細胞中の疾患の素因となる生殖系列変異体あるいは体細胞変異体の存在を決定する工程をさらに含む、請求項110−112のいずれか1つに記載の方法。
- 病原体は、細菌、真菌、あるいは原生動物である、請求項110に記載の方法。
- 病原体から得られる細胞は、患者、細菌叢サンプル、あるいは留置医療機器から採取された流体から得られる、請求項114に記載の方法。
- 病原体の同一性を決定する工程をさらに含む、請求項114または115に記載の方法。
- 処置に対する病原体の耐性の原因となる遺伝子変異体の存在を決定する工程をさらに含む、請求項110−116のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞は、腫瘍細胞、疑わしい癌細胞、あるいは癌細胞である、請求項98−110のいずれか1つに記載の方法。
- 1つ以上の診断変異あるいは予後変異の存在を決定する工程をさらに含む、請求項98−110または118のいずれか1つに記載の方法。
- 処置に対する耐性の原因となる生殖系列変異体あるいは体細胞変異体の存在を決定する工程をさらに含む、請求項98−110、118、または119のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞は遺伝子編集手順を受けた細胞である、請求項98−110のいずれか1つに記載の方法。
- 遺伝子編集プロセスによって引き起こされた計画外の突然変異の存在を決定する工程をさらに含む、請求項121に記載の方法。
- 細胞系統の履歴を決定する工程をさらに含む、請求項98−122のいずれか1つに記載の方法。
- 低頻度の配列変異体を同定するための、請求項37−123のいずれか1つに記載の方法の使用。
- 低頻度の配列変異体が全配列の≧0.01%を構成する、請求項124に記載の使用。
- 低頻度の配列変異体が全配列の≧0.05%を構成する、請求項124に記載の使用。
- 低頻度の配列変異体が全配列の≧0.10%を構成する、請求項124に記載の使用。
- 環境条件の変異原性を決定する方法であって、前記方法は:
a.環境条件に細胞をさらす工程と;
b.集団から単一細胞を単離する工程と;
c.単一細胞からの細胞溶解物を提供する工程と;
d.細胞溶解物を、少なくとも1つの増幅プライマー、少なくとも1つの核酸ポリメラーゼ、およびヌクレオチドの混合物と接触させる工程であって、ここで、ヌクレオチドの混合物は、ポリメラーゼによる核酸複製を停止する少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドを含む、工程と、
e.複数の停止増幅産物を生成するために、標的核酸分子を増幅する工程であって、ここで、複製は鎖置換複製により進行する、工程と;
f.停止増幅産物から少なくとも1つのターミネーターヌクレオチドを除去する工程と;
g.工程(f)で得られた分子をアダプターに連結し、それにより、増幅産物のライブラリを生成する工程と;
h.増幅産物のライブラリを配列決定する工程と、
i.突然変異を同定するために、増幅産物の配列を少なくとも1つの参照配列と比較する工程と、
を含む、方法。 - 単一細胞はヒト細胞である、請求項128に記載の方法。
- 環境条件は化学物質を含む、請求項128または129に記載の方法。
- 環境条件は放射線を含む、請求項128または129に記載の方法。
- 環境条件は紫外線を含む、請求項128または129に記載の方法。
- 単一細胞は、肝臓、皮膚、腎臓、血液、あるいは肺に由来する、請求項128−132のいずれか1つに記載の方法。
- 増幅産物の少なくともいくつかはバーコードを含む、請求項128−133のいずれか1つに記載の方法。
- バーコードは細胞バーコードを含む、請求項134に記載の方法。
- バーコードはサンプルバーコードを含む、請求項134または135に記載の方法。
- 増幅プライマーの少なくともいくつかは固有分子識別子(UMI)を含む、請求項128−136のいずれか1つに記載の方法。
- 前記方法は、PCRを使用する追加の増幅工程をさらに含む、請求項128−137のいずれか1つに記載の方法。
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