JP2021508241A - ムコ多糖症ｉｉｉａ型のための遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、機能的ｈＳＧＳＨをコードする操作された核酸配列、標的細胞におけるｈＳＧＳＨの発現を指示する制御配列、およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が、本明細書において提供される。製剤緩衝液中に本明細書において記載されるｒＡＡＶを含む医薬組成物、およびＭＰＳ ＩＩＩＡと診断されたヒト対象を処置する方法がまた、提供される。
【選択図】図なし

Description

電子形態で提出された事項の参照による取り込み
本出願人は、本明細書により、本明細書と共に電子形態で提出された配列表を参照により取り込む。このファイルを、「１８−８４７６ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名前を付ける。

ムコ多糖症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ ＩＩＩａ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、またはサンフィリポ症候群Ａ型）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパラン硫酸のリソソーム代謝において関与する、酵素Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ（ＳＧＳＨ）の欠乏により引き起こされる常染色体劣性遺伝性障害である。この欠乏は、中枢神経系における非分解性ヘパラン硫酸ならびにガングリオシドＧＭ２およびＧＭ３の細胞内蓄積を導き、神経機能障害および神経炎症を引き起こす。疾患は、３歳ごろの認知の遅延としてまず現れ、異常な活動亢進および攻撃行動が現れる。次に、疾患の進行は、最初の１０年間に運動および神経学的な機能の喪失を導き、年齢中央値１５歳での死亡を伴う。

ＭＰＳ ＩＩＩＡを有する人のための治癒または標準的処置は、現在存在しない。医薬を使用して、症状（例えば、てんかん発作用の抗けいれん剤）を軽減し、クオリティ・オブ・ライフを改善する。造血幹細胞移植は、神経心理学的悪化を有意に改善しないと思われる。ＭＰＳ ＩＩＩにおける欠乏のための組換え酵素が、利用可能であるが、酵素は、中枢神経系に進入することができないので、酵素補充療法（ＥＲＴ）における治験は、進行の改善において好ましくなかった。例えば、Ｇｅｒｍａｉｎｅ Ｌ Ｄｅｆｅｎｄｉ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ、Ｍｅｄｓｃａｐｅ、２０１４年３月２１日を参照。食事に対する変化は、疾患の進行を予防しないが、牛乳、砂糖および乳製品の制限は、過剰な粘液を有する一部の人に役立つ。

当該技術分野において、ＭＰＳ ＩＩＩＡの効率的な処置のための組成物および方法についての続く要求が存在する。

発明の概要
１つの態様において、機能的ヒトＮ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ（ｈＳＧＳＨ）および標的細胞におけるその発現を指示する制御配列をコードする操作された核酸配列を含むベクターが提供される。１つの実施形態において、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１と少なくとも９６％同一である。さらなる実施形態において、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１である。

別の態様において、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、機能的ｈＳＧＳＨをコードする操作された核酸配列、標的細胞におけるｈＳＧＳＨの発現を指示する制御配列、およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が提供される。１つの実施形態において、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１と少なくとも９５％同一である。さらなる実施形態において、ＡＡＶベクターゲノムは、配列番号４の配列（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏ．ＲＢＧ）を含む。いくつかの
実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。１つの実施形態において、ｒＡＡＶ（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏ．ＲＢＧ）は、ＡＡＶ９カプシドおよび配列番号４の配列を含むベクターゲノムを含む。

製剤緩衝液中に本明細書において記載されるｒＡＡＶを含む医薬組成物が、さらに提供される。

なお別の態様において、対象に製剤緩衝液中の本明細書において記載されるｒＡＡＶの懸濁液を投与する工程を含む、ＭＰＳ ＩＩＩＡと診断されたヒト対象を処置する方法が、本明細書において提供される。

さらなる態様において、機能的ｈＳＧＳＨをコードする操作された核酸配列を含む発現カセット、およびその発現を指示する制御配列が、提供される。１つの実施形態において、発現カセットにおけるｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１と少なくとも９６％同一である。

本発明の他の態様および利点は、以下の発明の詳細な説明から容易に明らかであろう。

図１Ａ〜１Ｅは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧの脳室内投与の６ヶ月後の、脳（図１Ａ）、脊髄（図１Ｂ）、肝臓（図１Ｃ）におけるＳＧＳＨ活性、ならびに心臓（図１Ｄ）および脳（図１Ｅ）におけるトータルのＧＡＧ貯蔵を提供する。ＳＧＳＨ活性における用量依存性増大を、脳、脊髄、および肝臓において観察した。トータルのＧＡＧは、高用量のみで心臓において低減された。ＧＡＧは、ＫＯ ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスの脳において増大し、処置により中（ＭＤ）および高用量（ＨＤ）にて正常化された。図１Ａ〜１Ｃにおいて、塗りつぶされてない記号は、オスを表し、一方、塗りつぶされた記号は、メスを表す。ＬＤは、低用量を指す。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２Ａおよび２Ｂは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧの脳室内投与の６ヶ月後の、ＬＩＭＰ２免疫染色により評価したリソソーム貯蔵（図２Ｂ）および定量（図２Ａ）を示す。リソソーム膜のＬＩＭＰ２免疫染色は、中用量および高用量での貯蔵負荷の低減を示した。図２Ａにおいて、塗りつぶされてない記号は、オスを表し、一方、塗りつぶされた記号は、メスを表す。 同上。 図３Ａおよび３Ｂは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧのＩＣＶ投与の６ヶ月後の、脳（図３Ａ）および脊髄（図３Ｂ）における病理組織学累積スコアを提供する。脳スコアは、脳におけるグリア細胞空胞化、大脳におけるニューロン空胞化、脳幹におけるニューロン空胞化、脳におけるＧＦＡＰ強度スコア、および単核細胞浸潤（最大スコア１５）の３−グレード重症度スコアの累積計である。脊髄スコアは、ニューロン空胞化（運動ニューロンにおいてより顕著）、グリア細胞空胞化、およびＧＦＡＰ強度（最大スコア９）の３グレード重症度スコアの累積計である。低用量ＭＰＳ ＩＩＩａマウスは、ビークルで処置したものと類似し、一方、中用量と高用量で処置したマウスの両方が、脳および脊髄において減少した神経病理学スコアを有した。神経病理学の補正は、高用量群の処置した動物において統計上有意である（事後のダンの多重比較検定を含む一元配置分散分析クラスカル・ウォリス検定、アルファ０．０５）。塗りつぶされてない記号は、オスを表し、一方、塗りつぶされた記号は、メスを表す。 同上。 図４は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧのＩＣＶ投与の６ヶ月後の、ロッキングロータロッドにより評価した神経機能を提供する。マウスを、それぞれの回転の後、回転方向の反転を伴う、回転ロッド（１分当たり１０回転）に置いた。落下までの時間を、３回の連続アッセイ中に最長期間３００秒に渡り測定した。３回のアッセイの平均時間を、測定器の平衡および調整として報告した。^＊マンフォイトニー検定ｐ＜０．０５。ビークルで処置したＭＰＳ ＩＩＩａマウスは、ヘテロ接合体マウスより前に回転ロッドから落下させる神経障害を提示した。中用量と高用量で処置したマウスの両方が、無処置のマウスより有意に良好に、ヘテロ接合体マウスと同様に行動した。しかしながら、低用量ＭＰＳ ＩＩＩａマウスは、ビークルで処置したマウスの様に行動した。 図５は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧ処置の長期効果を決定するための研究において使用したマウスの臨床上の健康状態を評価するために使用した評価スケールを提供する。 図６Ａおよび６Ｂは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧ投与後の長期研究におけるマウスについての臨床スコアを提供する。マウスを、年齢２ヶ月において高用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧ（９×１０１０ＧＣ、ＩＣＶ）を注射し、毎週評価した。オス（図６Ａ）およびメス（図６Ｂ）マウスについてのスコアを示す。対照群の野生型（ＷＴ）およびＭＰＳ ＩＩＩａ（ＫＯ）マウスは、ＰＢＳ注射を受けた。 同上。 図７は、ＭＰＳ ＩＩＩａ（ＫＯ）マウスへのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧの高用量の投与後のオープン・フィールド運動（ビームブレイク活性により評価した）の測定の結果を提供する。ＰＢＳ注射を受けた対照群の野生型（ＷＴ）およびＭＰＳ ＩＩＩａ（ＫＯ）マウスも評価した。 図８Ａおよび８Ｂは、高用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧを受けたＭＰＳ ＩＩＩａマウスを用いて行った高い迷路アッセイの結果を提供する。オープンアームアクティビティを、持続時間（図８Ａ）および頻度（図８Ｂ）に関して測定した。ＰＢＳ注射を受けた対照群の野生型（ＷＴ）およびＭＰＳ ＩＩＩａ（ＫＯ）マウスも評価した。 同上。

ムコ多糖症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）の処置および／またはＭＰＳＩＩＩＡの症状を緩和するのに有用な組成物が、本明細書において提供される。これらの組成物は、機能的ヒトＮ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ（ｈＳＧＳＨ）をコードする核酸配列および標的細胞におけるその発現を指示する制御配列を含み、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１と少なくとも９６％同一である。

１つの実施形態において、本明細書において記載される組成物および方法は、核酸配列、発現カセット、ベクター、組換えウイルス、機能的ヒトＳＧＳＨの発現のための他の組成物および方法を含む。別の実施形態において、本明細書において記載される組成物および方法は、核酸配列、発現カセット、ベクター、組換えウイルス、宿主細胞、機能的ヒトＳＧＳＨをコードする核酸配列を含む組成物の製造のための他の組成物および方法を含む。なお別の実施形態において、本明細書において記載される組成物および方法は、核酸配列、発現カセット、ベクター、組換えウイルス、ＭＰＳ ＩＩＩＡの処置のため対象に機能的ヒトＳＧＳＨをコードする核酸配列のデリバリーのための他の組成物および方法を含む。１つの実施形態において、本明細書において記載される組成物および方法は、治療レベルのＳＧＳＨを中枢神経系（ＣＮＳ）にもたらすのに有用である。加えてまたはあるいは、本明細書において記載される組成物および方法は、例えば、血液、肝臓、腎臓、または末梢神経系のような末梢において治療レベルのＳＧＳＨをもたらすのに有用である。ある種の実施形態において、本明細書において記載されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベ
クターベースの方法は、必要とする対象においてＳＧＳＨタンパク質の発現をもたらすことにより、ＳＧＳＨの所望される機能を回復させるか、ＭＰＳ ＩＩＩＡと関連する症状を緩和するか、ＭＰＳ ＩＩＩＡ関連バイオマーカーを改善するか、またはＭＰＳ ＩＩＩＡのための他の処置（複数可）を促進するのを助ける、新規処置オプションを提供する。

本明細書において使用される、用語「治療レベル」は、健常対照の少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、１００％より高い、約２倍、約３倍、または約５倍の酵素活性を意味する。ＳＧＳＨ酵素活性を測定するのに適当なアッセイが、本明細書において記載される。いくつかの実施形態において、かかる治療レベルのＳＧＳＨは、ＭＰＳ ＩＩＩＡ関連症状の緩和；疾患のＭＰＳ ＩＩＩＡ関連バイオマーカーの改善；またはＭＰＳ ＩＩＩＡのための他の処置（複数可）の促進、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、尿および／または他の生物学的試料におけるＧＡＧレベル；認知神経科学的低下の予防；ある種のＭＰＳ ＩＩＩＡ関連症状の逆転および／もしくはＭＰＳ ＩＩＩＡ関連のある種の症状の進行の予防；または任意のその組み合わせをもたらし得る。

本明細書において使用される、「健常対照」は、対象、またはそれ由来の生物学的試料を指し、対象は、ＭＰＳ障害を有さない。健常対照は、一対象由来であることができる。別の実施形態において、健常対照は、複数の対象のプールである。

本明細書において使用される、用語「生物学的試料」は、任意の細胞、生物学的液体、または組織を指す。本発明における使用に適当な試料は、非限定的に、全血、白血球、線維芽細胞、血清、尿、血漿、唾液、骨髄、脳脊髄液、羊水、および皮膚細胞を含み得る。かかる試料は、食塩水、緩衝液、または生理的に許容される希釈液を用いてさらに希釈されてもよい。あるいは、かかる試料は、従来の手段により濃縮される。

これらの発明の説明に関して、本明細書において記載される組成物のそれぞれが、本発明の方法における別の実施形態において有用であることが意図される。加えて、方法において有用であると本明細書において記載される組成物が、別の実施形態において、それ自体本発明の実施形態であることも意図される。

本明細書において別段定義されない限り、本明細書において使用される技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により、および当業者に本出願において使用される用語の多くについての一般的な指針をもたらす、公開されたテキストを参照することにより、通常理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書において使用される、「疾患」、「障害」および「状態」は、ムコ多糖症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩａ、サンフィリポ症候群Ａ型、またはサンフィリポＡ型疾患としても知られる）である。

本明細書において使用される、用語「ＭＰＳ ＩＩＩＡ関連症状（複数可）」、または「症状（複数可）」は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者においてならびにＭＰＳ ＩＩＩＡ動物モデルにおいて見られる症状（複数可）を指す。かかる症状は、言語遅滞；社会的相互作用およびコミュニケーションに伴う困難；睡眠障害；進行性知的障害および既に獲得した技術の喪失（発達の退行）；てんかん発作および運動障害；巨大な頭部；若干肥大した肝臓（軽度の肝腫大）；臍周りの軟膨出（臍ヘルニア）もしくは下腹部（鼠径ヘルニア）；低身長、関節硬直、軽度の多発性骨形性不全症、複数の骨格異常；慢性下痢；再発上気道感染；再発耳感染；難聴；視力異常；非対称性心室中隔肥大；粗顔面特徴；粗毛；密な頭蓋
冠；多発性骨形性不全症；成長異常；尿中のヘパラン硫酸排出；脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、尿および／もしくは任意の他の生物学的試料中のＧＡＧ蓄積；Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）もしくはＮ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ（ＩＤＵＡ）の異常な発現および／もしくは酵素活性；ＧＭ２およびＧＭ３の蓄積；リソソーム酵素の変化した活性；ＣＮＳにおける遊離の非エステル化コレステロールの蓄積；ＣＮＳおよび骨格組織における炎症反応；過剰な毛成長（多毛）；過剰活性；卵形胸腰椎骨；脾腫；眉毛叢生；肥厚した肋骨；ヘルニア；ならびに不安定および迷走性歩行を含むが、これらに限定されない。

本明細書において使用される「患者」または「対象」は、男性もしくは女性のヒト、イヌ、および臨床研究のため使用される動物モデルを意味する。１つの実施形態において、これらの方法および組成物の対象は、ＭＰＳ ＩＩＩＡと診断されたヒトである。ある種の実施形態において、これらの方法および組成物のヒト対象は、出生前、新生児、乳児、幼児、就学前、小学生、１０代、若年成人または成人である。さらなる実施形態において、これらの方法および組成物の対象は、小児ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者である。

臨床検査および尿検査（過剰なムコ多糖は、尿において排泄される）は、ＭＰＳ疾患の診断における第一段階である。血液、皮膚細胞、または様々な細胞における酵素活性のレベルを測定する酵素アッセイをまた使用して、ＭＰＳ ＩＩＩＡの確定診断をもたらす。ＭＰＳ ＩＩＩＡと関連するＳＧＳＨの変異を検出する様々な遺伝子検査が利用可能である。例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｔｒ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ／−Ｃ００８６６４７／； ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｔｒ／ａｌｌ／ｔｅｓｔｓ／？ｔｅｒｍ＝Ｃ００８６６４７［ＤＩＳＣＵＩ］を参照。羊水穿刺および絨毛膜絨毛試料採取を使用した出生前診断は、胎児が、障害に罹患しているかを検証することができる。遺伝子カウンセリングは、ムコ多糖症の家族歴を有する両親が、彼らが、障害を引き起こす変異した遺伝子を有するかを決めるのを助けることができる。例えば、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ＭＰＳ ＩＩＩ， Ｎａｔｉｏｎａｌ ＭＰＳ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２００８， ｍｐｓｓｏｃｉｅｔｙ．ｏｒｇ／ｌｅａｒｎ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｍｐｓ−ｉｉｉ／を参照。

「含むこと」は、他の成分または方法の工程を含めて意味する用語である。「含むこと」が使用されるとき、関連する実施形態が、他の成分または方法の工程を除外する、専門用語「からなる」、および実施形態または本発明の性質を実質的に変化する任意の成分または方法の工程を除外する、専門用語「本質的にからなる」を使用した記載を含むことは理解されるべきである。明細書における様々な実施形態が、「含むこと」という語句を使用して提示される一方、様々な状況下で、関連する実施形態もまた、「からなる」または「本質的にからなる」という語句を使用して記載されることは、理解されるべきである。

用語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味し、例えば、「ベクター」は、１つまたは複数のベクター（複数可）を表すと解されることは、注意されるべきである。従って、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用される。

本明細書において使用される、用語「約」は、別段特定されない限り、与えられた参照からプラスマイナス１０％の変動制を意味する。

１．Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ（ＳＧＳＨ）
本明細書において使用される、用語「Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ」および「ＳＧＳＨ」は、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、ＨＮＳと互換的に使用される。本発明は、本明細書において提供される核酸配列から発現されるＳＧＳＨタンパク質、または
その機能的フラグメントの任意のバリアントを含み、本明細書において提供される組成物においてまたは方法によりデリバリーされるとき、所望される機能を回復させるか、症状を改善するか、ＭＰＳ ＩＩＩＡ関連バイオマーカーと関連する症状を改善するか、またはＭＰＳ ＩＩＩＡのための他の処置を促進する。 ＭＰＳＩＩＩに適当なバイオマーカーの例は、国際公開第２０１７／１３６５３３号において記載されるものを含み、参照により本明細書に取り込まれる。

本明細書において使用される、用語「機能的ＳＧＳＨ」は、全長の野生型（天然の）ヒトＳＧＳＨアミノ酸配列（配列番号２およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ５１６８８において示される）を有する酵素、そのバリアント、保存的アミノ酸置換を有するその変異体、そのフラグメント、正常なヒトＳＧＳＨの生物学的活性レベルの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはほぼ同じか、もしくは１００％より高い活性レベルをもたらす、バリアントおよび変異体の任意の組み合わせの全長またはフラグメントを意味する。いくつかの実施形態において、機能的ＳＧＳＨは、配列番号２の配列を有する野生型タンパク質を指す。

ＳＧＳＨバリアントの例は、野生型におけるバリン（Ｖａｌ、Ｖ）の代わりに、３６１番目のアミノ酸にてイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）を有する配列番号２のアミノ酸配列からなる、Ｖ３６１Ｉ；野生型におけるメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）の代わりに、３７２番目のアミノ酸にてイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）を有する配列番号２のアミノ酸配列からなる、Ｍ３７２Ｉ；野生型におけるバリン（Ｖａｌ、Ｖ）の代わりに、３８７番目のアミノ酸にてメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）を有する配列番号２のアミノ酸配列からなる、Ｖ３８７Ｍ；野生型におけるメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）の代わりに、３９４番目のアミノ酸にてイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）を有する配列番号２のアミノ酸配列からなる、Ｍ３９４Ｉ；および野生型におけるアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）の代わりに、４５６番目のアミノ酸にてヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）を有する配列番号２のアミノ酸配列からなる、Ｒ４５６Ｈを含むが、これらに限定されない。ＳＧＳＨバリアントはまた、上で同定された位置にてアミノ酸の変異の任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、または全５つを含んでもよい。ＳＧＳＨバリアントのさらなる例は、当業者にとって利用可能な生物情報学ツールにより予想されるものを含んでもよい。例えば、Ｕｇｒｉｎｏｖ ＫＧら、Ａ ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ
ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＩＩＡ （Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１５年３月２５日；１０（３）：ｅ０１２１５１１、 ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２１５１１、ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１５を参照のこと、これは、参照により全体が本明細書に取り込まれる。

本明細書において使用される、「保存的アミノ酸置換」または「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸の、類似の生化学的特性（例えば、荷電、疎水性およびサイズ）を有する異なるアミノ酸への変更、置き換えまたは置換を指し、当業者により知られている。例えば、ＦＲＥＮＣＨら、Ｗｈａｔ ｉｓ ａ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ？ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、１９８３年３月、第１９巻、第２号、１７１〜１７５頁、およびＹＡＭＰＯＬＳＫＹら、Ｔｈｅ
Ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年８月；１７０（４）：１４５９〜１４７２頁も参照のこと、これらのそれぞれは、参照により全体が本明細書に取り込まれる。

従来の方法によりＳＧＳＨ発現および活性レベルを測定するための様々なアッセイが存在する。例えば、本明細書において記載される実施例１；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｔｒ／ａｌｌ／ｔｅｓｔｓ／？ｔｅｒｍ＝Ｃ００８６６４７［ＤＩＳＣＵＩ］＆ｆｉｌｔｅｒ＝ｍｅｔｈｏｄ：１＿２；ｔｅｓｔｔｙｐｅ：ｃｌｉｎｉｃａｌ；Ｋａｒｐｏｖａ ＥＡら、Ａ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ Ａ （ＭＰＳ ＩＩＩＡ）、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ、１９９６年；１９（３）：２７８〜８５頁；Ｔａｒｄｉｅｕ Ｍら、Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｒｈ．１０ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ
ＳＧＳＨ ａｎｄ ＳＵＭＦ１ ｃＤＮＡｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＩＩＡ ｄｉｓｅａｓｅ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｔｒｉａｌ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０１４年６月；２５（６）：５０６〜１６頁、ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｕｍ．２０１３．２３８、Ｅｐｕｂ ２０１４年５月５日；Ｗｈｙｔｅ ＬＳら、Ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｎ−ｓｕｌｆｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｕｌｆｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ （ＳＧＳＨ） ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｐ、２０１５年１０月２２日；５：６０〜６２頁、ｄｏｉ：
１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｒ．２０１５．１０．００５、ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
２０１５年１２月；Ｈｏｐｗｏｏｄ ＪＪら、Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｔｙｐｅ Ａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｂｙ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ ｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ、１９８２年８月１８日；１２３（３）：２４１〜５０頁を参照のこと、これらのそれぞれが、参照により全体が本明細書に取り込まれる。

１つの態様において、機能的ＳＧＳＨタンパク質をコードする核酸配列が提供される。１つの実施形態において、核酸配列は、配列番号３において再産生される野生型コード配列である。１つの実施形態において、核酸配列は、配列番号３の野生型ｈＳＧＳＨ配列に少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％同一である。１つの実施形態において、核酸配列は、配列番号３の野生型ｈＳＧＳＨ配列に８３．３％未満同一である。

核酸は、多量体形態のヌクレオチドを指し、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および合成形態、ならびに上のもの混合多量体を含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはヌクレオチドのいずれかのタイプの改変された形態（例えば、ペプチド核酸オリゴマー）を指す。用語はまた、ＤＮＡの１本および２本鎖形態を含む。当業者は、これらの核酸分子の機能的バリアントが、本発明の一部であることも意図されることを理解する。機能的バリアントは、基準遺伝子コードを使用して、直接翻訳して、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列をもたらし得る、核酸配列である。

ある種の実施形態において、機能的ヒトＳＧＳＨ（ｈＳＧＳＨ）をコードする核酸分子、ならびに本発明により包含され、発現カセットおよびベクターゲノムを生成するのに有用な他のコンストラクトが、酵母細胞、昆虫細胞またはヒト細胞のような、哺乳類細胞における発現のため操作されてもよい。方法は、公知であり、既に記載されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号）。野生型配列と比較して少なくとも１つの好ましくないコドンが、より好ましいコドンにより置換されるなら、配列は、操作されたとみなされる。故に、好ましくないコドンは、同じアミノ酸をコードする別のコドンより生物におい
てより少ない頻度で使用されるコドンであり、より好ましいコドンは、好ましくないコドンより生物においてより高い頻度で使用されるコドンである。特定の生物についてのコドン利用の頻度は、ｗｗｗ． ｋａｚｕｓａ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎのような、コドン頻度の表において見ることができる。好ましくは、１つより多くの好ましくないコドン、好ましくは、大部分または全ての好ましくないコドンは、より好ましいコドンにより置換される。好ましくは、生物において最も頻繁に使用されるコドンは、操作された配列において使用される。好ましいコドンによる置換は、一般に、より高い発現を導く。多数の異なる核酸分子が、同じポリペプチドを遺伝子コードの縮重の結果としてコードし得ることはまた、当業者により理解される。当業者が、日常的な技術を使用し、ポリペプチドが発現されるべき、任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するよう、核酸分子によりコードされるアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド置換を行うことはまた、理解される。それ故、別段特定されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」は、互いのバージョンを縮重し、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。核酸配列は、日常的な分子生物学的技術を使用し、クローニングされ得るか、または日常的な手法を使用し、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野におけるビジネスを有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により行われ得る、ＤＮＡ合成により新規に生成され得る。

１つの態様において、ＳＧＳＨコード配列は、操作された配列である。１つの実施形態において、操作された配列は、対象における産生、転写、発現または安全性を改善するのに有用である。別の実施形態において、操作された配列は、得られた治療組成物または処置の有効性を増大させるのに有用である。さらなる実施形態において、操作された配列は、発現されている機能的ＳＧＳＨタンパク質の有効性を増大させるのに有用であるが、機能的タンパク質をデリバリーするより低用量の治療試薬が、安全性を増大させるのも可能にし得る。

１つの実施形態において、操作されたＳＧＳＨコード配列は、野生型ＳＧＳＨコード配列と比較して改善された翻訳割合により特徴付けられる。１つの実施形態において、ＳＧＳＨコード配列は、配列番号３の野生型ｈＳＧＳＨ配列に８３．３％未満同一である。１つの実施形態において、ＳＧＳＨコード配列は、野生型ＳＧＳＨコード配列と約９９％未満、約９８％未満、約９７％未満、約９６％未満、約９５％未満、約９４％未満、約９３％未満、約９２％未満、約９１％未満、約９０％未満、約８９％未満、約８８％未満、約８７％未満、約８６％未満、約８５％未満、約８４％未満、約８３％未満、約８２％未満、約８１％未満、約８０％未満、約７９％未満、約７８％未満、約７７％未満、約７６％未満、約７５％未満、約７４％未満、約７３％未満、約７２％未満、約７１％未満、約７０％未満、約６９％未満、約６８％未満、約６７％未満、約６６％未満、約６５％未満、約６４％未満、約６３％未満、約６２％未満、約６１％未満、またはそれ未満の同一性を有する。別の実施形態において、ＳＧＳＨコード配列は、野生型ＳＧＳＨコード配列と約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、約８０％、約７９％、約７８％、約７７％、約７６％、約７５％、約７４％、約７３％、約７２％、約７１％、約７０％、約６９％、約６８％、約６７％、約６６％、約６５％、約６４％、約６３％、約６２％、約６１％、またはそれ未満の同一性を有する。１つの実施形態において、配列番号１の配列を含む操作された核酸配列であって、機能的ｈＳＧＳＨをコードする、核酸配列が提供される。１つの実施形態において、機能的ｈＳＧＳＨをコードする、配列番号１の操作された核酸配列、またはそれと少なくとも約９５％同一の核酸配列が、本明細書において提供される。別の実施形態において、ＳＧＳＨコード配列は、配列番号１と少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９
％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性であり、機能的ｈＳＧＳＨをコードする。

「操作された」により、本明細書において記載される機能的ＳＧＳＨタンパク質をコードする核酸配列が、構築され、例えば、非ウイルスデリバリーシステム（例えば、ＲＮＡベースのシステム、ネイキッドＤＮＡなど）を生成するため、またはパッケージング宿主細胞においてウイルスベクターを生成するため、および／または対象における宿主細胞にデリバリーするため、保有されるＳＧＳＨ配列を宿主細胞に導入する、任意の適当な遺伝要素、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどに置かれる。１つの実施形態において、遺伝要素は、ベクターである。１つの実施形態において、遺伝要素は、プラスミドである。かかる操作されたコンストラクトを作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に公知であり、遺伝子操作、組換え操作、および合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２０１２年）を参照のこと。

核酸配列の文脈における、用語「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」または「パーセント同一」は、一致について整列されたとき、同じである２つの配列における残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長に渡ってもよく、または少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常、少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６以上のヌクレオチドのより小さなフラグメントの間の同一性はまた、望ましくてもよい。

核酸配列についての複数の配列整列化プログラムがまた利用可能である。かかるプログラムの例は、インターネットのウェブサービスを介してアクセス可能である、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」を含む。かかるプログラムの他のソースは、当業者に公知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓがまた、使用される。上で記載されたプログラムにおいて含有されるものを含む、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用され得る、当該技術分野において公知の多数のアルゴリズムも存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラム、Ｆａｓｔａ（商標）を使用し比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリーと検索配列の間の最善の重複の領域の整列化およびパーセント配列同一性をもたらす。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１において提供される、そのデフォルトパラメーター（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスについてのＮＯＰＡＭ因子）を用いたＦａｓｔａ（商標）を使用し決定され得る。

パーセント同一性は、タンパク質の全長、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、またはそのペプチドフラグメントもしくは対応する核酸配列コード配列に渡るアミノ酸配列について容易に決定され得る。適当なアミノ酸フラグメントは、少なくとも約８個のアミノ酸長であってもよく、最大約７００個のアミノ酸であってもよい。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」について言及するとき、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列に関して決定される。「整列された」配列または「整列化」は、参照配列と比較して、欠損してい
るかまたは追加の塩基もしくはアミノ酸についての補正を大抵含有する、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。

同一性は、配列の整列化を調製することにより、当該技術分野において公知であるか、または市販（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ；Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ；ＦＡＳＴＡ；例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）の様々なアルゴリズムおよび／またはコンピュータープログラムの使用を通じて決定されてもよい。整列化は、様々な公的または市販の複数配列アライメントのいずれかを使用し、行われる。配列整列化プログラム、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムが、アミノ酸配列について利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかが、デフォルト設定にて使用されるが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変えることができる。あるいは、当業者は、言及されたアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるものと、同一性または整列化のレベルを少なくとももたらす別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。例えば、Ｊ． Ｄ． Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ、「Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」、２７（１３）：２６８２〜２６９０頁（１９９９年）を参照のこと。

本明細書において使用される、「所望される機能」は、健常対照の少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％のＳＧＳＨ酵素活性を指す。

本明細書において使用される、語句「症状を寛解させる」、「症状を改善する」または任意のその文法上の異形は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ関連症状の逆転、ＭＰＳ ＩＩＩＡ関連症状の進行の対決または予防を指す。１つの実施形態において、寛解または改善は、投与または使用前と比較して、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％低減されている、記載される組成物（複数可）の投与または記載される方法の使用後の患者における症状の総数を指す。別の実施形態において、寛解または改善は、投与または使用前と比較して、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％低減されている、記載される組成物（複数可）の投与または記載される方法の使用後の症状の重症度または進行を指す。

本明細書において記載されるＳＧＳＨ機能的タンパク質およびＳＧＳＨコード配列における組成は、本明細書に渡り記載される他の組成物、大群、態様、実施形態および方法に適用されることが意図されることは、理解されるべきである。

２．発現カセット
１つの態様において、機能的ｈＳＧＳＨをコードする操作された核酸配列、およびその発現を指示する制御配列を含む発現カセットが、提供される。１つの実施形態において、機能的ｈＳＧＳＨをコードする、本明細書において記載される操作された核酸配列、およびその発現を指示する制御配列を含む発現カセット。

本明細書において使用される、用語「発現」または「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が、機能的遺伝子産物の合成において使用される、プロセスを指す。遺伝子産物は、タンパク質、ペプチド、または核酸ポリマー（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＰＮＡ）であり得る。

本明細書において使用される、「発現カセット」は、機能的ＳＧＳＨのコード配列、プロモーターを含み、カセットが、ベクターにパッケージングされ得る、それらの他の制御配列を含んでもよい、核酸ポリマーを指す。

本明細書において使用される、用語「制御配列」、または「発現調整配列」は、それらが、作動可能に結合される核酸配列をコードするタンパク質の転写を誘導するか、抑制するか、またはそうでなければ調整する、開始配列、エンハンサー配列、およびプロモーター配列のような、核酸配列を指す。

本明細書において使用される、用語「作動可能に結合された」は、機能的ｈＳＧＳＨをコードする核酸配列と連続する発現調整配列および／または順にまたはその転写およびその発現を調整する距離で作用する発現調整配列の両方を指す。

核酸配列またはタンパク質を記載するために使用される、用語「外来性」は、核酸またはタンパク質が、それが、染色体、または宿主細胞に存在する位置において天然で生じないことを意味する。外来性核酸配列はまた、同じ宿主細胞または対象からもたらされ、挿入されるが、非天然の状態、例えば、異なるコピー数、または異なる制御エレメントの制御下で存在する、配列を指す。

核酸配列またはタンパク質を記載するために使用される、用語「異種性」は、核酸またはタンパク質が、それが発現される宿主細胞または対象と異なる生物または同じ生物の異なる種からもたらされたことを意味する。用語「異種性」は、プラスミド、発現カセット、またはベクターにおけるタンパク質または核酸に関して使用されるとき、タンパク質または核酸が、問題のタンパク質または核酸が、天然で互いに同じ関連性で見られない、別の配列または亜配列と共に存在することを示す。

１つの実施形態において、制御配列は、プロモーターを含む。１つの実施形態において、プロモーターは、トリβ−アクチンプロモーターである。さらなる実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーとトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢ７プロモーター）のハイブリッドである。別の実施形態において、適当なプロモーターは、伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ ＤＷら、Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｇｅｎｅ、１９９０年７月１６日；９１（２）：２１７〜２３頁を参照）、シナプシン１プロモーター（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ Ｓら、Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２００３年２月；１０（４）：３３７〜４７頁を参照）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ Ｊら、Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２００４年２月；１４５（２）：６１３〜９頁、Ｅｐｕｂ ２００３年１０月１６日を参照）、またはＣＢ６プロモーター（例えば、Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ−９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒ
ｏｎ Ｇｅｎｅ、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１６年１月；５８（１）：３０〜６頁、ｄｏｉ： １０．１００７／ｓ１２０３３−０１５−９８９９−５を参照）を含み得るが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、発現カセットは、ヒト対象における発現および分泌のため設計される。１つの実施形態において、発現カセットは、脳脊髄液および脳を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）における発現のため設計される。さらなる実施形態において、発現カセットは、ＣＮＳと肝臓の両方における発現に有用である。恒常的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは誘導可能／制御性プロモーターを含むが、これらに限定されない、適当なプロモーターが、選択されてもよい。恒常的プロモーターの例は、トリベータ−アクチンプロモーターである。様々なトリベータ−アクチンプロモーターは、単独、または様々なエンハンサーエレメントと組み合わせて記載されている（例えば、ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むトリベータ−アクチンプロモーターである；プロモーター、トリベータアクチンの第１のエクソンおよび第１のイントロン、およびウサギベータ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む、ＣＡＧプロモーター；ＣＢｈプロモーター、ＳＪ Ｇｒａｙら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０１１年９月；２２（９）：１１４３〜１１５３頁）。組織特異的であるプロモーターが、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、（１９９７年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、 ７１：５１２４〜３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、（１９９６年）、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ、３：１００２〜９頁；アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、（１９９６年）、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、７：１５０３〜１４頁）、ニューロン（例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、（１９９３年）、Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、１３：５０３〜１５頁；ニューロフィラメント鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、（１９９１年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８：５６１１〜５頁；およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、（１９９５年）、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３〜８４頁）、および他の組織について周知である。 あるいは、制御可能なプロモーターが、選択されてもよい。例えば、参照により本明細書に取り込まれる、国際公開第２０１１／１２６８０８Ｂ２号を参照。

１つの実施形態において、制御配列は、エンハンサーをさらに含む。１つの実施形態において、制御配列は、１つのエンハンサーを含む。別の実施形態において、制御配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは、同じであっても、または異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを含んでもよい。このエンハンサーは、互いに隣接する位置にある２つのコピーに存在してもよい。あるいは、エンハンサーの二重のコピーは、１つまたは複数の配列により分けられていてもよい。

１つの実施形態において、制御配列は、イントロンをさらに含む。さらなる実施形態において、イントロンは、トリベータ−アクチンイントロンである。他の適当なイントロンは、ヒトβ−グロブリンイントロン、および／または市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロンによる当該技術分野において公知のもの、ならびに国際公開第２０１１／１２６８０８号において記載されるものを含む。

１つの実施形態において、制御配列は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含む。さらなる実施形態において、ポリＡは、ウサギグロビンポリＡである。例えば、国際公開第２０１４／１５１３４１号を参照。あるいは、別のポリＡ、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、または合成ポリＡは、発現カセットにおいて含まれてもよい。

本明細書において記載される発現カセットにおける組成は、本明細書に渡り記載される他の組成物、大群、態様、実施形態および方法に適用されることが意図されることは、理解されるべきである。

３．ベクター
１つの態様において、機能的ヒトＮ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ（ｈＳＧＳＨ）および標的細胞におけるその発現を指示する制御配列をコードする操作された核酸配列を含むベクターが、本明細書において提供される。１つの実施形態において、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１と少なくとも９６％同一である。さらなる実施形態において、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１である。

本明細書において使用される「ベクター」は、当該核酸配列の複製または発現に適当な標的細胞に導入され得る核酸配列を含む生物学的または化学部分である。ベクターの例は、組換えウイルス、プラスミド、Ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ、Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ、Ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）結合体、磁気粒子、またはナノ粒子を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態において、ベクターは、機能的ＳＧＳＨをコードする外来性または異種性または操作された核酸が、挿入され得、次に、適当な標的細胞に導入することができる、核酸分子である。かかるベクターは、好ましくは、複製の１つまたは複数の起源、および組換えＤＮＡが挿入され得る、１つまたは複数の部位を有する。ベクターは、大抵、ベクターを含む細胞が、含まないものから選択することができるという意味を有し、例えば、それらが、薬物耐性遺伝子をコードする。共通のベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、および「人工染色体」を含む。ベクターの生成、産生、特徴または定量の従来の方法が、当業者にとって利用可能である。

１つの実施形態において、ベクターは、その記載される発現カセットを含む非ウイルスプラスミド、例えば、「ネイキッドＤＮＡ」、「ネイキッドプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡ；例えば、ミセル、リポソーム、陽イオン性脂質−核酸組成物、ポリ−グリカン組成物および他のポリマー、脂質および／またはコレステロールベースの核酸結合体、ならびに本明細書において記載される他のコンストラクトなどを含む、様々な組成物およびナノ粒子に結合された発現カセットを含む非ウイルスプラスミドである。例えば、Ｘ．Ｓｕら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２０１１年、８（３）、７７４〜７８７頁；ウェブ公開：２０１１年３月２１日；国際公開第２０１３／１８２６８３号、国際公開第２０１０／０５３５７２号および国際公開第２０１２／１７０９３０号を参照し、これらの全てが、参照により本明細書に取り込まれる。

ある種の実施形態において、本明細書において記載されるベクターは、ＳＧＳＨをコードする核酸配列を含有する発現カセットが、ウイルスカプシドまたはエンベロープにおいてパッケージングされる、合成または人工ウイルス粒子を指す「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」であり、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にまたパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である；すなわち、それらは、子孫ビリオンを生成できないが、標的細胞に感染する能力を保持する。１つの実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製するために要求される酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムを操作して、「惰弱」であり得、人工ゲノムの増幅およびパッケージングのため要求されるシグナルにより隣接されるＳＧＳＨをコードする核酸配列のみを含有する）が、これらの遺伝子は、産生中に供給されてもよい。それ故、子孫ビリオンによる複製および感染は、複製のため要求されるウイルス酵素の存在下を除き生じることができないので、それは、遺伝子治療における使用について安全とみなされる。

本明細書において使用される、組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、単純ヘルペ
スウイルスまたはレンチウイルスである。

本明細書において使用される、用語「宿主細胞」は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生される、パッケージング細胞株を指してもよい。宿主細胞は、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソームデリバリー、膜融合技術、高速度ＤＮＡコートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合により、細胞に導入された外来性または異種性ＤＮＡを含有する、原核生物または真核生物の細胞（例えば、ヒト、昆虫、もしくは酵母）であってもよい。宿主細胞の例は、単離された細胞、細胞培養液、大腸菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非哺乳類細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、肝細胞、腎細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、または幹細胞を含むが、これらに限定されない。

本明細書において使用される、用語「標的細胞」は、機能的ＳＧＳＨの発現が所望される、任意の標的細胞を指す。ある種の実施形態において、用語「標的細胞」は、ＭＰＳ ＩＩＩＡの処置をされている対象の細胞を参照することを意図される。標的細胞の例は、肝細胞、腎細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、および幹細胞を含むが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、ベクターは、エクスビボで標的細胞にデリバリーされる。ある種の実施形態において、ベクターは、インビボで標的細胞にデリバリーされる。

本明細書において記載されるベクターにおける組成は、本明細書に渡り記載される他の組成物、大群、態様、実施形態および方法に適用されることが意図されることは、理解されるべきである。

４．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
１つの態様において、ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が、本明細書において提供される。ｒＡＡＶは、ムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）の処置における使用のためである。ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、本明細書において記載される機能的ｈＳＧＳＨをコードする操作された核酸配列、標的細胞におけるｈＳＧＳＨの発現を指示する制御配列、およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。１つの実施形態において、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１と少なくとも９５％同一である。さらなる実施形態において、ｈＳＧＳＨコード配列は、配列番号１である。

１つの実施形態において、制御配列は、上で記載された通りである。１つの実施形態において、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、本明細書において記載される発現カセット、およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。

１つの実施形態において、ＡＡＶセロタイプ９（ＡＡＶ９）カプシドを含むｒＡＡＶおよびウサギベータ−グロビン（ｒＢＧ）ポリＡ配列を含むヒトＮ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ｈＳＧＳＨ）の操作されたバージョンを発現するＣＢ７プロモーターを含むベクターゲノムが、提供される。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、配列番号４の配列（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏ．ＲＢＧ）を含む。１つの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドおよび配列番号４の配列を含むベクターゲノムを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏ．ＲＢＧとして表される。１つの実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号５のアミノ酸配列を含むｈＳＧＳＨの操作されたバージョンを発現する。

本明細書において使用される、「ベクターゲノム」は、ベクター内にパッケージングさ
れた核酸配列を指す。１つの実施形態において、ベクターゲノムは、ｒＡＡＶカプシド形成ｒＡＡＶベクター内にパッケージングされた核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）を含有する。１つの実施形態において、ＩＴＲは、カプシドを供給するものと異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態において、便宜上使用して、規制上の承認を加速し得る、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠損バージョン（ΔＩＴＲ）。しかしながら、他のＡＡＶ源由来のＩＴＲが、選択されてもよい。ＩＴＲの源が、ＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが、別のＡＡＶ源由来である場合、得られたベクターは、偽型と呼ばれてもよい。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ＳＧＳＨコード配列および任意の制御配列、ならびにＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の配置が、適当であってもよい。Ｄ配列および末端分離部位（ｔｒｓ）が欠損されている、ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮バージョンが、記載されている。他の実施形態において、全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが、使用される。

本明細書において使用される、用語「ＡＡＶ」は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者にとってならびに／または本明細書において記載される組成物（複数可）および方法（複数可）に照らして利用可能なアデノ随伴ウイルス、ならびに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、標的細胞へのデリバリーのためＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）により隣接されるパッケージングされた発現カセットである、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ抵抗性粒子である。ＡＡＶカプシドは、選択されたＡＡＶに依存し、およそ１：１：１０〜１：１：２０の比で、正二十面体対称性で配置されている、６０種のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む。様々なＡＡＶが、上で定義されたＡＡＶウイルスベクターのカプシドについての源として選択されてもよい。例えば、米国特許公開第２００７−００３６７６０−Ａ１号；米国特許公開第２００９−０１９７３３８−Ａ１号；欧州特許第１３１０５７１号を参照のこと。例えば、国際公開第２００３／０４２３９７号（ＡＡＶ７および他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号および米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、国際公開第２００５／０３３３２１号および米国特許第７，９０６，１１１号（ＡＡＶ９）、および国際公開第２００６／１１０６８９号、および国際公開第２００３／０４２３９７号（ｒｈ．１０）をまた参照のこと。これらの文書はまた、ＡＡＶを生成するため選択され得、参照により取り込まれる、他のＡＡＶを記載する。ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離されるかまたは操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２は、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり；それは、異なる標的組織および動物モデルにおいて効率的な遺伝子導入実験のため広く使用されている。別段特定されない限り、ＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、および本明細書において記載される他の選択されたＡＡＶ成分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８およびＡＡＶＡｎｃ８０として一般に同定されるＡＡＶ、公知または述べられたＡＡＶのいずれかのバリアントもしくはまだ発見されていないＡＡＶ、またはそのバリアントもしくは混合物を含むが、これらに限定されない、任意のＡＡＶから容易に選択され得る。例えば、本明細書に参照により取り込まれる、国際公開第２００５／０３３３２１号を参照のこと。１つの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシドまたはそのバリアントである。ある種の実施形態において、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称における用語「ＡＡＶ」の後の数字または数字と文字の組み合わせにより設計される。

本明細書において使用される通り、ＡＡＶに関して、用語「バリアント」は、保存的アミノ酸置換を有するもの、およびアミノ酸または核酸配列に渡り少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、またはそれより高い配列同一性を有するも
のを含む、公知のＡＡＶ配列からもたらされる、任意のＡＡＶ配列を意味する。別の実施形態において、ＡＡＶカプシドは、任意の記載されるか、または公知のＡＡＶカプシド配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書において提供される、および／または当該技術分野において公知のＡＡＶカプシドと約９０％の同一性〜約９９．９％の同一性、約９５％〜約９９％の同一性または約９７％〜約９８％の同一性を有する。１つの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％の同一性を有する。ＡＡＶカプシドのパーセント同一性を決定するとき、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のいずれかに渡り成されてもよい。

ＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、当業者にとって利用可能な技術を使用し、ＡＡＶから容易に単離されるか、または操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、市販、または公的な供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から単離されるか、操作されるか、または得られてもよい。あるいは、ＡＡＶ配列は、合成または他の適当な手段を通じて、文献または例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのようなデータベースにおいて入手可能である、公的な配列を参照して操作されてもよい。ＡＡＶウイルスは、核酸配列の細胞特異的デリバリーのため、免疫原性を最小にするため、安定性および粒子半減期を調整するため、効率的な分解のため、核への正確なデリバリーなどのため、これらの粒子を最適化することを可能にする、従来の分子生物学的技術により操作されてもよい。

本明細書において使用される、互換的に使用される、用語「ｒＡＡＶ」および「人工ＡＡＶ」は、カプシドタンパク質を含むＡＡＶおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを非限定的に意味し、ベクターゲノムは、ＡＡＶにとって異種性の核酸を含む。１つの実施形態において、カプシドタンパク質は、天然に存在しないカプシドである。かかる人工カプシドは、任意の適当な技術により、異なる選択されたＡＡＶから、同じＡＡＶの不連続な部分から、非ＡＡＶウイルス源から、または非ウイルス源から得られ得る異種性配列と組み合わせて選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質のフラグメント）を使用し、生成されてもよい。人工ＡＡＶは、偽型ＡＡＶ、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであってもよいが、これらに限定されない。１つのＡＡＶのカプシドが、異種性カプシドタンパク質で置換されている、偽型ベクターは、本発明において有用である。１つの実施形態において、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８は、典型的な偽型ベクターである。選択された遺伝要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームデリバリー、膜融合技術、高速度ＤＮＡコートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む、任意の適当な方法によりデリバリーされてもよい。 かかるコンストラクトを作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に公知であり、遺伝子操作、組換え操作、および合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２０１２年）を参照のこと。

本明細書において使用される、（ａ）「ＡＡＶ９カプシド」は、本明細書において参照により取り込まれ、ＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質が配列番号６において再生産される、ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＡＡＳ９９２６４のアミノ酸配列、および／または（ｂ）ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＡＹ５３０５７９．１：（ｎｔ １．．２２１１）（配列番号７において再産生される）のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するＡＡＶ９を指す。 このコードされる配列由来のいくつかのバリエーションは、本発明により包含され、ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＡＡＳ９９２６４および米国特許第７９０６１１１号（または国際公開第２００５／０３３３２１号）における参照されたアミノ酸配列に対して約９
９％同一性を有する配列（すなわち、参照された配列から約１％未満のバリエーション）を含んでもよい。かかるＡＡＶは、例えば、天然の単離物（例えば、ｈｕ６８（２０１７年２月２８日付けで出願された同時係属中の米国特許出願第６２／４６４，７４８号、および２０１９年１１月２７日付けで出願された、米国特許出願第６２／５９１，００２号、両方が「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） Ｃｌａｄｅ Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と名称付けられ、ならびに国際公開第２０１８／１６０５８２号）、ｈｕ３１もしくはｈｕ３２）、または例えば、ＡＡＶ９カプシドを用いて整列された任意の他のＡＡＶカプシドにおける対応する位置から「補充された」代替の残基から選択されるアミノ酸置換を含むが、これらに限定されない、アミノ酸置換、欠損、もしくは付加を有するＡＡＶ９のバリアント；例えば、米国特許第９，１０２，９４９号、米国特許第８，９２７，５１４、米国特許第２０１５／３４９９１１；国際公開第２０１６／０４９２３０Ａ１ｌ号；米国特許第９，６２３，１２０号；米国特許第９，５８５，９７１号において記載されるものなどを含んでもよい。しかしながら、他の実施形態において、上で参照された配列と少なくとも約９５％の同一性を有するＡＡＶ９、またはＡＡＶ９カプシドの他のバリアントが、選択されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２０１５／００７９０３８号を参照。カプシド、そのためのコード配列を生成する方法、およびｒＡＡＶウイルスベクターの産生方法が、記載されている。例えば、Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ、１００（１０）、６０８１〜６０８６頁（２００３年）および米国特許第２０１３／００４５１８６Ａ１号を参照のこと。

１つの実施形態において、本明細書において記載されるｒＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶである。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列により保有されるコード領域が、分子内２本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するよう設計されている、コンストラクトを指す。感染の際、第２の鎖の細胞介在性合成を待つよりむしろ、２つの相補レベルのｓｃＡＡＶは、即座の複製および転写の用意ができている１つの２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成するよう結合する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙら、「Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ
（ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、（２００１年８月）、第８巻、Ｎｏ．１６、１２４８〜１２５４頁を参照のこと。自己相補的ＡＡＶは、米国特許第６，５９６，５３５号；第７，１２５，７１７号；および第７，４５６，６８３号において記載され、これらのそれぞれが、参照により全体が本明細書に取り込まれる。

ある種の実施形態において、本明細書において記載されるｒＡＡＶは、ヌクレアーゼ抵抗性である。かかるヌクレアーゼは、単一のヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼの混合物であってもよく、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであってもよい。ヌクレアーゼ抵抗性ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドが完全にアセンブルされ、産生プロセスから存在し得る混入している核酸を取り除くために設計されたヌクレアーゼインキュベーション工程中に、分解（消化）からこれらのパッケージングされたゲノム配列を保護することを示す。多くの例において、本明細書において記載されるｒＡＡＶは、ＤＮａｓｅ抵抗性である。

本明細書において記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、公知である技術を使用し、生成されてもよい。例えば、国際公開第２００３／０４２３９７号；国際公開第２００５／０３３３２１号、国際公開第２００６／１１０６８９号；米国特許第７５８８７７２Ｂ２号を参照のこと。かかる方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）により隣接される本明細書において記載される発現カセット；および発現カセットのＡＡＶカプシドタンパク質へのパッケージ
ングを可能にするための十分なヘルパー機能を含有する、宿主細胞を培養する工程を含む。ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；記載されるベクターゲノム；およびベクターゲノムのＡＡＶカプシドタンパク質へのパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞がまた、本明細書において提供される。１つの実施形態において、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、参照により本明細書に取り込まれる、国際公開第２０１７１６０３６０Ａ２号においてより詳細に記載されている。

当業者にとって利用可能なｒＡＡＶを産生する他の方法が、利用されてもよい。適当な方法は、バキュロウイルス発現系または酵母を介した産生を含み得るが、これらに限定されない。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ． Ｋｏｔｉｎ、Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２０１１年４月１５日；２０（Ｒ１）：Ｒ２-Ｒ６、２０１１年４月２９日にオンラインで公開、ｄｏｉ： １０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１；Ａｕｃｏｉｎ ＭＧら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ｂｉｏｅｎｇ、２００６年１２月２０日；９５（６）：１０８１〜９２頁；ＳＡＭＩ Ｓ． ＴＨＡＫＵＲ、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ、Ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ、２０１２年；Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ
Ｏら、Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ−ｔｏ−Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ
Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２０１７年８月１０日、ｐｉｉ： Ｓ１５２５−００１６（１７）３０３６２〜３頁、ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３、［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍら、ＯｎｅＢａｃ ２．０： Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１， ＡＡＶ２， ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１７年２月；２８（１）：１５〜２２頁、ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４；Ｌｉ Ｌら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ−ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ： ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１３年８月１日；８（８）：ｅ６９８７９頁、ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９、２０１３年出版；Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌら、Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ
ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ、２０１１年７月；１０７
Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０〜９３頁、ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８；およびＫｏｔｉｎ ＲＭ、Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２０１１年４月１５日；２０（Ｒ１）：Ｒ２〜６頁、ｄｏｉ： １０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１、２０１１年４月２９日に電子公開、を参照のこと。

高い塩濃度での２つの工程アフィニティークロマトグラフィー精製、続く陰イオン交換樹脂 クロマトグラフィーを使用して、ベクター薬物産物を精製し、空のカプシドを取り除く。これらの方法は、参照により本明細書に取り込まれる、「ＡＡＶ９の測定可能な精製方法」と名称付けられた、国際公開第２０１７／１６０３６０号においてより詳細に記載される。簡単に言うと、ゲノム欠損ＡＡＶ９中間体由来のパッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子を分離する方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子およびＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を、迅速な性能液体クロマトグラフィーの対象にする工程を含み、ＡＡＶ９ウイルス粒子およびＡＡＶ９中間体は、ｐＨ１０．２にて平衡化された強力な陰イオン交換樹脂に結合し、約２６０および約２８０での紫外線吸光度について溶出液をモニタリングしながら塩勾配の対象にする。ｒＡＡＶ９にあまり適してないが、ｐＨは、約１０．０〜１０．４の範囲にあってもよい。この方法において、ＡＡＶ９全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が屈曲点に達したとき、分画から収集される。１つの例において、アフィニティークロマトグラフィー工程のため、完全に濾過した産物は、ＡＡＶ２／９セロタイプを効率的に捕獲するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶ２／９親和性樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用されてもよい。これらのイオン条件下で、有意なパーセンテージの残りの細胞ＤＮＡおよびタンパク質は、カラムを流れるが、一方、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕獲される。

ｒＡＡＶの従来の特徴決定または定量方法は、当業者にとって利用可能である。空および完全な粒子内容物を計算するために、選択された試料（例えば、本明細書における実施例において、イオジキサノール勾配精製調製物、ＧＣの＃＝粒子の＃）についてのＶＰ３バンド体積が、添加したＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた一次方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を使用して、試験物ピークのバンド体積における粒子の数を計算する。 次に、添加した２０μＬ当たりの粒子（ｐｔ）の数に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。 ＧＣ／ｍＬにより割ったＰｔ／ｍＬは、粒子のゲノムコピーに対する比（ｐｔ／ＧＣ）となる。 Ｐｔ／ｍＬ-ＧＣ／ｍＬは、空のｐｔ／ｍＬとなる。 ｐｔ／ｍＬにより割り、１００を掛けた空のｐｔ／ｍＬは、空の粒子のパーセンテージとなる。一般に、空のカプシドおよびパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイする方法が、当該技術分野において公知である。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、（１９９９年）６：１３２２〜１３３０頁；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．
Ｔｈｅｒ、（２００３年）７：１２２〜１２８頁を参照のこと。変性したカプシドを試験するために、方法は、処理したＡＡＶストックを、３種のカプシドタンパク質を分離する能力がある任意のゲル、例えば、緩衝液中の３〜８％トリス酢酸を含有する勾配ゲルからなる、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の対象にする工程、次に、試料物質が分離されるまで、ゲルを電気泳動する工程、およびゲルをナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくは、ナイロンにブロットする工程を含む。次に、抗ＡＡＶカプシド抗体は、変性したカプシドタンパク質に結合する一次抗体、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ−２モノクローナル抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ、（２０００年）７４：９２８１〜９２９３頁）。次に、二次抗体、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出する手段を含有するもの、より好ましくは、それに共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体が、使用される。結合を検出する方法、好ましくは、放射性同位元素放射、電磁放射、または比色分析変化を検出する能力がある検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットを使用して、一次と二次抗体の間の結合を半定量的に決定する。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、カラム分画由来の試料が、採取され、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加緩衝液において加熱され得、カプシドタンパク質は、成形済勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）において分解された。銀染色は、製造元の指示に従いＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）、または他の適当な染色方法、すな
わち、ＳＹＰＲＯルビーまたはクーマシー染色を使用し、行われてもよい。１つの実施形態において、カラム分画中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定することができる。試料を希釈し、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の適当なヌクレアーゼ）を用いて消化して、外来性のＤＮＡを取り除く。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、さらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを使用して増幅される。定義されたレベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に達するために要求されるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システムにおいてそれぞれの試料について測定される。ＡＡＶベクターにおいて含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ−ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、それをプラスミド標準曲線のＣｔに正規化することにより、ベクターゲノムタイターを決定する。デジタルＰＣＲに基づく終点アッセイをまた使用することができる。

１つの態様において、広範なスペクトルセリンタンパク質分解酵素、例えば、タンパク質分解酵素Ｋ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから市販されている）を利用する、最適化されたｑ−ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料が、タンパク質分解酵素Ｋ緩衝液を用いて希釈され、タンパク質分解酵素Ｋを用いて処理され、その後、熱不活性化されることを除き、最適化されたｑＰＣＲゲノムタイターアッセイは、標準的アッセイに類似する。試料は、試料サイズと等しい量のタンパク質分解酵素Ｋ緩衝液を用いて希釈される。タンパク質分解酵素Ｋ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的には、タンパク質分解酵素Ｋ処置は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬで変動してもよい。処置工程は、一般に、約５５℃にて約１５分間行われるが、より低い温度（例えば、約３７℃〜約５０℃）にてより長い期間（例えば、約２０分〜約３０分）、またはより高い温度（例えば、最大約６０℃）にてより短い期間（例えば、約５〜１０分）行われる。同様に、熱不活性化は、一般に、約９５℃にて約１５分間であるが、温度は、下げ（例えば、約７０〜約９０℃）、時間を延長してもよい（例えば、約２０分〜約３０分）。次に、試料は、希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイにおいて記載されるＴａｑＭａｎ解析の対象にされる。

加えて、またはあるいは、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる１本鎖および自己相補的ＡＡＶベクターゲノムタイターを決定する方法が、記載されている。例えば、Ｍ． Ｌｏｃｋら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１４年４月；２５（２）：１１５〜２５頁、ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１、２０１４年２月１４日電子公開、を参照のこと。

カプシドタンパク質のｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３の比を決定する方法がまた、利用可能である。例えば、Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕら、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２０１３年１２月；８７（２４）：１３１５０〜１３１６０頁；Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ、Ｒｏｓｅ ＪＡ、１９７８年、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ
ＫＢ ｃｅｌｌｓ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ、２５：３３１〜３３８頁；およびＲｏｓｅ ＪＡ、Ｍａｉｚｅｌ ＪＶ、Ｉｎｍａｎ ＪＫ、Ｓｈａｔｋｉｎ ＡＪ、１９７１年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ、８：７６６〜７７０頁を参照のこと。

本明細書において使用される、用語「処置」または「処置すること」は、ＭＰＳ ＩＩ
ＩＡの１つまたは複数の症状の寛解の目的のための組成物（複数可）および／もしくは方法（複数可）、ＳＧＳＨの所望される機能の回復、または疾患のバイオマーカーの改善を指す。いくつかの実施形態において、用語「処置」または「処置すること」は、本明細書において示される目的のため、対象に本明細書において記載される１つまたは複数の組成物を投与する工程を包含すると定義される。従って、「処置」は、所定の対象において、ＭＰＳ ＩＩＩＡの発症もしくは進行を低減すること、疾患を予防すること、疾患症状の重症度を低減すること、それらの進行を遅延させること、疾患の症状を取り除くこと、疾患の進行を遅延させること、または治療の有効性を増大させることの１つまたは複数を含み得る。

本明細書において記載されるｒＡＡＶにおける組成は、本明細書に渡り記載される他の組成物、大群、態様、実施形態および方法に適用されることが意図されることは、理解されるべきである。

５．医薬組成物
１つの態様において、製剤緩衝液中に本明細書において記載されるベクターを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。１つの実施形態において、医薬組成物は、機能的ｈＳＧＳＨタンパク質または機能的スルファターゼ変更因子１（ＳＵＭＦ１）との同時投与に適当である。１つの実施形態において、製剤緩衝液中に本明細書において記載されるｒＡＡＶを含む医薬組成物が、提供される。１つの実施形態において、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ〜約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬにて製剤化される。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶは、約３×１０^９ＧＣ／ｍＬ〜約３×１０^１３ＧＣ／ｍＬにて製剤化される。なおさらなる実施形態において、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ〜約１×１０^１３ＧＣ／ｍＬにて製剤化される。１つの実施形態において、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬにて製剤化される。

１つの実施形態において、製剤は、水性懸濁液に溶解した、界面活性剤、保存剤、賦形剤、および／または緩衝液をさらに含む。１つの実施形態において、緩衝液は、ＰＢＳである。別の実施形態において、緩衝液は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、例えば、エリオットの製剤緩衝液；またはハーバード装置灌流液（終イオン濃度（ｍＭ）：Ｎａ、１５０；Ｋ、３．０；Ｃａ、１．４；Ｍｇ、０．８；Ｐ、１．０；Ｃｌ、１５５を有する人工ＣＳＦ）である。緩衝食塩水、界面活性剤、および生理的に適合可能な塩もしくは約１００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）〜約２５０ｍＭ塩化ナトリウムに均等なイオン強度に調節された塩の混合物、または均等なイオン濃度に調節された生理的に適合可能な塩の１つまたは複数を含むものを含む、様々な適当な溶液が、公知である。

適当には、製剤は、生理的に許容可能なｐＨ、例えば、ｐＨ６〜８、またはｐＨ６．５〜７．５、ｐＨ７．０〜７．７、またはｐＨ７．２〜７．８の範囲に調節される。脳脊髄液のｐＨは、約７．２８〜約７．３２であるので、くも膜下腔内デリバリーのため、この範囲内のｐＨが所望されてもよく、一方、静脈内デリバリーのため、ｐＨ６．８〜約７．２が所望され得る。しかしながら、広範囲およびこれらの部分範囲内の他のｐＨが、他の経路のデリバリーのため選択されてもよい。

適当な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、無毒性である非イオン性界面活性剤から選択されてもよい。１つの実施形態において、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有する、ポロクサマー１８８としても知られた、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］のような、一次ヒドロキシル基で終わる二機能ブロックコポリマー界面活性剤が、選択される。他の界面活性剤および他のポロクサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖により隣接されるポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖を含む非イオン性ト
リブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール−１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリルグリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノールならびにポリエチレングリコールが、選択されてもよい。１つの実施形態において、製剤は、ポロクサマーを含有する。これらのコポリマーは、文字「Ｐ」（ポロクサマーについて）、続いて、３つのアラビア数字：最初の２つのアラビア数字×１００が、ポリオキシプロピレン中心のおよその分子量を与え、最後のアラビア数字×１０が、パーセンテージポリオキシエチレン含量を与える、を用いて一般に名称付けられる。１つの実施形態において、ポロクサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の量最大約０．０００５％〜約０．００１％で存在してもよい。

１つの例において、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム、７Ｈ_２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム、２Ｈ_２Ｏ）、リン酸水素ナトリウム、およびその混合物の１つまたは複数を含む緩衝食塩水溶液を含有してもよい。適当には、くも膜下腔内デリバリーのため、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合可能な範囲内にある（例えば、約２７５〜約２９０）；例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６−ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照のこと。場合により、くも膜下腔内デリバリーのため、市販の希釈剤が、懸濁化剤として、または別の懸濁剤および他の任意選択の賦形剤と組み合わせて使用されてもよい。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照のこと。

他の実施形態において、製剤は、１つまたは複数の浸透エンハンサーを含有してもよい。適当な浸透エンハンサーの例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウレルエーテル、またはＥＤＴＡを含み得る。

加えて、医薬的に許容される担体および本明細書において記載される機能的ＳＧＳＨをコードする核酸配列を含むベクターを含む医薬組成物が、提供される。本明細書において使用される、「担体」は、任意および全ての溶媒、分散媒、ビークル、コーティング剤、希釈剤、抗菌および抗真菌剤、等調および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。医薬上有効な物質のためのかかる媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足の有効成分をまた、組成物に取り込むことができる。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどのようなデリバリービークルが、本発明の組成物の適当な宿主細胞への導入のため使用されてもよい。特に、ｒＡＡＶベクターは、デリバリーのため製剤化されるか、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、またはナノ粒子などに包含されるかのいずれかであってもよい。１つの実施形態において、治療上有効量の当該ベクターが、医薬組成物において含まれる。担体の洗濯は、本発明の限定ではない。保存剤、または化学安定剤のような、他の好適な医薬的に許容される担体。適当な典型的な保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールを含む。適当な化学安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。

語句「医薬的に許容される」は、宿主に投与されたとき、アレルギーまたは類似の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。

本明細書において使用される、用語「投薬量」または「量」は、処置のうちに対象にデリバリーされるトータルの投薬量もしくは量、または１単位（または複数単位若しくは分
割投薬量）投与においてデリバリーされる投薬量または量を指すことができる。

また、複製欠損ウイルス組成物を、ヒト患者について、範囲、好ましくは、１．０×１０^１２ＧＣ〜１．０×１０^１４ＧＣ内の全成分または分別量を含む、（体重７０ｋｇの平均的な対象を処置するため）約１．０×１０^９ＧＣ〜約１．０×１０^１６ＧＣの範囲内にある複製欠損ウイルスの量を含有するよう投薬単位で製剤化され得る。１つの実施形態において、組成物は、範囲内の全成分または分別量を含む１用量当たり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、または９×１０^９ＧＣを含有するよう製剤化される。別の実施形態において、組成物は、範囲内の全成分または分別量を含む１用量当たり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０ＧＣを含有するよう製剤化される。別の実施形態において、組成物は、範囲内の全成分または分別量を含む１用量当たり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、または９×１０^１１ＧＣを含有するよう製剤化される。別の実施形態において、組成物は、範囲内の全成分または分別量を含む１用量当たり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、または９×１０^１２ＧＣを含有するよう製剤化される。別の実施形態において、組成物は、範囲内の全成分または分別量を含む１用量当たり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、または９×１０^１３ＧＣを含有するよう製剤化される。別の実施形態において、組成物は、範囲内の全成分または分別量を含む１用量当たり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、または９×１０^１４ＧＣを含有するよう製剤化される。別の実施形態において、組成物は、範囲内の全成分または分別量を含む１用量当たり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、または９×１０^１５ＧＣを含有するよう製剤化される。１つの実施形態において、ヒト適用のため、用量は、範囲内の全成分または分別量を含む１用量当たり１×１０^１０〜約１×１０^１２ＧＣの範囲にあり得る。

１つの実施形態において、本明細書において記載されるｒＡＡＶを含む医薬組成物は、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ〜脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣにて投与可能である。

本明細書において記載される水性懸濁液または医薬組成物は、任意の適当な経路または異なる経路の組み合わせによるそれを必要とする対象へのデリバリーのため設計される。１つの実施形態において、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、くも膜下腔内（ＩＴ）、または嚢内注射を介したデリバリーのため製剤化される。１つの実施形態において、本明細書において記載される組成物は、静脈注射によるそれを必要とする対象へのデリバリーのため設計される。あるいは、他の投与経路が、選択されてもよい（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋肉内、および他の非経口経路）。

本明細書において使用される、用語「くも膜下腔内デリバリー」または「くも膜下腔内投与」は、薬物が脳脊髄液（ＣＳＦ）に達するように、脊柱管、より具体的には、くも膜下腔への注射を介した薬物についての投与経路を指す。くも膜下腔内デリバリーは、腰椎穿刺、脳室内、後頭下／嚢内、および／またはＣ１−２穿刺を含み得る。例えば、物質は、腰椎穿刺によるくも膜下腔を介した拡散のため導入され得る。別の例において、注射は、大槽へのものであってもよい。 大槽内デリバリーは、ベクター拡散を増大させ、および／または投与により引き起こされる毒性および炎症を低減し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓ
ｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ、２０１４年；１：１４０５１頁、２０１４年１２月１０日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照のこと。

本明細書において使用される、用語「嚢内デリバリー」または「嚢内投与」は、脳室または大槽小脳延髄内の脳脊髄液に直接、より具体的には、後頭下穿刺を介した、または大槽への直接注射によるまたは持続的に配置された管を介した、薬物についての投与経路を指す。図６は、嚢内注射がどのようになされるかについての説明を提供する。

本明細書において記載される医薬組成物における組成は、本明細書に渡り記載される他の組成物、大群、態様、実施形態および方法に適用されることが意図されることは、理解されるべきである。

６．処置方法
１つの態様において、ＭＰＳ ＩＩＩＡと診断されたヒト対象を処置する方法が、本明細書において提供される。現在、ＭＰＳ ＩＩＩの臨床上の疑いが存在するとき、最初の工程は、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）を使用した分光光度方法を介した尿中のＧＡＧの存在を検出するための定量検査の要求である。ＤＭＢ検査は、ＧＡＧのジメチルメチレンブルーへの結合および分光光度計を用いたＧＡＧ−ＤＭＢ複合体の定量に基づく。この検査の感度は１００％であり、特異性は７５〜１００％である。尿中のＧＡＧを検出したときの陰性結果は、減弱形態の疾患を有する幾人かの患者において、健常対照を用いたＧＡＧ排出のレベルが重複し得、ＭＰＳ ＩＩＩにおけるヘパラン硫酸の増大した排出が、無視され得るという事実に起因して、ＭＰＳ ＩＩＩの存在を除外しない。現在の診断のゴールドスタンダード技術は、培養皮膚線維芽細胞、白血球、血漿または血清における酵素活性の決定である。ＭＰＳ ＩＩＩＡの特異的な診断は、患者の白血球または線維芽細胞におけるヘパラン硫酸の分解に関与するＳＧＳＨ酵素活性の減少または不存在を示すことにより確かにされ；低減は、他のスルファターゼにおいて正常である、健常な個体における活性と比較したとき、１０％未満であるべきである。疾患はまた、複数のスルファターゼにおける欠乏に起因して、ヘパランＮ−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼおよび他のスルファターゼの活性における低減を示すので、少なくとも他のスルファターゼの生化学的解析は、ＭＰＳ ＩＩＩの診断を確かにするために要求され、これにより、複数のスルファターゼ欠乏を除外する。しかしながら、診断方法は、本発明の制限ではなく、他の適当な方法が選択されてもよい。

方法は、対象に本明細書において記載されるベクターの懸濁液を投与する工程を含む。１つの実施形態において、方法は、対象に脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ〜脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で製剤緩衝液中の本明細書において記載されるｒＡＡＶの懸濁液を投与する工程を含む。

本明細書において提供される組成物（複数可）および方法（複数可）は、ＭＰＳ ＩＩＩＡを有する必要とする対象の処置における有効性を達成する。対象における方法の有効性は、（ａ）ＳＧＳＨ酵素活性における増大；（ｂ）ＭＰＳ ＩＩＩＡ症状の寛解；（ｃ）ＭＰＳ ＩＩＩＡ関連バイオマーカー、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、尿および／または他の生物学的試料におけるＧＡＧレベルポリアミン（例えば、スペルミン）レベルの改善；または（ｅ）ＭＰＳ ＩＩＩＡについての任意の処置（複数可）の促進を評価することにより、示すことができる。ある種の実施形態において、有効性は、認知の改善および／または不安の是正、歩行および／または運動改善、振戦頻度および／または重症
度における低減、把持／攣縮における低減、姿勢における改善、角膜混濁における改善をモニタリングすることにより、決定されてもよい。加えてまたはあるいは、方法の有効性は、動物モデルに基づき、予想されてもよい。適当なマウスモデルの一例が、実施例１において記載される。別の実施形態において、複数パラメーターの評価スケールを開発して、疾患補正および動物モデルにおける本明細書において記載されるＭＰＳＩＩＩＡベクター療法への応答を評価した。参照により本明細書に取り込まれる、図５を参照のこと。動物は、振戦、姿勢、毛の質、把持、角膜薄濁、および歩行／運動の組み合わせの評価に基づきスコアを割り当てられる。ある種の実施形態において、これらの要素の１つまたは複数の任意の組み合わせを使用して、単独、または他の要素との組み合わせた有効性を示してもよい。例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｕｓｅ Ｂｉｏｌ、２０１２年６月、２：１４５〜６５頁；Ｔｕｍｐｅｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、１９９８年５月、３７０５〜１０頁；およびＧｕｙｅｎｅｔら、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ、２０１０年５月、３９；１７８７頁を参照のこと。処置された動物の認知の改善および不安の補正は、オープンフィールド（すなわち、例えば、Ｔａｔｅｍら、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ、２０１４年、（９１）：５１７８５頁において記載されるビームブレイク測定）および上昇した十字路迷路（例えば、ＷａｌｆおよびＦｒｙｅ、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ、２００７年、２（２）：３２２〜３２８頁において記載される）における運動を評価することにより、評価される。

本明細書において使用される、「ＭＰＳ ＩＩＩＡのための任意の処置（複数可）の促進」またはその文法上の異形は、記載される組成物（複数可）の投与および記載される方法（複数可）の使用を含まない標準的な処置のものと比較して、本発明においてまず開示される組成物（複数可）または方法（複数可）以外の、対象におけるＭＰＳ ＩＩＩＡの処置の減少した投薬量またはより少ない頻度を指す。本明細書において記載される組成物（複数可）または方法（複数可）により促進される適当な処置の例は、症状（例えば、てんかん発作および睡眠障害）を軽減し、クオリティ・オブ・ライフを改善するため使用される医薬；骨髄移植または臍帯血移植のような、造血幹細胞移植；静脈内投与または脳室内注入を介した酵素置換療法（ＥＲＴ）；および任意のその組み合わせを含んでもよいが、それらに限定されない。１つの実施形態において、記載される方法は、ＭＰＳ ＩＩＩＡと関連するバイオマーカーの改善を示している対象をもたらす。

「ＳＧＳＨ酵素活性における増大」は、用語「所望されるＳＧＳＨ機能における増大」と互換的に使用され、健常患者についてのＳＧＳＨ酵素範囲の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％のＳＧＳＨ活性を指す。ＳＧＳＨ酵素活性は、本明細書において記載されるアッセイにより測定されてもよい。１つの実施形態において、ＳＧＳＨ酵素活性は、血清、血漿、血液、尿、ＣＳＦ、または別の生物学的試料において測定されてもよい。１つの実施形態において、本明細書において記載される組成物の投与、または本明細書において記載される方法の使用は、血清、血漿、唾液、尿、または他の生物学的試料におけるＳＧＳＨ酵素活性における増大をもたらす。あるいは、ＣＳＦ ＧＡＧレベルおよびスペルミンレベルのような他のＣＳＦバイオマーカーを測定して、治療効果を決定してもよい。例えば、国際公開第２０１７／１３６５３３号を参照のこと。

神経認知は、従来の方法により決定することができ、例えば、国際公開第２０１７／１３６５００Ａ１号を参照のこと。認知神経科学的低下の予防は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者のものと比較して少なくとも約５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の本明細書において記載される組成物を投与された、または本明細書において記載される方
法を受けとった対象の認知神経科学的低下の減速を指す。

本明細書において使用される、用語「バイオマーカー」または「ＭＰＳ ＩＩＩＡ関連バイオマーカー」は、正または負の問題においてＭＰＳ ＩＩＩＡの進行または発生と相関する、対象の生物学的試料における生物学的または化学分子の存在、濃度、発現レベルまたは活性を指す。１つの実施形態において、バイオマーカーは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、尿、皮膚線維芽細胞、白血球、血漿、または任意の他の生物学的試料におけるＧＡＧレベルである。別の実施形態において、バイオマーカーは、臨床化学を使用し、評価される。なお別の実施形態において、バイオマーカーは、肝臓または脾臓体積である。１つの実施形態において、バイオマーカーは、ヘパランＮ−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼおよび他のスルファターゼの活性である。別の実施形態において、バイオマーカーは、ＣＳＦ、血清、または別の生物学的試料におけるスペルミンレベルである。なお別の実施形態において、バイオマーカーは、血清、ＣＳＦ、または別の生物学的試料におけるリソソーム酵素活性である。１つの実施形態において、バイオマーカーは、脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を介して評価される。別の実施形態において、バイオマーカーは、神経認知発症検査により測定される神経認知スコアである。本明細書において使用される、語句「バイオマーカーの改善」は、疾患の進行と正に相関するバイオマーカーにおける低減、または疾患の進行と負に相関するバイオマーカーにおける増大を意味し、低減または増大は、本明細書において記載される組成物の投与または本明細書において記載される方法の使用前のものと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％である。

１つの実施形態において、方法は、本明細書において提供される治療を用いた治療の開始に先立ち、 対象におけるＭＰＳ ＩＩＩＡと関連するバイオマーカーを検出する工程またはモニタリングする工程をさらに含む。ある種の実施形態において、方法は、対象由来の使用におけるポリアミン（例えば、スペルミン）であるバイオマーカーの検出を含む（参照により本明細書に取り込まれる、国際公開第２０１７／１３６５３３号を参照のこと）。ある種の実施形態において、患者試料におけるスペルミン濃度レベルを検出して、本明細書において記載されるベクターを使用したＭＰＳＩＩＩのための処置の有効性をモニターする。

現在、ＭＰＳＩＩＩＡを有する患者は、骨髄移植（ＢＭＴ）、基質還元療法（ＳＲＴ）または酵素補充療法（ＥＲＴ）の候補とみなされない。しかしながら、ある種の実施形態において、本明細書において記載されるＳＧＳＨを発現するベクターを用いて処置された遺伝子治療の患者は、最低でも、任意の亜正常範囲の酵素レベルが、ＥＲＴまたはＳＲＴを用いて処理され得る、十分な酵素発現レベルを有する。かかるＥＲＴは、ＥＲＴの用量が、ベクター投与後数ヶ月または数年間、モニターされ、調節される、同時治療であってもよい。加えてまたはあるいは、ＳＲＴは、ＳＲＴの用量が、ベクター投与後数ヶ月または数年間、モニターされ、調節される、同時治療であってもよい。

従って、１つの実施形態において、懸濁液は、機能的ｈＳＧＳＨタンパク質または機能的ＳＵＭＦ１タンパク質との同時投与に適している。

１つの実施形態において、懸濁液は、必要とする対象に脳室内、くも膜下腔内、嚢内または静脈内デリバリーされる。

１つの実施形態において、懸濁液は、ｐＨ約７．２８〜約７．３２を有する。

本明細書において使用される、酵素補充療法（ＥＲＴ）は、特定の酵素が、欠損しているか、または不存在である、患者において酵素を置換することを含む医薬処置である。酵素は、通常、組換えタンパク質として産生され、患者に投与される。１つの実施形態において、酵素は、機能的ＳＧＳＨである。別の実施形態において、酵素は、機能的ＳＧＳＨを含む組換えタンパク質である。全身、くも膜下腔内、脳室内または嚢内デリバリーは、ＥＲＴを使用し、成され得る。本明細書において使用される、基質還元療法（ＳＲＴ）は、ＳＧＳＨの不存在下で蓄積する、化合物の生合成を部分的に阻害する小分子薬物を使用した治療を指す。１つの実施形態において、ＳＲＴは、ゲネステインを介した治療である。例えば、Ｒｉｔｖａ Ｔｉｋｋａｎｅｎら、Ｌｅｓｓ Ｉｓ Ｍｏｒｅ： Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ、２０１６年７月；１７（７）：１０６５頁、２０１６年７月４日にオンラインで公開、ｄｏｉ： １０．３３９０／ｉｊｍｓ１７０７１０６５；Ｄｅｌｇａｄｉｌｌｏ Ｖら、Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ、２０１１年１０月；３４（５）：１０３９〜４４頁、ｄｏｉ： １０．１００７／ｓ１０５４５−０１１−９３４２−４、２０１１年５月１０日に電子公開；およびｄｅ Ｒｕｉｊｔｅｒ Ｊら、Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ｉｎ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ
ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｔｒｉａｌ、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、２０１２年１月；７１（１）：１１０〜２０頁、ｄｏｉ： １０．１００２／ａｎａ．２２６４３を参照のこと。

これらの用量および濃度のデリバリーに適した体積は、当業者により決定され得る。例えば、体積約１μＬ〜１５０ｍＬが選択されてもよく、より大きな体積は、成人のため選択される。典型的には、新生児について、適当な体積は、約０．５ｍＬ〜約１０ｍＬであり、より大きな乳児について、約０．５ｍＬ〜約１５ｍＬが、選択されてもよい。幼児について、約０．５ｍＬ〜約２０ｍＬの体積が、選択されてもよい。小児について、最大約３０ｍＬの体積が、選択されてもよい。１０代前および１０代について、体積最大約５０ｍＬが、選択されてもよい。なお他の実施形態において、患者は、選択される約５ｍＬ〜約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ〜約１０ｍＬの体積でのくも膜下腔内投与を受けてもよい。他の適当な体積および投薬量が、決定されてもよい。投薬量を調節して、任意の副作用に対する治療恩恵のバランスを取り、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療適用に依存して、変動してもよい。

１つの実施形態において、本明細書において記載されるｒＡＡＶは、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ〜脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣにて投与される。ある種の実施形態において、ｒＡＡＶは、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ＧＣ〜体重１ｋｇ当たり約１×１０^１３ＧＣの用量にて全身に同時投与される。

１つの実施形態において、対象に、治療上有効量の本明細書において記載されるベクターがデリバリーされる。本明細書において使用される、「治療上有効量」は、標的細胞において、有効性を達成するのに十分な酵素の量をデリバリーし、発現するｈＳＧＳＨをコードする核酸配列を含む組成物の量を指す。１つの実施形態において、ベクターの投薬量は、範囲内の全整数または分別量および末端を含む、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ〜脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）である。別の実施形態において、投薬量は、脳質量１グラム当たり１×１０^１０ＧＣ〜脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣである。特定の実施形態において、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．０×１０
^９ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、または約１．０×１０^１４ＧＣ／脳質量１ｇである。

１つの実施形態において、方法は、対象が、免疫抑制同時療法を受けることをさらに含む。かかる同時療法のための免疫抑制剤は、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗物質、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンもしくはラパログ）、およびアルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞毒性抗生物質、抗体、またはイムノフィリン上で活性な剤を含む細胞増殖抑制剤を含むが、これらに限定されない。免疫抑制剤は、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、プラチナ化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミスラマイシン、ＩＬ−２受容体−（ＣＤ２５−）またはＣＤ３指示抗体、抗ＩＬ−２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、オピオイド、またはＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子アルファ）結合剤を含み得る。

ある種の実施形態において、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日以上前に開始されてもよい。かかる療法は、同日での２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）および／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン））の同時投与を含んでもよい。１つまたは複数のこれらの薬物は、遺伝子療法投与後、同じ用量または調節された用量にて継続されてもよい。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間以上であってもよい。ある種の実施形態において、タクロリムスを含まない投与計画が、選択される。

ある種の実施形態において、方法は、血清抗ｈＳＧＳＨ抗体の測定を含む。抗ｈＳＧＳＨ抗体を測定する適当なアッセイが、利用可能であり、例えば、実施例１を参照のこと。

１つの実施形態において、本明細書において記載されるｒＡＡＶが、必要とする対象に１回投与される。別の実施形態において、ｒＡＡＶは、必要とする対象に１回より多く投与される。

本明細書において記載される方法における組成は、本明細書に渡り記載される他の組成物、大群、態様、実施形態および方法に適用されることが意図されることは、理解されるべきである。

７．キット
ある種の実施形態において、製剤（場合により、凍結された）において懸濁された濃縮ベクター、任意選択の希釈緩衝液、およびくも膜下腔内、脳室内または嚢内投与に要求される装置および成分を含むキットが、提供される。別の実施形態において、キットは、静脈内デリバリーのための成分をさらにまたは代わりに含んでもよい。１つの実施形態において、キットは、注射を可能にするのに十分な緩衝液を提供する。かかる緩衝液は、濃縮ベクターの約１：１〜１：５の希釈、またはそれ以上を可能にする。他の実施形態において、より多いかもしくは少ない量の緩衝液または無菌水を含んで、用量タイトレーションおよび臨床医による他の調節を可能にする。なお他の実施形態において、１つまたは複数の装置が、キットにおいて含まれる。食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはグリセロール／ＰＢＳのような、適当な希釈緩衝液が、利用可能である。

本明細書において記載されるキットにおける組成は、本明細書に渡り記載される他の組成物、大群、態様、実施形態および方法に適用されることが意図されることは、理解されるべきである。

８．装置
１つの態様において、本明細書において提供されるベクターは、例えば、参照により全体が本明細書に取り込まれる、国際公開第２０１７／１３６５００号において記載される方法および／または装置を介してくも膜下腔内投与されてもよい。あるいは、他の装置および方法が、選択されてもよい。要約すると、方法は、くも膜下穿刺針を患者の大槽に進める工程、長い柔軟性のあるチューブを、くも膜下穿刺針の近位中心に、バルブの出力ポートを柔軟性のあるチューブの近位末端に繋げる工程、および当該進め、繋げる工程後、およびチューブを患者の脳脊髄液を用いて自己刺激することを可能にした後、多量の等調溶液を含有する第１の容器を、バルブのフラッシュ入口ポートに繋げ、その後、多量の医薬組成物を含有する第２の容器を、バルブのベクター入口ポートに繋げる工程を含む。第１および第２の容器をバルブに繋げた後、液体流の通り道が、ベクター入口ポートとバルブの取り出し口の間で開かれ、医薬組成物が、くも膜下穿刺針を通じて患者に注射され、医薬組成物を注射後、液体流の通り道が、フラッシュ入口ポートを通じて開けられ、バルブの取り出し口および等調溶液をくも膜下穿刺針に注入して、医薬組成物を患者に流す。この方法およびこの装置はそれぞれ、場合により、本明細書において提供される組成物のくも膜下腔内デリバリーのため志位陽されてもよい。あるいは、他の方法および装置が、かかるくも膜下腔内デリバリーのため使用されてもよい。

本明細書において記載される装置における組成は、本明細書に渡り記載される他の組成物、大群、態様、実施形態および方法に適用されることが意図されることは、理解されるべきである。

本発明は、ここで、以下の実施例を参照して記載される。これらの実施例は、説明のみの目的で提供され、本発明は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書において提供される教示の結果として証拠となる任意および全てのバリエーションを包含すると解釈されるべきである。

実施例１：方法
Ａ．ベクター−ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏ．ｒＢＧ
配列番号１において示すｈＳＧＳＨ（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）操作した配列を、ＣＢ７プロモーター（サイトメガロウイルス最初期エンハンサーとトリβ−アクチンプロモーターのハイブリッド）、トリβ−アクチンイントロン（ＣＩ）、およびウサギベータグロビン（ｒＢＧ）ポリアデニル化配列を含有する発現コンストラクトにクローニングした。発現コンストラクトに、ＡＡＶ２末端逆位配列が隣接し、ＡＡＶ９トランスプラスミドを、キャプシド形成のため使用した。

ＡＡＶベクターを、イオジキサノール勾配方法を用いてＰｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにより製造した。Ｌｏｃｋ、Ｍ．ら、Ｒａｐｉｄ， Ｓｉｍｐｌｅ， ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１０年、２１（１０）： １２５９〜１２７１頁を参照のこと。精製したベクターを、ＭＰＳ ＩＩＩＡについてＤｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（Ｌｏｃｋ， Ｍ．ら、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ Ｓｅｌｆ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ
Ｔｉｔｅｒｓ ｂｙ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１４年、２５（２）：１１５〜１２５頁）を用いてタイトレーションした。

カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ）を、対照物質（ビークル対照）およびベクターのための希釈剤として使用した。試験物質を、無菌のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いてそれぞれの用量群に適当な濃度まで希釈した。希釈したベクターを、湿った氷の上で維持し、希釈後４時間以内に動物に注射した。

Ｂ．動物の手法
全ての動物プロトコールは、ペンシルベニア大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。自然発生マウスＳＧＳＨ変異体を含むマウスコロニーを、ペンシルベニア大学においてＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｇｒａｍ ｖｉｖａｒｉｕｍにおいて維持した。全ての子孫を、自動システム（Ｔｒａｎｓｎｅｔｙｘ Ｉｎｃ、８１１０ Ｃｏｒｄｏｖａ Ｒｏａｄ Ｓｕｉｔｅ １１９ Ｃｏｒｄｏｖａ、ＴＮ ３８０１６）を使用し、尾の切れ目のＤＮＡのＰＣＲ解析により遺伝子型同定した。マウスを、離乳後、それらの遺伝子型に基づきグループ分けし、その後は混ぜずに、戦闘を防ぎ、所定のケージの全ての動物は、同じ処置を受けた。ケージを、それらのそれぞれの処置に無作為化した（ｗｗｗ．ｒａｎｄｏｍｉｚｅｒ．ｏｒｇ）。

動物を、１〜５匹の動物／ケージの標準的ケージングで、自動タイマーを介して制御した１２時間の明／暗サイクル下、湿度３０〜７０％で収容した。温度を、６４〜７９°Ｆ（１８〜２６℃）の範囲内で維持した。オートクレーブしたげっ歯類固形飼料を、自由に提供した。水は、それぞれのケージ内の個々に置かれた水のボトルを介して自由に全ての動物にアクセス可能であった。少なくとも、水のボトルを、毎週のケージ交換中に１週間
当たり１回交換した。水供給を、フィラデルフィア市から引き、Ｇｅｔｉｎｇｅ水濾過を使用し、精製した。水の質を、ＵＬＡＲにより塩素レベルについて毎日、ならびにｐＨおよび硬度について年４回試験した。ネスティング物質（Ｎｅｓｔｌｅｔ（登録商標））を、それぞれの変化後、それぞれのケージにおいて提供した。動物を、ＧＴＰスタッフおよびＵＬＡＲ獣医スタッフにより毎日モニターした。

Ｃ．ベクターおよびビークル投与
ＭＰＳ ＩＩＩＡマウスは、平均１４週齢にて右側脳室に、１匹のマウス当たりベクター９×１０^８ＧＣ（低用量）または９×１０^９ＧＣ（中用量）もしくは９×１０^１０ＧＣ（高用量）、またはＰＢＳ５μＬを受けた。マウスを、イソフルレンを用いて麻酔した。それぞれの麻酔したマウスの後頭部のたるんだ皮膚によりしっかり握り、３ｍｍの深さに挿入するよう調節した、２７ゲージの針を取り付けたＨａｍｉｌｔｏｎの針を用いてブレグマの前側および後側にフリーハンドで注射した。

Ｄ．神経行動学的評価
ロッキングロータロッドを行い、注射の４ヶ月後の調整および平衡を評価した（ＭＰＳ
ＩＩＩＡ）。一定の低速（５ｒｐｍ）にて１２０秒間の２回のトライアル中に、マウスをロータロッドに慣らした。２分の休憩後、マウスを、ロータロッドに戻し、ロッキングパラダイムに従い、ロッドを、１０ｒｐｍの一定速度で回転し、他の回転毎に回転の向きを逆転させた。トライアル間の休憩２分間で、３回のトライアルを行った。結果を、ロッドから落下までの平均時間として表す；時間が長いほど、良好な調整。

Ｅ．組織学
マウスを、注射の５．５ヶ月後にケタミン／キシラジン麻酔下で心臓穿刺瀉血により安楽死させた。組織を迅速に集め、半分を、ドライアイス上で簡単に凍結し（酵素活性）、半分を、１０％中性ホルマリンにおいて浸漬固定し、組織学のためパラフィンに包埋した。集めた組織は、脳、脊髄、肝臓、および心臓であった。

ヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を、標準プロトコールに従い、パラフィン切片上で行った。処置について盲検で、委員会認定の獣医病理学者により、脳および脊髄において、病理組織学をスコア化した。脳スコアは、脳におけるグリア細胞空胞化、大脳におけるニューロン空胞化、脳幹におけるニューロン空胞化、脳におけるＧＦＡＰ強度スコア、および単核細胞浸潤（最大スコア１５）の３−グレード重症度スコアの累積計であった。脊髄スコアは、ニューロン空胞化（運動ニューロンにおいてより顕著）、グリア細胞空胞化、およびＧＦＡＰ強度（最大スコア９）の３グレード重症度スコアの累積計であった。累積スコアを、事後のダンの多重比較検定、アルファ０．０５を含む一元配置分散分析クラスカル・ウォリス検定により解析した。

リソソーム貯蔵を、ＬＩＭＰ２免疫染色および定量により評価した。ＬＩＭＰ２免疫染色を、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した脳組織由来の６μｍの切片において行った。切片を、エタノールおよびキシレン連続を通して脱パラフィンし、マイクロ波において６分間、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）において抗原回収のためボイルし、ＰＢＳ＋０．２％トリトン中の１％ロバ血清を用いて１５分間ブロッキングし、続いて連続して、ブロッキング緩衝液において希釈した一次（１時間）および標識した二次（４５分）抗体とインキュベーションした。一次抗体は、ウサギ抗ＬＩＭＰ２（Ｎｏｖｕｓ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、１：２００）および二次抗体は、ＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣ標識したロバ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。ＬＩＭＰ２について陽性に染色した細胞の数を、訓練を受けたＧＴＰ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙの中心人物により、それぞれの動物由来の２〜４つの脳切片（９０日目の剖検）において定量した。

Ｆ．酵素活性およびグリコサミノグリカン貯蔵
酵素活性アッセイおよびＧＡＧ含有量のため、タンパク質を、機械的均質化（Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｉｚｅｒ）により、酸性溶解溶液（０．２％トリトン、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ４に調節）において抽出した。試料を凍結融解し、遠心分離により清澄化した。タンパク質を、ＢＣＡアッセイにより定量した。

ＳＧＳＨ活性を、試料１０μＬを、１４．３ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５＋０．７％ＮａＣｌ＋０．０１Ｍ酢酸鉛において溶解した、５ｍＭ ４−メチルウンベリフェリル２−スルファミノ−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドナトリウム塩（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）２０μＬとインキュベーションすることにより、測定した。１７時間、３７℃にてインキュベーション後、リン酸／クエン酸ＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液、ｐＨ６．７、６μＬおよび１０Ｕ／ｍｌ酵母由来のアルファ−グルコシダーゼ（ｓｉｇｍａ）１０μＬを、反応混合物に加え、３７℃にてインキュベーションした。混合物を、グリシンＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．６において希釈し、放出された４−ＭＵを、遊離４−ＭＵの標準希釈液と比較して、蛍光（励起３６５ｎｍ、放出４５０ｎｍ）により定量し、タンパク質含有量により正常化した。

ＭＰＳ ＩＩＩＡ動物由来の組織抽出物におけるＧＡＧ含有量を、製造元の推奨毎に使用した市販のキット（Ｂｌｙｓｃａｎ Ｂｉｏｃｏｌｏｒ ＧＡＧｓキット）を用いた色素結合方法を使用し、測定した。

Ｇ．抗導入遺伝子抗体
血清抗ｈＳＧＳＨ抗体の測定のための血液を、顎下出血により何回かのインビボでの時間点にて、ならびに心臓穿刺により最終剖検にて集めた。血清を分離させ、ドライアイス上で凍結し、解析まで−８０℃にて保存した。ポリスチレンプレートを、ｐＨ５．８に設定した、組換えヒトＳＧＳＨ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬを用いて一晩コーティングした。プレートを洗浄し、１時間、中性ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）においてブロッキングした。次に、プレートを、ＰＢＳにおいて１：１０００希釈した血清試料とインキュベーションした。結合した抗体を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて１：１０，０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて検出した。アッセイを、テトラメチルベンジジン基質を使用して発生させ、２Ｎ硫酸を用いて停止させた後、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。

実施例２：ＭＰＳＩＩＩａのマウスモデルにおける最小有効用量（ＭＥＤ）の決定
ＭＰＳＩＩＩａのマウスモデルにおいて、実験を行い、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏ．ｒＢＧ、ヒトＳＧＳＨを発現するＡＡＶ９ベクターの１回の脳室内（ＩＣＶ）投与の発現、生物活性、および最小有効用量（ＭＥＤ）を評価した。

ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧを、注射後（ｐｉ）６ヶ月の観察期間を用いた０日目に、１匹のマウス当たり用量９×１０^８ＧＣまたは９×１０^９ＧＣまたは９×１０^１０ＧＣ（ベクターのｄｄＰＣＲタイター決定により決定）にて３ヶ月齢のＭＰＳ
ＩＩＩａマウス（１群当たりｎ＝１０）にＩＣＶ経路を通じて投与した。ビークル処置したＭＰＳ ＩＩＩａおよびヘテロ接合体同腹仔のうちの一匹が、対照として機能する（１群当たりｎ＝７〜８）。

生物活性を、血清における注射の１４日および５６日後におけるＳＧＳＨ活性、ならびに脳、脊髄、肝臓および心臓における注射の６ヶ月後におけるＳＧＳＨ活性を測定することにより、評価した。有効性およびＭＥＤを、注射の４ヶ月後におけるロッキングロータ
ロッドでの行動、ならびに注射の６ヶ月後における脳リソソーム貯蔵および神経炎症を測定することにより、決定した。

１匹のマウス当たり最大９×１０^１０ＧＣでのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏ．ｒＢＧのＭＰＳ ＩＩＩａマウスへのＩＣＶ投与は十分に許容され、処置に関連する臨床上の徴候または死亡率を伴わず、中枢神経系全体（ＣＮＳ、脳および脊髄）ならびに抹消組織（肝臓および血清）におけるＳＧＳＨ発現をもたらした。

注射の６ヶ月後での脳、脊髄および肝臓においてＳＧＳＨ活性における用量依存性増大が存在し（図１Ａ〜１Ｃ）、中用量でのヘテロ接合体レベルおよび高用量でのヘテロ接合体レベルに近い酵素活性を伴った。トータルのグリコサミノグリカン貯蔵は、心臓において高用量にて低減し（図１Ｄ）、一方、脳組織におけるグリコサミノグリカン貯蔵を調べる。注射の６ヶ月後の中および高用量での脳におけるＬＩＭＰ２染色における低減により示す通り、リソソーム区画の用量依存性正常化が存在した（図２Ａおよび２Ｂ）。ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色した脳切片において、リソソーム貯蔵の指標である、グリアおよびニューロンの空胞化の量ならびに頻度における用量依存性低減を観察した（図３Ａ）。ＧＦＡＰ免疫染色はまた、脳において全ての用量にて、および脊髄において高用量にて神経炎症の低減を明らかにした（図３Ｂ）。ＣＮＳリソソーム含有量における変化およびＨ＆Ｅ染色した切片における疾患関連形態学における改善に対応し、注射の４カ月後でのロッキングロータロッドアッセイにより評価した平衡および調整における改善が存在し、これは、中用量および高用量にて統計上有意な改善であった（図４）。

試験物質および注射手法は、十分に許容された。ＭＰＳ ＩＩＩａ表現型と関連する徴候とは別に、マウスにおいて、臨床上の異常さを示さなかった。１匹を除き全てのマウスが、スケジュールで決められた安楽死まで生存した。死亡したマウスは、中用量で処置したＭＰＳ ＩＩＩａオスであり、重篤な戦闘の傷が原因で、ＩＣＶ注射の４日後に安楽死させなければならなかった。これは、ケージ内の仲間の攻撃に関連し、処置または手法に関連するものではなかった。ＩＣＶ投与手法自体に関連する変化を、幾匹かのマウスにおいて観察した（ヘモシデロファージおよび単核細胞が、脳室周囲の実質および髄膜に浸潤する）が、病理組織学において脳における試験物質に関連する毒性の証拠は存在しなかった。

結論として、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧは、ＭＰＳ ＩＩＩａマウスにおいて全ての用量レベルにて十分に許容され、神経行動学的表現型で補正した、ＭＰＳ ＩＩＩａのＣＮＳと抹消パラメーターの両方における改善と関連する、ＳＧＳＨレベルにおける用量依存性増大（発現および酵素活性）をもたらした。中用量で投与した、９×１０^９ＧＣが、本研究における最小有効用量であった。

実施例３：ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨ投与の長期効果
実験を行い、ＭＰＳ ＩＩＩａマウスにおけるＡＡＶ．ｈＳＧＳＨの長期効果を調べた。２０匹のＭＰＳ ＩＩＩａマウスは、２ヶ月齢にて高用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨ．ｒＢＧ（９×１０^１０ＧＣ、ＩＣＶ）を受けた。さらに２０匹のＭＰＳ ＩＩＩａマウスおよび２０匹の野生型マウスが、ＰＢＳ対照注射を受けた。マウスを、注射後７ヶ月間モニタリングし、その間、毎週臨床スコアを評価し、行動および認知検査を受けさせた。

複数パラメーター評価スケールを開発して、疾患補正および研究の継続中の処置に対する応答を評価した。マウスを、振戦、姿勢、毛の質、把持、角膜薄濁、および歩行／運動の組み合わせの評価に基づきスコアを割り当てられた（図５）。臨床スコアシステムを、既に記載された方法（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏ
ｕｓｅ Ｂｉｏｌ、２０１２年６月、２：１４５〜６５頁；Ｔｕｍｐｅｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、１９９８年５月、３７０５〜１０頁；およびＧｕｙｅｎｅｔら、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ、２０１０年５月、３９；１７８７頁を参照のこと）に基づき適合させた。ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨを投与した、オス（図６Ａ）とメス（図６Ｂ）両方のＭＰＳ ＩＩＩａマウスについて、臨床スコアが改善した。

本研究におけるＭＰＳ ＩＩＩａマウスの認知の改善および不安の補正を、オープンフィールド（すなわち、例えば、Ｔａｔｅｍら、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ、２０１４年、（９１）：５１７８５頁において記載されるビームブレイク測定）および上昇した十字路迷路（例えば、ＷａｌｆおよびＦｒｙｅ、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ、２００７年、２（２）：３２２〜３２８頁において記載される）における運動を評価することにより、評価した。ビームブレイクアッセイの結果は、ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩａマウスが、３０分後に、対照マウスと匹敵する活性レベルを有したことを示した（図７）。高い迷路試験の結果は、開放空間により誘導された恐怖に対する減少した感受性／不安、およびＡＡＶ．ｈＳＧＳＨを受けたＭＰＳ ＩＩＩａマウスにおいて最高であったことを示した（図８Ａ）。さらに、オープンアームへの進入の頻度の測定は、ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨを投与したＭＰＳ ＩＩＩａマウスが、探索するそのままの好奇心および覚醒を有したことを示唆する（図８Ｂ）。

神経行動学的検査後、マウスを安楽死させ、それらの器官を試料採取して、脳における酵素活性およびリソソーム貯蔵補正を調べる。

概して、これらの長期研究の結果は、ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨ処置が、ＭＰＳ ＩＩＩａマウスにおいて、健康状態を改善し、正常な認知行動を回復させ得ることを示唆する。

実施例４：アカゲザルにおける薬理学／毒性学研究
実験を行い、２回用量のＡＡＶ．ｈＳＧＳＨのくも膜下腔内投与の安全性および周囲の免疫抑制を評価する。

対照物質を、群１における２匹のマカク（１匹のオスおよび１匹のメス）に後頭下穿刺を介して投与する。試験物質（ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨ）を、群２〜５に無作為化した１２匹のアカゲザルに後頭下穿刺を介して投与する。群２におけるマカクは、ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨを高用量にて（Ｎ＝３）；群３におけるマカクは、ＡＡＶ．ｈＳＧＳＨを低用量にて（Ｎ＝３）；ならびに群４および５におけるマカクは、免疫抑制剤投与計画に置き、それぞれ、高用量または低用量のＡＡＶ．ｈＳＧＳＨを受ける（Ｎ＝３／群）。血液および脳脊髄液を、一般的な安全性パネルの一部として集める。血清および抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を集めて、カプシドおよび導入遺伝子に対する体液性および細胞性免疫応答を調べる。

ベクター投与の９０±３日後での、これらの研究の存命フェーズの終了後、マカクを剖検し、総合的な病理組織学的調査のため組織を回収した。リンパ球を、脾臓、および骨髄から回収して、剖検時のこれらの器官におけるＣＴＬの存在を調べる。

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、配列を含むフリーテキストについて数値識別子＜２２３＞下で提供される。

本明細書において引用される全ての刊行物は、２０１７年１１月３０日付けで出願された、米国仮特許出願第６２／５９３，０８１号であるように、参照により全体が本明細書に取り込まれる。同様に、本明細書において言及され、添付の配列表において現れる配列番号は、参照により取り込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載される一方、修飾が、本発明の精神から逸脱することなく成され得ることは理解される。かかる修飾は、添付の請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (30)

1. ＡＡＶカプシドおよびそこにパッケージングされたベクターゲノムを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ５’末端逆位配列（ＩＴＲ）、機能的Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ（ｈＳＧＳＨ）をコードする操作された核酸配列、標的細胞におけるｈＳＧＳＨの発現を指示する制御配列、およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含み、前記ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一である、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
2. 前記ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記制御配列が、プロモーターを含む、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
4. 前記制御配列が、エンハンサーをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
5. 前記制御配列が、イントロンをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
6. 前記制御配列が、ポリＡをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
7. 前記ＡＡＶベクターゲノムが、配列番号４の配列（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＧＳＨｃｏ．ＲＢＧ）を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
8. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ９カプシドである、請求項１〜７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
9. それを必要とする対象における、ムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ ＩＩＩＡ）の処置における使用、および／または歩行もしくは運動を改善するか、振戦を低減するか、攣縮を低減するか、姿勢を改善するか、または視力喪失の進行を低減するためである、請求項１〜８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
10. 製剤緩衝液中の請求項１〜９のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む、医薬組成物。
11. 機能的ｈＳＧＳＨタンパク質または機能的スルファターゼ変更因子１（ＳＵＭＦ１）との同時投与に適当である、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 脳室内（ＩＣＶ）、くも膜下腔内（ＩＴ）、嚢内または静脈内（ＩＶ）注射を介したデリバリーのため製剤化される、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
13. 脳質量１グラム当たり用量１×１０^９ＧＣ〜脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣにて投与可能である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
14. ｐＨ約７．２８〜約７．３２を有するように製剤化される、請求項１０〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
15. それを必要とする対象における、ＭＰＳ ＩＩＩＡと診断されたヒト対象を処置する、および／または歩行もしくは運動を改善するか、振戦を低減するか、攣縮を低減するか、姿勢を改善するか、もしくは視力喪失の進行を低減する方法であって、前記対象に製剤緩衝液中の請求項１〜９のいずれかに記載のｒＡＡＶの懸濁液を脳質量１グラム当たり１×
    １０^９ＧＣ〜脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣにて投与することを含む、方法。
16. 前記方法が、健常対照の少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の血清ＳＧＳＨ活性をもたらす、請求項１５に記載の方法。
17. 前記懸濁液が、少なくとも１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬの前記ｒＡＡＶを有する、請求項１５に記載の方法。
18. 前記懸濁液が、機能的ｈＳＧＳＨタンパク質または機能的ＳＵＭＦ１タンパク質と同時投与するのに適当である、請求項１５に記載の方法。
19. 前記懸濁液が、必要とする前記対象に、脳室内、くも膜下腔内、または静脈内にデリバリーされる、請求項１５に記載の方法。
20. 前記懸濁液が、ｐＨ約７．２８〜約７．３２を有する、請求項１５に記載の方法。
21. （ａ）前記対象が、酵素補充療法のみを介した標準的処置と比較して、減少した投薬量にて、またはより少ない頻度で前記酵素補充療法を受ける；および／または
    （ｂ）前記対象が、ＭＰＳ ＩＩＩＡに関連するバイオマーカーの改善を示す
    請求項１５に記載の方法。
22. 前記ｒＡＡＶが、必要とする前記対象に１回投与される、請求項１５に記載の方法。
23. 前記ｒＡＡＶが、必要とする前記対象に１回より多く投与される、請求項１５に記載の方法。
24. 機能的ｈＳＧＳＨをコードする操作された核酸配列および標的細胞におけるその発現を指示する制御配列を含む、ベクターであって、前記ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１と少なくとも９６％同一である、ベクター。
25. 前記ｈＳＧＳＨコード配列が、配列番号１である、請求項２４に記載のベクター。
26. 組換えウイルス、プラスミド、Ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ、Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ、Ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）結合体、磁気粒子、またはナノ粒子である、請求項２４または２５に記載のベクター。
27. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはレンチウイルスである、請求項２４〜２６のいずれかに記載のベクター。
28. 前記標的細胞が、単離された細胞、培養細胞、細胞株、大腸菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非哺乳類細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、肝細胞、腎細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、または幹細胞である、請求項２４〜２７のいずれかに記載のベクター。
29. それを必要とする対象における、ＭＰＳ ＩＩＩＡの処置、および／または歩行もしくは運動を改善するか、振戦を低減するか、攣縮を低減するか、姿勢を改善するか、または視力喪失の進行を低減する方法における使用のための、請求項１〜９のいずれかに記載の
    ｒＡＡＶまたは請求項２４〜２８のいずれかに記載のベクター。
30. それを必要とする対象における、ＭＰＳ ＩＩＩＡの処置、および／または歩行もしくは運動の改善、振戦の低減、攣縮の低減、姿勢の改善、または視力喪失の進行の低減のための医薬の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは請求項２４〜２８のいずれかに記載のベクターの使用。