JP2021114970A - ブドウファバウイルスの検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の(5)〜(9)のプライマーのいずれか2つを含む、GFabVに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(5) GFabVのRNA2における配列番号5記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(6) GFabVのRNA2における配列番号6記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(7) GFabVのRNA2における配列番号7記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(8) GFabVのRNA2における配列番号8記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(9) GFabVのRNA2における配列番号9記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー。
[2]以下の(c)〜(f)のいずれか1つのプライマーセットである、[1]記載のプライマーセット。
(c) 配列番号14記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号18記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット;
(d) 配列番号15記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号19記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット;
(e) 配列番号16記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号19記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット;
(f) 配列番号17記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号19記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット。
[3]以下の(1)〜(4)のプライマーのいずれか2つを含む、GFabVに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(1) GFabVのRNA1における配列番号1記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(2) GFabVのRNA1における配列番号2記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(3) GFabVのRNA1における配列番号3記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(4) GFabVのRNA1における配列番号4記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー。
[4]以下の(a)又は(b)のプライマーセットである、[3]記載のプライマーセット。
(a) 配列番号10記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号13記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット;
(b) 配列番号11記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号12記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット。
[5][1]〜[4]のいずれか1記載のプライマーセットを含む、GFabV検出又はGFabV感染診断用キット。
[6][1]〜[4]のいずれか1記載のプライマーセット又は[5]記載のキットを用いて、GFabVの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、GFabV検出又はGFabV感染診断方法。
本発明に係るプライマーセットは、ブドウファバウイルス(GFabV)に特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするプライマーを含む、GFabVに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットである。
(1) GFabVのRNA1における配列番号1記載の塩基配列から成る保存領域(表3及び図2に示す保存領域(1))に対するプライマー;
(2) GFabVのRNA1における配列番号2記載の塩基配列から成る保存領域(表3及び図2に示す保存領域(2))に対するプライマー;
(3) GFabVのRNA1における配列番号3記載の塩基配列から成る保存領域(表3及び図2に示す保存領域(3))に対するプライマー;
(4) GFabVのRNA1における配列番号4記載の塩基配列から成る保存領域(表3及び図2に示す保存領域(4))に対するプライマー。
(a) 配列番号10記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(1)に対するフォワードプライマーFab-RNA1-5F)と配列番号13記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(4)に対するリバースプライマーCS1-3R2)とから成るプライマーセット;
(b) 配列番号11記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(2)に対するフォワードプライマーFbC1f)と配列番号12記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(3)に対するリバースプライマーFbC1r)とから成るプライマーセット。
(5) GFabVのRNA2における配列番号5記載の塩基配列から成る保存領域(表3及び図2に示す保存領域(5))に対するプライマー;
(6) GFabVのRNA2における配列番号6記載の塩基配列から成る保存領域(表3及び図2に示す保存領域(6))に対するプライマー;
(7) GFabVのRNA2における配列番号7記載の塩基配列から成る保存領域(表3及び図2に示す保存領域(7))に対するプライマー;
(8) GFabVのRNA2における配列番号8記載の塩基配列から成る保存領域(表3及び図2に示す保存領域(8))に対するプライマー;
(9) GFabVのRNA2における配列番号9記載の塩基配列から成る保存領域(表3及び図2に示す保存領域(9))に対するプライマー。
(c) 配列番号14記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(5)に対するフォワードプライマーFab-RNA2-5F)と配列番号18記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(9)に対するリバースプライマーCS2-3R1)とから成るプライマーセット;
(d) 配列番号15記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(6)に対するフォワードプライマーFab-Det-F1)と配列番号19記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(9)に対するリバースプライマーFab-Det-R)とから成るプライマーセット;
(e) 配列番号16記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(7)に対するフォワードプライマーFab-Det-F2)と配列番号19記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(9)に対するリバースプライマーFab-Det-R)とから成るプライマーセット;
(f) 配列番号17記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(8)に対するフォワードプライマーFab-Det-F3)と配列番号19記載の塩基配列を含むか又はそれから成るプライマー(保存領域(9)に対するリバースプライマーFab-Det-R)とから成るプライマーセット。
16SM3株に関しては、NGS解析により得られたコンティグが、既報のGFabV BB株(KX241484-KX241485)と塩基配列相同性の高いものであったことから、コンティグ配列とBB株の配列を基にプライマーを設計してほぼ全長の塩基配列を決定した(非特許文献4)。
本発明者等が決定したRNA1とRNA2について、データベース上に登録されている他の塩基配列と共にアライメントを行い、保存領域をそれぞれ探索した。
上記の各種ユニバーサルプライマーを用いたRT-PCRは、逆転写とPCR反応を同一チューブ内で行うワンステップRT-PCRの手法により行った。すなわち、それぞれの変異株が感染しているブドウ葉サンプルからPlant/Fungi RNA Purification Kit(ノルジェン)を用いて抽出したRNAを鋳型とし、PrimeScript One-Step RT-PCR Kit Ver. 2(タカラバイオ)を用いてワンステップRT-PCRを行った。PrimeScript One-Step RT-PCR Kit Ver. 2では、10μlの反応系で、2×1step buffer 5μl、PrimeScript 1step Enzyme 0.4μl、鋳型となる精製RNAを1μl、5μMに希釈した各プライマーを1.2μlずつ(終濃度0. 6μM)加え、不足部分についてはRNase free H2Oを加えることで10μlの反応液を作り、逆転写反応を50℃30分→95℃2分行った後、95℃20秒→52℃30秒→72℃40秒を43サイクル行った。
本発明者等は、RNA1とRNA2に存在する幾つかの保存領域を決定し、プライマーを設計して実際に試し、ユニバーサルな検出が可能であることを確認した。データベース上に登録されたものも含めて全ての変異株を試験したわけではないが、アライメントを検討する限り、多少のミスマッチが認められたとしてもRT-PCRでの検出には支障がなく(Stadhouders, R. Pas, SD, Anber J, Voermans J, Mes THM, Schuttenet M (2010) The effect of primer-template mismatches on the detection and quantification of nucleic acids using the 5'nuclease assay. J Mol Diagn 12:109-117)、それら全ての変異株を理論的には検出可能なユニバーサルプライマーであると考える。それらのうち、図4に示したユニバーサルプライマーセットの中では、Fab-Det-F1とFab-Det-RによるRT-PCRが最も効率よく増幅し、GFabV変異株のユニバーサル検出法として実用性を有すると判断した。また、Fab-Det-F1(又はFab-Det-F2)とFab-Det-Rを用いたPCR産物については、塩基配列の解析により変異株の系統判別も行うことができるので、伝染ルートの特定等の用途にも適すると考えらえた。一方、Fab-Det-F3とFab-Det-Rを用いた場合は、増幅産物の短いことが望ましいリアルタイムRT-PCRでは有効に活用できると考える。また、内在性コントロール(宿主DNA)や他ウイルスの検出と合わせたPCR反応を行うために、PCR増幅産物の長さや反応温度を調整したりする場合等には、条件に適するプライマーの組み合わせを選択して利用することができる。さらに本発明者等は将来的にTaqman法を用いたリアルタイムRT-PCRでの診断も見据えており、そのプローブも、今回決定した保存領域を利用することが可能である。
Claims (6)
- 以下の(5)〜(9)のプライマーのいずれか2つを含む、ブドウファバウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(5) ブドウファバウイルスのRNA2における配列番号5記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(6) ブドウファバウイルスのRNA2における配列番号6記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(7) ブドウファバウイルスのRNA2における配列番号7記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(8) ブドウファバウイルスのRNA2における配列番号8記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(9) ブドウファバウイルスのRNA2における配列番号9記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー。 - 以下の(c)〜(f)のいずれか1つのプライマーセットである、請求項1記載のプライマーセット。
(c) 配列番号14記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号18記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット;
(d) 配列番号15記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号19記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット;
(e) 配列番号16記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号19記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット;
(f) 配列番号17記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号19記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット。 - 以下の(1)〜(4)のプライマーのいずれか2つを含む、ブドウファバウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(1) ブドウファバウイルスのRNA1における配列番号1記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(2) ブドウファバウイルスのRNA1における配列番号2記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(3) ブドウファバウイルスのRNA1における配列番号3記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー;
(4) ブドウファバウイルスのRNA1における配列番号4記載の塩基配列から成る保存領域に対するプライマー。 - 以下の(a)又は(b)のプライマーセットである、請求項3記載のプライマーセット。
(a) 配列番号10記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号13記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット;
(b) 配列番号11記載の塩基配列を含むプライマーと配列番号12記載の塩基配列を含むプライマーとから成るプライマーセット。 - 請求項1〜4のいずれか1項記載のプライマーセットを含む、ブドウファバウイルス検出又はブドウファバウイルス感染診断用キット。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載のプライマーセット又は請求項5記載のキットを用いて、ブドウファバウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、ブドウファバウイルス検出又はブドウファバウイルス感染診断方法。
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