JP2021112169A - カタクリ属植物の組織培養による増殖方法 - Google Patents
カタクリ属植物の組織培養による増殖方法 Download PDFInfo
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Description
[1] 以下の工程:
(1) カタクリ属植物の超未熟種子を不定胚誘導用培地にて培養し、不定胚組織を誘導する工程、
(2) 工程(1)で誘導した不定胚組織を不定胚増殖用培地にて18℃以下で培養し、不定芽原基を含む組織を形成する一次増殖工程、及び
(3) 工程(2)で形成された不定芽原基を含む組織を分割し、分割塊を不定胚増殖用培地にて10〜18℃でさらに培養し、不定芽原基を含む組織を増殖する二次増殖工程、
を含む、カタクリ属植物の組織培養による増殖方法。
[2] 前記超未熟種子が、閉花後5〜10日の子房中にある未熟胚珠である、[1]に記載の方法。
[3] 前記超未熟種子の培養を、暗所にて15〜25℃で4〜6ヶ月行う、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 前記不定胚誘導用培地が、植物ホルモンとしてジベレリン類単独、ジベレリン類とオーキシン類との組み合わせ、又はジベレリン類とオーキシン類とサイトカイニン類との組み合わせを含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] ジベレリン類がGA3であり、オーキシン類がナフタレン酢酸(NAA)であり、サイトカイニン類がベンジルアデニン(BA)である、[4]に記載の方法。
[6] 前記一次増殖工程の培養を、暗所にて4〜5ヶ月行い、前記二次増殖工程の培養を、暗所にて2〜3ヶ月行う、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 前記一次増殖工程で形成された分割前の不定芽原基を含む組織が、0.5g以上である、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8] 前記不定胚増殖用培地が、ジベレリン類とオーキシン類とサイトカイニン類との組み合わせを含む、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9] ジベレリン類がGA3であり、オーキシン類がナフタレン酢酸(NAA)であり、サイトカイニン類がベンジルアデニン(BA)である、[8]に記載の方法。
[10] [1]〜[9]のいずれかに記載の方法で得られる不定芽原基を含む組織の集合体。
[11] 前記二次増殖工程後、得られた不定芽原基を含む組織を発芽用培地にて培養し、不定芽と球根を形成する工程をさらに含む、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
(1) カタクリ属植物の超未熟種子を不定胚誘導用培地にて培養し、不定胚組織を誘導する工程、
(2) 工程(1)で誘導した不定胚組織を不定胚増殖用培地にて18℃以下で培養し、不定芽原基を含む組織を形成する一次増殖工程、及び
(3) 工程(2)で形成された不定芽原基を含む組織を分割し、分割塊を不定胚増殖用培地にて10〜18℃でさらに培養し、不定芽原基を含む組織を増殖する二次増殖工程、
を含む。以下、各工程について説明する。
工程(1)では、カタクリ属植物の超未熟種子を不定胚誘導用培地にて培養することにより、不定胚組織を誘導する。
工程(2)では、工程(1)で誘導した不定胚組織を不定胚増殖用培地にて18℃以下で培養し、不定芽原基を含む組織を形成させる(一次増殖工程)。ここで形成される不定芽原基を含む組織の重量は、その後分割して培養(二次増殖)させるため、0.5g以上であることが好ましい。
工程(3)では、工程(2)で形成された不定芽原基を含む組織を分割し、分割塊を不定胚増殖用培地にて10〜18℃でさらに培養し、不定芽原基を含む組織を増殖させる(二次増殖工程)。本工程により、不定芽原基を含む組織の集合体又は細胞塊を得ることができる。また、本工程で得られた不定芽原基を含む組織を再度分割し、新たな不定胚増殖用培地にて同培養を繰り返すことによって、不定芽原基を含む組織を連続的に得ることもできる。
超未熟種子、未熟種子、完熟種子の成熟ステージの異なる種子を用いて不定胚への誘導を行った。カタクリ群生地より、閉花後の子房又は果実(さく果)を採取し、それより超未熟種子、未熟種子、完熟種子を取り出して実験に供した。超未熟種子(受精後間もない早期の胚珠)として、閉花後約1週間の1.5〜2cmの子房中にある大きさが縦長約3mm、横幅約1mmの胚珠(図1)を使用した。未熟種子として、閉花後約3週間の2〜3cmの子房中にある大きさが縦長5mm以上、横幅2mm以下の胚珠を使用した。完熟種子は、閉花後40〜50日目頃の果実が割れる前のもので、種子の大きさは縦長5mm以上、横幅3mm以上の充実したものを使用した。
超未熟種子から誘導された不定胚組織を一次増殖用培地(1/2MS培地を基本とし、ショ糖30g/L、支持体としてジェランガム2g/Lを加え、ナフタレン酢酸(NAA)NAA1.0mg/mL、BA2.0mg/mL、ジベレリンA3(GA3)0.2mg/mLを添加した培地)に移して20℃で培養したが、3ヶ月で少し大きくなったものの、その後5ヶ月まで培養を継続してもほとんどが停止するような状態であった。また、不定胚組織の形態は様々であった(図4)。そこで誘導された不定胚組織を上記と同じ一次増殖用培地にて6℃の低温で培養したところ、4〜5ヶ月で緩慢であったが確実に大きくなることが確認できた(図5)。よって、以下、分割が可能な大きさで、不定芽原基を含む組織(以下、「不定芽原基組織」という)の増殖(二次増殖)のための培養温度及び培地に添加する植物ホルモンの組み合わせの条件について検討を行った。
6℃の低温培養で大きくなってきた個体のなかで分割が可能な大きさである重量が約0.8〜1gの3系統(系統名BE1、BE2、BE3)をそれぞれメスで3〜4分割し、得られた分割塊をシャーレ内の二次増殖用培地に置床し、培養した。二次増殖用培地としては、1/2MS培地を基本とし、ショ糖30g/L、支持体としてジェランガム2g/Lを加え、ナフタレン酢酸(NAA)1.0mg/mL、ベンジルアデニン(BA)2.0mg/mL、ジベレリンA3(GA3)0.2mg/mLを添加した培地を用いた。培養は、暗所にて14℃で行い、分割塊(不定芽原基組織)の増殖が可能かどうかを検討した。培養3ヶ月後、肉眼で2倍以上の大きさになった時点での1塊の重量を測定した。測定結果を表3に示す。
二次増殖用培地として、1/2MS培地を基本とし、ショ糖30g/L、支持体としてジェランガム2g/Lを加え、表4に示す濃度でナフタレン酢酸(NAA)、ベンジルアデニン(BA)、ジベレリンA3(GA3)を添加した培地(実験区ME1〜5)を用いた。シャーレ内の同増殖用培地に、分割後14℃で繰り返し増殖が認められた上記系統を含む複数の個体から得た分割塊を1シャーレ当たり3〜4塊置床し、暗所にて14℃で3ヶ月培養し、分割塊(不定芽原基組織)の増殖に及ぼす二次増殖用培地中のホルモンの組み合わせの影響を調べた。
二次増殖用培地として、1/2MS培地を基本とし、ショ糖30g/L、支持体としてジェランガム2g/Lを加え、ナフタレン酢酸(NAA)1.0mg/mL、ベンジルアデニン(BA)2.0mg/mL、ジベレリンA3(GA3)0.2mg/mLを添加した培地(上記実験区ME4の培地)を用いた。シャーレ内の同増殖用培地に、分割後14℃で繰り返し増殖が認められた上記系統を含む複数の個体から得た分割塊を1シャーレ当たり3〜4塊置床し、表5に示す各温度で暗所にて3ヶ月培養し、分割塊(不定芽原基組織の増殖に及ぼす培養温度の影響を調べた。
分割塊から増殖(二次増殖)した不定芽原基組織を発芽用培地(1/2MS培地を基本とし、ショ糖30g/L、支持体としてジェランガム2g/Lを加え、ベンジルアデニン(BA)1.0mg/mLを添加した培地)において照明下(約300lx)で培養したところ、2ヶ月で不定芽が伸長し、さらには基部に1塊当たり数個の球根を形成することが確認できた(図7)。
Claims (11)
- 以下の工程:
(1) カタクリ属植物の超未熟種子を不定胚誘導用培地にて培養し、不定胚組織を誘導する工程、
(2) 工程(1)で誘導した不定胚組織を不定胚増殖用培地にて18℃以下で培養し、不定芽原基を含む組織を形成する一次増殖工程、及び
(3) 工程(2)で形成された不定芽原基を含む組織を分割し、分割塊を不定胚増殖用培地にて10〜18℃でさらに培養し、不定芽原基を含む組織を増殖する二次増殖工程、
を含む、カタクリ属植物の組織培養による増殖方法。 - 前記超未熟種子が、閉花後5〜10日の子房中にある未熟胚珠である、請求項1に記載の方法。
- 前記超未熟種子の培養を、暗所にて15〜25℃で4〜6ヶ月行う、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記不定胚誘導用培地が、植物ホルモンとしてジベレリン類単独、ジベレリン類とオーキシン類との組み合わせ、又はジベレリン類とオーキシン類とサイトカイニン類との組み合わせを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- ジベレリン類がGA3であり、オーキシン類がナフタレン酢酸(NAA)であり、サイトカイニン類がベンジルアデニン(BA)である、請求項4に記載の方法。
- 前記一次増殖工程の培養を、暗所にて4〜5ヶ月行い、前記二次増殖工程の培養を、暗所にて2〜3ヶ月行う、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一次増殖工程で形成された分割前の不定芽原基を含む組織が、0.5g以上である、請求項1〜6のいずれかに1項に記載の方法。
- 前記不定胚増殖用培地が、ジベレリン類とオーキシン類とサイトカイニン類との組み合わせを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ジベレリン類がGA3であり、オーキシン類がナフタレン酢酸(NAA)であり、サイトカイニン類がベンジルアデニン(BA)である、請求項8に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法で得られる不定芽原基を含む組織の集合体。
- 前記二次増殖工程後、得られた不定芽原基を含む組織を発芽用培地にて培養し、不定芽と球根を形成する工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
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