JP2021095350A

JP2021095350A - 繊維芽細胞増殖促進用組成物、皮膚コラーゲン産生促進用組成物、皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物、皮膚エラスチン産生促進用組成物、及び保湿性の改善用組成物

Info

Publication number: JP2021095350A
Application number: JP2019226467A
Authority: JP
Inventors: 丸山　広恵; Hiroe Maruyama; 広恵丸山
Original assignee: API Co Ltd
Current assignee: API Co Ltd
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-06-24

Abstract

【課題】優れた皮膚の繊維芽細胞の増殖性を示す繊維芽細胞増殖促進用組成物等を提供する。【解決手段】本発明の繊維芽細胞増殖促進用組成物、皮膚コラーゲン産生促進用組成物、皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物、皮膚エラスチン産生促進用組成物、及び保湿性の改善用組成物は、Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する。【選択図】なし

Description

本発明は、優れた皮膚繊維芽細胞の増殖性等を発揮する繊維芽細胞増殖促進用組成物、皮膚コラーゲン産生促進用組成物、皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物、皮膚エラスチン産生促進用組成物、及び保湿性の改善用組成物に関する。

一般に、ローヤルゼリーは、血圧降下作用、抗腫瘍作用、血清コレステロール低下作用、抗菌作用、放射線及び化学療法剤の副作用軽減作用、慢性疾患に対する作用等の種々の生理作用を有していることが知られている。したがって、従来よりローヤルゼリーは、健康食品のみならず、様々な食品、医薬品、化粧料等の用途にも用いられてきた。

また、近年、例えば特許文献１に開示されるように、ローヤルゼリーエキス抽出後の抽出溶媒に不溶性の画分に対して、中性プロテアーゼを作用させることにより得られるローヤルゼリーペプチドにおいて、抗酸化作用の向上効果等、生体に有用な作用の向上効果が見出されるようになった。

特開２００９−２９７７２号公報

本発明の目的とするところは、優れた皮膚繊維芽細胞の増殖性を示す繊維芽細胞増殖促進用組成物を提供することにある。
また、本発明の別の目的とするところは、優れた皮膚コラーゲン産生促進作用を示す皮膚コラーゲン産生促進用組成物を提供することにある。

また、本発明の別の目的とするところは、優れた皮膚ヒアルロン酸産生促進作用を示す皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物を提供することにある。
また、本発明の別の目的とするところは、優れた皮膚エラスチン産生促進作用を示す皮膚エラスチン産生促進用組成物を提供することにある。

また、本発明の別の目的とするところは、優れた保湿作用を示す保湿性の改善用組成物を提供することにある。

本発明は、特定のジペプチドが優れた皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用を発揮することを見出したことに基づくものである。
上記目的を達成するために、本発明の一態様の繊維芽細胞増殖促進用組成物では、Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の別の態様の皮膚コラーゲン産生促進用組成物は、Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の別の態様の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物は、Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の別の態様の皮膚エラスチン産生促進用組成物は、Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の別の態様の保湿性の改善用組成物は、Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。

本発明によれば、皮膚繊維芽細胞の増殖性に優れる。また、本発明によれば、皮膚コラーゲン産生促進作用に優れる。また、本発明によれば、皮膚ヒアルロン酸産生促進作用に優れる。また、本発明によれば、皮膚エラスチン産生促進作用に優れる。また、本発明によれば、保湿性の改善作用に優れる。

（第１実施形態）
以下、本発明の繊維芽細胞（線維芽細胞）増殖促進用組成物を具体化した一実施形態を説明する。本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物は、Ａｌａ−Ｌｅｕ（以下、「ＡＬ」という）及びＴｙｒ−Ｔｙｒ（以下、「ＹＹ」という）から選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する。これらの有効成分は、一種のジペプチドを使用してもよく、二種のジペプチドを組み合わせて使用してもよい。

また、これらのジペプチドは、天然由来のもの又は化学的に合成したもののいずれを用いてもよく、市販品を使用してもよい。ジペプチドを含む天然由来の素材そのものを有効成分として使用してもよいが、ジペプチドの含有比率を高めてジペプチド由来の作用を有効に発揮させる観点から、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を介して粗精製又は精製したものを使用することが好ましい。例えば、後述するローヤルゼリー（以下、「ＲＪ」という）にタンパク質分解酵素を用いて酵素処理したものが用いられる場合、処理物中において有効成分であるジペプチドの濃度を高めたものが用いられる。より具体的には、処理物中において固形分濃度として、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上である。

ジペプチドを天然由来のものから入手する場合、生ＲＪ及び乾燥ＲＪ（生ＲＪを凍結乾燥処理等により乾燥させて粉末化したもの）から選ばれる少なくとも一種が原料として用いられる。かかる原料中に含まれるＲＪタンパク質をタンパク質分解酵素を用いて酵素処理し、公知のクロマトグラフィーを用いて粗精製又は精製することにより得ることができる。

原料の生ＲＪ及び乾燥ＲＪの産地は、特に限定されず、例えば中国、台湾、日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、ブラジル等の南アメリカ諸国、及びニュージーランド、オーストラリア等のオセアニア諸国が挙げられる。

なお、原料は、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種から抽出溶媒を用いて得られる不溶性の分画を原料として使用してもよい。かかる不溶性の画分には、主としてＲＪ由来のタンパク質が高含有されている。抽出溶媒としては、親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒が使用される。親水性有機溶媒としては、例えばエタノール、メタノール、ブタノール及びプロパノール等の低級アルコール類、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類が挙げられる。一種の親水性有機溶媒を適用してもよく、二種以上の親水性有機溶媒を組み合わせて使用してもよい。含水親水性有機溶媒として例えば含水エタノールが使用される場合、抽出溶媒中におけるエタノールの濃度は、５０〜９９容量％が好ましく、８０〜９９容量％がより好ましく、９０〜９９容量％が最も好ましい。これらの抽出溶媒の添加量は、抽出効率の点から、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種を１重量部に対して１〜３０重量部が好ましく、２〜２０重量部がより好ましく、３〜１０重量部が最も好ましい。これらの抽出溶媒は、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種とともに混合及び撹拌される。抽出の温度は、溶媒の揮発を防ぐ点から、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。抽出の時間は、収率の点から、１〜２４時間が好ましく、１．５〜１２時間がより好ましく、２〜６時間がさらに好ましい。得られた抽出物は、溶媒に可溶性の画分と沈殿物からなる不溶性の画分から構成される。これらの可溶性画分と不溶性画分は、公知の方法、例えば濾過処理、遠心分離を用いることにより、容易に分離することができる。

タンパク質分解酵素としては、至適ｐＨを中性付近（好ましくはｐＨ５．０〜８．５、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５）に有する中性プロテアーゼを使用することが好ましい。中性プロテアーゼとして、ペプチドの途中から分解するエンド型プロテアーゼを適用することが好ましい。

中性プロテアーゼとして、具体的には、バチルス・サブティリス由来の中性プロテアーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（バチルス・サーモプロテオライティクス・ロッコ）由来の中性プロテアーゼであるサーモリシン、アスペルギルス・オリザエ由来の中性プロテアーゼ等を挙げることができる。これらの中で、有効成分であるジペプチドの産生に優れる観点からバチルス・サブティリスのエンド型中性プロテアーゼが好ましい。

ＲＪの酵素処理は、原料ＲＪを所定量の水又は緩衝液に、溶解又は分散させた酵素反応液が用いられる。酵素反応液のｐＨは、使用する酵素の至適ｐＨ付近に調整するのが好ましい。中性プロテアーゼを使用する場合、酵素処理液のｐＨは好ましくは５．０〜８．５、より好ましくは６．５〜７．５、さらに好ましくは６．８〜７．２に調整される。酵素反応液は、粘度上昇を十分に抑え、酵素処理を迅速に進行させる観点、及び次の乾燥処理を効率的に行う観点から、原料の質量に対して好ましくは１〜１０倍量、より好ましくは１．５〜６倍量の水又は緩衝液が使用される。酵素処理の時間は、反応温度、酵素の力価等により適宜設定されるが、効果の発現を高める観点及び経済性の観点から、好ましくは０．１〜２４時間、より好ましくは０．５〜１６時間である。なお、このタンパク質分解酵素処理は、酵素処理後に酵素反応液を直ちに７５〜１００℃で５〜６０分間加熱して前記プロテアーゼを失活させることが望ましい。

公知のクロマトグラフィーとしては、例えば液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等が挙げられる。液体クロマトグラフィーとしては、例えばカラムクロマトグラフィーを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィーを挙げることができる。クロマトグラフィー担体としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー（順相・逆相クロマトグラフィー）、吸着クロマトグラフィー、及び分子排斥クロマトグラフィー（ゲル濾過・分子篩クロマトグラフィー）が挙げられる。それらを適宜組み合わせて、公知の使用方法で有効成分であるジペプチドを精製することができる。

本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物は、皮膚繊維芽細胞の増殖を促進する作用を有する。皮膚繊維芽細胞の増殖促進により、皮膚繊維芽細胞によって産生される細胞外マトリックス、例えば皮膚の弾力性に寄与するコラーゲン、保湿成分であるヒアルロン酸、及びコラーゲンの線維を支え、皮膚の弾力性に寄与するエラスチンの増加が期待される。加齢に伴い、又は皮膚が紫外線及び活性酸素等に曝されると繊維芽細胞が減少することが知られている。それにより、繊維芽細胞によってもたらされるコラーゲン等の細胞外マトリックスも減少し、老化現象、例えば真皮の厚みの減少、皮膚のしわ及びたるみの発生、はりの消失、並びに保湿性の低下が生じる。本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物により、皮膚の繊維芽細胞の増殖が促進されると、しわやたるみの防止、はりの消失の防止、及び皮膚の保湿性の向上が期待され、優れた皮膚の老化防止・改善効果が発揮される。

また、皮膚組織が損傷した場合、損傷部位から繊維芽細胞が遊走・増殖し、細胞外マトリックスの合成により、損傷箇所が修復されることが知られている。本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物により、皮膚繊維芽細胞の増殖が促進されると、皮膚組織の損傷修復が促進され、治癒が早まることが期待される。

本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物の具体的な適用形態としては、上記の作用効果を得ることを目的とした飲食品、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、研究用試薬等として適用することができる。本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物を飲食品、皮膚外用剤、及び化粧品として適用する場合は、従来品と区別するために、上記作用・効果、例えば皮膚繊維芽細胞の増殖促進、しわやたるみの防止、はりの消失の防止、皮膚の保湿性の向上、老化防止・改善、及び皮膚創傷治癒促進等の効果を得ることを目的とする旨の表示を付すことが好ましい。

本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物は、好ましくは飲食品に適用される。飲食品とする場合、繊維芽細胞増殖促進用組成物を飲食品そのものとして、又は種々の食品素材若しくは飲料品素材に配合して使用できる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状のいずれであってもよく、また剤形としては、粉末、所定形状の顆粒、錠剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセル）、ドリンク剤のいずれであってもよい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。また、飲食品の用途としては、特に限定されず、いわゆる一般食品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品、機能性表示食品、病者用食品として適用できる。

本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物を化粧品に適用する場合、化粧品基材に配合することにより製造することができる。化粧品の形態は、乳液状、クリーム状、粉末状などのいずれであってもよい。このような化粧品を肌に適用することにより、皮膚の繊維芽細胞増殖促進作用を得ることができる。化粧品基剤は、一般に化粧品に共通して配合されるものであって、例えば、油分、精製水及びアルコールを主要成分として、界面活性剤、保湿剤、酸化防止剤、増粘剤、抗脂漏剤、血行促進剤、美白剤、ｐＨ調整剤、色素顔料、防腐剤及び香料から選択される少なくとも一種が適宜配合される。

本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物を皮膚外用剤、医薬用素材、又は医薬品として使用する場合は、各用途に応じて、皮膚への塗布、服用（経口摂取）により投与する場合の他、皮下注射、血管内投与、経皮投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。また、本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物を繊維芽細胞増殖促進用の試薬の形態で実験用・研究用試薬として適用してもよい。皮膚繊維芽細胞が関係する生理作用のメカニズムの解明又は各種症状の治療法等の研究・開発等の分野において、好適に用いられる。

本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物の作用及び効果について説明する。
（１）本実施形態の繊維芽細胞増殖促進用組成物は、優れた皮膚繊維芽細胞増殖促進作用を発揮する。したがって、皮膚繊維芽細胞増殖促進作用の発揮を目的とした飲食品、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、研究用試薬等の分野に好ましく適用することができる。

（２）ジペプチドとして天然由来の原料であるＲＪから得られたものである場合、安全に飲食品、皮膚外用剤、化粧品、医薬品等の分野に適用することができる。
（第２実施形態）
以下、本発明の皮膚コラーゲン産生促進用組成物を具体化した第２実施形態を説明する。本実施形態の皮膚コラーゲン産生促進用組成物は、ＡＬ及びＹＹから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する。これらの有効成分は、一種のジペプチドを使用してもよく、二種のジペプチドを組み合わせて使用してもよい。これらのジペプチドの入手方法は、第１実施形態と同一である。

本実施形態の皮膚コラーゲン産生促進用組成物は、皮膚において、特に繊維芽細胞においてコラーゲン産生を促進する作用を有する。加齢に伴い繊維芽細胞が減少したり、又は紫外線及び活性酸素等で変性することにより皮膚コラーゲンが減少することが知られている。それにより、老化現象、例えば真皮の厚みの減少、皮膚のしわ及びたるみの発生、はりの消失、並びに保湿性の低下が生じる。本実施形態の皮膚コラーゲン産生促進用組成物により、皮膚コラーゲンの産生が促進されると、しわやたるみの防止、はりの消失の防止、及び皮膚の保湿性の向上が期待され、優れた皮膚の老化防止・改善効果が発揮される。

また、皮膚組織が損傷した場合、損傷部位において繊維芽細胞が、コラーゲンを合成することにより、損傷箇所が修復されることが知られている。本実施形態の皮膚コラーゲン産生促進用組成物により、皮膚のコラーゲン産生が促進されると、皮膚組織の損傷修復を促進し、治癒を早めることが期待される。

本実施形態の皮膚コラーゲン産生促進用組成物の具体的な配合形態としては、上記の作用効果を得ることを目的とした飲食品、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、研究用試薬等として適用することができる。これらの中で、本実施形態の皮膚コラーゲン産生促進用組成物は飲食品として適用されることが好ましい。本実施形態の皮膚コラーゲン産生促進用組成物を飲食品、皮膚外用剤、化粧品として適用する場合は、従来品と区別するために、上記作用・効果、例えば皮膚コラーゲン産生促進、しわやたるみの防止、はりの消失の防止、皮膚の保湿性の向上、老化防止・改善、及び皮膚創傷治癒促進等の効果を得ることを目的とする旨の表示を付すことが好ましい。その他、具体的な適用形態の構成は、第１実施形態と同一である。

本実施形態の皮膚コラーゲン産生促進用組成物の作用及び効果について説明する。
（３）本実施形態の皮膚コラーゲン産生促進用組成物は、優れた皮膚コラーゲン産生促進作用を発揮する。したがって、皮膚コラーゲン産生促進作用の発揮を目的とした飲食品、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、研究用試薬等の分野に好ましく適用することができる。

（第３実施形態）
以下、本発明の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物を具体化した第３実施形態を説明する。本実施形態の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物は、ＡＬ及びＹＹから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する。これらの有効成分は、一種のジペプチドを使用してもよく、二種のジペプチドを組み合わせて使用してもよい。これらのジペプチドの入手方法は、第１実施形態と同一である。

本実施形態の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物は、皮膚において、特に繊維芽細胞においてヒアルロン酸産生を促進する作用を有する。加齢に伴い繊維芽細胞が減少したり、又は紫外線及び活性酸素等で変性することにより皮膚ヒアルロン酸が減少することが知られている。それにより、老化現象、例えば真皮の厚みの減少、皮膚のしわ及びたるみの発生、はりの消失、並びに保湿性の低下が生じる。本実施形態の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物により、皮膚のヒアルロン酸の産生が促進されると、しわやたるみの防止、はりの消失の防止、及び皮膚の保湿性の向上が期待され、優れた皮膚の老化防止・改善効果が発揮される。

また、皮膚組織が損傷した場合、損傷部位において繊維芽細胞が、ヒアルロン酸を合成することにより、損傷箇所が修復されることが知られている。本実施形態の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物により、皮膚ヒアルロン酸産生が促進されると、皮膚組織の損傷修復を促進し、治癒を早めることが期待される。

本実施形態の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物の具体的な配合形態としては、上記の作用効果を得ることを目的とした飲食品、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、研究用試薬等として適用することができる。これらの中で、本実施形態の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物は飲食品として適用されることが好ましい。本実施形態の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物を飲食品、皮膚外用剤、化粧品として適用する場合は、従来品と区別するために、上記作用・効果、例えば皮膚ヒアルロン酸産生促進、しわやたるみの防止、はりの消失の防止、皮膚の保湿性の向上、老化防止・改善、及び皮膚創傷治癒促進等の効果を得ることを目的とする旨の表示を付すことが好ましい。その他、具体的な適用形態の構成は、第１実施形態と同一である。

本実施形態の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物の作用及び効果について説明する。
（４）本実施形態の皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物は、優れた皮膚ヒアルロン酸産生促進作用を発揮する。したがって、皮膚ヒアルロン酸産生促進作用の発揮を目的とした飲食品、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、研究用試薬等の分野に好ましく適用することができる。

（第４実施形態）
以下、本発明のエラスチン産生促進用組成物を具体化した第４実施形態を説明する。本実施形態の皮膚エラスチン産生促進用組成物は、ＡＬ及びＹＹから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する。これらの有効成分は、一種のジペプチドを使用してもよく、二種のジペプチドを組み合わせて使用してもよい。これらのジペプチドの入手方法は、第１実施形態と同一である。

本実施形態の皮膚エラスチン産生促進用組成物は、皮膚において、特に繊維芽細胞においてエラスチン産生を促進する作用を有する。加齢に伴い繊維芽細胞が減少したり、又は紫外線及び活性酸素等で変性することにより皮膚エラスチンが減少することが知られている。それにより、老化現象、例えば真皮の厚みの減少、皮膚のしわ及びたるみの発生、はりの消失、並びに保湿性の低下が生じる。本実施形態の皮膚エラスチン産生促進用組成物により、皮膚のエラスチンの産生が促進されると、しわやたるみの防止、はりの消失の防止、及び皮膚の保湿性の向上が期待され、優れた皮膚の老化防止・改善効果が発揮される。

本実施形態の皮膚エラスチン産生促進用組成物の具体的な配合形態としては、上記の作用効果を得ることを目的とした飲食品、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、研究用試薬等として適用することができる。これらの中で、本実施形態の皮膚エラスチン産生促進用組成物は飲食品として適用されることが好ましい。本実施形態の皮膚エラスチン産生促進用組成物を飲食品、皮膚外用剤、化粧品として適用する場合は、従来品と区別するために、上記作用・効果、例えば皮膚エラスチン産生促進、しわやたるみの防止、はりの消失の防止、皮膚の保湿性の向上、老化防止・改善等の効果を得ることを目的とする旨の表示を付すことが好ましい。その他、具体的な適用形態の構成は、第１実施形態と同一である。

本実施形態の皮膚エラスチン産生促進用組成物の作用及び効果について説明する。
（５）本実施形態の皮膚エラスチン産生促進用組成物は、優れた皮膚エラスチン産生促進作用を発揮する。したがって、皮膚エラスチン産生促進作用の発揮を目的とした飲食品、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、研究用試薬等の分野に好ましく適用することができる。

尚、上記実施形態は、以下のように変更して実施できる。上記実施形態及び以下の変更例は、技術的に矛盾しない範囲で互いに組み合わせて実施できる。
・上記実施形態における有効成分として用いられるジペプチドは、繊維芽細胞増殖促進作用、皮膚コラーゲン産生促進作用、皮膚ヒアルロン酸産生促進作用、及び皮膚エラスチン産生促進作用を有する。そのため、さらにＡＬ及びＹＹから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分とする保湿性の改善用組成物として構成してもよい。また、ＡＬ及びＹＹから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分とする皮膚の老化防止・改善用組成物として構成してもよい。また、ＡＬ及びＹＹから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分とする皮膚創傷治癒促進用組成物として構成してもよい。

・上記実施形態において、ジペプチドを経口摂取する場合、摂取量の下限は、特に限定されないが、好ましくは成人１日当たりジペプチドの固形分として１μｇ以上、より好ましくは１０μｇ以上、さらに好ましくは１００μｇ以上である。一方、摂取量の上限は、特に限定されないが、好ましくは成人１日当たりジペプチドの固形分として５ｇ以下、より好ましくは１ｇ以下である。

以下に実施例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜試験例１：ヒト皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用の評価１＞
（１）評価する試験品
（実施例１）
実施例１として、ジペプチドＡＬ（Ａｌａ−Ｌｅｕ）、及びＹＹ（Ｔｙｒ−Ｔｙｒ）の混合物を使用した。ジペプチドは、純度９５％以上の標準品（市販品）を使用した。ジペプチドの混合比（質量比）は、ＡＬ：ＹＹ＝１：０．３〜３とした。

（２）使用細胞及び培養
正常ヒト線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts [NHDF]、TAKARA社製）を使用した。線維芽細胞増殖培地２（Supplement Pack; TAKARA社製）の中の血清（終濃度0.02mL/mL）及びインスリン（終濃度5μg/mL）を、基礎培地（PromoCell社製）に添加したものを基本培地として使用した。また、抗生物質としてペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンＢ懸濁液（和光純薬工業社製）を使用した。事前に試験を行い、抗生物質が増殖に影響を及ぼさないことを確認した（data not shown）。

NHDFの基礎培養は、培養フラスコ（培養面積25cm²、又は75cm²）に終濃度が1〜2×10⁴ cells/mL、全量8〜20mLとなるよう基礎培地で調整し、CO₂インキュベーター（37℃、CO₂ 5%）内で、3〜5日程度培養して必要細胞数を確保した。

（３）試験品溶液の調製
実施例１の試験品は、DMSO（final:50%DMSO溶液）に溶解し、120mg/mLとした。
試験品の濃度域は、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001、0.0003mg/mLとした。

（４）細胞増殖能評価
培養したNHDFをTrypsin処理により培養フラスコから回収し、細胞数をカウントした。
細胞を基礎培地で懸濁し、細胞濃度が2×10⁴cells/mLの細胞懸濁液を調製した。

調製した細胞懸濁液を培養プレート（24well）の適量の半量（0.5mL）を播種し、CO₂インキュベーター（37℃、CO₂ 5%）にて培養を行った。１wellあたりの細胞数は、1×10⁴個であった。

今回の細胞は、１時間ほどで完全に接着するのが顕微鏡下で確認できたので、被験品の添加は、播種後３時間後に行った。
各用量の試験品を含む基礎培地を半量重層し、さらに３日間培養を継続した。陽性対照には、細胞増殖活性を有するFGF（最終用量：3、1、0.3、0.1ng/mL）を用いた。

３日間培養後、培地を一旦回収し、残った細胞にWST-8を基本培地100μLに対して10μL添加した溶液500μL添加し、３時間のインキュベーション（37℃、CO₂ 5%）を行い、生細胞によって生成したホルマザン色素を450nmにて測定し、細胞増殖活性（n=4）を算出した。コントロールを１００％とした場合の細胞数相対比として示した。結果を表１に示す。尚、表中の＊は、細胞増殖が有意に高かった（p＜0.05）用量を示している。

表１に示されるように、ジペプチドを添加した実施例１は、濃度依存的に細胞増殖性が向上することが確認された。なお、1mg/mLの場合、DMSOによる影響があったものと思われる。

＜試験例２：ヒト皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用の評価２＞
（１）評価する試験品（実施例２，３）
実施例２として、ジペプチドＡＬ（Ａｌａ−Ｌｅｕ）を使用した。

実施例３として、ジペプチドＹＹ（Ｔｙｒ−Ｔｙｒ）を使用した。
ジペプチドは、それぞれ純度９５％以上の標準品（市販品）を使用した。
（２）使用細胞及び培養
正常ヒト線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts [NHDF]、TAKARA社製）を使用した。試験例１と同様に培養した。

（３）試験品溶液の調製
実施例２，３の試験品は、まずDMSO（final:50%DMSO溶液）に溶解し、その後、蒸留水で試験品の濃度域を0.3、0.1、0.03、0.01mg/mLに調製した。なお、試験品0.3mg/mLの場合、DMSOを0.3%含有する。

調製した細胞懸濁液を培養プレート（96well）の適量の半量（100μl）を播種し、CO₂インキュベーター（37℃、CO₂5%）にて一晩前培養を行った。
各試験品を含む基礎培地をさらに半量重層し、さらに5日間培養を続けた。陽性対照には、FGF（最終用量：3、1、0.3、0.1ng/mL）を用いた。

培養後、培地を一旦回収し、残った細胞にCell Counter Kit-8 Assay（WST-8試薬、同仁化学研究所社製）を基本培地100μLに対して10μL添加した溶液500μL添加し、３時間のインキュベーション（37℃、CO₂ 5%）を行い、生細胞によって生成したホルマザン色素を450nmにて測定し、細胞増殖活性（n=4）を算出した。コントロールを１００％とした場合の細胞数相対比として示した。結果を表２に示す。尚、表中の＊は、細胞増殖が有意に高かった（p＜0.05）用量を示している。

表２に示されるように、実施例２，３のジペプチドともに、濃度依存的に細胞増殖性が向上することが確認された。表には示していないが、実施例２のジペプチドは、3mg/mlの用量において、DMSOによる細胞毒性に対する保護作用も認められた（溶媒コントロールとの有意差あり）。

＜試験例３：保湿、弾性、バリア機能に関する遺伝子発現の評価＞
（１）評価する試験品
試験品として、試験例１の実施例１の試料を使用した。また、試験例１の細胞増殖能を有する陽性対照として使用したFGFも使用した。

（２）使用細胞及び培養
正常ヒト線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts [NHDF]、TAKARA社製）を使用した。試験例１の細胞増殖能評価方法と同様に試験品を投与し、培養後の細胞を回収し、-80℃にて保管した。

（３）RNAの採取とcDNAの作製
（ａ）-80℃にて保管した細胞に対して、SuperPrep II Cell Lysis & RT Kit for qPCR(TOYOBO社製）を用いて、凍結細胞の溶解とｃDNAの調製を行った。

（ｂ）G3PDH（ハウスキーピングgene）を用いて、cDNA量を調整し、下記の項目についてPCRを行い、対象と比較した。アガロースゲル電気泳動法にて行った。
（ｃ）候補遺伝子は、下記の通りである。

コラーゲンTypeI、コラーゲンTypeIII、コラーゲンTypeIV、エラスチン、ヒアルロン酸合成酵素（HAS2）の５遺伝子とした。
プライマーの設計は、Primer3(v.0.4.0)（タルトゥ大学の生命情報学部のサイト（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）にて利用可能に公開されているPCR用プライマー設計ツール）を用いて行った。

PCRは、GoTaq G2 Hot Start Green Master MIX（プロメガ社製）を使用した。
尚、PCR産物の同定（配列決定）は行わず、PCR産物のサイズの確認により行った。
アガロース電気泳動後、SYBR Green I（TAKARA社製）にて染色した。PCR産物の電気泳動像のイメージから、その強度（Intensity）をImageJ（アメリカ国立衛生研究所のサイト（https://imagej.nih.gov/ij/）からダウンロード可能な画像解析ソフトウェア）を用いて定量化した。結果を表３に示す。

コラーゲンType IIIは、コントロールの４倍程度の発現量が認められた。コラーゲンTypeIVは、コントロールに比べて発現量の増大が最大で４倍程度認められた。エラスチンは、コントロールに比べて発現量の増大が最大で４倍程度認められた。ヒアルロン酸合成酵素（HAS2）は、コントロールの２倍程度の発現を認められた。

以上のように、各遺伝子の発現量を比較するとFGFとは異なり、いくつかの遺伝子の発現を用量依存的に調節することが確認された。これらの結果から、本発明のジペプチドは、肌の保湿や柔軟性に寄与することが期待される。

次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、それらの効果とともに以下に追記する。
（イ）Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドは、ＲＪ由来のタンパク質を中性プロテアーゼを用いて酵素処理し、固形分濃度として０．００１質量％以上に粗精製したものが適用される前記皮膚繊維芽細胞増殖促進用組成物、前記皮膚コラーゲン産生促進用組成物、前記皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物、前記皮膚エラスチン産生促進用組成物、又は保湿性の改善用組成物。

（ロ）Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する皮膚の老化防止・改善用組成物、又は皮膚創傷治癒促進用組成物。

Claims

Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する繊維芽細胞増殖促進用組成物。
Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する皮膚コラーゲン産生促進用組成物。
Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する皮膚ヒアルロン酸産生促進用組成物。
Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する皮膚エラスチン産生促進用組成物。
Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＴｙｒ−Ｔｙｒから選ばれる少なくとも一種のジペプチドを有効成分として含有する保湿性の改善用組成物。