JP2021073989A - 細胞の培養方法、培養液の製造方法、培養液及び培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】３次元細胞を効率的に且つ多量に生産すること。【解決手段】発熱素子１０を発熱させて液体Ｗと発熱素子の界面に膜沸騰を生じさせることにより生成されたウルトラファインバブル１１を含む培養液６０２を用い、細胞６０３を培養する。【選択図】図１２

Description

本発明は、画像処理方法及び画像処理装置に関する。

再生医療分野においては、ヒト細胞を培養することで作製されたスフェロイドやオルガノイドのような３次元細胞が有望視されている。３次元細胞の移植は、既定部位に移植した際に細胞同士が足場構造を形成するため、単細胞や２次元細胞の移植に比べてアポトーシスが起こりにくく、移植後の細胞生存率が高いことが利点となっている。

近年では、分化万能性を有するＥＳ細胞や多能性幹細胞であるｉｐｓ細胞などを、未分化の状態から３次元浮遊培養し更に分化誘導する過程において、スフェロイドやオルガノイドが有用されている。そして、このようなスフェロイドやオルガノイドにおいては、長期に安定可能で所望のサイズを有するものを、確実に且つ多量に生産することが、求められている。非特許文献１には、細胞スフェロイドの有用性および様々な作製方法が開示されている。

特許第６１１８５４４号公報 特許第４４５６１７６号公報

「細胞スフェロイド化技術の開発と細胞治療への応用」Drug Delivery System 28-1, P45-53, 2013

しかしながら、３次元培養の過程においては、３次元細胞がある程度の大きさになると、内側の細胞に酸素が十分に供給されず、壊死（ネクローシス）してしまう傾向がある。このため、様々な培養方法が考案されてはいるものの、このような壊死がボトルネックとなり、３次元細胞を効率的に且つ多量に生産することは困難な状況であった。また、３次元細胞だけではなく、２次元細胞についても更に効率的にかつ多量に生産することが求められていた。

本発明は上記問題点を解消するためになされたものである。よってその目的とするところは、２次元細胞または３次元細胞を効率的に且つ多量に生産することが可能な培養方法、培養液の製造方法、培養液及び培養装置を提供することである。

そのために本発明は、発熱素子を発熱させて液体と前記発熱素子の界面に膜沸騰を生じさせることにより生成されたウルトラファインバブルを含む培養液を用い、細胞を培養すること特徴とする。

本発明によれば、２次元細胞または３次元細胞を効率的に且つ多量に生産することが可能となる。

ＵＦＢ生成装置の一例を示す図である。 前処理ユニットの概略構成図である。 溶解ユニットの概略構成図及び液体の溶解状態を説明するための図である。 Ｔ−ＵＦＢ生成ユニットの概略構成図である。 発熱素子の詳細を説明するための図である。 発熱素子における膜沸騰の様子を説明するための図である。 膜沸騰泡の膨張に伴ってＵＦＢが生成される様子を示す図である。 膜沸騰泡の収縮に伴ってＵＦＢが生成される様子を示す図である。 液体の再加熱によってＵＦＢが生成される様子を示す図である。 膜沸騰で生成される泡の消泡時の衝撃波によってＵＦＢが生成される様子を示す図である。 後処理ユニットの構成例を示す図である。 第１の実施形態の第１の実施例を比較例と共に示す図である。 Ｔ−ＵＦＢの凝集と分散の様子を説明するための模式図である。 スフェロイドとオルガノイドの違いを説明するための模式図である。 第１の実施形態の第２の実施例を示す図である。 第１の実施形態の第３の実施例を示す図である。 第２の実施形態で用いる培養装置の概略構成図である。 第２の実施形態で用いる培養装置の変形例を示す図である。

[第１の実施形態]
近年、直径がマイクロメートルサイズのマイクロバブル、及び直径がナノメートルサイズのナノバブル等の微細なバブルの特性を応用する技術が開発されてきている。特に、直径が１．０μｍ未満のウルトラファインバブル（Ｕｌｔｒａ Ｆｉｎｅ Ｂｕｂｂｌｅ；以下、「ＵＦＢ」ともいう）については、その有用性が様々な分野において確認されている。

特許文献１には、気体が加圧溶解された加圧液を減圧ノズルから噴出させることによって、微細なバブルを生成する微細気泡生成装置が開示されている。また、特許文献２には、混合ユニットを用いて気体混合液体の分流と合流を繰り返すことによって、微細なバブルを生成する装置が開示されている。

このようなＵＦＢは、再生医療の分野でもその活用が期待される。しかしながら、本発明者らの検討によれば、特許文献１や特許文献２に開示される方法で生成されたＵＦＢは、長期間の保存が困難であることが確認された。

＜＜ＵＦＢ生成装置の構成＞＞
図１は、本実施形態に適用可能なＵＦＢ生成装置の一例を示す図である。本実施形態のＵＦＢ生成装置１は、前処理ユニット１００、溶解ユニット２００、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００、後処理ユニット４００、及び回収ユニット５００を含む。前処理ユニット１００に供給された水道水などの液体Ｗは、上記の順番で各ユニット固有の処理が施され、Ｔ−ＵＦＢ含有液として回収ユニット５００で回収される。以下、各ユニットの機能及び構成について説明する。

図２は、前処理ユニット１００の概略構成図である。本実施形態の前処理ユニット１００は、供給された液体Ｗに対し脱気処理を行う。前処理ユニット１００は、主に、脱気容器１０１、シャワーヘッド１０２、減圧ポンプ１０３、液体導入路１０４、液体循環路１０５、液体導出路１０６を有する。例えば水道水のような液体Ｗは、バルブ１０９を介して、液体導入路１０４から脱気容器１０１に供給される。この際、脱気容器１０１に設けられたシャワーヘッド１０２が、液体Ｗを霧状にして脱気容器１０１内に噴霧する。シャワーヘッド１０２は、液体Ｗの気化を促すためのものであるが、気化促進効果を生み出す機構としては、遠心分離器なども代替可能である。

ある程度の液体Ｗが脱気容器１０１に貯留された後、全てのバルブを閉じた状態で減圧ポンプ１０３を作動させると、既に気化している気体成分が排出されるとともに、液体Ｗに溶解している気体成分の気化と排出も促される。この際、脱気容器１０１の内圧は、圧力計１０８を確認しながら数百〜数千Ｐａ（１．０Ｔｏｒｒ〜１０．０Ｔｏｒｒ）程度に減圧されればよい。脱気ユニット１００によって脱気される気体としては、例えば窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素などが含まれる。

以上説明した脱気処理は、液体循環路１０５を利用することにより、同じ液体Ｗに対して繰り返し行うことができる。具体的には、液体導入路１０４のバルブ１０９と液体導出路１０６のバルブ１１０を閉塞し、液体循環路１０５のバルブ１０７を開放した状態で、シャワーヘッド１０２を作動させる。これにより、脱気容器１０１に貯留され、脱気処理が一度行われた液体Ｗは、再びシャワーヘッド１０２を介して脱気容器１０１に噴霧される。更に、減圧ポンプ１０３を作動させることにより、シャワーヘッド１０２による気化処理と減圧ポンプ１０３による脱気処理が、同じ液体Ｗに対し重ねて行われることになる。そして、液体循環路１０５を利用した上記繰り返し処理を行う度に、液体Ｗに含まれる気体成分を段階的に減少させていくことができる。所望の純度に脱気された液体Ｗが得られると、バルブ１１０を開放することにより、液体Ｗは液体導出路１０６を経て溶解ユニット２００に送液される。

なお、図２では、気体部を低圧にして溶解物を気化させる脱気ユニット１００を示したが、溶解した液体を脱気させる方法はこれに限らない。例えば、液体Ｗを煮沸して溶解物を気化させる加熱煮沸法を採用してもよいし、中空糸を用いて液体と気体の界面を増大させる膜脱気方法を採用してもよい。中空糸を用いた脱気モジュールとしては、ＳＥＰＡＲＥＬシリーズ（大日本インキ社製）が市販されている。これは、中空糸膜の原料にポリ４−メチルペンテン−１（ＰＭＰ）を用いて、主にピエゾヘッド向けに供給するインクなどから気泡を脱気する目的で使用されている。更に、真空脱気法、加熱煮沸法、及び膜脱気方法の２つ以上を併用してもよい。

以上のような脱気処理を前処理として行うことにより、後述する溶解処理では、所望の気体の液体Ｗに対する純度および溶解度を高めることができる。さらに、後述するＴ−ＵＦＢ生成ユニットでは、液体Ｗに含まれる所望のＵＦＢの純度を高めることができる。すなわち、溶解ユニット２００およびＴ−ＵＦＢ生成ユニット３００の前に前処理ユニット１００を設けることにより、純度の高いＵＦＢ含有液を効率的に生成することが可能となる。

図３（ａ）及び（ｂ）は、溶解ユニット２００の概略構成図及び液体の溶解状態を説明するための図である。溶解ユニット２００は、前処理ユニット１００より供給された液体Ｗに対し所望の気体を溶解させるユニットである。本実施形態の溶解ユニット２００は、主に、溶解容器２０１、回転板２０２が取り付けられた回転シャフト２０３、液体導入路２０４、気体導入路２０５、液体導出路２０６、及び加圧ポンプ２０７を有する。

前処理ユニット１００より供給された液体Ｗは、液体導入路２０４より、溶解容器２０１に供給され貯留される。一方、気体Ｇは気体導入路２０５より溶解容器２０１に供給される。

所定量の液体Ｗと気体Ｇが溶解容器２０１に貯留されると、加圧ポンプ２０７を作動し溶解容器２０１の内圧を０．５Ｍｐａ程度まで上昇させる。加圧ポンプ２０７と溶解容器２０１の間には安全弁２０８が配されている。また、回転シャフト２０３を介して液中の回転板２０２を回転させることにより、溶解容器２０１に供給された気体Ｇを気泡化し、液体Ｗとの接触面積を大きくし、液体Ｗ中への溶解を促進する。そしてこのような作業を、気体Ｇの溶解度がほぼ最大飽和溶解度に達するまで継続する。この際、可能な限り多くの気体を溶解させるために、液体の温度を低下させる手段を配してもよい。また、難溶解性の気体の場合は、溶解容器２０１の内圧を０．５ＭＰａ以上に上げる事も可能である。その場合は、安全面から容器の材料などを最適にする必要がある。

気体Ｇの成分が所望の濃度で溶解された液体Ｗが得られると、液体Ｗは液体導出路２０６を経由して排出され、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００に供給される。この際、背圧弁２０９は、供給時の圧力が必要以上に高くならないように液体Ｗの流圧を調整する。

図３（ｂ）は、溶解容器２０１で混入された気体Ｇが溶解していく様子を模式的に示す図である。液体Ｗ中に混入された気体Ｇの成分を含む気泡２は、液体Ｗに接触している部分から溶解する。このため、気泡２は徐々に収縮し、気泡２の周囲には気体溶解液体３が存在する状態となる。気泡２には浮力が作用するため、気泡２は気体溶解液体３の中心から外れた位置に移動したり、気体溶解液体３から分離して残存気泡４となったりする。すなわち、液体導出路２０６を介してＴ−ＵＦＢ生成ユニット３００に供給される液体Ｗには、気体溶解液体３が気泡２を囲った状態のものや、気体溶解液体３と気泡２が互いに分離した状態のものが混在している。

なお、図において気体溶解液体３とは、「液体Ｗ中において、混入された気体Ｇの溶解濃度が比較的高い領域」を意味している。実際に液体Ｗに溶解している気体成分においては、気泡２の周囲や、気泡２と分離した状態であっても領域の中心で濃度が最も高く、その位置から離れるほど気体成分の濃度は連続的に低くなる。すなわち、図３（ｂ）では説明のために気体溶解液体３の領域を破線で囲っているが、実際にはこのような明確な境界が存在するわけではない。また、本実施形態においては、完全に溶解しない気体が、気泡の状態で液体中に存在しても許容される。

図４は、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００の概略構成図である。Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００は、主に、チャンバー３０１、液体導入路３０２、液体導出路３０３を備え、液体導入路３０２からチャンバー３０１内を経て液体導出路３０３に向かう流れが、不図示の流動ポンプによって形成されている。流動ポンプとしては、ダイヤフラムポンプ、ギアポンプ、スクリューポンプなど各種ポンプを採用することができる。液体導入路３０２から導入される液体Ｗには、溶解ユニット２００によって混入された気体Ｇの気体溶解液体３が混在している。

チャンバー３０１の底面には発熱素子１０が設けられた素子基板１２が配されている。発熱素子１０に所定の電圧パルスが印加されることにより、発熱素子１０に接触する領域に膜沸騰により生じる泡１３（以下、膜沸騰泡１３ともいう）が発生する。そして、膜沸騰泡１３の膨張や収縮に伴って気体Ｇを含有するウルトラファインバブル（ＵＦＢ１１）が生成される。その結果、液体導出路３０３からは多数のＵＦＢ１１が含まれたＵＦＢ含有液Ｗが導出される。

図５（ａ）及び（ｂ）は、発熱素子１０の詳細構造を示す図である。図５（ａ）は発熱素子１０の近傍、同図（ｂ）は発熱素子１０を含むより広い領域の素子基板１２の断面図をそれぞれ示している。

図５（ａ）に示すように、本実施形態の素子基板１２は、シリコン基板３０４の表面に、蓄熱層としての熱酸化膜３０５と、蓄熱層を兼ねる層間膜３０６と、が積層されている。層間膜３０６としては、ＳｉＯ２膜、または、ＳｉＮ膜を用いることができる。層間膜３０６の表面には抵抗層３０７が形成され、その抵抗層３０７の表面に、配線３０８が部分的に形成されている。配線３０８としては、Ａｌ、Ａｌ−Ｓｉ、またはＡｌ−ＣｕなどのＡｌ合金配線を用いることができる。これらの配線３０８、抵抗層３０７、及び、層間膜３０６の表面には、ＳｉＯ₂膜、またはＳｉ₃Ｎ₄膜から成る保護層３０９が形成されている。

保護層３０９の表面において、結果的に発熱素子１０となる熱作用部３１１に対応する部分、及び、その周囲には、抵抗層３０７の発熱に伴う化学的、及び物理的な衝撃から保護層３０９を保護するための耐キャビテーション膜３１０が形成されている。抵抗層３０７の表面において、配線３０８が形成されていない領域は、抵抗層３０７が発熱する熱作用部３１１である。配線３０８が形成されていない抵抗層３０７の発熱部分は、発熱素子（ヒータ）１０として機能する。このように素子基板１２における層は、半導体の製造技術によってシリコン基板３０４の表面に順次に形成され、これにより、シリコン基板３０４に熱作用部３１１が備えられる。

なお、図に示す構成は一例であり、その他の各種構成が適用可能である。例えば、抵抗層３０７と配線３０８との積層順が逆の構成、及び抵抗層３０７の下面に電極を接続させる構成（所謂プラグ電極構成）が適用可能である。つまり、後述するように、熱作用部３１１により液体を加熱して、液体中に膜沸騰を生じさせることができる構成であればよい。

図５（ｂ）は、素子基板１２において、配線３０８に接続される回路を含む領域の断面図の一例である。Ｐ型導電体であるシリコン基板３０４の表層には、Ｎ型ウェル領域３２２、及び、Ｐ型ウェル領域３２３が部分的に備えられている。一般的なＭＯＳプロセスによるイオンインプランテーションなどの不純物の導入、及び拡散によって、Ｎ型ウェル領域３２２にＰ−ＭＯＳ３２０が形成され、Ｐ型ウェル領域３２３にＮ−ＭＯＳ３２１が形成される。

Ｐ−ＭＯＳ３２０は、Ｎ型ウェル領域３２２の表層に部分的にＮ型あるいはＰ型の不純物を導入してなるソース領域３２５及びドレイン領域３２６と、ゲート配線３３５などから構成されている。ゲート配線３３５は、ソース領域３２５及びドレイン領域３２６を除くＮ型ウェル領域３２２の部分の表面に、厚さ数百Åのゲート絶縁膜３２８を介して堆積されている。

Ｎ−ＭＯＳ３２１は、Ｐ型ウェル領域３２３の表層に部分的にＮ型あるいはＰ型の不純物を導入してなるソース領域３２５及びドレイン領域３２６と、ゲート配線３３５などから構成されている。ゲート配線３３５は、ソース領域３２５及びドレイン領域３２６を除くＰ型ウェル領域３２３の部分の表面に、厚さ数百Åのゲート絶縁膜３２８を介して堆積されている。ゲート配線３３５は、ＣＶＤ法により堆積された厚さ３０００Å〜５０００Åのポリシリコンからなる。これらのＰ−ＭＯＳ３２０及びＮ−ＭＯＳ３２１によって、Ｃ−ＭＯＳロジックが構成される。

Ｐ型ウェル領域３２３において、Ｎ−ＭＯＳ３２１と異なる部分には、電気熱変換素子（発熱抵抗素子）の駆動用のＮ−ＭＯＳトランジスタ３３０が形成されている。Ｎ−ＭＯＳトランジスタ３３０は、不純物の導入及び拡散などの工程によりＰ型ウェル領域３２３の表層に部分的に形成されたソース領域３３２及びドレイン領域３３１と、ゲート配線３３３などから構成されている。ゲート配線３３３は、Ｐ型ウェル領域３２３におけるソース領域３３２及びドレイン領域３３１を除く部分の表面に、ゲート絶縁膜３２８を介して堆積されている。

本例においては、電気熱変換素子の駆動用トランジスタとして、Ｎ−ＭＯＳトランジスタ３３０を用いた。しかし、その駆動用トランジスタは、複数の電気熱変換素子を個別に駆動する能力を持ち、かつ、上述したような微細な構造を得ることができるトランジスタであればよく、Ｎ−ＭＯＳトランジスタ４３０には限定されない。また本例においては、電気熱変換素子と、その駆動用トランジスタと、が同一基板上に形成されているが、これらは、別々の基板に形成してもよい。

Ｐ−ＭＯＳ３２０とＮ−ＭＯＳ３２１との間、及びＮ−ＭＯＳ３２１とＮ−ＭＯＳトランジスタ３３０との間等の各素子間には、５０００Å〜１００００Åの厚さのフィールド酸化により酸化膜分離領域３２４が形成されている。この酸化膜分離領域３２４によって各素子が分離されている。酸化膜分離領域３２４において、熱作用部３１１に対応する部分は、シリコン基板３０４上の一層目の蓄熱層３３４として機能する。

Ｐ−ＭＯＳ３２０、Ｎ−ＭＯＳ３２１、及びＮ−ＭＯＳトランジスタ３３０の各素子の表面には、ＣＶＤ法により、厚さ約７０００ÅのＰＳＧ膜、またはＢＰＳＧ膜などから成る層間絶縁膜３３６が形成されている。層間絶縁膜３３６を熱処理により平坦にした後に、層間絶縁膜３３６及びゲート絶縁膜３２８を貫通するコンタクトホールを介して、第１の配線層となるＡｌ電極３３７が形成される。層間絶縁膜３３６及びＡｌ電極３３７の表面には、プラズマＣＶＤ法により、厚さ１００００Å〜１５０００ÅのＳｉＯ２膜から成る層間絶縁膜３３８が形成される。層間絶縁膜３３８の表面において、熱作用部３１１及びＮ−ＭＯＳトランジスタ３３０に対応する部分には、コスパッタ法により、厚さ約５００ÅのＴａＳｉＮ膜から成る抵抗層３０７が形成される。抵抗層３０７は、層間絶縁膜３３８に形成されたスルーホールを介して、ドレイン領域３３１の近傍のＡｌ電極３３７と電気的に接続される。抵抗層３０７の表面には、各電気熱変換素子への配線となる第２の配線層としてのＡｌの配線３０８が形成される。配線３０８、抵抗層３０７、及び層間絶縁膜３３８の表面の保護層３０９は、プラズマＣＶＤ法により形成された厚さ３０００ÅのＳｉＮ膜から成る。保護層３０９の表面に堆積された耐キャビテーション膜３１０は、Ｔａ、Ｆｅ，Ｎｉ，Ｃｒ，Ｇｅ，Ｒｕ，Ｚｒ，Ｉｒ等から選択される少なくとも１つ以上の金属であり、厚さ約２０００Åの薄膜から成る。抵抗層３０７としては、上述したＴａＳｉＮ以外のＴａＮ０．８、ＣｒＳｉＮ、ＴａＡｌ、ＷＳｉＮ等、液体中に膜沸騰を生じさせることができるものであれば各種材料が適用可能である。

図６（ａ）及び（ｂ）は、発熱素子１０に所定の電圧パルスを印加した場合の膜沸騰の様子を示す図である。ここでは、大気圧のもとでの膜沸騰を生じさせた場合を示している。図６（ａ）において、横軸は時間を示す。また、下段のグラフの縦軸は発熱素子１０に印加される電圧を示し、上段のグラフの縦軸は膜沸騰により発生した膜沸騰泡１３の体積と内圧を示す。一方、図６（ｂ）は、膜沸騰泡１３の様子を、図６（ａ）に示すタイミング１〜３に対応づけて示している。以下、時間に沿って各状態を説明する。

発熱素子１０に電圧が印加される前、チャンバー３０１内はほぼ大気圧が保たれている。発熱素子１０に電圧が印加されると、発熱素子１０に接する液体に膜沸騰が生じ、発生した気泡（以下、膜沸騰泡１３と称す）は内側から作用する高い圧力によって膨張する（タイミング１）。このときの発泡圧力は約８〜１０ＭＰａとみなされ、これは水の飽和蒸気圧に近い値である。

電圧の印加時間（パルス幅）は０．５ｕｓｅｃ〜１０．０ｕｓｅｃ程度であるが、電圧が印加されなくなった後も、膜沸騰泡１３はタイミング１で得られた圧力の慣性によって膨張する。但し、膜沸騰泡１３の内部では膨張に伴って発生した負圧力が徐々に大きくなり、膜沸騰泡１３を収縮する方向に作用する。やがて慣性力と負圧力が釣り合ったタイミング２で膜沸騰泡１３の体積は最大となり、その後は負圧力によって急速に収縮する。

膜沸騰泡１３が消滅する際、膜沸騰泡１３は発熱素子１０の全面ではなく、１箇所以上の極めて小さな領域で消滅する。このため、発熱素子１０においては、膜沸騰泡１３が消滅する極めて小さな領域に、タイミング１で示す発泡時よりも更に大きな力が発生する（タイミング３）。

以上説明したような膜沸騰泡１３の発生、膨張、収縮及び消滅は、発熱素子１０に電圧パルスが印加されるたびに繰り返され、そのたびに新たなＵＦＢ１１が生成される。

次に、膜沸騰泡１３の発生、膨張、収縮及び消滅の各過程において、ＵＦＢ１１が生成される様子を更に詳しく説明する。

図７（ａ）〜（ｄ）は、膜沸騰泡１３の発生及び膨張に伴ってＵＦＢ１１が生成される様子を示す図である。図７（ａ）は、発熱素子１０に電圧パルスが印加される前の状態を示している。チャンバー３０１の内部には、気体溶解液体３が混在した液体Ｗが流れている。

図７（ｂ）は、発熱素子１０に電圧が印加され、液体Ｗに接している発熱素子１０のほぼ全域で膜沸騰泡１３が一様に発生した様子を示している。電圧が印加されたとき、発熱素子１０の表面温度は１０℃／μｓｅｃ以上の速度で急激に上昇し、ほぼ３００℃に達した時点で膜沸騰が起こり、膜沸騰泡１３が生成される。

発熱素子１０の表面温度は、その後もパルスの印加中に６００〜８００℃程度まで上昇し、膜沸騰泡１３の周辺の液体も急激に加熱される。図では、膜沸騰泡１３の周辺に位置し、急激に加熱される液体の領域を未発泡高温領域１４として示している。未発泡高温領域１４に含まれる気体溶解液体３は熱的溶解限界を超えて析出しＵＦＢとなる。析出した気泡の直径は１０ｎｍ〜１００ｎｍ程度であり、高い気液界面エネルギを有している。そのため、短時間で消滅することもなく液体Ｗ内で独立を保ながら浮遊する。本実施形態では、このように膜沸騰泡１３の膨張時に熱的作用によって生成される気泡を第１のＵＦＢ１１Ａと称す。

図７（ｃ）は、膜沸騰泡１３が膨張する過程を示している。発熱素子１０への電圧パルスの印加が終了しても、膜沸騰泡１３は発生したときに得た力の慣性によって膨張を続け、未発泡高温領域１４も慣性によって移動及び拡散する。すなわち、膜沸騰泡１３が膨張する過程において、未発泡高温領域１４に含まれた気体溶解液体３が新たに気泡となって析出し、第１のＵＦＢ１１Ａとなる。

図７（ｄ）は、膜沸騰泡１３が最大体積となった状態を示している。膜沸騰泡１３は慣性によって膨張するが、膨張に伴って膜沸騰泡１３の内部の負圧は徐々に高まり、膜沸騰泡１３を収縮しようとする負圧力として作用する。そして、この負圧力が慣性力と釣り合った時点で、膜沸騰泡１３の体積は最大となり、以後収縮に転じる。

図８（ａ）〜（ｃ）は、膜沸騰泡１３の収縮に伴ってＵＦＢ１１が生成される様子を示す図である。図８（ａ）は、膜沸騰泡１３が収縮を開始した状態を示している。膜沸騰泡１３が収縮を開始しても、周囲の液体Ｗには膨張する方向の慣性力が残っている。よって、膜沸騰泡１３の極周囲には、発熱素子１０から離れる方向に作用する慣性力と、膜沸騰泡１３の収縮に伴って発熱素子１０に向かう力とが作用し、減圧された領域となる。図では、そのような領域を未発泡負圧領域１５として示している。

未発泡負圧領域１５に含まれる気体溶解液体３は、圧的溶解限界を超え、気泡として析出する。析出した気泡の直径は１００ｎｍ程度であり、その後短時間で消滅することもなく液体Ｗ内で独立を保ながら浮遊する。本実施形態では、このように膜沸騰泡１３が収縮する際の圧力的作用によって析出する気泡を、第２のＵＦＢ１１Ｂと称す。

図８（ｂ）は、膜沸騰泡１３が収縮する過程を示している。膜沸騰泡１３が収縮する速度は負圧力によって加速し、未発泡負圧領域１５も膜沸騰泡１３の収縮に伴って移動する。すなわち、膜沸騰泡１３が収縮する過程において、未発泡負圧領域１５が通過する箇所の気体溶解液体３が次々に析出し、第２のＵＦＢ１１Ｂとなる。

図８（ｃ）は、膜沸騰泡１３が消滅する直前の様子を示している。膜沸騰泡１３の加速度的な収縮により、周囲の液体Ｗの移動速度も増大するが、チャンバー３０１内の流路抵抗によって圧力損失が生じる。その結果、未発泡負圧領域１５が占める領域は更に大きくなり、多数の第２のＵＦＢ１１Ｂが生成される。

図９（ａ）〜（ｃ）は、膜沸騰泡１３の収縮時において、液体Ｗの再加熱によってＵＦＢが生成される様子を示す図である。図９（ａ）は、発熱素子１０の表面が収縮する膜沸騰泡１３に被覆されている状態を示している。

図９（ｂ）は、膜沸騰泡１３の収縮が進み、発熱素子１０の表面の一部が液体Ｗに接触した状態を示している。このとき発熱素子１０の表面には、液体Ｗが接しても膜沸騰には到らないほどの熱が残っている。図では、発熱素子１０の表面に接することにより加熱される液体の領域を未発泡再加熱領域１６として示している。膜沸騰には到らないものの、未発泡再加熱領域１６に含まれる気体溶解液体３は、熱的溶解限界を超えて析出する。本実施形態では、このように膜沸騰泡１３が収縮する際の液体Ｗの再加熱によって生成される気泡を第３のＵＦＢ１１Ｃと称す。

図９（ｃ）は、膜沸騰泡１３の収縮が更に進んだ状態を示している。膜沸騰泡１３が小さくなるほど、液体Ｗに接する発熱素子１０の領域が大きくなるため、第３のＵＦＢ１１Ｃは、膜沸騰泡１３が消滅するまで生成される。

図１０（ａ）および（ｂ）は、膜沸騰で生成された膜沸騰泡１３の消泡時の衝撃（所謂、キャビテーションの一種）によって、ＵＦＢが生成される様子を示す図である。図１０（ａ）は、膜沸騰泡１３が消滅する直前の様子を示している。膜沸騰泡１３は内部の負圧力によって急激に収縮し、その周囲を未発泡負圧領域１５が覆う状態となっている。

図１０（ｂ）は、膜沸騰泡１３が点Ｐで消滅した直後の様子を示している。膜沸騰泡１３が消泡するとき、その衝撃により音響波が点Ｐを起点として同心円状に広がる。音響波とは、気体、液体、固体を問わず伝播する弾性波の総称であり、本実施形態においては、液体Ｗの粗密、すなわち液体Ｗの高圧面１７Ａと低圧面１７Ｂ、とが交互に伝播される。

この場合、未発泡負圧領域１５に含まれる気体溶解液体３は、膜沸騰泡１３の消泡時の衝撃波によって共振され、低圧面１７Ｂが通過するタイミングで圧的溶解限界を超えて相転移する。すなわち、膜沸騰泡１３の消滅と同時に、未発泡負圧領域１５内には多数の気泡が析出する。本実施形態ではこのような膜沸騰泡１３が消泡する時の衝撃波によって生成される気泡を第４のＵＦＢ１１Ｄと称す。

膜沸騰泡１３の消泡時の衝撃波よって生成される第４のＵＦＢ１１Ｄは、極めて狭い薄膜的領域に極めて短時間（１μＳ以下）で突発的に出現する。直径は第１〜第３のＵＦＢよりも十分小さく、第１〜第３のＵＦＢよりも気液界面エネルギが高い。このため、第４のＵＦＢ１１Ｄは、第１〜第３のＵＦＢ１１Ａ〜１１Ｃとは異なる性質を有し異なる効果を生み出すものと考えられる。

また、第４のＵＦＢ１１Ｄは、衝撃波が伝播する同心球状の領域のいたる所で一様に発生するため、生成された時点からチャンバー３０１内に一様に存在することになる。第４のＵＦＢ１１Ｄが生成されるタイミングでは、第１〜第３のＵＦＢが既に多数存在しているが、これら第１〜第３のＵＦＢの存在が第４のＵＦＢ１１Ｄの生成に大きく影響することはない。また、第４のＵＦＢ１１Ｄの発生によって第１〜第３のＵＦＢが消滅することもない。

以上説明したように発熱素子１０の発熱により膜沸騰泡１３が発生し消泡するまでの複数の段階においてＵＦＢ１１が発生する。上述した例では膜沸騰泡１３が消泡するまでの例を示したがＵＦＢを発生させるためにはこれに限られない。例えば、発生した膜沸騰泡１３が消泡する前に大気と連通することで、膜沸騰泡１３が消耗まで至らない場合においてもＵＦＢの生成が可能である。

次にＵＦＢの残存特性について説明する。液体の温度が高いほど気体成分の溶解特性は低くなり、温度が低いほど気体成分の溶解特性は高くなる。すなわち、液体の温度が高いほど、溶解している気体成分の相転移が促され、ＵＦＢが生成されやすくなる。液体の温度と気体の溶解度は反比例の関係にあり、液体の温度上昇により、飽和溶解度を超えた気体が気泡になって液体中に析出される。

このため、液体の温度が常温から急激に上昇すると溶解特性が一気に下がり、ＵＦＢが生成され始める。そして、温度が上がるほど熱的溶解特性は下がり、多くのＵＦＢが生成される状況となる。

反対に液体の温度が常温から下降すると、気体の溶解特性は上昇し、生成されたＵＦＢは液化しやすくなる。しかしながら、このような温度は、常温よりも十分に低い。更に、液体の温度が下がっても、一度発生したＵＦＢは高い内圧と高い気液界面エネルギを有するため、この気液界面を破壊するほどの高い圧力が作用する可能性は極めて低い。すなわち、一度生成されたＵＦＢは、液体を常温常圧で保存する限り、簡単に消滅することはない。

本実施形態において、図７（ａ）〜（ｃ）で説明した第１のＵＦＢ１１Ａ、及び図９（ａ）〜（ｃ）で説明した第３のＵＦＢ１１Ｃは、このような気体の熱的溶解特性を利用して生成されたＵＦＢと言える。

一方、液体の圧力と溶解特性の関係においては、液体の圧力が高いほど気体の溶解特性は高くなり、圧力が低いほど溶解特性は低くなる。すなわち液体の圧力が低いほど、液体に溶解している気体溶解液体の気体への相転移が促され、ＵＦＢが生成されやすくなる。液体の圧力が常圧から下がると、溶解特性が一気に下がり、ＵＦＢが生成され始める。そして、圧力が下がるほど圧的溶解特性は下がり、多くのＵＦＢが生成される状況となる。

反対に液体の圧力が常圧から上昇すると、気体の溶解特性は上昇し、生成されたＵＦＢは液化しやすくなる。しかしながら、このような圧力は、大気圧よりも十分に高く、更に、液体の圧力が上がっても、一度発生したＵＦＢは高い内圧と高い気液界面エネルギを有するため、この気液界面を破壊するほどの高い圧力が作用する可能性は極めて低い。すなわち、一度生成されたＵＦＢは、液体を常温常圧で保存する限り、簡単に消滅することはない。

本実施形態において、図８（ａ）〜（ｃ）で説明した第２のＵＦＢ１１Ｂ、及び図１０（ａ）〜（ｃ）で説明した第４のＵＦＢ１１Ｄは、このような気体の圧力的溶解特性を利用して生成されたＵＦＢと言える。

以上では、生成される要因の異なる第１〜第４のＵＦＢを個別に説明してきたが、上述した生成要因は、膜沸騰という事象に伴って同時多発的に起こるものである。このため、第１〜第４のＵＦＢのうち少なくとも２種類以上のＵＦＢが同時に生成されることもあり、これら生成要因が互いに協働してＵＦＢを生成することもある。但し、いずれの生成要因も、膜沸騰現象によって招致されることは共通している。以下、本明細書では、このように急激な発熱に伴う膜沸騰を利用してＵＦＢを生成する方法を、Ｔ−ＵＦＢ（Ｔｈｅｒｍａｌ−Ｕｌｔｒａ Ｆｉｎｅ Ｂｕｂｂｌｅ）生成方法と称す。また、Ｔ−ＵＦＢ生成方法によって生成したＵＦＢをＴ−ＵＦＢ、Ｔ−ＵＦＢ生成方法によって生成されたＴ−ＵＦＢを含有する液体をＴ−ＵＦＢ含有液と称す。

Ｔ−ＵＦＢ生成方法によって生成される気泡はその殆どが１．０ｕｍ以下であり、ミリバブルやマイクロバブルは生成され難い。すなわち、Ｔ−ＵＦＢ生成方法によれば、ＵＦＢのみが効率的に生成されることになる。また、Ｔ−ＵＦＢ生成方法によって生成されたＴ−ＵＦＢは、従来法によって生成されたＵＦＢよりも高い気液界面エネルギを有し、常温常圧で保存する限り簡単に消滅することはない。更に、新たな膜沸騰によって新たなＴ−ＵＦＢが生成されても、先行して生成されていたＴ−ＵＦＢがその衝撃によって消滅することもない。つまり、Ｔ−ＵＦＢ含有液に含まれるＴ−ＵＦＢの数や濃度は、Ｔ−ＵＦＢ含有液における膜沸騰の発生回数に対しヒステリシス特性を有すると言える。言い替えると、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００に配する発熱素子の数や発熱素子に対する電圧パルスの印加回数を制御することにより、Ｔ−ＵＦＢ含有液に含まれるＴ−ＵＦＢの濃度を調整することができる。

再び図１を参照する。Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００において、所望のＵＦＢ濃度を有するＴ−ＵＦＢ含有液Ｗが生成されると、当該ＵＦＢ含有液Ｗは、後処理ユニット４００に供給される。

図１１（ａ）〜（ｃ）は、本実施形態の後処理ユニット４００の構成例を示す図である。本実施形態の後処理ユニット４００は、ＵＦＢ含有液Ｗに含まれる不純物を、無機物イオン、有機物、不溶固形物、の順に段階に除去する。

図１１（ａ）は、無機物イオンを除去するための第１の後処理機構４１０を示す。第１の後処理機構４１０は、交換容器４１１、陽イオン交換樹脂４１２、液体導入路４１３、集水管４１４及び液体導出路４１５を備えている。交換容器４１１には、陽イオン交換樹脂４１２が収容されている。Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００で生成されたＵＦＢ含有液Ｗは、液体導入路４１３を経由して交換容器４１１に注入され、陽イオン交換樹脂４１２に吸収され、ここで不純物としての陽イオンが除去される。このような不純物には、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００の素子基板１２より剥離した金属材料などが含まれ、例えばＳｉＯ₂、ＳｉＮ、ＳｉＣ、Ｔａ、Ａｌ₂Ｏ₃、Ｔａ₂Ｏ₅、Ｉｒが挙げられる。

陽イオン交換樹脂４１２は、三次元的な網目構造を持った高分子母体に官能基（イオン交換基）を導入した合成樹脂であり、合成樹脂は０．４〜０．７ｍｍ程度の球状粒子を呈している。高分子母体としては、スチレン−ジビニルベンゼンの共重合体が一般的であり、官能基としては例えばメタクリル酸系とアクリル酸系のものを用いることができる。但し、上記材料は一例である。所望の無機イオンを効果的に除去することができれば、上記材料は様々に変更可能である。陽イオン交換樹脂４１２に吸収され、無機イオンが除去されたＵＦＢ含有液Ｗは、集水管４１４によって集水され、液体導出路４１５を介して次の工程に送液される。

図１１（ｂ）は、有機物を除去するための第２の後処理機構４２０を示す。第２の後処理機構４２０は、収容容器４２１、ろ過フィルタ４２２、真空ポンプ４２３、バルブ４２４、液体導入路４２５、液体導出路４２６、及びエア吸引路４２７を備えている。収容容器４２１の内部は、ろ過フィルタ４２２によって上下２つの領域に分割されている。液体導入路４２５は、上下２つの領域のうち上方の領域に接続し、エア吸引路４２７及び液体導出路４２６は下方の領域に接続する。バルブ４２４を閉じた状態で真空ポンプ４２３を駆動すると、収容容器４２１内の空気がエア吸引路４２７を介して排出され、収容容器４２１の内部が負圧になり、液体導入路４２５よりＵＦＢ含有液Ｗが導入される。そして、ろ過フィルタ４２２によって不純物が除去された状態のＵＦＢ含有液Ｗが収容容器４２１に貯留される。

ろ過フィルタ４２２によって除去される不純物には、チューブや各ユニットで混合され得る有機材料が含まれ、例えばシリコンを含む有機化合物、シロキサン、エポキシなどが挙げられる。ろ過フィルタ４２２に使用可能なフィルタ膜としては、細菌系まで除去できるサブμｍメッシュのフィルタや、ウィルスまで除去できるｎｍメッシュのフィルタが挙げられる。

収容容器４２１にＵＦＢ含有液Ｗがある程度貯留された後、真空ポンプ４２３を停止してバルブ４２４を開放すると、収容容器４２１のＴ−ＵＦＢ含有液は液体導出路４２６を介して次の工程に送液される。なお、ここでは、有機物の不純物を除去する方法として真空ろ過法を採用したが、フィルタを用いたろ過方法としては、例えば重力ろ過法や加圧ろ過を採用することもできる。

図１１（ｃ）は、不溶の固形物を除去するための第３の後処理機構４３０を示す。第３の後処理機構４３０は、沈殿容器４３１、液体導入路４３２、バルブ４３３及び液体導出路４３４を備えている。

まず、バルブ４３３を閉じた状態で沈殿容器４３１に所定量のＵＦＢ含有液Ｗを液体導入路４３２より貯留し、しばらく放置する。この間、ＵＦＢ含有液Ｗに含まれている固形物は、重力によって沈殿容器４３１の底部に沈降する。また、ＵＦＢ含有液に含まれるバブルのうち、マイクロバブルのような比較的大きなサイズのバブルも浮力によって液面に浮上し、ＵＦＢ含有液から除去される。十分な時間が経過した後バルブ４３３を開放すると、固形物や大きなサイズのバブルが除去されたＵＦＢ含有液Ｗが液体導出路４３４を介して、回収ユニット５００に送液される。

再度図１を参照する。後処理ユニット４００で不純物が除去されたＴ−ＵＦＢ含有液Ｗは、そのまま回収ユニット５００に送液してもよいが、再び溶解ユニット２００に戻すこともできる。後者の場合、Ｔ−ＵＦＢの生成によって低下したＴ−ＵＦＢ含有液Ｗの気体溶解濃度を、溶解ユニット２００において再び飽和状態まで補填することができる。その上で新たなＴ−ＵＦＢをＴ−ＵＦＢ生成ユニット３００で生成すれば、上述した特性のもと、Ｔ−ＵＦＢ含有液のＵＦＢ含有濃度を更に上昇させることができる。すなわち、溶解ユニット２００、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００、後処理ユニット４００を巡る循環回数の分だけ、ＵＦＢ含有濃度を高めることができ、所望のＵＦＢ含有濃度が得られた後に、当該ＵＦＢ含有液Ｗを回収ユニット５００に送液することができる。

ここで、生成されたＴ−ＵＦＢ含有液Ｗを再び溶解ユニット２００に戻すことの効果について、本発明者らが具体的に検証した検証内容に従って簡単に説明する。まず、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００においては、素子基板１２に１００００個の発熱素子１０を配した。液体Ｗとしては工業用純水を用い、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００のチャンバー３０１の中を、１．０リットル／時の流速で流動させた。この状態で、個々の発熱素子に対し、電圧２４Ｖ、パルス幅１．０μｓの電圧パルスを、１０ＫＨｚの駆動周波数で印加した。

生成されたＴ−ＵＦＢ含有液Ｗを溶解ユニット２００に戻さず回収ユニット５００で回収した場合、すなわち循環回数を１回とした場合、回収ユニット５００で回収されたＴ−ＵＦＢ含有液Ｗには、１．０ｍＬあたり３６億個のＵＦＢが確認された。一方、Ｔ−ＵＦＢ含有液Ｗを溶解ユニット２００に戻す操作を１０回行った場合、すなわち循環回数を１０回とした場合、回収ユニット５００で回収されたＴ−ＵＦＢ含有液Ｗには、１．０ｍＬあたり３６０億個のＵＦＢが確認された。すなわち、ＵＦＢ含有濃度は、循環回数に比例して高くなることが確認された。なお、上記のようなＵＦＢの数密度については、島津製作所製の測定器（型番ＳＡＬＤ−７５００）を用い、所定体積のＵＦＢ含有液Ｗに含まれる直径１．０μｍ未満のＵＦＢ４１をカウントすることによって取得した。

回収ユニット５００は、後処理ユニット４００より送液されて来たＵＦＢ含有液Ｗを回収及び保存する。回収ユニット５００で回収されたＴ−ＵＦＢ含有液は、様々な不純物が除去された純度の高いＵＦＢ含有液となる。

回収ユニット５００においては、何段階かのフィルタリング処理を行い、ＵＦＢ含有液ＷをＴ−ＵＦＢのサイズごと分類してもよい。また、Ｔ−ＵＦＢ生成方法により得られるＴ−ＵＦＢ含有液Ｗは、常温よりも高温であることが予想されるため、回収ユニット５００には冷却手段を設けてもよい。なお、このような冷却手段は、後処理ユニット４００の一部に設けられていてもよい。

以上が、ＵＦＢ生成装置１の概略であるが、図示したような複数のユニットは無論変更可能であり、全てを用意する必要は無い。使用する液体Ｗや気体Ｇの種類、また生成するＴ−ＵＦＢ含有液の使用目的に応じて、上述したユニットの一部を省略してもよいし、上述したユニット以外に更に別のユニットを追加してもよい。

例えば、ＵＦＢに含有させる気体が大気である場合は、脱気ユニット１００や溶解ユニット２００を省略することができる。反対に、ＵＦＢに複数種類の気体を含ませたい場合は、溶解ユニット２００を更に追加してもよい。

また、図１に示した幾つかのユニットの機能は、１つのユニットに統合させることもできる。例えば、図３（ａ）および（ｂ）に示した溶解容器２０１の中に発熱素子１０を配することにより、溶解ユニット２００とＴ−ＵＦＢ生成ユニット３００とを統合させることができる。具体的には、気体溶解容器（高圧チャンバー）内に、電極タイプのＴ−ＵＦＢモジュールを内蔵させて、当該モジュール内に配した複数のヒータを駆動し、膜沸騰を発生させる。このようにすれば、１つのユニットの中で気体を溶解させながらその気体を含有するＴ−ＵＦＢを生成することができる。なお、この場合、Ｔ−ＵＦＢモジュールを気体溶解容器の底辺に配置しておくことにより、ヒータで生成された熱がマランゴリ対流を起こし、循環・攪拌手段を設けなくても容器内の液体をある程度攪拌することができる。

また、図１１（ａ）〜（ｃ）で示すような不純物を除去するための除去ユニットは、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００よりも上流に前処理ユニットの一部として設けてもよいし、上流と下流の両方に設けてもよい。ＵＦＢ生成装置に供給される液体が水道水や雨水、また汚染水などの場合は、液体中に有機系や無機系の不純物が含まれている事がある。そのような不純物を含んだ液体ＷをＴ−ＵＦＢ生成ユニット３００に供給すると、発熱素子１０を変質させたり、塩析現象を招致したりするおそれが生じる。図１１（ａ）〜（ｃ）で示すような機構をＴ−ＵＦＢ生成ユニット３００よりも上流に設けておくことにより、上記のような不純物を事前に除去し、より純度の高いＵＦＢ含有液をより効率的に生成することが可能となる。

特に、図１１（ａ）で示したイオン交換樹脂による不純物除去ユニットを、前処理ユニットに設ける場合は、陰イオン交換樹脂を配置するとＴ−ＵＦＢ水の効率的な生成に寄与する。何故なら、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００が生成するウルトラファインバブルは、負電荷を持つことが確認されているからである。そのため、前処理ユニットにおいて、同じ負電荷をもつ不純物を除去することで、純度の高いＴ−ＵＦＢ水を生成することができる。ここで使用する陰イオン交換樹脂としては、４級アンモニウム基を持つ強塩基性陰イオン交換樹脂や、１〜３級アミン基を持つ弱塩基性陰イオン交換樹脂の双方が適している。どちらが最適かは、使用する液体の種類に依存する。通常、水道水や純水などを液体として使用する場合は、後者の弱塩基性陰イオン交換樹脂のみで十分機能を満たすことができる。

＜＜Ｔ−ＵＦＢ含有液に使用可能な液体および気体＞＞
ここで、Ｔ−ＵＦＢ含有液を生成するために使用可能な液体Ｗについて説明する。本実施形態で使用可能な液体Ｗとしては、例えば、純水、イオン交換水、蒸留水、生理活性水、磁気活性水、化粧水、水道水、海水、川水、上下水、湖水、地下水、雨水などが挙げられる。また、これらの液体等を含む混合液体も使用可能である。また、水と水溶性有機溶剤との混合溶媒も使用できる。水と混合して使用される水溶性有機溶剤としては特に限定されないが、具体例として、以下のものを挙げることができる。メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどの炭素数１乃至４のアルキルアルコール類。Ｎ−メチル−２−ピロリドン、２−ピロリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなどのアミド類。アセトン、ジアセトンアルコールなどのケトン又はケトアルコール類。テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの環状エーテル類。エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール。１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオール、３−メチル−１，５−ペンタンジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、チオジグリコールなどのグリコール類。エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコールモノブチルエーテルなどの多価アルコールの低級アルキルエーテル類。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール類。グリセリン、１，２，６−ヘキサントリオール、トリメチロールプロパンなどのトリオール類。これらの水溶性有機溶剤は、単独で用いてもよく、または２種以上を併用してもよい。

溶解ユニット２００で導入可能な気体成分としては、例えば、水素、ヘリウム、酸素、窒素、メタン、フッ素、ネオン、二酸化炭素、オゾン、アルゴン、塩素、エタン、プロパン、空気、などが挙げられる。また、上記のいくつかを含む混合気体であってもよい。さらに、溶解ユニット２００では必ずしも気体状態にある物質を溶解させなくてもよく、所望の成分で構成される液体や固を液体Ｗに融解させてもよい。この場合の溶解としては、自然溶解のほか、圧力付与による溶解であってもよいし、電離による水和、イオン化、化学反応を伴う溶解であってもよい。

＜＜オゾンガスを用いた場合の具体例＞＞
ここで、一つの具体例として、オゾンガスを気体成分として用いる場合について説明する。まず、オゾンガスの生成方法としては、放電法、電解法、紫外線ランプ法が挙げられる。以下、これらを順番に説明する。

（１）放電法
放電法には無声放電法と沿面放電法がある。無声放電法では、平行平板状もしくは同軸円筒状に配置された一対の電極の間に酸素含有気体を流しつつ、交流高電圧をかける。これにより、酸素含有気体中に放電が生じ、オゾンガスが発生する。この一対の電極の表面は一方、もしくは双方がガラスなどの誘電体で被覆されている必要がある。放電はこの誘電体表面における電荷が正負交互に変動するのに伴って気体（空気もしくは酸素）中で発生する。

一方、沿面放電法は、平面状の電極の表面をセラミックスなどの誘電体で覆い、その誘電体の表面に線状の電極を配置して、平板状電極と線状電極の間に交流高電圧をかける。これにより、誘電体の表面に放電が生じオゾンガスが発生する。

（２）電解法
水中に電解質膜を挟んだ一対の電極を配置し、両極間に直流電圧をかける。これにより水の電気分解が起こり、酸素発生側に酸素と同時にオゾンガスが発生する。実用されているオゾン発生器としては、陰極に白金触媒層を持つ多孔質チタン、陽極にニ酸化鉛触媒層を持つ多孔質チタン、電解質膜にペルフルオルスルフォン酸陽イオン交換膜を用いたものなどがある。本装置によれば、２０重量％以上の高濃度オゾンを発生させることができる。

（３）紫外線ランプ法
地球のオゾン層が作られるのと同様の原理を利用し、紫外線を空気などにあててオゾンガスを発生させる。紫外線ランプとしては通常水銀ランプが使用される。

なお、オゾンガスを気体成分として用いる場合、以上説明した（１）〜（３）の方法を採用するオゾンガス生成ユニットは、図１のＵＦＢ生成装置１に更に追加してもよい。

次に、生成したオゾンガスの溶解方法について説明する。オゾンガスを液体Ｗ中に溶解させるのに適した方法としては、図３（ａ）および（ｂ）で示した加圧溶解法以外に、「気泡溶解法」、「隔膜溶解法」、「充填層溶解法」が挙げられる。以下に、これら３つの方法を比較しながら順番に説明する。

（ｉ）気泡溶解法
液体Ｗ中にオゾンガスを泡として混在させ、液体Ｗとともに流動させながら溶解する方法である。例えば、液体Ｗが貯留している容器の下部からオゾンガスを吹き込むバブリング法、液体Ｗを流動させる配管の一部に狭隘部を設け、狭隘部にオゾンガスを吹きこむエジェクター法、ポンプで液体Ｗとオゾンガスを攪拌する方法等がある。比較的コンパクトな溶解法であり、浄水場などでも有用されている。

（ｉｉ）隔膜溶解法
多孔質のテフロン膜に液体Ｗを流し、その外側にオゾンガスを流して、液体Ｗ中にオゾンガスを吸収および溶解させる方法である。

（ｉｉｉ）充填層溶解法
充填層の上部から液体Ｗを流し且つ下部からオゾンガスを流すことにより、オゾンガスと液体を向流させ、充填層内でオゾンガスを液体Ｗに溶解させる方法である。

なお、以上説明した（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法を採用する場合、ＵＦＢ生成装置１の溶解ユニット２００は、図３（ａ）および（ｂ）で示した構成のものから（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの方法を採用する構成のものに変更すればよい。

特に、純度の高いオゾンガスは、毒性が強いなどの観点から、特殊な環境を準備しない限り、ガスボンベでの購入や使用が制限されている。そのため、気体導入による従来のマイクロバブルやウルトラファインバブルの生成方法（例えば、ベンチュリー方式や旋回流方式、加圧溶解方式など）では、オゾンマイクロ・ウルトラファインバブルの生成が困難である。

一方、オゾン溶解水を生成する方法としては、前述の放電法、電解法や紫外線ランプ法によって供給される酸素からオゾンを生成し、同時に水などに溶解する方法が、安全且つ容易性の点から有用である。

但し、キャビテーション方式などでは、オゾン溶解水を元に、オゾンウルトラファインバブルの生成は可能であるが、装置が大型化し、且、オゾンウルトラファインバブルの濃度が高くできないなどの課題が残っている。

これに対し、Ｔ−ＵＦＢ生成方法は、比較的小型の装置の下で、オゾン溶解水から高濃度なオゾンウルトラファインバブルを生成できる点で、他の方法よりも優れていると言える。

＜＜Ｔ−ＵＦＢ生成方法の効果＞＞
次に、以上説明したＴ−ＵＦＢ生成方法の特徴と効果を、従来のＵＦＢ生成方法と比較して説明する。例えばベンチュリー方式に代表される従来の気泡生成装置においては、流路の一部に減圧ノズルのようなメカ的な減圧構造を設け、この減圧構造を通過するように所定の圧力で液体を流すことにより、減圧構造の下流の領域に様々なサイズの気泡を生成している。

この場合、生成された気泡のうち、ミリバブルやマイクロバブルのような比較的大きなサイズのバブルには浮力が作用するため、やがて液面に浮上して消滅してしまう。また、浮力が作用しないＵＦＢについても、然程大きな気液界面エネルギを有していないので、ミリバブルやマイクロバブルとともに消滅してしまう。加えて、上記減圧構造を直列に配置し、同じ液体を繰り返し減圧構造に流したとしても、その繰り返し回数に応じた数のＵＦＢを、長期間保存することはできない。すなわち、従来のＵＦＢ生成方法によって生成されたＵＦＢ含有液では、ＵＦＢ含有濃度を所定の値で長期間維持することは困難であった。

これに対し、膜沸騰を利用する本実施形態のＴ−ＵＦＢ生成方法では、常温から３００℃程度への急激な温度変化や、常圧から数メガパスカル程度への急激な圧力変化を、発熱素子の極近傍に局所的に生じさせている。当該発熱素子は、一辺が数十μｍ〜数百μｍ程度の四辺形をしている。従来のＵＦＢ発生器の大きさに比べると、１／１０〜１／１０００程度である。且つ、膜沸騰泡表面の極薄い膜領域に存在する気体溶解液体が、熱的溶解限界または圧力的溶解限界を瞬間的に（マイクロ秒以下の超短時間で）超えることにより、相転移が起こりＵＦＢとなって析出する。この場合、ミリバブルやマイクロバブルのような比較的大きなサイズのバブルは殆ど発生せず、液体には直径が１００ｎｍ程度のＵＦＢが極めて高い純度で含有される。更に、このように生成されたＴ−ＵＦＢは、十分に高い気液界面エネルギを有しているため、通常の環境下において破壊されにくく、長期間の保存が可能である。

特に、液体に対し局所的に気体界面を形成できる膜沸騰現象を用いた本実施形態であれば、液体領域全体に影響を与えることなく、液体の一部に界面形成し、それに伴う熱的、圧力的に作用する領域を極めて局所的な範囲とすることができる。その結果、安定的に所望のＵＦＢを生成することができる。また、液体を循環して生成液体に対し更にＵＦＢの生成条件を付与することで、既存のＵＦＢへの影響を少なく新たなＵＦＢを追加生成することができる。その結果、比較的容易に、所望のサイズ、濃度のＵＦＢ液体を製造することができる。

更に、Ｔ−ＵＦＢ生成方法においては、上述したヒステリシス特性を有するため、高い純度のまま所望の濃度まで含有濃度を高めていくことができる。すなわち、Ｔ−ＵＦＢ生成方法よれば、高純度、高濃度で且つ長期間保存可能なＵＦＢ含有液を、効率的に生成することができる。

本実施形態では、以上の方法で作成したＴ−ＵＦＢ含有液を、細胞の培養液として使用する。以下、Ｔ−ＵＦＢ含有液を用いた細胞培養について、いくつかの実施例を挙げて具体的に説明する。

（実施例１）
図１２（ａ）〜（ｃ）は、本実施形態のＴ−ＵＦＢ含有液を用いてスフェロイドを培養する様子を、比較例と共に示す図である。図１２（ａ）〜（ｃ）は、いずれもシャーレのような培養容器６０１に培養液６０２を貯留し、ヒト細胞の単一細胞６０３を浸し、所定の温度と湿度の下で一定期間静置した様子を示している。

単一細胞６０３の径は、約１〜１００μｍである。培養液６０２としては、液体培地を含むことが好ましい。また、液体培地は、アミノ酸類、無機塩類、及びビタミン類を含むことが好ましい。液体培地としては、アミノ酸をベースにした「ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）」ＡＫ０３培地（味の素社製）やＤＭＥＭ（富士フィルム和光純薬社製）などが使用可能である。また、培養液６０２は、動物性血清を含むことが好ましい。さらに、培養液６０２は、抗生物質を含むことが好ましい。動物性血清及び抗生物質としては、公知のものが使用可能である。培養液が酸素ＵＦＢを含む場合、培養液中の溶存酸素は過飽和状態であることが好ましい。また、培養液中の溶存酸素濃度は８．０ｐｐｍ以上であることが好ましい。なお、培養液中の溶存酸素は、溶存酸素濃度計（光学式溶存酸素濃度計、FDO Multi3510型（WTW（ダブリュ・ティ・ダブリュ社製）））によって測定することが可能である。通常、細胞培養は人間の体温と同じ程度の温度（約37℃）で行う事が多い。培養用のインキュベータ内で、溶存酸素濃度を測るために、少量で測れる携帯型の光学式タイプを選択した。溶存酸素濃度計（DO Meter）には、ガルバニ式（隔膜電極式）なども使用する事ができる。

図１２（ａ）は、一般的な培養容器６０１と培養液６０２を用いた場合を示している。単一細胞６０３は、培養液６０２より栄養分や酸素を吸収しながら増殖し、３次元細胞であるスフェロイド６０４を形成する。しかしながら、スフェロイド６０４がある程度の大きさになると、培養液６０２に接触し難い内側の細胞には、成長に必要な酸素が十分に供給されず、壊死（ネクローシス）してしまう傾向がある。培養中に培養液６０２を補充、交換することにより、このような壊死はある程度抑制できるものの、本発明者の観察によれば、培養液６０２を少なくとも１２時間おきに交換しても、一定時間が経過すると壊死細胞６０５が発生してしまう。

図１２（ｂ）は、培養容器６０１の底部を、酸素透過性の高い材料で形成した例を示している。このような材料としては、例えば、シリコン中空糸分離膜（ナガセップ：永柳工業製）のような気液分離膜や、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。

この場合、図１２（ａ）と比べると、培養液６０２が大気に曝される面積が増え、各細胞に酸素が供給されやすくなる。しかしながら、スフェロイド６０４の中心近傍に位置する細胞には、やはり十分な酸素は供給され難く、壊死細胞６０５が発生してしまう。

図１２（ｃ）は、本実施例の培養方法を示している。本実施例では、ＵＦＢ生成装置１で生成したウルトラファインバブル含有液と上記市販の培養液とを混合させたものを培養液６０２として用いる。具体的には、図１で説明したＵＦＢ生成装置１において、溶解ユニット２００で酸素を含む気体を溶解させ、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００でＴ−ＵＦＢを発生させる。そして作成されたＴ−ＵＦＢ含有液を上記市販の培養液に混合させ、出来上がった混合液を本実施例の培養液６０２として用いる。

Ｔ−ＵＦＢ生成方式で生成したＵＦＢ１１の大きさは１００ｎｍ以下であり、１〜１００μｍ程度の単一細胞６０３よりも十分に小さい。このため、酸素を含むＵＦＢ１１は、ブラウン運動しながら均一に分散し、スフェロイド６０４がある程度大きな塊となっても、個々の細胞の間を通り抜けて中心近傍に位置する細胞に近づくことができる。その結果、スフェロイド６０４を形成するほぼ全て細胞に酸素が安定して供給され、スフェロイド６０４は壊死細胞６０５を発生させることなく増殖していくことができる。すなわち、本実施例によれば、市販の培養液にＴ−ＵＦＢ生成方法で生成したＴ−ＵＦＢ含有液を混合させた液体を培養液として用いることにより、所望の大きさのスフェロイドを、再現性の高い状態で安定して作製することが可能となる。

また、個々の細胞に酸素が供給されやすくなる本実施例によれば、図１２（ａ）、（ｂ）に示した比較例に比べて、培養液を交換する頻度を減らすことができる。よって、マンパワーを削減できるとともに、ピペット作業などに伴う細胞へのストレスを軽減し、その点においても３次元細胞の効率的な生成を促すことになる。

以下、再度図１を参照しながら、本実施例で使用可能なＴ−ＵＦＢ含有液の具体的な製造方法を説明する。まず、本実施例では、液体Ｗとして滅菌した精製水（超純水）を使用する。水道水や一般的な純水では、コンタミネーションなどによって殺菌処理が不十分な場合があり、細胞にダメージを与える大腸菌などの細菌が混入し、細胞培養を阻害するリスクがあるためである。具体的には、メルコ社製の超純水装置（ＵＶ滅菌処理とフィルタろ過を含む）によって精製された超純水が好適に使用可能である。

溶解させる気体Ｇとしては、医療用ガスが好適である。具体的には、少なくとも酸素及び二酸化炭素を含む岩谷産業製の医療ガスが有用できる。気体Ｇには、酸素及び二酸化炭素のほか、窒素、水素、ネオン、オゾン、アルゴン、パーフロロカーボン系ガスなどが含まれていてもよい。

Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００においては、ユニット全体が滅菌環境下のドラフトチャンバー内に収納されていることが好ましい。具体的には、パナソニック製のバイオハザード対策用キャビネットクラスＩＩ（MHE-181AB3）が好適に利用可能である。

以上のように、製造済みの超純水と医療用ガスを用い、ドラフトチャンバーに収納されたＴ−ＵＦＢ生成ユニット３００でＴ−ＵＦＢ含有液を生成する形態とすれば、装置全体を比較的コンパクトにすることができる。そして、生成されたＴ−ＵＦＢ含有液を上記市販の培養液に混合させることにより、本実施例で使用可能なコンタミフリーの培養液６０２を生成することができる。

ところで、本発明者らの検討によれば、Ｔ−ＵＦＢ生成方法で生成したＴ−ＵＦＢは、生成された後に凝集体を形成する傾向があることが確認された。また、このような凝集体は、超音波を付与することによって分散可能であることも確認された。

図１３は、Ｔ−ＵＦＢの凝集と分散の様子を説明するための模式図である。Ｔ−ＵＦＢ生成方法で生成した個々のＵＦＢ１１は、±０〜−３０ｍＶのゼータ電位を有する、直径が１００ｎｍ以下の微細なバブルであり、互いに凝集する傾向がある。このため、Ｔ−ＵＦＢ生成方法によって生成されたＵＦＢ含有液においては、ＵＦＢ生成後比較的早い段階で凝集体１１Ｇの形成が開始される。

凝集体１１Ｇに含まれるＵＦＢ１１の数が多くなるほど、凝集体１１Ｇが有する負電荷も大きくなる。そして、凝集体１１Ｇの径が１００〜２００ｎｍ程度になると、凝集体が有するゼータ電位も−６０〜−１００ｍＶ程度となり、凝集体１１Ｇ同士は静電力によって反発し合うようになる。すなわち、Ｔ−ＵＦＢ生成方法によってＵＦＢを生成してしばらく置いた後のＴ−ＵＦＢ含有液は、一定の大きさの複数の凝集体１１Ｇが、ブラウン運動しながら液体中を分散して浮遊する状態となる。

但し、ＵＦＢ１１が凝集体１１Ｇの単位で浮遊する状態は、ＵＦＢの数が実際のＵＦＢ１１の数よりも抑えられた状態となり、スフェロイド６０４の中心近傍の細胞にまで酸素を供給するという効果が低減されてしまう。よって、本実施例においては、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００でＴ−ＵＦＢを生成した後の後処理として、超音波ホーンをＴ−ＵＦＢ含有液に浸し、１５０ＫＨｚの振動を８０Ｗで３０秒間発信する工程を追加した。これにより、凝集体１１Ｇは分散し、ＵＦＢ１１の数を見かけ上増大させることができた。そして、このような後処理を行った後のＵＦＢ含有液を、上記市販の培養液に混合させたものを、本実施例の培養液６０２として使用した。なお、上記振動の振動数は、状態に応じて無論変更可能である。本発明者らの検討によれば、ＫＨｚ帯からＭＫＨｚ帯に含まれる超音波であれば、凝集体１１Ｇを個別のＵＦＢ１１に分散できることが確認できた。

なお、本実施例において、培養したスフェロイドにおける壊死細胞の有無やスフェロイド全体の安定性は、オリンパス社製のＦＶ３０００などの３次元イメージング装置を用いて確認した。また、３次元細胞スフェロイドをスライスし、その割断面を染色し、細胞組織の活性化を評価する方法も採用した。

（実施例２）
実施例２では、本実施形態のＴ−ＵＦＢ含有液を用いてオルガノイドを培養する場合について説明する。

図１４は、スフェロイドとオルガノイドの違いを説明するための模式図である。スフェロイドが単一細胞（１種類の単細胞）を３次元培養することによって形成される３次元細胞であるのに対し、オルガノイドは２種以上の単細胞を３次元で共培養することによって形成される３次元細胞である。スフェロイドは１種類の複数細胞が互いに血管で繋がれた細胞塊となり、オルガノイドは複数種類の複数細胞が互いに血管で繋がれた細胞塊となる。

オルガノイドの培養も、スフェロイドと同様、細胞塊の内側にある細胞への酸素の供給が課題となる。オルガノイドにおいては、目的の臓器のサイズに近づくまで、すなわち比較的大きなサイズに成長するまで３次元培養することが求められるので、上記課題は更に重要となる。

図１５は、本実施形態のＵＦＢ含有液を培養液に使用して、オルガノイドを培養する状態を示す図である。培養液６０２としては、実施例１と同様のものを用いている。すなわち、図１で示したＵＦＢ生成装置１において、液体Ｗとして超純水を用い、医療用ガスを気体Ｇとして溶解させ、ドラフトチャンバー内に収納されているＴ−ＵＦＢ生成ユニット３００でＴ−ＵＦＢを生成した。そして、得られたＵＦＢ含有液に超音波ホーンを挿入し、１００ＫＨｚの振動を８０Ｗで３０秒間発信した後、「ＳｔｅｍＦｉｔ」ＡＫ０３培地（味の素社製）に混合させたものを、本実施例で使用する培養液６０２とした。そして、培養容器６０１に培養液６０２を貯留し、複数種類のヒト細胞６０６、６０７を浸して、所定の温度と湿度が保たれた環境の下、一定期間静置した。

本実施例においても、ＵＦＢ１１は、個々の細胞６０６、６０７の間を通り抜け、オルガノイド６０８の中心近傍に位置する細胞にも近づくことができる。その結果、オルガノイド６０８を形成するほぼ全て細胞に酸素が安定して供給され、オルガノイド６０８は壊死細胞を発生させることなく成長していくことができる。本発明者らの観察によれば、オルガノイドを２００μｍ〜１．０ｍｍのサイズまで成長させても、壊死細胞は確認されなかった。

すなわち、本実施例によれば、市販の培養液にＴ−ＵＦＢ生成方法で生成したＵＦＢ含有液を混合させた液体を、培養液として用いることにより、所望のサイズのオルガノイドを、再現性の高い状態で安定して作製することが可能となる。

（実施例３）
実施例３では、本実施形態のＴ−ＵＦＢ含有液を用いて、一度に複数のスフェロイドを培養する場合について説明する。

図１６は、本実施例の培養方法を示す図である。実施例１で説明した図１２（ｃ）と異なる点は、培養容器６０１の底部に、複数の凹部が形成されたマイクロプレート６１０を設置する点である。培養液６０２としては、実施例１、２と同様のものを用いる。凹部のそれぞれに単一細胞を一つずつ配することにより、凹部のそれぞれでスフェロイドを形成することができる。

本実施例においても、酸素を含むＵＦＢ１１は、培養容器６０１内において一様に分散し浮遊する。このため、スフェロイド６０４がある程度大きな塊となっても、ＵＦＢ１１は個々の細胞の間を通り抜けて中心近傍の細胞まで近づくことができる。その結果、それぞれのスフェロイド６０９を形成するほぼ全て細胞に酸素が安定して供給され、いずれのスフェロイド６０９も壊死細胞６０５を含むことなく正常かつ均等に成長していくことができる。すなわち、本実施例によれば、市販の培養液にＴ−ＵＦＢ生成方法で生成したＴ−ＵＦＢ含有液を混合させた液体を培養液として用いることにより、所望の大きさの複数のスフェロイドを、効率的に且つ多量に作製することが可能となった。

なお、以上説明した第１〜３の実施例では、市販の培養液にＴ−ＵＦＢ生成ユニットで生成したＴ−ＵＦＢ含有液を混合させることで、スフェロイド或いはオルガノイドの培養に用いる培養液としたが、培養液６０２の生成方法はこれに限定されない。図１で説明したＵＦＢ生成装置１において、前処理ユニット１００或いは溶解ユニット２００に供給する液体Ｗを、市販の培養液としてもよい。この場合、Ｔ−ＵＦＢ生成ユニット３００では、市販の培養液中に膜沸騰を生じさせＴ−ＵＦＢを生成させることになる。いずれにせよ、細胞の培養に必要な栄養分と、Ｔ−ＵＦＢ生成方式によって生成されたＴ−ＵＦＢとを含む液体であれば、本実施形態の培養液とみなすことができる。

また、培養過程においては、単細胞から所望の大きさの３次元細胞に成長するまで、常にＴ−ＵＦＢを含有する本実施形態の培養液を使用する必要はない。所定の培養過程のうち、特に酸素を必要とする期間のみ本実施形態の培養液を用い、３次元細胞がある程度成長した段階で従来の培養液に切り替えるようにしてもよい。

［第２の実施形態］
図１７は本実施形態で用いる培養装置２０００の概略構成図である。本実施形態の培養装置２０００は、主に、液体供給部７００、気体溶解部８００、収容室９００、ウルトラファインバブル生成部（ＵＦＢ生成部）１０００、及び培養部６００を含む。液体供給部７００、気体溶解部８００及びＵＦＢ生成部１０００は、第１の実施形態で説明した、図１の前処理ユニット１００、溶解ユニット２００及びＴ−ＵＦＢ生成ユニット３００にそれぞれ対応する。各部は配管１００６によって互いに接続され、配管１００６の途中に配されたポンプ１００２によって、液体Ｗが循環する。図１７において、実線矢印は液体の流れを示し、破線矢印は気体の流れを示す。

液体供給部７００は、液体貯留部７０１、ポンプ７０２、７０３、及び脱気部７０４を備えている。液体貯留部７０１には市販の培養液が貯留される。この培養液としては例えば「ＳｔｅｍＦｉｔ」ＡＫ０３培地（味の素社製）を好適に用いることができる。液体貯留部７０１に貯留された液体Ｗは、ポンプ７０２、７０３により、脱気部７０４を経由して、収容室９００に送液される。脱気部７０４の内部には、気体が通過でき液体が通過できない膜が配備されている。ポンプ７０２、７０３の圧力によって気体のみが膜を通過することにより、気体と液体とが分離され、液体Ｗは収容室９００に向かい、気体は外部に排出される。

気体溶解部８００は、気体供給部８０４、前処理部８０１、合流部８０２、気液分離室８０３を備えている。気体供給部８０４は、第１の実施形態で用いた医療用ガスのボンベであってもよいが、酸素を含む気体Ｇを連続的に発生可能な装置であってもよい。例えば、大気を取り込み、窒素を除去し、酸素濃度が高められた気体を連続的にポンプで送り込む装置とすることができる。

気体供給部８０４より供給された気体Ｇは、前処理部８０１によって放電等の処理がなされた後、合流部８０２において、収容室９００から流出された液体Ｗと合流する。この際、気体Ｇの一部は液体Ｗに溶解する。合流した気体Ｇと液体Ｗは気液分離室８０３によって再び分離され、液体Ｗに溶解されなかった気体Ｇのみが外部に排出される。気体Ｇが溶解された液体Ｗは、その後ポンプ１００２によってＵＦＢ生成部１０００に送られる。気液分離室８０３の下流には、液体Ｗ中の気体Ｇの溶解度を検知するための溶解度センサ８０５が設けられている。

ＵＦＢ生成部１０００は、流入された液体Ｗ中にＵＦＢを生成する。ＵＦＢの生成方式としては、図４〜図１０を用いて説明したＴ−ＵＦＢ生成方法を採用する。ＵＦＢ生成部１０００の上流にはフィルタ１００１が配され、不純物やごみなどがＵＦＢ生成部１０００に流入するのを防いでいる。不純物やごみなどを除去することにより、ＵＦＢ生成部１０００におけるＵＦＢの生成効率を向上させることができる。ＵＦＢ生成部１０００で生成されたＵＦＢ含有液Ｗは、配管１００６を通って収容室９００に収容される。

収容室９００は、液体供給部７００から供給された液体Ｗと、気体溶解部８００で所望の気体Ｇが溶解された液体Ｗと、ＵＦＢ生成部１０００でＴ−ＵＦＢが生成されたＵＦＢ含有液との混合液を収容する。

温度センサ９０５は、収容室９００に収容されている液体の温度を検知する。液面センサ９０２は、収容室９００の所定の高さに配置され、収容室９００における液体Ｗの液面を検出する。ＵＦＢ濃度センサ９０６は、収容室９００に収容された液体ＷのＵＦＢ濃度を検出する。バルブ９０４は、収容室９００に収容されている液体Ｗを培養容器６０１に供給する際に開放される。

温度調整部９０３は、収容室９００に収容されている液体Ｗの温度を管理する。気体溶解部８００で所望の気体Ｇを溶解させるとき、気体溶解部８００に供給する液体Ｗの温度はなるべく低温であるほうが効率的である。一方、収容室９００に貯留された液体Ｗを培養容器６０１に供給するとき、液体Ｗは培養に適した温度に調整されることが好ましい。本実施形態では、温度センサ９０５で液体の温度を検出しながら、温度調整部９０３を用いて、気体溶解部８００に供給する際の液体Ｗの温度や、培養容器６０１に供給する際の液体の温度を場面に応じて適切に調整している。

図１７には示していないが、収容室９００の内部には、第１の実施形態で説明したような超音波ホーンを配し、収容室９００から培養容器６０１に送る前の液体に振動を付与してもよい。更に、収容室９００には、液体Ｗの温度やＵＦＢの分布を一様にするための攪拌手段を設けてもよい。

培養部６００は、主に、培養容器６０１、流入管１００４及び流出管１００５を有している。培養容器６０１には、第１の実施形態の実施例３で説明したマイクロプレート６１０がセットされ、それぞれの凹部でスフェロイド或いはオルガノイドが培養される。図では３つの凹部を示しているが、マイクロプレート６１０には更に多数の凹部が形成されており、多数のスフェロイドが同時に培養可能となっている。収容室９００に収容されているＵＢＢ含有液は、流入管１００４を介して継続的に又は必要に応じて培養容器６０１に供給され、流出管１００３を介して継続的に又は必要に応じて培養容器６０１より排出される。

培養容器６０１に収容されているＵＢＢ含有液（培養液）は、細胞の呼吸や増殖に伴って酸素が消費されるが、本実施形態の培養装置であれば、適切なＵＦＢ濃度のＵＦＢ含有液を、継続的に培養容器６０１に供給することができる。つまり、人の手による培養液の交換の必要がなくなり、スフェロイドが所望の大きさに成長するまで、所定の環境下で静置しておくことが可能となる。

なお、本実施形態において、培養容器６０１に対する培養液６０２の流入や流出の方法は特に限定されない。ポンプを利用してもよいし、水頭差などを利用してもよい。いずれにしても、培養容器６０１に配された細胞を傷つけることがない程度の緩やかな流速に調整することが好ましい。

配管１００６、ポンプ１００２、フィルタ１００１、収容室９００、ＵＦＢ生成部１０００の接液部のように、培養液となる液体Ｗと接触する部材については、耐腐食性の強い材料で形成されていることが好ましい。例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）などのフッ素系樹脂、ＳＵＳ３１６Ｌなどの金属やその他の無機材料が好適に使用可能である。

図１７に示した本実施形態の循環経路において、所望の気体Ｇを溶解させる工程とＵＦＢを生成する工程とは、同時に行ってもよいし別々に行ってもよい。同時に行う場合は、気体溶解部８００とＵＦＢ生成部１０００とを共に動作させながら液体を循環させる。この際、バルブ９０４は循環中に開放されていてもよいが、複数回の循環の後、ＵＦＢ濃度センサが適切なＵＦＢ濃度を検出した際に開かれ、適量のＵＦＢ含有液を培養部６００に送液する形態としてもよい。

一方、気体Ｇを溶解させる工程とＵＦＢを生成する工程を別々に行う場合は、気体溶解部８００のみを動作させる循環を行った後に、ＵＦＢ生成部１０００のみを動作させる循環を行えばよい。この場合、気体溶解部８００のみを動作させる循環において、溶解度センサ８０５が適切な溶解度を検出したら、気体溶解部８００を停止してＵＦＢ生成部１０００の動作を開始すればよい。そして、ＵＦＢ濃度センサ９０６が適切なＵＦＢ濃度を検出したら、バルブ９０４を開放して培養部６００に液体を供給すればよい。

また、図１７では、液体貯留部７０１に市販の培養液を貯留させ、この培養液中にＴ−ＵＦＢを生成する形態としたが、培養容器６０１に供給する培養液は、第１の実施形態で説明した方法で作成してもよい。具体的には、液体貯留部７０１には超純水を貯留し、収容室９００と培養部６００との間に市販の培養液とＵＦＢ含有液Ｗとを混合させるための混合部を設けてもよい。また、このような混合部は、気体溶解部８００とＵＦＢ生成部１０００の間や、ＵＦＢ生成部１０００と収容室９００の間に設けてもよい。

図１８は、培養装置の変形例を示す図である。図１７で示した培養装置２０００と異なる点は、培養部６００を、循環経路の途中、具体的にはＵＦＢ生成部１０００と収容室９００との間に配していることである。本変形例の場合、収容室９００に収容された液体Ｗは、気体溶解部８００、ＵＦＢ生成部１０００、培養部６００を経由して、再び収容室９００に戻る。

培養部６００では培養中のスフェロイドが酸素を消費するため、培養部６００から送出される液体ＷのＵＦＢ濃度は、培養部６００に供給される液体ＷのＵＦＢ濃度よりも減少していることが想定される。このような液体Ｗを、気体溶解部８００及びＵＦＢ生成部１０００を含む経路で再び循環させることにより、液体Ｗ中の酸素ＵＦＢの濃度を再び向上させることができる。その結果、培養部６００に対しては、常に適切なＵＦＢ濃度の培養液を供給することが可能となる。

以上説明したように、気体溶解部８００、ＵＦＢ生成部１０００、及び培養部６００の間で液体を送液させる本実施形態の培養装置によれば、所望の大きさの３次元細胞を効率的に且つ多量に生産することが可能となる。

［第３の実施形態］
前述の第１及び第２の実施形態で示した３次元細胞の培養の他に、２次元細胞の培養においてもＴ−ＵＦＢ含有液を用いることで、２次元細胞を効率的に且つ多量に生産することができる。ＵＦＢ生成装置及びＴ−ＵＦＢ生成方法については、前述の第１及び第２の実施形態と同様のものを用いることができる。

以下に、Ｔ−ＵＦＢ含有液を用いた２次元細胞培養について、いくつかの実施例を挙げて具体的に説明する。

（実施例４）
皮膚の真皮内に含まれる繊維芽細胞の２次元培養について、以下に説明する。まず、フェノールレッド（ＰＲ）が含まれている液体培地であるＤＭＥＭ（富士フィルム和光純薬社製）に動物血清（ＦＢＳ：ＢｉｏＷｅｓｔ社製）をＤＭＥＭの含有量を基準として１０質量％と、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（抗生物質：富士フィルム和光純薬社製）をＤＭＥＭの含有量を基準として１質量％添加して培養液（培地）を作製する。この培養液を汎用のＴ型フラスコに入れて、次に、線維芽細胞を１，０００個投入し、二酸化炭素インキュベーターで生細胞数を増加させた（継代工程）。二酸化炭素インキュベーター内は、細胞培養に適した温度である３７℃とし、培地の蒸発を防ぐために湿度を９０〜１００％とし、ｐＨ調整のために二酸化炭素５％雰囲気下にしている。このような細胞培養を行うことによって、約１週間で細胞数が１０，０００個程に増加する。

次に、Ｔ型フラスコ内の細胞をかき集めて、１，０００個ずつをマルチウェルプレート内に入れて、前記二酸化炭素インキュベーターにいれて、上記と同じ条件で約１週間細胞の２次元培養を実施した。

前述のような２次元細胞を実施すると、シート状の細胞が形成される。細胞数は、約１０，０００個程度であった。

次に、本発明の酸素ＵＦＢを含有した培養液を以下の方法で別途作製した。

前記培養液（ＤＭＥＭ、ＦＢＳ１０質量％、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液１質量％）に酸素ＵＦＢ（ＵＦＢ濃度：１０．０億個／ｍｌ）を含有させた。そして、前述のように二酸化炭素インキュベーターで線維芽細胞を増加させた。その結果、約２日間で１０，０００個に達した。培養液中の溶存酸素濃度が、過飽和な状態（１０ｐｐｍ）を２日間維持しており、二酸化炭素インキュベーター内での細胞に対して、常に酸素を供給し続けた結果と推察される。

（実施例５）
前述のように、Ｔ型フラスコ内の細胞をかき集めて、１，０００個ずつの線維芽細胞をマルチウェルプレートに入れて、前記二酸化炭素インキュベーターで２次元細胞培養を実施した。その際に、培養液には、酸素ＵＦＢ（ＵＦＢ濃度：１０億個／ｍｌ）を含有させた。その結果、２日間で１０，０００個のシート状の細胞が形成できた。前述と同様に、培養液中の溶存酸素濃度が、過飽和な状態（１０ｐｐｍ）を２日間維持しており、二酸化炭素インキュベーター内での細胞に対して、常に酸素を供給し続けた結果と推察される。

１０ 発熱素子
１１ ウルトラファインバブル（ＵＦＢ）
６０２ 培養液
６０３ 細胞（単細胞）

Claims (27)

1. 発熱素子を発熱させて液体と前記発熱素子の界面に膜沸騰を生じさせることにより生成されたウルトラファインバブルを含む培養液を用い、細胞を培養すること特徴とする培養方法。
2. 前記ウルトラファインバブルには、酸素が含まれていることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
3. 前記ウルトラファインバブルには、二酸化炭素が更に含まれていることを特徴とする請求項２に記載の培養方法。
4. 前記細胞は、スフェロイド及びオルガノイドの少なくとも一方の３次元細胞であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の培養方法。
5. 前記細胞の培養に使用する前に、前記培養液に対しＫＨｚ帯からＭＫＨｚ帯に含まれる超音波を与えることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の培養方法。
6. 細胞を培養するために用いられる培養液の製造方法であって、
   発熱素子を発熱させて液体と前記発熱素子の界面に膜沸騰を生じさせることにより、前記液体中にウルトラファインバブルを生成するウルトラファインバブル生成工程と、
   前記ウルトラファインバブル生成工程で生成されたウルトラファインバブルを含有するウルトラファインバブル含有液と、所定の栄養分を含む液体とを混合させて前記培養液を生成する混合工程と
   を有することを特徴とする培養液の製造方法。
7. 前記ウルトラファインバブル生成工程で使用される前記液体は、滅菌処理をした精製水であることを特徴とする請求項６に記載の培養液の製造方法。
8. 細胞を培養するために用いられる培養液の製造方法であって、
   発熱素子を発熱させて、所定の栄養分を含む液体と前記発熱素子の界面に膜沸騰を生じさせることにより、前記液体中にウルトラファインバブルを発生させてウルトラファインバブル含有液を生成するウルトラファインバブル生成工程を有することを特徴とする培養液の製造方法。
9. 前記ウルトラファインバブル生成工程の前に、前記液体に所定の気体を溶解させる気体溶解工程を更に有することを特徴とする請求項６から８のいずれか1項に記載の培養液の製造方法。
10. 前記所定の気体は医療用ガスであることを特徴とする請求項９に記載の培養液の製造方法。
11. 前記ウルトラファインバブル生成工程の後に、前記ウルトラファインバブル含有液に振動を与える振動工程を更に有することを特徴とする請求項６から１０のいずれか１項に記載の培養液の製造方法。
12. 前記振動は、ＫＨｚ帯からＭＫＨｚ帯に含まれる超音波であることを特徴とする請求項１１に記載の培養液の製造方法。
13. 細胞を培養するための培養液であって、
    発熱素子を発熱させて液体と前記発熱素子の界面に膜沸騰を生じさせることにより生成されたウルトラファインバブルと、所定の栄養分とを含む培養液。
14. 前記ウルトラファインバブルは、±０〜−３０ｍＶのゼータ電位を有することを特徴とする請求項１３に記載の培養液。
15. 前記ウルトラファインバブルが、複数の前記ウルトラファインバブルで構成される凝集体の単位で浮遊していることを特徴とする請求項１４に記載の培養液。
16. 前記凝集体は−６０〜−１００ｍＶのゼータ電位を有することを特徴とする請求項１５に記載の培養液。
17. 前記培養液は、栄養分として液体培地を含むことを特徴とする請求項１３から１６のいずれか１項に記載の培養液。
18. 前記液体培地は、アミノ酸類、無機塩類、及びビタミン類を含むことを特徴とする請求項１７に記載の培養液。
19. 前記ウルトラファインバブルには、酸素が含まれていることを特徴とする請求項１３から１８のいずれか１項に記載の培養液。
20. 前記培養液中の溶存酸素が過飽和状態であることを特徴とする請求項１９に記載の培養液。
21. 前記培養液中の溶存酸素濃度が、８．０ｐｐｍ以上であることを特徴とする請求項２０に記載の培養液。
22. 液体に所定の気体を溶解させる気体溶解手段と、
    発熱素子を発熱させて前記液体と前記発熱素子の界面に膜沸騰を生じさせることにより、前記液体中にウルトラファインバブルを生成させるウルトラファインバブル生成手段と、
    前記ウルトラファインバブルを含む液体を用いて細胞を培養する培養手段と、
    を備えることを特徴とする培養装置。
23. 前記気体溶解手段で前記所定の気体が溶解され、前記ウルトラファインバブル生成手段で前記ウルトラファインバブルが生成された液体を、前記培養手段に供給するように、前記気体溶解手段、前記ウルトラファインバブル生成手段、及び前記培養手段の間で液体を送液する送液手段を更に備えることを特徴とする請求項２２に記載の培養装置。
24. 前記送液手段は、前記培養手段で使用された後の液体を外部に排出することを特徴とする請求項２３に記載の培養装置。
25. 前記送液手段は、前記培養手段で使用された後の液体を前記気体溶解手段に戻し、前記気体溶解手段、前記ウルトラファインバブル生成手段、及び前記培養手段の間で、液体を循環させることを特徴とする請求項２３に記載の培養装置。
26. 前記液体は培養に必要な所定の栄養分を含む液体であることを特徴とする請求項２２から２５のいずれか１項に記載の培養装置。
27. 前記液体は滅菌処理をした精製水であり、
    前記液体に培養に必要な所定の栄養分を含む液体を混合させる混合手段を更に備えることを特徴とする請求項２２から２５のいずれか１項に記載の培養装置。

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