JP2021072805A - ヌクレオチドにより活性化された糖から遊離形の単糖を生産するための発酵法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒することができ、前記ヌクレオチド活性化単糖から目的の前記単糖を遊離させる酵素を含む、前記単糖の合成のための微生物を準備する工程と、
b)前記微生物を増殖させるのに適した培地で前記微生物を培養する工程、ここで、前記微生物は前記単糖を有意な程度まで代謝することができず、培養工程中に目的の前記単糖が遊離形で産生され、蓄積する、
を含む。
a)微生物を増殖させるのに適した培地に、前記微生物に天然では存在しないヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒する酵素をコードする核酸配列を含むように形質転換されており、産生させようとする単糖を有意量で代謝することができない組換え宿主微生物を提供する工程と、
b)前記組換え宿主微生物を前記培地で培養することにより、前記単糖を遊離形で産生させる工程と、
c)前記遊離の単糖を前記培地から回収する工程を含む。
大腸菌(Escherichiea coli)BL21(DE3)(Novagen,Darmstadt,ドイツ)を使用して遺伝子操作し、フコース産生株を構築した。フコースはGDP−L−フコースの加水分解により産生されるので、大腸菌K12 DH5αに由来するホスホマンノムターゼ(manB)、マンノース−1−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ(manC)、GDP−マンノース−4,6−デヒドラターゼ(gmd)及びGDP−L−フコースシンターゼ(wcaG)をコードする遺伝子のゲノム組込みと過剰発現によりGDP−L−フコースの合成を亢進させる。オペロンmanC−manBをPtetプロモーターの転写制御下におき、オペロンgmd−wcaGをPT5プロモーターから発現させる。遺伝子クラスター<Ptet−manCB−PT5−gmd,wcaG−dhfr>(配列番号1;図4A)は更にトリメトプリム耐性を成分に付与するジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするdhfr遺伝子を含む。クラスターを転位により大腸菌BL21(DE3)ゲノムに組込むために、marinerファミリー転位因子Himar1により特異的に認識される逆向きの反復配列をクラスターの両末端に付加する。更に、大腸菌W株のcsc遺伝子クラスターを宿主生物のゲノムに導入した。この遺伝子クラスターはスクロースペルメアーゼ(cscB)、フルクトキナーゼ(cscK)、スクロースヒドロラーゼ(cscA)及び転写リプレッサー(cscR)の遺伝子を含む。Himar1に特異的な逆向きの反復配列をクラスター<cscB−cscK−cscA−cscR>(配列番号2;図4B)の両末端に付加してHimar1転位により組込みを実施し、スクロースを単独炭素源として増殖する能力を宿主生物に付与する(Choi,K.−H.and Kim,K.−J.(2009)Applications of transposon−based gene delivery system in bacteria.J.Microbiol.Biotechnol.19,217−228)。
大腸菌O126に由来する2−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子wbgL(アクセッション番号AND43847)(配列番号3;図4C)のコドン最適化と合成をGenScript社(Piscataway,米国)に委託した。また、ピロリ菌(Helicobacter pylori)に由来する1,2−フコシルトランスフェラーゼをコードするfutC遺伝子(アクセッション番号AAD29868)(配列番号4;図4D)も合成し、大腸菌での発現に適合するようにコドン最適化した。ベクターpDEST14にクローニングするために、夫々wbgLにはプライマー6128(配列番号5)及び6129(配列番号6)を使用し、futCにはプライマー6195(配列番号7)及び6196(配列番号8)を使用してこれらの遺伝子を増幅した(プライマー配列については、下表1参照)。
炭素源として1%(v/v)グリセロールと1%(v/v)スクロースを含有する無機塩培地でpDEST:wbgL(エラープローン)プラスミドライブラリーを保持する産生用大腸菌BL21(DE3)株を増殖させた。培地はNH4H2PO4 2g/L、K2HPO4 7g/L、KOH 2g/L、クエン酸0.3g/L、MgSO4・7H2O 0.98g/L、及びCaCl2・6H2O 0.02g/Lから構成される。これに1リットル当たり1ミリリットルの微量元素溶液(クエン酸鉄アンモニウム54.4g/L、MnCl2・4H2O 9.8g/L、CoCl2・6H2O 1.6g/L、CuCl2・2H2O 1g/L、H3BO3 1.9g/L、ZnSO4・7H2O 9g/L、Na2MoO4・2H2O 1.1g/L、Na2SeO3 1.5g/L、NiSO4・6H2O 1.5g/L)を添加する。選択のために、トリメトプリム10μg/mLとアンピシリン100μg/mLを加えた。96ウェルマイクロタイタープレートで細胞を24時間30℃にて振盪下に増殖させた。0.3mM IPTGを添加した新鮮なHEPES緩衝液(100mM)培地400μlを入れた96ウェルプレートに予備培養液50μlを移し、pDESTにおけるwbgL遺伝子の発現を誘導した。誘導した培養液を2日間30℃にて振盪下に増殖させた。細胞を遠心により沈降させ、遊離L−フコースの検出に上清を使用した。
L−フコースからL−フコノ−1,5−ラクトンへのNADP依存性変換を触媒するシュードモナス(Pseudomonas)属No.1143に由来するL−フコースデヒドロゲナーゼ(FuDH)(アクセッション番号D32042)を使用して比色アッセイで遊離のL−フコースを測定した。この比色アッセイでは、フェナジンメトサルフェートの共存下でニトロブルーテトラゾリウムをNADPHにより青紫色のホルマザンへと還元する。ホルマザンの形成を571nmでモニターする。(Mayer,K.M.and Arnold,F.H.(2002)A Colorimetric Assay to Quantify Dehydrogenase Activity in Crude Cell Lysates.J.Biomol.Screen.7,135−140)。
LCトリプル四重極型MS検出システム(Shimadzu LC−MS 8050)(島津製作所,京都)を使用してMRM(multiple reaction monitoring:多重反応モニタリング)により質量分析を行った。四重極1で前駆体イオンを選択・分析し、コリジョンセルでアルゴンをCIDガスとして使用して断片化を行い、四重極3でフラグメントイオンの選択を行う。
フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する産生用大腸菌BL21(DE3)株による遊離L−フコースの合成
大腸菌BL21(DE3)におけるGDP−L−フコース合成を亢進させるために、ホスホマンノムターゼ、マンノース−1−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ、GDP−マンノース−4,6−デヒドラターゼ及びGDP−L−フコースシンターゼをコードする異種遺伝子をゲノムに組込み、過剰発現された。更に、スクロースでの増殖能をBL21(DE3)株に付与するために、大腸菌W株に由来するスクロースペルメアーゼ、フルクトキナーゼ、スクロースヒドロラーゼ及び転写リプレッサーをコードするcsc遺伝子クラスターをゲノムに組込んだ。
転写インデューサーIPTGの存在下で増殖させた大腸菌BL21(DE3)pDEST:wbgL(H124A,E215G)及び大腸菌BL21(DE3)pDEST:futCの無細胞抽出液におけるGDP−L−フコースヒドロラーゼ活性を分析した。2−フコシルトランスフェラーゼFutCはオリゴ糖基質の不在下でGDP−L−フコースを加水分解すると記載されている(Stein,D.B.,Lin Y.−N.,Lin,C.−H.(2008)Characterization of Helicobacter pylori α1,2−fucosyltransferase for enzymatic synthesis of tumor−associated antigens.Adv.Synth.Catal.350,2313−2321)。5mM GDP−L−フコースと夫々の株の細胞溶解液を含有するヒドロラーゼアッセイ反応液中でGDP−L−フコースを開裂させた。L−フコースデヒドロゲナーゼアッセイを使用して遊離のL−フコースを検出した。粗抽出液の代わりにウシ血清アルブミンを含有するアッセイ反応液中に遊離のL−フコースは検出されず、GDP−L−フコースの安定性が実証された(図3)。
Claims (18)
- 微生物を使用して遊離形の目的の単糖を生産する方法であって、
a)ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒することができ、前記ヌクレオチド活性化単糖から目的の単糖を遊離させる酵素を含む、前記単糖の合成のための微生物を準備する工程と、
b)前記微生物を増殖させるのに適した培地で前記微生物を培養する工程と、ここで、前記微生物は前記単糖を有意な程度まで代謝することができず、培養工程中に目的の前記単糖が蓄積する、
を含む、方法。 - 組換え微生物を使用し、前記組換え微生物が、ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒することが可能な酵素をコードする異種核酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が、グリコシルトランスフェラーゼ、好ましくはフコシルトランスフェラーゼであり、前記酵素が、アクセプター分子の不在下でヌクレオチド活性化単糖GDP−フコースの加水分解を触媒することが可能である請求項1又は2に記載の方法。
- 前記酵素が、大腸菌(Escherichiea coli)に由来するwbgL遺伝子によりコードされる2−フコシルトランスフェラーゼの変異体又はピロリ菌(Helicobacter pylori)に由来するfutC遺伝子によりコードされる1,2−フコシルトランスフェラーゼの変異体であり、前記変異体が、夫々wbgL遺伝子によりコードされる野生型2−フコシルトランスフェラーゼ又はfutC遺伝子によりコードされる野生型1,2−フコシルトランスフェラーゼと比較して少なくとも1カ所、好ましくは少なくとも2カ所、より好ましくは3カ所以上に変異があり、前記変異が、前記酵素の加水分解活性の増加をもたらす請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1カ所の変異が、アミノ酸置換である請求項4に記載の方法。
- 前記微生物が、産生された単糖の分解をもたらす異化経路を不活性化又は大きく減少又は欠損するように更に改変されている請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、L−フコースの異化に関与する遺伝子を不活性化又は大きく減少又は欠損するように更に改変されている請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、前記ヌクレオチド活性化単糖の生合成に関与する少なくとも1種の遺伝子を過剰発現し、前記単糖のヌクレオチド活性化単糖の供給を改善するように更に改変されている請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- GDP−フコース、GDP−マンノース又はGDP−ラムノースの生合成に関与する少なくとも1種の遺伝子が過剰発現され、夫々GDP−フコース、GDP−マンノース又はGDP−ラムノースの供給を改善する請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の遺伝子が、異種又は同種である請求項8又は9に記載の方法。
- 前記微生物が、前記ヌクレオチド活性化単糖の競合経路を不活性化又は減少するように更に改変されている請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 生産される前記単糖が、L−フコース、L−ラムノース又はL−マンノースから選択される請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- グリセロール、スクロース、グルコース、フルクトース、糖蜜、キシロース、セルロース、合成ガス、コーンシロップ又はラクトースから選択されるが、これらに限定されない廉価な炭素源を含有する培地で前記微生物を培養する請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単糖が前記酵素によりリン酸化形態で遊離される場合には、前記微生物が、ホスファターゼを発現するように更に改変されている請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレオチド活性化単糖の加水分解を触媒し、アクセプター分子の不在下で前記ヌクレオチド活性化単糖から単糖を遊離させることが可能な異種酵素を含む組換え微生物であって、前記酵素が、グリコシルトランスフェラーゼ、好ましくはフコシルトランスフェラーゼである前記組換え微生物。
- 前記酵素が、wbgL遺伝子によりコードされる2−フコシルトランスフェラーゼの変異体又はピロリ菌に由来するfutC遺伝子によりコードされる1,2−フコシルトランスフェラーゼの変異体であり、前記変異体が、夫々wbgL遺伝子によりコードされる野生型2−フコシルトランスフェラーゼ又はfutC遺伝子によりコードされる野生型1,2−フコシルトランスフェラーゼと比較して少なくとも1カ所、好ましくは少なくとも2カ所、より好ましくは3カ所以上に変異があり、前記変異が、前記酵素の加水分解活性の増加をもたらす請求項15に記載の組換え微生物。
- ホスホマンノムターゼ、マンノース−1−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ、GDP−マンノース−4,6−デヒドラターゼ及びGDP−L−フコースシンターゼをコードする異種遺伝子を含むように更に改変されている請求項15又は16に記載の組換え微生物。
- 前記宿主微生物が、大腸菌株、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、クロストリジウム(Clostridium)属、バシラス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属又はサッカロミセス(Saccharomyces)属の株である請求項1から13のいずれか一項に記載の方法又は請求項15から17のいずれか一項に記載の組換え宿主微生物。
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