JP2021063035A - Ｂｒａｐ２作用増強剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の両者を阻害するのに有用な、新規のＢＲＡＰ２作用増強剤を提供する。【解決手段】ＢＲＡＰ２作用増強剤は、下記式（１）又は（２）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する。【選択図】図３Ａ

Description

本発明は、ＢＲＡＰ２作用増強剤に関する。
近年、特定の分子を標的として、その機能を抑制、あるいは惹起することで効果を発揮する分子標的薬は、従来の薬よりも標的が明確である分、副作用が少ない薬剤として、薬剤開発の中心となっている。このような分子標的薬は、疾患を引き起こす因子の細胞膜上の受容体への結合を阻止したり、受容体下流に存在し、細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質と結合してシグナル伝達を阻止するといった作用を示す。
例えば、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路は、がん細胞の増殖や生存を促す中心的なシグナル伝達として知られている。
Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路はＭＡＰＫ経路の一種であり、ＥＧＦＲのような増殖因子を受容する受容体からの刺激により活性化（リン酸化）したＲａｓが、下流のＲａｆ、ＭＥＫ、及びＥＲＫとシグナルを伝達し、様々な転写因子を活性化することで細胞増殖を促す。また、Ｒａｆ、ＭＥＫ、及びＥＲＫは活性化の際に複合体を形成する。その複合体形成に大きく関与するのが足場タンパク質であるＫｉｎａｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｒａｓ（ＫＳＲ）である。ＫＳＲの存在により、Ｒａｆ、ＭＥＫ、及びＥＲＫはシグナルを伝達できる。
一方、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路では、ＥＧＦＲやＰＤＧＦＲのような増殖因子を受容する受容体からの刺激により、ＰＩ３Ｋが活性化し、その後Ａｋｔ及びｍＴＯＲが活性化することで、細胞増殖が促される。
上記シグナル伝達に関与するタンパク質を阻害する分子標的薬は、シグナルが関与する疾患に対する医薬品の候補になり得るため、これまでにＲａｆ阻害薬、ＭＥＫ阻害薬、ＰＩ３Ｋ阻害薬、Ａｋｔ阻害薬等の開発が進められてきた。
しかし、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を阻害しても、バイパスとなるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路が活性化し、結果的に細胞増殖作用が亢進してしまうといった問題があり、両経路を阻害し得る阻害薬の開発が望まれる。
ところで、上記両経路を阻害できるタンパク質として、ＢＲＡＰ２が知られている。ＢＲＡＰ２は、Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ １（ＢＲＣＡ１）に結合し、ＢＲＣＡ１の核移行を阻害するタンパク質として発見された。一方で、近年、ＢＲＡＰ２は、Ｒａｆ、ＭＥＫ、及びＥＲＫの活性化に関わるＫＳＲの足場形成を阻害することや、脱リン酸化酵素ＰＨＬＰＰ１と結合してＡｋｔの活性化を阻害することが報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。よって、ＢＲＡＰ２の細胞内での作用を増強することができれば、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の両者が阻害され、細胞増殖を抑制し、ひいては細胞死を誘発することができると推定される。
このようなことから、ＢＲＡＰ２作用を増強する優れた化合物を見出すことが求められている。
Ｍａｔｈｅｎｙ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ；２００４；４２７；２５６ Ｆａｔｉｍａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．；２０１５；５；９４５９
本発明は、上記に鑑みて提案されたものであり、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の両者を阻害するのに有用な、新規のＢＲＡＰ２作用増強剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々の化合物を探索した結果、下記式（１）又は（２）で表される化合物が、ＢＲＡＰ２の作用を増強し、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の両者を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のものを提供する。
＜１＞ 下記式（１）又は（２）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する、ＢＲＡＰ２作用増強剤。
Figure 2021063035
 ［式中、Ｒ１は、水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ１及びＲ２がいずれもアルキル基である場合、Ｒ１及びＲ２は、それらが結合する窒素原子とともに、又はそれらが結合する窒素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子から選択される１種以上の原子とともに、単環式複素環を形成してもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、アルキル基、脂環式基、アリール基、アシル基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、又はニトロ基を示す。Ｒ３又はＲ４が複数存在する場合、複数のＲ３又はＲ４は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、脂肪族炭化水素基、又は置換基を有していてもよいアリール基を示す。Ｒ５及びＲ６がいずれも脂肪族炭化水素基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して脂環式基を形成してもよい。ｎは０以上の整数を示し、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０〜４の整数を示す。］
Figure 2021063035
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｎ、ｐ、及びｑは、上記式（１）と同義である。Ｒ７は、脂肪族炭化水素基又は置換基を有していてもよいアリール基を示す。］
＜２＞ ＜１＞に記載のＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する、ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患又は症状の予防又は治療薬。
＜３＞ ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患又は症状が、炎症性疾患、自己免疫疾患、又はウイルス感染症である、＜２＞に記載の予防又は治療薬。
＜４＞ ＜１＞に記載のＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する、免疫抑制剤。
＜５＞ 下記式（３）で表される化合物。
Figure 2021063035
＜６＞ 下記式（４）で表される化合物。
Figure 2021063035
＜７＞ ＜５＞又は＜６＞に記載の化合物又はその塩を有効成分として含有する、ＢＲＡＰ２作用増強剤。
＜８＞ ＜７＞に記載のＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する、ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患又は症状の予防又は治療薬。
＜９＞ ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患又は症状が、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、又はウイルス感染症である、＜８＞に記載の予防又は治療薬。
＜１０＞ ＜７＞に記載のＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する、免疫抑制剤。
本発明によれば、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の両者を阻害するのに有用な、新規のＢＲＡＰ２作用増強剤を提供することができる。
ＲＩＤ−Ｂを添加した場合のＭＴＴアッセイの結果を示す図である。 ＩＣ５０のＲＩＤ−Ｂを添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＩＣ５０のＲＩＤ−Ｂを添加した場合の活性型ｃａｓｐａｓｅ−３の検出の結果を示す図である。 ＴＡＭを添加した場合のＭＴＴアッセイの結果を示す図である。 ＩＣ５０のＴＡＭを添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＩＣ５０のＴＡＭを添加した場合の活性型ｃａｓｐａｓｅ−３の検出の結果を示す図である。 ＩＣ５０のＲＩＤ−Ｂを添加した場合のＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路への影響を確認した結果を示す図である。 ＩＣ５０のＲＩＤ−Ｂを添加した場合のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路への影響を確認した結果を示す図である。 ＩＣ５０のＲＩＤ−Ｂを添加した場合のＢＲＡＰ２発現量への影響を確認した結果を示す図である。 ＩＣ５０のＴＡＭを添加した場合のＢＲＡＰ２発現量への影響を確認した結果を示す図である。 ＲＩＤ−ＢとＢＲＡＰ２の結合の有無を確認した結果を示す図である。 ＲＩＤ−ＢとＢＲＡＰ２の直接的な結合の有無を確認した結果を示す図である。 ＲＩＤ−ＢとＢＲＡＰ２の直接的な結合の有無を確認した結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株におけるＢＲＡＰ２発現量を確認した結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｂを添加した場合のＭＴＴアッセイの結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｂを添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｂを添加した場合のＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路への影響を確認した結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２再発現株におけるＢＲＡＰ２発現量を確認した結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２再発現株にＲＩＤ−Ｂを添加した場合のＭＴＴアッセイの結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２再発現株にＲＩＤ−Ｂを添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−ＳＢ１０を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−ＳＢ１７を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｇを添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−ＳＧ１７を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｈを添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−ＳＨ１７を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−ＵＢを添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｂ−ＯＨ２を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−ＮＢを添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／ＯＨ）を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／Ｍｅ）を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／ＭＥＥ）を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−ＳＢ３１を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。 ＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｓ１０を添加した場合のｓｕｂＧ１解析の結果を示す図である。
＜ＢＲＡＰ２作用増強剤＞
本実施形態に係るＢＲＡＰ２作用増強剤は、下記式（１）又は（２）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する。
Figure 2021063035
Figure 2021063035
後述する実施例で示すように、本発明者らは、上記式（１）又は（２）で表される化合物がＢＲＡＰ２に結合することで、ＢＲＡＰ２の発現量が増加し、ＥＲＫ及びＡｋｔの活性化が阻害されることを見出した。その結果、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の両者が阻害され、細胞増殖の抑制、ひいては細胞死が誘発されることとなる。
上記式（１）中、Ｒ１は、水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ１又はＲ２がアルキル基である場合、アルキル基の炭素数は１〜３０であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましく、１〜５であることが更に好ましい。アルキル基は、直鎖状及び分岐鎖状のいずれであってもよく、直鎖状であることが好ましい。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２がいずれもアルキル基である場合、Ｒ１及びＲ２は、それらが結合する窒素原子とともに、又はそれらが結合する窒素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子から選択される１種以上の原子とともに、単環式複素環を形成してもよい。単環式複素環としては、５員環〜７員環が好ましい。単環式複素環の具体例としては、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、アザシクロヘプタン環、ジアザシクロヘキサン環、モルホリン環、チオモルホリン環等が挙げられる。
上記式（１）中、ｎは０以上の整数を示す。ｎは１〜３０の整数であることが好ましく、１〜１０の整数であることがより好ましく、１〜５の整数であることが更に好ましく、１又は２であることが特に好ましい。
上記式（１）中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、アルキル基、脂環式基、アリール基、アシル基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、又はニトロ基を示す。Ｒ３又はＲ４が複数存在する場合、複数のＲ３又はＲ４は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
Ｒ３又はＲ４がアルキル基である場合、アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
Ｒ３又はＲ４が脂環式基である場合、脂環式基の具体例としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基；シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、ノルボルネニル基、アダマンテニル基等のシクロアルケニル基；などが挙げられる。
Ｒ３又はＲ４がアリール基である場合、アリール基の具体例としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
Ｒ３又はＲ４がアシル基である場合、アシル基の具体例としては、アセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基、ナフタレンカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ３又はＲ４がアシルオキシ基である場合、アシルオキシ基の具体例としては、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ベンゾイルオキシ基、ナフタレンカルボニルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ３又はＲ４がハロゲン原子である場合、ハロゲン原子の具体例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
上記式（１）中、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０〜４の整数を示す。ｐ及びｑは０〜３の整数であってもよく、０〜２の整数であってもよく、０又は１であってもよい。
上記式（１）中、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、脂肪族炭化水素基、又は置換基を有していてもよいアリール基を示す。
Ｒ５又はＲ６が脂肪族炭化水素基である場合、脂肪族炭化水素基の炭素数は、１〜３０であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましく、１〜５であることが更に好ましい。Ｒ５及びＲ６がいずれも脂肪族炭化水素基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して脂環式基を形成してもよい。
脂肪族炭化水素基としては、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基；ビニル基、アリル基、ブテニル基等のアルケニル基；エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等のアルキニル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基；シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、ノルボルネニル基、アダマンテニル基等のシクロアルケニル基；などが挙げられる。Ｒ５とＲ６とが結合して形成する脂環式基としては、シクロアルキル基、シクロアルケニル基等が挙げられる。
Ｒ５又はＲ６がアリール基である場合、アリール基の具体例としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
アリール基が有していてもよい置換基の種類は、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。置換基の好適な例としては、アルキル基、脂環式基、アリール基、アシル基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。アリール基が複数の置換基を有する場合、当該複数の置換基は、同一であっても異なっていてもよい。
上記式（２）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｎ、ｐ、及びｑは、上記式（１）と同義である。
上記式（２）中、Ｒ７は、脂肪族炭化水素基又は置換基を有していてもよいアリール基を示す。脂肪族炭化水素基及び置換基を有していてもよいアリール基としては、上記Ｒ５又はＲ６について述べた基が挙げられる。
上記式（１）又は（２）で表される化合物の具体例を以下に挙げる。但し、上記式（１）又は（２）で表される化合物は、これらの具体例に限定されるものではない。
Figure 2021063035
また、上記式（１）又は（２）で表される化合物における、下記式（ｒ）で示される部分構造の具体例としては、下記式（ｒ１）に示す構造が挙げられる。
Figure 2021063035
Figure 2021063035
これらの上記式（１）又は（２）で表される化合物の具体例は、例えば、特開２００６−１１７６４８号公報、特開２００８−９４８３６号公報、国際公開第２００９／０３５０２０号、国際公開第２０１３／１６５００５号等に記載の方法に従って製造することができる。
その内、下記式（３）で表される化合物であるＲＩＤ−ＵＢ及び下記式（４）で表される化合物であるＲＩＤ−Ｂ−ＯＨ２は、後述する実施例に記載する方法に従って製造することができる。
Figure 2021063035
Figure 2021063035
上記式（１）又は（２）で表される化合物が酸性官能基又は塩基性官能基を有する場合、当該化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態であってもよい。例えば、上記式（１）又は（２）で表される化合物が酸性官能基を有する場合、当該化合物は、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニウム塩等の形態であってもよい。また、上記式（１）又は（２）で表される化合物が塩基性官能基を有する場合、当該化合物は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩の形態であってもよく、酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩の形態であってもよい。
上記式（１）又は（２）で表される化合物又はその塩は、ＢＲＡＰ２に結合することで、ＢＲＡＰ２の作用を増強することができる。したがって、上記式（１）又は（２）で表される化合物を用いることにより、ＢＲＡＰ２作用増強剤を製造することができる。ＢＲＡＰ２作用増強剤は、医薬用途に用いることができ、また、医薬以外の用途（研究用途等）に用いることもできる。
＜予防又は治療薬＞
本実施形態に係る予防又は治療薬は、上述した本実施形態に係るＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する。このため、本実施形態に係る予防又は治療薬は、ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患又は症状に対して有効である。なお、「予防」には、疾患の発症を防ぐことのほか、発症の時期を遅らせることも含まれる。また、「治療」には、疾患の症状を消失又は軽減させることのほか、症状の進行の度合いを抑制することも含まれる。
ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患の一例としては、炎症性疾患が挙げられる。炎症とは、組織損傷等の有害な刺激に対する防御反応である。炎症が起こると、炎症性サイトカインが産出され、免疫やシグナル伝達の調節に寄与するが、過剰な炎症性サイトカインの産出は、パーキンソン病等の様々な炎症性疾患を誘発する。炎症性サイトカインの産出には、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路とＮＦ−κＢ経路が大きく関与していることが報告されている。また、これらの経路は共に相互作用し、炎症性サイトカインを産生するため、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路とＮＦ−κＢ経路を同時に阻害することが、より効果的な治療アプローチにつながる（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．，２０１８，４１，１１０３参照）。また、ＢＲＡＰ２は、ＰＨＬＰＰ１と結合し、Ａｋｔの活性化を阻害することやＮＦ−κＢの核移行に関与するＣｕｌ１に結合することで、活性を阻害することが報告されている（Ｆａｔｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．，２０１５，５，９４５９；Ｔａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８，ｅ５８９１１参照）。これらのことから、ＢＲＡＰ２は抗炎症における重要な標的となると推測される。
炎症性疾患としては、アトピー性皮膚炎を含む各種皮膚炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、アレルギー、全身性紅斑性狼瘡、天疱瘡、アフター性口内炎、網膜炎等の眼疾患；胃炎、肝炎、気管支炎、食道炎、腸炎、膵臓炎、大膓炎、腎臓炎、床擦れ、狼瘡、慢性甲状腺炎、多発性硬化症等の各種慢性炎症疾患；敗血症、ショック、放射線損傷、臓器移植の拒絶反応等の各種急性炎症疾患；全身性浮腫及び局所性浮腫；などが挙げられる。
また、ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患の他の一例としては、自己免疫疾患が挙げられる。関節リウマチ等の自己免疫疾患は、身体を守るはずの免疫システムに異常が起こり、自分自身の身体を誤って攻撃するようになった状態である。その原因として、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１７細胞が大きく関与していることが報告されている。加えて、Ｔｈ１７細胞の分化にはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路が大きく関与している。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路が活性化すると、Ｔｈ１７細胞の分化に必須であるＲＯＲγは、Ｓ６Ｋ２と結合し、Ｓ６Ｋ２の核移行シグナルを利用して共に核へ輸送される（Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２０１２，１，３６０参照）。ＲＯＲγの核移行は、Ｔｈ１７細胞の分化促進のみに働き、他の細胞には影響を与えないことから、ＲＯＲγの制御が自己免疫疾患の新規治療戦略となり得る。ＢＲＡＰ２は、間接的にＡｋｔの活性化を阻害するとともに、核移行シグナルによる核移行を阻害することが報告されている（Ｆａｔｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．，２０１５，５，９４５９；Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，２００４，２４，８２３６参照）。つまり、ＢＲＡＰ２を制御できる薬剤は、自己免疫疾患の原因となるＴｈ１７細胞の分化を担うＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路及びＲＯＲγの核移行を阻害できる可能性をもつため、自己免疫疾患治療薬として用いることもできる。
自己免疫疾患としては、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、バセドウ病、１型糖尿病、シェーグレン症候群、炎症性大腸炎等の炎症性腸疾患；ベーチェット病；などが挙げられる。
また、ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患の他の一例としては、ウイルス感染症が挙げられる。核で機能するタンパク質の多くは、その分子内に核移行シグナルと呼ばれる配列を有している。ウイルスが自己複製するには、宿主細胞の核内にそのゲノムを送り込むことが不可欠である。そのため、デング出血熱を引き起こすデングウイルス、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型・Ｃ型肝炎ウイルスなどの多くのウイルスは、核移行シグナルによる核輸送を利用するため、カプシドと呼ばれるウイルスゲノムを包んでいる殻は核移行シグナルを有している。ＢＲＡＰ２は、核移行を阻害する機能を有しているため、新規核輸送の負の調節因子として注目されている（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，２００４，２４，８２３６参照）。実際に、ＢＲＡＰ２はサイトメガロウイルスが自己複製するのに重要な役割を果たすｐｐＵＬ４４と結合し、核への輸送を阻害することが報告されている（Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２０１０，２４，１４５４参照）。これらの知見は、ＢＲＡＰ２が抗ウイルス感染やウイルス性の疾患治療において、新たなアプローチの対象になることを示唆している。
また、ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患の他の一例としては、がんが挙げられる。がんとしては、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、肺がん、胃がん、肝がん、食道がん、膵臓がん、骨肉腫、大腸がん、卵巣がん、脳腫瘍、乳がん、腎がん；などが挙げられる。
＜免疫抑制剤＞
本実施形態に係る免疫抑制剤は、上述した本実施形態に係るＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する。
代表的なｍＴＯＲ阻害剤の一つであるラパマイシンは、ＩＬ−２刺激Ｔ細胞リンパ球のＧ１からＳ期への細胞周期の進行を妨げることにより、Ｔ細胞の増殖を減少させることが報告されている（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，１９９６，５８，３７３；Ｋａｗａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．，Ｈｅｐａｔｏｌ．，２０１１，５５，１４４１参照）。実際に、ｍＴＯＲ阻害剤は、様々な臓器の移植時に生じる拒絶反応を抑制できることが確認されており（Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｒ，Ｔｒａｎｓｐｌ．，２００１，７，４７３参照）、既に免疫抑制剤として臨床応用もされている。本実施形態に係るＢＲＡＰ２作用増強剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路を阻害可能であるため、免疫抑制剤として用いることもできる。
本実施形態に係る予防又は治療薬及び本実施形態に係る免疫抑制剤（以下、「予防又は治療薬等」という。）は、医薬品の分野において採用される任意の方法や適当な改良を加えた方法によって製造することができる。
予防又は治療薬等は、本実施形態に係るＢＲＡＰ２作用増強剤以外の成分を含有していてもよい。例えば、予防又は治療薬等は、製剤素材として慣用の有機又は無機の担体を含有していてもよい。この担体は、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等として、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合される。また、予防又は治療薬等は、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を含有していてもよい。
予防又は治療薬等の剤形は特に制限されない。予防又は治療薬等の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤等の経口剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。
予防又は治療薬等の適用対象は特に限定されず、哺乳類等を好ましく挙げることができる。哺乳動物としては、ヒト、及び非ヒト動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）のいずれであってもよい。
予防又は治療薬等の投与量は、投与対象、投与経路、対象疾患、症状等に応じて適宜決定される。
また、予防又は治療薬等は、投与目的等に応じて、他の薬剤と併用して投与してもよい。予防又は治療薬等とともに併用される薬剤の種類や量等は、得ようとする効果等に基づき適宜選択され、予防又は治療薬等とともに投与してもよく、別々に投与してもよい。
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
［化合物の合成］
＜合成例１：ＲＩＤ−Ｂ＞
ＲＩＤ−Ｂは特開２００６−１１７６４８号公報の実施例３に記載された方法に従って合成した。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-B;
mp: 108-109℃;
IR (KBr): 2929, 2789, 1606, 1511, 1460, 1280, 1242, 1174, 1040, 836, 821 cm-1;
1H NMR (CDCl3): δ 7.19-7.09 (m, 7H, Ar), 6.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Ar), 6.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Ar), 6.55 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Ar), 4.13 and 3.97 (t, J = 6.0 Hz, 4H, OCH2), 2.92 and 2.81 (t, J = 6.0 Hz, 4H, NCH2), 2.66-2.55 (m, 8 H, pyrroridinyl 2-H), 2.48 (q, J = 7.4 Hz, 2H, 3-H), 1.84-1.75 (m, 8H, pyrroridinyl 3-H), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 3H, 4-H);
13C NMR (CDCl3) δ 157.5, 156.7, 142.6, 140.9, 137.8, 136.3, 135.8, 131.8, 130.5, 129.7, 127.8, 125.8, 114.0, 113.3, 66.9, 66.7, 54.7, 54.7, 55.1, 55.1, 29.7, 29.0, 23.5, 23.4, 13.6;
HR MS (ESI): calcd for C34H43N2O2 (M+H+), 511.3319; found, 511.3319.
＜合成例２：ＲＩＤ−Ｓ１０＞
ＲＩＤ−Ｓ１０は国際公開第２０１３／１６５００５号の合成例１に記載された方法に従って合成した。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-S10;
mp: 161.3-161.9℃;
IR (KBr): 3400, 2966, 1606, 1505, 1227 cm-1;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.04-6.93 (m, 4H, Ar), 6.80-6.66 (m, 4H, Ar), 2.13 (q, J = 7.5 Hz, 4H, 3-H), 1.00 (t, J = 7.5 Hz, 6H, 4-H);
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 156.4, 156.3, 141.8, 138.2, 136.6, 131.2, 115.6 (Ar, 1, 2), 25.3 (3), 13.7 (4);
HR MS (ESI): calcd for C18H20O2Na (M+Na+) 291.1356, found 291.1343.
＜合成例３：ＲＩＤ−ＳＢ１０＞
ＲＩＤ−ＳＢ１０は国際公開第２０１３／１６５００５号の合成例１に記載された方法に従って合成した。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-SB10;
mp: 81.7-82.3℃;
IR (KBr): 2962, 2800, 1604, 1512, 1458, 1280, 1242, 1172, 1041, 818 cm-1;
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.06-7.01 (m, 4H, Ar), 6.82-6.80 (m, 4H, Ar), 4.12 (t, J = 6.0 Hz, 4H, OCH2), 2.88 (t, J = 6.0 Hz, 4H, NCH2), 2.68-2.56 (m, 8H, pyrrolidinyl 2-H), 2.14 (q, J = 7.6 Hz, 4H, 3-H), 1.86-1.74 (m, 8H, pyrrolidinyl 3-H), 0.99 (t, J = 7.6 Hz, 6H, 4-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 157.1, 141.6, 136.4, 136.1 (Ar), 130.2 (1), 114.0 (2), 66.9 (OCH2), 55.1 (NCH2), 54.7 (pyrrolidinyl 2-C), 24.4 (3), 23.5 (pyrrolidinyl 3-C), 13.4 (4);
HR MS (ESI): calcd for C30H43N2O2 (M+H+) 463.3319, found 463.3303.
＜合成例４：ＲＩＤ−ＳＢ１７＞
ＲＩＤ−ＳＢ１７は国際公開第２０１３／１６５００５号の合成例４に記載された方法に従って合成した。得られた化合物の物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-SB17;
IR (neat): 2954, 2785, 1604, 1504, 1242 cm-1;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.00 (d, J = 8.7 Hz, 4H, Ar), 6.80 (d, J = 8.7 Hz, 4H, Ar), 4.07 (t, J = 6.0 Hz, 4H, OCH2), 2.88 (t, J = 6.0 Hz, 4H, NCH2), 2.66-2.56 (m, 8H, pyrrolidinyl 2-H), 2.09 (t, J = 7.8 Hz, 4H, 3-H), 1.85-1.76 (m, 8H, pyrrolidinyl 3-H), 1.40 (tt, J = 7.2, 7.2 Hz, 4H, 4-H), 1.30-1.11 (m, 8H, 5-H and 6-H), 0.84 (t, J = 6.9 Hz, 6H, 7-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 156.9, 139.1, 136.9, 136.6 (Ar), 130.4 (1), 113.9 (2), 66.8 (OCH2), 55.1 (NCH2), 54.7 (pyrrolidinyl 2-C), 31.8 (3), 31.6 (4), 28.2 (5), 23.5 (pyrrolidinyl 3-C), 22.4 (6), 14.0 (7);
HR MS (ESI): calcd for C36H55N2O2 (M+H+) 547.4258, found 547.4276.
＜合成例５：ＲＩＤ−Ｇ＞
ＲＩＤ−Ｇは特開２００８−９４８３６号公報の実施例４に記載された方法に従って合成した。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-G;
mp: 94-95℃;
IR (neat): 3035, 2954, 1606, 1510, 837, 820 cm-1;
1H NMR (CDCl3): δ 7.17-7.07 (m, 7H, Ar-H), 6.88-6.86 (m, 2H, Ar-H), 6.76-6.73 (m, 2H, Ar-H), 6.54-6.51 (m, 2H, Ar-H), 4.03 (t, J = 6.5 Hz, 2H, OCH2), 3.87 (t, J = 6.5 Hz, 2H, OCH2), 2.48-2.45 (m, 4H, NCH2 and 3-H), 2.38 (t, J = 7.3 Hz, 2H, NCH2), 2.26 (s, 6H, CH3*2), 2.21 (s, 6H, CH3*2), 1.97 (tt, J = 7.3, 6.5 Hz, 2H, -CH2-), 1.86 (tt, J = 7.3, 6.5 Hz, 2H, -CH2-), 0.92 (t, J = 7.5 Hz, 3H, 4-H);
13C NMR (CDCl3): δ 157.7, 156.8 (Ar), 142.7 (1-C), 140.8 (2-C), 137.9, 136.2, 135.7, 131.9, 130.5, 129.7, 127.8, 125.8, 113.9, 113.2 (Ar), 66.1, 65.9 (OCH2), 56.5, 56.4 (NCH2), 45.51, 45.46 (CH3), 29.0 (3-C), 27.6, 27.5 (-CH2-), 13.6 (4-C);
HR MS (ESI): calcd for C32H43N2O2 (M+H+) 487.3319, found 487.3325.
＜合成例６：ＲＩＤ−ＳＧ１７＞
ＲＩＤ−ＳＧ１７は国際公開第２０１３／１６５００５号の合成例４に記載された方法に従い、合成例１の１−（２−クロロエチル）ピロリジン塩酸塩を（３−クロロプロピル）ジメチルアミン塩酸塩とすることで合成した。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-SG17;
IR (neat): 3039, 2954, 2861, 1604, 1504, 1466, 1265, 1241, 1172, 1057, 833, 740 cm-1;
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 6.99 (d, J = 8.7 Hz, 4H, Ar), 6.78 (d, J = 8.7 Hz, 4H, Ar), 3.98 (t, J = 6.3 Hz, 4H, OCH2), 2.45 (t, J = 6.9 Hz, 4H, NCH2), 2.26 (s, 12H, N(CH3)2), 2.10 (t, J = 7.5 Hz, 4H, 3-H), 1.94 (tt, J = 6.9, 6.3 Hz, 4H, NCH2CH2CH2O), 1.40 (tt, J = 7.5, 6.9 Hz, 4H, 4-H), 1.24-1.16 (m, 8H, 5-H, 6-H), 0.84 (t, J = 6.9 Hz, 6H, 7-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 157.1, 139.0, 136.9, 136.4 (Ar), 130.4 (1), 113.8 (2), 66.1 (OCH2), 56.5 (NCH2), 45.5 (N(CH3)2), 31.8 (3), 31.6 (4), 28.2 (5), 27.6 (NCH2CH2CH2O), 22.4 (6), 14.0 (7);
HR MS (ESI): calcd for C34H55N2O2 (M+H+) 523.4258, found 523.4242.
＜合成例７：ＲＩＤ−Ｈ＞
ＲＩＤ−Ｈは既報（Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，７１，２９０）に記載された方法に従って合成した。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-H;
Mp: 64-65 ℃;
IR (neat): 3034, 2957, 1605, 1507, 1173, 817 cm-1;
1H NMR (CDCl3): δ 7.17-7.07 (7H, m, Ar), 6.88-6.86 (2H, m, Ar), 6.76-6.73 (2H, m, Ar), 6.54-6.51 (2H, m, Ar), 4.04 (2H, t, J = 6.50 Hz, OCH2), 3.88 (2H, t, J = 6.50 Hz, OCH2), 2.63 (2H, t, J = 7.25 Hz, NCH2), 2.56-2.45 (12H, m, NCH2, 3-H and pyrrolidinyl 2-H), 2.02 (2H, tt, J = 7.25, 6.50 Hz, -CH2-), 1.92 (2H, tt, J = 7.25, 6.50 Hz, -CH2-), 1.81-1.75 (8H, m, pyrrolidinyl 3-H), 0.92 (3H, t, J = 7.50 Hz, 4-H);
13C NMR (CDCl3): δ 157.7, 156.8 (Ar), 142.7 (1-C), 140.8 (2-C), 137.9, 136.2, 135.7, 131.9, 130.5, 129.7, 127.8, 125.8, 113.9, 113.2 (Ar), 66.30, 66.07 (OCH2), 54.25, 54.20 (pyrrolidinyl 2-C), 53.22, 53.17 (NCH2), 29.0 (3-C), 28.95, 28.86 (-CH2-), 23.43, 23.40 (pyrrolidinyl 3-C), 13.6 (4-C);
HR MS (ESI): calcd for C36H47N2O2 (M+H+) 539.3638, found 539.3614.
＜合成例８：ＲＩＤ−ＳＨ１７＞
ＲＩＤ−ＳＨ１７は国際公開第２０１３／１６５００５号の合成例４に記載された方法に従い、合成例１の１−（２−クロロエチル）ピロリジン塩酸塩を１−（３−クロロプロピル）ピロリジン塩酸塩とすることで合成した。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-SH17;
mp: 32.5-33.1℃;
IR (KBr): 2954, 2854, 1612, 1512, 1466, 1280, 1242, 1172, 1057, 818 cm-1;
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.00-6.98 (m, 4H, Ar), 6.80-6.77 (m, 4H, Ar), 3.99 (t, J = 6.5 Hz, 4H, OCH2), 2.63 (t, J = 7.5 Hz, 4H, NCH2), 2.56-2.53 (br m, 8H, pyrrolidinyl 2-H), 2.09 (t, J = 7.5 Hz, 4H, 3-H), 2.00 (tt, J = 7.5, 6.5 Hz, 4H, NCH2CH2CH2O), 1.81-1.78 (br m, 8H, pyrrolidinyl 3-H), 1.39 (quint, J = 7.5 Hz, 4H, 4-H), 1.25-1.15 (m, 8H, 5-H and 6-H), 0.84 (t, J = 7.5 Hz, 6H, 7-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 157.0, 139.0, 136.9, 136.4 (Ar), 130.4 (1), 113.8 (2), 66.2 (OCH2), 54.2 (NCH2), 53.2 (pyrrolidinyl 2-C), 31.8 (3), 31.6 (4), 28.8 (NCH2CH2CH2O), 28.2 (5), 23.4 (pyrrolidinyl 3-C), 22.5 (6), 14.0 (7);
HR MS (ESI): calcd for C38H59N2O2 (M+H+) 575.4571, found 575.4562.
＜合成例９：ＲＩＤ−ＵＢ）
４，４’−（４”−ｃｈｌｏｒｏ−２”−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔ−１”−ｅｎｅ−１”，１”−ｄｉｙｌ）ｄｉｐｈｅｎｏｌ（２０．５ｍｇ，０．０５８４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５８ｍＬ）に溶解させ、５５％水素化ナトリウム（流動パラフィン分散剤，２０．４ｍｇ，０．４６７ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１５分撹拌した。室温にし、１−（２−クロロエチル）ピロリジン塩酸塩（３２．８ｍｇ，０．１９３ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を５０℃で３時間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を０℃で加えて反応を停止し、塩化メチレンで抽出した。有機層を集合して無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、これを濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー（アンモニア性クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製した後、再度、薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製すると淡黄色油状の化合物が得られた（５．２ｍｇ，１８％）。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-UB;
IR (ATR): 3034, 2961, 2928, 2781, 1604, 1507, 1245 cm-1;
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.26-7.12 (m, 7H, Ar and 3'''-H), 6.91 (d, J = 7.5 Hz, 2H, Ar), 6.77-6.72 (m, 3H, Ar), 6.55 (d, J = 7.5 Hz, 2H, Ar), 5.10 (d, J = 10.5 Hz, 1H, 4-H), 4.88 (d, J = 17.0 Hz, 1H, 4-H), 4.15 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.97 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 2.92 (t, J = 6.0 Hz, 2H, NCH2), 2.81 (t, J = 6.0 Hz, 2H, NCH2), 2.67-2.65 (m, 4H, pyrrolidinyl 2-H), 2.59-2.57 (m, 4H, pyrrolidinyl 2-H), 1.83-1.81 (m, 4H, pyrrolidinyl 3-H), 1.80-1.77 (m, 4H, pyrrolidinyl 3-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 158.0, 157.1, 141.6, 140.5, 138.9, 137.7, 135.4, 135.0, 132.2, 132.2, 131.5, 127.8, 126.2, 116.8 (4), 113.8, 113.3, 66.9, 66.7, 55.1, 55.0, 54.7 and 54.7 (pyrrolidinyl 2-C), 23.5 and 23.4 (pyrrolidinyl 3-C);
HR MS (ESI): calcd for C34H41N2O2 (M+H+) 509.3163, found 509.3161.
＜合成例１０：ＲＩＤ−Ｂ−ＯＨ２＞
（中間体の合成１）
まず、以下の方法で中間体である４，４’−（２’’−（４’’’−（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔ−１’’−ｅｎｅ−１’’，１’’−ｄｉｙｌ）ｄｉｐｈｅｎｏｌを合成した。
亜鉛粉末（４．０２ｇ，６１．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３８．０ｍＬ）懸濁液に、−１０℃で塩化チタン（ＩＶ）（３．１ｍＬ，２７．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を９０℃（バス温）で２時間還流した後、この反応混合物に、ＴＨＦ（７８．６ｍＬ）に溶解した４，４’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ（２．６６ｇ，１４．６ｍｍｏｌ）と１−（４’−（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎ−１−ｏｎｅ（８８５．９ｍｇ，４．５６ｍｍｏｌ）の混合物を０℃で加えた。反応混合物を暗所にて、９０℃（バス温）で２時間還流した後、明所にて０℃で１０％炭酸カリウム水溶液を混合物に加えた。混合物を酢酸エチルでセライトの短いパッドを通して濾過し、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。混合物を濾過し、溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液；ヘキサン／酢酸エチル＝６／１）で精製して、生成物（１．３２ｇ，８４％）を白色固体として得た。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
mp: 168-169℃;
IR (ATR): 3302, 1606, 1507, 1238, 828 cm-1;
1H NMR (CD3OD): δ 7.37-7.24 (m, 5H, -OCH2Ph), 7.01-6.98 (m, 4H, Ar), 6.94 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 6.68-6.61 (m, 2H, Ar), 6.42 (dd, J = 6.5, 2.0 Hz, 2H, Ar), 4.94 (s, 2H, -OCH2Ph), 4.87 (s, 2H, -OH) 2.44 (q, J = 7.5 Hz, 2H, 3''-H), 0.89 (t, J = 7.5 Hz, 3H, 4''-H);
13C NMR (CD3OD): δ 158.4, 157.0, 156.1, 141.0, 139.5, 138.7, 136.8, 136.6, 136.4, 133.1, 131.9, 131.6, 130.7, 129.4, 128.8, 128.6, 116.0, 115.8, 115.3, 115.1, 70.9 (-OCH2Ph), 29.8 (C3''), 14.1 (C4'');
HR MS (ESI): calcd for C29H25O3 (M+H+) 421.1798, found 421.1792.
（中間体の合成２）
次に、以下の方法で中間体であるＲＩＤ−Ｂ−ＯＢｎ２を合成した。
４，４’−（２’’−（４’’’−（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔ−１’’−ｅｎｅ−１’’，１’’−ｄｉｙｌ）ｄｉｐｈｅｎｏｌ（４１．１ｍｇ，０．０９７３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．０ｍＬ）溶液に５５％水素化ナトリウム（パラフィン液中の分散物，３４．０ｍｇ，０．７７８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃で１５分間撹拌し、次いで室温で１−（２−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（５４．６ｍｇ，０．３２１ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を５０℃で３時間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を０℃で加えた。混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。混合物を濾過し、溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（溶離液；アンモニア性クロロホルム／メタノール＝１５／１）で精製し、ＲＩＤ−Ｂ−ＯＢｎ２（４７．８ｍｇ，８０％）を白色固体として得た。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
mp: 114.5-115.3℃;
IR (ATR): 2928, 2873, 2788, 1606, 1508, 1241 cm-1;
1H NMR (CDCl3): δ 7.43-7.32 (m, 5H, -OCH2Ph), 7.14-7.12 (m, 2H, Ar), 7.04-7.02 (m, 2H, Ar), 6.90-6.88 (m, 2H, Ar), 6.80-6.76 (m, 4H, Ar), 6.56-6.57 (m, 2H, Ar), 5.00 (s, 2H, -OCH2Ph), 4.13 (t, J = 5.5 Hz, 2H, 1''-H), 3.99 (t, J = 5.5 Hz, 2H, 1''-H), 2.92 (t, J = 6.0 Hz, 2H, 2''-H), 2.82 (t, J = 6.0 Hz, 2H, 2''-H), 2.66-2.63 (m, 4H, 2-H or 2'-H), 2.61-2.58 (m, 4H, 2-H or 2'-H), 2.45 (q, J = 7.5 Hz, 2H, 3'''-H), 1.83-1.81 (m, 4H, 3-H or 3'-H), 1.80-1.77 (m, 4H, 3-H or 3'-H), 0.93 (t, J = 7.5 Hz, 3H, 4'''-H);
13C NMR (CDCl3): δ 157.4 and 156.9 and 156.6 (C4'''' or C4'''''), 140.3, 137.4, 137.1, 136.5, 136.0, 135.0, 131.9, 130.7, 130.5, 128.5, 127.8, 127.5, 114.2 and 114.0 and 113.4 (C3'''' or C3'''''), 69.8 (-OCH2Ph), 66.9 and 66.7 (C1''), 55.1 and 55.1 and 54.7 (C2 or C2' or C2''), 28.9 (C3'''), 23.4 and 23.4 (C3 or C3'), 13.7 (C4''');
HR MS: calcd for C41H49N2O3 (M+H+) 617.3738, found 617.3707.
（ＲＩＤ−Ｂ−ＯＨ２の合成）
アルゴン雰囲気下、室温で酢酸エチル（２．５ｍＬ）中のＲＩＤ−Ｂ−ＯＢｎ２（４６．７ｍｇ，０．０７５７ｍｍｏｌ）の溶液に、パラジウム炭素（１０％，３２．２ｍｇ，０．０３０３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を暗所で水素雰囲気（１．０気圧）下、室温で２時間撹拌し、次いで明所でアルゴン雰囲気に移した。混合物をセライトの短いパッドを通して酢酸エチルで濾過し、溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液；アンモニア性クロロホルム／メタノール＝１５／１）で精製してＲＩＤ−Ｂ−ＯＨ２（３０．１ｍｇ，７５％）を無色の油状物質として得た。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-B-OH2;
mp: 151.2-151.9℃;
IR (ATR): 3365, 2964, 2930, 2873, 2808, 1607, 1509, 1243, 1173, 832, 756 cm-1;
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.12-7.10 (m, 2H, Ar), 6.85 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 2H, Ar), 6.74 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 2H, Ar), 6.55 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar), 6.48 (d, J = 3.0 Hz, 2H, Ar), 6.46 (d, J = 3.0 Hz, 2H, Ar), 4.12 (t, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2), 3.96 (t, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2), 2.93 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 2.85 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 2.69-2.63 (m, 8H, pyrrolidinyl 2-H), 2.42 (q, J = 7.0 Hz, 2H, 3-H), 1.85-1.78 (m, 8H, pyrrolidinyl 3-H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 3H, 4-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 157.2, 156.3, 155.1, 140.7, 136.8, 136.8, 136.3, 133.5, 131.9, 130.8, 130.6, 115.2, 114.0, 113.2, 66.6 and 66.0 (OCH2), 55.0, 55.0, 54.6 and 54.4 (pyrrolidinyl 2-C), 28.9 (3), 23.4 and 23.2 (pyrrolidinyl 3-C), 13.7 (4);
HR MS (ESI): calcd for C34H43N2O3 (M+H+) 527.3268, found 527.3253.
＜合成例１１：ＲＩＤ−ＮＢ＞
ＲＩＤ−ＮＢは国際公開第２００９／０３５０２０号の実施例１（６）（ｉ）に記載された方法に従って合成した。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-NB;
mp: 79.3-80.0℃;
IR (KBr): 3023, 2962, 2792, 1604, 1489, 1280, 1241, 1049, 825, 694 cm-1;
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.10 (t, J = 7.5 Hz, 2H, Ar), 7.04-7.03 (m, 1H, Ar), 7.01-6.99 (m, 2H, Ar), 6.95-6.93 (m, 2H, Ar), 6.79-6.75 (m, 3H, Ar), 6.70 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar), 6.60 (dd, J = 8.5, 2.5 Hz, 1H, Ar), 4.16 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 4.12 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 2.96 (t, J = 5.5 Hz, 4H, NCH2), 2.92 (t, J = 8.5 Hz, 2H, 1-H), 2.78-2.71 (m, 10H, 2-H and pyrrolidinyl 2-H), 1.86-1.84 (br m, 8H, pyrrolidinyl 3-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 157.4, 157.2, 143.2, 137.7, 134.6 (4), 132.2 (3), 132.1, 130.6, 128.2, 127.5, 127.4, 125.6, 114.0, 113.8, 111.4, 66.5 (OCH2), 66.4 (OCH2), 55.0 (NCH2), 54.9 (NCH2), 54.7 (pyrrolidinyl 2-C), 54.6 (pyrrolidinyl 2-C), 30.7 (2), 28.9 (1), 23.4 (pyrrolidinyl 3-C);
HR MS (ESI): calcd for C34H41N2O2 (M+H+) 509.3163, found 509.3183.
＜合成例１２：ＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／ＯＨ）＞
ＲＩＤ−Ｓ１０（１１０ｍｇ，０．４１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４．１ｍＬ）に溶解させ、５５％水素化ナトリウム（流動パラフィン分散剤，３９．４ｍｇ，０．９０２ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１５分撹拌した。これに１−（２−クロロエチル）ピロリジン塩酸塩（７６．７ｍｇ，０．４５１ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で７時間撹拌した。冷却後、反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止し、塩化メチレンで抽出した。有機層を集合して飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、これを濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／アンモニア＝９０／１０／２）で精製すると目的の白色固体が得られた（７２．８ｍｇ，４９％）。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-S10-(B/OH);
mp: 131.8-132.5℃;
IR (KBr): 3433, 3031, 2962, 2870, 1604, 1504, 1272, 1234, 1172, 1049, 825 cm-1;
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.00-6.96 (m, 4H, Ar), 6.73-6.69 (m, 4H, Ar), 4.06 (t, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2), 2.91 (t, J = 6.0 Hz, 2H, NCH2), 2.68-2.63 (m, 4H, pyrrolidinyl 2-H), 2.14 (q, J = 7.5 Hz, 2H, 3-H or 3’-H), 2.13 (q, J = 7.5 Hz, 2H, 3’-H or 3-H), 1.85-1.80 (m, 4H, pyrrolidinyl 3-H), 0.99 (t, J = 7.5 Hz, 6H, 4-H and 4’-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 156.7, 154.8, 141.1, 136.5, 136.2, 135.4, 130.5, 130.3, 115.1, 113.6 (Ar, 1, 2), 65.8 (OCH2), 55.2 (NCH2), 54.4 (pyrrolidinyl 2-C), 24.4 (3), 23.3 (pyrrolidinyl 3-C), 13.4 (4);
HR MS (ESI): calcd for C24H32NO2 (M+H+) 366.2428, found 366.2436.
＜合成例１３：ＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／Ｍｅ）＞
５５％水素化ナトリウム（流動パラフィン分散剤，１０．４ｍｇ，０．２３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．３ｍＬ）に懸濁し、ＲＩＤ−Ｓ１０−（ＯＨ／Ｍｅ）（２２．４ｍｇ，７９．３μｍｏｌ）を加えて５０℃で１５分撹拌した。これに１−（２−クロロエチル）ピロリジン塩酸塩（２０．２ｍｇ，０．１１９ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１２時間撹拌した。冷却後、反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止し、塩化メチレンで抽出した。有機層を集合して無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、これを濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／アンモニア＝９０／３／２）で精製すると黄色油状の化合物が得られた（２９．７ｍｇ，９９％）。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-S10-(B/Me);
mp: 39.9-40.6℃;
IR (KBr): 3032, 2962, 2869, 1604, 1512, 1458, 1273, 1242, 1041, 818 cm-1;
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.06-7.01 (m, 4H, Ar), 6.84-6.79 (m, 4H, Ar), 4.08 (t, J = 6.2 Hz, 2H, OCH2), 3.78 (s, 3H, OMe), 2.88 (t, J = 6.0 Hz, 2H, NCH2), 2.64-2.60 (m, 4H, pyrrolidinyl 2-H), 2.14 (q, J = 7.6 Hz 4H, 3-H and 3’-H), 1.82-1.78 (m, 4H, pyrrolidinyl 3-H), 1.00 (t, J = 7.4 Hz, 6H, 4-H and 4’-H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 157.7, 157.1, 141.6, 136.3, 136.1, 130.3, 130.2, 113.9, 113.3, 66.9, 55.1 (NCH2), 54.7 (pyrrolidinyl 2-C), 24.4 (3), 23.5 (pyrrolidinyl 3-C), 13.4 (4);
HR MS (ESI): calcd for C25H34NO2 (M+H+) 380.2584, found 380.2598.
＜合成例１４：ＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／ＭＥＥ）＞
ＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／ＯＨ）（３４．０ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．９３ｍＬ）に溶解させ、５５％水素化ナトリウム（流動パラフィン分散剤，１２．２ｍｇ，０．２７９ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１５分撹拌した。これに２−クロロエチルメチルエーテル（１４．４μＬ，０．１５８ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で３時間撹拌した後、５５％水素化ナトリウム（流動パラフィン分散剤，４．１ｍｇ，９３．０μｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．３ｍＬ）、及び２−クロロエチルメチルエーテル（８．５μＬ，９３．３μｍｏｌ）を加えて５０℃で更に１４時間撹拌した。冷却後、反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止し、塩化メチレンで抽出した。有機層を集合して飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、これを濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／アンモニア＝９０／１０／２）で精製し、更に薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／アンモニア＝９／６／２）で精製すると目的の白色固体が得られた（３３．１ｍｇ，８４％）。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-S10-(B/MEE);
mp: 30.4-31.1℃;
IR (KBr): 3032, 2962, 2877, 1604, 1512, 1457, 1280, 1242, 1041, 825 cm-1;
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.04-7.00 (m, 4H, Ar), 6.84-6.80 (m, 4H, Ar), 4.08 (tt, J = 6.0, 5.3 Hz, 4H, OCH2), 3.73 (t, J = 4.8 Hz, 2H, MeOCH2), 3.44 (s, 3H, OMe), 2.88 (t, J = 6.3 Hz, 2H, NCH2), 2.62-2.60 (m, 4H, pyrrolidinyl 2-H), 2.14 (q, J = 7.3 Hz, 2H, 3-H or 3’-H), 2.13 (q, J = 7.3 Hz, 2H, 3’-H or 3-H), 1.81-1.78 (m, 4H, pyrrolidinyl 3-H), 1.00 (t, J = 7.5 Hz, 3H, 4-H or 4’-H), 0.99 (t, J = 7.5 Hz, 3H, 4’-H or 4-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 157.0, 156.9, 141.6, 136.5, 136.3, 136.0, 130.2, 113.9, 113.9 (Ar, 1, 2), 71.0 (MeOCH2), 67.1, 66.8 (OCH2), 59.2 (OMe), 55.1 (NCH2), 54.7 (pyrrolidinyl 2-C), 24.3 (3), 23.4 (pyrrolidinyl 3-C), 13.4 (4);
HR MS (ESI): calcd for C27H38NO3 (M+H+) 424.2846, found 424.2841.
＜合成例１５：ＲＩＤ−ＳＢ３１＞
まず、ＲＩＤ−Ｓ３１を既報（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１２，３，１０５）に従って合成した。次に、ＲＩＤ−Ｓ３１（２１．７ｍｇ，８６．０μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．６７ｍＬ）に溶解し、５５％水素化ナトリウム（流動パラフィン分散剤，１２．８ｍｇ，０．２９３ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１５分撹拌した。これに１−（２−クロロエチル）ピロリジン塩酸塩（２４．８ｍｇ，０．１４６ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１２時間撹拌した。冷却後、反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止し、塩化メチレンで抽出した。有機層を集合して無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、これを濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／アンモニア＝９０／３／２）で精製すると黄色油状の化合物が得られた（３０．５ｍｇ，ｑｕａｎｔ．）。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
RID-SB31;
IR (neat): 3032, 2970, 2785, 1604, 1504, 1466, 1265, 1242, 1173, 1041, 825, 740 cm-1;
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.27-7.24 (m, 1H, Ar), 7.18-7.12 (m, 3H, Ar), 7.06-7.03 (m, 2H, Ar), 6.83-6.81 (m, 2H, Ar), 4.08 (t, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2), 2.88 (t, J = 6.0 Hz, 2H, NCH2), 2.64-2.57 (m, 4H, pyrrolidinyl 2-H), 2.15 (q, J = 7.5 Hz, 2H, 3-H or 3’-H), 2.12 (q, J = 7.5 Hz, 2H, 3’-H or 3-H), 1.84-1.76 (m, 4H, pyrrolidinyl 3-H), 1.01 (t, J = 7.0 Hz, 3H, 4-H or 4’-H), 1.00 (t, J = 7.0 Hz, 3H, 4’-H or 4-H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 157.0, 143.8, 141.9, 136.6, 136.0, 129.2, 127.9 (Ar), 125.9 (1), 113.9 (2), 66.7 (OCH2), 55.1 (NCH2), 54.7 (pyrrolidinyl 2-C), 24.3 (3), 23.4 (pyrrolidinyl 3-C), 13.4 (4);
HR MS (ESI): calcd for C24H32NO (M+H+) 350.2478 found 350.2491.
＜合成例１６：ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ（Ｂｉｏ）−ＲＩＤ−Ｂ（Ｂｉｏ−ＲＩＤ−Ｂ）＞
Ｎ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌ−ｃａｐｒｏｙｌａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ Ａｃｉｄ（１２．６ｍｇ，２６．７μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．３３ｍＬ）に溶解させ、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（１１．０ｍｇ，３２．１μｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６５ｍｇ，５．３５μｍｏｌ）、トリエチルアミン（２２．４μＬ，０．１６０ｍｍｏｌ）、及びＤＭＦ（０．６６ｍＬ）を加えて１０分間撹拌した。更に２−（３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１，１−ｂｉｓ｛４−［２−（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ｝−１−ｂｕｔｅｎｅ（１６．９ｍｇ，３２．１μｍｏｌ）とＤＭＦ（０．３３ｍＬ）を加えて室温で１時間撹拌した。減圧下でこれを濃縮し、残渣を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／アンモニア＝９０／１０／２）で精製すると目的の化合物が得られた（９．８ｍｇ，３９％）。得られた化合物の化学構造及び物性データは以下のとおりである。
Figure 2021063035
Bio-RID-B;
mp: 150.8℃ (decompose);
IR (KBr): 3379, 3294, 3085, 2931, 2861, 1759, 1697, 1643, 1512, 1242, 1172, 1041, 833 cm-1;
1H NMR (500 MHz, methanol-d4): δ 7.17-7.11 (m, 3H, Ar), 6.96-6.92 (m, 3H, Ar), 6.83-6.81 (m, 2H, Ar), 6.76 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar), 6.59 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar), 4.47 (td, J = 8.0, 4.0 Hz, 1H, 8’’’-H), 4.28 (td, J = 8.0, 4.0 Hz, 1H, 7’’’-H), 4.15 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 4.00 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.20-3.13 (m, 5H, 6’-H, 6’’-H and 6’’’-H), 2.95 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 2.92-2.88 (m, 1H, 9’’’-H), 2.86 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 2.71-2.65 (m, 9H, pyrrolidinyl 2-H and 9’’’-H), 2.53 (t, J = 7.5 Hz, 2H, 2’-H), 2.47 (q, J = 7.5 Hz, 2H, 3-H), 2.19-2.15 (m, 4H, 2’’-H and 2’’’-H), 1.86-1.79 (m, 8H, pyrrolidinyl 3-H), 1.67-1.48 (m, 8H, 3’-H, 3’’-H, 3’’’-H and 5’’’-H), 1.43-1.40 (m, 4H, 5’-H and 5’’-H), 1.36-1.28 (m, 6H, 4’-H, 4’’-H and 4’’’-H), 0.93 (t, J = 7.5 Hz, 3H, 4-H);
13C NMR (125 MHz, methanol-d4): 176.0 (carboxyl), 176.0, 175.9 (6’-amide and 6’’-amide), 173.6 (carbamate), 159.1, 158.3, 152.1, 145.6, 140.2, 137.4 (Ar), 137.0 (1), 133.0, 131.6, 129.8, 128.5, 124.0, 115.2, 114.6 (2), 67.6, 67.3 (OCH2), 63.4 (7’’’), 61.6 (8’’’), 57.0 (6’’’), 56.1, 56.0 (NCH2), 55.6, 55.5 (pyrrolidinyl 2-C), 40.2, 40.2 (6’ and 6’’), 37.0, 36.8 (2’’ and 2’’’), 34.9 (2’), 30.1 (3), 29.8, 29.5 (5’ and 5’’), 27.6, 27.4, 27.4 (4’, 4’’ and 4’’’), 26.9, 26.7, 25.7, 25.6 (3’, 3’’, 3’’’ and 5’’’), 24.2, 24.2 (pyrrolidinyl 3-C), 13.9 (4);HR MS (ESI): calcd for C56H79N6O7S (M+H+) 979.5725, found 979.5688.
［細胞］
以下の試験では、ヒト白血病Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社）を用いた。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、３．５μｇ／Ｌの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｗａｋｏ社）、７５ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩（Ｗａｋｏ社）、２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３（Ｗａｋｏ社）、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｆｉｌｌ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用し、３７℃に設定した５％ ＣＯ２インキュベーター（ＥＳＰＥＣ社）内で培養した。
＜試験例１＞
試験例１では、ＲＩＤ−Ｂ及び下記式で表される公知化合物のＴａｍｏｘｉｆｅｎ（本明細書において、「ＴＡＭ」ともいう）をＪｕｒｋａｔ細胞に添加した場合の、細胞傷害を確認した。ＲＩＤ−Ｂを添加した場合のＭＴＴアッセイの結果を図１Ａに、ＴＡＭを添加した場合のＭＴＴアッセイの結果を図１Ｄに示す。また、ＲＩＤ−Ｂを添加した場合のｓｕｂＧ１期解析の結果を図１Ｂに、ＴＡＭを添加した場合のｓｕｂＧ１期解析の結果を図１Ｅに示す。また、ＲＩＤ−Ｂを添加した場合の活性型ｃａｓｐａｓｅ−３の検出の結果を図１Ｃに、ＴＡＭを添加した場合の活性型ｃａｓｐａｓｅ−３の検出の結果を図１Ｆに示す。
Figure 2021063035
（ＭＴＴアッセイ）
２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＪｕｒｋａｔ細胞を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに８０μＬずつ分注後、ＲＩＤ−Ｂ及びＴＡＭを各濃度で添加し、１１時間作用させた。ＭＴＴ試薬（Ｗａｋｏ社）を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１時間作用させた。終了後、９６穴プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いた。各ｗｅｌｌにＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ社）を１００μＬずつ添加し、生成したホルマザン沈殿を溶解した。マイクロプレートリーダー（Ａｗａｒｅｎｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて５７０ｎｍの吸光度を測定することでミトコンドリアのＮＡＤＨ量を測定し、細胞生存率を数値化した。
図１Ａ及び図１Ｄに示されるように、ＲＩＤ−ＢのＩＣ５０が約０．４μＭであったのに対し、ＴＡＭのＩＣ５０は約２０μＭであり、約５０倍の差が確認された。
（ｓｕｂＧ１期解析）
２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＪｕｒｋａｔ細胞に、ＲＩＤ−Ｂが終濃度０．４μＭと、ＴＡＭが終濃度２０μＭとなるように添加し、１２時間作用させた。細胞を回収後、ＰＢＳで遠心洗浄し、５００μＬの０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−１００（Ｗａｋｏ社）を含んだＰＢＳで懸濁した。１２．５μＬの１ｍｇ／ｍＬ ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｗａｋｏ社）と５ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ（Ｗａｋｏ社）を加えて懸濁し、２０分間室温暗所で静置した。その後、ナイロンメッシュに通してＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）でＰＩの蛍光強度を検出することでＤＮＡの定量を行い、薬剤により断片化したＤＮＡ（ｓｕｂＧ１期）を測定した。
図１Ｂ及び図１Ｅに示されるように、上記ＭＴＴアッセイで確認されたＲＩＤ−Ｂ及びＴＡＭのそれぞれのＩＣ５０において、ｓｕｂＧ１期のポピュレーションの増加が確認された。
（ウェスタンブロッティング）
２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＪｕｒｋａｔ細胞に、ＲＩＤ−Ｂが終濃度０．４μＭ、ＴＡＭが終濃度２０μＭとなるように添加し、１２時間作用させた。終了後、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで可溶化を行った。ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙを用いて２．０ｍｇ／ｍＬに調整した２０μＬのｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅと２０μＬのｓａｍｐｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを混合したサンプルを１００℃で３分間インキュベートした。タンパク質の分離には４％分離ゲルを重合させた１２％又は１５％ＳＤＳポリアクリルミドゲルを用いた。泳動終了後、転写を行い、ＰＶＤＦ膜を３％スキムミルク原液に浸し、室温で６０分間ブロッキング操作を行った。その後、スキムミルク希釈液に移し代え、室温で３０分間ブロッキング操作を２回行った。ＰＶＤＦ膜をビニール袋に移し、１０００倍希釈の抗ｃａｓｐａｓｅ−３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）及び抗β−ａｃｔｉｎ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を含む抗体液を入れ、４℃で一晩抗体反応させた。反応後、一次抗体液を回収し、ＰＶＤＦ膜をＴｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。２０００倍希釈のＨＲＰ標識抗体を入れ、室温で６０分間反応させた。反応後、二次抗体液を捨て、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳで１５分間、３回洗浄した。ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ＳｕｂｓｔｒａｔｅをＰＶＤＦ膜に注ぎ、１分間化学発光させた。その後、ＰＶＤＦ膜をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００で撮影した。
図１Ｃ及び図１Ｆに示されるように、上記ＭＴＴアッセイで確認されたＲＩＤ−Ｂ及びＴＡＭのそれぞれのＩＣ５０において、活性型ｃａｓｐａｓｅ−３（ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３）のバンドが示され、アポトーシスの誘導が起こっていることが確認された。
＜試験例２＞
試験例２では、ＲＩＤ−ＢをＪｕｒｋａｔ細胞に添加した場合のＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路への影響を確認した。
２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＪｕｒｋａｔ細胞に、ＲＩＤ−Ｂが終濃度０．４μＭとなるように添加し、３、６、９、１２時間作用させた後に、ウェスタンブロッティングによる検出を行った。ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、及びＡｋｔはリン酸化することで活性化するため、それぞれのリン酸化タンパク質特異的抗体及び非リン酸化タンパク質特異的抗体を用いた。ウェスタンブロッティングは、１０００倍希釈の抗ｐ−ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗ｐ−ＪＮＫ抗体、抗ＪＮＫ抗体、抗ｐ−ｐ３８抗体、抗ｐ３８抗体、抗ｐ−Ａｋｔ抗体、抗Ａｋｔ抗体（全てＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いた他は、試験例１と同様の方法を用いて行った。
図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、ＲＩＤ−Ｂを添加することで、ＥＲＫ及びＡｋｔのリン酸化が減弱することが示された。一方で、図２Ａに示されるように、ＪＮＫやｐ３８のリン酸化の減弱は認められなかった。これらの結果より、ＲＩＤ−Ｂは、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの両経路を阻害することがわかった。
＜試験例３＞
試験例２の結果より、ＲＩＤ−ＢがＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの両経路を阻害することが確認されたため、試験例３では、両経路を阻害することが知られているＢＲＡＰ２に対するＲＩＤ−Ｂによる影響をウェスタンブロッティングで確認した。
２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＪｕｒｋａｔ細胞に、ＲＩＤ−Ｂが終濃度０．４μＭ、ＴＡＭが終濃度２０μＭとなるように添加し、１２、２４時間作用させた後に、ウェスタンブロッティングによる検出を行った。ウェスタンブロッティングは、１０００倍希釈の抗ＢＲＡＰ２抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いた他は、試験例１と同様の方法を用いて行った。
図３Ａに示されるように、ＲＩＤ−Ｂを添加することで、ＢＲＡＰ２の発現量が増加することが示された。一方で、図３Ｂに示されるように、ＴＡＭの添加においてはＢＲＡＰ２の発現量の増加は示されなかった。
＜試験例４＞
試験例４では、ＲＩＤ−ＢとＢＲＡＰ２の結合の有無を確認した。
（Ｓｐｉｎ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）
ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ｂｅａｄｓ（本明細書において、、単に「ビーズ」ともいう）をＰＢＳで３回遠心洗浄した。ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ社））で可溶化したＪｕｒｋａｔ細胞溶解液の濃度を測定し、１つのサンプルが３．０ｍｇ／ｍＬで５００μＬになるよう調整した。各サンプルにビーズを１００μＬずつ加え、１時間、４℃でローテーションし、ビーズに結合するタンパク質をあらかじめ除去した（プレクリア）。１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をプレクリア済みの細胞溶解液として回収した。プレクリアした細胞溶解液には先にＲＩＤ−Ｂを終濃度が２５０μＭになるように加えて４時間、４℃でローテーションさせ、その後、上記で合成したＢｉｏ−ＲＩＤ−Ｂを終濃度が２５０μＭになるように加えて４時間、４℃でローテーションした。
Ｂｉｏ−ＲＩＤ−Ｂのみを加えるサンプルにはＢｉｏ−ＲＩＤ−Ｂを終濃度が２５０μＭになるように加えて４時間、４℃でローテーションした。各サンプルにビーズを１００μＬずつ加え、１時間、４℃でローテーションした。各サンプルを１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した後に、２００μＬのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、１３０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去した。これを３回行った。沈殿にｓａｍｐｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１０％ＳＤＳ、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％ ｇｌｙｃｅｒｉｎ、ＢＰＢ、５％ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を３０μＬ加えてボルテックスし、サンプルを１００℃で５分間インキュベートした。ボルテックス後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心して上清をサンプルとし、ウェスタンブロッティングで解析した。ウェスタンブロッティングは上記抗ＢＲＡＰ２抗体を用いて、試験例１と同様の方法を用いて行った。結果を図４Ａに示す。
図４Ａに示されるように、ＢＲＡＰ２がＢｉｏ−ＲＩＤ−Ｂと共沈することが示された。また、ビオチン標識されていないＲＩＤ−Ｂを同時添加することにより、Ｂｉｏ−ＲＩＤ−ＢとＢＲＡＰ２との結合が競合的に阻害することも示された。このことより、ＢＲＡＰ２とＢｉｏ−ＲＩＤ−Ｂは、直接又は間接的に結合することが確認された。
＜試験例５＞
試験例５では、ＲＩＤ−ＢとＢＲＡＰ２が直接結合しているか否かを確認した。
（結合試験１）
２ｃｍ角のＰＶＤＦ膜をメタノールで１０秒程度親水化後、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（１３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、３０％ ＭｅＯＨ、ｐＨ８．３）に１〜２分浸透させた。Ａｖｉｄｉｎ、ＢＳＡ、ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＲＡＰ２（ｈＢＲＡＰ２）を１μｇずつそれぞれＰＶＤＦ膜に滴下し、室温で２０分間乾燥した。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ／ＴＢＳＴにて室温で１時間ブロッキングした。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、１２．５μＭ Ｂｉｏ−ＲＩＤ−Ｂ／ＴＢＳＴと室温で２時間、反応させた。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、２μｇ／ｍＬ ｈＢＲＡＰ／ＴＢＳＴと室温で２時間、次いで４℃で一晩反応させた。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（東洋紡社）で１：１０００の割合で希釈した抗ＢＲＡＰ２抗体と室温で４時間反応させた。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、１：２０００の割合で希釈したａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と室温で２時間反応させた。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて１分間反応させた。反応後、ＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈ Ｉ（アトー社）を用いて撮影した。結果を図４Ｂに示す。
図４Ｂに示されるように、Ａｖｉｄｉｎをブロットした後にＢｉｏ−ＲＩＤ−Ｂを結合させ、そこにリガンドとしてＢＲＡＰ２を反応させた左上のスポットでは、抗ＢＲＡＰ２抗体によるスポットが検出されたことから、Ｂｉｏ−ＲＩＤ−ＢとＢＲＡＰ２は直接結合することが確認された。
（結合試験２）
結合試験１と同様に準備したＰＶＤＦ膜に、ｈＢＲＡＰ２を１μｇ、ＢＳＡを１μｇ、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙを１μＬ、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を１μｇ滴下し、室温で２０分間乾燥した。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、結合試験１と同様にブロッキングした。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、１２．５μＭ Ｂｉｏ−ＲＩＤ−Ｂ／ＴＢＳＴと室温で２時間、次いで４℃で一晩反応させた。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ／ＴＢＳＴ（１：１０００）と室温で２時間反応させた。ＰＶＤＦ膜を洗浄後、結合試験１と同様の方法を用いて撮影した。結果を図４Ｃに示す。
図４Ｃに示されるように、ＢＲＡＰ２をブロットした後に、リガンドとしてＢｉｏ−ＲＩＤ−Ｂを反応させた左上のスポットでは、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰによるスポットが検出された。この結果からも、Ｂｉｏ−ＲＩＤ−ＢとＢＲＡＰ２は直接結合することが確認された。
＜試験例６＞
試験例６では、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＢＲＡＰ２をノックアウト（ＫＯ）した場合における、ＲＩＤ−Ｂによる細胞障害を確認した。
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＢＲＡＰ２欠損株の作製）
ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０（ｐｌａｓｍｉｄ＃６２９８８）（Ａｄｄｇｅｎｅ社）１００ｎｇ／μＬのＢｂｓＩ部位を、ＢｂｓＩ（３００Ｕ，濃度：５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて３７℃で６０分間インキュベートすることで切断した。ＣＲＩＳＰＲ ｄｉｒｅｃｔ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）で設計したＢＲＡＰ２のｇＲＮＡ（Ｔｏｐ：ＣＡＣＣＧＧＡＡＡＧＧＣＧＣＴＧＣＧＴＴＣＧＡＡＡ（配列番号１），Ｂｏｔｔｏｍ：ＡＡＡＣＴＴＴＣＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣ（配列番号２））をＢｂｓＩ部位にＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて制限酵素処理産物（２０ｎｇ／μＬ）とＢＲＡＰ２のｇＲＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）を１：１の割合で混合し、１６℃で３時間インキュベートし、ライゲーションすることでＢＲＡＰ２ノックアウトプラスミドを構築した。Ｊｕｒｋａｔ細胞へのトランスフェクションは、エレクトロポレーション法（Ｎｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞へトランスフェクションする４時間前にＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ不含、抗生物質含有）でインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、ＰＢＳ（Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋不含）で洗浄し、ＰＢＳを除去後、３０μＬのｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｒで懸濁した。そこに１０μＬのプラスミドＤＮＡ（１μｇ／μＬ）を加えた。Ｎｅｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅ専用チップを装着後、細胞とプラスミドＤＮＡの混合液を１０μＬ吸引し、３ｍＬのｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒ Ｅが入ったＮｅｏｎ Ｔｕｂｅに設置した。ｐｕｌｓｅ ｖｏｌｔａｇｅ １３５０（Ｖ），ｐｕｌｓｅ ｗｉｄｔｈ １０（ｍｓ），ｐｕｌｓｅ ｎｕｍｂｅｒ ３の条件でトランスフェクションを行い、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ含有、抗生物質不含）で培養した。翌日にＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ含有、７５ｍｇ／Ｌ カナマイシン硫酸塩）で培養し、トランスフェクションを行ってから３日後から０．５μｇ／ｍＬのｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）による薬剤セレクションを約１カ月間行った。シングルセルクローニングを行うために、薬剤セレクションを行ったＪｕｒｋａｔ細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓに調整し、最終的な細胞数が１ウェルに１細胞になるよう段階希釈をして９６穴プレートに１００μＬずつ播種した。２日毎に位相差顕微鏡でシングルセルのウェルを確認し、増殖したシングルセル由来のクローンを２４穴プレート、１２穴プレート、６穴プレートの順にスケールアップしながら培養していき、Ｊｕｒｋａｔ（Ｍｏｃｋ）、Ｊｕｒｋａｔ（ΔＢＲＡＰ２）細胞の安定株を作製した。作製した細胞におけるＢＲＡＰ２発現量を、抗ＢＲＡＰ２抗体を用いたウェスタンブロッティングで確認した。
図５Ａに示されるように、空ベクター導入株（Ｍｏｃｋ）では、未導入細胞と比べてＢＲＡＰ２発現量は変化していない一方で、ＢＲＡＰ２を標的としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを導入したＢＲＡＰ２欠損株（ΔＢＲＡＰ２）では、ＢＲＡＰ２がノックアウトされていることが確認された。
Ｍｏｃｋ導入株及びＢＲＡＰ２欠損株にＲＩＤ−Ｂを添加し、１２時間作用させた後に、ＭＴＴアッセイ及びｓｕｂＧ１期解析にて細胞傷害を確認した。なお、ｓｕｂＧ１期解析においては、ＲＩＤ−Ｂを終濃度１μＭとなるように添加した。ＭＴＴアッセイ及びｓｕｂＧ１期解析は、試験例１と同様の方法を用いて行った。ＭＴＴアッセイの結果を図５Ｂに、ｓｕｂＧ１期解析の結果を図５Ｃに示す。
図５Ｂ及び図５Ｃに示されるように、ＢＲＡＰ２をノックアウトすることで、ＲＩＤ−Ｂ添加による細胞傷害が抑制することが確認された。これらの結果より、ＲＩＤ−ＢはＢＲＰ２に作用することで細胞傷害を亢進することがわかった。
＜試験例７＞
試験例７では、ＢＲＡＰ２欠損におけるＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路への影響をウェスタンブロッティングで確認した。ウェスタンブロッティングは、抗ｐ−ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗ｐ−Ａｋｔ抗体、抗Ａｋｔ抗体を用い、試験例１と同様の方法を用いて行った。結果を図６に示す。
図６に示されるように、ＢＲＡＰ２をノックアウトすることで、ＲＩＤ−ＢによるＥＲＫ及びＡｋｔのリン酸化阻害が抑制されることが確認された。
＜試験例８＞
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＢＲＡＰ２の欠損では、オフターゲット欠損により他のタンパク質も欠損することで、ＲＩＤ−Ｂの傷害抑制が生じている可能性が否定できない。そこで、試験例８では、ＢＲＡＰ２欠損株にＭＡＴ−ＦＬＡＧ−ＢＲＡＰ２を導入してＢＲＡＰ２を再発現させた場合に、ＲＩＤ−Ｂによる細胞傷害が回復するか確認した。
（ＢＲＡＰ２再発現株の作製）
ＭＡＴ−ＦＬＡＧ−ＢＲＡＰ２プラスミドは国立感染症研究所の深澤征義先生より供与された。ＢＲＡＰ２欠損株は、トランスフェクションする４時間前にＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ不含、抗生物質含有）でインキュベートした。ＢＲＡＰ２欠損株を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、ＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含）で洗浄し、ＰＢＳを除去後、ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｒで懸濁した。そこにＭＡＴ−ＦＬＡＧ−ＢＲＡＰ２プラスミドＤＮＡを添加した。ｐｕｌｓｅ ｖｏｌｔａｇｅ １３５０（Ｖ）、ｐｕｌｓｅ ｗｉｄｔｈ １０（ｍｓ）、ｐｕｌｓｅ ｎｕｍｂｅｒ ３の条件でトランスフェクションを行い、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ含有、抗生物質不含）で培養した。翌日にＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ含有、７５ｍｇ／Ｌ カナマイシン硫酸塩）で培養して、ＢＲＡＰ２再発現株を作製した。
ＢＲＡＰ２再発現株におけるＢＲＡＰ２発現量を、抗ＢＲＡＰ２抗体を用いたウェスタンブロッティングで確認した。図７Ａに示されるように、ＢＲＡＰ２再発現株においてＢＲＡＰ２が再発現されていることが確認された。
ＢＲＡＰ２再発現株にＲＩＤ−Ｂを添加し、１２時間作用させた後に、ＭＴＴアッセイ及びｓｕｂＧ１期解析にて細胞傷害を確認した。なお、ｓｕｂＧ１期解析においては、ＲＩＤ−Ｂを終濃度１μＭとなるように添加した。ＭＴＴアッセイ及びｓｕｂＧ１期解析は、試験例１と同様の方法を用いて行った。ＭＴＴアッセイの結果を図７Ｂに、ｓｕｂＧ１期解析の結果を図７Ｃに示す。
図７Ｂに示すように、ＢＲＡＰ２欠損株のＩＣ５０が２．６μＭであったのに対し、ＢＲＡＰ２再発現株のＩＣ５０は０．５６μＭであり、約４．６倍の差が確認された。また、図７Ｃに示すように、ＢＲＡＰ２再発現株においてｓｕｂＧ１期のポピュレーションの増加が確認された。これらの結果より、試験例６で示されたＢＲＡＰ２欠損株における、ＲＩＤ−Ｂによる細胞傷害の抑制は、オフターゲット欠損によるものではないことがわかった。
＜試験例９＞
試験例９では、他のＲＩＤ−Ｂ類縁体における、ＢＲＡＰ２への作用増強能を有する構造を明らかにするために、上記で合成した化合物、ＴＡＭ、下記式で表される４−ＯＨ−ＴＡＭ、５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌを、Ｍｏｃｋ導入株及びＢＲＡＰ２欠損株に添加した場合の細胞傷害を確認した。なお、ｓｕｂＧ１期解析において、ＲＩＤ−ＳＢ１０、ＲＩＤ−ＳＢ１７、ＲＩＤ−Ｇ、ＲＩＤ−ＳＧ１７、ＲＩＤ−Ｈ、及びＲＩＤ−ＳＨ１７は終濃度０．５μＭとなるように添加した。ＲＩＤ−ＵＢ及びＲＩＤ−ＮＢは終濃度１．５μＭとなるように添加した。ＲＩＤ−Ｂ−ＯＨ２は終濃度１μＭとなるように添加した。ＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／ＯＨ）、ＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／ＭＥＥ）は終濃度２０μＭとなるように添加した。ＲＩＤ−Ｓ１０−（Ｂ／Ｍｅ）は終濃度２５μＭとなるように添加した。ＲＩＤ−ＳＢ３１は終濃度４０μＭとなるように添加した。ＲＩＤ−Ｓ１０は終濃度１２５μＭとなるように添加した。それぞれの化合物を添加後、１２時間作用させた。
Figure 2021063035
ＭＴＴアッセイ及びｓｕｂＧ１期解析は、試験例１と同様の方法を用いて行った。ＭＴＴアッセイの結果を表１に、ｓｕｂＧ１期解析の結果を図８Ａ〜図８Ｎに示す。
Figure 2021063035
表１及び図８Ａ〜図８Ｎに示すように、ＢＲＡＰ２を欠損させることで、ピロリジン側鎖を２つ有する類縁体による細胞傷害が高程度で抑制された。一方で、ピロリジン側鎖を１つ有する類縁体による細胞傷害の抑制は示されなかった。ピロリジン側鎖を２つ有する類縁体の中でも、アルキル鎖が長いＲＩＤ−ＳＢ１７は、アルキル鎖が短いＲＩＤ−ＳＢ１０と比較した場合において、細胞傷害抑制の程度が高かった。この理由の一つとして、アルキル鎖の長さは細胞膜の透過性に関与していることが推測される。また、ピロリジン側鎖を２つ有する類縁体は、ピロリジン側鎖を１つ有する類縁体やピロリジン側鎖を有しない類縁体に比べてＩＣ５０の値が非常に小さいことが確認された。
ｓｕｂＧ１期解析では、ピロリジン側鎖を１つ有する類縁体においても、ＢＲＡＰ２欠損による細胞傷害抑制が中程度みられた。
ピロリジン側鎖を有しない類縁体、ＴＡＭ、４−ＯＨ−ＴＡＭ、又は５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌを添加した場合には、ＢＲＡＰ２欠損による細胞傷害抑制が示されないか、示された場合でもその程度は低いものであった。これらの結果より、ＢＲＡＰ２の作用を増強するための類縁体は、ピロリジン側鎖を２つ有することが好ましいことがわかった。

Claims (10)

  1. 下記式（１）又は（２）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する、ＢＲＡＰ２作用増強剤。
    Figure 2021063035
     ［式中、Ｒ１は、水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ１及びＲ２がいずれもアルキル基である場合、Ｒ１及びＲ２は、それらが結合する窒素原子とともに、又はそれらが結合する窒素原子に加えて、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子から選択される１種以上の原子とともに、単環式複素環を形成してもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、アルキル基、脂環式基、アリール基、アシル基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、又はニトロ基を示す。Ｒ３又はＲ４が複数存在する場合、複数のＲ３又はＲ４は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、脂肪族炭化水素基、又は置換基を有していてもよいアリール基を示す。Ｒ５及びＲ６がいずれも脂肪族炭化水素基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して脂環式基を形成してもよい。ｎは０以上の整数を示し、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０〜４の整数を示す。］
    Figure 2021063035
     ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｎ、ｐ、及びｑは、上記式（１）と同義である。Ｒ７は、脂肪族炭化水素基又は置換基を有していてもよいアリール基を示す。］
  2. 請求項１に記載のＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する、ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患又は症状の予防又は治療薬。
  3. ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患又は症状が、炎症性疾患、自己免疫疾患、又はウイルス感染症である、請求項２に記載の予防又は治療薬。
  4. 請求項１に記載のＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する、免疫抑制剤。
  5. 下記式（３）で表される化合物。
    Figure 2021063035
  6. 下記式（４）で表される化合物。
    Figure 2021063035
  7. 請求項５又は６に記載の化合物又はその塩を有効成分として含有する、ＢＲＡＰ２作用増強剤。
  8. 請求項７に記載のＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する、ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患又は症状の予防又は治療薬。
  9. ＢＲＡＰ２作用増強が有効な疾患又は症状が、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、又はウイルス感染症である、請求項８に記載の予防又は治療薬。
  10. 請求項７に記載のＢＲＡＰ２作用増強剤を有効成分として含有する、免疫抑制剤。
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