JP2020533954A - レバウジオシドの高効率生成のためのエンドウ(pisum sativum)カウレンオキシダーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
[0001] 本願は、2017年8月11日に出願された米国仮特許出願第62/544,718号、及び2017年8月11日に出願された国際出願第PCT/US2017/046637号の利益を主張し、それらの内容は、それら全体がここで参照により援用される。
[0002] 本開示は、特定のカウレンオキシダーゼ(KO)、それを含む組成物、それを含む宿主細胞、並びにレバウジオシドD及びレバウジオシドMを含むレバウジオシドの生成のためのその使用方法に関する。
[0003] 天然源に由来する0カロリー甘味料は、高糖消費の不良な効果(例えば糖尿病及び肥満)を制限するため、所望される。レバウジオシドM(RebM)、ステビア属植物(S.レバウディアナ・ベルトニ(S. rebaudiana Bertoni))によって生成される多数の甘味化合物の一つである。すべてのレバウジオシドの中で、RebMは、最高の効力を有し(スクロースよりも約200〜300倍甘い)、最もクリーンな味である。しかし、RebMは、専らステビア属植物により少量で生成され、全ステビオールグリコシド含量の小画分(<1.0%)である。Ohta et al., 2010, J. Appl. Glycosci., 57, 199-209 (2010)。それ故、大量且つ高純度での生成を可能にする生物工学的経路を用いてRebMを生成することが望ましい。
[0008] カウレンのカウレン酸への改善された変換のための組成物及び方法が本明細書に提供される。これらの組成物及び方法は、一部には、特定のカウレンオキシダーゼ(KO)がカウレンをカウレン酸に著しく高い効率で変換する能力があるという驚くべき発見に基づく。新しいKOを有する株の性能における控えめな改善(例えば10パーセント)であっても、潜在的には、RebMに対する市場の需要が5000百万トン/年であると仮定すると、将来における生産コストにおいて、1,000万ドル余り節約することが可能である。
6.1 用語法
[0027] 本明細書で用いられるとき、用語「異種」は、通常は天然に見出されないものを指す。用語「異種ヌクレオチド配列」は、通常は天然における所与の細胞内で見出されないヌクレオチド配列を指す。そのようなことから、異種ヌクレオチド配列は、(a)その宿主細胞に対して外来性である(即ち、細胞に対して「外因性」である);(b)宿主細胞内で天然に見出される(即ち「内因性」)が、細胞内で非天然量(即ち、宿主細胞内に天然に見出される量よりも多い量又は少ない量)で存在する;又は(c)宿主細胞内で天然に見出されるが、その天然遺伝子座の外部に位置づけられることがある。用語「異種酵素」は、通常は天然における所与の細胞内で見出されない酵素を指す。用語は、(a)所与の細胞に対して外因性である(即ち、宿主細胞内で天然に存在しない又は宿主細胞内の所与の状況下で天然に存在しないヌクレオチド配列によってコードされる)酵素;及び(b)宿主細胞内で天然に見出される(例えば、酵素は、細胞に対して内因性であるヌクレオチド配列によってコードされる)が、宿主細胞内で非天然量(例えば、天然に見出される量よりも多い量又は少ない量)で生成される酵素を包含する。
[0046] カウレンからカウレン酸(KA)を高効率で生成する能力がある宿主細胞が、本明細書に提供される。特定の実施形態では、宿主細胞は、出発物質としてのカウレンからカウレン酸を生成しうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、培地中の炭素源からカウレン酸を生成しうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、培地中の炭素源からカウレン酸を生成可能であり、カウレン酸からRebA又はRebDをさらに生成しうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、RebDからレバウジオシドM(RebM)をさらに生成しうる。
[0068] 別の態様では、参照配列(例えば配列番号1)と比べてのアミノ酸残基の修飾を含むが、カウレンをカウレン酸に、カウレンをカウレノールに、カウレノールをカウレナールに、及び/又はカウレナールをカウレン酸に変換するためのカウレンオキシダーゼとしての活性をさらに保持する、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ変異体が本明細書に提供される。特定の実施形態では、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ変異体は、最大20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、若しくは1のアミノ酸置換、欠失、付加、及び/又は挿入を、特定のアミノ酸位置又は参照配列(例えば配列番号1)と比べた位置に含みうる。特定の実施形態では、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ変異体は、本明細書に記載のカウレンオキシダーゼ変異体のいずれかを含む。
[0070] 本明細書に提供される組成物及び方法にとって有用な宿主細胞は、古細菌、原核細胞、又は真核細胞を含む。
[0077] いくつかの実施形態では、ステビオール生合成経路及び/又はステビオールグリコシド生合成経路は、経路の1又は複数の酵素をコードするポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドを発現するように細胞を改変することにより、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞内で活性化される。図1Bは、例示的なステビオール生合成経路を図示する。図2は、ゲラニルゲラニルピロリン酸から開始して様々なステビオールグリコシドに至る、例示的なステビオールグリコシド生合成経路を図示する。
[0082] ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(EC2.5.1.29)は、ファルネシルピロリン酸のゲラニルゲラニル二リン酸への変換を触媒する。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)(受入番号ABD92926)、ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)(受入番号CAA75568)、ムス・ムスクルス(Mus musculus)(受入番号AAH69913)、タラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana)(受入番号XP_002288339)、ストレプトマイセス・クラブリゲルス(Streptomyces clavuligerus)(受入番号ZP_05004570)、スルホロブス・アシドカルダリウス(Sulfulobus acidocaldarius)(受入番号BAA43200)、シネココッカス種(Synechococcus sp.)(受入番号ABC98596)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(受入番号NP_195399)、ブラケスレア・トリスポーラ(Blakeslea trispora)(受入番号AFC92798.1)及び米国特許出願公開第2014/0329281A1号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのGGPPS核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのGGPPS酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0083] コパリル二リン酸シンターゼ(EC5.5.1.13)は、ファルネシルピロリン酸のゲラニルゲラニル二リン酸への変換を触媒する。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)(受入番号AAB87091)、ストレプトマイセス・クラブリゲルス(Streptomyces clavuligerus)(受入番号EDY51667)、ダイズ根粒菌(Bradyrhizobium japonicum)(受入番号AAC28895.1)、トウモロコシ(Zea mays)(受入番号AY562490)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(受入番号NM_116512)、アジアイネ(Oryza sativa)(受入番号Q5MQ85.1)及び米国特許出願公開第2014/0329281A1号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのCDPS核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのCDPS酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、95%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0084] カウレンシンターゼ(EC4.2.3.19)は、コパリル二リン酸のカウレン及び二リン酸への変換を触媒する。酵素の実例として、ダイズ根粒菌(Bradyrhizobium japonicum)(受入番号AAC28895.1)、ファエオスファエリア種(Phaeosphaeria sp.)(受入番号O13284)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(受入番号Q9SAK2)、ピセア・グラウカ(Picea glauca)(受入番号ADB55711.1)及び米国特許出願公開第2014/0329281A1号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのKS核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのKS酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0085] CDPS−KS二官能性酵素(EC5.5.1.13及びEC4.2.3.19)も使用可能である。酵素の実例として、モモ枝折病菌(Phomopsis amygdali)(受入番号BAG30962)、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)(受入番号BAF61135)、ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)(受入番号Q9UVY5.1)、並びに米国特許出願公開第2014/0329281A1号、米国特許出願公開第2014/0357588A1号、米国特許出願公開第2015/0159188号、及び国際公開第2016/038095A2号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのCDPS−KS核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのCDPS−KS酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0086] Ent−カウレンオキシダーゼ(EC1.14.13.78;カウレンオキシダーゼとも称される)が本明細書に記載される。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのカウレンオキシダーゼ核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのカウレンオキシダーゼ酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0087] ステビオールシンターゼ、又はカウレン酸ヒドロキシラーゼ(KAH)、(EC1.14.13)は、カウレン酸のステビオールへの変換を触媒する。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)(受入番号ACD93722)、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)(配列番号10)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(受入番号NP_197872)、ヨーロッパブドウ(Vitis vinifera)(受入番号XP_002282091)、タルウマゴヤシ(Medicago trunculata)(受入番号ABC59076)、並びに米国特許出願公開第2014/0329281A1号、米国特許出願公開第2014/0357588A1号、米国特許出願公開第2015/0159188号、及び国際公開第2016/038095A2号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのKAH核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのKAH酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0088] チトクロムP450レダクターゼ(EC1.6.2.4)は、上記KO及び/又はKAHの活性を補助又は促進する能力がある。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)(受入番号ABB88839)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(受入番号NP_194183)、ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)(受入番号CAE09055)、クソニンジン(Artemisia annua)(受入番号ABC47946.1)、並びに米国特許出願公開第2014/0329281A1号、米国特許出願公開第2014/0357588A1号、米国特許出願公開第2015/0159188号、及び国際公開第2016/038095A2号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのCPR核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのCPR酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0089] UGT74G1は、ウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール19−COOHトランスフェラーゼとして、またウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール−13−O−グルコシド19−COOHトランスフェラーゼとして機能する能力がある。図2に示される通り、UGT74G1は、ステビオールを19−グリコシドに変換する能力がある。UGT74G1はまた、ステビオールモノシドをルブソシドに変換する能力がある。UGT74G1はまた、ステビオールビオシドをステビオシドに変換する能力があってもよい。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)の場合(例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41: 56-67、並びに米国特許出願公開第2014/0329281号及び国際公開第2016/038095A2号及び受入番号AAR06920.1の場合)が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのUGT74G1核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのUGT74G1酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0090] UGT76G1は、グルコース部分をアクセプター分子ステビオール1,2グリコシドのC−13−O−グルコースのC−3’に移す能力がある。したがって、UGT76G1は、ウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール13−O−1,2グルコシドC−3’グルコシルトランスフェラーゼ及びウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール−19−O−グルコース、13−O−1,2ビオシドC−3’グルコシルトランスフェラーゼとして機能する能力がある。図2に示される通り、UGT76G1は、ステビオールビオシドをRebBに変換する能力がある。UGT76G1はまた、ステビオシドをRebAに変換する能力がある。UGT76G1はまた、RebDをRebMに変換する能力がある。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)の場合(例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41: 56-67、並びに米国特許出願公開第2014/0329281A1号及び国際公開第2016/038095A2号及び受入番号AAR06912.1の場合)が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのUGT76G1核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのUGT76G1酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0091] UGT85C2は、ウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール13−OHトランスフェラーゼ、及びウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール−19−O−グルコシド13−OHトランスフェラーゼとして機能する能力がある。したがって、図2に示される通り、UGT85C2は、ステビオールをステビオールモノシドに変換する能力があり、19−グリコシドをルブソシドに変換する能力もある。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)の場合(例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41: 56-67、並びに米国特許出願公開第2014/0329281A1号及び国際公開第2016/038095A2号及び受入番号AAR06916.1の場合)が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのUGT85C2核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのUGT85C2酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0092] UGT91Dは、ウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール−13−O−グルコシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子ステビオール−13−O−グルコシド(ステビオールモノシド)の13−O−グルコースのC−2’に移し、ステビオシドを生成する能力がある。UGT91Dはまた、図2に示される通り、ウリジン5’−ジホスホグルコシル:ルブソシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子ルブソシドの13−O−グルコースのC−2’に移し、ステビオシドをもたらす能力がある。UGT91Dは、UGT91D2、UGT91D2e、又はUGT91D−like3とも称される。UGT91D酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)の場合(例えば、受入番号ACE87855.1、米国特許出願公開第2014/0329281A1号、国際公開第2016/038095A2号、及び配列番号7を有するUGT配列の場合)が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのUGT91D核酸の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのUGT91D酵素の少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
[0093] ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ(UGTAD)は、図2に示される通り、グルコース部分をRebAの19−O−グルコースのC−2’位に移し、RebDを生成する能力がある。UGTADはまた、グルコース部分をステビオシドの19−O−グルコースのC−2’位に移し、RebEを生成する能力がある。UGTの有用例として、アジアイネ(Oryza sativa)由来のOs_UGT_91C1(Houghton-Larsen et al.、国際公開第2013/022989A2号においてEUGT11とも称される;XP_015629141.1)及びトマト(Solanum lycopersicum)由来のSl_UGT_101249881(Markosyan et al.、国際公開第2014/193888A1号においてUGTSL2とも称される;XP_004250485.1)が挙げられる。さらに有用なUGTとして、UGT40087(XP_004982059.1)、sr.UGT_9252778(配列番号16)、Bd_UGT10840(XP_003560669.1)、Hv_UGT_V1(BAJ94055.1)、Bd_UGT10850(XP_010230871.1)、及びOb_UGT91B1_like(XP_006650455.1)が挙げられる。任意のUGT又はUGT変異体は、本明細書に記載の組成物及び方法において使用可能である。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、UGTの少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのUGTの少なくとも1つに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載のUGT変異体をコードする核酸が本明細書に提供される。
(a)配列番号17若しくは18のループ1アミノ酸配列、配列番号30のアミノ酸配列、又は配列番号17若しくは18のループ1位置に対応するUDP糖転移酵素の位置各々でのループ1変異体アミノ酸配列;
(b)配列番号17若しくは18のループ2アミノ酸配列、又は配列番号17若しくは18のループ2位置に対応するUDP糖転移酵素の位置各々でのループ2変異体アミノ酸配列;
(c)配列番号17若しくは18のループ3_1アミノ酸配列、又は配列番号17若しくは18のループ3_1位置に対応するUDP糖転移酵素の位置各々でのループ3_1変異体アミノ酸配列;
(d)配列番号17若しくは18のループ3_2アミノ酸配列、又は配列番号17若しくは18のループ3_2位置に対応するUDP糖転移酵素の位置各々でのループ3_2変異体アミノ酸配列;
(e)配列番号17若しくは18のループ4_1アミノ酸配列、又は配列番号17若しくは18のループ4_1位置に対応するUDP糖転移酵素の位置各々でのループ4_1変異体アミノ酸配列;及び
(f)配列番号17若しくは18のループ4_2位置に対応するUDP糖転移酵素の位置各々での配列番号17若しくは18のループ4_2アミノ酸配列、
のいずれかの組み合わせをさらに含む。
(a)配列番号18のアミノ酸位置11に対応するUDP糖転移酵素のアミノ酸位置でのバリン;
(b)配列番号18のアミノ酸位置12に対応するUDP糖転移酵素のアミノ酸位置でのイソロイシン;
(c)配列番号18のアミノ酸位置55に対応するUDP糖転移酵素のアミノ酸位置でのプロリン;
(d)配列番号18のアミノ酸位置90に対応するUDP糖転移酵素のアミノ酸位置でのグルタミン酸;
(e)配列番号18のアミノ酸位置203に対応するUDP糖転移酵素のアミノ酸位置でのセリン;
(f)配列番号18のアミノ酸位置223に対応するUDP糖転移酵素のアミノ酸位置でのグルタミン酸;又は
(g)配列番号18のアミノ酸位置413に対応するUDP糖転移酵素のアミノ酸位置でのバリン、
の1又は複数をさらに含み、ここで配列番号18のアミノ酸位置に対応するUDP糖転移酵素のアミノ酸位置は、配列アライメントによって決定される。
[00118] いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、FPP及び/又はGGPPの形成にとって有用なMEV経路の1又は複数の異種酵素を含む。図1Dを参照のこと。いくつかの実施形態では、MEV経路の1又は複数の酵素は、アセトアセチルCoAを形成するため、アセチルCoAをマロニルCoAと縮合する酵素を含む。いくつかの実施形態では、MEV経路の1又は複数の酵素は、アセトアセチルCoAを形成するため、アセチルCoAの2分子を縮合する酵素を含む。いくつかの実施形態では、MEV経路の1又は複数の酵素は、HMG−CoAを形成するため、アセトアセチルCoAをアセチルCoAと縮合する酵素を含む。いくつかの実施形態では、MEV経路の1又は複数の酵素は、HMG−CoAをメバロン酸に変換する酵素を含む。いくつかの実施形態では、MEV経路の1又は複数の酵素は、メバロン酸をメバロン酸5−リン酸にリン酸化する酵素を含む。いくつかの実施形態では、MEV経路の1又は複数の酵素は、メバロン酸5−リン酸をメバロン酸5−ピロリン酸に変換する酵素を含む。いくつかの実施形態では、MEV経路の1又は複数の酵素は、メバロン酸5−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む。
[00122] いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、アセチル−コエンザイムAの2分子を縮合し、アセトアセチルCoAを形成しうる酵素、例えばアセチルCoAチオラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、(NC_000913領域:2324131.2325315;大腸菌(Escherichia coli))、(D49362;パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans))、及び(L20428;出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))が挙げられる。
[00127] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アセトアセチルCoAをアセチルCoAのもう一つの分子と縮合し、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoA(HMG−CoA)を形成しうる酵素、例えばHMG−CoAシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、(NC_001145.相補体19061.20536;出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))、(X96617;出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))、(X83882;シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana))、(AB037907;キタサトスポラ・グリセオラ(Kitasatospora griseola))、(BT007302;ヒト(Homo sapiens))、及び(NC_002758、遺伝子座タグSAV2546、GeneID1122571;黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus))が挙げられる。
[00128] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、HMG−CoAをメバロン酸に変換しうる酵素、例えばHMG−CoAレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、HMG−CoAレダクターゼは、NADHを用いるヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ−CoAレダクターゼである。HMG−CoAレダクターゼ(EC1.1.1.34;EC1.1.1.88)は、(S)−HMG−CoAの(R)−メバロン酸の還元的脱アシル化を触媒し、且つクラスI及びクラスII HMGrsの2つのクラスに分類されうる。クラスIは、真核生物及び大部分の古細菌からの酵素を含み、またクラスIIは、特定の原核生物及び古細菌のHMG−CoAレダクターゼを含む。配列における分岐に加えて、2クラスの酵素はまた、それらの補助因子特異性に関して異なる。NADPHを排他的に利用するクラスI酵素と異なり、クラスIIのHMG−CoAレダクターゼは、NADPHとNADHとの間を識別する能力が変化する。例えば、Hedl et al., Journal of Bacteriology 186 (7): 1927-1932 (2004)を参照のこと。クラスIIのHMG−CoAレダクターゼを選択するための補助因子特異性は、以下に提供される。
[00139] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、メバロン酸をメバロン酸5−リン酸に変換しうる酵素、例えばメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、(L77688;シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana))、及び(X55875;出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))が挙げられる。
[00140] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、メバロン酸5−リン酸をメバロン酸5−ピロリン酸に変換しうる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、(AF429385;パラゴムノキ(Hevea brasiliensis))、(NM_006556;ヒト(Homo sapiens))、及び(NC_001145.相補体712315.713670;出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))が挙げられる。
[00141] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、メバロン酸5−ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸(IPP)に変換しうる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、(X97557;出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))、(AF290095;フェシウム菌(Enterococcus faecium))、及び(U49260;ヒト(Homo sapiens))が挙げられる。
[00142] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、MEV経路を介して生成されたIPPをジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)に変換しうる酵素、例えばIPPイソメラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、(NC_000913、3031087.3031635;大腸菌(Escherichia coli))、及び(AF082326;ヘマトコッカス藻(Haematococcus pluvialis))が挙げられる。
[00143] いくつかの実施形態では、宿主細胞は、IPP及び/又はDMAPP分子を縮合し、6つ以上の炭素を含有するポリプレニル化合物を形成しうるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
[00148] 別の態様では、ステビオールグリコシドを生成するための方法であって、
(a)炭素源を有する培地中でのステビオールグリコシドを生成する能力がある本明細書に記載の遺伝子組換え宿主細胞のいずれかの集団をステビオールグリコシド化合物の作製に適した条件下で培養するステップと;(b)前記ステビオールグリコシド化合物を培地から回収するステップと、を含む、方法が本明細書に提供される。
[00157] 微生物培養物の維持及び増殖のための材料及び方法は、微生物学又は発酵科学の当業者にとって周知である(例えば、Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw Hill, New York, 1986を参照)。適切な培地、pH、温度、及び好気性、微好気性、又は嫌気性条件に対する要件に対して、宿主細胞、発酵、及びプロセスの具体的要件に応じて検討がなされる必要がある。
[00178] 別の態様では、本明細書に記載の遺伝子組換え宿主細胞及び遺伝子組換え宿主細胞から生成されるステビオールグリコシドを含む発酵組成物が本明細書に提供される。発酵組成物は、培地をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、発酵組成物は、遺伝子組換え宿主細胞を含み、またRebA、RebD、及びRebMをさらに含む。特定の実施形態では、本明細書に提供される発酵組成物は、遺伝子組換え宿主細胞から生成されるステビオールグリコシドの主成分としてRebMを含む。特定の実施形態では、発酵組成物は、RebA、RebD、及びRebMを少なくとも1:7:50の比で含む。特定の実施形態では、発酵組成物は、RebA、RebD、及びRebMを少なくとも1:7:50〜1:100:1000の比で含む。特定の実施形態では、発酵組成物は、少なくとも1:7:50〜1:200:2000の比で含む。特定の実施形態では、RebA、RebD、及びRebMの比は、遺伝子組換え宿主細胞及び培地に関連したステビオールグリコシドの全含量に基づく。特定の実施形態では、RebA、RebD、及びRebMの比は、培地中のステビオールグリコシドの全含量に基づく。特定の実施形態では、RebA、RebD、及びRebMの比は、遺伝子組換え宿主細胞と会合したステビオールグリコシドの全含量に基づく。
[00180] 一旦ステビオールグリコシドが宿主細胞により生成されると、後の使用のため、それは当該技術分野で公知の任意の好適な分離及び精製方法を用いて回収又は単離されてもよい。いくつかの実施形態では、ステビオールグリコシドを含む有機相が、遠心分離により発酵から分離される。他の実施形態では、ステビオールグリコシドを含む有機相は、発酵から自発的に分離する。他の実施形態では、ステビオールグリコシドを含む有機相は、抗乳化剤及び/又は核形成剤を発酵反応に添加することにより、発酵から分離される。抗乳化剤の実例として、凝集剤及び凝固剤が挙げられる。核形成剤の実例として、ステビオールグリコシド自体や、ドデカン、ミリスチン酸イソプロピル、及びオレイン酸メチルなどの有機溶媒の液滴が挙げられる。
[00183] さらに、上記修飾の1又は複数、例えば、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ、及び/又は例えばステビオールグリコシド化合物における生合成経路酵素をコードする1又は複数の異種核酸を含むように遺伝子操作された宿主細胞を作製するための方法が本明細書に提供される。宿主細胞内での異種酵素の発現は、酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、宿主細胞内での発現を可能にする調節エレメントの制御下で、宿主細胞内に導入することにより達成されうる。いくつかの実施形態では、核酸は、染色体外プラスミドである。他の実施形態では、核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込みことが可能な染色体組込みベクターである。
実施例1:ファルネシルピロリン酸(FPP)及びイソプレノイドファルネセンに対する高フラックスが可能な基本酵母株の作製
[00202] ファルネセン生成株を、野生型出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)株(CEN.PK2)から、GAL1又はGAL10プロモーターの制御下でメバロン酸経路(図1D)の遺伝子を発現することにより作出した。この株は、出芽酵母(S. cerevisiae)からの、アセチルCoAチオラーゼ、HMG−CoAシンターゼ、HMG−CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、及びIPP:DMAPPイソメラーゼの染色体組み込みメバロン酸経路遺伝子を含んだ。本明細書に記載のすべての遺伝子を、公的に利用可能な又は他の好適なアルゴリズムを用いてコドン最適化した。さらに、株は、やはりGAL1又はGAL10プロモーターのいずれかの制御下で、アルテミシニン・アニュア(Artemisinin annua)由来のファルネセンシンターゼの6コピーを含有した。株はまた、GAL80遺伝子及びGAL4ocプロモーター下でのGAL4の追加的コピーの欠失を有し、ここで出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のGAL4遺伝子のコード配列は、その天然プロモーターの「オペラティブコンスティテューティブ(operative constitutive)」バージョン(PGAL4oc;例えば、Griggs & Johnston (1991) PNAS 88(19):8597-8601を参照)の調節的制御下にある。最後に、スクアレンシンターゼをコードするERG9遺伝子が、天然プロモーターを酵母遺伝子MET3のプロモーターと置換することにより下方制御される(Westfall et al PNAS 2012)。
[00203] 図1Bは、FPPからステビオールにかけての例示的な生合成経路を示す。図2は、ステビオールからグリコシドRebMにかけての例示的な生合成経路を示す。上記のファルネセン基本株をC−20イソプレノイドカウレンに対する高フラックスを有するように変換するため、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(GGPPs)の6コピー、その後、コパリル二リン酸シンターゼ及びカウレンシンターゼ各々の4コピーをゲノムに組み込んだ。表1は、FPPをRebAに変換するために用いたすべての遺伝子及びプロモーターを列挙する。このポイントで、ファルネセンシンターゼの6コピーを株から除去した。一旦新しい株がent−カウレンを作製することが確認されると、ent−カウレンをRebAに変換するための残存する遺伝子をゲノムに挿入した。2コピーを有したSr.KAH酵素以外、各遺伝子に単一コピーを組み込んだ(表1)。表1に記載のすべての遺伝子を含有する株は、主にRebAを生成した。酵素UGT91D_like3は、RebAをレバウジオシドD(RebD)に変換するのにやや低い活性を有する。我々は、91D_like3の単一コピーが、株中のRebAの約(3%)を上記の酵母株中のRebDにインビボで変換できることを評価した(図3及び表2)。次に、UGT76G1は、RebDを最終生成物レバウジオシドM(RebM)に変換しうる。
[00204] RebMに対する高フラックスを伴う株を作製するため、実施例2に記載の株を、GAL1プロモーター下、(実施例8、並びに本明細書中の付録として貼付されるPCT出願AM−7400PCT中の表及び図に記載の通り)遺伝子UGT40087の単一コピーで形質転換した。この株は、主にRebMを生成する。異なるKO対立遺伝子をカウレンのカウレン酸へのインビボでの変換についてスクリーニングするため、このRebM株中のステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)KO遺伝子を除去し、専らGAL1プロモーター及びターミネーターを、プロモーターとターミネーターとの間のF−CphI制限配列とともに有するランディングパッドと置換した(図3)。このスクリーニング株は、ここで任意のKO酵素が欠如し、専らent−カウレンを作る。
[00207] 次に、RebMに対して非常に高いフラックスを有する株において、Ps.KOの活性をSr.KOに対して試験した。KO酵素は、通常、大部分の植物において、植物ホルモンのジベレリンを生成するように作用する。植物細胞内のジベレリンのレベルは、工業生産における酵母において生成されるRebMのレベルよりも数桁低く、それ故、KO酵素は、商業的生産においてRebMを生成するのに要求される高フラックスを有することが期待されない。表3は、KO酵素を最初にスクリーニングするのに用いた株(即ち、KO「基本株」)よりも高いRebMフラックスを有する株中に含まれるすべての遺伝子及びプロモーターを列挙する。表3中のすべての遺伝子を酵母ゲノムに挿入した。KO酵素は、その後の3回の酸化を通じてent−カウレンを用い、カウレン酸を生成する。反応物及び中間体の順序は、以下の通りである。第1の酸化により、ent−カウレンがカウレノール(K−OL)になり、第2の酸化により、カウレノールがカウレナール(K−AL)になり、そして第3の酸化により、カウレナールがカウレン酸(−acid)になる(図1C)。ent−カウレンからRebMにかけて最大フラックスを達成するには、KO酵素は、K−acidにかけてent−カウレンを完全に酸化する必要がある。不完全な変換は、炭素を消費し、全RebM力価を低減し、そして潜在的に有毒な中間体化合物を生成することになる。図5中のデータは、RebMにかけての高い炭素フラックスを有する株中で、Sr.KO対立遺伝子が上流中間体のent−カウレン、カウレノール(K−OL)、カウレナール(K−AL)を有意な量で蓄積させる一方で、Ps.KO酵素がこれら中間体の有意に低下した蓄積を示すことを示す。
[00209] 想定されるカウレンオキシダーゼ遺伝子を含有することが確認された酵母コロニーを、20g/Lのスクロース及び37.5g/Lの硫酸アンモニウムを有するバードシード培地(BSM、van Hoek et al., Biotechnology and Bioengineering 68(5), 2000, pp. 517-523により最初に記載された)を含む96ウェルマイクロタイタープレートに採取した。細胞を、30℃、高性能マイクロタイタープレートインキュベーター内で、1000RPM及び80%湿度で振盪しながら3日間、培養物が炭素消耗に至るまで培養した。増殖飽和した培養物を、飽和培養物から14.4μLを採取し、新しい培地360μLに希釈することにより、40g/Lのスクロース及び150g/Lの硫酸アンモニウムを有するBSMを含む新しいプレートに継代した。生成培地中の細胞を、30℃、高性能マイクロタイタープレート振盪器内で、1000RPM及び80%湿度で、抽出及び分析前にさらに3日間培養した。完了時、全細胞ブロスを100%エタノール360μLで希釈し、ホイルシールで密封し、1250rpmで30分間振盪し、レバウジオシドを抽出する。490μLの50:50のエタノール:水を新しい1.1mLのアッセイプレートに添加し、10uLの培養物/エタノール混合物をアッセイプレートに添加する。混合物を遠心分離し、任意の固体をペレット化し、溶液400μLを新しい1.1mLのプレートに移し、LC−MSによってアッセイする。
ステビオール及びステビオールグリコシドの質量分析計による検出:
[00210] 試料を、以下の勾配を用いて、Sigma Ascentis Express Peptide ES-C18(5cm、2.1mm、2.7μm;パート番号53301−U)を用いるLC−MS質量分析計(AB QTrap 4000)により分析する。
[00212] 培養ブロス中でのent−カウレンの力価を、制限されたサーマルマスオーブン及び炎光イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフを用いて測定する。ブロスサンプルを、同比率のブロス及びメタノールを用いて抽出し、密封容器内で30分間振盪し、細胞からent−カウレンを回収する。次に、ブロス:メタノール溶液の一定分量240uLを酢酸エチル1mLで希釈し、密封し、さらに30分間振盪し、ent−カウレンを有機相に抽出する。有機相を、アッセイの線形範囲内に収まるように適宜希釈し、サンプルバイアルにアリコートする。サンプルを、線形範囲内に収まるように適切な分割比で注射する。(1)初期温度150℃、0分間、(2)25℃/分の温度上昇により温度を230℃に、(3)1800℃/分の温度上昇により温度を320℃にして1分間保持、という温度勾配を用いて、一定圧力モードでキャリアガスとして水素を用いる、Agilent DB-1MS LTM IIカラムでサンプル分離を行う。確証的なent−カウレン標準を用いる外部較正を用いて、ent−カウレン量を判定する。
[00213] 培養ブロス中でのカウレン酸、カウレノール、及びカウレナールの力価を、可変波長検出器を備えた高圧液体クロマトグラフを用いて測定する。ブロスサンプル(100μL)をエタノール300μLに希釈し、密封容器内で30分間振盪する。水200μLをブロス:エタノール混合物に添加し、混合し、遠心分離する。(細胞ペレットを回避している)得られた溶液の一定分量をサンプルバイアルに移し、HPLCを用いて分析する。以下の溶媒:
・移動相A:水中0.1%ギ酸(v/v)
・移動相B:アセトニトリル中0.1%ギ酸(v/v)
を用いて、以下の溶媒勾配を用いて、Aglient Eclipse Plus C18 USP L1(4.6mm×50mm×1.8μm)でサンプル分離を行う。分析物を、200nmでのUV吸光度を用いて検出し、ステビオール標準に対する相対的応答因子を伴う外部較正を用いて定量化する。
[00214] ブロス中でのレバウジオシドMの力価を、三連四重極型質量分析計を備えた高圧液体クロマトグラフを用いて測定する。ブロスサンプルを、50:50のエタノール:水で200倍〜800倍の間に希釈したエッペンドルフチューブにアリコートし、20分間混合し、遠心分離し、細胞及びデブリをペレット化し、上清の一定分量をサンプルバイアルに移し、分析にかける。サンプルは、分析物がMRM移行のシグナル強度に基づいて定量化される場合のフローインジェクションモードで流す。移動相は、1.1mL/分の流速で、40%水+0.1%ギ酸及び60%アセトニトリル+0.1%ギ酸である。レバウジオシドMの濃度は、その応答の内部標準(レバウジオシドN)の場合への正規化により判定する。
配列番号1
配列番号12
EGLPDGAESTNDVPHDRPDMV
配列番号20(Os_UGT_91C1からのループ3_1)
SEFLGTACAD
配列番号21(Os_UGT_91C1からのループ3_2)
SEFLGTACADWVIVDVFHH
配列番号22(Os_UGT_91C1からのループ4_1)
ADRRLERAETESPAAAGQGRPAAAPTFEVARMKLIRTKGSSGM
配列番号23(Os_UGT_91C1からのループ4_2)
MMLLGSAHMIASIADRRLERAETESPAAAGQGRPAAAPTFEVARMKLIRTKGSSGM
配列番号24(UGT40087からのループ2)
DGLPDGAEATSDIPPGKT
配列番号25(UGT40087からのループ3_1)
AAFLDAACADGSTNKVD
配列番号26(UGT40087からのループ3_2)
AAFLDAACADGSTNKVDWLFLDNFQY
配列番号27(UGT40087からのループ4_1)
GVPRVEPPVDGSTA
配列番号28(UGT40087からのループ4_2)
LNLTFAASTSAEYGVPRVEPPVDGSTA
配列番号29(UGT40087_ループ1中に存在するOs_UGT_91C1からの修飾ループ1)
TPRNISRLPPVPPALAP
配列番号30(Os_UGT_91C1_ループ1中に存在するUGT40087からの修飾ループ1)
TPRNISRLRPVRPALAP
配列番号31(配列番号8を有するOs_UGT_91C1からのループ1)
TPRNISRLPPVRPALAP
配列番号32(配列番号11を有するUGT40087からのループ1)
TPRNISRLRPVPPALAP
配列番号33(UGT40087/Si91Dlikeキメラ)
Claims (47)
- 配列番号1に対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼをコードする異種核酸を含む、1又は複数のステビオールグリコシドを生成する能力がある遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- カウレンをカウレン酸に、30%、35%、40%、45%、50%、若しくは55%を超える効率で変換する能力がある、請求項1に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記カウレンオキシダーゼが、配列番号1の配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記カウレンオキシダーゼが、カウレン、カウレノール、及び/又はカウレナールのC19位を酸化する能力がある、請求項1〜3のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記カウレンオキシダーゼが、配列番号15に対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む異種核酸によってコードされる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記カウレンオキシダーゼが、配列番号15の配列を有する異種核酸によってコードされる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- カウレンをカウレン酸に30%、35%、40%、45%、50%、若しくは55%を超える効率で変換する能力があり、且つ前記カウレンオキシダーゼが、配列番号1に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記カウレンオキシダーゼは、配列番号1の機能ドメインに対して少なくとも80%、85%、90%、若しくは95%の配列同一性を有する機能ドメインを有するポリペプチドである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- カウレンをカウレン酸に、55%を超える効率で変換する能力がある、請求項26に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- カウレン酸を生成する能力がある、請求項1〜9のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- ステビオールを生成する能力がある、請求項1〜10のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- RebDを生成する能力がある、請求項1〜11のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- RebMを生成する能力がある、請求項1〜12のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- RebM及びRebM2を、少なくとも10:1、100:1、又は1000:1の比で生成する能力がある、請求項1〜13のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記遺伝子組換え宿主細胞が、RebM2を検出不能なレベルで生成する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記遺伝子組換え宿主細胞が、ステビオールを作製するための経路の1又は複数の酵素をコードする1又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記遺伝子組換え宿主細胞が、ステビオールグリコシドを作製するための経路の1又は複数の酵素をコードする1又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記遺伝子組換え宿主細胞が、RebAを作製するための経路の1又は複数の酵素をコードする1又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記遺伝子組換え宿主細胞が、RebMを作製するための経路の1又は複数の酵素をコードする1又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記遺伝子組換え宿主細胞が、RebEを作製するための経路の1又は複数の酵素をコードする1又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼを含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、コパリル二リン酸シンターゼを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、ent−カウレンシンターゼを含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、カウレン酸ヒドロキシラーゼを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、チトクロムP450レダクターゼを含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、1又は複数のウリジン5’−二リン酸依存性糖転移酵素を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、Os_UGT_91C1、Sl_UGT_101249881、UGT40087、sr.UGT_9252778、Bd_UGT10840、Hv_UGT_V1、Bd_UGT10850、又はOb_UGT91B1_likeを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D、又はUGT40087又はその変異体を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ent−カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸ヒドロキシラーゼ、チトクロムP450レダクターゼ、UGTAD、UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、及びUGT91Dを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ent−カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸ヒドロキシラーゼ、チトクロムP450レダクターゼ、UGT40087又はその変異体、UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、及びUGT91Dを含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記UGT40087が、配列番号17、18、又は33に記載されている、請求項1〜30のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の前記1又は複数の酵素が、二官能性コパリル二リン酸シンターゼ及びカウレンシンターゼを含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の1又は複数の酵素をコードする前記1又は複数の異種核酸が、単一の転写制御因子の制御下にある、請求項1〜32のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記経路の1又は複数の酵素をコードする前記1又は複数の異種核酸が、複数の異種転写制御因子の制御下にある、請求項1〜33のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、及び植物細胞からなる群から選択される、請求項1〜34のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記細胞が、酵母細胞である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- 前記酵母が、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
- カウレン酸を生成するための方法であって、
(a)請求項1〜37のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞の集団を、RebDの作製に適した条件下の炭素源を有する培地中で培養することと;
(b)前記カウレン酸化合物を前記培地から回収することと、
を含む、方法。 - RebDを生成するための方法であって、
(a)請求項1〜37のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞の集団を、RebDの作製に適した条件下の炭素源を有する培地中で培養することと;
(b)前記RebD化合物を前記培地から回収することと、
を含む、方法。 - RebMを生成するための方法であって、
(a)請求項1〜37のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞の集団を、RebMの作製に適した条件下の炭素源を有する培地中で培養することと;
(b)前記RebM化合物を前記培地から回収することと、
を含む、方法。 - カウレン酸を生成するための方法であって、
(a)カウレンを、カウレン酸の形成に適した条件下で、カウレンをカウレン酸に変換する能力がある、前記請求項のいずれかに記載のカウレンオキシダーゼと接触させることと;
(b)前記カウレン酸化合物を前記培地から回収することと、
を含む、方法。 - 発酵組成物であって、
(a)i.カウレンをカウレン酸に変換する能力がある、前記請求項のいずれかに記載のカウレンオキシダーゼをコードする異種核酸
を含む遺伝子組換え宿主細胞;及び
(b)前記遺伝子組換え宿主細胞から生成されるステビオールグリコシド
を含む発酵組成物。 - 前記ステビオールグリコシドが、RebA、RebD及びReMを、少なくとも1:7:50のRebA:RebD:RebMの比で含む、請求項42に記載の発酵組成物。
- 配列番号1に対して少なくとも80%、85%、90%、95%の配列同一性を有する、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ。
- インビボでカウレンをカウレン酸に30%、35%、40%、45%、50%、若しくは55%を超える効率で変換する能力がある、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ。
- 請求項44又は45に記載の天然に存在しないカウレンオキシダーゼをコードする天然に存在しない核酸。
- ステビオールグリコシドを生成するための方法であって、
(a)請求項1〜37のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞の集団をステビオールグリコシドの作製に適した条件下の炭素源を有する培地中で培養すること
を含む、方法。
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