JP2020531010A - ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本明細書に提供されるのは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、例として、ヒトＩｇＧまたはマウスのＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）に融合しているＡｐｏＭ（例として、ヒトまたはマウスのＡｐｏＭ）を含む、工学的に作り出された融合タンパク質である。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＡｐｏＭに融合しているシグナルペプチド（例として、ＩＬ−２シグナルペプチド）をさらに含み、ひとたび組み換えによって発現させられると融合タンパク質が分泌されることを許容する。種々の疾患または障害の処置においてＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質またはスポンジバリアントを使用する方法が提供される。

Description

関連出願
この出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる「APOM-FC FUSION PROTEINS AND USES THEREOF」という表題の２０１７年８月１５日に出願された米国仮特許出願第62/545,629号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の利益を主張する。
政府支援
この出願は、アメリカ国立衛生研究所から認可番号1R35HL135821-01およびR01HL89934のもとで授与された政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
背景
アポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）は、脂質メディエーターであるスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）に結合し、および、Ｓ１Ｐに対してシャペロンとして働くことで、細胞表面Ｇタンパク質共役受容体（Ｓ１Ｐ受容体）を活性化させて細胞応答を誘導する。ＡｐｏＭ／Ｓ１Ｐ複合体は、急性および慢性の両方の疾患状態に関与する。ＡｐｏＭ／Ｓ１Ｐ複合体の正常でないレベルおよび／または活性は、種々の疾患において観察される。
概要
本明細書に提供されるのは、本明細書において「ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質」と呼ばれる、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、例として、ヒトＩｇＧまたはマウスのＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）に融合しているＡｐｏＭ（例として、ヒトまたはマウスのＡｐｏＭ）を含む工学的に作り出された融合タンパク質である。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＡｐｏＭに融合しているシグナルペプチド（例として、ＩＬ−２シグナルペプチド）をさらに含み、融合タンパク質が分泌されることを許容する。いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｓ１Ｐを結合させて、およびＳ１Ｐ受容体を活性化させることが可能である。いくつかの態様において、より高いＳ１Ｐに対する結合親和性を有する融合タンパク質のバリアント（本明細書において「スポンジバリアント」と呼ばれる）が設計される。種々の疾患または障害の処置においてＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質またはスポンジバリアントを使用する方法が提供される。
したがって、本開示のいくつかの側面は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）に融合しているアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＡｐｏＭに融合しているシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧである。いくつかの態様において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、ＦｃのＮ末端で融合している。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、ヒトＡｐｏＭまたはマウスのＡｐｏＭである。いくつかの態様において、Ｆｃは、ヒトＦｃまたはマウスのＦｃである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭはヒトＡｐｏＭであり、およびＦｃはヒトＦｃである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭはマウスのＡｐｏＭであり、およびＦｃはマウスのＦｃである。
いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号６８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号６８で表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｔ４２に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、アミノ酸置換は、Ｔ４２Ｎである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｖ４６に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、以下：Ｖ４６Ｋ、Ｖ４６Ｎ、およびＶ４６Ｑ、からなる群から選択される。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｉ６８に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、以下：Ｉ６８ＫおよびＩ６８Ｎからなる群から選択される。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｍ７０に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、Ｍ７０Ｙである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１〜４のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、架橋されている、環化されている、コンジュゲートされている、アシル化されている、カルボキシル化されている、脂質化されている、アセチル化されている、チオグリコール酸アミド化されている、アルキル化されている、メチル化されている、ポリグリシル化されている、グリコシル化されている、ポリシアル化されている、リン酸化されている、アデニリル化されている、ＰＥＧ化されている、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ポリマーへコンジュゲートされている。いくつかの態様において、融合タンパク質は、化学修飾を含む。
さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列核酸分子である。融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸を含む、細胞もまた、提供される。
さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の融合タンパク質を製造する方法であり、方法は、融合タンパク質が発現することを許容する条件下で、融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、分泌される。いくつかの態様において、方法は、培養媒体から融合タンパク質を回収することをさらに含む。
本明細書に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物が提供される。いくつかの態様において、医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
本明細書に記載の融合タンパク質に結合する抗体もまた提供される。
本開示の他の側面は、低減したスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）のレベルに関連する疾患または障害を処置する方法を提供し、方法は、治療的に有効な量の、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）に融合しているアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）を含む融合タンパク質を、それを必要とする対象へ投与することを含む。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＡｐｏＭに融合しているシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、ＦｃのＮ末端で融合している。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、ヒトＡｐｏＭまたはマウスのＡｐｏＭである。いくつかの態様において、Ｆｃは、ヒトＦｃまたはマウスのＦｃである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭはヒトＡｐｏＭであり、およびＦｃはヒトＦｃである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭはマウスのＡｐｏＭであり、およびＦｃはマウスのＦｃである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号１、配列番号２、または配列番号６８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号６８で表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、架橋されている、環化されている、コンジュゲートされている、アシル化されている、カルボキシル化されている、脂質化されている、アセチル化されている、チオグリコール酸アミド化されている、アルキル化されている、メチル化されている、ポリグリシル化されている、グリコシル化されている、ポリシアル化されている、リン酸化されている、アデニリル化されている、ＰＥＧ化されている、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ポリマーへコンジュゲートされている。いくつかの態様において、融合タンパク質は、化学修飾を含む。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、Ｓ１Ｐ受容体を活性化させる。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐ受容体は、Ｓ１Ｐ１である。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐ受容体は、血管のものである。いくつかの態様において、疾患または障害は、以下：感染症、敗血症、糖尿病、心血管疾患、網膜血管疾患、末梢血管疾患、メタボリックシンドローム、および呼吸器疾患、からなる群から選択される。いくつかの態様において、疾患または障害は、以下：原発性および／または二次性治療抵抗性高血圧、神経性高血圧、妊娠高血圧、糖尿病高血圧、慢性腎臓病の高血圧、心臓のもしくは心臓のものでない非心再灌流傷害、虚血性傷害、脳卒中、肺水腫、心筋梗塞、急性冠症候群、狭心症、アテローム性動脈硬化、および加齢性黄斑変性症、からなる群から選択される。いくつかの態様において、融合タンパク質は、皮下に、皮内に、静脈内に、筋肉内に、関節内に、動脈内に、関節滑液嚢内に、胸骨内に、髄腔内に、病変内に、または頭蓋内に投与される。
本開示の他の側面は、過剰なスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）に関連する疾患または障害を処置する方法を提供し、方法は、治療的に有効な量の、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）に融合しているアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）を含む融合タンパク質を、それを必要とする対象へ投与することを含み、ここでＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＡｐｏＭに融合しているシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、ＦｃのＮ末端で融合している。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、ヒトＡｐｏＭまたはマウスのＡｐｏＭである。いくつかの態様において、Ｆｃは、ヒトＦｃまたはマウスのＦｃである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭはヒトＡｐｏＭであり、およびＦｃはヒトＦｃである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭはマウスのＡｐｏＭであり、およびＦｃはマウスのＦｃである。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｔ４２に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、Ｔ４２Ｎである。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｖ４６に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、以下：Ｖ４６Ｋ、Ｖ４６Ｎ、およびＶ４６Ｑ、からなる群から選択される。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｉ６８に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、以下：Ｉ６８ＫおよびＩ６８Ｎからなる群から選択される。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｍ７０に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、Ｍ７０Ｙである。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１〜４のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、架橋されている、環化されている、コンジュゲートされている、アシル化されている、カルボキシル化されている、脂質化されている、アセチル化されている、チオグリコール酸アミド化されている、アルキル化されている、メチル化されている、ポリグリシル化されている、グリコシル化されている、ポリシアル化されている、リン酸化されている、アデニリル化されている、ＰＥＧ化されている、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ポリマーへコンジュゲートされている。いくつかの態様において、融合タンパク質は、化学修飾を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、過剰なＳ１Ｐを封鎖する。
いくつかの態様において、疾患または障害は、がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患である。いくつかの態様において、がんは、転移がんである。いくつかの態様において、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎である
いくつかの態様において、融合タンパク質は、皮下に、皮内に、静脈内に、筋肉内に、関節内に、動脈内に、関節滑液嚢内に、胸骨内に、髄腔内に、病変内に、または頭蓋内に投与される。
本開示のなお他の側面は、本明細書に記載の融合タンパク質をスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と接触させることを含む方法を提供する。いくつかの態様において、接触は、細胞内で行われる。
上の概要は、本明細書に開示の技術の態様、利点、特色および使用のいくつかを非限定的な様式で例示する意味を持つものである。本明細書に開示の技術の他の態様、利点、特色および使用は、詳細な説明、図面、例、および請求の範囲から明らかになる。
図面の簡単な説明
添付図面は、縮尺どおりに描かれたことを意図していない。図面において、種々の図で例示されている各々の同一または同一に近い構成要素は、似たような数字符号によって表される。明確さの目的のため、全部の図面中で全部の構成要素に標識を付しているわけではないことがある。本特許または出願のファイルには、少なくとも１つのカラーで作成された図面が含まれている。この特許もしくは特許出願公報の写しであってカラー図面（単数または複数）があるものは、請求および必要な費用の支払いがあれば庁により提供される。図面においては、以下：
図１Ａ〜１Ｃ。ＡｐｏＭ−Ｆｃは、Ｓ１Ｐ受容体を活性化させる。（図１Ａ）ＣＨＯ細胞、またはＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、もしくはＳ１Ｐ３で安定的に形質導入されたＣＨＯ細胞を、５〜３０分間処置することを、アルブミン−Ｓ１Ｐ、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（両方とも１００ｎＭのＳ１Ｐ）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（１２μｇ／ｍｌ）を使用し（上のパネル）、または、０〜２００ｎＭのＳ１Ｐまで希釈されたアルブミン−Ｓ１ＰもしくはＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ、またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（１２μｇ／ｍｌ）での用量−反応によって（下のパネル）、行った。試料を、リン酸化ｐ４４／４２ ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）および総ｐ４２／４４ ＥＲＫ（ｔＥＲＫ）について、免疫ブロッティングによって分析した。 （図１Ｂ）ＨＵＶＥＣｓを、アルブミン（Ａｌｂ）−Ｓ１Ｐ（３３３ｎＭのＳ１Ｐ）、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（２０μｇ／ｍｌ；２４０ｎＭのＳ１Ｐ）またはＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭ（２０ｍｇ／ｍｌ）で、示された時間処置し、ならびにｐ４４／４２ ＥＲＫ、ＡＫＴおよびｅＮＯＳの活性化について免疫ブロッティングにより分析した。（図１Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ３、もしくはＳ１Ｐ１，３ ＫＯのＨＵＶＥＣｓを、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｓ１Ｐ（１２μｇ／ｍｌ；１００ｎＭのＳ１Ｐ）で処置し、およびｐ４４／４２ ＥＲＫの活性化について免疫ブロッティングにより分析した。全てのウェスタンブロット実験について、Ｎ＝３の独立した実験；代表的なブロットが示されている。
ＡｐｏＭ２の結晶構造。ＡｐｏＭの疎水性結合ポケット、および、Ｓ１Ｐ脂質リン酸塩部分を取り巻くオープンで埋まっていない裂け目を、同定した。さらなる分析は、裂け目を直に取り巻く４つのアミノ酸（ＡｐｏＭ−Ｆｃ中のＴ６６、Ｖ７０、Ｉ９２、およびＭ９４）が突然変異およびタンパク質−脂質部分相互作用の変化に対して寛容であり得たということを解明した。さらにまた、Ｓ１Ｐのリン酸（ＰＯ３）基の負の荷電があることを考えると（リン酸塩（緑色）；酸素（赤色））、正に荷電したアミノ酸側鎖（すなわち、リシン（Ｋ））または水素結合を可能とするアミノ酸側鎖（すなわち、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、またはチロシン（Ｙ））のいずれかを裂け目へと導入することは、裂け目とリン脂質との相互作用を増加させること、および、脂質結合を増強もしくは安定化させることによってＳ１Ｐに対するＡｐｏＭの親和性を増加させることが予測される。
図３Ａ〜３Ｃ。網膜の病的な血管新生に対するＡｐｏＭ−Ｆｃの効果。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）に供した（１）。マウスを、ｐ７からｐ１２まで酸素過剰状態（７５％Ｏ２）に維持し、および酸素正常状態へ再導入した。ｐ１２、ｐ１４およびｐ１６で、マウスに生理食塩水または生理食塩水中に再懸濁したＡｐｏＭ−Ｆｃ（４ｍｇ／Ｋｇ）のいずれかを注射した。マウスをｐ１７でサクリファイスし、網膜を標準的な方法によって単離し（１）、およびイソレクチンB4-alexa 564で染色した。網膜を、共焦点顕微鏡によって可視化させ、および多重デジタル画像を取得してImageJによって分析した。提示されるのは、実験からの代表的な試料である。データは、次のとおり提示される。（図３Ａ）ＯＩＲによってもたらされる血管閉塞（血管喪失の面積／網膜の総面積の測定）。（図３Ｂ）ＯＩＲによってもたらされる血管新生（血管再成長の測定）。（図３Ｃ）ｐ１７でのＯＩＲによってもたらされる病変サイズ（病的な血管房の過成長の測定）。血管新生および病変サイズは、病的疾患の決め手となる決定要因であり、および網膜症を標的とするあらゆる治療薬の効能を決定するための主要な指標である。各実験についてN=5であり、およびデータは、処置したものと未処置の網膜組織とを比較して２元ＡＮＯＶＡによって分析した。
図４Ａ〜４Ｄ。ｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−ＨｉｓおよびｈＡｐｏＭ−ｈＦｃの発現および特徴づけ。（図４Ａ）ｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−Ｈｉｓ（ｐＦＵＳＥ−ｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−Ｈｉｓ）を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物のウェスタンブロット分析、および、５μｇの精製されたｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−Ｈｉｓのクマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（右）（図４Ｂ）ｈＡｐｏＭ−ｈＦｃ（ｐＦＵＳＥ−ｈＡｐｏＭ−ｈＦｃ；）を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物のウェスタンブロット分析（左）、および、８μｇの精製されたｈＡｐｏＭ−ｈＦｃのクマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（右）。（図４Ｃ)１０μｇの精製されたｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−Ｈｉｓまたは生理食塩水対照のＴＥＥＲ分析を使用した内皮バリア機能の測定。 （図４Ｄ）１０μｇの精製されたｈＡｐｏＭ−ｈＦｃまたは生理食塩水対照のＴＥＥＲ分析を使用した内皮バリア機能の測定。
図５。ＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異体Ｔ６６Ｎ、Ｖ７０Ｑ、およびＭ９４Ｙは、ＭＥＦ Ｓ１Ｐｒ１レポーター細胞におけるＳ１Ｐ受容体−１シグナリングを活性化させる。ＭＥＦ Ｓ１Ｐｒ１レポーター細胞を、３８４ウェルプレート中へと播種し、および生理食塩水ビヒクル、１００ｎＭ ＦＴＹ−Ｐ、１μＭ Ｓ１Ｐアルブミン、５μｇの精製されたスポンジ突然変異体（クローン１〜７）、または５μｇのＷＴの精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃのいずれかで２４時間処置した。ＧＦＰ陽性の核を撮像し、およびスポット検出ソフトウェアを使用して×１０でArrayScan VTIによって定量した。データは、トリプリケートのウェルの平均として提示される。
ある態様の詳細な記載
内皮細胞機能は、正常な心血管ホメオスタシスのために必須である。心血管および脳血管疾患にとっての多数の環境性および内因性リスク要因は、内皮機能不全を引き起こす。確かに、機能不全の内皮は、血管疾患の発症に関わっている（例として、参照によって本明細書に組み込まれるGirouard et al., Journal of Applied Physiology 100, 328-335, 2006に記載のとおり）。他方、種々の内生因子は、最適な内皮機能を促進し、およびリスク要因を相殺する（例として、参照によって本明細書に組み込まれるLibby et al., Journal of the American College of Cardiology 54, 2129-2138, 2009に記載のとおり）。
かかる要因の中でも特に、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）、多機能の循環するナノ粒子である。血漿ＨＤＬ濃度は、低減した心血管および脳血管疾患のリスクと相関すること（例として、参照によって本明細書に組み込まれるLibby et al., Journal of the American College of Cardiology 54, 2129-2138, 2009に記載のとおり）、ならびに虚血性事象の後の改善した結果と相関すること（例として、参照によって本明細書に組み込まれるMakihara et al., Cerebrovascular Diseases 33, 240-247, 2012; and Olsson et al., European Heart Journal 26, 890-896, 2005に記載のとおり）が示されている。ＨＤＬ粒子は、不均質であり、莫大な数の生物活性因子を含有し、および血管、代謝および免疫機能を調節するので、特定のＨＤＬ粒子サブタイプは、心血管系における固有の機能を調節するというということが提案される。
血漿アポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）含有するＨＤＬ（ＡｐｏＭ＋ＨＤＬ）は、生物活性脂質スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の生理学的担体であることが、以前に示されている。ＡｐｏＭ／Ｓ１Ｐ複合体は、炎症応答を抑制するＧタンパク質共役受容体を活性化させ、および血管バリア機能を維持する。ＡｐｏＭを欠くマウスはリポタンパク質代謝に変化があり、およびＬＤＬ受容体ヌルバックグラウンドにおいて増強されたアテローム性動脈硬化を呈する。ＩおよびＩＩ型糖尿病、心血管疾患、感染症、および内皮傷害と関連する状態を包含する、種々の病的状態は、低減したＡｐｏＭ／Ｓ１Ｐのレベルまたは活性と関連する。
本明細書に提供されるのは、内皮機能を促進し、およびホメオスタシスを回復するための、ＡｐｏＭ−Ｓ１Ｐシグナリング経路をモジュレートする戦略である。かかる戦略には、Ｓ１Ｐに結合しおよびＡｐｏＭ／Ｓ１Ｐ複合体を形成するための組換えＡｐｏＭを提供することが関与する。いくつかの態様において、ＡｐｏＭ−Ｓ１Ｐ複合体は、Ｓ１Ｐ受容体および下流のシグナリング経路を活性化させる。いくつかの態様において、過剰なＳ１Ｐを封鎖するＡｐｏＭバリアントが提供される。いくつかの態様において、組換えＡｐｏＭは、病的状態の間提供され得る。
ＨＤＬと会合していない遊離ＡｐｏＭは、極めて短い半減期を有する（例として、参照によって本明細書に組み込まれるFaber et al., Molecular Endocrinology 20, 212-218, 2006に記載のとおり）。本明細書において実証されているとおり、免疫グロブリンの定常領域にＡｐｏＭを融合させることは、血漿中でＡｐｏＭを安定化させる。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、Ｆｃに融合しているＡｐｏＭに融合しており、融合タンパク質が（例として、培養媒体中へと）分泌されること、および精製されることを許容する。
したがって、本開示のいくつかの側面は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）に融合しているアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）を含む融合タンパク質を提供する。本明細書に使用されるとき、「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異なるタンパク質からのドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。１つのタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部またはカルボキシ末端（Ｃ末端）タンパク質に位置し得、それによって「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タンパク質」をそれぞれ形成し得る。融合タンパク質は、異なるドメイン、例えば、ＡｐｏＭドメインおよびドメインおよびＦｃドメインを含み得る。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、ＦｃのＮ末端で融合している。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、ＦｃのＣ末端で融合している。
「免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域（Ｆｃ）」は、免疫グロブリン鎖定常領域のカルボキシル末端部、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその一部分を指す。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または、５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組み合わせ、を含み得る。好ましい態様において、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、および、いくつかの態様において、ＣＨ１ドメインを欠く。
いくつかの態様において、Ｆｃは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）の重鎖定常領域に由来する。いくつかの態様において、Ｆｃは、ＩｇＧ１の重鎖定常領域に由来する。他の免疫グロブリンのクラス、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）もまた使用され得る。適当な免疫グロブリン重鎖定常領域の選定は、当該技術分野において、例として、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,541,087号および第5,726,044号に、記載されている。ある特定の結果を達成するための、ある免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスからのある特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選定は、当該技術分野における技能水準の内にあると見なされる。いくつかの態様において、免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡコンストラクトの一部分は、好ましくは、少なくともヒンジドメインの一部分を、および好ましくは少なくともＦｃγのＣＨ３ドメインの一部分またはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのいずれかにおける相同ドメインを含む。
免疫グロブリンは、あらゆる哺乳動物（例として、ヒト、またはマウスもしくはラットなどのネズミ科動物）からのものであり得る。いくつかの態様において、Ｆｃは、ヒトＩｇＧからのもの（例として、ヒトＩｇＧ１）が使用される。いくつかの態様において、Ｆｃは、家畜伝染病（murrain）ＩｇＧ（例として、マウスのＩｇＧ１）からのものである。ヒトまたはマウスのＩｇＧ１からのＦｃのアミノ酸配列、およびかかるものをコードするヌクレオチド配列は、表１に提供されている。提供されている配列は、例示する目的のためのみのものであり、限定する意味を持つものではないということが理解されるべきである。免疫グロブリン重鎖定常領域の内のアミノ酸の置換または欠失もまた本明細書に企図される。非限定例は、Ｆｃ受容体に対する低減した親和性をもつＦｃバリアントを作り出すために上側ＣＨ２領域にアミノ酸置換を導入するものになる（例として、参照によって本明細書に組み込まれるCole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613に記載のとおり）。
いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる。
「アポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）」は、主に、哺乳動物の（例として、ヒト）血漿中の高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）と関連し、小さな割合がトリグリセリドリッチなリポタンパク質（ＴＧＲＬＰ）および低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）に存在する、２６ｋＤａのタンパク質である。それは、リポカリンタンパク質スーパーファミリーに属する。ＡｐｏＭは、肝臓中および腎臓中でのみ発現し、および少量は胎児の肝臓と腎臓に見られる。ネイティブなＡｐｏＭの発現は、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）およびレプチンによってin vivoおよび/またはin vitroで調節されることができた。ＡｐｏＭは、あらゆる哺乳動物（例として、ヒト、またはマウスもしくはラットなどのネズミ科動物）からのものであり得る。野生型のヒトおよびマウスＡｐｏＭのアミノ酸配列、およびかかるものをコードするヌクレオチド配列は、表１に提供されている。提供されている配列は、例示する目的のためのみのものであり、限定する意味を持つものではないということが理解されるべきである。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭは、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、ヒトＦｃに融合しているヒトＡｐｏＭを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、マウスのＦｃに融合しているマウスのＡｐｏＭを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、マウスのＦｃに融合しているヒトＡｐｏＭを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、ヒトＦｃに融合しているマウスのＡｐｏＭを含む。本明細書に記載の融合タンパク質のいずれも、あらゆる対象（例として、ヒト、またはマウスもしくはラットなどのネズミ科動物）において使用され得るが、対象と同じ起源（例として、種）からのドメインを含む融合タンパク質を使用することは、対象における融合タンパク質に対する望ましくない免疫応答を低減させ得る。これを踏まえ、いくつかの態様において、ヒトＦｃに融合しているヒトＡｐｏＭを含む融合タンパク質が、ヒト対象において使用される（例として、疾患または障害を処置するための慢性投与のために）。いくつかの態様において、マウスのＦｃ（例として、マウスＦｃ）に融合しているマウスのＡｐｏＭ（例として、マウスＡｐｏＭ）を含む融合タンパク質は、マウスにおいて（例として、疾患または障害のマウスモデルにおいて）使用される。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む。例えば、いくつかの態様において、シグナルペプチドは、ＡｐｏＭのＮ末端で融合している。「シグナルペプチド」は、分泌経路へ向かうことを運命づけられた多数の新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する短ペプチド（例として、１６〜３０アミノ酸長さ）を指す。シグナルペプチドは、典型的には、分泌経路上の膜を横切る移動に必要とされ、およびそれによって真核生物および原核生物の両方における大半のタンパク質の分泌経路への移入を普遍的に制御する。シグナルペプチドは、一般的には、３つの領域：通常は正に荷電したアミノ酸を含む、長さを異にするＮ末端領域；疎水性領域；および短いカルボキシ末端ペプチド領域、を包含する。真核生物においては、発生期の前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドが、リボソームを粗面小胞体膜(ER)へと導き、およびそれを横切った成長するペプチド鎖の輸送を開始させる。しかしながら、シグナルペプチドは、成熟したタンパク質の最終的な行き先には関与しないない。分泌タンパク質であって、それらの配列中にさらなるアドレスタグを持たないものは、外部環境へと分泌される。シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）常駐シグナルペプチダーゼによって前駆体タンパク質から切断されるか、または、それらは切断されないまま残り、および膜アンカーとして機能する。
シグナルペプチドは、１５〜６０アミノ酸の長さを有し得る。例えば、シグナルペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸の長さを有し得る。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、２０〜６０、２５〜６０、３０〜６０、３５〜６０、４０〜６０、４５〜６０、５０〜６０、５５〜６０、１５〜５５、２０〜５５、２５〜５５、３０〜５５、３５〜５５、４０〜５５、４５〜５５、５０〜５５、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、１５〜４５、２０〜４５、２５〜４５、３０〜４５、３５〜４５、４０〜４５、１５〜４０、２０〜４０、２５〜４０、３０〜４０、３５〜４０、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０、１５〜２５、２０〜２５、または１５〜２０アミノ酸の長さを有し得る。
いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、融合タンパク質の分泌を促すためにＮまたはＣ末端のいずれかにあるシグナルペプチドを含有する。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、融合タンパク質のＮ末端にある。例えば、融合タンパク質は、シグナルペプチド−ＡｐｏＭ−Ｆｃ構造を有し得る。いくつかの態様において、融合タンパク質に融合しているシグナルペプチドは、人工シグナルペプチド、例として、ＩＬ−２シグナルペプチド、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号５６）で表されるアミノ酸配列を含むＩＬ−２シグナルペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号５７）で表されるアミノ酸配列を含むＩｇ重鎖イプシロン−１シグナルペプチド（ＩｇＥ ＨＣ ＳＰ）である。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５８）で表されるアミノ酸配列を含むＩｇＧｋ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＨＡＨシグナルペプチド（ＩｇＧｋ ＳＰ）である。
いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、配列番号１〜４および６８のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、融合タンパク質は、配列番号１〜４および６８のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１〜４および６８のいずれか１つと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１〜４および６８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、配列番号１〜４および６８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる。
さらに本明細書に提供されるのは、ＡｐｏＭバリアント、およびかかるＡｐｏＭバリアントを含む融合タンパク質である。本明細書に記載のとおり、Ｓ１Ｐに結合することに関与するＡｐｏＭ中のアミノ酸は、Ｓ１ＰへのＡｐｏＭバリアントの結合を増強させる別のアミノ酸で置換され得る。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐに結合することに関与するＡｐｏＭ中のアミノ酸は、S1Pのリン酸と相互作用するそれらである。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐに結合することに関与するＡｐｏＭ中のアミノ酸は、Ｓ１Ｐ中のリン酸との増強した相互作用のために、およびそれによるより強いＳ１Ｐへの結合のために、正に荷電しているかまたは水素結合しているアミノ酸で置換され得る。かかるＡｐｏＭバリアントは、本明細書中で「ＡｐｏＭスポンジバリアント」と呼ばれる。 ＡｐｏＭスポンジバリアントを含む融合タンパク質は、「スポンジバリアント」ともまた呼ばれ得る。スポンジバリアント中の変異を含有しないＡｐｏＭは、「非スポンジＡｐｏＭ」と呼ばれ得る。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、増強した親和性でＳ１Ｐに結合する。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントとＳ１Ｐとの間の親和性は、非スポンジＡｐｏＭとＳ１Ｐとの間の親和性と比較して少なくとも２０％増強される。例えば、ＡｐｏＭスポンジバリアントとＳ１Ｐとの間の親和性は、非スポンジＡｐｏＭとＳ１Ｐとの間の親和性と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上、増強される。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントとＳ１Ｐとの間の親和性は、非スポンジＡｐｏＭとＳ１Ｐとの間の親和性と比較して２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上、増強される。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭにおける置換されているアミノ酸は、ヒトＡｐｏＭ（配列番号５）におけるＴ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、および／またはＭ７０である。これらのアミノ酸位置は、マウスＡｐｏＭ（配列番号６）におけるＴ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、および／またはＴ７０に対応し、これらもまた置換され得る。特定のアミノ酸への参照をしないときの「アミノ酸置換」は、普段その位置で見出される野生型の残基以外の、あらゆるアミノ酸を包含し得る。かかる置換は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびプロリンなどの非極性（疎水性）アミノ酸との置き換えであり得る。置換は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンなどの極性（親水性）アミノ酸との置き換えであり得る。置換は、電荷を帯びたアミノ酸、例として、アスパラギン酸、およびグルタミン酸などの負電荷を帯びたアミノ酸、および、リシン、アルギニン、およびヒスチジンなどの正電荷を帯びたアミノ酸、との置き換えであり得る。
本明細書に記載の置換変異は、典型的には、異なる自然発生のアミノ酸残基との置き換えになるが、一部の場合には、自然発生でないアミノ酸残基もまた置換され得る。本明細書においてその用語が使用される、非天然アミノ酸は、自然発生するかまたは科学的に合成されるかのいずれかである、タンパク質新生しない（すなわち、タンパク質非コードの）アミノ酸である。例は、β−アミノ酸（β３およびβ２）、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖コアアミノ酸、ジアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、およびＮ−メチルアミノ酸、を包含するがこれらに限定されない。いくつかの態様において、アミノ酸は、置換または非置換とすることができる。置換アミノ酸または置換基は、疎水性側鎖上の、ハロゲン化脂肪族もしくは芳香族修飾、または脂肪族もしくは芳香族修飾とすることができる。
いくつかの態様において、記載されたＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例えば、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を含み得る。１以上のアミノ酸置換を含むＡｐｏＭスポンジバリアントについては、アミノ酸置換は、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置でのあらゆる組み合わせ、例として、Ｔ４２およびＶ４６での、Ｔ４２およびＩ６８での、Ｔ４２およびＭ７０での、Ｖ４６およびＩ６８での、Ｖ４６およびＭ７０での、Ｉ６８およびＭ７０での、Ｔ４２、Ｖ４６、およびＩ６８での、Ｔ４２、Ｖ４６、およびＭ７０での、Ｔ４２、Ｉ６８、およびＭ７０での、Ｖ４６、Ｉ６８、およびＭ７０での、およびＴ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、およびＭ７０でのものであり得る。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号５における位置Ｔ４２に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。本明細書に記載のとおり、いくつかの態様において、配列番号５のＴ４２に対応する位置のアミノ酸は、正に荷電しているかまたは水素結合しているアミノ酸で置換されていてもよい。いくつかの態様において、配列番号５における位置Ｔ４２に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｔ４２Ｎである。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号５における位置Ｖ４６に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。本明細書に記載のとおり、いくつかの態様において、配列番号５のＶ４６に対応する位置のアミノ酸は、正に荷電しているかまたは水素結合しているアミノ酸で置換されていてもよい。いくつかの態様において、配列番号５における位置Ｖ４６に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｖ４６Ｋ、Ｖ４６Ｎ、またはＶ４６Ｑである。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号５における位置Ｉ６８に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。本明細書に記載のとおり、いくつかの態様において、配列番号５のＩ６８に対応する位置のアミノ酸は、正に荷電しているかまたは水素結合しているアミノ酸で置換されていてもよい。いくつかの態様において、配列番号５における位置Ｉ６８に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｉ６８ＫまたはＩ６８Ｎである。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号５における位置Ｍ７０に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。本明細書に記載のとおり、いくつかの態様において、配列番号５のＭ０に対応する位置のアミノ酸は、正に荷電しているかまたは水素結合しているアミノ酸で置換されていてもよい。いくつかの態様において、配列番号５における位置Ｍ７０に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｍ７０Ｙである。いくつかの態様において、配列番号５における位置Ｍ７０に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｉ７０Ｙ（例として、配列番号６における）である。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。例えば、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントは、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる。
本開示の融合タンパク質は、本明細書に記載のＡｐｏＭスポンジバリアントのいずれをも含み得る。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジ突然変異体を含む融合タンパク質は、シグナルペプチド、例として、ＡｐｏＭスポンジ突然変異体のＮ末端で融合しているものを、さらに含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントを含む融合タンパク質において、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置でのアミノ酸置換は、融合タンパク質の位置Ｔ６６、Ｖ７０、Ｉ９２、またはＭ９４でのもの（例として、配列番号１における）、または融合タンパク質の位置Ｔ６６、Ｖ７０、Ｉ９２、またはＩ９４でのもの（例として、配列番号２における）である。
いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントを含む融合タンパク質は、配列番号１〜４のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントを含む融合タンパク質は、配列番号１〜４のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントを含む融合タンパク質は、配列番号１〜４のいずれか１つと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントを含む融合タンパク質は、配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＡｐｏＭスポンジバリアントを含む融合タンパク質は、配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる。
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、KarlinおよびAltschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムの、KarlinおよびAltschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるとおり改変されたものを使用して、決定される。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、興味の対象のタンパク質分子に相同であるアミノ酸配列を得るための、ＸＢＬＡＳＴプログラム、score=50、wordlength=3で行うことができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、ギャップドＢＬＡＳＴを、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載のとおり利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用するときには、それぞれのプログラム（例として、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。
アミノ酸置換は、ペプチドの化学合成の間に、所望の置換アミノ酸を合成プロセスにおける適当な配列に加えることによって達成することができる。代替的に、分子生物学的方法を使用することもできる。非保存的置換もまた、それらの本明細書に記載のペプチドの活性を実質的に保つ程度までは網羅される。
いくつかの態様において、アミノ酸置換された融合タンパク質は、置換されていない融合タンパク質の活性を実質的に保つ。「実質的に保つ」とは、バリアントの１以上の活性が、同様の条件下での同様のアッセイにおける元のポリペプチドの活性と比較して、少なくとも５０％であることを意味する。いくつかの態様において、活性は、元の融合タンパク質と比較して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍またはそれよりも高い活性である。
いくつかの態様において、リンカーは、（例として、野生型またはバリアント）をFcに融合させるために使用され得、および／またはシグナルペプチドを残りの融合タンパク質に融合させるために使用され得る。「リンカー」は、２つの分子または部分を、例として、融合タンパク質の２つのドメインを、連結させる、化学基もしくは分子を指す。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、ドメイン、または他の部分の間に位置するかまたはそれらによって隣接され、および、１つ１つに共有結合を介して接続されて、それによって２つを接続する。リンカーは、共有結合のように単純であり得るか、またはそれは、多数の原子の長さの高分子リンカーであり得る。いくつかの態様において、リンカーは、ポリペプチドであるかまたはアミノ酸に基づく。いくつかの態様において、リンカーは、ペプチド様ではない。いくつかの態様において、リンカーは、共有結合（例として、炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、炭素−ヘテロ原子結合、等々）である。いくつかの態様において、リンカーは、アミド結合の炭素−窒素結合である。いくつかの態様において、リンカーは、環状または非環状の、置換または非置換の、分枝または非分枝の脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、高分子（例として、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステル、等々）である。
いくつかの態様において、リンカーは、アミノアルカン酸の、モノマー、ダイマー、またはポリマーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノアルカン酸（例として、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ−アラニン、３−アミノプロパン酸、４−アミノブタン酸、５−ペンタン酸、等々）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の、モノマー、ダイマー、またはポリマーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、炭素環部分（例として、シクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の態様において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の態様において、リンカーは、アミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ペプチドを含む。いくつかの態様において、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。いくつかの態様において、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、リンカーへのペプチドからの求核剤（例として、チオール、アミノ）の付着を促すための官能基化部分を包含し得る。あらゆる求電子剤は、リンカーの一部として使用され得る。例示の求電子剤は、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアン酸塩、を包含するがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例として、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、結合（例として、共有結合）、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、長さ１〜１００アミノ酸、例えば、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０または１５０〜２００アミノ酸である。より長いかまたはより短いリンカーもまた企図される。
いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号５９）を含み、これはＸＴＥＮリンカーともまた呼ばれる。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳ（配列番号６０）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号６１）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６２）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６３）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６４）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号５９）、または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのいずれかの組み合わせ、を含み、ここで、ｎは、独立して、１と３０との間の整数であり、およびＸはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。いくつかの態様において、リンカーは、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号５９）、およびＳＧＧＳ（配列番号６０）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号６５）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号６６）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号６７）を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、修飾を含む。本明細書中で融合タンパク質を指すとき、それは、その全ての誘導体およびバリアントを網羅する。修飾を含むポリペプチドは、アミノ酸の内容以外の追加の特徴を有する。本明細書に使用されるとき、タンパク質またはポリペプチド（例として、本明細書に記載の融合タンパク質）の「修飾」または「誘導体」は、所与のペプチドの、基準のペプチドに対して相対的に化学修飾された形態である、修飾されたかまたは誘導体化されたポリペプチドを産生し、修飾は、オリゴマー化またはポリマー化、アミノ酸残基またはペプチド骨格の修飾、架橋、環化、コンジュゲーション、ＰＥＧ化、グリコシル化アセチル化、リン酸化、アシル化、カルボキシル化、脂質化、チオグリコール酸アミド化、アルキル化、メチル化、ポリグリシル化、グリコシル化、ポリシアル化、アデニル化、ＰＥＧ化、追加の異種のアミノ酸配列への融合、あるいは、本明細書に記載のポリペプチドの活性を実質的に保ちながらペプチドの安定性、可溶性、またはその他の性質を実質的に変化させるようなその他の修飾、を包含するが、これらに限定されない。
かかる修飾を含む融合タンパク質は、架橋されている、環化されている、コンジュゲートされている、アシル化されている、カルボキシル化されている、脂質化されている、アセチル化されている、チオグリコール酸アミド化されている、アルキル化されている、メチル化されている、ポリグリシル化されている、グリコシル化されている、ポリシアル化されている、リン酸化されている、アデニリル化されている、ＰＥＧ化されている、またはそれらの組み合わせである、ということが理解されるべきである。いくつかの態様において、本開示の修飾された融合タンパク質は、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類または単糖類、およびリン酸塩などの、非アミノ酸要素を含有し得る。本開示の融合タンパク質は、Ｃ末端（例として、Ｃ末端アミド化）、Ｎ末端（例として、Ｎ末端アセチル化）で、本明細書に開示の修飾を含み得る。末端修飾は、プロテイナーゼ消化に対する感受性を低減するのに有用であり、かつそのことでよく知られており、およびそれゆえに、溶液特にプロテアーゼが存在し得る生体液中で、ポリペプチドの半減期を延長させるのに役立つ。いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、末端ＮＨ２アシル化による修飾、例として、アセチル化、またはチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシルアミド化によるもの、例として、アンモニア、メチルアミン等での末端修飾、など、配列内でさらに修飾されている。
末端修飾は、プロテイナーゼ消化による感受性を低減することに有用であり、およびそれゆえに、溶液中で、特にプロテアーゼが存在し得る生体液中で、ポリペプチドの半減期を延長させるのに役立つことができる。アミノ末端修飾は、メチル化（例として、−ＮＨＣＨ３または−Ｎ（ＣＨ３）２）、アセチル化（例として、酢酸またはa-クロロ酢酸、a-ブロモ酢酸、もしくはa-ヨード酢酸などのそのハロゲン化誘導体で）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基を付加すること、あるいは、ＲＣＯＯ−で定義されるカルボン酸官能基またはＲ−−ＳＯ２−で定義されるスルホニル官能基（ここでＲは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール等、および同様の基、からなる群から選択される）を含有するいずれかの保護基で、アミノ末端をブロックすること、を包含する。プロテアーゼに対する感受性を減少させるかまたはペプチドの立体配置を制限するために、（Ｎ末端アミノ基がないように）デスアミノ酸をＮ末端に組み込むこともまたできる。ある態様において、Ｎ末端は、酢酸または無水酢酸でアセチル化されている。
カルボキシ末端修飾は、遊離酸をカルボキサミド基と置き換えること、または、構造的拘束を導入するためにカルボキシ末端で環状ラクタムを形成することを、包含する。プロテアーゼに対する感受性を減少させるかまたはペプチドの立体配置を制限するために、末端アミノもしくはカルボキシ基がないように、本明細書に記載のペプチドを環化させること、またはデスアミノもしくはデスカルボキシ残基をペプチドの末端に組み込むこともまたできる。環状ペプチド合成の方法は、当該技術分野において、例えば、米国特許出願第20090035814号；MuralidharanおよびMuir, 2006, Nat Methods, 3:429-38；ならびにLocklessおよびMuir, 2009, Proc Natl Acad Sci U S A. Jun 18, Epubにおいて、知られている。本明細書に記載のペプチドのＣ末端官能基は、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、ならびにその低級エステル誘導体、ならびにその薬学的に許容し得る塩を包含する。
いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、リン酸化されている。リン酸化およびその他の方法によってペプチドを修飾することもできる（例として、Hruby, et al. (1990) Biochem J. 268:249-262に記載のとおり）。いくつかの態様において、遺伝的にコードされたアミノ酸（または立体異性体のＤアミノ酸）の自然発生の側鎖を、他の側鎖で、例を挙げると、アルキル、低級（Ｃ１〜６）アルキル、環状の４、５、６、から７員のアルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびそれらの低級エステル誘導体などの基で、および４、５、６、から７員の複素環で、置き換えることもまたできる。例えば、プロリン残基の環サイズが５員から４、６、もしくは７員に変更されたプロリン類縁体を用いることができる。
環状基は、飽和または不飽和とすることができ、および、不飽和であれば、芳香族または非芳香族とすることができる。複素環基は、好ましくは、１以上の窒素、酸素、および／または硫黄原子を含有する。かかる基の例は、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルホリニル（例として、モルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例として、１−ピペラジニル）、ピペリジル（例として、１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例として、１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例として、チオモルホリノ）、およびトリアゾリル基を包含する。これらの複素環基は、置換されているかまたは非置換とすることができる。基が置換されている場合、置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換もしくは非置換フェニルとすることができる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、１以上のポリマー部分に取り付けられ得る。いくつかの態様において、これらのポリマーは、本開示の融合タンパク質に共有結合的に取り付けられている。いくつかの態様において、最終製品の調製物の治療的な使用のために、ポリマーは、薬学的に許容し得るものである。当業者は、ポリマー−ペプチドコンジュゲートが治療的に使用されるかどうかなどの考慮事項、およびそうであるならば所望の投薬量、循環時間、タンパク質分解への抵抗性、および他の考慮事項、に基づいて、所望のポリマーを選択することが可能である。
好適なポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−）ヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを包含するデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンフラグメント、多糖類、セルロース、および、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを包含するセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびそれらの誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびそれらの誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびα，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）］−ＤＬ−アスパルトアミド等、またはそれらの混合物、を包含する。かかるポリマーは、それ自身の生物学的活性を有していても有していなくてもよい。ポリマーは、融合タンパク質へ共有結合的にまたは非共有結合的にコンジュゲートされることができる。血清半減期を増加させるためおよび放射線治療のための、コンジュゲーションの方法は、当該技術分野において、例えば、本明細書によってそれらの全体が参照により組み込まれる米国特許第5,180,816号、第6,423,685号、第6,884,780号、および第7,022,673号において知られている。
いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、１以上の水溶性ポリマーに取り付けられ得る。水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニル−ピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、およびポリオキシエチル化ポリオール、であり得る。好ましい水溶性ポリマーは、ＰＥＧである。
ポリマーは、あらゆる分子量のものであり得、および分枝または非分枝であり得る。反応剤ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは、約３，０００と約５０，０００ダルトンの間である（用語「約」は、ＰＥＧの調製物中において、記述された分子量よりも、一部の分子は重量が大きく、および一部のものは小さい、ということを指し示す。)。より好ましくは、ＰＥＧは、約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有し、およびなおより好ましくは、ＰＥＧは１５〜３０ｋＤａの分子量を有する。所望の治療薬プロファイル（例として、所望の徐放の期間；もしあれば、生物学的活性への影響；取り扱いの簡単さ；抗原性の度合いまたは欠如；および当業者に知られている治療用ペプチドに対するＰＥＧのその他の効果）に依存して、他のサイズが使用されてもよい。
取り付けられるポリマー分子の数は変動し得る：例えば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の水溶性ポリマーが、本開示のペプチドに取り付けられ得る。複数取り付けられたポリマーは、同じかまたは異なる化学部分であり得る（例として、異なる分子量のＰＥＧ）。
ある態様において、ＰＥＧは、本明細書に記載の融合タンパク質の少なくとも１つの末端（Ｎ末端またはＣ末端）に付いていてもよい。いくつかの態様において、ＰＥＧは、融合タンパク質のリンカー部分に付いていてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、好適に活性化されたＰＥＧ種で誘導体化されることを可能とする１よりも多い反応性アミンを包含する。
ＰＥＧ化は、標的分子とのＰＥＧの反応性誘導体のインキュベーションにより慣行的に達成される。薬物または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合的な付着は、剤を宿主の免疫系から「覆い隠す（mask）」ことができ（低減した免疫原性および抗原性）、および剤の流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増加させ、これは腎クリアランスを低減させることによってその循環時間を延長させる。ＰＥＧ化はまた、疎水性の剤およびタンパク質に水溶性を提供することもできる。ＰＥＧ化は、分子の分子量を増加させることによって、修飾されていない形態よりも、以下のものなどの複数の有意な薬学的利点を付与することができる：改善した薬物溶解性、低減された投薬頻度、減弱された有効性を伴わず、潜在的に低減された毒性を伴う、延びた循環寿命、増加した薬物安定性、および、タンパク質分解による劣化からの増強された保護。加えて、ＰＥＧ化された薬物は、新規な送達形式および投薬レジメンについてのより広範な機会を有する。分子、タンパク質およびペプチドをＰＥＧ化する方法は、当該技術分野において周知であり、例として、米国特許第5,766,897号；第7,610,156号；第7,256,258号および国際出願公開第WO/1998/032466号に記載のとおりである。
本明細書の融合タンパク質のコンジュゲートが、本明細書に網羅される。 融合タンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に加えて、他のポリマーにコンジュゲートされることができる。ポリマーは、それ自身の生物学的活性を有していても有していなくてもよい。ポリマーコンジュゲーションのさらなる例は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを包含するデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンフラグメント、多糖類、セルロースおよびメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを包含するセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびそれらの誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびそれらの誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびα，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）］−ＤＬ−アスパルトアミド等、またはそれらの混合物などのポリマーを包含するが、これらに限定されない。
ポリマーへのコンジュゲーションは、他の効果の中でも特に、血中半減期を改善することができる。様々なキレート化剤は、本明細書に記載のペプチドをコンジュゲートさせるために使用することができる。これらのキレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコール−０，０’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、トリエチレンテトラアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ"，Ｎ’"，Ｎ’"−六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ"，Ｎ’"−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＴＩＴＲＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ"，Ｎ’"−四酢酸（ＴＥＴＡ）、および１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（ＴＥＴＲＡ）を包含するが、これらに限定されない。コンジュゲーションの方法は、当該技術分野において、例えば、本明細書によってそれらの全体が参照により組み込まれるP. E. Thorpe, et. al, 1978, Nature 271, 752 − 755; Harokopakis E., et. al., 1995, Journal of Immunological Methods, 185:31-42；S. F. Atkinson, et. al., 2001, J. Biol. Chem., 276:27930-27935；および米国特許第5,601,825号、第5,180,816号、第6,423,685号、第6,706,252号、第6,884,780号および第7,022,673号において周知である。
ペプチドを安定化させるための当該技術分野において知られている他の方法が、本明細書に記載の方法および組成物とともに使用され得る。例えば、Ｄ−アミノ酸を使用すること、低減したアミド結合をペプチド骨格に使用すること、および側鎖を連結するのに非ペプチド結合を使用すること（ピロリノンおよび糖模倣化合物を包含するがこれらに限定されない）は、各々、安定化を提供することができる。糖スキャフォールドペプチド模倣物の設計および合成は、Hirschmann et al. （J. Med. Chem., 1996, 36, 2441-2448により記載され、これは全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。さらに、ピロリノンに基づいたペプチド模倣物は、改善したバイオアベイラビリティ特性を有する安定なバックグラウンド上のペプチドファーマコフォアを提示する（例えば、Smith et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 11037-11038を参照）、これは全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
異なる修飾および誘導体化の全ての組み合わせが、本明細書に記載の融合タンパク質として構想される。ポリペプチドを再個別化（reprivatizing）する、修飾、誘導体および方法は、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる公開された国際出願公開第WO2010/014616号に記載されている。
本開示の他の側面は、融合タンパク質を製造する方法を提供する。融合タンパク質は、一般的に、適当な細胞（例として、細菌細胞または真核細胞）中の発現形態の組換え核酸から製造され、および単離される。融合タンパク質を製造するために、融合タンパク質をコードする核酸が、細胞（例として、細菌細胞、または酵母細胞もしくは昆虫細胞などの真核細胞）内へと導入され得る。細胞は、融合タンパク質をコードする核酸から融合タンパク質が発現することを許容する条件下で、培養され得る。シグナルペプチドを含む融合タンパク質は、例として、培養媒体中へと、分泌されることができ、およびその後回収されることができる。融合タンパク質は、当該技術分野において知られるタンパク質を精製するあらゆる方法によって単離され得る。
本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を得ること、および核酸のヌクレオチド配列を決定することは、当該技術分野において知られるあらゆる方法によってなし得る。本明細書に記載の融合タンパク質またはバリアントをコードする非限定的な例示のヌクレオチド配列は、表１および表２に提供され、例として、配列番号５１〜５４である。当業者は、融合タンパク質のアミノ酸配列から、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を同定することが可能である。本開示の融合タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、二本鎖または一本鎖であり得る。いくつかの態様において、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、異なる発現系（例として、哺乳動物の発現のため）に適応するために、コドン最適化され得る。
いくつかの態様において、核酸は、発現ベクターなどのベクター内に含まれている。いくつかの態様において、ベクターは、核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
本明細書に記載の融合タンパク質の発現のために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲなどのウイルスＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、E. coli ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、および単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターを包含するがこれらに限定されない、様々なプロモーターを使用することができる。
調節可能なプロモーターもまた、使用することができる。かかる調節可能なプロモーターは、ｌａｃオペレーターを持つ哺乳動物細胞プロモーターからの転写を調節するための転写モジュレーターとしてE. coliからのｌａｃリプレッサーを使用するそれらのもの［Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)］、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を使用するそれらのもの［Gossen, M.,およびBujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)；Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998)；Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)］、を包含する。他の系は、ＦＫ５０６ダイマー、アストラジオール（astradiol）を使用するＶＰ１６もしくはｐ６５、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン（diphenol murislerone）、またはラパマイシンを包含する。誘導可能な系は、Invitrogen, ClontechおよびAriadから入手可能である。
オペロンを伴うリプレッサーを包含する調節可能なプロモーターを使用することができる。１つの態様において、Escherichia coliからのｌａｃリプレッサーは、ｌａｃオペレーターを持つ哺乳動物細胞プロモーターからの転写を調節するための転写のモジュレーターとして機能することができ［M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)］；GossenおよびBujard (1992)；［M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)］は、哺乳動物細胞における遺伝子発現を制御するために、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を転写アクチベーター（ＶＰ １６）と組み合わせたことでｔｅｔＲ−哺乳動物細胞転写アクチベーター融合タンパク質ｔＴａ（ｔｅｔＲ−ＶＰ １６）を作り出し、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）メジャー前初期プロモーターに由来するｔｅｔＯを保有する最小プロモーターと組み合わせたことでｔｅｔＲ−ｔｅｔオペレーター系を作り出した。１つの態様において、テトラサイクリン誘導性スイッチが使用される（Yao et al., Human Gene Therapy; Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)；Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)）。
加えて、例えば、次のもののうちのいくつかまたは全てを含有することができる：哺乳動物細胞における安定なまたは一過性のトランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子；転写の高いレベルのためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセッシングシグナル；ＳＶ４０ポリオーマ複製起点および正しいエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、汎用的なマルチクローニング部位；ならびにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのin vitro転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター。導入遺伝子を含有するベクターを製造するための好適なベクターおよび方法は、当該技術分野において周知かつ利用可能である。
核酸を含む発現ベクターを、慣用的な技法（例として、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈殿）によって宿主細胞へ移入させることができ、および、トランスフェクトされた細胞は、本明細書に記載の融合タンパク質を製造するための慣用的な技法によって培養される。いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質の発現は、構成的、誘導性または組織特異的プロモーターによって調節される。
本明細書に記載の融合タンパク質を発現させるために使用される宿主細胞は、Escherichia coliなどの細菌細胞、または、好ましくは真核細胞の、いずれかであり得る。特に、ヒトサイトメガロウイルスからのメジャーな中間体初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併せたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、免疫グロブリンについての有効な発現系である（Foecking et al. (1986) "Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors," Gene 45:101-106; Cockett et al. (1990) "High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification," Biotechnology 8:662-667）。
様々な宿主発現ベクター系が、本明細書に記載の融合タンパク質を発現させるために利用され得る。かかる宿主発現系は、本明細書に記載の単離された融合タンパク質のコード配列がそれによって産生され得および続いて精製され得るビヒクルを表すが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされたときに本明細書に記載の融合タンパク質をin situで発現し得る細胞をもまた表す。
これらは、本明細書に記載の融合タンパク質についてのコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例として、E. coliおよびB. subtilis）などの微生物；本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例として、Saccharomyces pichia）；本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例として、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例として、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に感染したかまたは本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例として、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例として、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例として、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現コンストラクトを保有する、哺乳動物細胞系（例として、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ様細胞（米国特許第5,807,715号を参照）、Ｐｅｒ Ｃ．６細胞（Crucellにより開発されたヒト網膜細胞））、を包含するがこれらに限定されない。
細菌系において、数々の発現ベクターが、発現させる融合タンパク質のために意図した使用に依存して、有利に選択され得る。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質の医薬組成物の生成のために、大量のかかるタンパク質が製造されるべき場合には、容易に精製される高いレベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましいことがあり得る。かかるベクターは、E. coli発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones," EMBO J. 2:1791-1794）（融合タンパク質が産生されるように、コード配列が個別に、ｌａｃ Ｚコード領域とインフレームにてベクター中へとライゲートされ得る）；ｐＩＮベクター（Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli," J. Biol. Chem. 24:5503-5509）；等を包含するが、これらに限定されない。
ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とともに融合タンパク質としての外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、かかる融合タンパク質は、可溶性であり、および、溶解された細胞から、吸着およびマトリックスグルタチオンアガロースビーズへの結合と、これに続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出を行うことによって、簡単に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されることができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を包含するように設計される。
昆虫系において、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。ウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞中で成長する。コード配列は、個別に、ウイルスの非必須領域（例として、ポリヘドリン遺伝子）へとクローン化され得、およびＡｃＮＰＶプロモーター（例として、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。
哺乳動物宿主細胞において、数々のウイルス由来発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、興味の対象のコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例として、後期プロモーターおよび三区分リーダー配列にライゲートされ得る。このキメラ遺伝子は、次いでin vitroまたはin vivo組み換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例として、領域Ｅ１またはＥ３）中における挿入は、感染した宿主中で生存可能であり免疫グロブリン分子を発現させることを可能とする組換えウイルスをもたらすことになる（例として、Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。
特定の開始シグナルもまた、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために要求され得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を包含する。さらにまた、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするため、所望のコード配列のリーディングフレームと同相にしなくてはならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、様々な起源のものとすることができる。発現の効率は、適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、等々の包含によって、向上し得る（Bitter et al. (1987) "Expression And Secretion Vectors For Yeast," Methods in Enzymol. 153:516-544を参照）。
加えて、宿主細胞株が選定され得、これは、挿入された配列の発現をモジュレートするか、または所望の特定のやり方で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングするものである。タンパク質産物のかかる修飾（例として、グリコシル化）およびプロセッシング（例として、切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。組換えタンパク質の精製および修飾は、当業者によって容易によく理解される数々の態様を包含し得るように、当該技術分野において周知である。
当該技術分野において知られるあらゆる既知のプロテアーゼまたはペプチダーゼを、前駆体分子の、例として、トロンビンまたは第Ｘａ因子（Nagai et al. (1985) "Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255、およびreviewed in Jenny et al. (2003) "A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa," Protein Expr. Purif. 31:1-11、それらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる）、エンテロキナーゼ（Collins-Racie et al. (1995) "Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA," Biotechnology 13:982-987、本明細書によってその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、フリン、およびＡｃＴＥＶ（Parks et al. (1994) "Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase," Anal. Biochem. 216:413-417、本明細書によってその全体が参照により本明細書に組み込まれる）および口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３の、記載された修飾のために使用することができる。
異なる宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳語プロセッシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適当な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを確実にするために選定されることができる。このため、一次転写物の正しいプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を保有する真核性の宿主細胞が、使用され得る。かかる哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔ、を包含するがこれらに限定されない。
組換えタンパク質の長期間の高収率の製造のためには、安定的な発現が好ましい。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質を安定的に発現する細胞株が工学的に作り出され得る。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞は、適当な発現制御要素（例として、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等々）によって制御されたＤＮＡで、および選択可能なマーカーで、形質転換されることができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、工学的に作り出された細胞は、富化された媒体中で１〜２日間成長させられ得、および次いで選択可能な媒体へと切り替えられ得る。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対し抵抗性を付与し、および細胞がそれらの染色体中へとプラスミドを安定的に取り込みおよび細胞巣を形成するように成長することを許容し、これがひいてはクローン化され、および細胞株へと拡張させることができる。この方法は、本明細書に記載の融合タンパク質を発現する細胞株を工学的に作り出すために有利に使用され得る。かかる工学的に作り出された細胞株は、本明細書に記載の融合タンパク質と直接的にまたは間接的に相互作用する融合タンパク質のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al. (1977) "Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells," Cell 11: 223-232）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska et al. (1992) "Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy," Bioessays 14: 495-500）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al. (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene," Cell 22: 817-823）を包含するがこれらに限定されない、数々の選択系が使用され得、遺伝子はそれぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において用いられ得る。
また、代謝拮抗物質の耐性を、次の遺伝子について選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートへの抵抗性を付与する（Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570；O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸への抵抗性を付与する（Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８への抵抗性を付与する（Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260:926-932；およびMorgan et al. (1993) "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217）およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンへの抵抗性を付与する（Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells," Gene 30:147-156）。
使用することができる、組換えＤＮＡ技術の技術分野において一般に知られている方法は、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；およびChapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.；Colberre-Garapin et al. (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells," J. Mol. Biol. 150:1-14において記載されている。
本明細書に記載の融合の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（振り返りには、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)）を参照。本明細書に記載の融合タンパク質を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能なとき、宿主細胞の培養物中に存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加させる。増幅された領域が、本明細書に記載の融合タンパク質のヌクレオチド配列または本明細書に記載の融合タンパク質と関連するので、融合タンパク質の産生もまた増加することになる（Crouse et al. (1983) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Mol. Cell. Biol. 3:257-266）。
本明細書に記載の融合がひとたび組換え発現させられると、それはポリペプチド、ポリタンパク質または抗体の精製のための、当該技術分野において知られるあらゆる方法（例として、抗原選択性に基づく抗体精製スキームに類似）によって生成され得、例えば、クロマトグラフィー（例として、イオン交換、親和性、特に特定の抗原に対する親和性によるもの（任意に、ポリペプチドがＦｃドメイン（またはその一部分）を含む、タンパク質Ａ選択の後)、およびサイジングクロマトグラフィー）、遠心分離、差分溶解度によって、またはポリペプチドもしくは抗体の精製のためのあらゆる他の標準的な技法による。
いくつかの態様において、精製（例として、親和性クロマトグラフィーによる）を促すために、本明細書に記載の融合タンパク質は、融合ドメインをさらに含む。かかる融合ドメインの周知の例は、限定せずに、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミン、を包含する。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離のために特に有用である。親和性精製の目的のために、グルタチオン−、アミラーゼ−およびニッケル−またはコバルト−コンジュゲート樹脂などの、親和性クロマトグラフィーのための関係するマトリックスが使用される。かかるマトリックスの数多くのものは、Pharmacia ＧＳＴ精製系、およびQIAexpressTM系（Qiagen）（（ＨＩＳ６）融合パートナーとともに有用である）などの「キット」形態で入手可能である。
本開示の他の側面は、本明細書に記載の融合タンパク質に結合する抗体を提供する。「抗体」または「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、外因性物質（例として、細菌およびウイルスなどの病原体）を中和するための免疫系によって使用される形質細胞によって主に産生される、大きなＹ字型のタンパク質である。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、として分類される。「抗体」および「抗体フラグメント」は、全抗体およびあらゆる抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部」）、またはそれらの一本鎖を包含する。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）と重鎖定常領域とを含んでなる。
重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）と軽鎖定常領域とを含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変性の領域へとさらに細分化されることができ、フレームワーク領域と名付けられたより保存された領域とともに散在している。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で並べられている、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、から構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、宿主細胞または因子（免疫系の種々の細胞（例として、エフェクター細胞)、および、古典的な補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）を包含する）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
基本的な４本鎖の抗体単位は、２つの同一のＬ鎖および２つのＨ鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と称される追加のポリペプチドを一緒に伴った５つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、およびそれゆえに１０の抗原結合部位を含有し、一方、分泌されたＩｇＡ抗体は、ポリマー化して、Ｊ鎖を一緒に伴った２〜５つの基本的なヘテロ四量体単位を含む多価集合体を形成することができる）。ＩｇＧの場合、４本鎖単位は、一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに依存する１以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。各ＨおよびＬ鎖はまた、一定間隔で間をあけた鎖内ジスルフィド架橋も有する。
各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、これに続いてαおよびγ鎖の各々に対して３つの定常ドメイン（ＣＨ）、および、μおよびεアイソタイプに対して４つのＣＨドメインがある。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、これに続いてその他端に定常ドメイン（ＣＬ）がある。ＶＬは、ＶＨと並んでおり、および、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と並んでいる。ある特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖の可変ドメイン間に界面を形成するものと考えられている。ＶＨおよびＶＬのペアリングは、一緒になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造および特性については、（例として、参照によって本明細書に組み込まれる、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71およびChapter 6）。
いかなる脊椎動物種からのＬ鎖も、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと称される２つの明確に区別されるタイプの１つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμとして指定された重鎖を有する。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能における相対的に小さな差異に基づいたサブクラスにさらに分割され、例として、ヒトは次のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２。
Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、および、ある特定の抗体のそのある特定の抗原に対する特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸の全域にわたって均等には分布していない。その代わりに、Ｖ領域は、各々９〜１２アミノ酸長さの、「超可変領域」と称される、より短い極端な可変性の領域によって分離された、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的に不変のストレッチからなる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲ（βシート構造に接続し、およびいくつかの場合にはその一部を形成する、ループを形成する、３つの超可変領域によって接続された、βシート構造を概して採用する）を含む。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって互いに近接して結びついており、および、他の鎖からの超可変領域とともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（例として、参照によって本明細書に組み込まれるKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照）。定常ドメインは、抗原に抗体を結合させることに直接的には関与しないが、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への抗体の介入などの種々のエフェクター機能を呈する。
本開示に従う使用のための「抗体フラグメント」は、抗体の抗原結合部を含有する。抗体の抗原結合部は、抗原に特異的に結合する能力を保つ抗体の１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体のフラグメントによって行えるということが示されている。用語「抗原結合部」に網羅される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（例として、参照によって本明細書に組み込まれるWard et al., (1989) Nature 341:544-546に記載のとおり）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。
さらにまた、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるものの、組換え方法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖にすることを可能にさせる合成リンカーによって、それらを繋ぎ合わせることができ、そこではＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例として、参照によって本明細書に組み込まれる、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。かかる一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部」という用語に網羅されることも意図される。これらの抗体フラグメントは、当該技術分野の技能を有する者に知られる慣用の技法を使用して得られ、およびフラグメントは、全長の抗体と同じ様式で実用性のためにスクリーニングされる。
いくつかの態様において、抗体フラグメントは、Ｆｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、または単一変化(single-change）Ｆｖフラグメントであり得る。Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドによって結びついた両方のＨ鎖のカルボキシ末端部を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域中の配列により決定され、この領域は、あるタイプの細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
Ｆｖフラグメントは、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。このフラグメントは、強い非共有結合的な会合状態にある、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変領域のダイマーからなる。これらの２つのドメインのフォールディングから、６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖から各々３つのループ）が生まれ、それは抗原結合のためにアミノ酸残基を寄与させ、および抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含む、半分のＦｖ）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性とはいえ抗原を認識して結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」ともまた略される一本鎖Ｆｖは、単一のポリペプチド鎖中に接続されているＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬとのドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む（例として、参照によって本明細書に組み込まれる、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995に記載のとおり）。
抗体は、単離されていてもよい。単離された抗体は、その自然な環境の化合物から、同定されおよび分離され、および／または回収されたものである。その自然な環境の汚染成分は、抗体の診断または治療的な使用に干渉することとなる材料であり、および、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性の溶質を包含し得る。好ましい態様において、抗体は、（１）Lowry法によって決定するものとして抗体の９５重量％を超えるまで、および最も好ましくは９９重量％を超えて、（２）スピニングカップ配列決定機器の使用により少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な度合いまで、あるいは（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して、還元もしくは非還元環境下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質まで、精製されることになる。単離された抗体は、抗体の自然な環境の少なくとも１つの構成要素が存在しなくなることから、組換え細胞内のin situの抗体を包含する。普通は、しかしながら、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されることになる。
いくつかの態様において、本開示の抗体は、モノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体であり、すなわち、集団を含む個別の抗体は、少量存在し得る、考えられる自然発生突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。さらにまた、異なる決定因子（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を包含するポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有利である。
修飾語「モノクローナル」は、いかなるある特定の方法による抗体の産生を要求するものとも解釈されるべきではない。例えば、本発明において有用であるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製されてもよいし、または細菌、真核動物または植物細胞における組換えＤＮＡ方法を使用して作られてもよい（例として、米国特許第4,816,567号を参照）。モノクローナル抗体はまた、例として、参照によって本明細書に組み込まれるClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
本明細書中のモノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分がある特定の種に由来するかまたはある特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖（単数または複数）の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体、ならびにかかる抗体のフラグメントを、それらが所望の生物学的活性を呈するものである限りにおいて、包含する（米国特許第4,816,567号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を参照）。本明細書中の興味の対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類(例として、旧世界猿、類人猿、等々)に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化された」抗体、およびヒト定常領域配列、を包含する。
いくつかの態様において、本開示の抗体は、ポリクローナル抗体である。「ポリクローナル抗体」は、抗原の１つよりも多い免疫原性決定因子と反応する異なる抗体分子の混合物である。ポリクローナル抗体は、哺乳動物の血液、分泌物、または他の液から、または卵子から、単離され得る。ポリクローナル抗体はまた、組み換え型でもあり得る。組換えポリクローナル抗体は、組換え技術の使用により生成されるポリクローナル抗体である。組み換えによって生成されたポリクローナル抗体は、通常、高い濃度の、異なる抗体分子を含有し、その全てまたは大部分（例として、８０％より多くの、８５％より多くの、９０％より多くの、９５％より多くの、９９％より多くの、またはそれ以上）は、１以上のエピトープで構成された抗原に対する所望の結合活性を発揮する。
抗体（例として、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を製造する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ポリクローナル抗体は、動物、好ましくは哺乳動物を、選んだアレルゲンで免疫化し、続いて抗体産生Ｂリンパ球を血液、骨髄、リンパ節、または脾臓から単離することによって、調製され得る。代替的に、抗体産生細胞は、動物から単離され、およびin vitroでそれに対する抗体を生じさせるべきアレルゲンに曝されてもよい。抗体産生細胞は、次いで、任意に骨髄腫などの不死化された細胞株への融合の後に、抗体産生細胞の集団を得るために培養され得る。いくつかの態様において、完全ヒトポリクローナル抗体を生成するために、出発物質として、Ｂリンパ球がアレルギーの患者の組織から単離され得る。完全ヒトポリクローナル抗体を生成するために、出発物質として、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるマウス、ラット、ブタ（イノシシ科動物）、ヒツジ、ウシ材料、または他の動物において、抗体を賛成し得る。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるマウスまたは他の動物（例として、米国特許第5,939,598号に開示のとおり）で、動物は、Ｂリンパ球の抽出またはポリクローナル血清の精製による動物からのポリクローナル抗体の調製の前に、特定の抗体および抗体産生細胞のin vivo生成を刺激するために、免疫化され得る。
モノクローナル抗体は、典型的には、骨髄腫細胞を、所望の抗原で免疫化されたマウス脾臓細胞と融合させることが関与した、細胞培養によって作られる（すなわち、ハイブリドーマ技術）。細胞の混合物は、希釈され、および、クローンが、単一の親細胞からマイクロタイターウェル上で成長させられる。異なるクローンから分泌された抗体は、次いで、それらの抗原に結合する能力について（ＥＬＩＳＡまたは抗原マイクロアレイアッセイなどの試験で）または免疫ドットブロットについて、アッセイされる。最も生産性があり安定なクローンが、次いで将来的な使用のために選択される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒトにおける使用（例として、治療法として）のために、「ヒト化され」ている。非ヒト（例として、齧歯類動物の）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。
さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にまたはドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練させるためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、および典型的には２つの、可変ドメインの実質的に全てのものであって、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、かつ、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のそれらであるものを、含むことになる。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分をもまた含み、それは典型的にはヒト免疫グロブリンのものである。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照。
いくつかの態様において、抗体は、融合タンパク質に、５×１０−８Ｍよりも少ない、および任意に５×１０−８と１×１０−１０との間の、ＫＤで結合し得る。いくつかの態様において、融合タンパク質への抗体の結合は、その生物学的活性を阻害する。いくつかの態様において、融合タンパク質融合タンパク質への抗体の結合は、その生物学的活性を刺激する。
さらに本明細書に提供されるのは、融合タンパク質を使用する方法(例として、治療的な応用における)である。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、医薬組成物中に製剤化される。本明細書に記載の融合タンパク質もしくはそれを含む医薬組成物を使用して疾患または障害を処置する方法もまた提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載の融合タンパク質を使用する方法は、融合タンパク質をＳ１Ｐと接触させることを含む。本明細書に記載の融合タンパク質をＳ１Ｐと接触させることは、融合タンパク質とＳ１Ｐとの間の複合体の形成をもたらす。いくつかの態様において、かかる接触は、細胞内で行われる。
いくつかの態様において、「非スポンジ」融合タンパク質は、低減したスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）のレベルと関連する疾患または障害を処置する方法において使用され、方法は、治療的に有効な量の、「非スポンジＡｐｏＭ」融合タンパク質を、それを必要とする対象へ投与することを含む。かかる融合タンパク質は、Ｓ１Ｐに結合し、およびＳ１Ｐ受容体を活性化させ、下流のシグナリング経路をトリガーする。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐ受容体は、Ｓ１Ｐ１である。融合タンパク質−Ｓ１Ｐ複合体は、他のタイプのＳ１Ｐ受容体、例として、Ｓ１Ｐ２またはＳ１Ｐ３、と比較して、特異的にＳ１Ｐ１受容体を活性化させるということが本明細書において実証されている。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐ受容体（例として、Ｓ１Ｐ１）は、血管のものであり、すなわち、血管中の内皮細胞の表面上で見出される。
「低減したＳ１Ｐのレベルと関連する」疾患または障害とは、疾患または障害を有する対象における、健康な対象と比較した、Ｓ１ＰのまたはＳ１Ｐにトリガーされるシグナリング経路のレベルまたは活性が低減した、正常でない状態を指す。いくつかの態様において、Ｓ１ＰのまたはＳ１Ｐにトリガーされるシグナリング経路のレベルまたは活性は、疾患または障害を有する対象において、健康な対象と比較して、少なくとも２０％低減する。例えば、Ｓ１ＰのまたはＳ１Ｐにトリガーされるシグナリング経路のレベルまたは活性は、疾患または障害を有する対象において、健康な対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低減し得る。いくつかの態様において、Ｓ１ＰのまたはＳ１Ｐにトリガーされるシグナリング経路のレベルまたは活性は、疾患または障害を有する対象において、健康な対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減する。
「非スポンジ」融合タンパク質を、またはかかる本明細書に記載の融合タンパク質を含む組成物を、低減したＳ１Ｐのレベルと関連する疾患または障害を有する対象へ投与することは、例として、Ｓ１Ｐ１などのＳ１Ｐ受容体を活性化させることによって、Ｓ１Ｐシグナリングを増加させた。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐシグナリングは、融合タンパク質の存在下では、融合タンパク質がない場合と比較して、少なくとも２０％増加する。例えば、Ｓ１Ｐシグナリングは、融合タンパク質の存在下では、融合タンパク質がない場合と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上増加し得る。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐシグナリングは、融合タンパク質の存在下では、融合タンパク質がない場合と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上増加する。
いくつかの態様において、低減したＳ１Ｐのレベルと関連する疾患または障害は、限定せずに、以下を包含する：感染症、敗血症、糖尿病、心血管疾患、網膜血管疾患、末梢血管疾患、メタボリックシンドローム、および呼吸器疾患。
いくつかの態様において、低減したＳ１Ｐのレベルと関連する疾患または障害は、限定せずに、以下を包含する：原発性および／または二次性治療抵抗性高血圧、神経性高血圧、妊娠高血圧、糖尿病高血圧、慢性腎臓病の高血圧、心臓のおよび心臓のものでない再灌流傷害、虚血性傷害、脳卒中、肺水腫、心筋梗塞、急性冠症候群、狭心症、アテローム性動脈硬化、および加齢性黄斑変性症。
いくつかの態様において、Ｆｃに融合しているＡｐｏＭの「スポンジバリアント」を含む融合タンパク質は、過剰なスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と関連する疾患または障害を処置する方法において使用され、方法は、治療的に有効な量の、Ｆｃに融合しているＡｐｏＭ「スポンジバリアント」を含む融合タンパク質を、それを必要とする対象へ投与することを含む。かかる融合タンパク質は、増加した親和性でＳ１Ｐと結合し、それによって過剰なＳ１Ｐを封鎖する。「封鎖する」とは、過剰量の遊離Ｓ１Ｐを取り除くことを意味する。
「Ｓ１Ｐの過剰と関連する」疾患または障害とは、疾患または障害を有する対象における、健康な対象と比較した、Ｓ１ＰのまたはＳ１Ｐにトリガーされるシグナリング経路のレベルまたは活性が増加した、正常でない状態を指す。いくつかの態様において、Ｓ１ＰのまたはＳ１Ｐにトリガーされるシグナリング経路のレベルまたは活性は、疾患または障害を有する対象において、健康な対象と比較して、少なくとも２０％増加する。例えば、Ｓ１ＰのまたはＳ１Ｐにトリガーされるシグナリング経路のレベルまたは活性は、疾患または障害を有する対象において、健康な対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上増加し得る。いくつかの態様において、Ｓ１ＰのまたはＳ１Ｐにトリガーされるシグナリング経路のレベルまたは活性は、疾患または障害を有する対象において、健康な対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上増加する。
「スポンジバリアント」融合タンパク質、またはかかる本明細書に記載の融合タンパク質を含む組成物を、過剰なＳ１Ｐと関連する疾患または障害を有する対象へ投与することは、例として、過剰なＳ１Ｐを封鎖することにより、Ｓ１Ｐシグナリングを低減させる。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐシグナリングは、融合タンパク質の存在下では、融合タンパク質がない場合と比較して、少なくとも２０％減少する。例えば、Ｓ１Ｐシグナリングは、融合タンパク質の存在下では、融合タンパク質がない場合と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％減少し得る。いくつかの態様において、Ｓ１Ｐシグナリングは、融合タンパク質の存在下では、融合タンパク質がない場合と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％減少する。
いくつかの態様において、過剰なＳ１Ｐと関連する疾患または障害は、限定せずに、以下を包含する：がん、炎症性疾患、および自己免疫疾患。いくつかの態様において、がんは、転移がんである。いくつかの態様において、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎である。非限定的な例示のがんは、以下を包含する：新生物、悪性腫瘍、転移、またはがん性と見なされるような制御されない細胞成長によって特徴づけられるあらゆる疾患もしくは障害。がんは、原発性または転移がんであり得る。
がんは、成人および小児の急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、虫垂のがん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、胆道がん、骨肉腫、線維性組織球腫、脳がん、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、膠芽腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視床下部神経膠腫、乳房がん、男性乳房がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、起源不明の癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頸部のがん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性および骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸がん、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、
ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃がん、消化管間質腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛細胞性白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部および視経路神経膠腫、眼内黒色腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓がん、腎細胞がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、扁平上皮頸部がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、
骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体がん、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、前立腺がん、直腸がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚がん、小腸がん、扁平上皮癌、扁平上皮頸部がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺がん、甲状腺がん、移行上皮がん、絨毛性腫瘍、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣のがん、外陰部がん、絨毛癌、血液腫瘍、成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、間質性腫瘍および胚細胞腫瘍、またはウィルムス腫瘍、を包含するがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、がんは、肺がん、乳房がん、前立腺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、膵臓がん、脳および中枢神経系のがん、皮膚がん、卵巣がん、白血病、子宮内膜がん、骨、軟骨および軟組織肉腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、腎芽細胞腫、網膜芽細胞腫、または生殖腺胚細胞腫瘍である。
本明細書に使用されるとき、「医薬組成物」は、薬学的に許容し得る担体と組み合わせた本明細書に記載の融合タンパク質の製剤を指す。医薬組成物は、追加の剤（例として、特異的な送達のため、半減期を増加させるため、または他の治療剤）をさらに含むことができる。
本明細書に使用されるとき、用語「薬学的に許容し得る担体」は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤(例として、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸)などの、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルであって、身体のある部位（例として、送達部位）から別の部位（例として、器官、組織または身体の一部分）へと融合タンパク質を運ぶことまたは輸送することに関与するものを意味する。薬学的に許容し得る担体は、製剤の他の成分と適合性があり、および対象の組織に傷害性でない（例として、生理学的に適合性、滅菌されている、生理学的ｐＨ、等々）という意味で「許容し得る」。
薬学的に許容し得る担体をして役立つことができる材料のいくつかの例は、以下を包含する：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどの、セルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤；（８）ココアバターおよび坐剤ロウなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブオイル、コーン油および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物資非含水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボナートおよび／またはポリ無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清構成要素；（２２）エタノールなどのＣ２〜Ｃ１２アルコール；および（２３）医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合性物質。
湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、フレーバー剤、香り付与剤、防腐剤および抗酸化剤もまた、製剤中に存在することができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」などの用語または同様のものは、本明細書において互換的に使用される。
いくつかの態様において、組成物中の本開示の融合タンパク質は、注射により、カテーテルの手段により、坐剤の手段により、または移植の手段により投与され、移植されるものは、多孔質の、無孔の、またはゼラチン状の材料であり、シラスティック膜（sialastic membrane）などの膜、または繊維などを包含する。典型的には、組成物を投与するとき、本開示の融合タンパク質がそれに吸収されないような材料が使用される。
他の態様において、本開示の融合タンパク質は、制御放出系で送達される。１つの態様において、ポンプが使用され得る（例として、Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。別の態様において、高分子材料を使用することができる。（例として、Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984)；Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照。Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105もまた参照。）他の制御放出系は、例えば、Langer、上記を参照、において開示されている。
本開示の融合タンパク質は、治療的に有効な量の結合剤および１以上の薬学的に適合する成分を含む医薬組成物として投与することができる。
いくつかの態様において、医薬組成物は、慣行的な手順に従って、対象への、例として、ヒトへの静脈内または皮下投与に適応した医薬組成物として製剤化されている。典型的には、注射による投与のための組成物は、滅菌された等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、医薬は、可溶化剤および注射の部位の痛みを軽減するためのリグノカインなどの局所麻酔もまた包含することができる。一般的に、成分は、別々にまたは単位投薬形態中で一緒に混合されるかのいずれかで、例えば、活性な剤の量を示したアンプルまたは小袋などの密閉された容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、供給される。医薬が輸液により投与されるべき場合、それは滅菌された医薬グレードの水または生理食塩水を含有する輸液ボトルで分配されることができる。医薬が注射により投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
全身投与のための医薬組成物は、液体、例として、滅菌生理食塩水、乳酸リンゲルもしくはハンクス溶液、であり得る。加えて、医薬組成物は、固体形態とし、および使用直前に再溶解または懸濁化することもできる。凍結乾燥された形態もまた企図される。
医薬組成物は、非経口投与にもまた好適であるリポソームまたは微結晶などの、脂質粒子またはベシクルの内に含有させることもできる。粒子は、組成物がその中に含有されるものである限りにおいて、単層または複層などのあらゆる好適な構造のものであり得る。本開示の融合タンパク質は、融合性脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低いレベル（５〜１０ｍｏｌ％）のカチオン性脂質を含有する「安定化プラスミド−脂質粒子」（ＳＰＬＰ）中に捕捉されることができ、および、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングによって安定化されることができる（Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47）。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート、または「ＤＯＴＡＰ」、などの正に荷電した脂質は、かかる粒子およびベシクルに特に好ましい。かかる脂質粒子の調製は、よく知られている。例として、米国特許第4,880,635号；第4,906,477号；第4,911,928号；第4,917,951号；第4,920,016号；および第4,921,757号を参照。
本開示の医薬組成物は、単位用量として、例えば投与またはパッケージ化され得る。用語「単位用量」は、本開示の医薬組成物への参照において使用されるときには、各々の単位が、要求される希釈剤；すなわち、担体またはビヒクル、と関連して所望の治療効果を生み出すために算出された所定の量の活性材料を含有する、対象への１単位の投薬として好適である物理的に孤立した単位を指す。
いくつかの態様において、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥された形態である本開示の融合タンパク質を含有する容器と、（ｂ）注射のための薬学的に許容し得る希釈剤（例として、滅菌水）を含有する第２の容器と、を含む医薬キットとして提供されることができる。薬学的に許容し得る希釈剤は、凍結乾燥された本開示の融合タンパク質の再構成または希釈のために使用することができる。 任意に、かかる容器（単数または複数）と関連するものは、医薬もしくは生物製品の製作、使用または販売を規制する政府機関によって定められた形式での表示とすることができ、この表示は、ヒトへの投与のための製作、使用または販売の機関による承認を反映する。
別の側面において、上に記載した疾患の処置に有用な材料を含有する製造品が包含される。いくつかの態様において、製造品は、容器およびラベルを含む。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を包含する。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。いくつかの態様において、容器は、本明細書に記載の疾患を処置するのに有効な組成物を保持し、および、滅菌された取出し口を有し得る。例えば、容器は、静注溶液バッグ、または、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る。組成物中の活性な剤は、本開示の融合タンパク質である。いくつかの態様において、容器上のまたは容器に関連付けられるラベルは、選んだ疾患を処置するために化合物が使用されるということを表示する。製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容し得る緩衝剤を含む第２の容器を、さらに含み得る。それは、市販のおよびユーザーの立場から望ましい他の材料をさらに包含してもよく、これは他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用のための指示を伴う添付文書を包含する。
用語「処置」または「処置すること」は、治療的および予防的な処置の両方を指す。対象が、（過剰なＳ１Ｐと関連する疾患としての）がんの処置を必要とする場合には、「状態を処置すること」は、がんと関連する１以上の症状もしくはがんの重症度を良くすること、低減させることまたは解消すること、またはがんのあらゆるさらなる進行を予防することを指す。処置を必要とする対象が、がんを有するリスクがある者である場合には、対象を処置することは、対象のがんを有するリスクを低減させることまたは対象ががんを発症することを予防することを指す。
対象は、ヒト、または脊椎動物、または、齧歯類動物（例として、ラットまたはマウス）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、および霊長類（例として、サル）、を包含するがこれらに限定されない哺乳動物を意味するものとする。本開示の方法は、それを必要とする対象を処置するのに有用である。それを必要とする対象は、Ｓ１Ｐの低減から過剰までと関連する疾患または障害を発症するリスクを有する対象か、またはかかる疾患を有するかもしくは障害がある対象とすることができる。
薬学的に、本開示に従って使用され得る組成物は、対象へ直接的に投与され得るか、または、それを必要とする対象へ治療的に有効な量で投与され得る。用語「治療的に有効な量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な量を指す。例えば、本開示と関連するがん標的リポソームの治療的に有効な量は、疾患または障害の１以上の症状を良くするのに十分なその量であり得る。本明細書に提供される教示と組み合わせて、種々の活性化合物の中から選定し、および効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、副作用の重症度および好ましい投与の方式などの要因を秤にかけることによって、実質的な毒性を引き起こさず、なおかつある特定の対象を処置するのに完全に有効である、有効な予防的または治療的処置レジメンを計画することができる。あらゆる具体的な応用のための有効量は、処置される疾患または状態、対象のサイズに投与される具体的な医薬組成物、または疾患または状態の重症度などの要因に依存して変動する可能性がある。当該技術分野における通常の技能を有する者は、過度の実験を必要とせずに本開示と関連するある特定の治療化合物の有効量を経験的に決定することができる。
送達のための本開示の融合タンパク質の対象用量は、典型的には、投与あたり約０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲にあり、これは、投与が与えられるのが毎日、毎週、または毎月、およびあらゆる他の期間の間であるかに依存する。いくつかの態様において、単回用量が、重大なコンソリデーション（consolidation）または再コンソリデーション期間の間に投与される。これらの目的のための用量は、投与あたり約１０μｇ〜５ｍｇ、および最も典型的には約１００μｇ〜１ｍｇの範囲にあり得、２〜４回の投与は、例えば、数日もしくは数週間空けて、またはそれ以上で、間隔を空けることを伴い得る。しかしながら、いくつかの態様において、これらの目的のための非経口の用量は、上に記載した典型的な用量よりも５〜１０，０００倍高い範囲で使用され得る。
いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、哺乳動物の体重に対して約１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される。他の態様において、本開示の融合タンパク質は、哺乳動物の体重に対して約０．００１ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される。なお他の態様において、本開示の融合タンパク質は、哺乳動物の体重に対して約１０〜１００ｎｇ／ｋｇ、１００〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、または１〜５ｍｇ／ｋｇの間の投薬量で、または、その中のあらゆる個別の投薬量で、投与される。
本開示の製剤は、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性のある担体、および任意に他の治療的な成分を日常的に含有し得る、薬学的に許容し得る溶液で投与される。
治療における使用のためには、有効量の本開示の融合タンパク質は、融合タンパク質を所望の場所へ送達するあらゆる方式、例として、粘膜、注射、全身的、等々によって、対象へ投与することができる。本開示の医薬組成物を投与することは、技術の熟練者に知られているあらゆる手段によって成し遂げ得る。いくつかの態様において、融合タンパク質は、皮下に、皮内に、静脈内に、筋肉内に、関節内に、動脈内に、関節滑液嚢内に、胸骨内に、髄腔内に、病変内に、または頭蓋内に投与される。
経口投与のために、活性化合物（単数または複数）を当該技術分野において周知である薬学的に許容し得る担体と組み合わせることによって、本開示の融合タンパク質を容易に製剤化することができる。かかる担体は、本開示の化合物を、処置される対象による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化することを可能にする。経口使用のための医薬調製物は、固体賦形剤として得ることができ、任意に、もたらされた混合物を粉砕し、および顆粒の混合物を加工することを、所望であれば好適な助剤を加えた後で行うことで、錠剤または糖衣錠のコアが得られる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖などの充填剤であり；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤もまた添加され得る。任意に、経口製剤はまた、生理食塩水または緩衝剤、すなわち、内部酸性条件を中和するためのＥＤＴＡ中において製剤化されてもよく、または何らの担体も伴わずに投与され得る。
上記の構成要素（単数または複数）の経口投薬形態もまた、特定的に企図される。構成要素（単数または複数）は、誘導体の経口送達が効果的であるように、化学修飾され得る。一般的に、企図される化学修飾は、構成要素の分子それ自体への少なくとも１つの部分の付着であり、ここで当該部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸からの血流への取り込みを許すものである。また望ましいのは、構成要素（単数または複数）の全体的な安定性の増加、および体内での循環時間の増加である。かかる部分の例は、以下を包含する：ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリン（Abuchowski and Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189）。使用することができる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−トリオキソラン（tioxocane）である。薬学的な用途に好ましいものは、上記に記したとおり、ポリエチレングリコール部分である。
放出の場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、または回腸）、または大腸であり得る。当業者は、胃で溶解することなく、なお十二指腸または腸内の他の場所で材料を放出する製剤を利用可能としている。好ましくは、放出は、治療剤の保護によるか、または腸内など胃の環境を越えての生物学的に活性な材料の放出によるかのいずれかで、胃の環境の有害な影響を回避することになる。
完全な胃耐性を確保するために、少なくともｐＨ５．０に対して不浸透性のコーティングが好ましい。腸溶性コーティングとして使用される、より一般的な不活性成分の例は、トリメリット酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ ５０、ＨＰＭＣＰ ５５、ポリ酢酸フタル酸ビニル（ＰＶＡＰ）、Eudragit L30D、Aquateric、フタル酸酢酸セルロース（ＣＡＰ）、Eudragit L、Eudragit S、およびShellacである。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用され得る。
コーティングまたはコーティングの混合物もまた、胃に抗して守ることを意図されていないものである錠剤に使用することができる。これは、糖衣、または、錠剤をより飲み込み易くするコーティングを包含することができる。カプセルは、乾燥した治療薬すなわち粉末の送達のための硬い殻（ゼラチンなどの）からなるものであり得；液体形態のためには、軟らかいゼラチンの殻が使用され得る。カシェ剤の殻材料は、厚いデンプンまたは他の可食の紙とすることができた。丸剤、トローチ剤、湿製錠剤または粉薬錠剤のために、湿式塊化技法を使用することができる。
融合タンパク質を、粒子サイズが約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態の微細多粒子として製剤に包含することができる。カプセル投与のための材料の製剤化もまた、粉末、軽く圧縮されたプラグ、または錠剤することさえできたものである。治療薬は、圧縮によって調製することができたものである。
着色料およびフレーバー剤は全て包含され得る。例えば、治療剤が、製剤化され（リポソームまたはミクロスフェア封入によるなど）、および、次いでさらに着色料およびフレーバー剤を含有する冷蔵飲料などの可食製品中に含有され得る。
不活性材料で、治療薬を希釈またはその体積を増加させてもよい。これらの希釈剤は、炭水化物、とりわけ、マンニトール、ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを包含することができる。ある無機塩もまた、充填剤として使用され得、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを包含するいくつかの商業的に入手可能な希釈剤は、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、EmcompressおよびAvicellである。
崩壊剤が、固体投薬形態への治療薬の製剤化に包含され得る。崩壊物として使用される材料は、デンプンに基づく市販の崩壊剤を包含するデンプンを包含するが、これらに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Amberlite、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然海綿およびベントナイトは全て使用され得る。崩壊剤の別の形態は、不溶性のカチオン交換樹脂である。粉末ガムは、崩壊剤として、および結合剤として使用され得、これらは、寒天、カラヤまたはトラガカントなどの粉末ガムを包含することができる。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた、崩壊剤として有用である。
結合剤は、治療剤を互いに結びつけて固い錠剤を形成するために使用され得、および、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンなどの天然産物からの材料を包含する。他は、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を包含する。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は、両方とも、治療薬を顆粒化するためにアルコール溶液中で使用することができる。
抗摩擦剤は、製剤プロセスの間の粘着を防ぐために、治療薬の製剤に包含され得る。滑沢剤は、治療薬と金型壁との間の層として使用され得、およびこれらは以下を包含することができるが、これらに限定されない；そのマグネシウムおよびカルシウム塩を包含するステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油およびロウ。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000および6000、などの可溶性の滑沢剤もまた使用され得る。
製剤化する間に薬物の流動特性を改善し得、および圧縮する間に再配列を補助する、流動促進剤が加えられてもよい。流動促進剤は、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和したアルミノケイ酸を包含し得る。
水性環境中へと治療薬を溶解させることを補助するために、界面活性剤が、湿潤剤として加えられてもよい。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのアニオン性洗剤を包含し得る。カチオン性洗剤が使用されることがあり得、および、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを包含する可能性がある。界面活性剤として製剤に包含される可能性がある潜在的な非イオン性洗剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独か、または異なる比率での混合物として、のいずれかで治療剤の製剤中に存在する可能性がある。
経口的に使用することができる医薬調製物は、ゼラチンから作られた押込み型カプセル、ならびに、ゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作られた軟かい密封されたカプセルを包含する。押込み型カプセルは、活性成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意に安定化剤、との混合状態で含有することができる。軟カプセルにおいては、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に、溶解または懸濁され得る。加えて、安定化剤が加えられてもよい。経口投与のために製剤化されたミクロスフェアもまた、使用され得る。かかるミクロスフェアは、当該技術分野において良く定義されている。経口投与のための全ての製剤は、かかる投与に好適な投薬量でなければならない。
口腔投与のために、組成物は、慣用的な様式で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態を取り得る。
吸入による投与のために、本開示による使用のための化合物は、好適な噴射剤、例として、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用して、加圧されたパックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーを発する形態で、便利に送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器での使用のための、例として、ゼラチンの、カプセルまたはカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースとの粉末混合体を含有して製剤化され得る。
本開示の医薬組成物は、それらを全身に送達することが望ましいときには、注射による、例として、ボーラス注射または連続した輸液による、非経口投与のために製剤化され得る。注射のための製剤は、単位投薬形態で、例としてアンプル中またはマルチドーズ溶液中で加えられた防腐剤とともに、提示され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態を取ることができ、および、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用（formulatory）剤を含有し得る。
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性の形態の活性化合物の水溶液を包含する。加えて、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁液として調製され得る。好適な親油性の溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどを包含する。水性の注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。任意に、懸濁液は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするように化合物の溶解度を増加させる好適な安定化剤もしくは剤をもまた含有し得る。
前に記載された製剤に加えて、融合タンパク質はまた、デポ調製物としても製剤化され得る。かかる長時間作用型製剤は、好適な高分子もしくは疎水性の材料で（例えば、許容し得る油中のエマルションとして）、またはイオン交換樹脂で、あるいは難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として、製剤化され得る。
医薬組成物は、好適な固体またはゲル相の担体または賦形剤をもまた含み得る。かかる担体または賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを包含する。
好適な液体または固体の医薬調製物の形態は、例えば、吸入用の水溶液または生理食塩水である、マイクロカプセル化される、渦巻状である、微細な金粒子上にコーティングされる、リポソームに含有される、噴霧状、エアロゾル、皮膚中への移植のためのペレットである、または、皮膚を引掻く鋭利な物体の上で乾燥させられる。医薬組成物は、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルション、懸濁液、クリーム、点滴剤、または長引く活性化合物の放出がある調製物をもまた含み、その調製においては、賦形剤ならびに崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、滑沢剤、フレーバー、甘味料または可溶化剤などの添加剤および／または助剤が、上に記載したとおり慣行的に使用される。医薬組成物は、様々な薬物送達系における使用に好適である。薬物送達のための方法の簡潔な振り返りのためには、Langer, Science 249:1527-1533, 1990を参照、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示の医薬組成物および任意の他の治療薬は、それ自体で（純物質で）、または薬学的に許容し得る塩の形態で投与され得る。薬剤中で使用されるとき、塩は、薬学的に許容し得るものでなければならないが、薬学的に許容し得るものでない塩も、それらの薬学的に許容し得る塩を調製するのに便利に使用され得る。かかる塩は、以下の酸から調製されたものを包含するが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、かかる塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などの、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製することができる。
好適な緩衝剤は以下を包含する：酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；およびリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）。好適な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）を包含する。
本明細書に開示の技術の態様、利点、特色および使用のいくつかは、下記の例から、より充分に理解される。例は、本開示の利益のいくつかを例示して具体的な態様を記載することを意図するが、本開示の全範囲の実例を示すことを意図してはおらず、したがって、本開示の範囲を限定しない。
例
例１：それぞれ慢性研究および臨床研究のための、マウスおよびヒトＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質の設計および製造。
Ｓ１Ｐに結合するＡｐｏＭは、この脂質メディエーターに対してシャペロンとして働き、および、細胞表面Ｇタンパク質共役受容体を活性化させることで細胞応答を誘導する１。ＡｐｏＭ／Ｓ１Ｐ複合体は、ＡｐｏＭ／Ｓ１Ｐ複合体は、急性および慢性の両方の疾患状態に関与する。例えば、敗血症および敗血症性ショックの間、ＡｐｏＭおよびＳ１Ｐレベルは低減する２。加えて、ＩおよびＩＩ型糖尿病ならびに心血管疾患の間、ＡｐｏＭ／Ｓ１Ｐレベルは低減するかまたはより活性が少ない１、３〜５。よって、治療として、これらの疾患状態の間、ＡｐｏＭ／Ｓ１Ｐレベルを回復させることが望ましい。
マウスのＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ）に融合しているヒトＡｐｏＭの工学的に作り出された融合タンパク質を開発し、および、タンパク質を、組換え系における急速な分泌のために構築した。このタンパク質を、ＡｐｏＭ−Ｆｃと命名した。Ｓ１Ｐに結合しない、ＡｐｏＭの三重変異型もまた、Ｆｃに融合させたことで、ＡｐｏＭ−Ｆｃ−ＴＭと名付けられるバリアント融合タンパク質を形成した。しかしながら、免疫応答を誘導せずに急性および慢性のヒトの疾患のマウスモデルにおける慢性投与を行うのに好適なＡｐｏＭ−Ｆｃ分子を開発するため、マウスのＩｇＧ１Ｆｃに融合しているマウスＡｐｏＭを含有するコンストラクトを本明細書において設計したことで、マウスモデルのための非免疫原性の誘導体を開発した。ヒトＡｐｏＭおよびヒトＩｇＧ１Ｆｃを融合したヒト化ＡｐｏＭ−Ｆｃを含有する別のコンストラクトもまた、ヒト臨床試験における臨床投与のために、本明細書において設計した。
ヒトおよびマウスバージョンの両方の、ＤＮＡコンストラクトの設計および翻訳されたポリペプチドは、下記表１に示されている。手短には、ＩＬ−２シグナルペプチドが、マウスおよびヒトＡｐｏＭ ｃＤＮＡに融合している。融合タンパク質のＣ末端は、次いでマウスおよびヒトＦｃポリペプチドにそれぞれ融合している。いくつかの事例においては、融合における構造的な違いに起因して、および精製を簡単にするために、６つのヒスチジンをマウスのＡｐｏＭ−ｍＦｃ融合のカルボキシ末端に付加させて、ニッケル−ＮＴＡ親和性樹脂を使用した親和性精製での融合タンパク質の精製を許容した。これらのタンパク質は、真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞またはバキュロウイルスでトランスフェクトされたＳｆ９細胞の条件培地中へと効率よく分泌されるように設計されていることで、十分な量の融合タンパク質が精製され得る。
表１：マウスおよびヒトＡｐｏＭ、Ｆｃ（ＩｇＧ１定常領域）およびＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質配列




配列番号５１については、アミノ酸２１〜１９０（太文字）をコードするマウスアポリポタンパク質Ｍ（GenBank：BC021597.1）のオープンリーディングフレームをＰＣＲによって生成し、および、ヒトＩＬ−２シグナルペプチドおよびマウスＩｇＧ１定常領域（カタログ＃ pfusess-mchg1；Invivogen）をコードするｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｍＧ１ベクターのＥｃｏＲＩ（ｇａａｔｔｃ）およびＸｈｏＩ（ｃｔｃｇａｇ）クローニング部位へとクローン化した。スタート（ＡＴＧ）およびストップ（ＴＧＡ）コドンは、斜体文字で表される。
マウスＡｐｏＭ−マウスＩｇＧ１Ｆｃ融合の予測ポリペプチド配列は、配列番号１によって与えられている。ヒトインターロイキン−２のシグナルペプチドは下線を付され、マウスＡｐｏＭアミノ酸２１〜１９０は太字で表され、およびマウスＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ）は斜体文字で表される。
配列番号５２については、アミノ酸２１〜１８８（太文字）をコードするヒトアポリポタンパク質Ｍ（GenBank：BC020683.1）のオープンリーディングフレームをＰＣＲによって生成し、および、ヒトＩＬ−２シグナルペプチドおよびヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター（カタログ＃ pfusess-hchg1；Invivogen）のＸＨＯＩ（ｃｔｃｇａｇ）およびＮＨＥＩクローニング部位へとクローン化した。スタート（ＡＴＧ）およびストップ（ＴＧＡ）コドンは、斜体文字で表される。
ヒトＡｐｏＭ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合の予測ポリペプチド配列は、配列番号２によって与えられている。ヒトインターロイキン−２のシグナルペプチドは下線を付され、ヒトＡｐｏＭアミノ酸２１〜１８８は太字で表され、およびヒトＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ）は斜体文字で表される。
配列番号５３においては、アミノ酸２１〜１８８（太文字）をコードするヒトアポリポタンパク質Ｍ（GenBank：BC020683.1）のオープンリーディングフレームをＰＣＲによって生成し、および、ヒトＩＬ−２シグナルペプチドおよびマウスＩｇＧ１定常領域をコードするｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｍＧ１ベクター（カタログ＃ pfusess-mchg1；Invivogen）のＸＨＯＩ（ｃｔｃｇａｇ）およびＮＨＥＩクローニング部位とクローン化した。突然変異体を、プライマーに基づく部位特異的な突然変異生成によって作り出した。スタート（ＡＴＧ）およびストップ（ＴＧＡ）コドンは、斜体文字で表される。
ヒトＡｐｏＭマウスＩｇＧ１Ｆｃ融合の予測ポリペプチド配列は、配列番号３によって与えられている。ヒトインターロイキン−２のシグナルペプチドは下線を付され、ヒトＡｐｏＭアミノ酸２１〜１８８は太字で表され、およびマウスＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ）は斜体文字で表される。
配列番号６９については、アミノ酸２１〜１９０（配列番号６８において太字にされている）をコードするマウスアポリポタンパク質Ｍ（GenBank：BC021597.1）のオープンリーディングフレームをＰＣＲによって生成し、および、ヒトＩＬ−２シグナルペプチドおよびマウスＩｇＧ１定常領域（カタログ＃ pfusemg1fc1；Invivogen）をコードするｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクターのＮｃｏＩ（ｃｃａｔｇｇ）およびＢｇｌＩＩ（ｃｔｃｇａｇ）クローニング部位へとクローン化した。６つのヒスチジンのタグは、下線を付されている。スタート（ＡＴＧ）およびストップ（ＴＧＡ）コドンは、斜体文字で表される。マウスＡｐｏＭ−マウスＩｇＧ１Ｆｃ−Ｈｉｓ融合のポリペプチド配列は、配列番号６８として示されている。ヒトインターロイキン−２のシグナルペプチド（下線）。マウスＡｐｏＭアミノ酸２１〜１９０（太字）。マウスＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ；斜体文字）。
ｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−Ｈｉｓ（ｐＦＵＳＥ−ｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−Ｈｉｓ）およびヒトＡｐｏＭ−Ｆｃ（ｐＦＵＳＥ−ｈＡｐｏＭ−ｈＦｃ）のためのプラスミドコンストラクトを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションおよびＡｐｏＭ特異的なウェスタンブロット分析によって、タンパク質発現について試験した。タンパク質ｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−ＨｉｓおよびヒトＡｐｏＭ−ｈＦｃを、ＣＨＯ−Ｓ懸濁細胞培養物中で発現させ、およびＣＨＯ−Ｓ培養物上清ＣＨＯ−Ｓ懸濁細胞培養物からミリグラム量で精製した。精製されたｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−ＨｉｓおよびヒトＡｐｏＭ−ｈＦｃタンパク質を、次いで、内皮細胞の経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）分析を使用して機能活性について試験しており、これは、増加するバリア抵抗およびそれによる増強した内皮細胞機能を示すことによって、特異的なＳ１Ｐ受容体活性化を実証する（図４Ａ〜４Ｄ）。
いずれのＳ１Ｐ受容体がＡｐｏＭ−Ｆｃと相互作用するかを決定するために、Ｓ１Ｐ受容体１、２または３をＣＨＯ細胞において発現させた。対照ＣＨＯ細胞、またはＳ１Ｐ受容体を発現しているＣＨＯ細胞を、次いで、ＡｐｏＭ−Ｆｃで刺激し、および、受容体依存性細胞シグナル伝達経路を調査した。図２Ａ〜２Ｃに示されるとおり、ＡｐｏＭ−Ｆｃは、Ｓ１Ｐ受容体−１、−２および−３を活性化させた。しかしながら、それは、Ｓ１Ｐ受容体−１を、他の２つの受容体よりもはるかに効率よく活性化させた。これは、ＡｐｏＭ−Ｆｃを、受容体シグナリングを調査するために、および特定の受容体アゴニストおよびアンタゴニストの発見に、使用することができるということを示す。
例１のための材料および方法
マウスＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｈｉｓの創出
アミノ酸２１〜１９０をコードするマウスアポリポタンパク質Ｍ（GenBank：BC021597.1）のオープンリーディングフレームを、以下のプライマー：フォワード：５’−ｔｔｔｃｃａｔｇｇｔｔａａｔｃａｇｔｇｃｃｃｔｇａｇｃａｃａｇｔｃ−３’； リバース：５’−ｔｔｔｇｇａｔｃｃｃｃａｃｔｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇｇｇｃａ−３’ を使用したＰＣＲによって生成した。
ＮｃｏＩ（ｇｇａｔｃｃ）およびＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）を使用してＰＣＲ産物を消化し、および、ヒトＩＬ−２シグナルペプチドおよびマウスＩｇＧ１定常領域（カタログ＃ pfusemg1fc1；Invivogen）をコードするｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ１−Ｆｃ２ベクターのＮｃｏＩ（ｃｃａｔｇｇ）およびＢｇｌＩＩ（ｃｔｃｇａｇ）クローニング部位へとクローン化したことで、ｐＦＵＳＥ−ｍＡｐｏＭ−ｍＦｃを作り出した。
以下のプライマー：フォワード ５’−ｔｔｔｔｃｔａｇａａｔｇｔａｃａｇｇａｔｇｃａａｃｔｃｃｔｇｔｃ−３’； リバース：５’−ｔｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｔｔｔａｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｇｇａｇａｇ−３’ を使用して、融合オープンリーディングフレームに、６つのヒスチジンのカルボキシ末端タグ（下線）を加えた。ＸｂａＩ（ｔｃｔａｇａ）およびＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）を使用してＰＣＲ産物を消化し、および、ｐｃｄｈ−ｃｍｖ−ｍｃｓ−ｅｆ１−ｐｕｒｏベクターのＸｂａＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位へとクローン化したことで、ｐＣＤＨ−ｍＡｐｏＭ−Ｆｃ−Ｈｉｓを作り出した。
ヒトＡｐｏＭ−ｈＦｃの創出
アミノ酸２１〜１９０（太文字）をコードするヒトアポリポタンパク質Ｍ（GenBank：BC020683.1）のオープンリーディングフレームを、以下のプライマー：フォワード ５’−ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｇｔａｃｃａｇｔｇｃｃｃｔｇａｇｃａｃａｇ−３’；リバース ５’−ｔｔｔｇｃｔａｇｃｃｃａｇｔｔａｔｔｇｇａｃａｇｃｔｃａｃａｇ−３’ を使用したＰＣＲによって生成した。ＸＨＯＩ（ｃｔｃｇａｇ）およびＮＨＥＩ（ｇｃｔａｇｃ）を使用してＰＣＲ産物を消化し、および、ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター（カタログ＃ pfusess-hchg1；Invivogen）のクローニング部位へとクローン化し、および、pFUSEss-CHIg-hG1ベクター（カタログ＃ pfusess-hchg1；Invivogen）のＸＨＯＩ（ｃｔｃｇａｇ）およびＮＨＥＩ（ｇｃｔａｇｃ）クローニング部位へとクローン化したことで、ｐＦＵＳＥ−ｈＡｐｏＭ−ｈＦｃを作り出した。
融合オープンリーディングフレームを、以下のプライマー：フォワード： ５’−ｔｔｔｔｃｔａｇａｔｇｔａｃａｇｇａｔｇｃａａｃｔｃｃｔｇｔｃ−３’；リバース： ５’−ｔｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａｇ−３’ を使用した２周目のＰＣＲに供した。ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩ（ｔｃｔａｇａ）およびＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）を使用して消化し、および、ｐｃｄｈ−ｃｍｖ−ｍｃｓ−ｅｆ１−ｐｕｒｏベクターのＸｂａＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位へとクローン化したことで、ｐＣＤＨ−ｈＡｐｏＭ−ｈＦｃを作り出した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのｍＡｐｏＭ−ｍＦｃの発現
Turbofect（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（３×１００ｍｍプレート）を、プレートあたり５μｇのｐＣＤＨ−ｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−ＨｉｓまたはｐＣＤＨ−ｈＡｐｏＭ−ｈＦｃでトランスフェクトした。２４時間後、細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのランにかけ、および、抗ＡｐｏＭウサギモノクローナル抗体（Abcam; Catalog# ab91656）を使用してウェスタンブロットによってＡｐｏＭ発現について分析した。
ＣＨＯ−Ｓ細胞からのｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−Ｈｉｓの発現および精製
Turbofect（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ＣＨＯ−Ｓ細胞（１００ｍｍプレート）（ThermoFisher）を、５μｇのｐＣＤＨ−ｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−Ｈｉｓでトランスフェクトした。ピューロマイシン（３０ｕｇ／ｍｌ；Thermo Fisher Scientific）を使用して５日間、細胞を選択した。選択した細胞を、FreeStyle CHO Expression Medium（カタログ＃ 12651014；Thermo Fisher Scientific）中の懸濁培養に適応させ、および３×１０６細胞／ｍｌ（５００ｍｌ）の密度まで成長させた。上清を、遠心分離によって清澄化し、およびもたらされた上清を１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ Superflowビーズ（Qiagen）を使用した親和性クロマトグラフィーに供した。タンパク質を溶出させ、濃縮し、およびAmicon Ultra-15 Centrifugal Filtersを使用して生理食塩水中に再懸濁させた。５μｇの精製されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、およびクマシーブルーで染色した。
ＣＨＯ−Ｓ細胞からのｈＡｐｏＭ−ｈＦｃの発現および精製
Turbofect（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ＣＨＯ−Ｓ細胞（１００ｍｍプレート）（ThermoFisher）を、５μｇのｐＣＤＨ−ｈＡｐｏＭ−Ｆｃでトランスフェクトした。ピューロマイシン（３０ｕｇ／ｍｌ；Thermo Fisher Scientific）を使用して５日間、細胞を選択した。選択した細胞を、FreeStyle CHO Expression Medium（カタログ＃ 12651014；Thermo Fisher Scientific）中の懸濁培養に適応させ、および３×１０６細胞／ｍｌ（５００ｍｌ）の密度まで成長させた。上清を、遠心分離によって清澄化し、およびもたらされた上清を１ｍｌのProtein G sepharose（カタログ＃ 101241；ThermoFisher Scientific）を使用した親和性クロマトグラフィーに供した。タンパク質を溶出させ、濃縮し、およびAmicon Ultra-15 Centrifugal Filtersを使用して生理食塩水中に再懸濁させた。８μｇの精製されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、およびクマシーブルーで染色した。
ＴＥＥＲ分析とＥＣＩＳを使用したin vitroでの内皮バリア機能の測定
ＨＵＶＥＣｓを、継代数４代と８代との間で分析した。内皮バリア機能を、内皮細胞インピーダンスシステム（ＥＣＩＳ）機器（Applied BioPhysics）を使用することにより細胞被覆電極の抵抗を測定することによって評価した。ＨＵＶＥＣｓを、ウェルあたり１×１０５細胞の密度で、０．１％フィブロネクチン被覆電極（8W10E プレート）上にプレーティングした。コンフルエントになった細胞を、内皮基礎培地（ＥＢＭ−２；Lonza）中で２〜６時間飢餓状態にし、および、示された濃度でのｍＡｐｏＭ−ｍＦｃ−ＨｉｓまたはｈＡｐｏＭ−ｈＦｃのいずれかで処置した。抵抗をモニターし、および、アッセイの開始時のベースラインに正規化した分数の抵抗値として表現した。アッセイは、トリプリケートにて行った。
例２：転移がんおよび慢性炎症性疾患における過剰なＳ１Ｐシグナリングを阻害するための「スポンジ」Ｓ１Ｐとして設計されるＡｐｏＭ−Ｆｃ融合タンパク質の開発。
Ｓ１Ｐに結合したＡｐｏＭの結晶構造の調査６は、Ｓ１Ｐのリン酸頭基とイオン対をなすアミノ酸残基を含有する強リガンド結合ポケットの存在を提案する（図３）。加えて、複数のＡｐｏＭの残基は、疎水性のスフィンゴシン部分と相互作用するリガンド結合ポケットを形成する。ＡｐｏＭの４つのアミノ酸が、結合ポケットを変化させる潜在力を有するものとして同定された。Ｓ１Ｐの負に荷電したリン酸と相互作用させるために正に荷電しているかまたは水素結合しているアミノ酸を置換することにより、突然変異したＡｐｏＭは野生型ＡｐｏＭ分子よりも強くＳ１Ｐに結合すること、およびそれゆえに、Ｓ１Ｐを結合させてそれを効率よく放さないようになる「Ｓ１Ｐスポンジ」様分子に至ることが予測される（図３）。
ｐＦＵＳＥ−ｈＡｐｏＭ−ｍＩｇＧ１Ｆｃ骨格の部位特異的な突然変異生成を使用して合計７つのアミノ酸置換突然変異体（表４）を調製し、およびもたらされたプラスミドをＣＨＯ細胞へとトランスフェクトさせた。各突然変異体を代表するＡｐｏＭ−Ｆｃタンパク質を精製し、および質量分析によってＳ１Ｐ含有量について評価した、表３（ならびに「材料および方法」セクション）。Ｓ１Ｐ「スポンジ」として名付けられる、かかる分子は、受容体との相互作用と競合することによって、活性化した細胞から放出された遊離Ｓ１Ｐをブロックするものと期待される。それらは、よって、Ｓ１Ｐがより十分でない環境中でＳ１Ｐのアンタゴニストとして作用する。例えば、炎症環境中では、Ｓ１Ｐ受容体を発現する組織細胞においてＳ１Ｐ依存性応答を有するために血管透過性が必要である。
ＡｐｏＭ−Ｆｃスポンジの潜在的な応用は、腫瘍の転移およびリウマチ性関節炎の慢性炎症性疾患の処置におけるものである。両方の状態は、過剰なＳ１Ｐの産生で知られている。
転移がんの処置のためのＡｐｏＭ−Ｆｃスポンジ
腫瘍の成長、拡大および転移は、スフィンゴ脂質を包含する数々の生物活性因子に依存する多変量プロセスである。複数の研究は、腫瘍細胞がＳ１Ｐの量を増加させたということを観察している７。加えて、疾患病理学の過程で、いくつかの腫瘍は成長／生存因子としてＳ１Ｐを使用すること、Ｓ１Ｐ依存性の移動および転移を増加させたこと、およびＳ１Ｐが腫瘍の化学療法抵抗性に寄与するということが、観察されている７。これらの観察を踏まえて、Ｓ１Ｐに結合し、および腫瘍において考えられるＳ１Ｐ依存性シグナリングをブロックする、バイオ医薬品は、Ｓ１Ｐ依存性腫瘍成長、転移および化学療法抵抗性を弱める手段を提供する。Ｂ１６肺転移モデルを使用して、マウスを、候補のＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異「スポンジ」タンパク質で処置し、およびもたらされた腫瘍をサイズおよび数について評価したことで、腫瘍の成長に対するこのアプローチの効果を決定した。後続する研究は、Ｓ１Ｐの除去が腫瘍を他の治療法に対して敏感にするか否かを決定するために、ｃｉｓ−プラチナまたはドキシルビシン（Doxirubicin）などの確立された化学療法剤、または抗−ＰＤ−１もしくは抗−ＰＤ−Ｌ１もしくは抗−ＣＴＬＡ−４抗体などの免疫療法剤、または抗ＶＥＧＦ抗体などの抗血管新生薬と併せたＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異「スポンジ」を使用した相乗効果的アプローチの評価を包含することができる。
リウマチ性関節炎（ＲＡ）などの慢性炎症性疾患の処置のためのＡｐｏＭ−Ｆｃスポンジ
リウマチ性関節炎（ＲＡ）を包含する慢性炎症性疾は、炎症性白血球での関節の滑膜の過剰な浸潤によって特徴づけられる。浸潤の結果として、これらの細胞は、過剰な量のＩｌ−１β，ＴＮＦαおよびＩＬ−６などの炎症性サイトカインを産生する８。過剰なサイトカインシグナリングの１つの帰結は、スフィンゴシンキナーゼの直接の活性化、および炎症した滑膜における結果としてのＳ１Ｐの過剰な産生であり、これは滑液中で検出することができる８。過剰なＳ１Ｐは、浸潤している白血球をさらに活性化し、ならびに滑膜を構成する組織に影響を及ぼす、潜在性を有する。炎症した滑液からのＳ１Ｐを吸収することにおけるＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異「スポンジ」分子の有効性を、混合実験を通して直接的に試験した。液体のＳ１Ｐ濃度およびＡｐｏＭ−Ｆｃは、インキュベーションの前および後に質量分析によって決定することとした。第２のアプローチとして、マウスを、確立されたコラーゲン誘導性関節炎モデルで関節炎状態へと誘導し９、および次いでＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異体「スポンジ」または適当な対照で処置することとした。
本明細書に記載のアプローチと同様に、慢性投与の研究のために、ヒトおよびマウスバージョンでのＡｐｏＭのＳ１Ｐスポンジバリアントを設計し、および製造した。これらは、表２に与えられている。
表２：Ｓ１Ｐスポンジバリアントについての突然変異位置（配列番号３に対して相対的である）
ＡｐｏＭ−ＦＣスポンジ突然変異体のＳ１Ｐ−結合分析
Ｓ１Ｐの結合に対する各突然変異の効果を決定した。ＣＨＯ細胞の個別の培養物を、突然変異クローンについてのプラスミドでトランスフェクトさせ、および組換え細胞を拡張させた。ＡｐｏＭ−ＦＣスポンジ突然変異体を、各細胞株からの上清から精製し（材料および方法を参照）、およびタンパク質をＳ１Ｐと混合し、再精製し、およびＳ１Ｐ含有量を決定するために質量分析法の分析に供した。
結合分析のために、５００μｇの各ＡｐｏＭ−Ｆｃ（スポンジ）突然変異体を精製し、および、メタノール中に再懸濁されたＳ１Ｐ（Avanti Polar Lipids；カタログ番号860492）と１０：１（Ｍ／Ｍ）の比率で混合し、および４℃で２４時間インキュベートした。Superose 6 10/300クロマトグラフィーカラム上でBiorad NGC FPLCを使用して、各タンパク質を再精製することで、遊離Ｓ１Ｐからタンパク質を分離した。２５マイクログラムの各々の精製されたタンパク質を、ＬＣ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によってスフィンゴ脂質含有量について分析した。結果は、表３に示されている。ＷＴ ＡｐｏＭ−Ｆｃと比較すると、クローン４ Ｖ７０Ｑはこれに匹敵するＳ１Ｐ結合を保っていた。
表３：スフィンゴ脂質含有量および種。
表４．「スポンジ」バリアントのアミノ酸配列







* 変異したアミノ酸には下線が付されている；全ての融合タンパク質配列は、Ｎ末端シグナルペプチドを含有する。参照配列として融合タンパク質配列を使用した変異位置は、バリアントの名称の後の括弧内に示されている。
表５．ＡｐｏＭ−Ｆｃスポンジ突然変異体の例示のヌクレオチド配列


ＡｐｏＭ−Ｆｃスポンジ突然変異体を使用したＳ１Ｐ受容体１の活性化
各々の精製されたＡｐｏＭ−Ｆｃスポンジ突然変異体を、Kono et al.（Sphingosine-1-phosphate receptor 1 reporter mice reveal receptor activation sites in vivo. J. Clin. Invest. 2014;124:2076−2086）に記載の最近開発された受容体特異的なin vitroレポーター系を使用して、Ｓ１Ｐ受容体１の活性化について分析した。Ｓ１Ｐ受容体１の活性化は、ＭＥＦ細胞株の核の中のＧＦＰ−ヒストンタンパク質の転写および蓄積に至る。核の緑色蛍光強度の増加は、ＡｐｏＭ−ＦｃなどのＳ１ＰシャペロンによるＳ１Ｐ受容体１活性化の度合いに比例する。もたらされた蛍光強度を、デジタル分光測光法により定量する。この系を使用して、ＡｐｏＭ−Ｆｃ（スポンジ）突然変異体Ｔ６６Ｎ、Ｖ７０Ｑ、およびＭ９４Ｙは、Ｓ１Ｐ１受容体をＷＴ ＡｐｏＭ−Ｆｃよりも効率よく活性化させるということが、観察された（図５）。表１における結果と組み合わせると、これらの結果は、ＡｐｏＭ−ＦＣスポンジ突然変異体Ｔ６６ＮおよびＭ９４Ｙが、モルベースで減少した量のＳ１Ｐを結合させる一方、これらの突然変異体はこのアッセイにおいてＳ１Ｐ受容体１を活性化させるのにより効率的である、ということを提案する。
例２のための材料および方法
ＡｐｏＭ−Ｆｃの部位特異的な突然変異生成
前に構築されたｐＦＵＳＥ−ｈＡｐｏＭ−ｍＩｇＧ１−Ｆｃを、QuikChange IIキット（Agilent）および製造者の指示書を使用した部位特異的な突然変異生成に供した。突然変異生成のために使用したＤＮＡプライマーは、表５に与えられている。
表５：突然変異生成のためのＤＮＡプライマー

突然変異プラスミドを、コンピテントＤＨ５α中へと形質転換させ、およびＬＢアンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）寒天プレート上で選択した。突然変異を確認するために、組換えクローンをＤＮＡ配列分析に供した。
ＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異体を発現するＣＨＯ細胞の製造
各々の確認された突然変異クローンプラスミドを、Midi-prep（Qiagen）によってトランスフェクションのために調製し、およびTurbofect（Thermo Fisher Scientific）を使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の新鮮な培養物上へとトランスフェクトさせた。トランスフェクトされた細胞を、Geneticin（５００ｍｇ／ｍｌ）中で７日間選択し、および拡張させた。
ＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異体の製造および精製
各クローンからの組換えＣＨＯ細胞を、ウシ血清アルブミン（１０μｇ／ｍｌ）を添加したHam’s F12媒体中で２４時間培養した。ＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異体を含有する媒体を、遠心分離（１５，０００ｇ）によって清澄化し、およびもたらされた上清をConcanavalin-A Sepharose Beads（GE Healthcare）とともに終夜インキュベートし、および２０体積のレクチン結合緩衝液（ＬＢＢ；２０ｍＭ Tris、ｐＨ７．５、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ２）で洗浄し、および、２体積の２５０ｍＭ β−メチルマンノシド（Sigma）を添加したＬＢＢで溶出させた。精製されたタンパク質をBradfordアッセイ（Biorad）によって定量した。５００μｇの各ＡｐｏＭ−Ｆｃ（スポンジ）突然変異体を、メタノール中に再懸濁されたＳ１Ｐ（Avanti Polar Lipids；カタログ番号860492）と１０：１ Ｓ１Ｐ／タンパク質（Ｍ／Ｍ）の比率で混合し、および４℃で２４時間インキュベートした。Superose 6 10/300クロマトグラフィーカラム上でBiorad NGC FPLCを使用して、各タンパク質を再精製することで、遊離Ｓ１Ｐからタンパク質を分離した。
ＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異体のＳ１Ｐ含有量
Stony Brook University Lipidomics Core Facilityを使用して、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって、２５μｇの精製されたタンパク質をスフィンゴ脂質含有量および種について分析した（表３）。
Ｓ１Ｐ１レポーター細胞におけるＳ１Ｐ依存性シグナル伝達のin vitro分析
Kono et al.（J. Clin. Invest. 2014;124:2076−2086）は、Ｓ１Ｐ１シグナリングを記録するために、β−アレスチンシグナリングに基づくマウス株（Ｓ１Ｐ１−ＧＦＰシグナリングマウスと称される）を確立した。本質的に、Ｓ１ＰによるＳ１Ｐ１受容体の活性化は、活性化された細胞の核におけるヒストン−ＧＦＰ融合タンパク質の蓄積をもたらす。ＭＥＦ系統を、１０．５日目の胚から確立した。標準的なプロトコルで、胚を解離させ、およびＭＥＦを単離しおよびＳＶ４０ラージＴ抗原で形質転換させた。もたらされた形質転換された細胞を、低い内生ＧＦＰ発現について選択し、および、１０％の活性炭処理済みＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で維持し、これは極めて低い量のＳ１Ｐを含有する。機能的アッセイについては、我々は、脂肪酸不含（ＦＡＦ）アルブミン−Ｓ１Ｐを加えることが、刺激後６時間の早さで現れ２４時間で最大シグナルを伴う核のＧＦＰ蓄積をもたらす、ということを決定した。
細胞を、３８４ウェルプレート中へと播種し、２４時間接着させ、および次いで、ＦＴＹ−Ｐ（Cayman Chemical；402615-91-2）、脂肪酸不含アルブミン（Millipore-Sigma；カタログ番号9048-46-8）中に再懸濁されたＳ１Ｐ（Avanti Polar Lipids；カタログ番号860492）、または５μｇ／ウェルの精製されたスポンジ突然変異体クローン１〜７もしくはＷＴ ＡｐｏＭ−Ｆｃのいずれかを添加した。ＧＦＰ陽性の核を撮像し、およびスポット検出ソフトウェアを使用して×１０でArrayScan VTIによって定量した。データは、トリプリケートのウェルの平均として提示される。
腫瘍転移アッセイ
ＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異体の「スポンジ」体の効能を評価するために、腫瘍転移アッセイを、ＡＴＣＣから取得しマイコプラズマについて試験したＢ１６メラノーマ細胞を使用して行う。５００，０００の細胞が、静脈内に注射されるようにする。腫瘍成長は、２〜３週間、進行することを許容されることとする。マウスは、４ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＭ−Ｆｃ ＷＴまたは突然変異体を、実験の期間の間４日毎に受けることとする。マウスをサクリファイスし、および肺を摘出し、および腫瘍のサイズおよび数を決定することとする。
リウマチ性滑膜関節液アッセイ
ヒトまたはマウスの対照もしくは病理学的に罹患した関節からの滑液を取得し、および、質量分析によるＳ１Ｐ含有量についてアッセイすることとする。ＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異タンパク質（１〜１００μｇ／ｍｌ）を、流体と２〜２４時間混合し、およびＦＰＬＣ上でサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。インキュベーション前の突然変異タンパク質および滑液に曝された後の突然変異タンパク質の両方のＳ１Ｐ含有量を、質量分析によるＳ１Ｐ含有量について測定し、および各突然変異タンパク質の相対的なＳ１Ｐ結合能を決定することとする。候補のＡｐｏＭ−Ｆｃ突然変異体を、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデル２などのリウマチ性関節炎のためのマウスモデルにおける罹患したおよび対照の関節へと１〜５０μｇ／ｍｌで注射し、および処置レジメンの有効性を評価するために組織学的分析を行った。
例３：網膜血管疾患を処置するためのＡｐｏＭ−Ｆｃの開発
正常でない血管の増殖は、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性症（湿潤型）（湿潤ＡＭＤ）を包含する数多くの眼科疾患で起こる。これらの疾患のためのマウスモデルが、開発された１０。このモデルにおいて、網膜血管房形成のインヒビターは、湿潤ＡＭＤの臨床試験において有効であった。図３Ａ〜３Ｃに示されるとおり、ＡｐｏＭ−Ｆｃ処置は、病的な網膜血管房形成を阻害するということが示された。これは、ＡｐｏＭ−Ｆｃが糖尿病性網膜症および湿潤ＡＭＤの処置において有用である可能性があるということを示唆する。
参考文献

本明細書中、例として、背景、概要、詳細な説明、例、および／または参考文献のセクションで言及した全ての刊行物、特許、特許出願、公報、およびデータベースエントリ（例として、配列データベースエントリ）は、各個の刊行物、特許、特許出願、公報、およびデータベースエントリが特定的におよび個別的に参照によって本明細書に組み込まれたものであったかのように、本明細書によってそれらの全体が参照により組み込まれる。対立がある場合には、本明細書中のあらゆる定義を含めて、本願が支配する。
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載の態様の多数の均等物を、認識するか、または、慣行的な実験を使用するだけで確かめることを可能とする。本開示の範囲は、上の記載に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付した請求の範囲に規定されるとおりである。
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、それに反することが示されない限り、または文脈から別様に明白でない限り、１または１よりも多いことを意味し得る。群の２つ以上のメンバーの間に「または」を包含する請求項または説明は、それに反することが示されない限り、または文脈から別様に明白でない限り、群のメンバーの１つ、複数、または全てが存在すれば満たされると見なされる。２つ以上の群のメンバーの間に「または」を包含する群の開示は、グループのちょうど１つのメンバーが存在する態様、グループの１より多いメンバーが存在する態様、およびグループの全てのメンバーが存在する態様を提供する。簡潔化の目的のために、それらの態様は本明細書においては個別的に書き出されてはいないが、これらの態様の各々が本明細書に提供されており、特定的に請求の範囲とされるかもしくは排除されることがあり得る。
本開示は、１以上の限定、要素、節、または説明的な用語が、請求項の１以上から、または１以上の関係する説明の部分から、別の請求項中へと導入された、全てのバリエーション、組合せ、および並び替えを網羅するということが理解されるべきである。例えば、他の１つの請求項に従属する請求項を、同じ基礎とした請求項に従属する他のいずれかの請求項中に見いだされる限定の１以上を包含するように改変することができる。さらにまた、請求項が組成物について謳っている場合、別様に示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当該技術分野における通常の技能を有する者に明白でない限り、本明細書に開示の作製もしくは使用する方法のいずれかによる、または、もしあれば、当該技術分野において知られる方法による、組成物を作製もしくは使用する方法が包含されるということが、理解されるべきである。
要素がリストとして、例として、マーカッシュグループ形式にて提示される場合、要素の全部の考えられるサブグループもまた開示されるということ、および、いずれかの要素または要素のサブグループを群から取り除くことができる、ということが理解されるべきである。用語「含む」はオープンであり、および追加の要素およびステップの包含を許すことを意図しているということにもまた留意すべきである。一般的に、態様、物、または方法が、具体的な要素、特徴、またはステップを含むものとして呼ばれる場合、かかる要素、特徴、またはステップからなるか本質的にそれらからなる態様、物、または方法も、また同様に提供されるということが、理解されなければならない。簡潔化の目的のために、それらの態様は本明細書においては個別的に書き出されてはいないが、これらの態様の各々が本明細書に提供されており、特定的に請求の範囲とされるかもしくは排除されることがあり得る。
範囲が与えられている場合、端点は包含される。さらにまた、別様に示されない限り、または文脈および／または当該技術分野における通常の技能を有する者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現された値は、いくつかの態様において記述された範囲内の、あらゆる特定の値を、文脈が明確に別様に書き記すものでない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までを想定することができるということが、理解されるべきである。簡潔化の目的のために、各範囲中の値は本明細書においては個別的に書き出されてはいないが、これらの態様の各々が本明細書に提供されており、特定的に請求の範囲とされるかもしくは排除されることがあり得る。別様に示されない限り、または文脈および／または当該技術分野における通常の技能を有する者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現された値は、与えられた範囲内のあらゆる部分範囲を想定することができ、ここで部分範囲の端点は、範囲の下限の単位の１０分の１と同じ精度まで表現される、ということもまた理解されるべきである。
ウェブサイトが提供されている場合、ＵＲＬアドレスは、ブラウザ実行可能ではないコード（non-browser-executable codes）として提供され、それぞれのウェブアドレスのピリオド（periods）を括弧で表している。実際のウェブアドレスは、ピリオドを含有しない。
加えて、本開示のいずれかのある特定の態様が、請求項のいずれか１以上から明示的に除外されることがあり得る、ということが理解されるべきである。範囲が与えられている場合、範囲内にあるいずれかの値が、請求項のいずれか１以上から明示的に除外されることがあり得る。本開示の組成物および／または方法の、いずれかの態様、要素、特徴、応用、または側面を、請求項のいずれか１以上から除外することができる。簡潔化の目的のために、１以上の要素、特徴、目的、または側面が除外された全ての態様は、本明細書において明示的に規定されてはいない。

Claims (105)

  1. 免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）に融合しているアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）を含む、融合タンパク質。
  2. ＡｐｏＭに融合しているシグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 免疫グロブリンがＩｇＧである、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. ＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. ＡｐｏＭが、ＦｃのＮ末端で融合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. ＡｐｏＭがヒトＡｐｏＭまたはマウスのＡｐｏＭである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. ＦｃがヒトＦｃまたはマウスのＦｃである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  8. ＡｐｏＭがヒトＡｐｏＭであり、およびＦｃがヒトＦｃである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. ＡｐｏＭがマウスのＡｐｏＭであり、およびＦｃがマウスのＦｃである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  10. Ｆｃが、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  11. Ｆｃが、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  12. Ｆｃが、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質。
  13. ＡｐｏＭが、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. ＡｐｏＭが、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. ＡｐｏＭが、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１３または１４に記載の融合タンパク質。
  16. 配列番号１、配列番号２、または配列番号６８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 配列番号１、配列番号２、または配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
  18. 配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１６または１７に記載の融合タンパク質。
  19. ＡｐｏＭが、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  20. ＡｐｏＭが、配列番号５における位置Ｔ４２に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  21. アミノ酸置換がＴ４２Ｎである、請求項２０に記載の融合タンパク質。
  22. ＡｐｏＭが、配列番号５における位置Ｖ４６に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  23. アミノ酸置換が、以下：Ｖ４６Ｋ、Ｖ４６Ｎ、およびＶ４６Ｑ、からなる群から選択される、請求項２２に記載の融合タンパク質。
  24. ＡｐｏＭが、配列番号５における位置Ｉ６８に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  25. アミノ酸置換が、以下：Ｉ６８ＫおよびＩ６８Ｎからなる群から選択される、請求項２４に記載の融合タンパク質。
  26. ＡｐｏＭが、配列番号５における位置Ｍ７０に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  27. アミノ酸置換がＭ７０Ｙである、請求項２６に記載の融合タンパク質。
  28. ＡｐｏＭが、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  29. ＡｐｏＭが、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  30. ＡｐｏＭが、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  31. 配列番号１〜４のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  32. 融合タンパク質が、配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  33. 融合タンパク質が、配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる、請求項３２に記載の融合タンパク質。
  34. 融合タンパク質が、架橋されている、環化されている、コンジュゲートされている、アシル化されている、カルボキシル化されている、脂質化されている、アセチル化されている、チオグリコール酸アミド化されている、アルキル化されている、メチル化されている、ポリグリシル化されている、グリコシル化されている、ポリシアル化されている、リン酸化されている、アデニリル化されている、ＰＥＧ化されている、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  35. 融合タンパク質が、ポリマーへコンジュゲートされている、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  36. 融合タンパク質が、化学修飾を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  37. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  38. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項３７に記載の核酸を含む、細胞。
  39. 融合タンパク質が発現することを許容する条件下で、請求項３８に記載の細胞を培養媒体中で培養することを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造する方法。
  40. 融合タンパク質が、分泌される、請求項３９に記載の方法。
  41. 培養媒体から融合タンパク質を回収することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 請求項１〜３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
  43. 薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
  44. 請求項１〜３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質に結合する、抗体。
  45. 低減したスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）のレベルと関連する疾患または障害を処置する方法であって、治療的に有効な量の、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）に融合しているアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）を含む融合タンパク質を、それを必要とする対象へ投与することを含む、前記方法。
  46. 融合タンパク質が、ＡｐｏＭに融合しているシグナルペプチドをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  47. ＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. ＡｐｏＭが、ＦｃのＮ末端で融合している、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. ＡｐｏＭがヒトＡｐｏＭまたはマウスのＡｐｏＭである、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. ＦｃがヒトＦｃまたはマウスのＦｃである、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. ＡｐｏＭがヒトＡｐｏＭであり、およびＦｃがヒトＦｃである、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. ＡｐｏＭがマウスのＡｐｏＭであり、およびＦｃがマウスのＦｃである、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. ＡｐｏＭが、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. ＡｐｏＭが、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の方法。
  55. ＡｐｏＭが、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる、請求項５３または５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. Ｆｃが、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. Ｆｃが、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. Ｆｃが、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. 融合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、または配列番号６８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 融合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、または配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 融合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、または配列番号６８で表されるアミノ酸配列からなる、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. 融合タンパク質が、架橋されている、環化されている、コンジュゲートされている、アシル化されている、カルボキシル化されている、脂質化されている、アセチル化されている、チオグリコール酸アミド化されている、アルキル化されている、メチル化されている、ポリグリシル化されている、グリコシル化されている、ポリシアル化されている、リン酸化されている、アデニリル化されている、ＰＥＧ化されている、またはそれらの組み合わせである、請求項４５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 融合タンパク質が、ポリマーへコンジュゲートされている、請求項４５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 融合タンパク質が、化学修飾を含む、請求項４５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 融合タンパク質が、Ｓ１Ｐ受容体を活性化させる、請求項４５〜６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. Ｓ１Ｐ受容体がＳ１Ｐ１である、請求項６５に記載の方法。
  67. Ｓ１Ｐ受容体が、血管のものである、請求項６５または６６に記載の方法。
  68. 疾患または障害が、以下：感染症、敗血症、糖尿病、心血管疾患、網膜血管疾患、末梢血管疾患、メタボリックシンドローム、および呼吸器疾患、からなる群から選択される、請求項４５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 疾患または障害が、以下：原発性および／または二次性治療抵抗性高血圧、神経性高血圧、妊娠高血圧、糖尿病高血圧、慢性腎臓病の高血圧、心臓のもしくは心臓のものでない非心再灌流傷害、虚血性傷害、脳卒中、肺水腫、心筋梗塞、急性冠症候群、狭心症、アテローム性動脈硬化、および加齢性黄斑変性症、からなる群から選択される、請求項４５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  70. 融合タンパク質が、皮下に、皮内に、静脈内に、筋肉内に、関節内に、動脈内に、関節滑液嚢内に、胸骨内に、髄腔内に、病変内に、または頭蓋内に投与される、請求項４５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 過剰なスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と関連する疾患または障害を処置する方法であって、治療的に有効な量の、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域（Ｆｃ）に融合しているアポリポタンパク質Ｍ（ＡｐｏＭ）を含む融合タンパク質を、それを必要とする対象へ投与することを含む方法であり、ここでＡｐｏＭは、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記方法。
  72. 融合タンパク質が、ＡｐｏＭに融合しているシグナルペプチドをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
  73. ＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. ＡｐｏＭが、ＦｃのＮ末端で融合している、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. ＡｐｏＭがヒトＡｐｏＭまたはマウスのＡｐｏＭである、請求項７１〜７４のいずれか一項の融合タンパク質。
  76. ＦｃがヒトＦｃまたはマウスのＦｃである、請求項７１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. ＡｐｏＭがヒトＡｐｏＭであり、およびＦｃがヒトＦｃである、請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. ＡｐｏＭがマウスのＡｐｏＭであり、およびＦｃがマウスのＦｃである、請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  79. Ｆｃが、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. Ｆｃが、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. Ｆｃが、配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる、請求項７９または８０に記載の方法。
  82. ＡｐｏＭが、配列番号５または配列番号６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項７１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. ＡｐｏＭが、配列番号５における位置Ｔ４２に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項７１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. アミノ酸置換がＴ４２Ｎである、請求項８３に記載の方法。
  85. ＡｐｏＭが、配列番号５における位置Ｖ４６に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項７１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. アミノ酸置換が、以下：Ｖ４６Ｋ、Ｖ４６Ｎ、およびＶ４６Ｑ、からなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
  87. ＡｐｏＭが、配列番号５における位置Ｉ６８に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項７１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. アミノ酸置換が、以下：Ｉ６８ＫおよびＩ６８Ｎからなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
  89. ＡｐｏＭが、配列番号５における位置Ｍ７０に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項７１〜８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. アミノ酸置換がＭ７０Ｙである、請求項８９に記載の方法。
  91. ＡｐｏＭが、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む、請求項７１〜９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. ＡｐｏＭが、配列番号９〜２２のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる、請求項９１に記載の方法。
  93. 融合タンパク質が、配列番号１〜４のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、かつ、配列番号５における位置Ｔ４２、Ｖ４６、Ｉ６８、またはＭ７０に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項７１〜９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 融合タンパク質が、配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 融合タンパク質が、配列番号２３〜５０のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる、請求項９４に記載の方法。
  96. 融合タンパク質が、架橋されている、環化されている、コンジュゲートされている、アシル化されている、カルボキシル化されている、脂質化されている、アセチル化されている、チオグリコール酸アミド化されている、アルキル化されている、メチル化されている、ポリグリシル化されている、グリコシル化されている、ポリシアル化されている、リン酸化されている、アデニリル化されている、ＰＥＧ化されている、またはそれらの組み合わせである、請求項７１〜９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 融合タンパク質が、ポリマーへコンジュゲートされている、請求項７１〜９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 融合タンパク質が、化学修飾を含む、請求項７１〜９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 融合タンパク質が、過剰なＳ１Ｐを封鎖する、請求項７１〜９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 疾患または障害が、がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患である、請求項７１〜９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. がんが、転移がんである、請求項１００に記載の方法。
  102. 炎症性疾患が、リウマチ性関節炎である、請求項１００に記載の方法。
  103. 融合タンパク質が、皮下に、皮内に、静脈内に、筋肉内に、関節内に、動脈内に、関節滑液嚢内に、胸骨内に、髄腔内に、病変内に、または頭蓋内に投与される、請求項７１〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 請求項１〜３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と接触させることを含む、方法。
  105. 接触が、細胞内で行われる、請求項１０４に記載の方法。
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