JP2020530264A - 核酸誘導型ヌクレアーゼ - Google Patents
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Abstract
核酸誘導型ヌクレアーゼ、ガイド核酸及びターゲティング可能なヌクレアーゼシステム並びに使用方法が本明細書に開示される。操作された天然に存在しない核酸誘導型ヌクレアーゼ、ガイド核酸及びターゲティング可能なヌクレアーゼシステム並びに使用方法が本明細書に開示される。ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、再帰的な遺伝子編集方法及び追跡可能な遺伝子編集方法を含め、遺伝子標的を編集するために使用され得る。
Description
本開示は、核酸誘導型ヌクレアーゼに関する。
核酸誘導型ヌクレアーゼは、研究及びゲノム編集のための重要なツールとなっている。
これらのツールの適用可能性は、配列の特異性要件、発現又は送達の問題によって制限され得る。
これらのツールの適用可能性は、配列の特異性要件、発現又は送達の問題によって制限され得る。
細胞のゲノム中の標的領域を改変する方法が本明細書に開示され、この方法は、細胞を、（ａ）配列番号７、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、（ｂ）核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸、及び（ｃ）標的領域に対する配列の変化を有する、前記標的領域に相補的な核酸をコードする編集配列と接触させることと、ヌクレアーゼ、ガイド核酸及び編集配列が細胞のゲノムの標的領域にゲノム編集を創出することを可能にすることとを含む。一部の態様では、操作されたガイド核酸及び編集配列は、単一の核酸として提供される。一部の態様では、単一の核酸は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ：ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）部位に変異をさらに含む。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４７又は２０３〜２２２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３３又は１８３〜２０２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３又は２４３〜２６２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２３〜２４２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４２又は２８３〜３０２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２８又は２６３〜２８２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４８又は３２３〜３４２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３０３〜３２２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４４又は７２２〜７４１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３０又は７４２〜７６１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５０又は７６２〜７８１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号７８２〜８０１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む。
核酸誘導型ヌクレアーゼシステムであって、（ａ）配列番号７、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、（ｂ）核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸、及び（ｃ）細胞のゲノム中の標的領域の配列に対する配列の変化を有する編集配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼシステムが本明細書に開示され、このシステムは、ヌクレアーゼ、操作されたガイド核酸及び編集配列によって促進される、細胞のゲノム中の標的領域におけるゲノム編集をもたらす。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４７又は２０３〜２２２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３３又は１８３〜２０２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３又は２４３〜２６２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２３〜２４２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４２又は２８３〜３０２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２８又は２６３〜２８２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４８又は３２３〜３４２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３０３〜３２２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４４又は７２２〜７４１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３０又は７４２〜７６１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５０又は７６２〜７８１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号７８２〜８０１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる。一部の態様では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、編集される細胞のためにコドン最適化される。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む。一部の態様では、操作されたガイド核酸及び編集配列は、単一の核酸として提供される。一部の態様では、単一の核酸は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に変異をさらに含む。
組成物であって、（ａ）配列番号７、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び（ｂ）核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸を含む組成物が本明細書に開示され、操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、異種性の操作されたガイド核酸である。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む。一部の態様では、ヌクレアーゼは、特定の生物体に由来する細胞における使用のためのコドン最適化された核酸配列によってコードされる。一部の態様では、核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化される。一部の態様では、核酸配列は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化される。一部の態様では、核酸配列は、哺乳動物細胞のためにコドン最適化される。一部の態様では、核酸配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化される。一部の態様では、核酸配列は、植物細胞のためにコドン最適化される。
核酸誘導型ヌクレアーゼシステムであって、（ａ）配列番号７、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び（ｂ）核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる異種性の操作されたガイド核酸を含む核酸誘導型ヌクレアーゼシステムが本明細書に開示される。一部の態様では、このターゲティングシステムは、（ｃ）標的領域の配列に対する配列の変化を有する編集配列をさらに含む。一部の態様では、ターゲティングシステムは、ヌクレアーゼ、異種性の操作されたガイド核酸及び編集配列によって促進される標的領域の編集をもたらす。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む。一部の態様では、操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む。一部の態様では、ヌクレアーゼは、特定の生物体に由来する細胞における使用のためのコドン最適化された核酸配列によってコードされる。一部の態様では、核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化される。一部の態様では、核酸配列は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化される。一部の態様では、核酸配列は、哺乳動物細胞のためにコドン最適化される。一部の態様では、核酸配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化される。一部の態様では、核酸配列は、植物細胞のためにコドン最適化される。
参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が具体的に且つ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が具体的に且つ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本特許又は出願ファイルには、カラーで作成した少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面を伴う本特許又は特許出願公開の複写は、要求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供されるであろう。
本開示は、核酸誘導型ヌクレアーゼ及び使用方法を提供する。多くの場合、対象の核酸誘導型ヌクレアーゼは、核酸誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸を含むターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの一部である。対象のターゲティング可能なヌクレアーゼシステムを使用して、多くの場合に標的配列と称される標的ポリヌクレオチド配列を切断、改変及び／又は編集することができる。対象のターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、本明細書に開示される対象の核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質及びガイド核酸をコードする配列を含み得る遺伝子の発現に関与するか又はその活性を方向付ける転写物及び他のエレメントを集合的に指す。
本明細書に記載の方法、システム、ベクター、ポリヌクレオチド及び組成物は、タンパク質などの遺伝子産物の合成の変化又は改変、ポリヌクレオチド切断、ポリヌクレオチド編集、ポリヌクレオチドスプライシング、標的ポリヌクレオチドの輸送、標的ポリヌクレオチドの追跡、標的ポリヌクレオチドの単離、標的ポリヌクレオチドの視覚化などを含む多様な用途において使用され得る。本発明の態様は、例えば、インビトロ、インビボ又はエクスビボで原核細胞、古細菌又は真核細胞において１つ若しくは複数の遺伝子又は１つ若しくは複数の遺伝子産物の発現を変更又は操作するためのゲノム編集における、本明細書に記載される組成物及びシステムの方法及び使用も包含する。
核酸誘導型ヌクレアーゼ
細菌及び古細菌のターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、正確なゲノム編集のための強力なツールとして出現した。しかしながら、天然に存在するヌクレアーゼは、核酸配列及びタンパク質のサイズに起因する発現及び送達の課題を含む一部の制限を有する。ＰＡＭ認識を必要とするターゲティング可能なヌクレアーゼも、遺伝子配列全体でターゲティングできる配列が制限されている。他の課題には、処理能力、標的認識の特異性及び効率並びにヌクレアーゼの酸性度の効率などがあり、これらは、多くの場合、遺伝子編集の効率に影響する。
細菌及び古細菌のターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、正確なゲノム編集のための強力なツールとして出現した。しかしながら、天然に存在するヌクレアーゼは、核酸配列及びタンパク質のサイズに起因する発現及び送達の課題を含む一部の制限を有する。ＰＡＭ認識を必要とするターゲティング可能なヌクレアーゼも、遺伝子配列全体でターゲティングできる配列が制限されている。他の課題には、処理能力、標的認識の特異性及び効率並びにヌクレアーゼの酸性度の効率などがあり、これらは、多くの場合、遺伝子編集の効率に影響する。
天然に存在しないターゲティング可能なヌクレアーゼ及び天然に存在しないターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、これらの課題及び限定の多くに対処することができる。
天然に存在しないターゲティング可能なヌクレアーゼシステムが本明細書に開示される。そのようなターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、上記の課題の１つ又は複数に取り組むために操作され、操作されたヌクレアーゼシステムと称することができる。操作されたヌクレアーゼシステムは、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼなどの操作されたヌクレアーゼ、操作されたガイド核酸、前記ヌクレアーゼをコードする操作されたポリヌクレオチド又は前記ガイド核酸をコードする操作されたポリヌクレオチドなどの１つ又は複数を含み得る。操作されたヌクレアーゼ、操作されたガイド核酸及び操作されたヌクレアーゼ又は操作されたガイド核酸をコードする操作されたポリヌクレオチドは、天然に存在せず、天然に見出されない。これらのエレメントの１つ又は複数を含む操作されたヌクレアーゼシステムは、天然に存在しないことになる。
天然に存在しないヌクレアーゼシステムを得るために行うことができる操作の型の非限定的な例は、以下の通りである。操作は、異種宿主細胞などの宿主細胞における発現を容易にするか又は発現を改善するためのコドン最適化を含み得る。発現又は送達を容易にするために、操作によりヌクレアーゼのサイズ又は分子量を低減することができる。ＰＡＭ特異性を変化させるため又は認識されるＰＡＭの範囲を広げるために、操作によりＰＡＭ選択を変化させることができる。操作により、ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの安定性、処理能力、特異性又は効率を変化させるか、増大させるか又は低減することができる。操作により、タンパク質安定性を変化させるか、増大させるか又は低減することができる。操作により、核酸スキャニングの処理能力を変化させるか、増大させるか又は低減することができる。操作により、標的配列特異性を変化させるか、増大させるか又は低減することができる。操作により、ヌクレアーゼ活性を変化させるか、増大させるか又は低減することができる。操作により、編集効率を変化させるか、増大させるか又は低減することができる。操作により、形質転換効率を変化させるか、増大させるか又は低減することができる。操作により、ヌクレアーゼ又はガイド核酸の発現を変化させるか、増大させるか又は低減することができる。
本明細書に開示されている天然に存在しない核酸配列の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌における発現についてコドン最適化された配列（例えば、配列番号４１〜６０）、酵母などの単細胞真核生物における発現についてコドン最適化された配列（例えば、配列番号１２７〜１４６）、ヒト細胞などの多細胞真核生物における発現についてコドン最適化された配列（例えば、配列番号１４７〜１６６）、本明細書に開示されている任意の配列のクローニング若しくは発現のために使用されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号６１〜８０）、異種プロモータ、若しくは核局在化シグナル、若しくは他の異種エレメントに作動可能に連結した、核酸配列を含むプラスミド（例えば、配列番号２１〜４０）、操作若しくはコドン最適化された核酸配列から生成されるタンパク質（例えば、配列番号１〜２０）又は配列番号８４〜１０７のいずれか１つを含む操作されたガイド核酸が挙げられる。そのような天然に存在しない核酸配列は、合成オリゴヌクレオチド又はｄＮＴＰから増幅させるか、クローニングするか、アセンブルするか、合成するは以下の、生成することにより又は当業者に公知の方法を使用して他の方法で得ることができる。
核酸誘導型ヌクレアーゼが本明細書に開示される。対象のヌクレアーゼは、インビトロで機能するか、又はインビトロ、インビボ若しくはエクスビボでの適用において原核細胞、古細菌又は真核細胞で機能する。適切な核酸誘導型ヌクレアーゼは、チオミクロスピラ（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ）、スクシノビブリオ（Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ）、カンジダタス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アシドモノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、スミセラ（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、シネルギステス（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ（レプトスピラ）、カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンドレリア（Ｋａｎｄｌｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ドレア（Ｄｏｒｅａ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フルクトバチルス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、フィリファクタ（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリア（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スパエロヘータ（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジアリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デスルホナトロヌム（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ヘルココッカス（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトリトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、メタノメチオフィラス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オピトゥトゥス（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、パルディバクター（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、スパエロヘータ（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ツベリバチルス（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ（オレイフィラス）、オムニトロフィカ（Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ）、パルクバクテリア（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）を含むが、これらに限定されない属の生物体に由来するものであり得る。そのような属の生物体の種は、本明細書において他で論じられているものであり得る。適切な核酸誘導型ヌクレアーゼは、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｔｅｓ）及びテネリクテス（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）を含むが、これらに限定されない界内の属又は未分類属の生物体に由来するものであり得る。適切な核酸誘導型ヌクレアーゼは、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ）、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フラボバクテリア（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ガンマプロテオバクテリア（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、イプシロンプロテオバクテリア（Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）及びモリクテス（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）を含むが、これらに限定されない門内の属又は未分類の属の生物体に由来するものであり得る。適切な核酸誘導型ヌクレアーゼは、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、バクテオロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）、ナウティリア（Ｎａｕｔｉｌｉａｌｅｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）及びチオスリックス（Ｔｈｉｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）を含むが、これらに限定されない目内の属又は未分類の属の生物体に由来するものであり得る。適切な核酸誘導型ヌクレアーゼは、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、フラボバクテウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クリオモルファス（Ｃｒｙｏｍｏｏｒｐｈａｃｅａｅ）、ロドビウム（Ｒｈｏｄｏｂｉａｃｅａｅ）、ロドスフィルス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、ナウティリア（Ｎａｕｔｉｌｉａｃｅａｅ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）、ピスキリケッチア（Ｐｉｓｃｉｒｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）及びフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｃｅａｅ）を含むが、これらに限定されない科内の属又は未分類の属の生物体に由来するものであり得る。他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、２０１５年１２月１８日に出願された米国特許出願公開第２０１６０２０８２４３号明細書、２０１３年３月１５日に出願された米国出願公開第２０１４００６８７９７号明細書、２０１３年１０月１５日に出願された米国特許第８６９７３５９号明細書及びゼッツェ（Ｚｅｔｓｃｈｅ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２０１５年１０月２２日、第１６３巻、第３号、ｐ．７５９〜７１に記載され、これらは、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の方法、システム及び組成物における使用に適した一部の核酸誘導型ヌクレアーゼとしては、例えば、これらに限定されないが、チオミクロスピラ属（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）ＸＳ５、ユウバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）、カンジダタス・メタノプラズマ・ターミタム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、カンジダタス・メタノメチロフィルス・アルバス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｌｖｕｓ）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）、フラボバクテリウム・ブランキオフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｓｐ．）、アシドモノコッカス属（Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＣＯＥ１、プレボテラ・ブレビス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｅｖｉｓ）ＡＴＣＣ１９１８８、スミセラ属（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、モレキセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）、シネルギステス・ジョネシイ（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ ｊｏｎｅｓｉｉ）、バクテロイデス口腔分類群（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ）２７４、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、レプトスピラ・イナダイライム血清型株１０（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ ｓｅｒｏｖａｒ Ｌｙｍｅ ｓｔｒ．１０）、アシドモノコッカス属（Ａｃｉｄｏｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）結晶構造（５Ｂ４３）ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）、ニトラティフラクター・サルスガイニス（Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、ニトラティルプター・テルガルカス（Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ）、スタフィロコッカス・アウリクラリス（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ソルデリイ（Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＣ２０１７ １、ブチリビブリオ・プロテオクラスティクス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ブチリビブリオ・プロテオクラスティクス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）Ｂ３１６、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミテラ属（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＭＡ２０２０、カンジダタス・メタノプラズマ・ターミタム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユウバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ）、モレキセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ）、ポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ）、カテニバクテリウム属（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＣＡＧ：２９０、カンドレリア・ビツリナ（Ｋａｎｄｌｅｒｉａ ｖｉｔｕｌｉｎａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）細菌ＫＡ００２７４、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌３−２、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、コプロコッカス・カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）ＧＤ／７、エンテロコッカス・コルムバエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｌｕｍｂａｅ）ＤＳＭ ７３７４、フルクトバチルス属（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＥＦＢ−Ｎ１、ワイセラ・ハロトレランス（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトバチルス・カルバータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・バースモルデンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｍｏｌｄｅｎｓｉｓ）、フィリファクター・アロキス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）ＡＴＣＣ ３５８９６、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ ４９０２５、デスルホビブリオ・イノピナタス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ）、デスルホビブリオ・イノピナタス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ）ＤＳＭ １０７１１、オレイフィラス属（Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．）オレイフィラス属（Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．）ＨＩ０００９、カンジダタス・ケフェルディバクテリア（Ｃａｎｄｉｄｔｕｓ ｋｅｆｅｌｄｉｂａｃｔｅｒｉａ）、パルクバクテリア（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）ＣａｓＹ．４、オムニトロフィカ（Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ）ＷＯＲ ２細菌ＧＷＦ２、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＮＳＰ２．１及びバチルス・サーモアミロボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ）などの生物体に由来するものが挙げられる。
一部の例では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１〜２０のいずれか１つに対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含む。一部の例では、ヌクレアーゼは、配列番号１〜２０のいずれか１つに対して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるか又は１００％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１〜２０のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるアミノ酸同一性を含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１〜８又は１０〜１２のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるアミノ酸同一性を含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１〜８又は１０〜１１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるアミノ酸同一性を含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるアミノ酸同一性を含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号７に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるアミノ酸同一性を含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるアミノ酸同一性を含む。
一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１〜２０のいずれか１つを含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１〜８又は１０〜１２のいずれか１つを含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１〜８又は１０〜１１のいずれか１つを含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２を含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号７を含む。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４を含む。
一部の例では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２又は配列番号１０８〜１１０のいずれか１つに対して最大で１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含む。一部の例では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２又は配列番号１０８〜１１０のいずれか１つに対して最大で５０％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含む。一部の例では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２又は配列番号１０８〜１１０のいずれか１つに対して最大で４５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含む。一部の例では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２又は配列番号１０８〜１１０のいずれか１つに対して最大で４０％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含む。一部の例では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２又は配列番号１０８〜１１０のいずれか１つに対して最大で３５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含む。一部の例では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２又は配列番号１０８〜１１０のいずれか１つに対して最大で３０％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含む。
一部の例では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２１〜４０のいずれか１つに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の例では、ヌクレアーゼは、配列番号２１〜４０のいずれか１つに対して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるか又は１００％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の例では、ヌクレアーゼは、配列番号２１〜４０のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２１〜４０のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２１〜２８又は３０〜３２のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２１〜２８又は３０〜３１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２７に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２４に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。
一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２１〜４０のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２１〜２８又は３０〜３２のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２１〜２８又は３０〜３１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２７の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２４の核酸配列によってコードされる。
一部の例では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、核酸配列上にコードされる。そのような核酸は、所望の宿主細胞での発現のためにコドン最適化することができる。適切な宿主細胞には、非限定的な例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ）及びビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）などの原核細胞並びに出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真核細胞、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）又はタバコ細胞などの植物細胞、昆虫細胞、線虫細胞、両生類細胞、魚類細胞又はヒト細胞を含む哺乳動物細胞が含まれ得る。
核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、グラム陽性細菌、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はグラム陰性細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のためにコドン最適化することができる。一部の例では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４１〜６０、２０３〜２２２、２８３〜３０２又は７２２〜７４１のいずれか１つに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の例では、ヌクレアーゼは、配列番号４１〜６０、２０３〜２２２、２８３〜３０２又は７２２〜７４１のいずれか１つに対して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるか又は１００％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４１〜４８、５０〜５１、５３〜６０、２０３〜２２２、２８３〜３０２又は７２２〜７４１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４１〜４８、５０〜５２、２０３〜２２２、２８３〜３０２又は７２２〜７４１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４１〜４８、５０〜５１、２０３〜２２２、２８３〜３０２又は７２２〜７４１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４２又は２８３〜３０２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４７又は２０３〜２２２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４４又は７２２〜７４１に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。
一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４１〜６０、２０３〜２２２、２８３〜３０２又は７２２〜７４１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４１〜４８、５０〜５２、２０３〜２２２、２８３〜３０２又は７２２〜７４１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４１〜４８、５０〜５１、２０３〜２２２、２８３〜３０２又は７２２〜７４１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４２又は２８３〜３０２の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４７又は２０３〜２２２の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４４又は７２２〜７４１の核酸配列によってコードされる。
核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、酵母の一種、例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現のためにコドン最適化することができる。一部の例では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２７〜１４６、１８３〜２０２、２６３〜２８２又は７４２〜７６１のいずれか１つに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の例では、ヌクレアーゼは、配列番号１２７〜１４６、１８３〜２０２、２６３〜２８２又は７４２〜７６１のいずれか１つに対して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるか又は１００％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の例では、ヌクレアーゼは、配列番号１２７〜１４６、１８３〜２０２、２６３〜２８２又は７４２〜７６１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２７〜１４６、１８３〜２０２、２６３〜２８２又は７４２〜７６１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２７〜１３４、１３６〜１３８、１８３〜２０２、２６３〜２８２又は７４２〜７６１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２７〜１３４、１３６〜１３７、１８３〜２０２、２６３〜２８２又は７４２〜７６１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２８又は２６３〜２８２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３３又は１８３〜２０２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３０又は７４２〜７６１に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。
一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２７〜１４６、１８３〜２０２、２６３〜２８２又は７４２〜７６１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２７〜１３４、１３６〜１３８、１８３〜２０２、２６３〜２８２又は７４２〜７６１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２７〜１３４、１３６〜１３７、１８３〜２０２、２６３〜２８２又は７４２〜７６１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２８又は２６３〜２８２の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３３又は１８３〜２０２の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３０又は７４２〜７６１の核酸配列によってコードされる。
核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化することができる。一部の例では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４７〜１６６、２４３〜２６２、３２３〜３４２又は７６２〜７８１のいずれか１つに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の例では、ヌクレアーゼは、配列番号１４７〜１６６、２４３〜２６２、３２３〜３４２又は７６２〜７８１のいずれか１つに対して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるか又は１００％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４７〜１６６、２４３〜２６２、３２３〜３４２又は７６２〜７８１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４７〜１５４、１５６〜１５８、２４３〜２６２、３２３〜３４２又は７６２〜７８１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４７〜１５４、１５６〜１５７、２４３〜２６２、３２３〜３４２又は７６２〜７８１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４８又は３２３〜３４２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３又は２４３〜２６２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５０又は７６２〜７８１に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。
一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４７〜１６６、２４３〜２６２、３２３〜３４２又は７６２〜７８１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４７〜１５４、１５６〜１５８、２４３〜２６２、３２３〜３４２又は７６２〜７８１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４７〜１５４、１５６〜１５７、２４３〜２６２、３２３〜３４２又は７６２〜７８１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４８又は３２３〜３４２の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３又は２４３〜２６２の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５０又は７６２〜７８１の核酸配列によってコードされる。
核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、植物細胞での発現のためにコドン最適化することができる。一部の例では、本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３４３〜３５９、２２３〜２４２、３０３〜３２２又は７８２〜８０１のいずれか１つに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の例では、ヌクレアーゼは、配列番号３４３〜３５９、２２３〜２４２、３０３〜３２２又は７８２〜８０１のいずれか１つに対して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超えるか又は１００％の配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３４３〜３５９、２２３〜２４２、３０３〜３２２又は７８２〜８０１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３４３〜３４７、３４９〜３５１、２２３〜２４２、３０３〜３２２又は７８２〜８０１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３４３〜３４７、３４９〜３５０、２２３〜２４２、３０３〜３２２又は７８２〜８０１のいずれか１つに対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３０３〜３２２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２３〜２４２に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号７８２〜８０１に対して少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％を超える配列同一性を含む核酸配列によってコードされる。
一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３４３〜３５９、２２３〜２４２、３０３〜３２２又は７８２〜８０１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３４３〜３４７、３４９〜３５１、２２３〜２４２、３０３〜３２２又は７８２〜８０１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３４３〜３４７、３４９〜３５０、２２３〜２４２、３０３〜３２２又は７８２〜８０１のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３０３〜３２２の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２３〜２４２の核酸配列によってコードされる。一部の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号７８２〜８０１の核酸配列によってコードされる。
核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、プロモータに作動可能に連結することができる。そのような核酸配列は、直鎖状又は環状であり得る。核酸配列は、複製起点、選択可能若しくはスクリーニング可能なマーカ、ターミネータ、ガイド核酸などのターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの他の成分又は本明細書に開示される編集若しくは記録カセットなどの追加のエレメントを含む、より大きい直鎖状又は環状の核酸配列に含まれ得る。後により詳細に説明するように、これらのより大きい核酸配列は、組換え発現ベクターであり得る。
ガイド核酸
一般的に、ガイド核酸は、適合する核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成することができ、且つ標的配列とハイブリダイズし、それによりヌクレアーゼを標的配列に導くことができる。ガイド核酸と複合体を形成することができる主題の核酸誘導型ヌクレアーゼは、ガイド核酸に適合する核酸誘導型ヌクレアーゼと称することができる。同様に、核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体形成することができるガイド核酸は、核酸誘導型ヌクレアーゼに適合するガイド核酸と称することができる。
一般的に、ガイド核酸は、適合する核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成することができ、且つ標的配列とハイブリダイズし、それによりヌクレアーゼを標的配列に導くことができる。ガイド核酸と複合体を形成することができる主題の核酸誘導型ヌクレアーゼは、ガイド核酸に適合する核酸誘導型ヌクレアーゼと称することができる。同様に、核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体形成することができるガイド核酸は、核酸誘導型ヌクレアーゼに適合するガイド核酸と称することができる。
ガイド核酸は、ＤＮＡであり得る。ガイド核酸は、ＲＮＡであり得る。ガイド核酸は、ＤＮＡとＲＮＡとの両方を含み得る。ガイド核酸は、改変された又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。ガイド核酸がＲＮＡを含む場合、ＲＮＡガイド核酸は、本明細書に開示されているプラスミド、直鎖状構築物又は編集カセットなどのポリヌクレオチド分子上のＤＮＡ配列によりコードされ得る。
ガイド核酸は、ガイド配列を含み得る。ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列に対して標的配列にハイブリダイズし、複合体を形成した核酸誘導型ヌクレアーゼの標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な相補性を有するポリヌクレオチド配列である。ガイド配列とその対応する標的配列との相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントした場合、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上又はそれを超える。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５ヌクレオチド以上、約１０ヌクレオチド以上、約１１ヌクレオチド以上、約１２ヌクレオチド以上、約１３ヌクレオチド以上、約１４ヌクレオチド以上、約１５ヌクレオチド以上、約１６ヌクレオチド以上、約１７ヌクレオチド以上、約１８ヌクレオチド以上、約１９ヌクレオチド以上、約２０ヌクレオチド以上、約２１ヌクレオチド以上、約２２ヌクレオチド以上、約２３ヌクレオチド以上、約２４ヌクレオチド以上、約２５ヌクレオチド以上、約２６ヌクレオチド以上、約２７ヌクレオチド以上、約２８ヌクレオチド以上、約２９ヌクレオチド以上、約３０ヌクレオチド以上、約３５ヌクレオチド以上、約４０ヌクレオチド以上、約４５ヌクレオチド以上、約５０ヌクレオチド以上、約７５ヌクレオチド以上又はそれを超える長さである。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、約４５ヌクレオチド未満、約４０ヌクレオチド未満、約３５ヌクレオチド未満、約３０ヌクレオチド未満、約２５ヌクレオチド未満、約２０ヌクレオチド未満の長さである。ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長であることが好ましい。ガイド配列は１５〜２０ヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列は、１５ヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列は、１６ヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列は、１７ヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列は、１８ヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列は、１９ヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列は、２０ヌクレオチドの長さであり得る。
ガイド核酸は、足場配列を含み得る。一般に、「足場配列」は、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体の形成を促進するのに十分な配列を有する任意の配列を含み、ここで、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、核酸誘導型ヌクレアーゼ並びに足場配列及びガイド配列を含むガイド核酸を含む。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体の形成を促進するのに十分な足場配列内の配列は、足場配列内の２つの配列領域、例えば二次構造の形成に関与する１つ又は２つの配列領域などの長さに沿ってある程度の相補性を含み得る。一部の場合、１つ又は２つの配列領域は、同じポリヌクレオチド上に含まれるか又はコードされる。一部の場合、１つ又は２つの配列領域は、別々のポリヌクレオチド上に含まれるか又はコードされる。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、１つ又は２つの配列領域のいずれかの中の自己相補性などの二次構造をさらに説明することができる。一部の実施形態では、１つ又は２つの配列領域間の２つのうちの短い方の長さに沿った相補性の程度は、最適にアラインメントした場合、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上又はそれよりも高い。一部の実施形態では、２つの配列領域の少なくとも一方は、約５ヌクレオチド以上、約６ヌクレオチド以上、約７ヌクレオチド以上、約８ヌクレオチド以上、約９ヌクレオチド以上、約１０ヌクレオチド以上、約１１ヌクレオチド以上、約１２ヌクレオチド以上、約１３ヌクレオチド以上、約１４ヌクレオチド以上、約１５ヌクレオチド以上、約１６ヌクレオチド以上、約１７ヌクレオチド以上、約１８ヌクレオチド以上、約１９ヌクレオチド以上、約２０ヌクレオチド以上、約２５ヌクレオチド以上、約３０ヌクレオチド以上、約４０ヌクレオチド以上、約５０ヌクレオチド以上又はそれを超える長さである。
主題のガイド核酸の足場配列は、二次構造を含み得る。二次構造は、シュードノット領域を含み得る。一部の場合、ガイド核酸の核酸誘導型ヌクレアーゼに対する結合カイネティクスは、一部において、足場配列内の二次構造によって決定される。一部の場合、ガイド核酸の核酸誘導型ヌクレアーゼに対する結合カイネティクスは、一部において、足場配列内の核酸配列によって決定される。足場配列内のシュードノット領域の例を図４９Ｃに示す。
足場配列は、ループ配列を含み得る。ループ配列は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。一部の例では、ループ配列は、４ヌクレオチドを含む。一部の例では、ループ配列は、５ヌクレオチドを含む。ループ配列は、別の配列とハイブリダイズしないか、又は足場配列内の別の配列とハイブリダイズしない足場配列の領域であり得る。足場配列内のループ配列の例を図４９Ｃに示す。
足場配列は、配列番号８４〜１０７又は１７２〜１８２のいずれか１つの配列を含み得る。足場配列は、配列番号８４〜１０３のいずれか１つの配列を含み得る。足場配列は、配列番号８４〜９１又は９３〜９５のいずれか１つの配列を含み得る。足場配列は、配列番号８８、９３、９４又は９５のいずれか１つの配列を含み得る。足場配列は、配列番号８８の配列を含み得る。足場配列は、配列番号９３の配列を含み得る。足場配列は、配列番号９４の配列を含み得る。足場配列は、配列番号９５の配列を含み得る。足場配列は、図４９Ａ、４９Ｂ又は４９Ｃに示す配列又はコンセンサス配列を含み得る。
一部の態様では、本開示は、保存された足場配列を含むガイド核酸に結合するヌクレアーゼを提供する。例えば、本開示で使用するための核酸誘導型ヌクレアーゼは、図１３に示すように、保存されたシュードノット領域に結合することができる。具体的には、本開示で使用するための核酸誘導型ヌクレアーゼは、図１３に示すように、保存されたシュードノット領域を含むガイド核酸に結合することができる。本開示における使用のための特定の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−１（配列番号１７２）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のための他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−３（配列番号１７３）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のためのさらに他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−４（配列番号１７４）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のための他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−５（配列番号１７５）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のための他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−６（配列番号１７６）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のためのさらに他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−７（配列番号１７７）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のための他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−８（配列番号１７８）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のための他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−１０（配列番号１７９）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のためのさらに他の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−１１（配列番号１８０）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のための特定の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−１２（配列番号１８１）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。本開示における使用のための特定の核酸誘導型ヌクレアーゼは、足場−２５（配列番号１８２）のシュードノット領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有するシュードノット領域に結合することができる。
本開示における使用のための特定の核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号８４〜１０７又は１７２〜１８２のいずれか１つに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する足場配列に結合することができる。本開示における使用のための特定の核酸誘導型ヌクレアーゼは、図４９Ａ、４９Ｂ又は４９Ｃに示される配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する足場配列に結合することができる。
本開示における使用のための特定の核酸誘導型ヌクレアーゼは、図４９Ａ、４９Ｂ又は４９Ｃに示されるループ配列を有する足場配列に結合することができる。本開示における使用のための特定の核酸誘導型ヌクレアーゼは、ＵＡＵＵ、ＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵのループ配列を有する足場配列に結合することができる。
本開示における使用のための特定の核酸誘導型ヌクレアーゼは、ＴがＵで置換された、配列番号１８１のＲＮＡバージョンを含む足場配列に結合することができる。一部の場合、足場配列は、配列番号１８１のＲＮＡバージョンと比較して少なくとも１つの変異を含む。例えば、足場配列は、足場配列のループ配列中に変更された配列を含み得る。例えば、ループ配列は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵを含み得る。
ガイド核酸は、配列番号８４〜１０７のいずれか１つの配列を含み得る。ガイド核酸は、配列番号８４〜１０３のいずれか１つの配列を含み得る。ガイド核酸は、配列番号８４〜９１又は９３〜９５のいずれか１つの配列を含み得る。ガイド核酸は、配列番号８８、９３、９４又は９５のいずれか１つの配列を含み得る。ガイド核酸は、配列番号８８の配列を含み得る。ガイド核酸は、配列番号９３の配列を含み得る。ガイド核酸は、配列番号９４の配列を含み得る。ガイド核酸は、配列番号９５の配列を含み得る。
本発明の態様では、「ガイド核酸」という用語は、１）標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列、及び２）本明細書に記載の核酸誘導型ヌクレアーゼと相互作用するか又は複合体を形成することができる足場配列を含む１つ又は複数のポリヌクレオチドを指す。ガイド核酸は、１つ又は複数の核酸として提供され得る。特定の実施形態では、ガイド配列及び足場配列は、単一のポリヌクレオチドとして提供される。
ガイド核酸及び核酸誘導型ヌクレアーゼは、この２つのエレメントが、標的配列を切断することができる機能的なターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を形成することができる場合に適合し得る。多くの場合、適合するガイド核酸に対する適合する足場配列は、ネイティブな核酸誘導型ヌクレアーゼ遺伝子座に隣接する配列をスキャンすることによって見出すことができる。換言すると、ネイティブな核酸誘導型ヌクレアーゼは、対応する適合するガイド核酸又は足場配列の近傍にあるゲノム上にコードされ得る。
核酸誘導型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ内因性宿主内に見出されないガイド核酸に適合し得る。そのような直交性のガイド核酸は、経験的試験によって決定することができる。直交性のガイド核酸は、異なる細菌種に由来するものであり得、合成された又は他の方法で操作されて天然に存在しないものであり得る。
共通する核酸誘導型ヌクレアーゼに適合する直交性のガイド核酸は、１つ又は複数の共通する特徴を含み得る。共通する特徴は、シュードノット領域の外側の配列を含み得る。共通する特徴は、シュードノット領域を含み得る。共通する特徴は、一次配列又は二次構造を含み得る。
ガイド核酸は、ガイド配列を、ガイド配列が標的配列と相補的であり、それによりガイド配列と標的配列とのハイブリダイゼーションが可能になるように変化させることにより、所望の標的配列を標的とするように操作することができる。操作されたガイド配列を有するガイド核酸は、操作されたガイド核酸と称することができる。操作されたガイド核酸は、多くの場合、天然に存在せず、天然に見出されない。
対象のヌクレアーゼに適合するガイド核酸又は足場配列は、本明細書に開示されるスクリーニングアッセイを使用して同定又は試験することができる。一般に、ベクターのライブラリは、本明細書に開示されるように生成することができ、前記ベクターは、ＰＡＭ配列に隣接する標的配列を含む。前記ベクターは、選択可能なマーカ又はスクリーニング可能なマーカを含み得る。前記ベクターは、試験されるガイド核酸配列を含み得る。前記ベクターは、試験されるガイド核酸の識別を可能にするバーコード又は他のユニークな識別子を含み得る。前記ガイド核酸は、ベクターの標的配列をターゲティングすることができるターゲティング配列を含み得る。前記ガイド核酸は、足場配列を含み得る。一般に、そのようなベクターのライブラリ内では、足場配列は、異なるベクター間で異なり得るため、単一の実験又は高スループットの方法で多数の異なる足場配列をスクリーニング又は試験できる。一部の場合、足場配列内のステムループ配列は、異なるベクター間で異なり、単一の実験又は高スループットの方法で多数の異なる足場配列をスクリーニング又は試験できる。一部の場合、ベクターライブラリは、標的配列に隣接する様々な異なるＰＡＭ配列を含む。次いで、ベクターライブラリを宿主細胞に導入することができ、前記宿主細胞は、対象のヌクレアーゼを含む。前記対象ヌクレアーゼは、ガイド核酸ベクターと同時に、その前に又はその後に細胞に導入される同じ又は異なるベクターから発現させることができる。他の場合、対象のヌクレアーゼをｍＲＮＡ転写物として細胞に導入することができる。他の場合、対象のヌクレアーゼをタンパク質として細胞に導入することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、各細胞内でガイド核酸が発現されるであろう。発現されたガイド核酸が対象のヌクレアーゼと適合する場合、ガイド核酸は、対象のヌクレアーゼと複合体を形成し、ヌクレアーゼを標的配列にターゲティングし、その後、ヌクレアーゼが標的配列を切断し得る。この切断事象により、宿主細胞は、標的配列を含むベクターを失うか、選択可能なマーカ又はスクリーニング可能なマーカの機能を失うため、宿主細胞は、選択中に死ぬか又はスクリーニング中に失われるであろう。一方、ガイド核酸が対象のヌクレアーゼと適合しない場合、標的配列は、切断されず、従って宿主細胞は、選択可能又はスクリーニング可能なマーカを維持する。インプットベクターを、生存するか、又は選択されたアウトプット宿主細胞からのベクターについて選択若しくはスクリーニングされたものと比較することにより、枯渇したベクターを特定することができる。インプットベクター及びアウトプットベクターのバーコード又はユニークな識別子を配列決定又は分析することにより、枯渇したバーコード又はユニークな識別子を識別でき、これにより枯渇したガイド核酸の識別が可能になるであろう。枯渇したガイド核酸には、対象のヌクレアーゼと適合するものが含まれるであろう。
一部の場合、本明細書に記載のガイド核酸スクリーニング又は試験アッセイを実施する場合、アッセイを使用して、対象のヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を同定又はスクリーニングすることもできる。そのような場合、ベクターライブラリ内のベクターは、ＰＡＭに隣接するバーコード又はユニークな識別子を含み得る。インプットベクターをアウトプットベクターと比較することにより、枯渇したＰＡＭ配列を特定できる。枯渇したＰＡＭ配列には、対象のヌクレアーゼと適合するものが含まれるであろう。一部の場合、本明細書に記載のアッセイを使用することにより、単一の実験若しくはスクリーニング又はハイスループット方式において、対象のヌクレアーゼに適合するガイド核酸及びＰＡＭ配列を特定又は試験することができる。
枯渇は、開始頻度又は参照配列頻度に対する対象配列の減少を指し得る。枯渇は、濃縮の逆であり、従って負の濃縮値として表現することもできる。枯渇は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して計算できる。一部の場合、実験データ内の各配列又は構築物の頻度を計算することにより枯渇スコアを計算し、対象の頻度を対照と比較することができる。ここで、枯渇は、対象の頻度の対照又は基準頻度に対する変化のレベルである。一部の場合、ノイズを減少させるために閾値頻度が使用される。例えば、データが枯渇スコアの計算に使用される前に少なくとも５０カウントのカットオフが存在し得る。平均又は標準偏差は、対照又は基準頻度に対する変化を示さない配列について計算される。この平均及び標準偏差を使用して、有意閾値を推測するために０．０５未満のｐ値を得ることができるｚスコアを導き出すことができる。一部の場合、枯渇スコアの過大評価の可能性を修正するためにカットオフが使用され、その閾値を超える枯渇スコアは、枯渇したと見なされる。一部の場合、閾値は、ｌｏｇ２−１、ｌｏｇ２−２、ｌｏｇ２−３、ｌｏｇ２−４又はｌｏｇ２−５であり得る。
一部の例では、以下の式を使用して、枯渇スコアをｌｏｇ２枯渇スコアとして計算できる：Ｗ＝ｌｏｇ２（Ｆｘ，ｆ／Ｆｘ，ｉ）（式中、Ｆｘ，ｆは、最終時点におけるカセットＸの頻度であり、Ｆｘ，ｉは、カセットＸの最初の頻度であり、Ｗは、各バリアントの絶対的な適応度である）。頻度は、各バリアントについての読み取りカウントを、フィルタリングで失われたものを含めた総実験カウントで割ることによって決定した。複数の複製のカウント加重平均を使用して、以下のように各変異の平均適応度スコアを推測できる：Ｗａｖｇ＝（ΣＮ ｉ＝１ｃｏｕｎｔｓｉ＊Ｗｉ）／（ΣＮ ｉ＝１ｃｏｕｎｔｓｉ）。計算されたスコアは、計算値が負の場合、枯渇スコアと呼ばれることがあり、計算値が正の場合、濃縮スコアと呼ばれることがある。
ターゲティング可能なヌクレアーゼシステム
ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムが本明細書に開示される。ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、核酸誘導型ヌクレアーゼ又は核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、ガイド核酸又はガイド核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。
ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムが本明細書に開示される。ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、核酸誘導型ヌクレアーゼ又は核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、ガイド核酸又はガイド核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。
一般に、本明細書に開示されるターゲティング可能なヌクレアーゼシステムは、標的配列の部位でのターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられ、ここで、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、核酸誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸を含む。
ガイド核酸及び核酸誘導型ヌクレアーゼは、ガイド核酸のガイド配列によって決定されるように、標的ポリヌクレオチド内の標的配列に結合することができるターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を共に形成する。
一般に、二本鎖切断を生成するには、ほとんどの場合、ターゲティング可能な核酸ヌクレアーゼ複合体がガイド核酸によって決定される標的配列に結合し、ヌクレアーゼは、標的配列に隣接するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識しなければならない。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１〜２０のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１〜８又は１０〜１２のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１〜８又は１０〜１１のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。これらの場合のいずれにおいても、ガイド核酸は、核酸誘導型ヌクレアーゼと適合する足場配列を含み得る。これらの場合のいずれにおいても、足場配列は、天然の足場配列又は異種足場配列であり得る。これらの場合のいずれにおいても、ガイド核酸は、ガイド配列をさらに含み得る。ガイド配列は、任意の所望の標的配列をターゲティングするように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列と相補的であるように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように操作することができる。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１〜２０のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８４〜１０７のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１〜２０のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１〜８又は１０〜１２のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８４〜９５のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１〜８又は１０〜１２のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１〜８又は１０〜１１のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８４〜９１又は９３〜９５のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号１〜８又は１０〜１１のいずれか１つの核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。これらの場合のいずれにおいても、ガイド核酸は、ガイド配列をさらに含み得る。ガイド配列は、任意の所望の標的配列をターゲティングするように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列と相補的であるように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように操作することができる。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８４〜１０７又は１７２〜１８２のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８８、９３、９４又は９５のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８８を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号９３を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号９４を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号９５を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７２を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７３を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７４を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７５を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７６を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７７を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７８を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７９を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１８０を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１８１を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号２の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１８２を含む適合するガイド核酸を含み得る。これらの場合のいずれにおいても、ガイド核酸は、ガイド配列をさらに含み得る。ガイド配列は、任意の所望の標的配列をターゲティングするように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列と相補的であるように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように操作することができる。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８４〜１０７又は１７２〜１８２のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８８、９３、９４又は９５のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８８を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号９３を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号９４を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号９５を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７２を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７３を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７４を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７５を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７６を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７７を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７８を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７９を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１８０を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１８１を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号７の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１８２を含む適合するガイド核酸を含み得る。これらの場合のいずれにおいても、ガイド核酸は、ガイド配列をさらに含み得る。ガイド配列は、任意の所望の標的配列をターゲティングするように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列と相補的であるように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように操作することができる。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８４〜１０７又は１７２〜１８２のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８８、９３、９４又は９５のいずれか１つを含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号８８を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号９３を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号９４を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号９５を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７２を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７３を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７４を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７５を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７６を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７７を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７８を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１７９を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１８０を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１８１を含む適合するガイド核酸を含み得る。ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、配列番号４の核酸誘導型ヌクレアーゼ及び配列番号１８２を含む適合するガイド核酸を含み得る。これらの場合のいずれにおいても、ガイド核酸は、ガイド配列をさらに含み得る。ガイド配列は、任意の所望の標的配列をターゲティングするように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列と相補的であるように操作することができる。ガイド配列は、任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように操作することができる。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、対象のターゲティング可能なヌクレアーゼ及びガイド核酸を含み得る。一部の場合、対象核酸との適合性に基づいてガイド核酸が選択される。適合するガイド核酸を決定及び選択する方法は、本明細書に開示されており、他の箇所でより詳細に説明されている。一部の場合、ガイド核酸は、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体に付与される切断効率に基づいて選択される。切断効率は、標的核酸を切断する頻度であり得る。一部の場合、ガイド核酸は、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体に付与されるターゲティング効率に基づいて選択される。標的効率は、目的の標的核酸をターゲティングする頻度であり得る。一部の場合、ガイド核酸は、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体に付与される切断特異性に基づいて選択される。切断特異性は、意図しない標的配列の切断と比較した、意図した標的配列の切断の頻度であり得る。一部の場合、ガイド核酸は、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体に付与されるターゲティング特異性に基づいて選択される。ターゲティング特異性は、意図しない標的配列のターゲティングと比較した、意図した標的配列のターゲティングの頻度であり得る。
切断特異性、切断効率、ターゲティング特異性又はターゲティング効率などの特性は、ガイド核酸の特性に基づいて決定できる。例えば、足場配列、シュードノット領域又はループ配列は、それぞれ又は組み合わせて対象のヌクレアーゼ複合体のターゲティング又は切断特性に影響し得る。一部の例では、ヌクレアーゼと相互作用する足場配列の部分は、複合体の切断又はターゲティングの特異性若しくは効率に影響する。一部の場合、ガイド核酸のガイド配列（ターゲティング配列と称されることもある）は、複合体の切断又はターゲティングの特異性若しくは効率に影響する。一部の例では、標的配列の選択は、複合体の切断又はターゲティングの特異性若しくは効率に影響する。例えば、ガイド配列と標的配列との間のミスマッチは、複合体の切断又はターゲティングの特異性若しくは効率に影響し得る。一部の場合、ＰＡＭに対するミスマッチの位置は、複合体の切断又はターゲティングの特異性若しくは効率に影響し得る。一部の場合、互いに対するミスマッチの数又はミスマッチの間隔は、複合体の切断又はターゲティングの特異性若しくは効率に影響し得る。これらの場合のいずれにおいても、列挙されたパラメータは、対象のターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体のターゲティング特異性、ターゲティング効率、切断特異性又は切断効率を増加又は減少させることができる。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体の標的配列は、原核細胞又は真核細胞に対して又はインビトロで内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的配列は、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）をコードする配列であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、標的配列は、ＰＡＭ、すなわちターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体によって認識される短い配列に関連付けられるべきであると考えられている。ＰＡＭの正確な配列及び長さの要件は、使用する核酸誘導型ヌクレアーゼによって異なるが、ＰＡＭは、典型的には標的配列に隣接する２〜５塩基対の配列である。ＰＡＭ配列の例は、以下の実施例セクションに与えられており、当業者は、所与の核酸誘導型ヌクレアーゼでの使用のためのさらなるＰＡＭ配列を同定することができるであろう。さらに、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ：ＰＡＭ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）ドメインの操作により、ＰＡＭ特異性のプログラミングが可能になり、標的部位認識の忠実度が向上し、核酸誘導型ヌクレアーゼゲノム編集プラットフォームの汎用性が向上し得る。核酸誘導型ヌクレアーゼは、例えば、クラインスタイバーＢ Ｐ（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ Ｂ Ｐ）ら著、「ＰＡＭ特異性が変更された、操作されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１５年７月２３日、第５２３巻（７５６１号）、ｐ．４８１〜５、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４５９２に記載されているように、ＰＡＭ特異性を変更するように操作され得る。
ＰＡＭ部位は、標的配列の近傍にあるヌクレオチド配列である。ほとんどの場合、核酸誘導型ヌクレアーゼは、適切なＰＡＭが存在する場合にのみ標的配列を切断できる。ＰＡＭは、核酸誘導型ヌクレアーゼ特異的であり、２つの異なる核酸誘導型ヌクレアーゼ間で異なり得る。ＰＡＭは、標的配列の５’又は３’であり得る。ＰＡＭは、標的配列の上流又は下流にあり得る。ＰＡＭは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド又はそれを超える長さであり得る。多くの場合、ＰＡＭは、２〜６ヌクレオチドの長さである。
対象のヌクレアーゼ又はターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体と適合するＰＡＭ部位は、本明細書に開示される方法を使用して同定することができる。一般に、ベクターのライブラリは、本明細書に開示されるように生成することができ、前記ベクターは、ＰＡＭ配列に隣接する標的配列を含む。そのようなベクターのライブラリ内では、ＰＡＭ配列は、異なるベクター間で異なり得るため、単一の実験又は高スループットの方法で多数の異なるＰＡＭ配列をスクリーニング又は試験できる。前記ベクターは、試験されるＰＡＭの識別を可能にするバーコード又は他のユニークな識別子を含み得る。前記ベクターは、選択可能なマーカ又はスクリーニング可能なマーカを含み得る。前記ベクターは、ガイド核酸配列を含み得る。前記ガイド核酸は、ベクターの標的配列をターゲティングすることができるターゲティング配列を含み得る。前記ガイド核酸は、足場配列を含み得る。一部の場合、ベクターライブラリは、様々な異なるガイド核酸配列又は足場配列を含む。次いで、ベクターライブラリを宿主細胞に導入することができ、前記宿主細胞は、対象のヌクレアーゼを含む。前記対象ヌクレアーゼは、ガイド核酸ベクターと同時に、その前に又はその後に細胞に導入される同じ又は異なるベクターから発現させることができる。他の場合、対象のヌクレアーゼをｍＲＮＡ転写物として細胞に導入することができる。他の場合、対象のヌクレアーゼをタンパク質として細胞に導入することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、各細胞内でガイド核酸が発現され、対象のヌクレアーゼと複合体を形成するであろう。次いで、ガイド核酸は、ヌクレアーゼを標的配列にターゲティングすることができる。一部の場合、標的配列に隣接するＰＡＭが対象のヌクレアーゼと適合する場合、対象のヌクレアーゼは、標的配列を切断できる。この切断事象により、宿主細胞は、標的配列を含むベクターを失うか、選択可能なマーカ又はスクリーニング可能なマーカの機能を失うため、宿主細胞は、選択中に死ぬか又はスクリーニング中に失われるであろう。一方、ＰＡＭが対象のヌクレアーゼと適合しない場合、標的配列は、切断されず、従って、宿主細胞は、選択可能又はスクリーニング可能なマーカを維持する。インプットベクターを、生存するか、又は選択されたアウトプット宿主細胞からのベクターについて選択若しくはスクリーニングされたものと比較することにより、枯渇したベクターを特定することができる。インプットベクター及びアウトプットベクターのバーコード又はユニークな識別子を配列決定又は分析することにより、枯渇したバーコード又はユニークな識別子を識別でき、これにより枯渇したＰＡＭ配列の識別が可能になるであろう。枯渇したＰＡＭ配列には、対象のヌクレアーゼと適合するものが含まれるであろう。
一部の場合、本明細書に記載のＰＡＭスクリーニング又は試験アッセイを実施する場合、アッセイを使用して、対象のヌクレアーゼと適合するガイド核酸配列を同定又はスクリーニングすることもできる。そのような場合、ベクターライブラリ内のベクターは、ガイド核酸に隣接するバーコード又はユニークな識別子を含み得る。インプットベクターをアウトプットベクターと比較することにより、枯渇したガイド核酸配列を特定できる。枯渇したガイド核酸配列には、対象のヌクレアーゼと適合するものが含まれるであろう。一部の場合、本明細書に記載のアッセイを使用することにより、単一の実験若しくはスクリーニング又はハイスループット方式において、対象のヌクレアーゼに適合するガイド核酸及びＰＡＭ配列を特定又は試験することができる。前述の枯渇の計算及び評価の方法は、これらの場合の枯渇の計算及び評価にも適用できる。
一部の例では、ＰＡＭは、別々のオリゴヌクレオチド上に提供され得る。そのような場合、オリゴヌクレオチド上にＰＡＭを提供することにより、標的配列と同じポリヌクレオチド上に隣接するＰＡＭが存在しないために切断できない標的配列の切断が可能になる。
ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの成分をコードするポリヌクレオチド配列は、１つ又は複数のベクターを含み得る。一般に、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖の核酸分子；１つ又は複数の遊離末端を含むか又は遊離末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその両方を含む核酸分子；及び当技術分野で公知の他の種類のポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などによって追加のＤＮＡセグメントを挿入できる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルス由来のＤＮＡ又はＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠陥アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター内に存在するウイルスベクターである。ウイルスベクターには、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含まれる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技術で有用な一般的な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。ベクターのさらなる議論が本明細書で提供される。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含み得、これは、組換え発現ベクターが１つ又は複数の調節エレメントを含むことを意味し、これは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得、発現される核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクター内において、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で調節エレメントに連結されている（例えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいて又はベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞において）ことを意味することが意図される。組換え及びクローニングの方法については、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６ Ａ１号明細書として公開された米国特許出願公開第１０／８１５，７３０号明細書で言及され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、調節エレメントは、ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの１つ又は複数の成分の発現を駆動するように、ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの１つ又は複数のエレメントに作動可能に連結される。
一部の実施形態では、ベクターは、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞又は真核細胞などの特定の細胞での発現のためにコドン最適化することができる。真核細胞は、酵母、真菌、藻類、植物、動物又はヒト細胞であり得る。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又は非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物などの特定の生物体のもの又はそれに由来するものであり得る。
一般に、コドン最適化は、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ又は複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、５０以上又はそれを超えるコドン）を、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置換することにより、目的の宿主細胞での発現を強化するために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の、特定のコドンに対する特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物体間のコドン使用の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率相関し、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般的にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。従って、コドン最適化に基づいて、所与の生物体での最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を仕立てることができる。コドン使用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／にある「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」（２００２年７月９日訪問）で容易に入手でき、これらの表は、多くの方法で適応させることができる。ナカムラ，Ｙ．（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．）ら著、「国際ＤＮＡ配列データベースから集計されたコドン使用：２０００年の状態」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．）、第２８巻、ｐ．２９２（２０００年）を参照されたい。ジーン・フォージ（Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ）（アプタジェン（Ａｐｔａｇｅｎ）、ペンシルベニア州ヤコブス（Ｊａｃｏｂｕｓ））など、特定の宿主細胞での発現のために特定の配列をコドン最適化するコンピュータアルゴリズムも利用可能である。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする配列中の１つ又は複数のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０若しくはそれを超えるか又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
一部の実施形態では、ベクターは、１つ又は複数の核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、例えば約１つ又は複数、約２つ以上、約３つ以上、約４つ以上、約５つ以上、約６つ以上、約７つ以上、約８つ以上、約９つ以上、約１０以上又はそれを超えるＮＬＳを含む核酸誘導型ヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、アミノ末端又はその近傍に約１つ又は複数、約２つ以上、約３つ以上、約４つ以上、約５つ以上、約６つ以上、約７つ以上、約８つ以上、約９つ以上、約１０以上又はそれを超えるＮＬＳを含み、カルボキシ末端又はその近傍に約１つ又は複数、約２つ以上、約３つ以上、約４つ以上、約５つ以上、約６つ以上、約７つ以上、約８つ以上、約９つ以上、約１０以上若しくはそれを超えるＮＬＳ又はこれらの組合せを含む（例えば、アミノ末端に１つ又は複数のＮＬＳ及びカルボキシ末端に１つ又は複数のＮＬＳ）。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれを他のＮＬＳとは独立して選択することができ、従って単一のＮＬＳが２つ以上のコピー内に存在し得、且つ／又は１つ若しくは複数のコピー内に存在する１つ若しくは複数の他のＮＬＳとの組合せで存在し得る。本発明の好ましい実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、最大で６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近傍のアミノ酸が、Ｎ又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又はそれを超えるアミノ酸の範囲内であれば、Ｎ又はＣ末端に近いと見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１１）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ−抗原のＮＬＳに由来するＮＬＳ配列；ヌクレオプラスミン（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１１２）を有するヌクレオプラスミンバイパータイトＮＬＳ）由来のＮＬＳに由来するＮＬＳ配列；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１１３）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１１４）を有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳに由来するＮＬＳ配列；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１１５）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳに由来するＮＬＳ配列；インポーチン−アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１ １１６）に由来するＮＬＳ配列；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１１７）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１１８）に由来するＮＬＳ配列；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１１９）に由来するＮＬＳ配列；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１２０）に由来するＮＬＳ配列；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１２１）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１２２）に由来するＮＬＳ配列；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１２３）に由来するＮＬＳ配列；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１２４）に由来するＮＬＳ配列；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１２５）に由来するＮＬＳ配列；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１２６）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。
一般に、１つ又は複数のＮＬＳは、真核細胞の核内への核酸誘導型ヌクレアーゼの検出可能な量での蓄積を駆動するのに十分な強度のものである。一般に、核局在化活性の強度は、ＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ又はこれらの因子の組合せから引き出すことができる。核内への蓄積の検出は、任意の適切な技法によって実施することができる。例えば、検出可能なマーカを核酸誘導型ヌクレアーゼと融合させることができ、従って例えば核の場所を検出するための手段（例えば、ＤＡＰＩなどの核に特異的な染色）と組み合わせて、細胞内の場所を可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその内容物を、免疫組織化学、ウエスタンブロット又は酵素活性アッセイなど、タンパク質を検出するための任意の適切なプロセスによって分析することができる。核内の蓄積は、例えば、核酸誘導型ヌクレアーゼ複合体の形成の影響についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡ切断若しくは変異についてのアッセイ又はターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体の形成及び／若しくは核酸誘導型ヌクレアーゼ活性による影響を受ける遺伝子発現活性の変化についてのアッセイ）により、核酸誘導型ヌクレアーゼ若しくはターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体に曝露していないか、又は１つ若しくは複数のＮＬＳを欠く核酸誘導型ヌクレアーゼに曝露した対照と比較して間接的に決定することもできる。
核酸誘導型ヌクレアーゼ及び１つ又は複数のガイド核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡとして送達できる。核酸誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸の両方のＲＮＡ（未改変又は塩基若しくは骨格改変を含む）分子としての送達を使用して、核酸誘導型ヌクレアーゼが細胞内に残留する時間を短縮することができる。これにより、標的細胞におけるオフターゲット切断活性のレベルが低下し得る。ｍＲＮＡとしての核酸誘導型ヌクレアーゼの送達は、タンパク質に翻訳されるのに時間がかかるため、核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質との相互作用に利用できるガイド核酸のレベルを最大化するために、核酸誘導型ヌクレアーゼｍＲＮＡの送達の数時間後にガイド核酸を送達することが有利である可能性がある。他の場合、核酸誘導型ヌクレアーゼｍＲＮＡ及びガイド核酸は、同時に送達される。他の例では、ガイド核酸は、核酸誘導型ヌクレアーゼｍＲＮＡの０．５、１、２、３、４時間後又はそれより後に連続的に送達される。
ガイド核酸の量が制限されている状況では、ｍＲＮＡとしての核酸誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸の発現を駆動するプロモータを備えたＤＮＡ発現カセットの形態のガイド核酸を導入することが望ましい場合がある。これにより、利用可能なガイド核酸の量が転写によって増幅される。
ＲＮＡの形態の又はＤＮＡ発現カセット上にコードされたガイド核酸は、ベクター又は染色体上にコードされた核酸誘導型ヌクレアーゼを含む宿主細胞に導入することができる。ガイド核酸は、カセット内で連続的又は非連続的であり得る１つ又は複数のポリヌクレオチドをカセット内に提供し得る。特定の実施形態では、ガイド核酸は、単一の連続したポリヌクレオチドとしてカセット中に提供される。
様々な送達システムを使用して、核酸誘導型ヌクレアーゼ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）及びガイド核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主細胞に導入できる。これらには、酵母システム、リポフェクションシステム、マイクロインジェクションシステム、遺伝子銃システム、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、ビリオン、人工ビリオン、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、細胞透過性ペプチド、ナノ粒子、ナノワイヤー（シャレク（Ｓｈａｌｅｋ）ら著、ナノレターズ（Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２０１２年）、エキソソームの使用が含まれる。トロイの木馬分子リポソーム（パートリッジ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）ら著、コールド・スプリング・ハーバ・プロトコル（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ）、２０１０年、ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７）を使用して、操作されたヌクレアーゼを送達し、血液脳関門を越えてヌクレアーゼを誘導し得る。
一部の実施形態では、編集テンプレートも提供される。編集テンプレートは、本明細書に記載のベクターの成分であり、別個のベクターに含まれるか、又はオリゴヌクレオチド、直鎖状ポリヌクレオチド若しくは合成ポリヌクレオチドなどの別々のポリヌクレオチドとして提供され得る。一部の場合、編集テンプレートは、ガイド核酸と同じポリヌクレオチド上にある。一部の実施形態では、編集テンプレートは、本明細書に開示される複合体の一部として核酸誘導型ヌクレアーゼによってニック又は切断される標的配列内又はその近傍などで相同組換えのテンプレートとして機能するように設計される。編集テンプレートポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド以上、約１５ヌクレオチド以上、約２０ヌクレオチド以上、約２５ヌクレオチド以上、約５０ヌクレオチド以上、約７５ヌクレオチド以上、約１００ヌクレオチド以上、約１５０ヌクレオチド以上、約２００ヌクレオチド以上、約５００ヌクレオチド以上、約１０００ヌクレオチド以上又はそれを超える長さなどの任意の適切な長さであり得る。一部の実施形態では、編集テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適にアラインされる場合、編集テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列の１つ又は複数のヌクレオチド（例えば、約１ヌクレオチド以上、約５ヌクレオチド以上、約１０ヌクレオチド以上、約１５ヌクレオチド以上、約２０ヌクレオチド以上、約２５ヌクレオチド以上、約３０ヌクレオチド以上、約３５ヌクレオチド以上、約４０ヌクレオチド以上又はそれを超えるヌクレオチド）と重複する可能性がある。一部の実施形態では、編集テンプレート配列及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアラインされる場合、テンプレートポリヌクレオチドの最も近傍のヌクレオチドは、標的配列から約１ヌクレオチド以内、約５ヌクレオチド以内、約１０ヌクレオチド以内、約１５ヌクレオチド以内、約２０ヌクレオチド以内、約２５ヌクレオチド以内、約５０ヌクレオチド以内、約７５ヌクレオチド以内、約１００ヌクレオチド以内、約２００ヌクレオチド以内、約３００ヌクレオチド以内、約４００ヌクレオチド以内、約５００ヌクレオチド以内、約１０００ヌクレオチド以内、約５０００ヌクレオチド以内、約１００００ヌクレオチド以内又はそれを超えるヌクレオチド以内である。
多くの例では、編集テンプレートは、標的配列と比較して少なくとも１つの変異を含む。編集テンプレートは、標的配列と比較した挿入、欠失、改変又はそれらの任意の組合せを含み得る。一部の編集テンプレートの例は、後のセクションでより詳細に説明する。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載の１つ又は複数のベクター又は直鎖状ポリヌクレオチドなどの１つ又は複数のポリヌクレオチド、１つ又は複数のその転写物及び／又はそれから宿主細胞に転写された１つ又はタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。一部の態様では、本発明は、そのような方法によって産生される細胞及びそのような細胞を含む又はそのような細胞から産生される生物体をさらに提供する。一部の実施形態では、ガイド核酸と組み合わせた（及び任意選択により複合体化した）操作されたヌクレアーゼが細胞に送達される。
従来のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子導入法は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞又は標的組織などの細胞に核酸を導入するために使用できる。そのような方法を使用して、操作された核酸誘導型ヌクレアーゼシステムの成分をコードする核酸を培養物中又は宿主生物体中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸及びリポソームなどの送達媒体と複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソームのゲノム又は組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子治療手順のレビューについては、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５６巻、ｐ．８０８〜８１３（１９９２年）；ナーベル（Ｎａｂｅｌ）及びフェイナー（Ｆｅｉｇｎｅｒ）著、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１１巻、ｐ．２１１〜２１７（１９９３年）；ミタニ（Ｍｉｔａｎｉ）及びキャスキー（Ｃａｓｋｅｙ）著、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１１巻、ｐ．１６２〜１６６（１９９３年）；ディロン（Ｄｉｌｌｏｎ）著、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１１巻、ｐ．１６７〜１７５（１９９３年）；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５７巻、ｐ．４５５〜４６０（１９９２年）；ヴァン・ブラント（Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第６巻、第１０号、ｐ．１１４９〜１１５４（１９８８年）；ヴィネ（Ｖｉｇｎｅ）、リストラティブ・ニューロロジー・アンド・ニューロサイエンス（Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、第８巻、ｐ３５〜３６（１９９５年）；クレマー（Ｋｒｅｍｅｒ）及びペリコーデ（Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ）、英国医学会報（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、第５１巻、第１号、ｐ．３１〜４４（１９９５年）；ハダダ（Ｈａｄｄａｄａ）ら著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）のカレントトピックス（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ）、デルフラー（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ）及びボーム（Ｂｏｈｍ）編（１９９５年）；及びユー（Ｙｕ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１巻、ｐ．１３〜２６（１９９４年）を参照されたい。
核酸の非ウイルス性送達の方法には、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン及びＤＮＡの薬剤強化された取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、第４，９４６，７８７号明細書及び第４，８９７，３５５号明細書に記載され、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（商標）及びリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性及び中性脂質には、フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット、国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが含まれる。送達は、細胞（例えば、インビトロ又はエクスビボ投与）又は標的組織（例えば、インビボ投与）に対して行うことができる。
免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、クリスタル（Ｃｒｙｓｔａｌ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７０巻、ｐ．４０４〜４１０（１９９５年）；ブレーズ（Ｂｌａｅｓｅ）ら著、キャンサー・ジーン・セラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、第２巻、ｐ．２９１〜２９７（１９９５年）；ベール（Ｂｅｈｒ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、第５巻、ｐ．３８２〜３８９（１９９４年）；レミー（Ｒｅｍｙ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、第５巻、ｐ．６４７〜６５４（１９９４年）；ガオ（Ｇａｏ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第２巻、ｐ．７１０〜７２２（１９９５年）；アハマド（Ａｈｍａｄ）ら著、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第５２巻、ｐ．４８１７〜４８２０（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、第４，２１７，３４４号明細書、第４，２３５，８７１号明細書、第４，２６１，９７５号明細書、第４，４８５，０５４号明細書、第４，５０１，７２８号明細書、第４，７７４，０８５号明細書、第４，８３７，０２８号明細書及び第４，９４６，７８７号明細書を参照されたい）。
核酸の送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスに基づくシステムの使用は、培養物中又は宿主内の特定の細胞にウイルスをターゲティングし、ウイルス負荷量を核又は宿主細胞ゲノムに輸送するための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、培養物中の細胞、患者（インビボ）に直接投与することも、インビトロで細胞を処置するために使用することもでき、改変された細胞は、任意選択により患者に投与され得る（エクスビボ）。従来のウイルスに基づくシステムには、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターが含まれ得る。レトロウイルス、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法により、宿主ゲノム中の組み込みが可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型及び標的組織で高い形質導入効率が観察されている。
レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことにより変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入又は感染させることができ、典型的に高いウイルス力価をもたらすレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存するであろう。レトロウイルスベクターは、シス作用性の長い末端反復配列で構成され、最大６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を備えている。最小シス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、その後、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで持続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びそれらの組合せに基づくものが含まれる（例えば、ブッシャー（Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６６巻、ｐ．２７３１〜２７３９（１９９２年）；ヨハン（Ｊｏｈａｎｎ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６６巻、ｐ．１６３５〜１６４０（１９９２年）；サマーフェルト（Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ）ら著、バイロロジー（Ｖｉｒｏｌ．）、第１７６巻、ｐ．５８〜５９（１９９０年）；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６３巻、ｐ．２３７４〜２３７８（１９８９年）；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６５巻、ｐ．２２２０〜２２２４（１９９１年）；ＰＣＴ／米国特許出願公開第９４／０５７００号明細書を参照されたい）。
一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムが使用され得る。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターでは、より高い力価及び発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に生成できる。
アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ産生において、且つインビボ及びエクスビボ遺伝子治療手順のために標的核酸で細胞を形質導入するためにも使用され得る（例えば、ウエスト（Ｗｅｓｔ）ら著、バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１６０巻、ｐ．３８〜４７（１９８７年）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号公報；コーチン（Ｋｏｔｉｎ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第５巻、ｐ．７９３〜８０１（１９９４年）；ムジツカ（Ｍｕｚｙｃｚｋａ）著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第９４巻、ｐ．１３５１（１９９４年）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；トラッチン（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ）ら著、モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第５巻、ｐ．３２５１〜３２６０（１９８５年）；トラッチン（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ）ら著、モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第４巻、ｐ．２０７２〜２０８１（１９８４年）；ハーモナット（Ｈｅｒｍｏｎａｔ）及びムジツカ（Ｍｕｚｙｃｚｋａ）、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第８１巻、ｐ．６４６６〜６４７０（１９８４年）；及びサマルスキ（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６３巻、ｐ．０３８２２〜３８２８（１９８９年）を含む多くの刊行物に記載されている。
一部の実施形態では、宿主細胞は、１つ又は複数のベクター、直鎖ポリヌクレオチド、ポリペプチド、核酸−タンパク質複合体又はそれらの本明細書に記載の任意の組合せで一時的又は非一時的にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、インビトロ、培養下又はエクスビボでトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、対象において自然発生するときにトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、対象から採取される。一部の実施形態では、細胞は、細胞株などの対象から採取された細胞に由来する。
一部の実施形態では、１つ又は複数のベクター、直鎖ポリヌクレオチド、ポリペプチド、核酸−タンパク質複合体又はそれらの本明細書に記載の任意の組合せでトランスフェクトされた細胞は、１つ又は複数のトランスフェクション由来配列を含む新しい細胞株を確立するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された核酸誘導型ヌクレアーゼシステムの成分で一時的にトランスフェクトされ（１つ又は複数のベクターの一時的なトランスフェクション又はＲＮＡでのトランスフェクションなどによる）、操作されたヌクレアーゼ複合体の活性により改変された細胞は、改変を含むが他の外因性配列を欠く細胞を含む新しい細胞株を確立するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の１つ又は複数のベクターを使用して、非ヒトトランスジェニック細胞、生物体、動物又は植物を産生する。一部の実施形態では、トランスジェニック動物は、マウス、ラット又はウサギなどの哺乳動物である。トランスジェニック細胞、生物体、植物及び動物を産生する方法は、当技術分野で公知であり、一般的に、本明細書に記載されているような細胞形質転換又はトランスフェクションの方法で始まる。
本明細書に開示される方法を使用して、オフターゲット切断事象を分析することができる。オフターゲット切断事象は、意図した標的配列以外の核酸配列位置で発生する切断事象であり得、それにより、それらは、意図しない標的配列となる。一般に、ベクターのライブラリは、本明細書に開示されるように生成することができ、前記ベクターは、ＰＡＭ配列に隣接する標的配列又は意図しない標的配列を含む。そのようなベクターのライブラリ内では、標的配列又は意図しない標的配列は、異なるベクター間で異なり得るため、単一の実験又は高スループットの方法で多数の異なる標的配列又は意図しない標的配列をスクリーニング又は試験できる。前記ベクターは、試験される標的配列又は意図しない標的配列の同定を可能にするバーコード又は他のユニークな識別子を含み得る。前記ベクターは、選択可能なマーカ又はスクリーニング可能なマーカを含み得る。前記ベクターは、ガイド核酸配列を含み得る。前記ガイド核酸は、ベクター内の適合する標的配列をターゲティングすることができる標的配列を含み得る。前記ガイド核酸は、足場配列を含み得る。次いで、ベクターライブラリを宿主細胞に導入することができ、前記宿主細胞は、対象のヌクレアーゼを含む。前記対象ヌクレアーゼは、ガイド核酸ベクターと同時に、その前に又はその後に細胞に導入される同じ又は異なるベクターから発現させることができる。他の場合、対象のヌクレアーゼをｍＲＮＡ転写物として細胞に導入することができる。他の場合、対象のヌクレアーゼをタンパク質として細胞に導入することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、各細胞内でガイド核酸が発現され、対象のヌクレアーゼと複合体を形成するであろう。次いで、ガイド核酸は、ヌクレアーゼを適合する標的配列にターゲティングすることができる。一部の場合、ガイド核酸が標的配列又は意図しない標的配列とハイブリダイズできる場合、対象のヌクレアーゼは、標的配列又は意図しない標的配列を切断できる。この切断事象により、宿主細胞は、標的配列を含むベクターを失うか、選択可能なマーカ又はスクリーニング可能なマーカの機能を失うため、宿主細胞は、選択中に死ぬか又はスクリーニング中に失われるであろう。一方、ガイド核酸が意図しない標的配列にハイブリダイズできない場合、意図しない標的配列は、切断されないため、宿主細胞は、選択可能又はスクリーニング可能なマーカを維持するであろう。インプットベクターを、生存するか、又は選択されたアウトプット宿主細胞からのベクターについて選択若しくはスクリーニングされたものと比較することにより、枯渇したベクターを特定することができる。インプットベクター及びアウトプットベクターのバーコード又はユニークな識別子を配列決定又は分析することにより、枯渇したバーコード又はユニークな識別子を識別でき、これにより枯渇した標的配列又は意図しない標的配列の識別が可能になるであろう。枯渇した標的配列又は意図しない標的配列には、ガイド核酸とハイブリダイズすることができ、従って対象のヌクレアーゼによって切断することができたものが含まれるであろう。枯渇した意図しない標的配列は、従って、オフターゲット切断事象又は対象のヌクレアーゼシステムによって切断することができたオフターゲット配列を含むであろう。
本明細書に開示されるオフターゲットアッセイにおける試験又はスクリーニングされる意図しない標的配列は、対象のガイド核酸によってターゲティングされ得る既知の標的配列のバリアントであり得る。例えば、目的の既知の標的配列を使用して、意図しない標的配列は、既知の標的配列と比較して挿入、欠失、再配列又は他の配列変更を含むように設計することができる。そのような配列変化は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド又はそれを超えるヌクレオチドを含み得る。変化したヌクレオチドは、連続していても又は連続していなくてもよい。
前述の枯渇の計算及び評価の方法は、これらの場合の枯渇の計算及び評価にも適用できる。
他のオフターゲット評価アッセイは、１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、削除、変異などの配列の変異のために識別できることが多いオフターゲット切断事象を識別するために宿主生物体のゲノムの配列決定を含んでいた。従って、これらの他の方法は、対象のヌクレアーゼシステムのオフターゲット効果を評価する場合、宿主細胞のゲノム配列によって制限される。本明細書で開示される対象のアッセイは、実質的にあらゆる配列のオフターゲット効果を識別するはるかに強く高スループットの方法を可能にし、これは、宿主細胞のゲノム配列によって制限されない。
他のオフターゲット評価アッセイは、１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、削除、変異などの配列の変異のために識別できることが多いオフターゲット切断事象を識別するために宿主生物体のゲノムの配列決定を含んでいた。従って、これらの他の方法は、対象のヌクレアーゼシステムのオフターゲット効果を評価する場合、宿主細胞のゲノム配列によって制限される。本明細書で開示される対象のアッセイは、実質的にあらゆる配列のオフターゲット効果を識別するはるかに強く高スループットの方法を可能にし、これは、宿主細胞のゲノム配列によって制限されない。
使用方法
操作されたヌクレアーゼ複合体の形成に関連して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、操作されたヌクレアーゼ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置し得る。標的配列は、インビトロ又は無細胞環境に位置し得る。
操作されたヌクレアーゼ複合体の形成に関連して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、操作されたヌクレアーゼ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞の核又は細胞質に位置し得る。標的配列は、インビトロ又は無細胞環境に位置し得る。
典型的には、標的配列にハイブリダイズし、本明細書に開示される１つ又は複数の操作されたヌクレアーゼと複合体化されたガイド核酸を含む操作されたヌクレアーゼ複合体の形成は、標的配列中又はその近傍（例えば、そこから１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、５０又はそれを超える塩基対以内）の一方又は両方の鎖の切断をもたらす。切断は、標的配列内、標的配列の５’、標的配列の上流、標的配列の３’又は標的配列の下流で行われ得る。
一部の態様では、ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの１つ又は複数の成分の発現を駆動する１つ又は複数のベクターは、１つ又は複数の標的部位でターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を形成するように宿主細胞中に又はインビトロで導入される。例えば、核酸誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸は、それぞれ別々のベクター上の別々の調節エレメントに作動可能に連結され得る。代わりに、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを単一のベクターに結合し得、１つ又は複数の追加のベクターは、第１のベクターに含まれないターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの任意の成分を提供する。単一のベクターに結合されるターゲティング可能なヌクレアーゼシステムのエレメントは、第２のエレメントについて（その「上流」に）５’又は第２のエレメントについて（その「下流」に）３’に位置する１つのエレメントなど、任意の適切な方向に配置し得る。１つのエレメントのコーディング配列は、第２のエレメントのコーディング配列の同じ又は反対の鎖上に位置し、同じ又は反対の方向に向けられ得る。一部の実施形態では、単一のプロモータは、核酸誘導型ヌクレアーゼ及び１つ又は複数のガイド核酸をコードする転写物の発現を駆動する。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼ及び１つ又は複数のガイド核酸は、同一のプロモータに作動可能に連結され、そこから発現される。他の実施形態では、１つ若しくは複数のガイド核酸又は１つ若しくは複数のガイド核酸をコードするポリヌクレオチドは、核酸誘導型ヌクレアーゼ又は核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を既に含む細胞又はインビトロ環境に導入される。
複数の異なるガイド配列が使用される場合、細胞内又はインビトロで、ヌクレアーゼ活性を複数の異なる対応する標的配列に向けるために単一の発現構築物が使用され得る。例えば、単一のベクターは、約１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１５以上、２０以上又はそれを超えるガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上又はそれを超えるそのようなガイド配列含有ベクターが提供され、任意選択により、細胞中に又はインビトロで送達され得る。
本明細書に開示される方法及び組成物は、複数のガイド核酸を含み得、ここで、各ガイド核酸は、異なるガイド配列を有し、それにより異なる標的配列をターゲティングする。そのような場合、複数のガイド核酸が多重化に使用でき、複数の標的が同時にターゲティングされる。追加的又は代替的に、集団の各細胞が異なる又はランダムなガイド核酸を受け取るように、複数のガイド核酸を細胞の集団に導入し、それにより細胞の集団にわたって複数の異なる標的配列をターゲティングする。そのような場合、その後変更された細胞の収集物は、ライブラリと称され得る。
本明細書に開示される方法及び組成物は、それぞれが１つ又は複数の異なる対応するガイド核酸を有する、複数の異なる核酸誘導型ヌクレアーゼを含み、それにより、異なる核酸誘導型ヌクレアーゼによる異なる標的配列のターゲティングを可能にする。一部のそのような場合、各核酸誘導型ヌクレアーゼは、別個の複数のガイド核酸に対応することができ、これにより、２つ以上の重複しないか、部分的に重複するか又は完全に重複する多重化事象を可能にする。
一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断活性又はＲＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、標的配列内及び／又は標的配列の補体内などの標的配列の位置で一方又は両方の鎖の切断を導く。一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００又はそれを超える塩基対以内の一方又は両方の鎖の切断を導く。
一部の実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、誘導性システムの成分を形成し得る。システムの誘導性により、エネルギーの一形態を使用した遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間制御が可能になるであろう。エネルギーの形態には、電磁放射、音エネルギー、化学エネルギー、光エネルギー、温度及び熱エネルギーが含まれるが、これらに限定されない。誘導性システムの例には、テトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｔｅｔ−オン（ＯｎＴｅｔ−Ｏｎ）又はＴｅｔ−オフ（Ｔｅｔ−Ｏｆｆ））、低分子の２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）又は光誘導性システム（フィトクロム、ＬＯＶドメイン又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列特異的な様式で転写活性の変化を導くための光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ：Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）の一部であり得る。光誘導性システムの構成要素には、核酸誘導型ヌクレアーゼ、光応答性シトクロムヘテロダイマー（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来）及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質のさらなる例及びそれらの使用方法は、米国特許第６１／７３６，４６５号明細書及び米国特許第６１／７２１，２８３号明細書に提供されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。誘導システムは、温度を上げるか又は下げることでシステムがオン又はオフになるように温度誘導性とすることができる。一部の温度誘導性システムでは、温度を上げるとシステムがオンになる。一部の温度誘導性システムでは、温度を上げるとシステムがオフになる。
一部の態様では、本開示は、インビトロで又は原核細胞若しくは真核細胞において（これは、インビボ、エクスビボ若しくはインビトロであり得る）標的配列を改変する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、原核細胞などの細胞又は細胞集団又はヒト若しくは非ヒト動物若しくは植物（微細藻類を含む）からのものをサンプリングし、細胞を改変することを含む。培養は、インビトロ又はエクスビボの任意の段階で行われ得る。１つ又は複数の細胞は、非ヒト動物又は植物（微細藻類を含む）などの宿主に再導入されることさえあり得る。再導入された細胞の場合、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。
一部の実施形態では、この方法は、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を標的配列に結合させて、前記標的配列の切断をもたらし、それにより標的配列を改変することを含み、ここで、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、ガイド核酸と複合体化した核酸誘導型ヌクレアーゼを含み、ガイド核酸のガイド配列は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされる。
一部の態様では、本開示は、インビトロ又は原核細胞又は真核細胞における標的ポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、前記結合が前記標的ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少をもたらすように、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を標的ポリヌクレオチドと共に標的配列に結合させることを含み、ここで、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、ガイド核酸と複合体化した核酸誘導型ヌクレアーゼを含み、ガイド核酸のガイド配列は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされる。標的ポリヌクレオチドを改変する方法について、上記と同様の考慮事項が適用される。実際、これらのサンプリング、培養及び再導入のオプションは、本発明の態様を通して適用される。
一部の態様では、本開示は、上記の方法及び組成物に開示されているエレメントのいずれか１つ又は複数を含有するキットを提供する。エレメントは、個別に又は組み合わせて提供され得、バイアル、ボトル又はチューブなどの任意の適切な容器で提供され得る。一部の実施形態では、キットは、１つ又は複数の言語、例えば複数の言語での説明書を含む。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載のエレメントの１つ又は複数を利用するプロセスにおける使用のための１つ又は複数の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器中に提供され得る。例えば、キットは、１つ又は複数の反応又は保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイで使用可能な形態又は使用前に１つ又は複数の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮物又は凍結乾燥形態）で提供され得る。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない任意の緩衝液であり得る。一部の実施形態では、緩衝液は、アルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は、約７〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列と調節エレメントを作動可能に連結するために、ベクターに挿入するためのガイド配列に対応する１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、編集テンプレートを含む。
一部の態様では、本開示は、操作されたターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの１つ又は複数のエレメントを使用する方法を提供する。本開示のターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列を改変するための効果的な手段を提供する。本開示のターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、多数の細胞型における標的配列の改変（例えば、欠失、挿入、転位置、不活性化、活性化）を含む多様な有用性を有する。このように、本発明のターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、例えば、生化学経路最適化、ゲノムワイド研究、ゲノム編集、遺伝子治療、薬物スクリーニング、疾患診断及び予後において幅広い用途を有する。例示的なターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、ガイド核酸と複合体化された本明細書に開示される核酸誘導型ヌクレアーゼを含み、ここで、ガイド核酸のガイド配列は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズできる。ガイド核酸は、足場配列に連結したガイド配列を含み得る。足場配列は、ある程度の相補性を有する１つ又は複数の配列領域を、それらが一緒になって二次構造を形成するように含み得る。一部の場合、１つ又は複数の配列領域は、同じポリヌクレオチド上に含まれるか又はコードされる。一部の場合、１つ又は複数の配列領域は、別々のポリヌクレオチド上に含まれるか又はコードされる。
標的ポリヌクレオチドを切断する方法が本明細書で提供される。この方法は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列に結合し、前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらす、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を使用して標的ポリヌクレオチドを切断することを含む。典型的には、本発明のターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体は、細胞に導入されると、標的配列に切断（例えば、一本鎖又は二本鎖切断）を生じる。例えば、この方法を使用して、細胞内の標的遺伝子を切断するか、又は野生型配列を改変配列に置き換えることができる。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体によって生じた切断は、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）経路、高忠実度相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）などの修復プロセス又は組換え経路によって修復できる。これらの修復プロセス中、編集テンプレートをゲノム配列に導入することができる。一部の方法では、標的配列を改変するためにＨＤＲ又は組換えプロセスを使用する。例えば、上流の配列及び下流の配列が隣接する組み込まれる配列を含む編集テンプレートが細胞に導入される。上流及び下流の配列は、染色体、標的ベクター又は標的ポリヌクレオチドの組み込み部位のいずれかの側と配列類似性を共有している。
編集テンプレートは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ：ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ：ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの直鎖状部分、ＰＣＲ断片、オリゴヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、ネイキッド核酸又はリポソーム若しくはポロキサマーなどの送達媒体と複合体化した核酸であり得る。
編集テンプレートポリヌクレオチドは、組み込まれる配列（例えば、変異遺伝子）を含み得る。組み込みのための配列は、細胞にとって内因性又は外因性の配列であり得る。組み込まれる配列の例には、タンパク質又は非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドが含まれる。従って、統合のための配列は、適切な制御配列に作動可能に連結され得る。代わりに、組み込まれる配列は、調節機能を提供し得る。組み込まれる配列は、内因性野生型配列の変異型又はバリアントであり得る。代わりに、組み込まれる配列は、内因性変異型配列の野生型バージョンであり得る。追加的又は代替的に、組み込まれる配列は、内因性の変異型又はバリアント配列のバリアント又は変異形態であり得る。
目的の標的ポリヌクレオチドと編集テンプレートポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するために、編集テンプレートポリヌクレオチドの上流及び下流配列を選択することができる。上流配列は、組み込みのための標的部位の上流の配列と配列類似性を有する核酸配列であり得る。同様に、下流配列は、組み込みの標的部位の下流の配列と類似性を有する核酸配列であり得る。編集テンプレートの上流及び下流の配列は、標的ポリヌクレオチドと７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、編集テンプレートポリヌクレオチドの上流及び下流配列は、標的ポリヌクレオチドと約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。一部の方法では、編集用テンプレートポリヌクレオチドの上流及び下流配列は、標的ポリヌクレオチドと約９９％又は１００％の配列同一性を有する。
上流又は下流の配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００又は２５００ｂｐを含む。一部の方法では、例示的な上流又は下流配列は、約１５ｂｐ〜約５０ｂｐ、約３０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ又はより詳細には約７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。
一部の方法では、編集テンプレートポリヌクレオチドは、マーカをさらに含み得る。このようなマーカは、ターゲティングされた組み込みのスクリーニングを容易にする。適切なマーカの例には、制限部位、蛍光タンパク質又は選択可能なマーカが含まれる。本発明の外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、組換え技術を使用して構築することができる（例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）及びサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、２０１４年及びオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、２０１７年を参照されたい）。
編集テンプレートポリヌクレオチドを組み込むことにより標的ポリヌクレオチドを改変するための例示的な方法では、操作されたヌクレアーゼ複合体によって二本鎖切断がゲノム配列に導入され、この切断は、テンプレートが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、編集テンプレートを使用した相同組換えを介して修復することができる。二本鎖切断の存在は、編集テンプレートの組み込みの効率を高めることができる。
細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法が本明細書に開示される。一部の方法は、標的ポリヌクレオチドに結合するターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を使用することにより、標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させることを含む。
一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化して、細胞内の発現の改変をもたらすことができる。例えば、細胞内の標的配列にターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体が結合すると、配列が転写されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のように機能しないように標的ポリヌクレオチドが不活性化される。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡコード配列は、タンパク質が産生されないように不活性化され得る。
一部の方法では、制御配列は、それが制御配列としてもはや機能しなくなるように不活性化され得る。本明細書で使用される場合、「調節配列」は、核酸配列の転写、翻訳又は接近可能性に影響する任意の核酸配列を指し得る。調節配列の例には、プロモータ、転写ターミネータ及びエンハンサーが含まれる。
不活性化された標的配列は、欠失変異（すなわち１つ又は複数のヌクレオチドの欠失）、挿入変異（すなわち１つ又は複数のヌクレオチドの挿入）又はナンセンス変異（すなわち終止コドンが導入されるような、単一ヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換）を含み得る。一部の方法では、標的配列の不活性化は、標的配列の「ノックアウト」をもたらす。
シグナル伝達生化学経路に関連する１つ又は複数の標的ポリヌクレオチドの発現の変化は、候補薬剤と接触させたときの、試験モデル細胞と対照細胞との間での対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの違いをアッセイすることにより決定できる。代わりに、コードされたポリペプチド又は遺伝子産物のレベルの差を検出することにより、シグナル伝達生化学経路に関連する配列の差次的発現が決定される。
ｍＲＮＡ転写物又は対応するポリヌクレオチドのレベルの薬剤誘発性変化をアッセイするために、当技術分野の標準的な方法に従い、まず試料に含有される核酸が抽出される。例えば、ｍＲＮＡは、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）及びサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（２０１４年）に記載されている手順に従い、様々な溶菌酵素又は化学溶液を使用して単離することができるか、又は製造元が提供する付属の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出することができる。次いで、抽出された核酸試料に含有されるｍＲＮＡは、当技術分野で広く知られている方法に従って又は本明細書に例示される方法に基づいて、増幅手順又は従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）によって検出される。
本発明の目的のために、増幅とは、合理的な忠実度で標的配列を複製することができるプライマー及びポリメラーゼを使用する任意の方法を意味する。増幅は、タックゴールド（ＴａｑＧｏｌｄ）（商標）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片及び逆転写酵素などの天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼによって実行され得る。好ましい増幅方法は、ＰＣＲである。特に、単離されたＲＮＡは、シグナル伝達生化学経路に関連する配列の発現レベルを定量化するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と組み合わせた逆転写アッセイに供することができる。
遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイにおいてリアルタイムで実行できる。一態様では、増幅産物は、ＤＮＡインターカレータ及びＤＮＡグループバインダーを含むが、これらに限定されない蛍光ＤＮＡ結合剤で直接視覚化することができる。二本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれたインターカレータの量は、典型的には、増幅されたＤＮＡ産物の量に比例するため、当技術分野における従来の光学システムを使用して、インターカレートされた色素の蛍光を定量化することにより、増幅産物の量を便利に決定することができる。この用途に適したＤＮＡ結合色素には、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、ホースト（Ｈｏｅｓｔｅ）、ＳＹＢＲゴールド、エチジウムブロマイド、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどが含まれる。
別の態様では、配列特異的プローブなどの他の蛍光標識を増幅反応に使用して、増幅産物の検出及び定量化を促進することができる。プローブに基づく定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的検出に依存している。これは、蛍光標的特異的プローブ（例えば、タックマン（ＴａｑＭａｎ）（商標）プローブ）を利用して、特異性及び感度を向上させる。プローブに基づく定量的増幅を実施する方法は、当技術分野で十分に確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号明細書に教示されている。
さらに別の態様では、シグナル伝達生化学経路に関連する配列と配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを使用する従来のハイブリダイゼーションアッセイを実施することができる。典型的には、プローブは、ハイブリダイゼーション反応において試験対象に由来する生体試料内に含有されるシグナル伝達生化学経路に関連する配列と安定した複合体を形成することができる。アンチセンスがプローブ核酸として使用される場合、試料中に提供される標的ポリヌクレオチドがアンチセンス核酸の配列に相補的であるように選択されることは、当業者によって理解されるであろう。逆に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドは、センス核酸の配列に相補的であるように選択される。
ハイブリダイゼーションは、例えば、本明細書に記載されているように、様々なストリンジェンシー条件下で実施することができる。本発明の実施に適したハイブリダイゼーション条件は、プローブとシグナル伝達生化学経路に関連する配列との間の認識相互作用が十分に特異的且つ十分に安定の両方であるようなものである。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は、広く知られており、当技術分野で公開されている。例えば、（グリーン（Ｇｒｅｅｎ）及びサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、２０１４年、非放射性インサイチューハイブリダイゼーション・アプリケーション・マニュアル（Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）、ベーリンガーマンハイム、第２版）を参照されたい。ハイブリダイゼーションアッセイは、ニトロセルロース、ガラス、シリコン及び様々な遺伝子アレイを含むが、これらに限定されない、任意の固体支持体に固定されたプローブを使用して形成することができる。好ましいハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号明細書に記載されているように高密度遺伝子チップ上で実行される。
ハイブリダイゼーションアッセイ中に形成されるプローブ−標的複合体の簡便な検出のために、ヌクレオチドプローブは、検出可能な標識に結合される。本発明での使用に適した検出可能な標識には、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。蛍光若しくは化学発光標識、放射性同位体標識、酵素又は他のリガンドを含む、多様な適切な検出可能な標識が当技術分野で公知である。好ましい実施形態では、ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体などの蛍光標識又は酵素タグを使用することが望まれるであろう。
ハイブリダイゼーション強度を検出又は定量化するために使用される検出方法は、典型的には、上記で選択した標識に依存する。例えば、放射標識は、写真フィルム又はホスホイメージャを使用して検出され得る。蛍光マーカは、放射光線を検出するために光検出器を使用して検出及び定量化され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用により生成される反応生成物を測定することにより検出され、最後に、着色した標識を単に視覚化することにより比色標識が検出される。
シグナル伝達生化学経路に関連する配列の発現における薬剤誘導性の変化も、対応する遺伝子産物を調べることにより決定できる。タンパク質レベルの決定は、典型的には、ａ）生物学的試料に含有されるタンパク質を、シグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤と接触させることと、（ｂ）形成された薬剤：タンパク質複合体を特定することとを含む。この実施形態の一態様では、シグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
反応は、薬剤とシグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質との間に複合体が形成される条件下において、試験試料に由来するシグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質の試料と薬剤を接触させることにより実行できる。複合体の形成は、当技術分野の標準的な手順に従って直接的又は間接的に検出することができる。直接検出法では、薬剤に検出可能な標識が与えられ、複合体から未反応の薬剤を除去でき、残っている標識の量により、形成された複合体の量が示される。そのような方法について、ストリンジェントな洗浄条件中でも薬剤に付着したままである標識を選択することが好ましい。標識は、結合反応を妨害しないことが好ましい。代わりに、間接的な検出手順では、化学的又は酵素的に導入された標識を含有する薬剤が使用され得る。望ましい標識は、一般に、得られる薬剤：ポリペプチド複合体の結合又は安定性を妨げない。しかしながら、標識は、典型的には、効果的な結合のために抗体がアクセスできるように設計されているため、検出可能な信号が生成される。
タンパク質レベルの検出に適した多様な標識が当技術分野で知られている。非限定的な例には、放射性同位体、酵素、コロイド金属、蛍光化合物、生物発光化合物及び化学発光化合物が含まれる。
結合反応中に形成される薬剤：ポリペプチド複合体の量は、標準的な定量アッセイによって定量化できる。上記のように、薬剤：ポリペプチド複合体の形成は、結合部位に残った標識の量によって直接的に測定できる。別の方法では、シグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質は、特定の薬剤の結合部位について標識された類似体と競合する能力について試験される。この競合アッセイでは、捕捉された標識の量は、試験試料に存在するシグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質配列の量に反比例する。
上記で概説した一般的な原理に基づいたタンパク質分析のための多くの技法が当技術分野で利用可能である。それらは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫放射分析）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線アッセイ、インサイチューイムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素又は放射性同位元素標識を使用）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを含むが、これらに限定されない。
シグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質を特異的に認識又は結合する抗体は、前述のタンパク質分析を行うために好ましい。必要に応じて、特定のタイプの翻訳後改変（例えば、シグナル伝達生化学経路誘導性改変）を認識する抗体を使用できる。改変後修飾には、グリコシル化、脂質化、アセチル化及びリン酸化が含まれるが、これらに限定されない。これらの抗体は、商業的ベンダーから購入され得る。例えば、チロシンリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗ホスホチロシン抗体は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）などの多くのベンダーから入手できる。抗ホスホチロシン抗体は、ＥＲストレスに応答して、そのチロシン残基が特異的にリン酸化されるタンパク質の検出に特に有用である。そのようなタンパク質には、真核生物翻訳開始因子２アルファ（ｅＩＦ−２．アルファ）が含まれるが、これに限定されない。代わりに、これらの抗体は、宿主動物又は抗体産生細胞を、所望の翻訳後改変を示す標的タンパク質で免疫することにより、従来のポリクローナル又はモノクローナル抗体技術を使用して生成することができる。
対象の方法を実施する際、異なる身体組織、異なる細胞タイプ及び／又は異なる細胞下構造におけるシグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質の発現パターンを識別することが望ましい場合がある。これらの研究は、特定の組織、細胞タイプ又は細胞下構造で優先的に発現されるタンパク質マーカに結合できる組織特異的、細胞特異的又は細胞下構造特異的抗体を使用して実施できる。
シグナル伝達生化学経路に関連する遺伝子の発現の変化は、対照細胞と比較した遺伝子産物の活性の変化を調べることによっても決定できる。シグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質の活性における薬剤誘発性変化のアッセイは、生物学的活性及び／又は調査中のシグナル伝達経路に依存する。例えば、タンパク質がキナーゼである場合、下流の基質をリン酸化する能力の変化は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって決定することができる。代表的なアッセイには、リン酸化タンパク質を認識する抗ホスホチロシン抗体などの抗体を用いた免疫ブロット法及び免疫沈降法が含まれるが、これらに限定されない。さらに、アルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）（商標）（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）から入手可能）及びｅタグ（ｅＴａｇ）（商標）アッセイ（チャン・フイ（Ｃｈａｎ−Ｈｕｉ）ら著、２００３年、クリニカル・イムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１１１巻、ｐ．１６２〜１７４）などのハイスループット化学発光アッセイにより、キナーゼ活性を検出することができる。
シグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質が細胞内ｐＨ条件の変動につながるシグナル伝達カスケードの一部である場合、蛍光ｐＨ色素などのｐＨ感受性分子をレポータ分子として使用できる。シグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質がイオンチャネルである別の例では、膜電位及び／又は細胞内イオン濃度の変動を監視できる。多くの市販のキット及びハイスループットデバイスは、イオンチャネルのモジュレーターの迅速で強いスクリーニングに特に適している。代表的な機器には、ＦＬＩＰＲ（商標）（モレキュラーデバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．））及びＶＩＰＲ（オーロラ・バイオサイエンシズ（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））が含まれる。これらの機器は、１０００サンプルウェルを超えるマイクロプレート中の反応を同時に検出し、１秒以内又はその数分の一以内でリアルタイム測定及び機能データを提供することができる。
本明細書に開示される方法のいずれかを実施する際、適切なベクターは、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、カチオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション、光トランスフェクション、独自の薬剤により強化された核酸の取り込み及びリポソーム、イムノリポソーム、ビロソーム又は人工ビリオンによる送達を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の１つ又は複数の方法により細胞、組織、生物体又は胚に導入することができる。一部の方法では、マイクロインジェクションによってベクターを胚に導入する。ベクターは、胚の核又は細胞質にマイクロインジェクションされ得る。一部の方法では、ヌクレオフェクションによりベクターを細胞に導入し得る。
標的配列
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体の標的ポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核、原核細胞のゲノム又は宿主細胞の染色体外ベクターに存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）をコードする配列であり得る。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体の標的ポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核、原核細胞のゲノム又は宿主細胞の染色体外ベクターに存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）をコードする配列であり得る。
標的ポリヌクレオチドの例には、シグナル伝達生化学経路に関連する配列、例えばシグナル伝達生化学経路に関連する遺伝子又はポリヌクレオチドが含まれる。標的ポリヌクレオチドの例は、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドを含む。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して、疾患に冒された組織に由来する細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写又は翻訳産物を生じる任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。それは、異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子である可能性があり、それは、異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子である可能性があり、発現の変化は、疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子は、疾患の病因について、直接的な原因があるか、又は原因となる遺伝子と連鎖不平衡にある、変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写又は翻訳された生成物は、既知又は未知であり得、正常又は異常なレベルであり得る。
本発明の実施形態は、遺伝子のノックアウト、遺伝子の編集、遺伝子の変更、遺伝子の増幅及び特定の変異の修復に関連する方法及び組成物にも関する。遺伝子の変化は、標的配列の後成的操作を意味する場合もある。これは、標的配列のメチル化状態の改変（すなわちメチル化又はメチル化パターン又はＣｐＧアイランドの追加又は除去）、ヒストン改変、標的配列への接近可能性の増加若しくは減少又は３Ｄフォールディングの促進などによる標的配列のクロマチン状態であり得る。目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作により、細胞、生物体又はヒト若しくは非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物又は生物体を改変する方法に言及する場合、これは、生物体（又は哺乳動物）全体又は単一の細胞のみ又はその生物体の細胞集団（生物体が多細胞の場合）に適用され得ることが理解されるであろう。例えば、ヒトの場合、本出願人らは、とりわけ、単一の細胞又は細胞の集団を想定し、これらは、好ましくは、エクスビボで改変され、その後、再導入され得る。この場合、生検又は他の組織若しくは体液試料が必要になり得る。これに関して、幹細胞も特に好ましい。しかし、当然のことながら、インビボの実施形態も想定される。また、本発明は、ＨＳＣに関して特に有利である。
ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体の機能性は、任意の適切なアッセイにより評価できる。例えば、ガイド核酸及び核酸誘導型ヌクレアーゼを含む、ターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を形成するのに十分なターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの成分は、操作されたヌクレアーゼシステムの成分をコードするベクターによるトランスフェクションなどにより、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供することができ、標的配列内の優先的切断の評価がそれに続く。同様に、標的配列及びターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体の成分を提供することにより、試験管内で標的配列の切断を評価し得る。他のアッセイが可能であり、当業者は、それを想到するであろう。ガイド配列は、任意の標的配列をターゲティングするように選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列は、標的ゲノムにおいてユニークなものを含む。
編集カセット
標的ポリヌクレオチド配列を編集するための組成物及び方法が本明細書に開示される。そのような組成物は、ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの１つ又は複数の成分を含有するポリヌクレオチドを含む。これらの方法で使用するポリヌクレオチド配列は、編集カセットと称され得る。
標的ポリヌクレオチド配列を編集するための組成物及び方法が本明細書に開示される。そのような組成物は、ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムの１つ又は複数の成分を含有するポリヌクレオチドを含む。これらの方法で使用するポリヌクレオチド配列は、編集カセットと称され得る。
編集カセットは、１つ又は複数のプライマー部位を含み得る。プライマー部位は、１つ又は複数のプライマー部位にハイブリダイズできる逆相補配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、編集カセットを増幅するために使用できる。編集カセットは、２つ以上のプライマー時間を含み得る。ときに、編集カセットは、編集カセットの各末端にプライマー部位を含み、前記プライマー部位は、編集カセットの他の成分の１つ又は複数に隣接する。プライマー部位は、およそ１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ヌクレオチド又はそれを超える長さであり得る。
編集カセットは、本明細書で開示される編集テンプレートを含み得る。編集カセットは、編集配列を含み得る。編集配列は、標的配列と相同であり得る。編集配列は、標的配列と比較して少なくとも１つの変異を含み得る。編集配列は、多くの場合、標的配列に対する少なくとも１つの変異に隣接する相同領域（又はホモロジーアーム）を含み、隣接する相同領域が編集配列の標的配列への相同組換えを促進する。編集配列は、本明細書で開示される編集テンプレートを含み得る。例えば、編集配列は、標的配列に対し、ＰＡＭ部位を変異又は欠失させる１つ又は複数のＰＡＭ変異を含む少なくとも１つの変異を含み得る。編集配列は、非編集標的部位に関連するコドン又は非コード配列に１つ又は複数の変異を含み得る。
ＰＡＭ変異は、サイレント変異であり得る。サイレント変異は、元のコドンによってコードされたアミノ酸を変更しない、元のコドンと比較したコドンの少なくとも１つのヌクレオチドの変更であり得る。サイレント変異は、イントロン、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域又は他の非コード領域などの非コード領域内のヌクレオチドの変化であり得る。
ＰＡＭ変異は、非サイレント変異であり得る。非サイレント変異には、ミスセンス変異が含まれ得る。ミスセンス変異は、元のコドンによってコードされたアミノ酸を変更する、元のコドンと比較したコドンの少なくとも１つのヌクレオチドの変更であり得る。ミスセンス変異は、エクソン、オープンリーディングフレーム又は他のコーディング領域内で発生し得る。
編集配列は、標的配列と比較して少なくとも１つの変異を含み得る。変異は、サイレント変異又はミスセンス変異などの非サイレント変異であり得る。変異は、１つ又は複数のヌクレオチド又は塩基対の挿入を含み得る。変異は、１つ又は複数のヌクレオチド又は塩基対の欠失を含み得る。変異は、１つ又は複数のヌクレオチド又は塩基対の、異なる１つ又は複数のヌクレオチド又は塩基対への置換を含み得る。挿入又は置換された配列は、外因性又は異種性の配列を含み得る。
編集カセットは、ガイド核酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み得る。一部の場合、ガイド核酸配列は、任意選択により、プロモータに作動可能に連結している。ガイド核酸配列は、本明細書に記載の足場配列及びガイド配列を含み得る。
編集カセットは、バーコードを含み得る。バーコードは、対応する編集配列の１つ又は複数の変異をバーコードが識別できるように編集配列に対応するユニークなＤＮＡ配列であり得る。一部の例では、バーコードは、１５ヌクレオチドである。バーコードは、１０ヌクレオチド未満、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８８、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ヌクレオチド又は２００を超えるヌクレオチドを含み得る。バーコードは、天然に存在しない配列であり得る。バーコードを含む編集カセットは、天然に存在しない配列であり得る。
編集カセットは、１つ又は複数の編集配列と、任意選択によりプロモータに作動可能に連結された、ガイド核酸をコードするポリヌクレオチドとを含み得、編集カセット及びガイド核酸配列は、プライマー部位に隣接する。編集カセットは、バーコードをさらに含み得る。
編集カセットの例を図３に示す。各編集カセットは、標的配列内の部位を編集するように設計できる。標的とされる部位は、コーディング領域、非コーディング領域、機能的に中性の部位であり得、スクリーニング可能又は選択可能なマーカ遺伝子であり得る。編集配列内の相同性領域は、編集カセットの１つ又は複数の変異に隣接し、組換えにより標的配列に挿入することができる。組換えは、核酸誘導型ヌクレアーゼによるものなどのＤＮＡ切断及び相同組換えによる修復を含み得る。
編集カセットは、化学合成、ギブソンアセンブリ、ＳＬＩＣ、ＣＰＥＣ、ＰＣＡ、ライゲーションフリークローニング、オーバーラップオリゴ伸長、インビトロアセンブリ、インビトロオリゴアセンブリ、ＰＣＲ、従来のライゲーションに基づくクローニング、当技術分野における他の公知の方法又はそれらの任意の組合せによって生成することができる。
バーコード又はレコーダ配列などの追跡可能な配列は、インシリコにおいて、標的コドンにおける縮重変異を用いて標準のコードによって設計することができる。縮重変異は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３０を超える核酸残基を含み得る。一部の例では、縮重変異は、１５の核酸残基（Ｎ１５）を含み得る。
編集配列を所望の場所に相同組換え又は相同性駆動型修復によって組み入れることを可能にするために、編集配列にホモロジーアームを付加することができる。ホモロジーアームは、合成、インビトロアセンブリ、ＰＣＲ又は当技術分野で公知の他の方法によって付加することができる。例えば、化学合成、ギブソンアセンブリ、ＳＬＩＣ、ＣＰＥＣ、ＰＣＡ、ライゲーションフリークローニング、オーバーラップオリゴ伸長、インビトロアセンブリ、インビトロオリゴアセンブリ、ＰＣＲ、従来のライゲーションに基づくクローニング、当技術分野における他の公知の方法又はそれらの任意の組合せである。ホモロジーアームをバーコード、レコーダ配列及び／又は編集配列の両末端に付加し、それにより配列に２つの別個のホモロジーアーム、例えば５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームを隣接させることができる。
ホモロジーアームは、標的配列に相同な配列を含み得る。ホモロジーアームは、標的配列に隣接する配列に相同な配列を含み得る。ホモロジーアームは、標的配列の上流又は下流の配列に相同な配列を含み得る。ホモロジーアームは、標的配列と同一の遺伝子又はオープンリーディングフレーム内の配列に相同な配列を含み得る。ホモロジーアームは、標的配列が含まれる遺伝子又はオープンリーディングフレームの上流又は下流の配列に相同な配列を含み得る。ホモロジーアームは、その中に標的配列がある遺伝子又はオープンリーディングフレームの５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲに相同な配列を含み得る。ホモロジーアームは、標的配列が含まれているものと異なる遺伝子、オープンリーディングフレーム、プロモータ、ターミネータ又は核酸配列に相同な配列を含み得る。
同じ５’及び３’ホモロジーアームを複数の別個の編集配列に付加し、それにより、それぞれが同じ標的とされる挿入部位を有するユニークな編集配列のライブラリを生成することができる。同じ５’及び３’ホモロジーアームを複数の別個の編集テンプレートに付加し、それにより、それぞれが同じ標的とされる挿入部位を有するユニークな編集テンプレートのライブラリを生成することができる。代替の例では、異なる又は種々の５’又は３’ホモロジーアームを複数の編集配列又は編集テンプレートに付加することができる。
隣接するホモロジーアームを含むバーコードライブラリ又はレコーダ配列ライブラリをベクター骨格にクローニングすることができる。一部の例では、隣接するホモロジーアームを含むバーコードを編集カセットにクローニングする。クローニングは、化学合成、ギブソンアセンブリ、ＳＬＩＣ、ＣＰＥＣ、ＰＣＡ、ライゲーションフリークローニング、オーバーラップオリゴ伸長、インビトロアセンブリ、インビトロオリゴアセンブリ、ＰＣＲ、従来のライゲーションに基づくクローニング、当技術分野における他の公知の方法又はそれらの任意の組合せにより行うことができる。
隣接するホモロジーアームを含む編集配列ライブラリをベクター骨格にクローニングすることができる。一部の例では、編集配列及びホモロジーアームを編集カセットにクローニングする。編集カセットは、一部の場合、所望の編集配列挿入部位、例えば標的配列を標的とするように操作されたガイド核酸又はｇＲＮＡをコードする核酸配列をさらに含み得る。編集カセットは、一部の場合、バーコード又はレコーダ配列をさらに含み得る。クローニングは、化学合成、ギブソンアセンブリ、ＳＬＩＣ、ＣＰＥＣ、ＰＣＡ、ライゲーションフリークローニング、オーバーラップオリゴ伸長、インビトロアセンブリ、インビトロオリゴアセンブリ、ＰＣＲ、従来のライゲーションに基づくクローニング、当技術分野における他の公知の方法又はそれらの任意の組合せにより行うことができる。
全遺伝子又は全ゲノム編集ライブラリをベクター骨格にクローニングすることができる。バーコード又はレコーダ配列ライブラリを第２の部位に挿入又はアセンブルして、レコーディングバーコードを固定された遺伝子座に埋め込むと同時に編集ライブラリを多様な使用者により規定される部位に組み込むことができるコンピテントな追跡可能なプラスミドを生成することができる。クローニングは、化学合成、ギブソンアセンブリ、ＳＬＩＣ、ＣＰＥＣ、ＰＣＡ、ライゲーションフリークローニング、オーバーラップオリゴ伸長、インビトロアセンブリ、インビトロオリゴアセンブリ、ＰＣＲ、従来のライゲーションに基づくクローニング、当技術分野における他の公知の方法又はそれらの任意の組合せにより行うことができる。
最初にガイド核酸又はそれをコードする配列をベクター骨格にアセンブル又は挿入し、その後、編集配列及び／又はカセットを挿入することができる。他の場合、最初に編集配列及び／又はカセットをベクター骨格に挿入又はアセンブルし、その後、ガイド核酸又はそれをコードする配列を挿入することができる。他の場合、ガイド核酸又はそれをコードする配列並びに編集配列及び／又はカセットを同時にベクターに挿入又はアセンブルすることができる。レコーダ配列又はバーコードは、これらの手順のいずれかの前又は後に挿入できる。換言すると、本開示のエレメントが組み立てられる順序には、多くの可能な並べ替えがあることが理解されるべきである。ベクターは、直鎖状又は環状で、化学合成、ギブソンアセンブリ、ＳＬＩＣ、ＣＰＥＣ、ＰＣＡ、ライゲーションフリークローニング、オーバーラップオリゴ伸長、インビトロアセンブリ、インビトロオリゴアセンブリ、ＰＣＲ、従来のライゲーションに基づくクローニング、当技術分野における他の公知の方法又はそれらの任意の組合せによって生成することができる。
本明細書に開示される１つ又は複数のエレメントを含む核酸分子を合成することができる。編集カセットを含む核酸分子を合成することができる。ガイド核酸を含む核酸分子を合成することができる。レコーダカセットを含む核酸分子を合成することができる。バーコードを含む核酸分子を合成することができる。ホモロジーアームを含む核酸分子を合成することができる。編集カセット及びガイド核酸を含む核酸分子を合成することができる。編集カセット及びバーコードを含む核酸分子を合成することができる。編集カセット、ガイド核酸及びレコーダカセットを含む核酸分子を合成することができる。編集カセット、レコーダカセット及び２つのガイド核酸を含む核酸分子を合成することができる。レコーダカセット及びガイド核酸を含む核酸分子を合成することができる。これらの場合のいずれにおいても、ガイド核酸は、任意選択により、プロモータに作動可能に連結し得る。これらの場合のいずれにおいても、核酸分子は、１つ又は複数のバーコードをさらに含み得る。
合成は、当技術分野で公知の任意の核酸合成方法によって行うことができる。合成は、酵素的核酸合成によって行うことができる。合成は、化学合成によって行うことができる。合成は、アレイに基づく合成によって行うことができる。合成は、固相合成又はホスホルアミダイト法によって行うことができる。合成は、カラム法又はマルチウェル法によって行うことができる。合成された核酸分子は、天然に存在しない核酸分子であり得る。
多重化合成及び生成のためにソフトウェア及び自動化方法を使用することができる。例えば、ソフトウェア及び自動化を使用して、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６又はそれを超える合成ポリヌクレオチド、カセット又はプラスミドを創出することができる。自動化方法は、最小限のステップを有するワークフローを介して処理され、遺伝子全体又はゲノム全体の編集ライブラリなど、正確に定義されたライブラリを生成できる迅速な方法で所望の配列及びライブラリを生成できる。
前述のエレメントのいずれかの１つ又は複数の組合せを含めた、レコーダ配列、編集配列、ガイド核酸及び任意選択のバーコードの本明細書に開示されている任意の組合せを含む２つ以上の核酸分子又はプラスミドを含むポリヌクレオチド又はライブラリを生成することができる。例えば、そのようなライブラリは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０又はそれを超える本開示の核酸分子又はプラスミドを含み得る。そのようなライブラリは、上に特定の数が明示的に列挙されていなくても、任意の数の核酸分子又はプラスミドを含み得ることが理解されるべきである。
各追跡可能なプラスミドに含まれるレコーダ配列と編集配列の対を決定するために、追跡可能なプラスミドライブラリ又は核酸分子ライブラリについて配列決定することができる。他の場合、ライブラリ生成プロセス中に公知のレコーダ配列と公知の編集配列とを対にする。共通する核酸分子又はプラスミド上に含まれるレコーダ配列と編集配列との関連を決定する他の方法は、編集配列をレコーダ配列の同定又は配列決定によって同定することができるように構想される。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と他の生物体／細胞株との間でシャトルされる編集されたエピソームのライブラリを追跡するための方法及び組成物が本明細書で提供される。ライブラリは、プラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、合成染色体又はウイルス若しくはファージゲノム上に含まれ得る。これらの方法及び組成物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主生物体におけるポータブルのバーコードが付されたライブラリを生成することができる。そのような生物体におけるライブラリ生成により、相同組換えを実施するための確立された技法の利点がもたらされ得る。バーコードが付されたプラスミドライブラリについて１つの部位において深層配列決定して、ライブラリカバレッジの深度の劇的な改善を可能にするプラスミドの残りの部分を標的とする変異による多様性を追跡することができる。
本明細書に開示される任意の核酸分子は、単離された核酸であり得る。単離された核酸は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば標準の組換え方法、アセンブリ方法、合成技法又はこれらの組合せを使用して作出することができる。一部の実施形態では、核酸をクローニング、増幅、アセンブル又は他の方法で構築することができる。
単離された核酸は、当技術分野で公知の任意の数のクローニング方法論を使用して、細胞、細菌又は他の供給源から得ることができる。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件下で生物体又は細胞の他のオリゴヌクレオチド又は核酸に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、単離された核酸を単離又は同定できる。
細胞のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを、同定された目的の遺伝子エレメントの存在について、プローブを使用し、１つ又は複数の配列に基づいてスクリーニングすることができる。種々の程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションをアッセイに使用することができる。
核酸ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件は、当技術分野で周知である。例えば、条件は、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによってもたらされるものなどの低塩及び／又は高温条件を含み得る。所望のストリンジェンシーの温度及びイオン強度は、一部において、特定の核酸の長さ、標的配列の長さ及びヌクレオチド含有量、核酸の電荷組成により、且つハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウム又は他の溶媒の存在又は濃度により決定されることが理解される。核酸は、標的配列と完全に相補的であり得、１つ又は複数のミスマッチを示し得る。
目的の核酸を、種々の公知の増幅技法を使用して増幅することもできる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）技術を使用して、標的配列をＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡから直接増幅することができる。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅方法は、例えば、核酸配列をクローニングするため、試料中の標的核酸の存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作出するため、核酸配列決定のため又は他の目的のためにも有用であり得る。
単離された核酸は、ホスホトリエステル法などの方法による直接化学合成により又は自動合成機を使用して調製することができる。化学合成では、一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドが生成する。これを、相補配列とのハイブリダイゼーションにより、又は一本鎖をテンプレートとして使用し、ＤＮＡポリメラーゼを用いた重合により二本鎖ＤＮＡに変換することができる。
レコーダ
一部の例では、２つの編集カセットを一緒に使用して遺伝子操作のステップを追跡できる。例えば、１つの編集カセットは、編集テンプレート及びコードされたガイド核酸を含み得、レコーダカセットと称される第２の編集カセットは、レコーダ配列と、第１の編集カセットのものと比較して別個のガイド配列を有するコード核酸とを含む編集テンプレートを含み得る。そのような場合、編集配列とレコーダ配列は、別々の標的配列に挿入し、その対応するガイド核酸によって決定することができる。レコーダ配列は、バーコード、追跡可能（ｔｒａｃｋａｂｌｅ）又は追跡可能（ｔｒａｃｅａｂｌｅ）な配列及び／又はスクリーニング可能又は選択可能なマーカで作動できる調節エレメントを含み得る。
一部の例では、２つの編集カセットを一緒に使用して遺伝子操作のステップを追跡できる。例えば、１つの編集カセットは、編集テンプレート及びコードされたガイド核酸を含み得、レコーダカセットと称される第２の編集カセットは、レコーダ配列と、第１の編集カセットのものと比較して別個のガイド配列を有するコード核酸とを含む編集テンプレートを含み得る。そのような場合、編集配列とレコーダ配列は、別々の標的配列に挿入し、その対応するガイド核酸によって決定することができる。レコーダ配列は、バーコード、追跡可能（ｔｒａｃｋａｂｌｅ）又は追跡可能（ｔｒａｃｅａｂｌｅ）な配列及び／又はスクリーニング可能又は選択可能なマーカで作動できる調節エレメントを含み得る。
多重化クローニング手法により、レコーダカセットをプラスミド内の少なくとも１つの編集カセット（例えば、図１７Ａ）と共有結合によりカップリングして、ユニークなレコーダカセットと編集カセットとの組合せを有するプラスミドライブラリを生成することができる。このライブラリについて配列決定してレコーダ／編集マッピングを生成することができ、これを使用して編集ライブラリを標的ＤＮＡの大きいセグメントにわたって追跡することができる（例えば、図１７Ｃ）。レコーダ及び編集配列は、同じカセット上に含まれ得、この場合、これらは、両方が同じ組換え事象により、ゲノム又はプラスミドなどの標的核酸配列に組み入れられる。他の例では、レコーダ及び編集配列は、同じプラスミド内の別々のカセット上に含まれ得、この場合、レコーダ及び編集配列は、別々の組換え事象により、同時に又は逐次的に標的核酸配列に組み入れられる。
特異的に設計された追跡可能な変異のライブラリを創出するために、多重化オリゴヌクレオチド合成とリコンビニアリングとを組み合わせる方法が本明細書で提供される。スクリーニング及び／又は選択、その後のハイスループットな配列決定及び／又はバーコードマイクロアレイ法により、目的の表現型をもたらす変異の迅速なマッピングを可能にすることができる。
本明細書に開示されている方法及び組成物を使用して、標的核酸配列における操作事象を同時に操作し、追跡することができる。
そのようなプラスミドは、インビトロアセンブリ又はクローニング技法を使用して生成することができる。例えば、プラスミドを、化学合成、ギブソンアセンブリ、ＳＬＩＣ、ＣＰＥＣ、ＰＣＡ、ライゲーションフリークローニング、他のインビトロオリゴアセンブリ技法、従来のライゲーションに基づくクローニング又はそれらの任意の組合せを使用して生成することができる。
そのようなプラスミドは、インビトロアセンブリ又はクローニング技法を使用して生成することができる。例えば、プラスミドを、化学合成、ギブソンアセンブリ、ＳＬＩＣ、ＣＰＥＣ、ＰＣＡ、ライゲーションフリークローニング、他のインビトロオリゴアセンブリ技法、従来のライゲーションに基づくクローニング又はそれらの任意の組合せを使用して生成することができる。
そのようなプラスミドは、少なくとも１つのレコーディング配列、例えばバーコードなど、及び少なくとも１つの編集配列を含み得る。ほとんどの場合、レコーディング配列は、操作事象を記録及び追跡するために使用される。編集配列は、それぞれ所望の編集を標的核酸配列に組み入れるために使用することができる。所望の編集は、標的核酸配列の挿入、欠失、置換又は変化を含む。一部の例では、１つ又は複数のレコーディング配列及び編集配列は、プラスミド内に含まれる単一のカセット上に含まれ、従って同じ操作事象によって標的核酸配列に組み入れられる。他の例では、レコーディング及び編集配列は、プラスミド内の別々のカセット上に含まれ、従ってそれぞれが別個の操作事象によって標的核酸に組み入れられる。一部の例では、プラスミドは、２つ以上の編集配列を含む。例えば、１つの編集配列を使用してＰＡＭ配列を変化させる又はサイレンシングすることができると同時に、第２の編集配列を使用して別個の配列に変異を組み入れることができる。
レコーダ配列は、編集配列挿入部位から分離された部位に挿入することができる。挿入されたレコーダ配列は、編集配列から１ｂｐ〜１Ｍｂｐだけ分離できる。例えば、分離距離は、約１ｂｐ、１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｐ、２ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ又はそれを超える距離であり得る。分離距離は、１ｂｐ〜１０Ｍｂｐの任意の別個の整数であり得る。一部の例では、分離の最大距離は、標的核酸又はゲノムのサイズに依存する。
レコーダ配列は、編集配列に隣接させて又は編集配列の近傍に挿入することができる。例えば、レコーダ配列は、編集配列が挿入されるオープンリーディングフレームの外側に挿入することができる。レコーダ配列は、編集配列が挿入されているオープンリーディングフレームに隣接する非翻訳領域に挿入することができる。レコーダ配列は、機能的に中性又は非機能性の部位に挿入することができる。レコーダ配列は、スクリーニング可能又は選択可能なマーカ遺伝子に挿入することができる。
一部の例では、標的核酸配列は、ゲノム、人工染色体、合成染色体又はエピソームプラスミド内に含まれる。種々の例では、標的核酸配列は、インビトロ又はインビボにあり得る。標的核酸配列がインビボにある場合、プラスミドを宿主生物体に形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、遺伝子銃、ナノ粒子、細胞透過技術又は他の公知のＤＮＡ送達のための方法又はそれらの任意の組合せによって導入することができる。そのような例では、宿主生物体は、真核生物、原核生物、細菌、古細菌、酵母又は他の真菌であり得る。
操作事象は、リコンビニアリング、非相同末端結合、相同組換え又は相同性駆動型修復を含み得る。一部の例では、操作事象をインビトロ又はインビボで実施する。
本明細書に記載の方法は、原核及び真核細胞を含め、ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムが機能する（例えば、ＤＮＡを標的とし、切断する）ことができる任意の細胞型において実行することができる。一部の実施形態では、細胞は、エシェリキア種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの細菌細胞である。他の実施形態では、細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）などの真菌細胞である。他の実施形態では、細胞は、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞又はヒト細胞を含めた哺乳動物細胞である。
本明細書に記載の方法は、原核及び真核細胞を含め、ターゲティング可能なヌクレアーゼシステムが機能する（例えば、ＤＮＡを標的とし、切断する）ことができる任意の細胞型において実行することができる。一部の実施形態では、細胞は、エシェリキア種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの細菌細胞である。他の実施形態では、細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）などの真菌細胞である。他の実施形態では、細胞は、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞又はヒト細胞を含めた哺乳動物細胞である。
一部の例では、細胞は、組換え生物体である。例えば、細胞は、非ネイティブなターゲティング可能なヌクレアーゼシステムを含み得る。加えて又は代わりに、細胞は、組換えシステム機構を含み得る。そのような組換えシステムとしては、ラムダレッド組換えシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ又は他のインテグラーゼシステムを挙げることができる。適切な場合、プラスミドは、選択された組換えシステムが正確に且つ効率的に機能するために必要な相補的な構成成分又は機構を有し得る。
ゲノム編集のための方法は、（ａ）少なくとも１つの編集カセット及び少なくとも１つのガイド核酸をコードするベクターを第１の細胞の集団に導入するステップであって、それによりベクターを含む第２の細胞の集団を作製するステップと、（ｂ）第２の細胞の集団を、核酸誘導型ヌクレアーゼが発現するか又は維持される条件下で維持するステップであって、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ベクター上、第２のベクター上、第２の細胞の集団の細胞のゲノム上にコードされているか、又は他の方法で細胞に導入され、その結果、ＤＮＡ切断及び編集カセットの組み入れがもたらされる、ステップと、（ｃ）生存細胞を得るステップと、（ｄ）第２の細胞の集団の少なくとも１つの細胞内の標的ＤＮＡ分子について配列決定して、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップとを含み得る。
ゲノム編集のための方法は、（ａ）本明細書に開示されているＰＡＭ変異を含む少なくとも１つの編集カセット及び少なくとも１つのガイド核酸をコードするベクターを第１の細胞の集団に導入するステップであって、それによりベクターを含む第２の細胞の集団を作製するステップと、（ｂ）第２の細胞の集団を、核酸誘導型ヌクレアーゼが発現するか又は維持される条件下で維持するステップであって、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ベクター上、第２のベクター上、第２の細胞の集団の細胞のゲノム上にコードされているか、又は他の方法で細胞に導入され、その結果、ＤＮＡ切断、編集カセットの組み入れ及びＰＡＭ変異を含む第２の細胞の集団の細胞は、生存可能であるが、ＰＡＭ変異を含まない第２の細胞の集団の細胞の死がもたらされる、ステップと、（ｃ）生存細胞を得るステップと、（ｄ）第２の細胞の集団の少なくとも１つの細胞内の標的ＤＮＡについて配列決定して、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップとを含み得る。
追跡可能なゲノム編集のための方法は、（ａ）少なくとも１つの編集カセット、少なくとも１つのレコーダカセット及び少なくとも２つのガイド核酸をコードするベクターを第１の細胞の集団に導入するステップであって、それによりベクターを含む第２の細胞の集団を作製するステップと、（ｂ）第２の細胞の集団を、核酸誘導型ヌクレアーゼが発現するか又は維持される条件下で維持するステップであって、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ベクター上、第２のベクター上、第２の細胞の集団の細胞のゲノム上にコードされているか、又は他の方法で細胞に導入され、その結果、ＤＮＡ切断並びに編集及びレコーダカセットの組み入れがもたらされる、ステップと、（ｃ）生存細胞を得るステップと、（ｄ）第２の細胞の集団の少なくとも１つの細胞内の標的ＤＮＡ分子のレコーダ配列について配列決定して、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップとを含み得る。
プラスミドが、ＰＡＭがサイレンシングされるように設計された第２の編集配列を含む一部の例では、追跡可能なゲノム編集のための方法は、（ａ）少なくとも１つの編集カセット、レコーダカセット及び少なくとも２つのガイド核酸をコードするベクターを第１の細胞の集団に導入するステップであって、それによりベクターを含む第２の細胞の集団を作製するステップと、（ｂ）第２の細胞の集団を、核酸誘導型ヌクレアーゼが発現するか又は維持される条件下で維持するステップであって、核酸誘導型ヌクレアーゼは、ベクター上、第２のベクター上、第２の細胞の集団の細胞のゲノム上にコードされているか、又は他の方法で細胞に導入され、その結果、ＤＮＡ切断、編集及びレコーダカセットの組み入れ並びにＰＡＭ変異を含む第２の細胞の集団の細胞は、生存可能であるが、ＰＡＭ変異を含まない第２の細胞の集団の細胞の死がもたらされる、ステップと、（ｃ）生存細胞を得るステップと、（ｄ）第２の細胞の集団の少なくとも１つの細胞内の標的ＤＮＡのレコーダ配列について配列決定して、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップとを含み得る。
一部の例では、形質転換効率を、リコンビニアリング手順の検証及びＣＦＵ／ｎｇの算出を可能にする非ターゲティング対照ガイド核酸を使用することによって決定する。一部の場合、絶対的な効率を、各形質転換プレート上のコロニーの総数をカウントすることにより、例えばｇａｌＫ対照に由来する赤色コロニー及び白色コロニーの両方をカウントすることにより得る。一部の例では、相対的な効率を、対照（例えば、ｇａｌＫ対照）に由来する全てのコロニーのうちの成功した形質転換体（例えば、白色コロニー）の総数によって算出する。
本開示の方法は、例えば、コンビナトリアルライブラリの生成の効率、規模、費用及び／又はそのようなライブラリ生成の精度の１０００×よりも大きい改善をもたらすことができる。
本開示の方法は、ゲノム又はコンビナトリアルライブラリの生成の効率の例えば１０×よりも大きい、５０×よりも大きい、１００×よりも大きい、２００×よりも大きい、３００×よりも大きい、４００×よりも大きい、５００×よりも大きい、６００×よりも大きい、７００×よりも大きい、８００×よりも大きい、９００×よりも大きい、１０００×よりも大きい、１１００×よりも大きい、１２００×よりも大きい、１３００×よりも大きい、１４００×よりも大きい、１５００×よりも大きい、１６００×よりも大きい、１７００×よりも大きい、１８００×よりも大きい、１９００×よりも大きい、２０００×よりも大きい又はそれよりも大きい改善をもたらすことができる。
本開示の方法は、ゲノム又はコンビナトリアルライブラリの生成の規模の例えば１０×よりも大きい、５０×よりも大きい、１００×よりも大きい、２００×よりも大きい、３００×よりも大きい、４００×よりも大きい、５００×よりも大きい、６００×よりも大きい、７００×よりも大きい、８００×よりも大きい、９００×よりも大きい、１０００×よりも大きい、１１００×よりも大きい、１２００×よりも大きい、１３００×よりも大きい、１４００×よりも大きい、１５００×よりも大きい、１６００×よりも大きい、１７００×よりも大きい、１８００×よりも大きい、１９００×よりも大きい、２０００×よりも大きい又はそれよりも大きい改善をもたらすことができる。
本開示の方法は、ゲノム又はコンビナトリアルライブラリの生成の費用の例えば１０分の１よりも大きい、５０分の１よりも大きい、１００分の１よりも大きい、２００分の１よりも大きい、３００分の１よりも大きい、４００分の１よりも大きい、５００分の１よりも大きい、６００分の１よりも大きい、７００分の１よりも大きい、８００分の１よりも大きい、９００分の１よりも大きい、１０００分の１よりも大きい、１１００分の１よりも大きい、１２００分の１よりも大きい、１３００分の１よりも大きい、１４００分の１よりも大きい、１５００分の１よりも大きい、１６００分の１よりも大きい、１７００分の１よりも大きい、１８００分の１よりも大きい、１９００分の１よりも大きい、２０００分の１よりも大きい又はそれよりも大きい低減をもたらすことができる。
本開示の方法は、ゲノム又はコンビナトリアルライブラリ生成の精度の例えば１０×よりも大きい、５０×よりも大きい、１００×よりも大きい、２００×よりも大きい、３００×よりも大きい、４００×よりも大きい、５００×よりも大きい、６００×よりも大きい、７００×よりも大きい、８００×よりも大きい、９００×よりも大きい、１０００×よりも大きい、１１００×よりも大きい、１２００×よりも大きい、１３００×よりも大きい、１４００×よりも大きい、１５００×よりも大きい、１６００×よりも大きい、１７００×よりも大きい、１８００×よりも大きい、１９００×よりも大きい、２０００×よりも大きい又はそれよりも大きい改善をもたらすことができる。
コンビナトリアル操作の反復的追跡
操作の繰り返しラウンドのための方法及び組成物が本明細書に開示される。単一細胞レベルでのＣＲＥＡＴＥレコーディングをいくつかの連続的な操作サイクルで実行することを可能にする反復的操作戦略が本明細書に開示される（例えば、図１８及び図１９）。これらの開示されている方法及び組成物により、複雑な遺伝子型空間を有効に構築及び探究することができる検索に基づく技術を可能にすることができる。反復的及び繰り返し的という用語は、互換的に使用することができる。
操作の繰り返しラウンドのための方法及び組成物が本明細書に開示される。単一細胞レベルでのＣＲＥＡＴＥレコーディングをいくつかの連続的な操作サイクルで実行することを可能にする反復的操作戦略が本明細書に開示される（例えば、図１８及び図１９）。これらの開示されている方法及び組成物により、複雑な遺伝子型空間を有効に構築及び探究することができる検索に基づく技術を可能にすることができる。反復的及び繰り返し的という用語は、互換的に使用することができる。
コンビナトリアル操作方法は、多数ラウンドの操作を含み得る。本明細書に開示されている方法は、２ラウンド以上の操作を含み得る。例えば、方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０ラウンド又は３０ラウンドを超える操作を含み得る。
一部の例では、操作の各ラウンド中、新しいレコーダ配列、例えばバーコードなどが近傍部位で同じ遺伝子座に組み入れられ（例えば、図１８、灰色の棒又は図１９、黒色の棒）、従って、ゲノム全体を通してコンビナトリアル多様性を構築するための多数の操作サイクル後（例えば、図１８、灰色の棒又は図１９、灰色の棒）、各コンビナトリアル遺伝子型を再構築するため又は各ラウンドからの操作された編集が標的部位に組み入れられたことを確認するために、レコーディング遺伝子座の単純なＰＣＲを使用することができる。
操作の連続的なラウンドを選択するための方法が本明細書に開示される。選択は、編集カセットによって組み入れられたＰＡＭ変異により行うことができる。選択は、レコーダカセットによって組み入れられたＰＡＭ変異により行うことができる。選択は、スクリーニング可能な、選択可能な又は対抗選択可能なマーカを使用して行うことができる。選択は、操作の前のラウンドによって組み入れられた編集又はレコーディングのための部位をターゲティングし、それにより操作の両方のラウンド又は前の全てのラウンドに由来する、編集及びレコーダ配列が問題なく組み入れられたバリアントを選択することによって行うことができる。
これらの遺伝子型の定量化は、大集団に対するコンビナトリアルな変異による影響を理解するため及びエピスタシスなどの重要な生物現象を調査するために使用することができる。
連続的な編集及びコンビナトリアルな追跡は、本明細書に開示されている反復的ベクターシステムを使用して実行することができる。これらの反復的ベクターシステムを使用して、形質転換手順を迅速に進めることができる。一部の例では、これらのシステムは、直交性の複製開始点、抗生物質マーカ及びコードされたガイド核酸を含有する２つ以上のプラスミドからなる。各ベクター内のコードされたガイド核酸は、核酸誘導型ヌクレアーゼ媒介性切断による破壊に対する他の耐性マーカの１つを標的とするように設計することができる。これらのシステムは、一部の例では、抗生物質選択圧が、前のプラスミドが除去され、次のラウンドの操作されたゲノムの濃縮が駆動されるように切り換わる形質転換を実施するために使用することができる。形質転換ループを通じて２回以上の継代を実施することができるか、又は換言すると多数ラウンドの操作を実施することができる。必要なレコーディングカセット及び編集カセットの本明細書に開示されている反復的ベクターへの導入を各形質転換ステップにおける高効率での同時のゲノム編集及びプラスミドキュアリングに使用することができる。
一部の例では、本明細書に開示されている反復的ベクターシステムは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又は１０を超えるユニークなプラスミドを含む。一部の例では、反復的ベクターシステムでは、特定のプラスミドを、前のラウンド及び後のラウンドにおいて別個のプラスミドが使用される場合に１回以上使用することができる。
本明細書に開示されている反復的方法及び組成物を使用して、ターゲティングされたゲノム又はプラスミドにおける選択可能又はスクリーニング可能なエレメントの機能を回復させることができる。選択可能又はスクリーニング可能なエレメントとしては、抗生物質抵抗性遺伝子、蛍光遺伝子、ユニークなＤＮＡ配列又はウォーターマーク又は他の公知のレポータ、スクリーニング可能な又は選択可能な遺伝子を挙げることができる。一部の例では、操作の連続的なラウンドそれぞれは選択可能又はスクリーニング可能なエレメントの断片を組み入れることができ、従って操作ラウンドの最後に、選択可能又はスクリーニング可能なエレメント全体が標的ゲノム又はプラスミドに組み入れられている。そのような例では、断片の全て、従って所望の対応する変異の全てが問題なく組み入れられたゲノム又はプラスミドのみを選択又はスクリーニングすることができる。このように、選択又はスクリーニングされた細胞は、操作の繰り返しラウンドの１回１回で編集を組み入れたものが濃縮される。
反復的方法を使用して、操作の連続的なラウンドそれぞれで選択可能又はスクリーニング可能なマーカをオンの位置及びオフの位置又はオフの位置及びオンの位置で切り換えることができる。そのような方法を使用することにより、例えば１つのみのスクリーニング可能又は選択可能なマーカの使用が必要になることにより、入手可能な選択可能又はスクリーニング可能なマーカの保存が可能になる。さらに、短い調節配列又は開始コドン又は非開始コドンを使用して、スクリーニング可能又は選択可能なマーカをオン及びオフにすることができる。そのような短い配列は、合成されたカセット又はポリヌクレオチド内に容易に適合させることができる。
本明細書に開示されている方法及び組成物を使用して操作の１回又は複数回のラウンドを実施することができる。一部の例では、操作の各ラウンドを使用して、前のラウンドの編集と比べてユニークな編集を組み入れる。操作の各ラウンドにより、ユニークなレコーディング配列を組み入れることができる。操作の各ラウンドにより、操作の前のラウンドで使用したプラスミドの除去又はキュアリングをもたらすことができる。一部の例では、操作の各ラウンドのレコーディング配列の成功した組み入れにより、完全且つ機能的な、スクリーニング可能又は選択可能なマーカ又はユニークな配列組合せがもたらされる。
バーコード又はスクリーニング可能若しくは選択可能なマーカなどのレコーディング配列を含むユニークなレコーダカセットを操作の各ラウンドで挿入し、それにより実施された編集又は操作ステップの組合せを示すレコーダ配列を生成することができる。連続的なレコーディング配列を互いに隣接させて挿入することができる。連続的なレコーディング配列を互いとの近傍に挿入することができる。連続的な配列を互いから少し離して挿入することができる。
連続的な配列を互いから少し離して挿入することができる。例えば、連続的なレコーダ配列を挿入し、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００又は１００ｂｐよりも大きく離すことができる。一部の例では、連続的なレコーダ配列は、約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００又は１５００ｂｐよりも大きく離れている。
連続的なレコーダ配列を任意の所望の塩基対の数だけ離すことができ、これは、挿入される連続的なレコーダ配列の数、標的核酸若しくは標的ゲノムのサイズ及び／又は所望の最終的なレコーダ配列の設計に依存し、それにより限定され得る。例えば、収集されたレコーダ配列が機能的なスクリーニング可能又は選択可能なマーカである場合、連続的なレコーディング配列を互いに近傍に及び同じ読み枠内に挿入することができる。収集されたレコーダ配列が配列決定によって同定されるバーコードのユニークなセットであり、コード配列エレメントを有さない場合、連続的なレコーダ配列を、任意の所望の塩基対の数だけそれらを離して挿入することができる。これらの場合、分離距離は、使用される配列決定技術及び読み取り長の限界に依存し得る。
本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態が単に例として提供されていることは、当業者に明白であろう。当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変化形態及び置換形態を直ちに想到するであろう。本明細書に記載の発明の実施形態に対する種々の代替形態を本発明の実施において使用できることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義され、それにより、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物が包含されるものとする。
一部の定義
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者に理解される技術用語であり、変異体又はバリアント形態とは区別される、天然に存在する生物体、株、遺伝子又は特徴の典型的な形態を意味する。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者に理解される技術用語であり、変異体又はバリアント形態とは区別される、天然に存在する生物体、株、遺伝子又は特徴の典型的な形態を意味する。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の提示を意味するものと解釈されるべきである。
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称される）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称される）という用語は、当技術分野で周知である。さらなるガイダンスによると、本明細書で使用される場合、タンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じ又は類似の機能を果たす同じ種のタンパク質である。相同タンパク質は、構造的に関連し得るが、そうである必要はなく、又は部分的にのみ構造的に関連している。タンパク質の「オルソログ」は、本明細書で使用される場合、それがオルソログであるタンパク質と同じ又は類似の機能を果たす異なる種のタンパク質である。オルソロガスなタンパク質は、構造的に関連し得るが、そうである必要はなく、又は部分的にのみ構造的に関連している。相同体及びオルソログは、相同性モデリング（例えば、グリーア（Ｇｒｅｅｒ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２２８巻（１９８５年）ｐ．１０５５及びブランデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ）ら著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ）第１７２巻（１９８８年）、ｐ．５１３）又は「構造ＢＬＡＳＴ」（デイ・Ｆ（Ｄｅｙ Ｆ）、クリフ・チャン・Ｑ（Ｃｌｉｆｆ Ｚｈａｎｇ Ｑ）、ペトリー・Ｄ（Ｐｅｔｒｅｙ Ｄ）、ホニグ・Ｂ（Ｈｏｎｉｇ Ｂ）著、「『構造ＢＬＡＳＴ』に向けて：構造関係を使用して機能を推測（Ｔｏｗａｒｄ ａ “ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＢＬＡＳＴ”：ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｔｏ ｉｎｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、プロテイン・サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．）２０１３年４月、第２２巻、第４号、ｐ．３５９−６６、ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．２２２５）によって特定され得る。
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称される）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称される）という用語は、当技術分野で周知である。さらなるガイダンスによると、本明細書で使用される場合、タンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じ又は類似の機能を果たす同じ種のタンパク質である。相同タンパク質は、構造的に関連し得るが、そうである必要はなく、又は部分的にのみ構造的に関連している。タンパク質の「オルソログ」は、本明細書で使用される場合、それがオルソログであるタンパク質と同じ又は類似の機能を果たす異なる種のタンパク質である。オルソロガスなタンパク質は、構造的に関連し得るが、そうである必要はなく、又は部分的にのみ構造的に関連している。相同体及びオルソログは、相同性モデリング（例えば、グリーア（Ｇｒｅｅｒ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２２８巻（１９８５年）ｐ．１０５５及びブランデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ）ら著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ）第１７２巻（１９８８年）、ｐ．５１３）又は「構造ＢＬＡＳＴ」（デイ・Ｆ（Ｄｅｙ Ｆ）、クリフ・チャン・Ｑ（Ｃｌｉｆｆ Ｚｈａｎｇ Ｑ）、ペトリー・Ｄ（Ｐｅｔｒｅｙ Ｄ）、ホニグ・Ｂ（Ｈｏｎｉｇ Ｂ）著、「『構造ＢＬＡＳＴ』に向けて：構造関係を使用して機能を推測（Ｔｏｗａｒｄ ａ “ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＢＬＡＳＴ”：ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｔｏ ｉｎｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、プロテイン・サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．）２０１３年４月、第２２巻、第４号、ｐ．３５９−６６、ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．２２２５）によって特定され得る。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか又はそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知又は未知の任意の機能を実行し得る。遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。この用語は、合成骨格を有する核酸様構造も包含する。例えば、エクステイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、１９９１年；バセルガ（Ｂａｓｅｒｇａ）ら、１９９２年；ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）、１９９３年；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；国際公開第９６／３９１５４号パンフレット；マタ（Ｍａｔａ）、１９９７年；ストラウス−スーカップ（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ）、１９９７年；及びサムスタッグ（Ｓａｍｓｔａｇ）、１９９６年を参照されたい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの１つ又は複数の改変ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリマーのアセンブリの前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などにより、重合後にさらに改変され得る。
「相補性」とは、従来のワトソン−クリック塩基対合又は他の非従来的なタイプのいずれかにより、核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対合など）を形成できる核酸分子内の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列の同数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド又はそれを超えるヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である相補性の程度を指すか、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
本明細書において、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に相補性を有する核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に配列依存性であり、多くの要因によって異なる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、ティジセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）著、１９９３年、生化学及び分子生物学における実験室技術−核酸プローブによるハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ）パートＩ、第２章「ハイブリダイゼーションの原理及び核酸プローブアッセイの戦略の概要（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ）」（ニューヨーク、エルゼビア社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ））に詳細に記載されている。ポリヌクレオチド配列に言及する場合、相補的又は部分的に相補的な配列も想定される。これらは、高度にストリンジェントな条件下で参照配列にハイブリダイズできることが好ましい。一般に、ハイブリダイゼーション速度を最大化するために、比較的低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が選択される：摂氏約２０〜２５度。熱融点（Ｔｍ）よりも低い。Ｔｍは、特定の標的配列の５０％が、定義されたイオン強度及びｐＨで溶液中の完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。一般に、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を必要とするために、高度にストリンジェントな洗浄条件は、Ｔｍよりも摂氏約５〜１５度低くなるように選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を必要とするために、中程度にストリンジェントな洗浄条件は、Ｔｍよりも摂氏約１５〜３０度低くなるように選択される。高度に許容的である（ストリンジェンシーが非常に低い）洗浄条件は、Ｔｍよりも摂氏５０度も低い場合があり、ハイブリダイズされた配列間で高レベルのミスマッチを許容する。当業者は、標的配列とプローブ配列との間の特定レベルの相同性からの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるために、ハイブリダイゼーション及び洗浄段階における他の物理的及び化学的パラメータも変更できることを認識するであろう。
「ハイブリダイゼーション」は、１つ又は複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック型塩基対合、フーグスティーン結合又は他の任意の配列特有の方法で発生し得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖又はこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始又は酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より広範なプロセスにおけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所与の配列の「補体」と称される。
本明細書で使用される場合、「ゲノム遺伝子座」又は「遺伝子座」（複数の遺伝子座）という用語は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」とは、生物体内で機能する役割を果たすポリペプチド又はＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの区間を指し、従って生物体内の遺伝の分子単位である。本発明の目的のために、遺伝子は、そのような調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているかどうかにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節する領域を含むと考えられ得る。従って、遺伝子には、プロモータ配列、ターミネータ、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレータ、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、機能的遺伝子産物の合成において遺伝子からの情報が使用されるプロセスである。遺伝子発現の産物は、多くの場合にタンパク質であるが、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子などの非タンパク質コード遺伝子では、産物は、機能性ＲＮＡである。遺伝子発現のプロセスは、全ての既知の生命−真核生物（多細胞生物体を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）及びウイルスによって使用され、生き残るための機能的産物を生成する。本明細書で使用される場合、遺伝子又は核酸の「発現」は、細胞遺伝子発現だけでなく、クローニングシステム及び他の文脈における核酸の転写及び翻訳も包含する。本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから転写されるプロセス（ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物など）及び／又は転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスも指す。転写産物及びコードされるポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状又は分岐状であり得、改変アミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断され得る。この用語には、改変されたアミノ酸ポリマーも包含される。例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又は標識成分との結合などの他の任意の操作である。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体の両方を含む天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸並びにアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含む。
本明細書で使用される場合、「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」という用語は、タンパク質鎖の残りの部分とは無関係に存在し機能し得るタンパク質配列の一部を指す。
本発明の態様に記載されるように、配列同一性は、配列相同性に関連する。相同性の比較は、目により、又はより一般的には容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて実行され得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算し、２つ以上のアミノ酸又は核酸配列によって共有される配列同一性も計算し得る。配列相同性は、当技術分野で公知の多数のコンピュータプログラム、例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどのいずれかによって生成され得る。そのようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベネフィット（ＣＧＣ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）パッケージ（米国ウィスコンシン大学、デヴェロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら著、１９８４年、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第１２巻、ｐ．３８７）である。配列比較を実行し得る他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、１９９９年（同上）、第１８章を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（アッチュル（Ａｔｓｃｈｕｌ）ら著、１９９０年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、ｐ．４０３〜４１０）及びジーンワークス（ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ）スイートの比較ツールが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方がオフライン及びオンライン検索に使用できる（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、１９９９年（同上）、ｐ．７−５８〜７−６０を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧベストフィット（ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムを使用することが好ましい。
本発明の態様に記載されるように、配列同一性は、配列相同性に関連する。相同性の比較は、目により、又はより一般的には容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて実行され得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算し、２つ以上のアミノ酸又は核酸配列によって共有される配列同一性も計算し得る。配列相同性は、当技術分野で公知の多数のコンピュータプログラム、例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどのいずれかによって生成され得る。そのようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベネフィット（ＣＧＣ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）パッケージ（米国ウィスコンシン大学、デヴェロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら著、１９８４年、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第１２巻、ｐ．３８７）である。配列比較を実行し得る他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、１９９９年（同上）、第１８章を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（アッチュル（Ａｔｓｃｈｕｌ）ら著、１９９０年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、ｐ．４０３〜４１０）及びジーンワークス（ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ）スイートの比較ツールが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方がオフライン及びオンライン検索に使用できる（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、１９９９年（同上）、ｐ．７−５８〜７−６０を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧベストフィット（ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムを使用することが好ましい。
パーセント相同性は、連続した配列にわたって計算され得る。すなわち、１つの配列を他の配列とアラインし、１つの配列の各アミノ酸又はヌクレオチドを、他の配列の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと一度に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アライメントと呼ばれる。典型的には、このようなギャップなしアライメントは、比較的少数の残基に対してのみ実行される。
これは、非常に単純で一貫性のある方法であるが、例えば他には同一の配列のペアにおいて、１つの挿入又は欠失によって次のアミノ酸残基がアライメントから外れる場合があり、従ってグローバルアライメントを実行すると、％相同性が大幅に低下する可能性がある。従って、大半の配列比較方法は、全体の相同性又は同一性スコアに不当にペナルティを課すことなく、可能な挿入及び欠失を考慮した最適なアライメントを生成するように設計されている。これは、配列のアラインメントに「ギャップ」を挿入することにより、局所的な相同性又は同一性を最大化しようとすることで達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法では、アラインメントで発生する各ギャップに「ギャップペナルティ」が割り当てられるため、同じ数の同一のアミノ酸に対してできる限り少ないギャップでの配列アラインメント（これは、２つの比較される配列間のより高い関連性を反映する）は、ギャップの多いものよりも高いスコアを達成し得る。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ内の後続の各残基に対してより小さいペナルティを課す、「アフィニティギャップコスト」が典型的に使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然のことながら、より少ないギャップで最適化されたアライメントを生成し得る。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティを改変できる。しかしながら、配列比較にこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシンベストフィット（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）パッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップについて−１２、各伸長について−４である。
従って、最大％相同性の計算では、まずギャップペナルティを考慮して最適なアライメントを作成する必要がある。そのようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベネフィット（ＣＧＣ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）パッケージである（デヴェロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら著、１９８４年、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第１２巻、ｐ．３８７）。配列比較を実行し得る他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、１９９９年、分子生物学のショートプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第４版、第１８章を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（アッチュル（Ａｔｓｃｈｕｌ）ら著、１９９０年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、ｐ．４０３〜４１０）及びジーンワークス（ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ）スイートの比較ツールが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方がオフライン及びオンライン検索に使用できる（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、１９９９年、分子生物学のショートプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｐ．７−５８〜７−６０を参照されたい）。しかしながら、一部の用途では、ＧＣＧベストフィット（ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２シーケンシス（ＢＬＡＳＴ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と呼ばれる新しいツールは、タンパク質とヌクレオチド配列とを比較するためにも利用できる（欧州微生物学会連合（ＦＥＭＳ）マイクロバイオロジー・レター（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．）、１９９９年、第１７４巻、第２号、ｐ．２４７−５０；欧州微生物学会連合（ＦＥＭＳ）マイクロバイオロジー・レター（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．）、１９９９年、第１７７巻、第１号、ｐ．１８７−８；及び国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトにある国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを参照されたい）。
最終的な％相同性は、同一性の観点から測定され得るが、アライメントプロセス自体は、典型的にはオールオアナッシングの対の比較に基づくものではない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケーリングされた類似性スコアマトリックスが典型的に使用される。一般的に使用されるこのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。これは、プログラムのＢＬＡＳＴスイートのデフォルトのマトリックスである。ＧＣＧウィスコンシン（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）プログラムでは、一般に、公開されているデフォルト値又はカスタムシンボル比較表（与えられた場合）が使用される（詳細はユーザーマニュアルを参照されたい）。一部の用途について、ＧＣＧパッケージの公開デフォルト値を使用することが好ましいか、又は他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
代わりに、相同性のパーセンテージは、ＣＬＵＳＴＡＬ（ヒギンズ．Ｄ．Ｇ．（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ Ｇ）及びシャープ．Ｐ．Ｍ．（Ｓｈａｒｐ Ｐ Ｍ）、１９８８年、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第７３巻、第１号、ｐ．２３７〜２４４）に類似したアルゴリズムに基づいて、ＤＮＡＳＩＳ（商標）（日立ソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ））のマルチプルアライメント機能を使用して計算し得る。ソフトウェアが最適なアライメントを生成すると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することができる。典型的には、ソフトウェアは、これを配列比較の一部として実行し、数値結果を生成する。
配列は、サイレント変化を生じ、機能的に同等の物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有し得る。アミノ酸の性質（極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は残基の両親媒性など）の類似性に基づいて計画的にアミノ酸置換を行い得るため、これは、アミノ酸を官能基でグループ化するのに役立つ。アミノ酸は、その側鎖のみの特性に基づいてグループ化され得る。しかしながら、変異データも含めるとより便利である。このようにして得られたアミノ酸のセットは、構造上の理由で保存されている可能性がある。これらのセットは、ベン図の形態で記載され得る（リビングストンＣ．Ｄ．（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．）及びバートンＧ．Ｊ．（Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．）、１９９３年、「タンパク質配列アライメント：残基保存の階層分析のための戦略（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」、コンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシズ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．）第９巻、ｐ．７４５〜７５６）（テイラーＷ．Ｒ．（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．）、１９８６年、「アミノ酸保存の分類（Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」、ジャーナル・オブ・セオレティカル・バイオロジー（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．）、第１１９巻、ｐ．２０５〜２１８）。保存的置換は、例えば、一般に受け入れられているアミノ酸のベン図グループを説明する以下の表に従って行われ得る。
本発明の実施形態は、生じ得る相同置換、すなわち塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性などのアミノ酸の場合の同類置換を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含む（置換及び交換は両方、存在するアミノ酸残基又はヌクレオチドの、代替の残基又はヌクレオチドとの交換を意味するために本明細書で使用される）。非相同置換、すなわちあるクラスの残基から別のクラスに、又は代わりにオルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含を含むものも発生し得る。
バリアントアミノ酸配列は、グリシン又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサに加えて、メチル、エチル又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入され得る適切なスペーサ基を含み得る。ペプトイド形態の１つ又は複数のアミノ酸残基の存在を含むさらなる形態のバリエーションは、当業者によって十分に理解され得る。疑義を回避するため、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素ではなく、残基の窒素原子上にあるバリアントアミノ酸残基を指すために使用される。ペプトイド形態のペプチドを調製するためのプロセスは、当技術分野、例えばサイモンＲ．Ｊ．（Ｓｉｍｏｎ Ｒ Ｊ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、１９９２年、第８９巻、第２０号、ｐ．９３６７〜９３７１及びホーウェルＤ．Ｃ．（Ｈｏｒｗｅｌｌ Ｄ Ｃ）、トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、１９９５年、第１３巻、第４号、ｐ．１３２〜１３４で知られている。
本発明の実施は、特に明記しない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学及び組換えＤＮＡの従来技術を使用し、これらは、当業者の技術範囲内である。グリーン（Ｇｒｅｅｎ）及びサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．）、第４版、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、２０１４年）；分子生物学の最新プロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）（Ｆ．Ｍ．オースベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、２０１７年）；分子生物学のショートプロトコル（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、１９９９年）；メソッド・イン・エンザイモロジー（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）（アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．））、ＰＣＲ ２：実践的アプローチ（ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ）（Ｍ．Ｊ．マクファーソン（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ）、Ｂ．Ｄ．ハメス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）及びＧ．Ｒ．テイラー（Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ）編、１９９５年）；抗体、実験マニュアル（ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）、第２版（ハーロ（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ）編、２０１４年）；及び動物細胞の培養：基礎技術マニュアル（ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬＳ：Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＢＡＳＩＣ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ）、第７版（Ｒ．Ｉ．フレッシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編、２０１６年）を参照されたい。
（実施例）
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられており、決して本発明を限定するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に本発明の好ましい実施形態を代表するものであり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、その変更形態及び特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨内に含まれる他の用途を想到するであろう。
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられており、決して本発明を限定するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に本発明の好ましい実施形態を代表するものであり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、その変更形態及び特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨内に含まれる他の用途を想到するであろう。
実施例１．核酸誘導型ヌクレアーゼ
ＭＡＤ１〜ＭＡＤ２０と呼ばれる２０の核酸誘導型ヌクレアーゼの配列（配列番号１〜２０）を整列させ、他の核酸誘導型ヌクレアーゼと比較した。ヌクレアーゼ及び系統樹の特定のアミノ酸の部分的な配列は、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに描かれている。ＰＡＭ部位の認識に関与し得る重要な残基を図１Ａに示す。これらには、位置１６７、５３９、５４８、５９９、６０３、６０４、６０５、６０６及び６０７のアミノ酸が含まれる。
ＭＡＤ１〜ＭＡＤ２０と呼ばれる２０の核酸誘導型ヌクレアーゼの配列（配列番号１〜２０）を整列させ、他の核酸誘導型ヌクレアーゼと比較した。ヌクレアーゼ及び系統樹の特定のアミノ酸の部分的な配列は、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに描かれている。ＰＡＭ部位の認識に関与し得る重要な残基を図１Ａに示す。これらには、位置１６７、５３９、５４８、５９９、６０３、６０４、６０５、６０６及び６０７のアミノ酸が含まれる。
ＮＣＢＩ非冗長性データベースでＭＡＤヌクレアーゼ相同体の調査のためにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使い配列アライメントを作った。ジーニアス１０（Ｇｅｎｅｉｏｕｓ １０）で実行されるデフォルト設定のＭＵＳＣＬＥアライメントアルゴリズムを使用して、複数の配列アライメントをさらに改良した。ＳｐＣａｓ９及びＡｓＣｐｆ１参照配列の各ホモログのパーセント同一性は、これらのグローバルアラインメントからのペアワイズアラインメントマッチングに基づいて計算された。
ゲノムソースシーケンスは、ユニプロット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）結合情報又はデフォルトパラメータを使用するＮＣＢＩのＴＢＬＡＳＴＮ検索を使用し、翻訳一致の全ての可能なフレームを検索して特定された。
他の様々なヌクレアーゼに対するＭＡＤ１〜８及び１０〜１２のパーセント同一性は、表１に要約する。これらのパーセント同一性は、指摘されたタンパク質間の共有アミノ酸配列同一性を表す。
実施例２：ＭＡＤヌクレアーゼの発現
ＭＡＤ１〜ＭＡＤ２０の野生型核酸配列は、それぞれ配列番号２１〜４０を含む。これらのＭＡＤヌクレアーゼを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現についてコドン最適化し、コドン最適化された配列は、配列番号４１〜６０として列挙されている（表２に要約）。
ＭＡＤ１〜ＭＡＤ２０の野生型核酸配列は、それぞれ配列番号２１〜４０を含む。これらのＭＡＤヌクレアーゼを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現についてコドン最適化し、コドン最適化された配列は、配列番号４１〜６０として列挙されている（表２に要約）。
コドン最適化されたＭＡＤ１〜ＭＡＤ２０を、構成的又は誘導性プロモータ（例えば、ｐｒｏＢプロモータ配列番号８３又はｐＢＡＤプロモータ配列番号８１若しくは配列番号８２）及び任意選択の６×−Ｈｉｓタグ（配列番号３７６）を含む発現構築物にクローニングした（例えば、図２）。生成したＭＡＤ１〜ＭＡＤ２０発現構築物は、それぞれ配列番号６１〜８０として提供される。図２に示す発現構築物は、制限／ライゲーションに基づくクローニング又は相同性に基づくクローニングのいずれかによって生成された。
実施例３．ＭＡＤヌクレアーゼと適合する試験ガイド核酸配列
機能するターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を有するために核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合性のあるガイド核酸が必要である。適合性のあるガイド核酸配列、特にガイド核酸の足場配列部分を決定するために複数の手段が取られた。まず、各ＭＡＤヌクレアーゼの内因性遺伝子座をスキャンして、潜在的な足場配列を調べた。ＭＡＤ２などの一部の場合、内因性の足場配列が見つからなかった。従って、ＭＡＤ２と、他のＭＡＤヌクレアーゼの内因性遺伝子座の近くにある足場配列との適合性を試験した。ＭＡＤヌクレアーゼ及び試験された対応する内因性足場配列を表２に示した。
機能するターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を有するために核酸誘導型ヌクレアーゼ及び適合性のあるガイド核酸が必要である。適合性のあるガイド核酸配列、特にガイド核酸の足場配列部分を決定するために複数の手段が取られた。まず、各ＭＡＤヌクレアーゼの内因性遺伝子座をスキャンして、潜在的な足場配列を調べた。ＭＡＤ２などの一部の場合、内因性の足場配列が見つからなかった。従って、ＭＡＤ２と、他のＭＡＤヌクレアーゼの内因性遺伝子座の近くにある足場配列との適合性を試験した。ＭＡＤヌクレアーゼ及び試験された対応する内因性足場配列を表２に示した。
ＭＡＤヌクレアーゼ及び対応するガイド核酸の機能を評価するために、図３に示すような編集カセットを作成した。各編集カセットは、編集配列及びコードされたガイド核酸に作動可能に連結されたプロモータを含む。編集カセットは、フランキング末端にプライマー部位（Ｐ１及びＰ２）をさらに含む。ガイド核酸は、試験対象の様々な足場配列と、編集のために標的配列にＭＡＤヌクレアーゼを誘導するガイド配列とを含んでいた。編集配列は、ＰＡＭ変異及び／又は標的配列に関連するコドン変異を含んでいた。変異は、切断された標的配列への組換えを可能にする相同性領域（ホモロジーアーム又はＨＡ）に隣接していた。
図４は、異なるＭＡＤヌクレアーゼ及びガイド核酸の組合せを試験するために設計された実験を示す。ＭＡＤヌクレアーゼをコードする発現カセットは、上記のように様々な編集カセットと共に宿主細胞に追加された。この実施例では、宿主細胞のｇａｌＫ遺伝子を標的とするようにガイド核酸が操作され、遺伝子を遮断するためにターゲティングされたｇａｌＫ遺伝子を変異させるように編集配列を設計し、それにより編集に成功した細胞のスクリーニングを可能にした。この設計は、機能的又は適合するＭＡＤヌクレアーゼ及びガイド核酸の組合せの同定に使用された。編集効率は、回収された細胞の編集プラスミドをハイスループットで測定するためにｑＰＣＲによって決定された。ＭＡＤ１１及びＣａｓ９プライマーの特異性の検証を図１４Ａ及び１４Ｂに示す。これらの結果は、選択されたプライマーペアが直交しており、インプットプラスミドＤＮＡの定量的測定を可能にしていることを示す。
図５Ａ〜５Ｂは、同様の実験計画による実験の描写である。この場合、編集カセット（図５Ｂ）は、選択マーカ、この場合にはカナマイシン耐性（ｋａｎ）をさらに含み、ＭＡＤヌクレアーゼ発現ベクター（図５Ａ）は、選択マーカ、この場合にはクロラムフェニコール耐性（Ｃｍ）及び標的配列への編集配列の相同組換え（ＨＲ）を補助するためのラムダＲＥＤ組換えシステムをさらに含む。適合するＭＡＤヌクレアーゼ及びガイド核酸の組合せは、ＰＡＭ配列が存在する場合、標的配列において二本鎖切断を引き起こすであろう。編集配列（図３など）には、ＭＡＤヌクレアーゼによって認識されないＰＡＭ変異が含まれているため、ＰＡＭ変異を含む編集された細胞は、ＭＡＤヌクレアーゼによる切断を生き残るが、野生型の非編集細胞は、死滅する（図５Ｃ）。編集配列は、編集された細胞のスクリーニングを可能にするｇａｌＫ遺伝子の変異をさらに含むが、ＭＡＤヌクレアーゼ発現ベクター及び編集カセットは、編集された細胞の選択を可能にする薬物選択マーカを含む。
これらの方法を使用して、ＭＡＤ１〜ＭＡＤ２０に適合するガイド核酸を試験した。２０の足場配列が試験された。実験で使用したガイド核酸は、足場−１、足場−２などと呼ばれる２０の足場配列の１つ及びｇａｌＫ遺伝子を標的とするガイド配列を含んでいた。足場−１〜足場−２０の配列は、それぞれ配列番号８４〜１０３として列挙されている。本開示を読むと当業者に明らかであるように、ガイド核酸のガイド配列は、可変であり、任意の所望の標的配列を標的とするように操作又は設計され得ることを理解するべきである。ＭＡＤ２には、試験するための内因性の足場配列がないため、相同性の高いヌクレアーゼからの足場配列（足場−２、配列番号８５）が試験され、機能しないことが確認された。すなわち、ＭＡＤ２及び足場−２は、適合しない。従って、ＭＡＤ２及び他のＭＡＤヌクレアーゼ間の配列相同性が低いにもかかわらず、ＭＡＤ２は、１９の他の足場配列で試験された。
このワークフローは、特定のＭＡＤヌクレアーゼと適合するＰＡＭ配列を識別又は試験するためにも使用された。ＰＡＭサイトを識別する別の方法について、以下の実施例で説明する。
一般に、記載されているアッセイについて以下のように形質転換を実施した。コドン最適化ＭＡＤヌクレアーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を一晩増殖させた。飽和培養物を１／１００に希釈し、ＯＤ６００が０．６になるまで成長させ、０．４％のファイリング濃度でアラビノースを添加し、（温度感受性プラスミドを使用する場合）振盪水浴で培養物を摂氏４２度にシフトすることにより誘導した。誘導後、細胞を氷上で１５分間冷却し、１０％グリセロールを含む当初の培養液の１／４で３回洗浄した（例えば、５０ｍＬで２００ｍＬ培養物を洗浄）。細胞を初期容量の１／１００で再懸濁（例えば、２００ｍＬの培養液では２ｍＬ）し、使用するまで摂氏−９０度で保存した。ここで説明した適合性及び編集効率のスクリーンを実行するために、エレクトロポレーションによって５０ｎｇの編集カセットが細胞アリコートに形質転換された。エレクトロポレーション後、細胞を３時間ＬＢで回収し、１００μＬの細胞を、１％ガラクトースを含むマッコンキープレートにプレーティングした。
編集効率は、白いコロニー（編集された細胞）の数を白いコロニー及び赤いコロニー（編集された細胞及び編集されていない細胞）の総数で割ることによって決定された。
実施例４．ＰＡＭ選択アッセイ
標的配列に二本鎖切断を生成するには、ガイド核酸が標的配列にハイブリダイズし、ＭＡＤヌクレアーゼが、標的配列に隣接するＰＡＭ配列を認識しなければならない。ガイド核酸が標的配列にハイブリダイズするが、ＭＡＤヌクレアーゼがＰＡＭ部位を認識しない場合、切断は、起こらない。
実施例４．ＰＡＭ選択アッセイ
標的配列に二本鎖切断を生成するには、ガイド核酸が標的配列にハイブリダイズし、ＭＡＤヌクレアーゼが、標的配列に隣接するＰＡＭ配列を認識しなければならない。ガイド核酸が標的配列にハイブリダイズするが、ＭＡＤヌクレアーゼがＰＡＭ部位を認識しない場合、切断は、起こらない。
ＰＡＭは、ＭＡＤヌクレアーゼに特異的であり、必ずしも全てのＭＡＤヌクレアーゼが同じＰＡＭを認識するわけではない。ＭＡＤヌクレアーゼに対するＰＡＭ部位の必要条件を評価するために、図６Ａ〜６Ｃに示すアッセイを実施した。
他の箇所に記載されているように、図６Ａは、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びラムダＲＥＤ組換えシステムも含むＭＡＤヌクレアーゼ発現ベクターを示す。
図６Ｂは、セルフターゲティング編集カセットを示す。ガイド核酸は、同じ核酸分子に含まれる標的配列を標的とするように設計されている。標的配列には、Ｎ４で示されるランダムなヌクレオチドが隣接する。これは、標的配列の両端にある４つのランダムなヌクレオチドを意味する。任意の数のランダムヌクレオチドも使用でき得ることを理解すべきである（例えば、３、５、６、７、８など）。ランダムなヌクレオチドは、潜在的なＰＡＭのライブラリとして機能する。
図６Ｂは、セルフターゲティング編集カセットを示す。ガイド核酸は、同じ核酸分子に含まれる標的配列を標的とするように設計されている。標的配列には、Ｎ４で示されるランダムなヌクレオチドが隣接する。これは、標的配列の両端にある４つのランダムなヌクレオチドを意味する。任意の数のランダムヌクレオチドも使用でき得ることを理解すべきである（例えば、３、５、６、７、８など）。ランダムなヌクレオチドは、潜在的なＰＡＭのライブラリとして機能する。
図６Ｃは、実験計画を示す。基本的に、ＭＡＤヌクレアーゼ発現ベクター及びランダムＰＡＭ部位を含む編集カセットは、宿主細胞に形質転換された。機能的なターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体が形成され、ＭＡＤヌクレアーゼがＰＡＭ部位を認識した場合、編集カセットベクターが切断され、細胞死を引き起こす。機能的なターゲティング可能な複合体が形成されなかった場合又はＭＡＤヌクレアーゼがＰＡＭを認識しなかった場合、標的配列は、切断されず、細胞は、生き残った。検出メカニズム（次世代シーケンス（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）など）を使用して開始細胞集団及び最終細胞集団を配列決定し、特定のＭＡＤヌクレアーゼによって認識されたＰＡＭサイトを特定した。次に、特定のＭＡＤヌクレアーゼのコンセンサス又は非コンセンサスＰＡＭを決定するために、これらの認識されたＰＡＭ部位を使用した。
ＭＡＤ１〜ＭＡＤ８及びＭＡＤ１０〜ＭＡＤ１２のコンセンサスＰＡＭは、ＴＴＴＮであると決定された。ＭＡＤ９のコンセンサスＰＡＭは、ＮＮＧであると決定された。ＭＡＤ１３〜ＭＡＤ１５のコンセンサスＰＡＭは、ＴＴＮであると決定された。ＭＡＤ１６〜ＭＡＤ１８のコンセンサスＰＡＭは、ＴＡであると決定された。ＭＡＤ１９〜ＭＡＤ２０のコンセンサスＰＡＭは、ＴＴＣＮであると決定された。
実施例５：異種ガイド核酸の試験
編集効率は、ＭＡＤ１、ＭＡＤ２及びＭＡＤ７で試験され、図７に示されている。実験の詳細及び編集効率は、表３に要約されている。編集された細胞の数を、回収された細胞の総数で割ることにより編集効率を決定した。編集細胞のスクリーニングを可能にするために、ｇａｌＫ遺伝子をターゲティングする様々な編集カセットが使用された。編集カセットにコードされたガイド核酸は、表３に要約されているように、示されたＭＡＤヌクレアーゼと示された足場配列との適合性を試験するために、ｇａｌＫ遺伝子をターゲティングするガイド配列及び様々な足場配列の１つを含んでいた。
編集効率は、ＭＡＤ１、ＭＡＤ２及びＭＡＤ７で試験され、図７に示されている。実験の詳細及び編集効率は、表３に要約されている。編集された細胞の数を、回収された細胞の総数で割ることにより編集効率を決定した。編集細胞のスクリーニングを可能にするために、ｇａｌＫ遺伝子をターゲティングする様々な編集カセットが使用された。編集カセットにコードされたガイド核酸は、表３に要約されているように、示されたＭＡＤヌクレアーゼと示された足場配列との適合性を試験するために、ｇａｌＫ遺伝子をターゲティングするガイド配列及び様々な足場配列の１つを含んでいた。
適合するＭＡＤヌクレアーゼ及びガイド核酸（示された足場配列を含む）の編集効率は、７５〜１００％の編集効率を有することが観察された。ＭＡＤ２は、７５〜１００％の編集効率であり、ＭＡＤ７は、９７〜１００％の編集効率であった。
これらの実験でＭＡＤ２と足場−１、足場−２、足場−４又は足場−１３とを組み合わせると、編集効率が０％になる。これらのデータは、ＭＡＤ２がこれらの試験されたガイド核酸と機能的複合体を形成しなかったこと、及びＭＡＤ２がこれらの足場配列と適合しないことを意味する。これらの実験でＭＡＤ７と足場−１、足場−２、足場−４又は足場−１３とを組み合わせると、編集効率が０％になる。これらのデータは、ＭＡＤ７がこれらの試験されたガイド核酸と機能的複合体を形成しなかったこと、及びＭＡＤ７がこれらの足場配列と適合しないことを意味する。従って、本開示のシステム及び方法において有用なガイド核酸は、実験的データを使用して特定することができ、本開示で教示された方法を使用する場合、当業者による妥当な実験が必要であろう。
ＭＡＤ１の場合、試験したガイド核酸の組合せは、全て編集効率が０％であり、ＭＡＤ１は、試験したガイド核酸のいずれとも機能的複合体を形成しなかったことを意味する。これらのデータは、ＭＡＤ１が試験した足場配列と適合しないことも意味する。
合わせて、これらのデータは、機能的なターゲティング可能なヌクレアーゼ複合体を形成するために、適合するＭＡＤヌクレアーゼ及び足場配列のペアを見つけることの予測不可能性を強調している。一部の試験したＭＡＤヌクレアーゼは、試験した足場配列のいずれとも機能しなかった。一部の試験したＭＡＤヌクレアーゼは、一部の試験した足場配列でのみ機能し、他では機能しなかった。
実施例６．ＭＡＤ２及びＭＡＤ７の評価
上記と同様の実験設計を使用して、異種ガイド核酸で機能するＭＡＤ２及びＭＡＤ７の能力を試験した。ＭＡＤ２と他の足場配列との適合性を試験し、その実験結果を図８に示す。この実験で使用したＭＡＤヌクレアーゼ、ガイド核酸足場配列及び編集配列を表４に要約する。
上記と同様の実験設計を使用して、異種ガイド核酸で機能するＭＡＤ２及びＭＡＤ７の能力を試験した。ＭＡＤ２と他の足場配列との適合性を試験し、その実験結果を図８に示す。この実験で使用したＭＡＤヌクレアーゼ、ガイド核酸足場配列及び編集配列を表４に要約する。
ＭＡＤ７と他の足場配列との適合性を試験し、その実験結果を表９に示す。この実験で使用したＭＡＤヌクレアーゼ、ガイド核酸足場配列及び編集配列を表５に要約する。
別の実験では、編集コロニー（白色コロニー、編集されたｇａｌＫ遺伝子）対総コロニーの比率を計算することにより、編集効率（図１０Ａ）が決定された。形質転換効率（図１０Ｂ）は、細胞の開始数と比較した回収された細胞の総数を計算することにより決定された。
この実施例（図１０Ａ〜１０Ｂ）では、ＭＡＤ２又はＭＡＤ７のいずれかを発現する発現構築物及びｇａｌＫ遺伝子をターゲティングするガイド核酸を含む対応する編集カセットで、ｇａｌＫを発現する細胞を形質転換した。ガイド核酸は、ｇａｌＫ遺伝子をターゲティングするガイド配列及び足場−１２配列（配列番号９５）から構成されていた。
示された実施例では、ＭＡＤ２及びＭＡＤ７は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９と比較して低い形質転換効率であるが、ＭＡＤ２及びＭＡＤ７の編集効率は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９より若干高かった。
編集の実験からコロニーを回収し、編集の存在を確認するために代表的な数をＮＧＳにかけた。図１１は、上記のアッセイから回収されたこれらの選択コロニーからの配列決定結果を示す。標的配列は、ｇａｌＫコード配列（ＣＤＳ）にあった。ＴＴＴＮ ＰＡＭは、逆相補体（野生型ＮＡＡＡ、変異ＮＧＡＡ）と表示される。編集配列の対象となる変異は、標的コドンとして標識されている。野生型配列と比較した変更が強調表示されている。これらの実験では、足場−１２配列（配列番号９５）を使用した。ガイド核酸のガイド配列は、ｇａｌＫ遺伝子を標的とした。
ＭＡＤ２実験で示された７つの配列のうちの６つは、設計されたＰＡＭ変異及びｇａｌＫの標的コドンに設計された変異を含んでおり、１つの配列コロニーは野生型ＰＡＭ及び野生型標的コドンを維持しながら、標的部位の上流に意図しない変異も含む。
ＭＡＤ７実験からの４つの示された配列のうちの２つは、設計されたＰＡＭ変異及び変異した標的コドンを含んでいた。１つのコロニーは、野生型配列を含み、もう１つのコロニーは、標的配列の上流に８つのヌクレオチドの欠失を含んでいた。
図１２は、編集された細胞の回収を補助する選択機能を試験する２つの実験結果を示す。本実験例では、ＭＡＤ２ヌクレアーゼは、足場−１１配列及びｇａｌＫをターゲティングするガイド配列を含むガイド核酸と共に使用された。編集カセットは、ｇａｌＫにＬ８０＊＊変異を組み込むように設計された編集配列を含み、それにより編集された細胞のスクリーニングを可能にした。本実験例１では、ＭＡＤ２ヌクレアーゼは、足場−１２配列及びｇａｌＫをターゲティングするガイド配列を含むガイド核酸と共に使用された。編集カセットは、ｇａｌＫにＬ１０ＫｐｎＩ変異を組み込むように設計された編集配列を含んでいた。両方の実験において、ＭＡＤ２と適合しないガイド核酸を使用したネガティブコントロールプラスミドが形質転換に含まれた。形質転換後、適合性のない編集カセット（ネガティブコントロール）に対する適合性編集カセット（足場−１１又は足場−１２ガイド核酸を含むもの）の比率を測定した。実験は、選択の存在下又は不存在下で行われた。結果は、適合しない編集カセットと比較して、適合する編集カセット含有細胞がより回収されたことを示す。この結果は、選択を使用すると拡大される。
実施例７．ガイド核酸の特性評価
足場１〜８及び１０〜１２の配列（配列番号８４〜９１及び９３〜９５）を整列させ、図１３に示した。コンセンサス配列に一致するヌクレオチドは、色調が薄いが、コンセンサス配列と異なるヌクレオチドは、明確に見える。予測されたシュードノット領域が示されている。理論に拘束されることなく、シュードノットの５’領域は、核酸誘導型ヌクレアーゼの結合及び／又は動態に影響を与える可能性がある。図１３に示されるように、一般に、シュードノット領域外の配列と比較して、シュードノット領域内の足場配列（例えば、配列番号１７２〜１８１）間の多様性は、少ないようである。
足場１〜８及び１０〜１２の配列（配列番号８４〜９１及び９３〜９５）を整列させ、図１３に示した。コンセンサス配列に一致するヌクレオチドは、色調が薄いが、コンセンサス配列と異なるヌクレオチドは、明確に見える。予測されたシュードノット領域が示されている。理論に拘束されることなく、シュードノットの５’領域は、核酸誘導型ヌクレアーゼの結合及び／又は動態に影響を与える可能性がある。図１３に示されるように、一般に、シュードノット領域外の配列と比較して、シュードノット領域内の足場配列（例えば、配列番号１７２〜１８１）間の多様性は、少ないようである。
実施例８．ＭＡＤヌクレアーゼの編集効率
プレートに基づく編集効率アッセイ及び分子編集効率アッセイを使用して、様々なＭＡＤヌクレアーゼ及びガイド核酸の組合せの編集効率を試験した。
プレートに基づく編集効率アッセイ及び分子編集効率アッセイを使用して、様々なＭＡＤヌクレアーゼ及びガイド核酸の組合せの編集効率を試験した。
図１５は、足場−１２及びｇａｌＫをターゲティングするガイド配列を含むガイド核酸と共にＭＡＤ２ヌクレアーゼを使用する分子編集効率アッセイを使用して得られたデータの定量化を示す。示された変異は、変異を含む対応する編集カセットを使用してｇａｌＫに組み込まれた。図１６は、前述の白色コロニーと赤色コロニーとを使用したプレートに基づくアッセイ及び分子編集効率アッセイによって決定された編集効率の比較を示す。図１６に示すように、２つの別々のアッセイで決定された編集効率は、一致している。
実施例９．追跡可能な編集
遺伝子編集は、バーコードを使用して追跡できる。本明細書に記載されているように、バーコードを編集部位内又はその近くに組み込むことができる。各ラウンドで異なる編集が行われる操作を複数回繰り返されている場合、各ラウンドの操作で共通領域にバーコードを挿入することが有益であり得る。このようにして、単一部位を配列決定でき、編集された各部位を個別に配列決定する必要なく、各ラウンドからバーコードの全ての配列を得ることができる。図１７Ａ及び１７Ｃ、１８及び１９は、このような追跡可能な操作ワークフローの例を示す。
遺伝子編集は、バーコードを使用して追跡できる。本明細書に記載されているように、バーコードを編集部位内又はその近くに組み込むことができる。各ラウンドで異なる編集が行われる操作を複数回繰り返されている場合、各ラウンドの操作で共通領域にバーコードを挿入することが有益であり得る。このようにして、単一部位を配列決定でき、編集された各部位を個別に配列決定する必要なく、各ラウンドからバーコードの全ての配列を得ることができる。図１７Ａ及び１７Ｃ、１８及び１９は、このような追跡可能な操作ワークフローの例を示す。
図１７Ａに示すように、ＭＡＤヌクレアーゼを発現する細胞は、編集カセット及びレコーディングカセットを含むプラスミドで形質転換される。編集カセットには、ＰＡＭ変異と遺伝子編集が含まれている。レコーダカセットは、バーコード、この場合には試験された配列に固有の１５ｎｔバーコードを備えている。編集カセット及びレコーディングカセットの両方は、それぞれ明確な標的配列へのガイド核酸を含む。そのようなプラスミドのライブラリ内では、各ラウンドのレコーダカセットに同じガイド核酸を含めることができる。そのため、いずれの編集カセット及び対応する遺伝子編集が使用されているかに関係なく、最初のラウンドのバーコードが全てのバリアントと同じ場所に挿入される。ただし、バーコードの配列決定によって編集が識別できるように、バーコード及び編集カセット間の相関関係は、事前に決定される。図１７Ｂは、１５ｎｔバーコードを組み込んでＰＡＭ部位を欠失するように設計されたレコーディングカセットの例を示す。野生型ＰＡＭ配列を含む細胞は、死滅するが、変異ＰＡＭ細胞は、細胞死を逃れるため、欠失されたＰＡＭは、編集された細胞を濃縮するために使用される。
同様のアプローチを図１８に示す。この場合、各ラウンドからのレコーダカセットは、前のラウンドに隣接する配列を標的とするように設計されており、毎回、新しいＰＡＭ部位がレコーダカセットにより欠失される。結果は、各ラウンドからのバーコードを含むバーコード配列で、行われた操作の各ラウンドを確認して、細胞に含まれる変異の組合せ及び変異が行われた順序を決定するために配列決定することができる。連続する各レコーダカセットは、前ラウンドからの変異ＰＡＭを含む領域の一端が相同になるように設計されることが可能である。これにより、実験終了時に完全に編集された細胞を取得する効率が向上し得る。他の実施例では、レコーダカセットは、以前のレコーダカセットによって組み込まれた固有のランディング部位を標的とするように設計されている。これにより、後続のレコーダカセット及びバーコードは、以前の一連の操作を正常に完了した細胞のみを標的にできるため、全ての所望された変異を含む細胞の回収効率が向上する。
図１９は、選択可能なマーカの再利用を可能にするか、又はそれ以外の場合には以前の一連の操作を形成するプラスミドの細胞を修復させる別のアプローチを示す。この場合、選択マーカ又はプラスミド内の他の特殊な配列を標的とするように設計されたガイド核酸を含む形質転換されたプラスミドは、以前の一連の操作を形成する。
実施例１０．プラスミドベースのＰＡＭ（ｐＰＡＭ）ライブラリ設計
ｐＰＡＭ標的ライブラリは、標的配列の５’末端及び３’末端に縮重ヌクレオチドが隣接する個々のスペーサ配列を取ることにより設計された。Ｎ４−ＳＰＡＣＥＲＮ＝２０−Ｎ４及びＮ５−ＳＰＡＣＥＲＮ＝２０−Ｎ３の配置形式が使用された。これらの配列は、指定された位置（Ｎ３、Ｎ４及びＮ５など）に縮重を有する単一のオリゴヌクレオチドとして順序付けられた。オリゴヌクレオチドを増幅し、標的ライブラリに一致するスペーサを含むｇＲＮＡベクターにクローン化して、競合的成長状況で枯渇する自己ターゲティングｇＲＮＡベクターを作成した（図２０）。１つの実験では、合計８つの異なるスペーサ配列が、それぞれの標的に一致するように設計されたｇＲＮＡを含むベクターにクローニングされた。
ｐＰＡＭ標的ライブラリは、標的配列の５’末端及び３’末端に縮重ヌクレオチドが隣接する個々のスペーサ配列を取ることにより設計された。Ｎ４−ＳＰＡＣＥＲＮ＝２０−Ｎ４及びＮ５−ＳＰＡＣＥＲＮ＝２０−Ｎ３の配置形式が使用された。これらの配列は、指定された位置（Ｎ３、Ｎ４及びＮ５など）に縮重を有する単一のオリゴヌクレオチドとして順序付けられた。オリゴヌクレオチドを増幅し、標的ライブラリに一致するスペーサを含むｇＲＮＡベクターにクローン化して、競合的成長状況で枯渇する自己ターゲティングｇＲＮＡベクターを作成した（図２０）。１つの実験では、合計８つの異なるスペーサ配列が、それぞれの標的に一致するように設計されたｇＲＮＡを含むベクターにクローニングされた。
実施例１１．方法
標的ライブラリのクローニング
ＰＡＭ及びスペーサモチーフの特異性を分析するために使用された全ての標的ライブラリは、単鎖重複オリゴプールの増幅により所望のクローニング部位にクローニングされた。クローニングのための直鎖化された主鎖は、挿入アンプリコンと適合する重複を有するＰＣＲ増幅及び親ベクターの混入を排除するために消化されたｄｐｎＩによって生成された。直鎖化された主鎖及び挿入プールは、ギブソンアセンブリを介してクローン化された（製造元のプロトコルに従ってギブソンアセンブリマスターミックス又はＮＥＢビルダーＨｉＦｉＤＮＡアセンブリキットのいずれかを使用）。ペトリ皿内の脱イオン水に浮かべた０．０２５μｍ透析膜を使用して、各ギブソンアセンブリの半分を３０分間脱塩した。これを使用して、イークローニ １０Ｇスプリームコンピテント細胞（Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ ｓｕｐｒｅｍｅ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を形質転換し、ＬＢで１時間回収した。回収された形質転換の１％（１０μＬ）を希釈に基づくプレーティングに使用して、クローニング反応ごとのＣＦＵ及びライブラリカバレッジを推定した。ＣＦＵカウントがライブラリサイズの１０倍未満の場合、クローニングを繰り返して、所望の配列スペースの完全なカバレッジを確保した。残りの回収量は、１００μｇ／ｍＬカルベネシリンを含む２５ｍＬの一晩培養液に移し、クローン化されたライブラリを複製するための選択圧を維持した。
標的ライブラリのクローニング
ＰＡＭ及びスペーサモチーフの特異性を分析するために使用された全ての標的ライブラリは、単鎖重複オリゴプールの増幅により所望のクローニング部位にクローニングされた。クローニングのための直鎖化された主鎖は、挿入アンプリコンと適合する重複を有するＰＣＲ増幅及び親ベクターの混入を排除するために消化されたｄｐｎＩによって生成された。直鎖化された主鎖及び挿入プールは、ギブソンアセンブリを介してクローン化された（製造元のプロトコルに従ってギブソンアセンブリマスターミックス又はＮＥＢビルダーＨｉＦｉＤＮＡアセンブリキットのいずれかを使用）。ペトリ皿内の脱イオン水に浮かべた０．０２５μｍ透析膜を使用して、各ギブソンアセンブリの半分を３０分間脱塩した。これを使用して、イークローニ １０Ｇスプリームコンピテント細胞（Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ ｓｕｐｒｅｍｅ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を形質転換し、ＬＢで１時間回収した。回収された形質転換の１％（１０μＬ）を希釈に基づくプレーティングに使用して、クローニング反応ごとのＣＦＵ及びライブラリカバレッジを推定した。ＣＦＵカウントがライブラリサイズの１０倍未満の場合、クローニングを繰り返して、所望の配列スペースの完全なカバレッジを確保した。残りの回収量は、１００μｇ／ｍＬカルベネシリンを含む２５ｍＬの一晩培養液に移し、クローン化されたライブラリを複製するための選択圧を維持した。
一晩の回収後、各ライブラリクローニング反応から２ｘ１ｍＬアリコート採取し、グリセロールストックとして保存した。残りの２３ｍＬの培養液をペレット化し、キアゲンプラスミドプラスミディキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出するために使用した。このＤＮＡは、提示されたデータを得るためにその後の形質転換に使用された。
ｇＲＮＡ枯渇研究のためのコンピテントセルの調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５への編集プラスミドであるｇＲＮＡ枯渇のためのコンピテントセルを準備する。編集用プラスミドは、目的とする温度誘導性ＲＮＡヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、アラビノース誘導性λＲＥＤオペロン及びクロラムフェニコール耐性マーカを含んでいた。一晩増殖させた後、飽和ＲＧＥＮ含有細胞株を、１／１００希釈で、５００ｍＬバッフル付き振盪フラスコ中の２５０ｍＬのＬＢ＋２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールに導入した。接種された培養物を０．５〜０．８ＯＤまで増殖させ、４２℃の振盪水浴に移してＲＧＥＮ発現を誘導した。４２℃の誘導細胞に続いて、氷上に１０分間置いた。次いで、細胞を１００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ又は１０％グリセロールで３回洗浄した。最終洗浄ステップ後、細胞を２．５ｍＬ（又は総培養液量の１００分の１）の１０％グリセロールに再懸濁し、２００μＬずつ分注して、−８０°Ｃで保存した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５への編集プラスミドであるｇＲＮＡ枯渇のためのコンピテントセルを準備する。編集用プラスミドは、目的とする温度誘導性ＲＮＡヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、アラビノース誘導性λＲＥＤオペロン及びクロラムフェニコール耐性マーカを含んでいた。一晩増殖させた後、飽和ＲＧＥＮ含有細胞株を、１／１００希釈で、５００ｍＬバッフル付き振盪フラスコ中の２５０ｍＬのＬＢ＋２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールに導入した。接種された培養物を０．５〜０．８ＯＤまで増殖させ、４２℃の振盪水浴に移してＲＧＥＮ発現を誘導した。４２℃の誘導細胞に続いて、氷上に１０分間置いた。次いで、細胞を１００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ又は１０％グリセロールで３回洗浄した。最終洗浄ステップ後、細胞を２．５ｍＬ（又は総培養液量の１００分の１）の１０％グリセロールに再懸濁し、２００μＬずつ分注して、−８０°Ｃで保存した。
ｇＲＮＡ枯渇法
各ｇＲＮＡ枯渇実験は、ＲＧＥＮ含有コンピテントセルの単一の２００μＬのアリコートを使用して行った。細胞のこのアリコートを、冷却した２ｃｍのギャップキュベットに分注し、ネッパジーンシステムを使用してエレクトロポレーションを実行した。エレクトロポレーションは、２４００Ｖの転送パルス及び２０の１５０Ｖパルスを混合し使用した。実験フォルダに記載されているように、各形質転換は、５０〜５００ｎｇの所望のライブラリで実行された。２時間の回収後、１％の形質転換体をスポットプレーティングして形質転換効率（すなわち総ＣＦＵ）を決定し、残りの形質転換ボリュームは、１００ｍＬの増殖培養物に接種するために使用された。１ｍＬのアリコートを取り出すことにより、種々の時点で培養物をサンプリングし、下流のシーケンス用にキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のキアプレップミニプレップキット（ＱｉａＰｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を使用してＤＮＡ抽出を実行した。
各ｇＲＮＡ枯渇実験は、ＲＧＥＮ含有コンピテントセルの単一の２００μＬのアリコートを使用して行った。細胞のこのアリコートを、冷却した２ｃｍのギャップキュベットに分注し、ネッパジーンシステムを使用してエレクトロポレーションを実行した。エレクトロポレーションは、２４００Ｖの転送パルス及び２０の１５０Ｖパルスを混合し使用した。実験フォルダに記載されているように、各形質転換は、５０〜５００ｎｇの所望のライブラリで実行された。２時間の回収後、１％の形質転換体をスポットプレーティングして形質転換効率（すなわち総ＣＦＵ）を決定し、残りの形質転換ボリュームは、１００ｍＬの増殖培養物に接種するために使用された。１ｍＬのアリコートを取り出すことにより、種々の時点で培養物をサンプリングし、下流のシーケンス用にキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のキアプレップミニプレップキット（ＱｉａＰｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）を使用してＤＮＡ抽出を実行した。
一般的なＮＧＳの準備及び分析
プラスミドのミニプレップは、実験インデックス付きプライマーで増幅された。アンプリコンをプールして、予想される読み取り数を標準化し、ＭｉＳｅｑ／ＮｅｘｔＳｅｑ機器にロードする前にゲル精製した。次に、インデックス化されたｆａｓｔｑ読み取りファイルは、実験デザインから１００％の同一性を有すると予想されるバリアントに対してマッピングされ、データに見られる比較分析を実行するためにカウントが集計される。全てのカウントは、ｅｑｎによって頻度を正規化された。Ｖｆ＝（Ｖカウント）／（合計カウント）ここで、Ｖｆは、特定のインデックスのバリアントの頻度であり、Ｖカウントは、そのバリアントで見られるカウントであり、合計カウントは、実験インデックス全体で観測された合計カウントである。
プラスミドのミニプレップは、実験インデックス付きプライマーで増幅された。アンプリコンをプールして、予想される読み取り数を標準化し、ＭｉＳｅｑ／ＮｅｘｔＳｅｑ機器にロードする前にゲル精製した。次に、インデックス化されたｆａｓｔｑ読み取りファイルは、実験デザインから１００％の同一性を有すると予想されるバリアントに対してマッピングされ、データに見られる比較分析を実行するためにカウントが集計される。全てのカウントは、ｅｑｎによって頻度を正規化された。Ｖｆ＝（Ｖカウント）／（合計カウント）ここで、Ｖｆは、特定のインデックスのバリアントの頻度であり、Ｖカウントは、そのバリアントで見られるカウントであり、合計カウントは、実験インデックス全体で観測された合計カウントである。
データ分析及び枯渇計算
枯渇スコア（又は絶対的適応度スコア）は、以下の式を使用してｌｏｇ２枯渇スコアとして計算された：Ｗ＝ｌｏｇ２（Ｆｘ，ｆ／Ｆｘ，ｉ）（式中、Ｆｘ，ｆは、最終時点でのカセットＸの頻度であり、Ｆｘ，ｉは、カセットＸの初期頻度であり、Ｗは、各バリアントの絶対的適応度である）。頻度は、各バリアントについての読み取りカウントを、フィルタリングで失われたものを含めた総実験カウントで割ることによって決定した。各選択を２回反復で実施し、２回の測定のカウント重み付け平均を使用して、各変異の平均適応度スコアを以下の通り推定した：Ｗａｖｇ＝（ΣＮ ｉ＝１ｃｏｕｎｔｓｉ＊Ｗｉ）／（ΣＮ ｉ＝１ｃｏｕｎｔｓｉ）。計算されたスコアは、計算値が負の場合、枯渇スコアと呼ばれるが、計算値が正の場合、濃縮スコアと呼ばれることもあることに留意されたい。
枯渇スコア（又は絶対的適応度スコア）は、以下の式を使用してｌｏｇ２枯渇スコアとして計算された：Ｗ＝ｌｏｇ２（Ｆｘ，ｆ／Ｆｘ，ｉ）（式中、Ｆｘ，ｆは、最終時点でのカセットＸの頻度であり、Ｆｘ，ｉは、カセットＸの初期頻度であり、Ｗは、各バリアントの絶対的適応度である）。頻度は、各バリアントについての読み取りカウントを、フィルタリングで失われたものを含めた総実験カウントで割ることによって決定した。各選択を２回反復で実施し、２回の測定のカウント重み付け平均を使用して、各変異の平均適応度スコアを以下の通り推定した：Ｗａｖｇ＝（ΣＮ ｉ＝１ｃｏｕｎｔｓｉ＊Ｗｉ）／（ΣＮ ｉ＝１ｃｏｕｎｔｓｉ）。計算されたスコアは、計算値が負の場合、枯渇スコアと呼ばれるが、計算値が正の場合、濃縮スコアと呼ばれることもあることに留意されたい。
これらのスコアを使用して、調査した種々の選択圧下での各変異の適応度寄与を順位付けし、評価した。全ての選択について、平均成長率の複合尺度として、同義の変異体についての絶対的適応度スコアの平均を提供した。変異体の濃縮が野生型値の少なくともμ±２＊σ（すなわち正規分布を仮定してｐ＝０．０５）であれば、絶対的な濃縮スコアは、有意であると見なした。平均及び有意性の閾値は、選択ごとに報告された。各選択に関して少なくとも２回の反復実験が実施され、反復実験全体でカットオフ閾値１０が各分析に組み入れるため適用された。
一部の場合、データは、ＮＲＲＮ ＰＡＭコントロールライブラリデータ又は他の非標的コントロールライブラリデータに対して正規化された。
図２１Ａは、インピーダンスがＳＯＰコンピテント細胞及び一定量のＤＮＡを含むウェルあたりの形質転換体の数を反映することを示した。図２１Ｂは、カウント加重平均枯渇スコアとＥｃ１１０（４回反復）、Ｅｃ８３＊（５回反復）及びＥｃ７８＊（２回反復）との比較を示す。これらのアンプリコンは、配列であり、３’−ＰＡＭがサンプルバーコードとして使用された。図２２Ａは、インプットＥＣ１１０コントロールプラスミド及び１５時間の増殖後のＥＣ１１０コントロールプラスミドのカウントがほぼ同一であることを示す。図２２Ｂは、液体増殖１５時間後及び２０時間後のＥＣ１１０コントロールプラスミドのカウントがほぼ同一であることを示し、インプットプラスミドの安定した維持を示す。
図２１Ａは、インピーダンスがＳＯＰコンピテント細胞及び一定量のＤＮＡを含むウェルあたりの形質転換体の数を反映することを示した。図２１Ｂは、カウント加重平均枯渇スコアとＥｃ１１０（４回反復）、Ｅｃ８３＊（５回反復）及びＥｃ７８＊（２回反復）との比較を示す。これらのアンプリコンは、配列であり、３’−ＰＡＭがサンプルバーコードとして使用された。図２２Ａは、インプットＥＣ１１０コントロールプラスミド及び１５時間の増殖後のＥＣ１１０コントロールプラスミドのカウントがほぼ同一であることを示す。図２２Ｂは、液体増殖１５時間後及び２０時間後のＥＣ１１０コントロールプラスミドのカウントがほぼ同一であることを示し、インプットプラスミドの安定した維持を示す。
実施例１２．ＭＡＤ７ ＰＡＭ及びＭＡＤ２ ＰＡＭの同定のためのｐＰＡＭアッセイ
ＭＡＤ２及びＭＡＤ７に対するＰＡＭプリファレンスは、上記のｐＰＡＭプラスミド枯渇アッセイ及びデータ分析方法を使用して決定された。種々のＰＡＭの枯渇スコアは、ＭＡＤ７（図２３Ａ）及びＭＡＤ２（図２３Ｂ）の両方について、上記のように２０時間で計算された。枯渇又は減少したＰＡＭは、認識可能であり、従ってヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ複合体により切断された。両方の酵素の優先ＰＡＭ部位は、それぞれ左から右に示されている。ＭＡＤ２及びＭＡＤ７は、いずれもＮＹＹＮ ＰＡＭを優先するが、一部のＮＹＹＮ ＰＡＭは、他のＰＡＭよりも良好に機能した（図２３Ａ及び２３Ｂ）。編集対切断効率は、選択されたＭＡＤ７ＰＡＭプラスミドについてさらに特徴付けられた（図２３Ｃ）。
ＭＡＤ２及びＭＡＤ７に対するＰＡＭプリファレンスは、上記のｐＰＡＭプラスミド枯渇アッセイ及びデータ分析方法を使用して決定された。種々のＰＡＭの枯渇スコアは、ＭＡＤ７（図２３Ａ）及びＭＡＤ２（図２３Ｂ）の両方について、上記のように２０時間で計算された。枯渇又は減少したＰＡＭは、認識可能であり、従ってヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ複合体により切断された。両方の酵素の優先ＰＡＭ部位は、それぞれ左から右に示されている。ＭＡＤ２及びＭＡＤ７は、いずれもＮＹＹＮ ＰＡＭを優先するが、一部のＮＹＹＮ ＰＡＭは、他のＰＡＭよりも良好に機能した（図２３Ａ及び２３Ｂ）。編集対切断効率は、選択されたＭＡＤ７ＰＡＭプラスミドについてさらに特徴付けられた（図２３Ｃ）。
実施例１３．合成プラスミドベースのオフターゲット（ＳＰＯＴ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｌａｓｍｉｄ ｂａｓｅｄ Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ）アッセイの設計
合成プラスミドベースのオフターゲット（ＳＰＯＴ）標的ライブラリは、個々のスペーサ配列を２０ヌクレオチド長とし、ＰＡＭ配列のサブセットを両側に付加することにより設計された。一部の実験では、各標的の５’側にＹＴＴＮ ＰＡＭが付加され、ＮＧＧ ＰＡＭは、３’側に付加された。これにより、フォーマットＹＴＴＮ−ＳＰＡＣＥＲＮ＝２０−ＮＧＧ（配列番号３７７）が生成された。ＩＵＰＡＣの正式な命名法に基づいて、Ｙ＝Ｃ又はＴ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧである。５’ＰＡＭ−３’ＰＡＭペアの８つの組合せが各標的の初期実験で試験された。各３’ＰＡＭと共に各５’ＰＡＭについて１つが２回サンプリングされた。具体的には、以下の５’ＰＡＭ−３’ＰＡＭの組合せを生成して試験した：ＴＴＴＡ−ＡＧＧ（配列番号３７８）；ＴＴＴＣ−ＣＧＧ（配列番号３７９）；ＴＴＴＧ−ＧＧＧ（配列番号３８０）；ＴＴＴＴ−ＴＧＧ（配列番号３８１）；ＣＴＴＡ−ＡＧＧ（配列番号３８２）；ＣＴＴＣ−ＣＧＧ（配列番号３８３）；ＣＴＴＧ−ＧＧＧ（配列番号３８４）；及びＣＴＴＴ−ＴＧＧ（配列番号３８５）、ここで、２０のヌクレオチドスペーサが各ＰＡＭの組合せ間にあった。この実験では、代表的な数の組合せのみが試験されたが、全ての可能な５’−ＹＴＴＮ−Ｎ＝２０−ＮＧＧ−３’（配列番号３７７）ＰＡＭ組合せも同様に試験され得ることを理解されたい。次に、異なるＰＡＭの組合せを有する標的スペーサのセットを、スペーサ配列全体の点変異を設計するためのテンプレートとして使用した。標的スペーサの変異ライブラリの設計は、各ＰＡＭスペーサ配列及び内部標準の４つの異なる変異セットで構成されていた。
合成プラスミドベースのオフターゲット（ＳＰＯＴ）標的ライブラリは、個々のスペーサ配列を２０ヌクレオチド長とし、ＰＡＭ配列のサブセットを両側に付加することにより設計された。一部の実験では、各標的の５’側にＹＴＴＮ ＰＡＭが付加され、ＮＧＧ ＰＡＭは、３’側に付加された。これにより、フォーマットＹＴＴＮ−ＳＰＡＣＥＲＮ＝２０−ＮＧＧ（配列番号３７７）が生成された。ＩＵＰＡＣの正式な命名法に基づいて、Ｙ＝Ｃ又はＴ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧである。５’ＰＡＭ−３’ＰＡＭペアの８つの組合せが各標的の初期実験で試験された。各３’ＰＡＭと共に各５’ＰＡＭについて１つが２回サンプリングされた。具体的には、以下の５’ＰＡＭ−３’ＰＡＭの組合せを生成して試験した：ＴＴＴＡ−ＡＧＧ（配列番号３７８）；ＴＴＴＣ−ＣＧＧ（配列番号３７９）；ＴＴＴＧ−ＧＧＧ（配列番号３８０）；ＴＴＴＴ−ＴＧＧ（配列番号３８１）；ＣＴＴＡ−ＡＧＧ（配列番号３８２）；ＣＴＴＣ−ＣＧＧ（配列番号３８３）；ＣＴＴＧ−ＧＧＧ（配列番号３８４）；及びＣＴＴＴ−ＴＧＧ（配列番号３８５）、ここで、２０のヌクレオチドスペーサが各ＰＡＭの組合せ間にあった。この実験では、代表的な数の組合せのみが試験されたが、全ての可能な５’−ＹＴＴＮ−Ｎ＝２０−ＮＧＧ−３’（配列番号３７７）ＰＡＭ組合せも同様に試験され得ることを理解されたい。次に、異なるＰＡＭの組合せを有する標的スペーサのセットを、スペーサ配列全体の点変異を設計するためのテンプレートとして使用した。標的スペーサの変異ライブラリの設計は、各ＰＡＭスペーサ配列及び内部標準の４つの異なる変異セットで構成されていた。
最初の変異ライブラリは、１、２、３又は４ｂｐの連続したミスマッチからなるスキャンニングミスマッチライブラリであり、各ミスマッチは、野生型配列の相補ヌクレオチドであった。スペーサ配列の全長に沿って、可能性のある１，２，３及び４つの連続したｂｐ変異がそれぞれ生成された。
２番目の変異ライブラリは、１，２，３又は４ｂｐの連続した欠失からなるスキャニング欠失ライブラリであった。スペーサ配列の全長に沿って、各可能性のある１、２、３及び４つの連続したｂｐ変異がそれぞれ生成された。
第３の変異ライブラリは、スペーサの各位置で単一の塩基挿入が行われた単一の挿入ライブラリであった。いくつかの実験では、挿入部位の５’にヌクレオチドを直接複製することにより、各１ｂｐ挿入を行った。他の挿入ライブラリの設計には、挿入部位の３’にヌクレオチドを直接複製すること、又は可能な各ヌクレオチド挿入バリアント、例えばスペーサ領域の各位置にＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇのいずれか１つを挿入した個々のバリアントを生成することが含まれる。
４番目の変異ライブラリは、２〜５ｂｐの位置をランダムに変異させて、生物学的に最も関連性のある種類の多様性に近い変異体配列のセットを作成するランダム変異誘発ライブラリであった。これらの２〜５ｂｐの変異は、連続していることを要しなかったため、多くの場合、変異したヌクレオチド間に介在する非変異又は野生型ヌクレオチドを有していた。このような非連続なランダム変異は、生物学的システムで一般的であることがわかっている。
ｐＰＡＭライブラリと同様に、ＳＰＯＴ配列は、標的ライブラリに一致するスペーサを含むｇＲＮＡベクターにクローン化され、自己ターゲティングｇＲＮＡベクターを作成した。オリゴプールを増幅し、標的ライブラリに一致するスペーサを含むｇＲＮＡベクターにクローン化して、選択的圧力下でプラスミドの切断及び喪失のため、競合的成長条件下で枯渇するであろう自己ターゲティングｇＲＮＡベクターを生成した。８つの異なるスペーサ配列の個々に隣接する８つの選択的５’−３’ＰＡＭ組合せは、標的に一致するように設計されたｇＲＮＡを含むベクターにクローニングされた。
ＳＰＯＴアッセイを使用すると、リボ核タンパク質複合体の生産に関係なく、インビボでの枯渇アッセイが可能である。また、このアッセイでは、様々な変異ライブラリ設計オプションにより、体系的なオフターゲット設計による独自のオフターゲット分析が可能である。ＳＰＯＴアッセイの追加の利点には、オフターゲット候補のより制御されたバリエーションが含まれる。このアッセイを使用して異なるＰＡＭの構造を比較できる。また、このアッセイは、上記のｐＰＡＭライブラリアッセイと組み合わせるか又は混合することができる。
サイト（Ｓｉｔｅ）−Ｓｅｑ、ＢＬＩＳＳ、ディゲノム（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ）−Ｓｅｑ又はサークル（Ｃｉｒｃｌｅ）−Ｓｅｑなどの他のオフターゲットアッセイは、哺乳類実験から切断されたサイトをマイニングし、ディープシーケンシングからＮＨＥＪ修復効率でオフターゲット配列を報告する。これらの他のアッセイを使用すると、ほとんどの研究において、３ｂｐを超えるランダムミスマッチのオフターゲット効果が示されている。
実施例１４．オフターゲットの特性評価
ＭＡＤ７及びＭＡＤ２のオフターゲット効果は、上記の合成プラスミドベースのオフターゲット（ＳＰＯＴ）アッセイを使用して分析された。まず、参照ヌクレアーゼ、ＭＡＤ７又はＭＡＤ２のいずれかを使用して、種々の隣接ＰＡＭ部位を有する８つの標的の切断活性を試験した。次に、上から選択した標的を、標的内の種々のランダム変異のライブラリを生成するための開始点として使用した。このアッセイ実施例では、標的及び隣接するＰＡＭ領域が増幅されたときに１７１ｂｐのアンプリコンが生成され、インラインインデックスで８７ｂｐの読み取り又は１２ｂｐインデックス読み取りで４６ｂｐの読み取りが可能になった。
ＭＡＤ７及びＭＡＤ２のオフターゲット効果は、上記の合成プラスミドベースのオフターゲット（ＳＰＯＴ）アッセイを使用して分析された。まず、参照ヌクレアーゼ、ＭＡＤ７又はＭＡＤ２のいずれかを使用して、種々の隣接ＰＡＭ部位を有する８つの標的の切断活性を試験した。次に、上から選択した標的を、標的内の種々のランダム変異のライブラリを生成するための開始点として使用した。このアッセイ実施例では、標的及び隣接するＰＡＭ領域が増幅されたときに１７１ｂｐのアンプリコンが生成され、インラインインデックスで８７ｂｐの読み取り又は１２ｂｐインデックス読み取りで４６ｂｐの読み取りが可能になった。
実験例のデータを図２４Ａ〜Ｃに示す。標的には、ランダム変異の示された数が含まれていた（ｒ３＝３ｂｐ；ｒ４＝４ｂｐ；ｒ５＝５ｂｐ）。Ｃａｓ９を使用して図２４Ａの枯渇プロットを生成し、ＭＡＤ７を使用して図２４Ｂの枯渇プロットを生成し、ＭＡＤ２を使用して図２４Ｃの枯渇プロットを生成した。
参照タンパク質枯渇プロットとＭＡＤ７及びＭＡＤ２枯渇プロットとを比較した際に見られるように、参照タンパク質は、ｒ３、ｒ４及びｒ５ライブラリのそれぞれにわたりはるかに多くのオフターゲット切断事象を有する。ＭＡＤ７とＭＡＤ２との両方は、ランダムな変異に対してオフターゲット切断事象を少なく示し、５ｂｐのランダムなミスマッチを伴うオフターゲット切断事象は、事実上なかった。これらのオフターゲット切断事象又はその欠如は、ＰＡＭ又は標的配列とは無関係である。
実施例１５．ＰＡＭ決定及びオフターゲット分析の組合せ
組合せ実験でのＰＡＭ特異性及びオフターゲット効果を特徴付ける能力は、上記のｐＰＡＭアッセイ及びＳＰＯＴアッセイを組み合わせることで試験された。この組合せは、本明細書ではインスクリプタ（Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ）アッセイと称される。（例えば、図２５）。このインスクリプタ（Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ）アッセイ実施例では、標的及び隣接するＰＡＭ領域が増幅されるときに１７１ｂｐのアンプリコンが生成され、１２ｂｐインデックス読み取りで４６ｂｐの読み取りが可能になる。ターゲティング配列は、スペーサ配列の広範な融解温度値を均一にサンプリングするために選択された。
組合せ実験でのＰＡＭ特異性及びオフターゲット効果を特徴付ける能力は、上記のｐＰＡＭアッセイ及びＳＰＯＴアッセイを組み合わせることで試験された。この組合せは、本明細書ではインスクリプタ（Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ）アッセイと称される。（例えば、図２５）。このインスクリプタ（Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ）アッセイ実施例では、標的及び隣接するＰＡＭ領域が増幅されるときに１７１ｂｐのアンプリコンが生成され、１２ｂｐインデックス読み取りで４６ｂｐの読み取りが可能になる。ターゲティング配列は、スペーサ配列の広範な融解温度値を均一にサンプリングするために選択された。
インスクリプタ（Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ）アッセイは、１０の酵素のＰＡＭ特異性及びオフターゲット率を迅速に特徴付けるために使用された。ＭＡＤ７の枯渇は、枯渇の２０時間（ＭＡＤ７）〜２４時間（ＭＡＤ７．２４）で基本的に同一であった。プラスミドインプットは、Ｅｃ１１０に類似しており、Ｅｃ１１０は、上記のエンジンベクター骨格に類似しているが、ヌクレアーゼをコードする遺伝子が欠如しているコントロールプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。ＭＡＤ２枯渇は、構成的プロモータＥｃ７８＊（ＭＡＤ２）対Ｅｃ１１３と同じままであり、Ｅｃ１１３は、ｐＬ誘導性プロモータシステムの代わりに構成的ｐｒｏＡプロモータによって制御されるＭＡＤ７ヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む上記のエンジンベクター骨格を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。ＭＡＤ７又はＭＡＤ２及び複数標的ライブラリを使用すると強い枯渇が観察され、ＭＡＤ４では複数標的ライブラリ内の強い枯渇も観察された。ＭＡＤ２、ＭＡＤ７及びＭＡＤ４と比較して、ＭＡＤ５で枯渇が少ないことが観察された。
これらのデータに基づいて、ＭＡＤ７、ＭＡＤ２、ＭＡＤ４及びＭＡＤ５がさらなる特性評価のために選択された。ｐＰＡＭアッセイデータをそれぞれ使用して、ＰＡＭ特異性が分析された。試験されたＰＡＭ ＴＴＮ及びＣＴＴＮの枯渇プロットを図２６Ａ及び図２６Ｂに示し、ＰＡＭ ＲＴＴＮ及びＹＣＣＮを図２６Ｃに示す。
種々のＰＡＭのＭＡＤ７枯渇スコアも図２７Ａ〜２７Ｂに示されており、これらのデータは、標的配列のＧＣ含有量が枯渇活性のスケールに影響を与える可能性があることを示し、ＰＡＭ及び標的配列の選択に基づいて切断及びターゲティングを調整できることを示唆する。
種々のＰＡＭのＭＡＤ２枯渇スコアも図２８Ａ〜２９Ｂに示されており、これらのデータは、標的配列のＧＣ含有量が枯渇活性のスケールに影響を与える可能性があることを示し、ＰＡＭ及び標的配列の選択に基づいて切断及びターゲティングを調整できることを示唆する。例えば、ＧＣ含有量が標的８と同等のＴＴＴＡのＰＡＭは、非常に強い枯渇を示す。
種々のＰＡＭのＭＡＤ４枯渇スコアも図２９Ａ〜２９Ｂに示されており、これらのデータは、標的配列のＧＣ含有量が枯渇活性のスケールに影響を与える可能性があることを示し、ＰＡＭ及び標的配列の選択に基づいて切断及びターゲティングを調整できることを示唆する。ＭＡＤ４は、試験された全ての標的の中で最もＧＣ含有量が高い標的８でも高い枯渇スコアを示した。
種々のＰＡＭのＭＡＤ５枯渇スコアも図３０Ａ〜３０Ｂに示されている。これらのデータは、ＭＡＤ５が、試験された標的配列及びＰＡＭ配列の組合せの強力な枯渇をもたらさないことを示す。
ＭＡＤ７、ＭＡＤ２及びＭＡＤ４のオフターゲット切断効果がさらに特徴付けられた。種々の試験された標的の変異体ライブラリを使用したＳＰＯＴアッセイの実施例のデータを図３１Ａ〜３１Ｃに示す。ＭＡＤ４は、図３２Ａ〜３２Ｈに示す実施例データに示されているように、試験された標的クラスの多くでＭＡＤ２及びＭＡＤ７よりさらに少ないオフターゲット活性を示した。各グラフに描かれている変異体ライブラリが表示されており、ランダム変異（図３２Ａ及び３２Ｅ）、欠失変異（図３２Ｂ及び３２Ｆ）、ミスマッチ変異（図３２Ｃ及び３２Ｇ）又は挿入変異（図３２Ｄ及び３２Ｈ）が含まれている。図３２Ｉ〜３２Ｐは、ＭＡＤ７を使用した実験からの枯渇スコア及び試験された各標的配列内の示された位置に変異を含む変異ライブラリを示す。これらのデータは、ＭＡＤ７を使用した実験で使用された全てのＹＴＴＮ ＰＡＭの組合せである。図３２Ｉ〜３２Ｐの場合、非Ｔは、５’−ＮＧＧＮ ＰＡＭから計算され、ｗｔ（野生型）は、標的に変異のないコントロールであり、「位置」は、標的配列内の変異の位置である。図３２Ｉ〜３２Ｊは、１ｂｐのスキャニング変異ライブラリ（ｍ１）からのデータを示す。図３２Ｋ〜３２Ｌは、２ｂｐのスキャニング変異ライブラリ（ｍ２）からのデータを示し、示された位置から始まる２つの連続した変異を有する。図３２Ｍ〜３２Ｎは、３ｂｐのスキャニング変異ライブラリ（ｍ３）からのデータを示し、示された位置から始まる３つの連続した変異を有する。これらのデータを合わせると、これらの位置内の変異の枯渇スコアの減少が示すように、この領域内の変異は、ＭＡＤ７切断活性を破壊する傾向があるため、位置１−７のシード配列が重要であることを示す。図３２Ｏ〜３２Ｐは、２ｂｐのスキャニング変異ライブラリ（ｍ２）のデータを示し、ＰＡＭ配列によって編成された１つの標的からのデータを示す。これらのデータを合わせると、一部のＰＡＭ配列が他のＰＡＭ配列よりも特異性が低いことを示し、ＰＡＭ強度及び標的特異性の関係を示唆する。例えば、ＴＴＴＡ ＰＡＭは、例えば、ＣＴＴＴ ＰＡＭと比較した場合、試験された残りの組合せよりも高い比率で２ｂｐタンデムミスマッチがあるテンプレートの切断を支援しているようである。これらの観察結果は、ＰＡＭの強度を標的の選択に組み込むべきであることを示唆する。
実施例１６．適合するガイドＲＮＡ配列の特性評価
どの足場配列が、試験されたＭＡＤヌクレアーゼと適合するかを特徴付けるために、異なる足場配列を含む様々なガイドＲＮＡが試験された。非相同又は直交性ＭＡＤヌクレアーゼシステムに由来する非相同足場配列と同様に、対象のＭＡＤヌクレアーゼの内因性ＣＲＩＳＰＲアレイからの足場が試験された。図３３は、試験された種々のＭＡＤヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ足場の組合せの概略図の例並びに試験されているＭＡＤヌクレアーゼ（ＭＡＤ＃など）及びガイドＲＮＡ足場配列（ｃｒＭＡＤ＃など）の適合性を試験するために使用された構築物を示す。構築物は、足場配列（ｃｒＲｅｐｅａｔ）及びターゲティング配列（例えば、ｇａｌＴ４５スペーサ）を含むガイドＲＮＡの発現を駆動するプロモータを含んでいた。構築物は、ガイドＲＮＡのターゲティング配列によりターゲティングされる標的配列（例えば、ｇａｌＴ４５、２４ｂｐ）も含んでいた。３〜４ｂｐのＰＡＭ領域が標的配列に隣接していた。また、各構築物には、足場配列を識別するために使用された固有の配列ＩＤ又はバーコードが含まれていた。図３３に示すように、例えばバーコード／固有ＩＤ及びその領域に隣接するプライマーを使用して標的配列領域を増幅した後に同定を行うことが可能である。一部の実施例では、増幅により１７６ｂｐアンプリコンが生成され、Ｖ３ＨＩＧＨスループット１ｘ７５ｂｐキットを使用して１２ｂｐインデックス読み取りで５０ｂｐ読み取りが可能になる。
どの足場配列が、試験されたＭＡＤヌクレアーゼと適合するかを特徴付けるために、異なる足場配列を含む様々なガイドＲＮＡが試験された。非相同又は直交性ＭＡＤヌクレアーゼシステムに由来する非相同足場配列と同様に、対象のＭＡＤヌクレアーゼの内因性ＣＲＩＳＰＲアレイからの足場が試験された。図３３は、試験された種々のＭＡＤヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ足場の組合せの概略図の例並びに試験されているＭＡＤヌクレアーゼ（ＭＡＤ＃など）及びガイドＲＮＡ足場配列（ｃｒＭＡＤ＃など）の適合性を試験するために使用された構築物を示す。構築物は、足場配列（ｃｒＲｅｐｅａｔ）及びターゲティング配列（例えば、ｇａｌＴ４５スペーサ）を含むガイドＲＮＡの発現を駆動するプロモータを含んでいた。構築物は、ガイドＲＮＡのターゲティング配列によりターゲティングされる標的配列（例えば、ｇａｌＴ４５、２４ｂｐ）も含んでいた。３〜４ｂｐのＰＡＭ領域が標的配列に隣接していた。また、各構築物には、足場配列を識別するために使用された固有の配列ＩＤ又はバーコードが含まれていた。図３３に示すように、例えばバーコード／固有ＩＤ及びその領域に隣接するプライマーを使用して標的配列領域を増幅した後に同定を行うことが可能である。一部の実施例では、増幅により１７６ｂｐアンプリコンが生成され、Ｖ３ＨＩＧＨスループット１ｘ７５ｂｐキットを使用して１２ｂｐインデックス読み取りで５０ｂｐ読み取りが可能になる。
例示的な実験では、１２種類のＭＡＤ酵素を１０種類の足場配列で試験した。結果として、その後に１回のネクストＳｅｑラン（ＮｅｘｔＳｅｑ Ｒｕｎ）でシーケンスされたアンプリコンが得られた。
特定のＭＡＤ酵素と種々の足場配列との適合性をこのアッセイを使用して試験した。試験した足場配列（ｃｒＭＡＤ＃）の一部の一次及び二次構造を図３４Ａ及び３４Ｂに示す。図３４Ａは、示されたＭＡＤシステムからのｃｒＲＮＡ足場配列のアラインメントを示す。図３４Ｂは、示されたＭＡＤ ｃｒＲＮＡｓからのシュードノット領域からの一部を示す。図３４Ａ〜３４Ｂのこれらのアライメントは、これらのアライメントされたＭＡＤ ｃｒＲＮＡのシュードノット領域の強力な配列及び構造的保存を示す。アライメントは、必ずしも配列ではないが、反復領域の５’末端の存在（図３４Ａでマーク）が切断活性にあまり関係がないことをさらに示す。選択したＭＡＤ ｃｒＲＮＡのコンセンサス配列からの配列の変異が示されている。例えば、コンセンサス配列のＵとは対照的に、５’に最も描かれているヌクレオチドは、ＭＡＤ３ ｃｒＲＮＡのＣである。さらなる実施例として、ループ構造の２番目のヌクレオチドは、コンセンサス配列のＡであり、代わりに１）ＭＡＤ１０ ｃｒＲＮＡのＵ、２）ＭＡＤ４、ＭＡＤ７及びＭＡＤ１１ ｃｒＲＮＡのＧ、３）ＭＡＤ２５ ｃｒＲＮＡのＣ、及び４）ＭＡＤ３ ｃｒＲＮＡのＣＵである。さらなる実施例として、コンセンサス配列のループ構造の３番目のヌクレオチドは、Ｕであり、代わりにＭＡＤ５ ｃｒＲＮＡのＧである。示されているように、一部のＭＡＤ ｃｒＲＮＡの場合、ループ配列の長さは、４ヌクレオチドであり、他の（例えば、ＭＡＤ３ ｃｒＲＮＡ）の場合、ループ配列の長さは、４ヌクレオチドである。
このアッセイの結果の例は、それぞれＭＡＤ７、ＭＡＤ２及びＭＡＤ４の図３５Ａ〜３５Ｃに示されている。各データセットの一部の観察結果を以下に示す。
図３５Ａに示すように、ＭＡＤ７は、４ｂｐループを備えた試験した足場配列のほとんどと適合するようである。また、より弱いＰＡＭ配列と組み合わせた場合、ＵＡＧＵループ配列では切断活性がわずかに低いように見えた。ＭＡＤ７活性は、それぞれの枯渇スコアによって示されるように、ＰＡＭ配列の広範囲に広がっている。総合すると、これらの結果は、足場配列の操作によってＭＡＤ７活性を調整できることを示唆する。これらのＭＡＤ７実験の追加データを図３６Ａ〜３６Ｂに示す。図３６Ａ〜３６Ｂは、異なるステムループ配列を含むネイティブな足場配列及び非相同性足場配列とのＭＡＤ７’の適合性の比較を示す。ＭＡＤ７と異なるステムループ配列を有する種々の足場配列との適合性を示す追加のデータは、図３７に示す。このデータが示すように、ＰＡＭの上流の−１位置の配列が重要であるように見え、−１位置の最初の「Ｃ」ヌクレオチドが枯渇に悪影響を及ぼす。−１の位置には以下の優先順位があるようである：ＣＴＴＴ ＰＡＭの状況を除き、Ｇ＞Ｔ＞Ａ＞Ｃ。その場合、優先順位は、Ａ＞Ｇ＞Ｔ＞Ｃのようである。特に、シード領域のピリミジン（Ｔ／Ｃ）リッチスペーサ配列は、ＭＡＤ７とＭＡＤ２との両方でわずかに不利であるように見え、プリン（Ａ／Ｇ）リッチは、わずかに濃縮された。ＰＡＭの上流にＣを有することも有害と思われる。
図３５Ａに示すように、ＭＡＤ７は、４ｂｐループを備えた試験した足場配列のほとんどと適合するようである。また、より弱いＰＡＭ配列と組み合わせた場合、ＵＡＧＵループ配列では切断活性がわずかに低いように見えた。ＭＡＤ７活性は、それぞれの枯渇スコアによって示されるように、ＰＡＭ配列の広範囲に広がっている。総合すると、これらの結果は、足場配列の操作によってＭＡＤ７活性を調整できることを示唆する。これらのＭＡＤ７実験の追加データを図３６Ａ〜３６Ｂに示す。図３６Ａ〜３６Ｂは、異なるステムループ配列を含むネイティブな足場配列及び非相同性足場配列とのＭＡＤ７’の適合性の比較を示す。ＭＡＤ７と異なるステムループ配列を有する種々の足場配列との適合性を示す追加のデータは、図３７に示す。このデータが示すように、ＰＡＭの上流の−１位置の配列が重要であるように見え、−１位置の最初の「Ｃ」ヌクレオチドが枯渇に悪影響を及ぼす。−１の位置には以下の優先順位があるようである：ＣＴＴＴ ＰＡＭの状況を除き、Ｇ＞Ｔ＞Ａ＞Ｃ。その場合、優先順位は、Ａ＞Ｇ＞Ｔ＞Ｃのようである。特に、シード領域のピリミジン（Ｔ／Ｃ）リッチスペーサ配列は、ＭＡＤ７とＭＡＤ２との両方でわずかに不利であるように見え、プリン（Ａ／Ｇ）リッチは、わずかに濃縮された。ＰＡＭの上流にＣを有することも有害と思われる。
図３５Ｂに示すように、ＭＡＤ２は、４ｂｐループを備えた試験した足場の多くと適合するようである。バイモーダルＰＡＭ認識も観察された。これらの実験の追加データを図３６Ｃ〜３７Ｄに示す。これらは、異なるステムループ配列を含むネイティブな足場配列及び非相同性足場配列とのＭＡＤ２’の適合性の比較を示す。
図３５Ｃに示すように、ＭＡＤ４は、４ｂｐループを備えた試験した足場の多くと適合するようである。また、より弱いＰＡＭ配列と組み合わせた場合、ＵＡＧＵループ配列では切断活性がわずかに低いように見えた。ＰＡＭ認識は、わずかにバイモーダルであるように見えた。これらの実験の追加データを図３６Ｅ〜３６Ｆに示す。これらは、異なるステムループ配列を含むネイティブな足場配列及び非相同性足場配列とのＭＡＤ４’の適合性の比較を示す。
実施例１７．酵母中のＭＡＤ７活性の特徴付け
ＣＡＮ１選択アッセイを使用して、多数の酵母ＭＡＤ７カセット構造を試験した。いくつかの実験例では、標的配列の編集効率について、種々のホモロジーアームの配向を有する１１種類の異なるカセットを試験した。一般に、酵母細胞は、対象カセットの１つ及び出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現にコドン最適化されたＭＡＤ７酵素を発現するベクターとで形質転換された。形質転換された細胞は、選択のためにカナバニンにプレーティングされた。正常に編集された細胞のみがカナバニン選択で生存し、ＭＡＤ７及びカセットの組合せが所望の編集に効果的に成功したことを示す。次に、選択した細胞からＤＮＡを抽出し、消化又は配列決定によって所望の編集を確認した。試験されたカセットの詳細は、表６に記載されている。表６では、下線が引かれたヌクレオチドは、ペンターＴモチーフが真核細胞の転写終結のシグナルとして機能を果たす可能性があるため、潜在的な問題のある配列を示し、そのため発現の問題を引き起こす可能性がある。従って、これらの潜在的な問題のある配列は、太字の斜体で示されたヌクレオチドで１つ又は複数のヌクレオチドを削除又は置換することにより種々の試験したリンカー配列に変更された。実験例のデータを表７に要約した。これらのデータは、３６ｂｐのＴからＣーＦスタイルのカセットが好ましい方向及び構成であることを示す。
ＣＡＮ１選択アッセイを使用して、多数の酵母ＭＡＤ７カセット構造を試験した。いくつかの実験例では、標的配列の編集効率について、種々のホモロジーアームの配向を有する１１種類の異なるカセットを試験した。一般に、酵母細胞は、対象カセットの１つ及び出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現にコドン最適化されたＭＡＤ７酵素を発現するベクターとで形質転換された。形質転換された細胞は、選択のためにカナバニンにプレーティングされた。正常に編集された細胞のみがカナバニン選択で生存し、ＭＡＤ７及びカセットの組合せが所望の編集に効果的に成功したことを示す。次に、選択した細胞からＤＮＡを抽出し、消化又は配列決定によって所望の編集を確認した。試験されたカセットの詳細は、表６に記載されている。表６では、下線が引かれたヌクレオチドは、ペンターＴモチーフが真核細胞の転写終結のシグナルとして機能を果たす可能性があるため、潜在的な問題のある配列を示し、そのため発現の問題を引き起こす可能性がある。従って、これらの潜在的な問題のある配列は、太字の斜体で示されたヌクレオチドで１つ又は複数のヌクレオチドを削除又は置換することにより種々の試験したリンカー配列に変更された。実験例のデータを表７に要約した。これらのデータは、３６ｂｐのＴからＣーＦスタイルのカセットが好ましい方向及び構成であることを示す。
表８に示すような追加のカセット配置も試験した。この一連の実験では、スペーサにＴＴＴＴＴ（ターゲティング配列）が存在しないように、ホモロジーアーム又はスペーサに６ｂｐを超えるホモポリマー領域が存在しないように（ターゲティング配列）カセットパラメータをフィルター処理した。
表９は、追加の実験で選択されたカセットの編集効率を要約したものであり、予想される変異に基づいて２５−１００％の編集効率の範囲を示す。表１０は、示されたカセットに含まれる配列、ターゲティングしたＷＴ遺伝子配列及び対象のＭＡＤ酵素及びｃｒＲＮＡ複合体によるＤＮＳ切断後に挿入された変異配列を含む他の実験の詳細を要約した。
実施例１８．哺乳類の標的配列のインビトロ及びインビボでの切断。
ＭＡＤ７を使用して哺乳類細胞標的を標的とし、切断した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はヒトコドン最適化ＭＡＤ７発現構築物が生成された（例えば、図３８Ａ）。簡単に述べると、構築物Ｉ６９は、５’（Ｎ末端）Ｖ５エピトープタグ及び核局在化シグナル（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）も含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ＭＡＤ７配列に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモータを含み、構築物は、ＧＦＰレポータ及びブラスチシジン耐性遺伝子のＥＦ１ａｌｐｈａプロモータ駆動発現も含む。構築物Ｉ１９は、ＮＬＳ及びＶ５配列がＭＡＤ７配列の３’末端（Ｃ末端）にあることを除いて、Ｉ６９に類似している。Ｉ９構築物は、ＭＡＤ７配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではなく、ヒト細胞での発現にコドン最適化されていることを除いて、Ｉ６９配列と類似している。Ｉ１８構築物は、ＭＡＤ７配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではなく、ヒト細胞での発現にコドン最適化されていることを除いて、Ｉ１９構築物と類似している。図３８Ｂに示すように、２つのガイドＲＮＡ配列を使用した。
ＭＡＤ７を使用して哺乳類細胞標的を標的とし、切断した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はヒトコドン最適化ＭＡＤ７発現構築物が生成された（例えば、図３８Ａ）。簡単に述べると、構築物Ｉ６９は、５’（Ｎ末端）Ｖ５エピトープタグ及び核局在化シグナル（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）も含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ＭＡＤ７配列に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモータを含み、構築物は、ＧＦＰレポータ及びブラスチシジン耐性遺伝子のＥＦ１ａｌｐｈａプロモータ駆動発現も含む。構築物Ｉ１９は、ＮＬＳ及びＶ５配列がＭＡＤ７配列の３’末端（Ｃ末端）にあることを除いて、Ｉ６９に類似している。Ｉ９構築物は、ＭＡＤ７配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではなく、ヒト細胞での発現にコドン最適化されていることを除いて、Ｉ６９配列と類似している。Ｉ１８構築物は、ＭＡＤ７配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではなく、ヒト細胞での発現にコドン最適化されていることを除いて、Ｉ１９構築物と類似している。図３８Ｂに示すように、２つのガイドＲＮＡ配列を使用した。
図３９Ａ〜３９Ｂは、ＰＰＩＢ（図３９Ａ）及びＤＮＭＴ３Ｂ（図３９Ｂ）の２つの標的遺伝子内の標的部位を示す。図３９Ｃ〜３９Ｄは、示されたガイドＲＮＡ配列によりターゲティングされたＰＡＭ配列及び標的配列並びに標的配列及びどのＤＮＡ鎖がターゲティングされたかのＣＧ含有率を要約している。
哺乳類細胞にＭＡＤ７発現ベクターを個々にトランスフェクトし、細胞溶解物が収集された。ＭＡＤ７発現を確認するために、細胞溶解物をウエスタンブロット分析により評価した。細胞溶解物は、哺乳類細胞内で発現したタンパク質の適切な発現及びフォールディングを示すＭＡＤ７タンパク質機能を評価するインビトロ切断アッセイでも使用された。このアッセイにより、標的配列のクロマチン凝縮のために細胞機構が切断事象を修正又はブロックすることなく、ＭＡＤ７の発現及び切断能力を評価できる。切断アッセイを実行した後、溶解物をゲル電気泳動で分離し、イメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェア及びデンシトメトリーを使用して分析し、切断産物強度を総バンド強度で割ることにより算出された切断％（切断％）を決定した。
図４０は、Ｉ１８構築物を使用した、示されたＰＰＩＢ及びＤＮＭＴ３Ｂ標的配列の実験例からの切断率（切断効率）の定量化を示す。４２−ｍｅｒ及び５６−ｍｅｒのガイドＲＮＡ配列間では、インビトロで切断にほとんど違いが見られなかったため、２つの平均値を図４０にプロットした。ＰＰＩＢの場合、試験した１０のガイドＲＮＡのうちの８つが標的切断を引き起こし、ｇＲＮＡ−１４及びｇＲＮＡ−２５は、このアッセイを使用して検出不能な切断を引き起こした。ＰＰＩＢをターゲティングするｇＲＮＡ−１５は、効率的な切断をもたらしたが、生成された切断産物のサイズが小さく（切断されていないものと約７０ｂｐの差）、測定が困難であったため、切断パーセントは、＞９０％と推定された。ＤＮＭＴ３Ｂの場合、試験した１０のガイドＲＮＡのうちの９つが標的切断を引き起こし、ｇＲＮＡ−１４及びｇＲＮＡ−４は、このアッセイを使用して検出不能な切断を引き起こした。ＤＮＭＴ３ＢをターゲティングするｇＲＮＡ−１は、効率的な切断をもたらしたが、生成された切断産物のサイズが小さく（切断されていないものと約７０ｂｐの差）、測定が困難であったため、切断パーセントは、＞９０％と推定された。
図４１は、哺乳動物細胞におけるインデル（挿入又は欠失）形成の定量化を示す。手短に述べると、ＭＡＤ７ヌクレアーゼ発現ベクター（Ｉ９又はＩ１８、図３８Ａを参照されたい）及び合成ガイドＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。約７２時間のインキュベーション期間後、インデル形成を検出することによりインビボでの切断を評価した。理論に拘束されることを望むものではないが、切断が発生した後、一部の場合、切断されたＤＮＡは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムを介して修復されると考えられる。これにより、多くの場合、１つ又は複数のヌクレオチドが切断部位から挿入又は削除される。これらの挿入及び／又は欠損事象は、インデルと呼ばれる。インデルは、Ｔ７ＥＩアッセイを使用したＤＮＡミスマッチ検出アッセイを使用して検出された。このミスマッチアッセイは、予想される非改変配列並びに切断及びＮＨＥＪ修復後のインデルを含む改変配列間のミスマッチを検出する。一部の場合、５６−ｍｅｒガイドＲＮＡは、４２−ｍｅｒガイドＲＮＡと比較してより高いインデル形成をもたらした。ＰＰＩＢの場合、３つのガイドＲＮＡのうちの２つは、この方法で検出可能な切断をもたらしたが、３つのうちの３つは、ＤＮＭＴ３Ｂ遺伝子標的を検出した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ＭＡＤ７ヌクレアーゼを使用した他の２つの構築物も、ヒトコドン最適化構築物と比較的同じ効率でインデル形成を示した（データは示さず）。全体として、これらのデータは、哺乳類細胞のインビボでのＭＡＤ７切断活性の成功を示す。
合わせて、これらのデータは、ＭＡＤ７が哺乳類細胞で効率的に発現及びフォールディングされ、哺乳類の標的配列においてインビトロ及びインビボで効率的に機能することを示す。また、インビトロデータは、より短い４２−ｍｅｒ ｇＲＮＡがより長い５６−ｍｅｒ ｇＲＮＡと同程度に効率的にカットすることを示すが、これは、哺乳類細胞の内因性インデル形成を測定する際に必ずしも観察されなかった。
実施例１９．ＭＡＤヌクレアーゼのさらなる特性評価
選択されたＭＡＤヌクレアーゼのＰＡＭプリファレンスをさらに特徴付けるために編集スクリーンが実行された。ｇａｌＫ遺伝子は、このスクリーニングの標的として使用された。これらのデータからの一部の注目すべき観測には、ＧＴＴＧ及びＴＴＴＣ ＰＡＭを使用してＭＡＤ７で編集が観察され、ＴＴＴＣ ＰＡＭを使用してＭＡＤ２で編集が観察されたことが含まれる。これらの実験では、いくつかの細胞毒性が観察された。表１１は、これらの実験の結果の要約である。
選択されたＭＡＤヌクレアーゼのＰＡＭプリファレンスをさらに特徴付けるために編集スクリーンが実行された。ｇａｌＫ遺伝子は、このスクリーニングの標的として使用された。これらのデータからの一部の注目すべき観測には、ＧＴＴＧ及びＴＴＴＣ ＰＡＭを使用してＭＡＤ７で編集が観察され、ＴＴＴＣ ＰＡＭを使用してＭＡＤ２で編集が観察されたことが含まれる。これらの実験では、いくつかの細胞毒性が観察された。表１１は、これらの実験の結果の要約である。
ＰＡＭスクリーンアッセイは、ＭＡＤ２、ＭＡＤ４及びＭＡＤ７を使用して繰り返された。このアッセイの実験設計によれば、白色コロニーは、変異を含む編集カセットの相同組換えによる終止コドンの挿入を反映し、赤色コロニーは、終止コドンが挿入されなかったことを示す。ＭＡＤ２は、前述のＰＡＭ特異性データと一致する編集を示した。ＭＡＤ４は、高い細胞毒性を示し、ＭＡＤ２及びＭＡＤ７形質転換細胞と比較して観察可能なコロニーが少なかった。ＭＡＤ７は、以前のＰＡＭ特異性データと一致する編集結果を示し、ＭＡＤ２よりも幅広い編集効率を示した。
これらのデータは、細胞の生存率が低いにもかかわらず、編集効率が９０％以上であることを示す。表１２は、これらの実験の結果の要約である。これらのデータは、ＭＡＤ２（２５倍）又はＭＡＤ７（１０１倍）と比較してＭＡＤ４（約２．３倍）のＰＡＭ部位間の変動性が低いことを示す。この倍率変化は、以下のように計算された：倍数差＝最大値（編集されたＣＦＵ）／最小値（編集されたＣＦＵ）。
本発明は、本発明の好ましい実施形態に関連して詳細に説明されるように、多くの異なる形態の実施形態の開示によって満たされるが、本開示は、本発明の原理の例示と見なされるべきであり、本明細書で例示及び説明する特定の実施形態に本発明を限定することを意図したものではないことが理解される。本発明の趣旨から逸脱することなく、当業者によって多数の変形形態がなされ得る。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によって判断される。要約及び発明の名称は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、それらの目的は、適切な当局及び一般大衆が本発明の一般的性質を迅速に判断できるようにすることである。
Claims (117)
- 細胞のゲノム中の標的領域を改変する方法であって、
（ａ）細胞を、
配列番号７のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、
前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸、及び
前記標的領域に対する配列の変化を有する、前記標的領域に相補的な核酸をコードする編集配列
と接触させることと、
（ｂ）前記ヌクレアーゼ、ガイド核酸及び編集配列が前記細胞の前記ゲノムの標的領域にゲノム編集を創出することを可能にすることと
を含む方法。 - 前記操作されたガイド核酸及び前記編集配列は、単一の核酸として提供される、請求項１に記載の方法。
- 前記単一の核酸は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に変異をさらに含む、請求項２に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４７又は２０３〜２２２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３３又は１８３〜２０２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３又は２４３〜２６２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２３〜２４２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 核酸誘導型ヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、
（ｂ）前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸、及び
（ｃ）細胞のゲノム中の標的領域の配列に対する配列の変化を有する編集配列
を含み、前記ヌクレアーゼ、前記操作されたガイド核酸及び前記編集配列によって促進される、前記細胞の前記ゲノム中の前記標的領域におけるゲノム編集をもたらす、核酸誘導型ヌクレアーゼシステム。 - 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４７又は２０３〜２２２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１０に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３３又は１８３〜２０２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１０に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５３又は２４３〜２６２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１０に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号２２３〜２４２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１０に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、編集される前記細胞のためにコドン最適化される、請求項１０に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項１０に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、請求項１０に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸及び前記編集配列は、単一の核酸として提供される、請求項１０に記載のシステム。
- 前記単一の核酸は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に変異をさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
- 組成物であって、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸であって、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、操作されたガイド核酸
を含む組成物。 - 前記操作されたガイド核酸は、異種性の操作されたガイド核酸である、請求項２０に記載の組成物。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項２０に記載の組成物。
- 前記ヌクレアーゼは、特定の生物体に由来する細胞における使用のためのコドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項２０に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化される、請求項２２に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化される、請求項２２に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、哺乳動物細胞のためにコドン最適化される、請求項２２に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化される、請求項２２に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、植物細胞のためにコドン最適化される、請求項２２に記載の組成物。
- 核酸誘導型ヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる異種性の操作されたガイド核酸
を含む核酸誘導型ヌクレアーゼシステム。 - （ｃ）標的領域の配列に対する配列の変化を有する編集配列をさらに含む、請求項２９に記載のシステム。
- 前記ヌクレアーゼ、前記異種性の操作されたガイド核酸及び前記編集配列によって促進される標的領域の編集をもたらす、請求項３０に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、請求項２９に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項２９に記載のシステム。
- 前記ヌクレアーゼは、特定の生物体に由来する細胞における使用のためのコドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項２９に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化される、請求項３０に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化される、請求項３０に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、哺乳動物細胞のためにコドン最適化される、請求項３０に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化される、請求項３０に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、植物細胞のためにコドン最適化される、請求項３０に記載のシステム。
- 細胞のゲノム中の標的領域を改変する方法であって、
（ａ）細胞を、
配列番号２のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、
前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸、及び
前記標的領域に対する配列の変化を有する、前記標的領域に相補的な核酸をコードする編集配列
と接触させることと、
（ｂ）前記ヌクレアーゼ、ガイド核酸及び編集配列が前記細胞の前記ゲノムの標的領域にゲノム編集を創出することを可能にすることと
を含む方法。 - 前記操作されたガイド核酸及び前記編集配列は、単一の核酸として提供される、請求項４０に記載の方法。
- 前記単一の核酸は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に変異をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４２又は２８３〜３０２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項４０に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２８又は２６３〜２８２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項４０に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４８又は３２３〜３４２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項４０に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３０３〜３２２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項４０に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項４０に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、請求項４０に記載の方法。
- 核酸誘導型ヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、
（ｂ）前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸、及び
（ｃ）細胞のゲノム中の標的領域の配列に対する配列の変化を有する編集配列
を含み、前記ヌクレアーゼ、前記操作されたガイド核酸及び前記編集配列によって促進される、前記細胞の前記ゲノム中の前記標的領域におけるゲノム編集をもたらす、核酸誘導型ヌクレアーゼシステム。 - 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４２又は２８３〜３０２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項４９に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１２８又は２６３〜２８２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項４９に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１４８又は３２３〜３４２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項４９に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号３０３〜３２２と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項４９に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、編集される前記細胞のためにコドン最適化される、請求項４９に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項４９に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、請求項４９に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸及び前記編集配列は、単一の核酸として提供される、請求項４９に記載のシステム。
- 前記単一の核酸は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に変異をさらに含む、請求項５７に記載のシステム。
- 組成物であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸であって、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、操作されたガイド核酸
を含む組成物。 - 前記操作されたガイド核酸は、異種性の操作されたガイド核酸である、請求項５９に記載の組成物。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項５９に記載の組成物。
- 前記ヌクレアーゼは、特定の生物体に由来する細胞における使用のためのコドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項５９に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化される、請求項６２に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化される、請求項６２に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、哺乳動物細胞のためにコドン最適化される、請求項６２に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化される、請求項６２に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、植物細胞のためにコドン最適化される、請求項６２に記載の組成物。
- 核酸誘導型ヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる異種性の操作されたガイド核酸
を含む核酸誘導型ヌクレアーゼシステム。 - （ｃ）標的領域の配列に対する配列の変化を有する編集配列をさらに含む、請求項６８に記載のシステム。
- 前記ヌクレアーゼ、前記異種性の操作されたガイド核酸及び前記編集配列によって促進される標的領域の編集をもたらす、請求項６９に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、請求項６８に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項６８に記載のシステム。
- 前記ヌクレアーゼは、特定の生物体に由来する細胞における使用のためのコドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項６８に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化される、請求項７３に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化される、請求項７３に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、哺乳動物細胞のためにコドン最適化される、請求項７３に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化される、請求項７３に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、植物細胞のためにコドン最適化される、請求項７３に記載のシステム。
- 細胞のゲノム中の標的領域を改変する方法であって、
（ａ）細胞を、
配列番号４のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、
前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸、及び
前記標的領域に対する配列の変化を有する、前記標的領域に相補的な核酸をコードする編集配列
と接触させることと、
（ｂ）前記ヌクレアーゼ、ガイド核酸及び編集配列が前記細胞の前記ゲノムの標的領域にゲノム編集を創出することを可能にすることと
を含む方法。 - 前記操作されたガイド核酸及び前記編集配列は、単一の核酸として提供される、請求項７９に記載の方法。
- 前記単一の核酸は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に変異をさらに含む、請求項８０に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４４又は７２２〜７４１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項７９に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３０又は７４２〜７６１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項７９に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５０又は７６２〜７８１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項７９に記載の方法。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号７８２〜８０１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項７９に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項７９に記載の方法。
- 前記操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、請求項７９に記載の方法。
- 核酸誘導型ヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、
（ｂ）前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸、及び
（ｃ）細胞のゲノム中の標的領域の配列に対する配列の変化を有する編集配列
を含み、前記ヌクレアーゼ、前記操作されたガイド核酸及び前記編集配列によって促進される、前記細胞の前記ゲノム中の前記標的領域におけるゲノム編集をもたらす、核酸誘導型ヌクレアーゼシステム。 - 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号４４又は７２２〜７４１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項８８に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１３０又は７４２〜７６１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項８８に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号１５０又は７６２〜７８１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項８８に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、配列番号７８２〜８０１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によってコードされる、請求項８８に記載のシステム。
- 前記核酸誘導型ヌクレアーゼは、編集される前記細胞のためにコドン最適化される、請求項８８に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項８８に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、請求項８８に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸及び前記編集配列は、単一の核酸として提供される、請求項８８に記載のシステム。
- 前記単一の核酸は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に変異をさらに含む、請求項９６に記載のシステム。
- 組成物であって、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる操作されたガイド核酸であって、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、操作されたガイド核酸
を含む組成物。 - 前記操作されたガイド核酸は、異種性の操作されたガイド核酸である、請求項９８に記載の組成物。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項９８に記載の組成物。
- 前記ヌクレアーゼは、特定の生物体に由来する細胞における使用のためのコドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項９８に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化される、請求項１０１に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化される、請求項１０１に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、哺乳動物細胞のためにコドン最適化される、請求項１０１に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化される、請求項１０１に記載の組成物。
- 前記核酸配列は、植物細胞のためにコドン最適化される、請求項１０１に記載の組成物。
- 核酸誘導型ヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む核酸誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）前記核酸誘導型ヌクレアーゼと複合化することができる異種性の操作されたガイド核酸
を含む核酸誘導型ヌクレアーゼシステム。 - （ｃ）標的領域の配列に対する配列の変化を有する編集配列をさらに含む、請求項１０７に記載のシステム。
- 前記ヌクレアーゼ、前記異種性の操作されたガイド核酸及び前記編集配列によって促進される標的領域の編集をもたらす、請求項１０８に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、ＵＡＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＧＵＵ、ＵＣＵＵ、ＵＣＵＵＵ又はＵＡＧＵの配列を含むループ配列を含む、請求項１０７に記載のシステム。
- 前記操作されたガイド核酸は、配列番号１７２〜１８２のいずれか１つを含む、請求項１０７に記載のシステム。
- 前記ヌクレアーゼは、特定の生物体に由来する細胞における使用のためのコドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項１０７に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化される、請求項１１２に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化される、請求項１１２に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、哺乳動物細胞のためにコドン最適化される、請求項１１２に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化される、請求項１１２に記載のシステム。
- 前記核酸配列は、植物細胞のためにコドン最適化される、請求項１１２に記載のシステム。
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