JP2020526224A - ユニバーサルドナー細胞及び関連方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2107年7月12日に出願された「ユニバーサルドナー(UNIVERSAL DONOR)細胞及び関連方法」と題する米国実用出願第15/648,337号に対する優先権を主張する。
び活性化シグナルのバランスによって決まる。Haynes et al., THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE, PART 15: Immune-Mediated, Inflammatory, and Rheumatologic Disorders, 372e Introduction to the Immune System。
添付の配列表に列挙されている核酸及びアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822で定義されている核酸塩基についての標準的な文字略語及びアミノ酸についての3文字コードを使用して示される。各核酸配列の1つの鎖のみが示されているが、示された鎖についての任意の参照により、相補鎖が含まれているものと理解される。配列表は、ASCIIテキストファイルSequence_Listing、2018年7月3日、11KBとして提出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
Iシグナルの過剰発現ではなく、NK活性化リガンドシグナルの遮断であることが示唆された。
本発明の一態様によれば、NK細胞機能を抑制するための処置方法が提供される。本発明の別の態様によれば、少なくとも1つの免疫応答を抑制するための処置法が提供される。各方法は、処置を必要とする対象にNK細胞機能を阻害する剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、剤は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、標的細胞上のNK細胞活性化リガンドに選択的に結合する。
cells Immunology and Cell Biology (2011) 89, 216-224にさらに記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
は、NK活性化リガンドをコードする1つ以上の遺伝子の発現を欠失、阻害、又は低減させることが含まれる。特定の実施形態では、そのようなNK活性化リガンドは、表1から選択される。特定の実施形態では、そのようなNK活性化リガンドは、表1の分類1、2、3又はそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、そのようなNK活性化リガンドは、表1の分類1、2、及び3から選択される。特定の実施形態では、そのようなNK活性化リガンドは、表1の分類1及び3から選択される。特定の実施形態では、そのようなNK活性化リガンドは、表1の分類1及び2から選択される。特定の実施形態では、そのようなNK活性化リガンドは、表1の分類2及び3から選択される。特定の実施形態では、そのようなNK活性化リガンドは、ICAM−1、CEACAM1、CADM1 MICA、MICB、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
分泌細胞、適切に特定された内分泌細胞、未成熟内分泌細胞、又は機能性β細胞である。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、同種又は異種細胞集団であり得る。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、1つ以上の目的の生物活性物質を産生する細胞である。低免疫原性細胞、例えば、膵臓前駆細胞又はPDX1陽性膵臓内胚葉は、最初に移植される場合に初期には治療的に活性でなくてもよいが、ひと度移植されると、さらに発達し、成熟して、治療効果を有する。
に購入することができるものが含まれ、具体的には、BG01、BG02、及びBG03が含まれる。
gulnickらは、細胞集団のうちの73%〜80%がPDX1陽性(PDX1+)及びNKX6.1+膵臓前駆細胞からなるような、膵臓前駆細胞を作成するための変更プロトコルを記載した。膵臓前駆細胞は、膵島様細胞(IC)にさらに分化し、これは73%〜89%の内分泌細胞を再現可能に含み、そのうち約40%〜50%がインスリンを発現した。これらのインスリン陽性細胞の大部分は、単一ホルモン陽性であり、転写因子PDX1及びNKX6.1を発現した。Agulnickは、Schulzらの2012プロトコルを、ステージ3(5〜7日目)においてアクチビンA、Wnt3A、及びヘレグリンβでさらに処理し、ステージ4(7〜13日目)においてアクチビンA及びヘレグリンβでさらに処理することにより変更したプロトコルを記載している。一実施形態では、低免疫原性細胞は、米国特許第8,859,286号(これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている細胞と実質的に同様である。
hESCに由来する膵臓内胚葉細胞(PEC)を生成するための標準的な作製方法を以下の表2に開示する。
Systems);IV:2.5μM TGF−βRIキナーゼ阻害剤IV(EMD Bioscience);db:0.5×B−27 Supplement(Life Technologies)、1×GlutaMAX、及び1%v/v ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した、DMEM HI Glucose(HyClone);CTT3:0.25μM KAAD−シクロパミン(Toronto Research Chemicals))及び3nM TTNPB(Sigma−Aldrich);N50:50ng/mL 組換えヒトノギン(R&D Systems);K50:50ng/mL 組換えヒトKGF(R&D Systems);E50:50ng/mL 組換えヒトEGF(R&D Systems)。
カルセイン放出アッセイは、NK細胞の細胞傷害性を研究するための非放射性代替法である。標的細胞は蛍光色素(カルセインAM)を取り込み、該蛍光色素は細胞質によって活性な蛍光色素に変換され、これは溶解時にのみ細胞から放出される。溶解した細胞は蛍光色素を上清に放出し、次いで該上清を採取し、蛍光計で蛍光量を定量する。細胞溶解率は、NK細胞(エフェクター)、遮断抗体、又はその両方の存在下又は非存在下でインキュベートした後に上清に存在する蛍光量から計算される。
14日に出願された、MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERMと題する同第12/093,590号;2006年6月20日に出願された、EMBRYONIC STEM CELL CULTURE COMPOSITIONS
AND METHODS OF USE THEREOFと題する同第11/993,399号;2006年10月27日に出願された、PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERMと題する同第11/588,693号;2007年3月2日に出願された、ENDOCRINE PROGENITOR/PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTIONと題する同第11/681,687号;2007年5月24日に出願された、METHODS FOR CULTURE AND PRODUCTION OF SINGLE CELL POPULATIONS OF HESCと題する同第11/807,223号;2007年7月5日に出願された、METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONESと題する同第11/773,944号;2007年9月24日に出願された、METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM PRODUCTIONと題する同第11/860,494号;2008年4月8日出願された、METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONESと題する同第12/099,759号;2008年4月21日に出願された、PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FORM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLSと題する同第12/107,020号;2009年11月13日に出願された、ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS)と題する同第12/618,659号;2010年4月22日及び2013年2月6日に出願された、両方とも、CELL COMPOSITIONS FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLSと題する同第12/765,714号及び同第13/761,078号;2007年8月13日に出願された、COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURING DIFFERENTIABLE CELLSと題する同第11/838,054号;2008年11月4日に出願された、STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOFと題する同第12/264,760号;2010年4月27日に出願された、SMALL MOLECULES SUPPORTING PLURIPOTENT CELL GROWTHと題する同第13/259,15号;2011年2月21日に出願された、LOADING SYSTEM FOR AN ENCAPSULATION DEVICEと題する国際出願PCT/US11/25628;2010年12月28日に出願された、AGENTS AND METHODS FOR INHIBITING PLURIPOTENT STEM CELLS)と題する同第13/992,931号;並びに2011年12月12日に出願された米国意匠出願第29/408,366号;同第2011年12月12日に出願された同第29/408,368号;2012年5月31日に出願された同第29/423,365号;及び2013年3月13日に出願された同第29/447,944号;2014年3月7日に出願された、DIMENSIONAL LARGE CAPACITY CELL ENCAPSULATION DEVICE ASSEMBLYと題する米国出願第14/201,630号;2013年12月13日に出願された、IN VITRO DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS TO PANCREATIC ENDODERM CELLS (PEC) AND ENDOCRINE CELLSと題する米国出願第14/106,330号;2016年11月10日に出願された、PDX1 PANCREATIC ENDODERM CELLS IN CELL DELIVERY DEVICES AND METHODS THEREOFと題する国際出願PCT/US2016/061442に見出すことができ、これらは全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Stem Cellsと題する米国特許公開第2011/0151561号;2009年10月22日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cellsと題する米国特許公開第2010/0112692号;2011年8月17日に出願された、Differentiation of Pluripotent Stem Cellsと題する米国特許公開第2012/0052576号;
2009年10月23日に出願された、Differentiation of human pluripotent stem cellsと題する米国特許公開第2010/0112693号;2010/12/16日に出願された、Differentiation of human embryonic stem cellsと題する米国特許公開第2011/0151560号;2008年7月31日に出願された、Differentiation of human embryonic stem cellsと題する米国特許公開第2010/0015100号;2008年11月25日に出願された、Differentiation of human embryonic stem cellsと題する米国特許公開第2009/0170198号;2015年5月7日に出願された、Use of Small Molecules to Enhance MAFA Expression in Pancreatic Endocrine Cellsと題する米国特許公開第2015/0329828号;2013年6月6日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Pancreatic Endocrine Cellsと題する米国特許公開第2013/0330823号;2013年6月13日に出願された、Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cellsと題する国際公開第2013/192005号;2013年12月30日に出願された、Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cellsと題する米国特許公開第2014/0242693号;2014年6月17日に出願された、Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cellsと題する米国特許公開第2014/0295552号;2014年5月21日に出願された、Suspension
and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cellsと題する国際公開第2015/065524号;2013年6月6日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Pancreatic Endocrine Cellsと題する米国特許公開第2013/0330823号;2013年12月18日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cells Into Pancreatic Endocrine Cells Using HB9 Regulatorsと題する米国特許公開第2014/0186953号;2015年12月9日に出願された米国出願第14/963730号;2015年12月11日に出願された米国出願第14/898,015号に見出すことができ、これらは全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
5号、同第29/484,362号、同第29/484,358号、同第29/408,366号、同第29/517,319号、同第29/408,368号、同第29/518,513号、同第29/518,516号、同第29/408,370号、同第29/517,144号、同第29/423,365号、同第29/530,325号、同第29/584,046に記載されているデバイスであり、これらは全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、細胞送達デバイス又は大容量アセンブリは、細胞送達デバイスの管腔をさらに仕切る1つ又は2つ以上のシール(seal)、すなわち仕切りシールからなる。例えば、本出願人の米国意匠出願第29/408366号、同第29/408368号、同第29/408370号、同第29/423,365号、及び同第29/584,046号を参照のこと。
体内の組織を置換及び回復するための胚性幹細胞及び人工多能性幹(iPS)細胞の多様性は、癌リスクの増加と並行して生じる。癌リスクの増加は遺伝子療法にも関連する。したがって、再プログラム化組織は、ES細胞又はiPS細胞に由来するかどうか(Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676, (2006)及びHanna, J. H., Saha, K. & Jaenisch, R. Pluripotency and Cellular Reprogramming:
Facts, Hypotheses, Unresolved Issues. Cell 143, 508-525, (2010)(これらは両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる))、又は他の多能性細胞若しくは前駆体細胞に由来するかどうか、及び遺伝子治療ベクターで処置された細胞に由来するかどうかに関係なく、安全上の懸念を与える(Knoepfler, P. S. Deconstructing Stem Cell Tumorigenicity: A Roadmap to Safe Regenerative Medicine. Stem Cells 27, 1050-1056, (2009)(これは、参照によりその全体が組み込まれる))。例えば、皮下移植されたiPS細胞は奇形腫を引き起こし、iPSキメラ動物は高い発生率で原発性悪性癌を発症する(Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676, (2006); Knoepfler, P. S. Deconstructing Stem Cell Tumorigenicity: A Roadmap
to Safe Regenerative Medicine. Stem Cells 27, 1050-1056, (2009))。良性の奇形腫は手術で容易に除去し得るが、浸潤性癌は細胞療法のリスクが残ったままである。
al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されている。
物の使用をさらに包含し、組成物は適切な低免疫原性細胞枯渇組成物及び薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、細胞枯渇組成物は、抗体及び毒素を含むキメラ組成物である。
本明細書に記載の実施形態は、低免疫原性細胞又は治療剤が充填されたデバイスを指す
組み合わせ製品も開示し、すなわち、それぞれが単独で医療デバイス又は細胞製品の候補であり得るが、それらは組み合わせて使用することで組み合わせ製品となる。一実施形態では、組み合わせ製品は、低免疫原性細胞が充填された有孔デバイスを指す。これは、「組み合わせ製品」又は「有孔組み合わせ製品」と称される。デバイス(有孔又は非有孔)は、米国特許第8,278,106号及び同第9,526,880号、国際出願PCT/US2016/0061442号、並びに米国意匠特許第D714956号、同第D718472号、同第D718467号、同第D718466号、同第D718468号、同第D718469号、同第D718470号、同第D718471号、同第D720469号、同第D726306号、同第D726307号、同第D728095号、同第D734166号、同第D734847号、同第D747467号、同第D747468号、同第D747798号、同第D750769号、同第D750770号、同第D755986号、同第D760399号、同第D761423号、同第D761424号(参照によりそれらの全体が組み込まれる)に記載されるような細胞カプセル化デバイスを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載されている任意のマクロ細胞送達デバイスであり得る。デバイス(有孔又は非有孔)に充填される細胞は、胚体内胚葉、PDX1陽性内胚葉、PDX1陽性前腸内胚葉、膵臓内胚葉、PDX1及びNKX6.1を発現する膵臓内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、NKX6.1及びINSを発現する内分泌前駆細胞、未成熟β細胞、NKX6.1、INS、及びMAFBを発現する未成熟β細胞、成熟内分泌細胞、INS、GCG、SST、及びPPを発現する成熟内分泌細胞、及び成熟β細胞、並びにINS及びMAFAを発現する成熟β細胞を含むがこれらに限定されない、上記で論じた任意の低免疫原性細胞であり得る。
特定の実施形態では、免疫寛容原性因子をゲノム編集された幹細胞株に挿入又は再挿入して、免疫特権を有するユニバーサルドナー幹細胞株を作成することができる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるユニバーサル幹細胞は、1つ以上の免疫寛容原性因子を発現するようにさらに修飾されている。例示的な免疫寛容原性因子には、HLA−C、HLA−E、HLA−F、HLA−G、PD−L1、CTLA−4−Ig、CD47、CI−阻害剤、及びIL−35のうちの1つ以上が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子編集の任意の方法が、上記の免疫寛容原性因子などの免疫寛容原性因子をAAVS1遺伝子座に挿入することを促進して免疫拒絶を積極的に阻害するために使用され得る。
本発明の他の実施形態を以下の番号付き項目を参照して記載する。
は活性を低減又は排除するようにICAM−1遺伝子が編集された、第2のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含むヒト多能性幹細胞。
、項目1〜8のいずれか1つのインビトロ細胞集団。
伝子が編集された、第1のゲノム修飾と、(b)細胞中のICAM−1表面発現及び/又は活性を低減又は排除するようにICAM−1遺伝子が編集された、第2のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む膵臓内胚葉(PEC)細胞。
項目1:低免疫原性細胞を含むインビトロ細胞集団であって、低免疫原性細胞が、少なくとも1つの機能的HLAクラスI細胞表面タンパク質及び少なくとも1つの機能的NK細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質を欠く、インビトロ細胞集団。
項目1:a)移植を必要とする対象に、有効量の、膵臓内胚葉細胞集団を含む移植片を投与することを含む、移植片拒絶を低減する方法であって、少なくとも1つのHLAクラスI細胞表面タンパク質及び少なくとも1つのNK細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質の機能が破壊されている、方法。
項目1:少なくとも1つの主要組織適合性複合体(MHC)クラスI遺伝子及び少なくとも1つのナチュラルキラー(NK)細胞活性化リガンド遺伝子の機能が破壊又は阻害されている、多能性細胞を含むインビトロ細胞集団。
項目14:少なくとも1つの主要組織適合性複合体(MHC)クラスI遺伝子及び少なくとも1つのナチュラルキラー(NK)細胞活性化リガンドの機能が破壊又は阻害されている、膵臓系統細胞を含むインビトロ細胞集団。
項目21:以下を含む、ヒト膵臓細胞の細胞移植片拒絶を防止する方法:
b.ヒト膵臓細胞集団を哺乳動物対象に移植し、MHCクラスI細胞表面タンパク質及びNK活性化リガンド発現がないことによって細胞移植片拒絶が防止されること。
項目26.以下を含む、インスリンの産生方法:
b)ヒト膵臓内胚葉細胞集団を哺乳動物対象に移植し、膵臓内胚葉細胞は哺乳動物対象において成熟し、グルコース刺激に応答してインスリンを産生すること。
番号4〜6のいずれか1つの配列を含むリボ核酸と接触させることにより、細胞中のICAM−1表面発現及び/又は活性を低減又は排除するようにICAM−1遺伝子が編集された、第2のゲノム修飾と、(c)細胞をCasタンパク質又はCasタンパク質をコードする核酸又は配列番号7〜9のいずれか1つの配列を含むリボ核酸と接触させることにより、細胞中のCEACAM1表面発現及び/又は活性を低減又は排除するようにCEACAM1遺伝子が編集された、第3のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む膵臓内胚葉(PEC)細胞。
「低免疫原性」若しくは「ユニバーサルドナー細胞」若しくは「変異細胞」又はそれらの同等物は、少なくとも1つのHLAクラスI細胞表面タンパク質及び少なくとも1つのNK活性化リガンドの発現が低減又は排除された細胞を意味する。そのような細胞は、そのような細胞又は移植片が移植される対象による免疫拒絶又は移植片拒絶の傾向が少ないと予想される。例えば、改変されていない野生型細胞に対して、そのような低免疫原性細胞は、そのような細胞が移植された対象による免疫拒絶の傾向が約2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97.5%、99%又はそれ以上少ないものであり得る。
抗体(例えば二重特異性抗体)、及び所望の生物学的遮断活性を示す限り、抗体断片を特に包含する。
B2M欠損hES細胞を、CyT49細胞株を使用して生成したが、任意のヒト多能性幹細胞株を使用することができる。B2M遺伝子の標的化破壊により、細胞表面上にHL
AクラスIタンパク質を発現しない細胞を生成した。CyT49 hESC株におけるB2M遺伝子座の両方の対立遺伝子は、PCT国際公開第2016183041A号(これは、その全体が本明細書に組み込まれる)に概説される既知の技術を使用したCRISPR/Cas9技術を使用して破壊された。しかしながら、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む他のヌクレアーゼを使用して、遺伝子の編集及び従来の相同組換えなどを行うことができる。B2Mの公開された配列の例は、配列番号1、2、及び3として提出している。デュアルガイドRNA及びFokIヌクレアーゼに融合された触媒的に不活性なCas9タンパク質を導入するNEXTGEN(商標)CRISPR(Transposagen Inc.,ケンタッキー州レキシントン)が、遺伝子を編集するために使用される。ガイドRNA及びCas9を含むプラスミドをCyT49 hESCにエレクトロポレーションし、細胞を組織培養プレートに播種した。エレクトロポレーションの12日後、蛍光活性化細胞選別(FACS)により、B2M抗体(BioLegendカタログ#316306)に対する陰性反応性について細胞を選別した。選別した細胞をクローン密度でプレーティングした。個々のクローンを選び、約25日目にプレーティングした。クローンを増殖させて、凍結保存した。G分染法により正常な核型を示し、かつ、フローサイトメトリー及び/又は免疫蛍光法によりB2Mタンパク質の発現及びHLAクラスIタンパク質の表面発現が陰性である増殖クローンをさらなる実験のために選択した。
次いで、野生型及びB2MノックアウトhES細胞をPan−HLA−ABCモノクローナル抗体(BD Pharmingen、カタログ#560169)を使用して分析し、これらのノックアウト細胞が細胞表面上でHLAクラスIタンパク質を発現しないことを確認した。Pan−HLA−ABC抗体は、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIタンパク質HLA−A、HLA−B、及びHLA−Cと反応する。Pan−HLA−ABC抗体の発現を、野生型及びノックアウト細胞において、IFN−γへの曝露後の通常及び炎症状態下でフローサイトメトリーにより評価した。通常:IFN−γなし(B線);炎症:100ng/mLのIFN−γへの18〜24時間の曝露(A線)。
B2MノックアウトhES細胞を、Schulz et al. A Scalable System for Production
of Functional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic Stem Cells PLoS One 7:5 1-17 (2012)及び米国特許第8,895,300号(これらは両方とも、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる)に記載されているようにWT hES細胞と同じ条件下で培養、継代、及び増殖させた。具体的には、Schulzらは、付着性hESCの増殖及び懸濁液ベースの分化について記載している。
ラー(FlexiRoll digital cell roller)(Argos Technologies)上に31rpmの速度で設置した。分化プロセスの残りの間、培養物を約3lrpmで回転させ、上記のSchulzら(2012)から調整した以下の表2に記載するものに、毎日、培地交換を行った。hESの成長、継代、及び増殖は、米国特許第7,964,402号、同8,211,699号、同8,334,138号、同8,008,07号、及び同8,153,429号に実質的に記載される通りである。ヒト胚性幹細胞由来の膵臓内胚葉細胞(PEC)を作るために使用される標準的な作製方法を以下の表2に提供する。
);0.2%FBS(HyClone)、1×GlutaMAX−1(Life Technologies)、1%v/vペニシリン/ストレプトマイシン;ITS:1:5000又は1:1000に希釈したインスリン−トランスフェリン−セレン(Life Technologies);A100:100ng/mL組換えヒトアクチビンA(R&D Systems);W50:50ng/mL組換えマウスWnt3A(R&D Systems);K25:25ng/mL組換えヒトKGF(R&D Systems);IV:2.5μM TGF−β RIキナーゼ阻害剤IV(EMD Bioscience);db:0.5×B−27サプリメント(Life Technologies)、1×GlutaMAX、及び1%v/vペニシリン/ストレプトマイシンを補充した、DMEM HIグルコース(HyClone);CTT3:0.25μM KAAD−シクロパミン(Toronto Research Chemicals)、及び3nM TTNPB(Sigma−Aldrich);N50:50ng/mL組換えヒトノギン(R&D Systems);K50:50ng/mL組換えヒトKGF(R&D Systems);E50:50ng/mL組換えヒトEGF(R&D Systems)。
次いで、実施例3の野生型及びB2Mノックアウト膵臓内胚葉細胞(PEC)を、フローサイトメトリーを使用して、IFN−γなしで又はIFN−γを用いて分析した:IF
N−γなし(B線);100ng/mLのIFN−γに18〜24時間曝露(A線)。
実施例2と同様に、野生型及びB2MノックアウトPECを、Pan−HLA−ABCモノクローナル抗体(BD Pharmingen、カタログ#560169)を使用してHLAクラスI細胞表面発現について分析した。野生型及びノックアウト細胞において(1)未処理(B線)及び(2)100ng/mLのIFN−γで18〜24時間処理(A線)の2つの条件下で、フローサイトメトリーにより、発現を評価した。
標的細胞に対するIFN−γ処理の効果をさらに定義するために、WT及びB2MノックアウトhES細胞におけるICAM−1発現を、(1)未処理(B線)及び(2)100ng/mLのIFN−γによる18〜24時間処理(A線)の2つの条件下でフローサイトメトリーにより評価した。ICAM−1は、標的細胞における抗原提示を含むいくつかの免疫学的機能に必要であり、既知のNK活性化リガンドである。インビボでは、特定
のモノクローナル抗体(「mAbs」)、すなわち、抗ICAM−1又は抗LFA−1を適用することによって細胞間ICAM/LFA結合相互作用を破壊することにより、免疫学的利点を得ることが可能である。Isobe et al., Specific Acceptance of Cardiac Allograft After Treatment With Antibodies to ICAM-1 and LFA-1, 255 SCIENCE 1125-1127 (Feb. 1992)を参照のこと。本出願人は、Milteney Biotec Inc.から得たICAM−1抗体、カタログ番号130−103−909を使用した。
実施例4及び5と同様に、野生型及びB2MノックアウトPECを、既知のNK活性化リガンド、例えばICAM−1に対する抗体を使用して分析した。ICAM−1の細胞表面タンパク質発現を、WT及びノックアウトPECにおいて(1)未処理及び(2)100ng/mLのIFN−γによる18〜24時間処理の2つの条件下でフローサイトメトリーにより評価した。
ことを発見した。したがって、ICAM−1は、PECにおいてIFN−γ刺激により非常に誘導可能である。
標的細胞に対するIFN−γ処理の効果をさらに特徴付けるために、WT PECを、(1)未処理(B線)及び(2)100ng/mLのIFN−γによる18〜24時間処理(A線)の2つの条件下でフローサイトメトリーにより評価し、他の既知のNK活性化リガンドの細胞表面タンパク質発現を分析した。
、CADM1発現がIFN−γへの曝露後に増加しないことを示唆している。
HLAクラスI発現の低減又は排除及びNK細胞活性化リガンド発現の低減又は排除の組み合わせがNK媒介細胞溶解を防止するのに十分かどうかを試験するために、5μg/mL及び10μg/mLの濃度のICAM−1遮断抗体を使用して、ICAM−1発現を標的細胞上で遮断した。ICAM−1抗体をWT又はB2M−/−ES細胞若しくはPECに添加することにより、IFN−γ処理後の標的細胞のNK溶解が低減した(図15)。
カルセイン放出アッセイは、NK細胞の細胞傷害性を研究するための非放射性代替法である。標的細胞は、蛍光色素(カルセインAM)を取り込み、それを細胞質で活性蛍光色素に変換し、該活性蛍光色素は溶解時にのみ細胞から放出される。溶解した細胞は蛍光色素を上清に放出し、次いで該上清を採取し、蛍光量を蛍光計で定量する。細胞溶解率は、NK細胞(エフェクター)、遮断抗体、又はその両方の存在下又は非存在下でインキュベーションを行った後に、上清に存在する蛍光の量から計算される。
次いで、カルセインAM標識した標的細胞を、10:1のエフェクター対標的比(E:T比)を有するNK細胞(エフェクター細胞)とともにインキュベートした。具体的には、1ウェルあたり100μLのNK細胞(1×106個/mLの密度)を96ウェルV底プレートに添加し、次いで100μLのカルセイン染色したESC又はPEC細胞を添加した(1×105個/ウェル)。指示された場合、5μg/mL及び10μg/mLの濃度のヒトICAM−1表面抗原(R&D Systems,Inc.、カタログ#BBA3)に対する遮断抗体をウェルに添加して、NK媒介細胞溶解を低減することができるかを決定した。
iceプレートリーダーを使用して蛍光を測定した(励起フィルター:485nm/発光フィルター:530nm)。特定の溶解は、溶解%=100×[(抗体ありの場合の平均蛍光−平均自発蛍光)/(平均最大蛍光−平均自発蛍光)]の式を使用して計算した。最大蛍光は、界面活性剤(1%TritonX−100)とともにインキュベートした細胞の溶解によって決定され、自発的溶解は、抗体又はエフェクター細胞を含まない標的細胞で得られた蛍光とした。
図1に示すように、目標は、シナリオC(NK細胞が標的細胞を攻撃する)からシナリオA(応答なし又は応答の低減)に移行させることである。図15では、このシナリオは条件4及び8に示される。条件4及び8では、標的細胞(B2M−/−hES細胞又はPEC)は機能的HLAクラスI表面発現を欠き、IFN−γに曝露される。上記で論じ、かつ条件4及び8に見られるように、IFN−γへの曝露は、NK活性化リガンド(ICAM−1)の増加を引き起こし、これは、IFN−γへの曝露なしのHLAクラスIノックアウトと比較して、より大きな細胞溶解をもたらす(条件3対4及び条件7対8の最初のバーを比較)。しかしながら、標的細胞上でNK活性化シグナルの発現を遮断するように作用するICAM−1阻害抗体で処理すると、NK媒介細胞溶解は、B2M−/−hES細胞では83%から73%に低下し、IFN−γで処理されたB2M−/−PECでは72%から61%に低下する。NK媒介細胞溶解率はゼロにまで低下しないが、それは、ICAM−1細胞表面タンパク質発現が遮断抗体を使用しても完全に遮断され得ず、上記で論じたように、標的細胞が2つ以上のNK活性化リガンドを発現するためである。NK媒介細胞溶解率は、ICAM−1発現がさらに阻害され、他のNK活性化リガンドが標的細胞において遮断された場合に、より大幅に低下すると予想される。したがって、ICAM−1阻害抗体は、表1に列挙されたリガンド、好ましくは分類1(既知の活性化リガンド)及び分類2(遺伝子チップデータから同定されたリガンドを活性化する潜在的候補、それらはIFNγ後にPEC及び/又はESCでアップレギュレートされる)のいずれかに対する阻害抗体を含む、さらなるNK活性化リガンド阻害抗体と組み合わせることができる。一実施形態では、ICAM1遺伝子及び他のNK活性化リガンド遺伝子は、それらの活性を完全に遮断するために破壊される。
る。これらの条件では、細胞は、B2M−/−の結果としてHLAクラスI細胞表面発現を示さない。したがって、NK活性化リガンドが細胞のIFN−γ曝露によって活性化されない場合、ICAM−1阻害抗体はほとんど効果がなく、hES細胞では71%から70%であり、PECでは54%から57%である。
実施例9は、ICAM−1発現の阻害又は抑制によって、IFN−γ処理B2M−/−PECがNK媒介細胞殺傷活性から保護されることを記載している。したがって、移植後のNK細胞媒介殺傷からB2M−/−PECを保護するためには、NK細胞活性化リガンド遺伝子を破壊することが望ましい。例えば、上記の実施例に基づき、既知のNK活性化リガンド遺伝子であるICAM−1を破壊又は「ノックアウト」することができる。好ましくは、B2M−/−CyT49 hESC株におけるICAM−1遺伝子座の両方の対立遺伝子を、CRISPR/Cas9又は現在知られている若しくは将来既知となるべき他の遺伝子編集技術を使用して破壊することができる。PCT国際公開第2016183041A号(これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。ICAM−1の公開された配列の例は、配列番号4、5、及び6として提出されている。例えば、本発明の一実施形態では、デュアルガイドRNA及びFoklヌクレアーゼに融合された触媒的に不活性なCas9タンパク質を導入するNEXTGEN(商標)CRISPR(Transposagen Inc.、ケンタッキー州レキシントン)が細胞の遺伝子編集に使用される。
実施例9及び10は、機能的細胞表面発現の阻害(抗NK活性化リガンド)及びMHCクラスI細胞表面発現の破壊(例えば、B2M−/−)と組み合わせたNK細胞活性化リガンドの遺伝子破壊(例えば、ICAM1−/−)は、NK媒介細胞死から標的細胞を保護することができることを実証している。2つ以上のNK細胞活性化リガンドを欠損した細胞の移植を行い、NK媒介細胞死からさらに保護することができる。
る。CD58遺伝子座の両方の対立遺伝子は、国際公開第2016183041Aで概説されている既知の技術を使用したCRISPR/Cas9技術を使用して、B2M−/−:ICAM−/−ダブルノックアウトCyT49 hESC株において破壊することができる。CEACAM1の公開された配列の例は、配列番号7、8、及び9として提出されている。再度、編集バージョンは、NEXTGEN(商標)CRISPR(Transposagen Inc.、ケンタッキー州レキシントン)であり得る。
表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない(例えば、ICAM1−/−及びCD58−/−)。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスRNA、RNAデコイ、リボザイム、RNAアプタマー、siRNA、shRNA/miRNA、トランスドミナントネガティブタンパク質(TNP)、キメラ/融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体(sFv)、ヌクレオシド類似体(NRTI)、非ヌクレオシド類似体(NNRTI)、インテグラーゼ阻害剤(オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤)、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性T細胞(CTL)媒介傷害及びNK細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、CTL又はNK細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるHLAクラスIがほとんど又は全くなく、NK活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
NK活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト(例えば、hES細胞由来の細胞療法)によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のNK活性化リガンドを排除/低減する必要があり得る。標的細胞上のNK活性化リガンドの効果を阻害することによってNK細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、WT及びB2M−/−hES細胞及びPECにおけるNK活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のCADM1及びCD58タンパク質を遮断するためのCADM1及びCD58遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる(図15と同様)。したがって、NK細胞による細胞溶解は、CADM1及びCD58などのNK活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。B2M−/−細胞においてNK活性化リガンドに対する抗体を使用してCADM1及びCD58の発現を遮断することは、3つのノックアウト(HLAクラスI遺伝子ノックアウト及びNK活性化リガンド遺伝子ノックアウト)を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞(例えば、hES及び/又は膵臓系統細胞)は、図1のシナリオCからシナリオAに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、HLAクラスI細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず(B2M−/−)、NK活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない(例えば、CADM1−/−及びCD58−/−)。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスRNA、RNAデコイ、リボザイム、RNAアプタマー、siRNA、shRNA/miRNA、トランスドミナントネガティブタンパク質(TNP)、キメラ/融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体(sFv)、ヌクレオシド類似体(NRTI)、非ヌクレオシド類似体(NNRTI)、インテグラーゼ阻害剤(オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤)、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性T細胞(CTL)媒介傷害及びNK細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、CTL又はNK細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるHLAクラスIがほとんど又は全くなく、NK活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
NK活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト(例えば、hES細胞由来の細胞療法)によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のNK活性化リガンドを排除/低減する必要があり得る。標的細胞上のNK活性化リガンドの効果を阻害することによっ
てNK細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、WT及びB2M−/−hES細胞及びPECにおけるNK活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のCD155及びCD58タンパク質を遮断するためのCD155及びCD58遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる(図15と同様)。したがって、NK細胞による細胞溶解は、CD155及びCD58などのNK活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。B2M−/−細胞においてNK活性化リガンドに対する抗体を使用してCD155及びCD58の発現を遮断することは、3つのノックアウト(HLAクラスI遺伝子ノックアウト及びNK活性化リガンド遺伝子ノックアウト)を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞(例えば、hES及び/又は膵臓系統細胞)は、図1のシナリオCからシナリオAに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、HLAクラスI細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず(B2M−/−)、NK活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない(例えば、CD155−/−及びCD58−/−)。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスRNA、RNAデコイ、リボザイム、RNAアプタマー、siRNA、shRNA/miRNA、トランスドミナントネガティブタンパク質(TNP)、キメラ/融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体(sFv)、ヌクレオシド類似体(NRTI)、非ヌクレオシド類似体(NNRTI)、インテグラーゼ阻害剤(オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤)、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性T細胞(CTL)媒介傷害及びNK細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、CTL又はNK細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるHLAクラスIがほとんど又は全くなく、NK活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
NK活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト(例えば、hES細胞由来の細胞療法)によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のNK活性化リガンドを排除/低減する必要があり得る。標的細胞上のNK活性化リガンドの効果を阻害することによってNK細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、WT及びB2M−/−hES細胞及びPECにおけるNK活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のICAM1、CD155、及びCD58タンパク質を遮断するためのICAM1、CD155、及びCD58遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる(図15と同様)。したがって、NK細胞による細胞溶解は、ICAM1、CD58、及びCD155などのNK活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。B2M−/−細胞においてNK活性化リガンドに対する抗体を使用してICAM1、CD58、及びCD155の発現を遮断することは、4つのノックアウト(HLAクラスI遺伝子ノックアウト及びNK活性化リガンド遺伝子ノックアウト)を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞(例えば、hES及び/又は膵臓系統細胞)は、図1のシナリオCからシナリオAに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、HLAクラスI細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず(B2M−/−)、NK活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない(例えば、ICAM1−/−、CD58−/−、及びCD155−/−)。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスRNA、RNAデコイ、リボザイム、RNAアプタマー、siRNA、shRNA/miRNA、トランスドミナントネガティブタンパク質(TNP)、キメラ/融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガン
ド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体(sFv)、ヌクレオシド類似体(NRTI)、非ヌクレオシド類似体(NNRTI)、インテグラーゼ阻害剤(オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤)、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性T細胞(CTL)媒介傷害及びNK細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、CTL又はNK細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるHLAクラスIがほとんど又は全くなく、NK活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
NK活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト(例えば、hES細胞由来の細胞療法)によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のNK活性化リガンドを排除/低減する必要があり得る。標的細胞上のNK活性化リガンドの効果を阻害することによってNK細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、WT及びB2M−/−hES細胞及びPECにおけるNK活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のICAM1、CD155、CD58、及びCADM1タンパク質を遮断するためのICAM1、CD155、CD58、及びCADM1遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる(図15と同様)。したがって、NK細胞による細胞溶解は、ICAM1、CD58、CD155、及びCADM1などのNK活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。B2M−/−細胞においてNK活性化リガンドに対する抗体を使用してICAM1、CD58、CD155、及びCADM1の発現を遮断することは、5つのノックアウト(HLAクラスI遺伝子ノックアウト及びNK活性化リガンド遺伝子ノックアウト)を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞(例えば、hES及び/又は膵臓系統細胞)は、図1のシナリオCからシナリオAに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、HLAクラスI細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず(B2M−/−)、NK活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない(例えば、ICAM1−/−、CD58−/−、CD155−/−、及びCADM1−/−)。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスRNA、RNAデコイ、リボザイム、RNAアプタマー、siRNA、shRNA/miRNA、トランスドミナントネガティブタンパク質(TNP)、キメラ/融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体(sFv)、ヌクレオシド類似体(NRTI)、非ヌクレオシド類似体(NNRTI)、インテグラーゼ阻害剤(オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤)、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性T細胞(CTL)媒介傷害及びNK細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、CTL又はNK細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるHLAクラスIがほとんど又は全くなく、NK活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
NK活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト(例えば、hES細胞由来の細胞療法)によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のNK活性化リガンドを排除/低減する必要があり得る。標的細胞上のNK活性化リガンドの効果を阻害することによってNK細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、WT及びB2M−/−hES細胞及びPECにおけるNK活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のICAM1、C
D155、及びCADM1タンパク質を遮断するためのICAM1、CD155、及びCADM1遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる(図15と同様)。したがって、NK細胞による細胞溶解は、ICAM1、CD155、及びCADM1などのNK活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。B2M−/−細胞においてNK活性化リガンドに対する抗体を使用してICAM1、CD155、及びCADM1の発現を遮断することは、4つのノックアウト(HLAクラスI遺伝子ノックアウト及びNK活性化リガンド遺伝子ノックアウト)を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞(例えば、hES及び/又は膵臓系統細胞)は、図1のシナリオCからシナリオAに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、HLAクラスI細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず(B2M−/−)、NK活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない(例えば、ICAM1−/−、CD155−/−、及びCADM1−/−)。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスRNA、RNAデコイ、リボザイム、RNAアプタマー、siRNA、shRNA/miRNA、トランスドミナントネガティブタンパク質(TNP)、キメラ/融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体(sFv)、ヌクレオシド類似体(NRTI)、非ヌクレオシド類似体(NNRTI)、インテグラーゼ阻害剤(オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤)、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性T細胞(CTL)媒介傷害及びNK細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、CTL又はNK細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるHLAクラスIがほとんど又は全くなく、NK活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
Claims (13)
- 膵臓系統細胞を含むインビトロ細胞集団であって、少なくとも1つの主要組織適合性複合体(MHC)クラスI遺伝子及び少なくとも1つのナチュラルキラー(NK)細胞活性化リガンドの機能が、前記膵臓系統細胞において破壊又は阻害されている、インビトロ細胞集団。
- 前記MHCクラスI遺伝子が、β−2マイクログロブリン(B2M)又はヒト白血球抗原(HLA)−ABC細胞表面タンパク質をコードする、請求項1に記載のインビトロ細胞集団。
- 前記NK細胞活性化リガンドが、細胞間接着分子(ICAM)1、分化抗原群(CD)58、CD155、ポリオウイルス受容体(PVR)、癌胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)1、細胞接着分子(CADM)1、主要組織適合性クラスI関連鎖タンパク質(MIC)A、MICB、又はそれらの組み合わせである、請求項1又は2に記載のインビトロ細胞集団。
- NK細胞活性化リガンドの組み合わせが、前記膵臓系統細胞において破壊又は阻害され、前記NK細胞活性化リガンドの組み合わせが、a)CD58及びICAM1、b)CD58、ICAM1、及びCD155、c)CD58及びCADM1、d)CD58及びCD155、e)CD58、ICAM1、CD155、及びCADM1、又はf)ICAM1、CADM1、及びCD155である、請求項1又は2に記載のインビトロ細胞集団。
- 前記膵臓系統細胞が、胚体内胚葉、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、内分泌前駆体、又はインスリン産生細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団。
- 前記膵臓系統細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに前記剤が膵臓系統細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団。
- 前記タンパク質が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、前記細胞死誘導剤が、ガンシクロビルである、請求項6に記載のインビトロ細胞集団。
- 前記MHCクラスI遺伝子が、ゲノム編集を使用して破壊又は阻害されるか、又は前記NK細胞活性化リガンドが、ゲノム編集を使用して破壊及び/又は阻害される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団。
- 前記ゲノム編集が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、エンドデオキシリボヌクレアーゼ、クラスター化され規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復(CRISPR)/cas)システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システム、又は相同組換えの使用を含む、請求項8に記載のインビトロ細胞集団。
- 前記NK細胞活性化リガンドが、抗NK細胞活性化リガンド剤を使用して破壊又は阻害される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団。
- 前記抗NK細胞活性化リガンド剤が、抗体又は抗体断片である、請求項10に記載のインビトロ細胞集団。
- 哺乳動物対象におけるヒト膵臓系統細胞の細胞移植片拒絶を低減する方法であって、治
療有効量の請求項1〜11のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団を前記哺乳動物対象に移植することを含み、前記MHCクラスI遺伝子及びNK細胞活性化リガンドの機能の破壊又は阻害によって、前記MHCクラスI遺伝子及びNK細胞活性化リガンドの機能が破壊又は阻害されていないヒト膵臓系統細胞と比較して、細胞移植片拒絶が低減される、方法。 - 哺乳動物対象においてインスリンを産生する方法であって、治療有効量の請求項1〜11のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団を前記哺乳動物対象に移植することを含み、前記細胞集団が、前記哺乳動物対象において、グルコース刺激に応答してインスリンを産生する細胞へと成熟する、方法。
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