JP2020521146A - 光学顕微鏡の画像コントラスト増強 - Google Patents

Abstract

物体を撮像する方法は、物体をサンプルホルダのプラズモン層の上で支持するステップであって、プラズモン層は、物体に近接するサブミクロン構造の周期的アレイを画定する、ステップと、サンプルホルダを光に露出するステップであって、光の第１部分が、（ｉ）プラズモン層を通過するが、物体を通過しないか、あるいは、（ｉｉ）プラズモン層および物体の第１セクションを通過するようにし、光の第２部分が、プラズモン層および物体の少なくとも第２セクションを通過するようにし、光は、少なくともプラズモン層と相互作用し、透過光の第１部分は、１つ以上の第１表面プラズモン共鳴ピークによって特徴付けられ、透過光の第２部分は、物体がプラズモン層内を伝搬するプラズモンに影響を与える結果として、第１表面プラズモン共鳴ピークから波長シフトした、１つ以上の第２表面プラズモン共鳴によって特徴付けられる、ステップと、透過光の第１部分および第２部分から物体の画像を構築し、これにより物体を空間的に分解可能にするステップと、を含む。

Description

本開示は、一般に、光学顕微鏡法のための方法、デバイスおよび機器に関する。より詳細には、本開示は、光学顕微鏡内のサンプルの画像コントラストを増強するための方法、デバイスおよび機器に関する。

１７世紀のレーベンフックによる生物学への光学顕微鏡の応用は、生命科学において重要な瞬間であった。それ以来、位相差顕微鏡の導入など、顕微鏡の継続的な開発が行われ、通常は光をあまり散乱したり吸収したりせず、透明に見える生体細胞を研究することが可能になった。位相差顕微鏡法は、試料を通る光路長の変動を利用しており、これは、材料の屈折率および厚さの両方の関数である。適切な設定では、異なる光路長の光線間の干渉により、建設的干渉および相殺的干渉が発生し、サンプルの位相情報が光の振幅の変化として見えるようになる。

その偉大な成功にも拘らず、位相差顕微鏡法は、疑似の量の光が撮像物体のエッジを越えて見える、いわゆる「ハロー(halo)」効果など、アーチファクト（人工物）の潜在的な導入を含む多くの短所を有する。従って、ハロー効果は、位相差顕微鏡の空間分解能を事実上減少させる。

光学顕微鏡のコントラストを増強するために使用される他の関連技術は、ジョルジュ・ノマルスキーによって開発された微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）イメージングである。ＤＩＣは、波面剪断方向の偏光依存の変化率を干渉と組み合わせて使用し、サンプル内の光路長差を増強する。多くの位相差顕微鏡法とは異なり、ＤＩＣは、回折ハローアーチファクトを含まない。この方法は、構造化された表面に似た擬似３Ｄ画像を出力するが、サンプルのトポロジー（位相幾何）の正確な表現ではない。

位相差顕微鏡法とＤＩＣ手法の両方は、従来の光学顕微鏡の設定への変更を必要とし、経験豊富なユーザが画像情報を適切に解釈する必要がある。これらの手法の欠点は、従来の顕微鏡法と比較して空間分解能が減少することがあり、得られる画像はアーチファクトを含むことがあることである。

現代の顕微鏡を支える光学システムは、非常に高い開口数のレンズを使用することによって、高い空間分解能でサンプルを撮像することが可能である。しかしながら、生命科学にとって、画像コントラストおよび特異性(specificity)の問題は、光と弱く相互作用する試料のイメージングにとって依然として根本的な課題である。これは、多くの細胞および組織サンプルを含む。従来の明視野顕微鏡において、入射光とサンプルの相互作用、光学システムの品質、および検出器の効率がコントラストを決定付ける。これは、コントラストが撮像試料の固有の特性ではなく、撮像システムの固有の特性であることを意味する。

光学顕微鏡法において、画像コントラストは、位相情報、光路長の勾配(gradient)、サンプルの染色または蛍光標識(labelling)を用いて増強できる。特に位相コントラストイメージングは、光との相互作用が弱すぎて従来の顕微鏡を用いて検出できないサンプル構造(feature)のコントラストを増強するために使用される主要な手法の１つになった。

位相コントラストまたはＤＩＣイメージングが利用できないか、またはアーチファクトが生じる場合、染色が通常使用され、コントラストを増加させる。この場合、試料に導入された色素による光吸収の結果として、画像コントラストが増強される。この手法の欠点は、サンプル損傷の可能性、アーチファクトの導入、および生体サンプルを撮像する能力がないことである。

従って、従来の光学設定を用いて、未染色の蛍光フリーのサンプルを撮像するための、高コントラストでラベルフリーの撮像手法を開発するニーズがある。

本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、物品などの議論は、これらの事項の何れかまたは全ては、先行技術の基礎の一部を形成するという自認として解釈すべきではなく、本願の各請求項の優先日前に存在しているような本開示に関連する分野での共通の一般的な知識であり、あるいは、関連性ありと見做されるか、または当業者によって組み合わされたと合理的に予想されると理解されるであろう。

本開示の第１態様において、物体を撮像する方法が提供される。該方法は、
物体をサンプルホルダのプラズモン層の上で支持するステップであって、プラズモン層は、物体に近接するサブミクロン構造の周期的アレイを画定する、ステップと、
サンプルホルダを光に露出するステップであって、
光の第１部分が、プラズモン層を通過するが、物体を通過しないか、あるいは、プラズモン層および物体の第１セクションを通過するようにし、
光の第２部分が、プラズモン層および物体の少なくとも第２セクションを通過するようにし、
光は、少なくともプラズモン層と相互作用し、
透過光の第１部分は、１つ以上の第１表面プラズモン共鳴ピークによって特徴付けられ、
透過光の第２部分は、物体がプラズモン層内を伝搬するプラズモンに影響を与える結果として、第１表面プラズモン共鳴ピークから波長シフトした、１つ以上の第２表面プラズモン共鳴によって特徴付けられる、ステップと、
透過光の第１部分および第２部分から物体の画像を構築し、これにより物体を空間的に分解可能にするステップと、を含む。

幾つかの実施形態において、該方法はさらに、画像を解析して物体を空間的に分解することを含む。

光は、２００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の複数の波長を有してもよい。幾つかの実施形態において、第１および第２表面プラズモン共鳴ピークの少なくとも一方は、３００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲の波長でピーク強度を有する。

サブミクロン構造は、２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲のサブミクロン構造間の間隔を備えた周期的アレイ状に配置されてもよい。サブミクロン構造は、５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の最大寸法を有してもよい。

幾つかの実施形態において、サブミクロン構造は、プラズモン層を通るアパーチャ（開口）である。アパーチャは、円、トーラス、楕円、十字形、および複数の交差する細長いアームを含む形状のいずれか１つ以上として成形してもよい。近接する細長いアーム間の角度は、３０°〜９０°の範囲である。

該方法はさらに、サンプルホルダおよび物体を、偏光した光に露出することを含んでもよい。

更なる実施形態において、偏光した光は、アパーチャの周期的アレイの第１軸に対して第１偏光角で直線偏光しており、周期的アレイは、第１軸に沿ったサブミクロン構造の第１間隔を有し、これは、第２軸に沿ったサブミクロン構造の第２間隔とは異なり、第２軸は、第１軸に対してある角度で配向している。該方法はさらに、第１軸に対して第２偏光角で直線偏光した光にサンプルホルダおよび物体を露出することを含んでもよい。

幾つかの実施形態において、該方法は、光学顕微鏡を用いて実施される。

プラズモン層は、Ａｌ，Ａｇ，Ａｕ，Ｎｉ，ＰｔおよびＰｄのいずれかから選択される１つ以上の金属から形成してもよい。プラズモン層は、２０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の厚さを有してもよい。

サンプルホルダは、プラズモン層のための機械的支持を提供するために、プラズモン層の第１表面の少なくとも一部に接続された基板を含む。基板は、光学的に透明でもよく、そのため基板を通る光透過率がゼロより大きく、基板は第１表面を化学的に隔離する。

幾つかの実施形態において、サンプルホルダは、プラズモン層を隔離するためにプラズモン層の第２側に結合された光学的に透明な保護層を含む。光学的に透明な保護層は、１５０ｎｍ未満の厚さを有してもよい。幾つかの実施形態において、光学的に透明な保護層は、８０ｎｍ未満の厚さを有してもよい。光学的に透明な保護層は、酸化シリコン、窒化シリコン、透明金属酸化物およびポリマーのいずれか１つ以上を含んでもよい。

本開示の第２態様において、光学顕微鏡で使用するためのサンプルホルダが提供される。サンプルホルダは、サブミクロン構造の周期的アレイを画定するプラズモン層を含み、
サンプルホルダおよびプラズモン層は、
物体を支持する場合、サブミクロン構造のアレイが物体に近接するように物体を支持し、
光がプラズモン層を透過できるようにし、光は、少なくともプラズモン層と相互作用し、透過光からのスペクトルは、
１つ以上の第１表面プラズモン共鳴ピークによって特徴付けられる第１部分と、
物体がプラズモン層内を伝搬するプラズモンに影響を与える結果として、第１表面プラズモン共鳴ピークから波長シフトした、１つ以上の第２表面プラズモン共鳴によって特徴付けられる第２部分とを含み、
これにより透過光から物体の画像を構築し、物体を該画像から空間的に分解可能にするように構成される。

プラズモン層は、３００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲の波長でピーク強度を備えた少なくとも１つの表面プラズモン共鳴ピークを生成するように構成してもよい。

サブミクロン構造は、２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲のサブミクロン構造間の間隔を備えた周期的アレイ状に配置されてもよい。サブミクロン構造は、５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の最大寸法を有してもよい。

幾つかの実施形態において、サブミクロン構造は、プラズモン層を通るアパーチャ（開口）である。アパーチャは、円、トーラス、楕円、十字形、および複数の交差する細長いアームを含む形状のいずれか１つ以上として成形してもよい。近接する細長いアーム間の角度は、３０°〜９０°の範囲である。

プラズモン層は、Ａｌ，Ａｇ，Ａｕ，Ｎｉ，ＰｔおよびＰｄのいずれかから選択される１つ以上の金属から形成してもよい。プラズモン層は、２０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の厚さを有してもよい。

サンプルホルダは、プラズモン層のための機械的支持を提供するために、プラズモン層の第１表面の少なくとも一部に接続された基板を含む。基板は、光学的に透明でもよく、そのため基板を通る光透過率がゼロより大きく、基板は第１表面を化学的に隔離する。

幾つかの実施形態において、サンプルホルダは、プラズモン層を隔離するために、プラズモン層の第２側に結合された光学的に透明な保護層を含む。光学的に透明な保護層は、１５０ｎｍ未満の厚さを有してもよい。幾つかの実施形態において、光学的に透明な保護層は、８０ｎｍ未満の厚さを有してもよい。光学的に透明な保護層は、酸化シリコン、窒化シリコン、透明金属酸化物およびポリマーのいずれか１つ以上を含んでもよい。

本開示の第３態様において、光学顕微鏡で使用される場合に第１態様に係る方法を実施する、第２態様の請求項の実施形態のいずれか１つに係るサンプルホルダが提供される。

本明細書全体を通して、言葉「備える、含む(comprise)」、または「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などの変形は、記述した要素、整数またはステップ、または要素のグループ、整数またはステップの包含を意味し、他の要素、整数またはステップ、または要素のグループ、整数またはステップの除外を意味しないと理解される。

実施形態は、一例として以下に簡単に説明される添付図面を参照して、さらに詳細に後述する。

幾つかの実施形態に係る、撮像物体を支持するためのサンプルホルダの側面断面図である。 図１ａのサンプルホルダのあるセクションの上面図であり、挿入画像が、サンプルホルダのプラズモン層のサブミクロン構造またはアパーチャのアレイの拡大図を示す。 表面プラズモン共鳴ピークを含むスペクトルのプロットである。 幾つかの実施形態に係るサンプルホルダのあるセクションの上面図である。 幾つかの実施形態に係るサンプルホルダの側面図である。 幾つかの実施形態に係る、物体を撮像する方法のフローチャートである。 一実施形態に係るサンプルホルダ上に支持された物体の上面明視野顕微鏡画像である。 従来の顕微鏡スライド上に支持された図６ａの物体の上面明視野顕微鏡画像である。 幾つかの実施形態に係る、物体を支持するサンプルホルダの側面断面図であり、光の第１部分を示す。 図７ａのサンプルホルダおよび物体の側面断面図であり、光の第２部分を示す。 一実施形態に係るサンプルホルダ上に支持された物体の０°直線偏光した光を用いた上面明視野顕微鏡画像である。 一実施形態に係る図８ａのサンプルホルダ上に支持された物体の９０°直線偏光した光を用いた上面明視野顕微鏡画像である。 一実施形態に係るサンプルホルダ上に支持されたミエリン鞘(myelin sheath)の０°直線偏光した光を用いた明視野顕微鏡画像、および画像の一部の拡大画像である。 図９ａのサンプルホルダ上の図９ａに示した同じミエリン鞘の９０°直線偏光した光を用いた明視野顕微鏡画像、および画像の一部の拡大画像である。 一実施形態に係るサンプルホルダ上に支持されたイオン注入薄膜の明視野顕微鏡画像である。 従来の顕微鏡スライド上に支持されたイオン注入薄膜の明視野顕微鏡画像である。 一実施形態に係るサンプルホルダ上に支持された子房(plant ovary)の断面の明視野顕微鏡画像である。 従来の顕微鏡スライド上に支持された子房の断面の明視野顕微鏡画像である。

本開示は、一般に、光学顕微鏡法のための方法、デバイスおよび機器に関する。より詳細には、本開示は、光学顕微鏡内のサンプルの画像コントラストを増強するための方法、デバイスおよび機器に関する。

幾つかの実施形態は、例えば、顕微鏡スライドなど、変更したサンプルホルダを用いる顕微鏡法のための方法およびデバイスに関する。これらの方法およびデバイスは、染色または蛍光マーカーを使用することなく、構造を空間的に分解可能にしつつ、著しい画像コントラスト増強を好都合に提供できる。

図１ａと図１ｂを参照して、顕微鏡（図示せず）で使用するためのサンプルホルダ１００が提供される。サンプルホルダ１００は、サブミクロンサイズの構造１２４の周期的アレイ１２２を画定するプラズモン層１２０を含み、サンプルホルダ１００およびプラズモン層１２０は、サブミクロン構造１２４のアレイ１２２が物体１４０に近接するように、物体１４０を支持するように構成される。

幾つかの実施形態において、サンプルホルダ１００は、サブミクロンサイズの構造１２４の周期的アレイ１２２を画定するプラズモン層１２０を備え、サンプルホルダ１００は、プラズモン層１２０のサブミクロン構造１２４のアレイ１２２が物体１４０に近接するように、物体１４０を支持するように構成される。例えば、プラズモン層１２０は、物体１４０を支持するように構成してもよい。

幾つかの実施形態において、プラズモン層１２０の少なくとも一部は、自立型フィルムまたは自己支持型フィルムであり、サンプルホルダ１００は、プラズモン層１２０の他の部分を支持するフレームを含んでもよい。

光源１５２が、サンプルホルダ１００を露出する光１５０を生成するために使用される。サンプルホルダ１００およびプラズモン層１２０は、プラズモン層１２０に入射する光１５０がサンプルホルダ１００およびプラズモン層１２０を透過できるように構成され、そのため透過光１６０は、１つ以上の固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０を備えたスペクトル２００（図２Ａ）によって特徴付けられる。透過光１６０の得られるスペクトル２００は、より詳しく後述するように、サンプルホルダ１００及び／又はプラズモン層１２０の特性に特徴的である１つ以上の固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０を示すことができる。

幾つかの実施形態において、サンプルホルダ１００は、プラズモン層１２０に入射する光１５０がサンプルホルダ１００およびプラズモン層１２０を透過可能にするように構成される。例えば、サンプルホルダ１００は、より詳しく後述するように、ウインドウまたはアパーチャを画定するフレーム、あるいは光学的に透明な基板４１０を含んでもよい。

入射光１５０は、プラズモン層１２０が延在する水平面（不図示）に対して垂直な長手方向Ｚに伝搬できる。

周期的アレイ１２２は、例えば、三角形、長方形または正方形のアレイでもよい。三角形の周期的アレイは、六角形アレイの外観を与えることがある。各サブミクロン構造１２４間の間隔は、必要に応じて２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲である。

幾つかの実施形態において、サブミクロン構造１２４は、プラズモン層１２０を通るアパーチャである。アパーチャは、５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の最大開口を有してもよい。アパーチャは、円、楕円、トーラス、正方形、長方形、十字形、多角形のいずれか１つ以上として成形してもよい。例えば、図１ｂの挿入画像のスケールバー１９１は３００ｎｍでもよく、円形アパーチャは１６０ｎｍの直径を有してもよい。

アパーチャ１２４のアレイ１２２は、集束イオンビーム、フォトリソグラフィおよび化学エッチング、または電子ビームリソグラフィおよび化学エッチング、またはテンプレートを用いたナノインプリント方式の技術のいずれか１つを用いて、プラズモン層１２０に形成できる。

サブ波長ナノスケールのアパーチャの周期的アレイを通る光伝搬は、異常光透過(Extraordinary Optical Transmission)によって説明できる。異常光透過は、アパーチャのサイズに等しいか、それより長い入射光１５０の波長で発生することがある。この現象は、プラズモン層１２０での表面プラズモンポラリトン伝搬によって説明できる。

サブミクロン構造１２４はまた、粗い表面、ナノ粒子、柱(pillar)および格子(grating)も含んでもよい。サブミクロン構造は、光１５０の波長より小さいか、それに等しい距離だけ隔離及び／又は分離してもよい。サブミクロン構造１２４のサイズに等しいか、これより長い波長を備えた入射光１５０は、より詳しく後述するように、プラズモン層１２０での表面プラズモンポラリトンの伝搬を導くことができる。

図２に示すスペクトル２００は、透過光１６０の強度が透過光１６０の波長λにどのように依存するかを示す。各固有表面プラズモン共鳴ピーク２２０は、共鳴波長λＰ２２２によって定義され得る。表面プラズモン共鳴ピーク２２０の共鳴波長λ_Ｐ２２２は、固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０の最大強度に対応する波長と考えてもよい。代替として、表面プラズモン共鳴ピーク２２０の共鳴波長λ_Ｐ２２２は、固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０の最大強度の半分である波長間の中心波長でもよい。

固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０は、入射光１５０と、プラズモン層１２０の表面１２５，１２６での自由電子の集団振動との共鳴相互作用の結果である。これは、伝搬励起または、表面プラズモンポラリトンとして知られる表面プラズモンを導く。表面プラズモンポラリトンの共鳴波長λ_Ｐ２２２（および個々の共鳴周波数）は、プラズモン層１２０の表面組成および構造に強く依存する。

固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０の波長は、サンプルホルダパラメータ、例えば、プラズモン層１２０の誘電率、アレイ１２２およびサブミクロン構造またはアパーチャ１２４の構成などにも依存し得る。例えば、アパーチャの間隔およびサイズ（さらに後述する）は、固有の共鳴ピーク２２０の波長に影響を与え得る。従って、固有の共鳴ピーク２２０は、サンプルホルダ１００及び／又はプラズモン層１２０の構成に特徴的である。

幾つかの実施形態において、プラズモン層１２０は、２００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長を備えた少なくとも１つの固有のプラズモン共鳴ピーク２２０を生成するように構成される。従って、透過光１６０の少なくとも幾つかは可視であり、可視スペクトルの波長を含むためである。

プラズモン層１２０の誘電率は、特定の材料からプラズモン層１２０を形成することによって予め決定できる。幾つかの実施形態において、プラズモン層１２０は、Ａｌ，Ａｇ，Ａｕ，Ｎｉ，ＰｔおよびＰｄのグループから選択される１つ以上の金属から形成される。プラズモン層１２０は、２０〜３００ｎｍの範囲の厚さを有してもよい。入射光１５０の幾つかは、使用する材料および光の波長に応じて、プラズモン層１２０を直接透過することがある。これは、プラズモン層１２０によって提供される画像コントラスト増強を減少させる背景光に寄与することがあるため、望ましくない場合がある。

プラズモン層１２０が金属から形成される場合、金属プラズモン層１２０は、物理的堆積方法、例えば、以下に限定されないが、スパッタリング、熱蒸着または電子ビーム蒸着などを用いて、基板（後述する透明基板４１０など）上に堆積してもよい。

表面プラズモンポラリトンの電磁場はまた、プラズモン層１２０の表面１２６の外側におよびこれを超えて存在する。表面１２６に垂直な電磁場の成分は、図１に示すように、プラズモンの表面１２６に垂直な方向Ｚに指数関数的に減衰する。その結果、プラズモン層１２０に近接する近傍での環境は、表面プラズモンポラリトン、固有の共鳴ピーク２２０、および共鳴波長λ_Ｐ２２２の生成にも影響を与えることができる。表面プラズモンポラリトンは、例えば、プラズモン層１２０内のサブミクロン構造１２４のアレイ１２２に近接する環境の屈折率または誘電率の差に対して敏感である。

図１ａに示すように、プラズモン層１２０は、第１表面１２５および第２表面１２６を画定する。第２表面１２６は、第１表面１２５の裏面でもよい。第１表面１２５および第２表面１２６は、プラズモン層１２０の主面(major surface)でもよい。各表面１２５，１２６に近接する環境の誘電率が異なる場合、プラズモン層１２０を透過した光からのスペクトル２００は、第１表面１２５においてプラズモンを発生する光に対応する他の固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２１も含んでもよい。

物体１４０はまた、物体１４０がプラズモン層１２０に近接して配置される場合、表面プラズモン伝搬に影響を与えることができる。プラズモン層１２０での表面プラズモン伝搬に影響を与えるように、物体１４０がプラズモン層１２０に充分に近い場合、プラズモン層１２０および物体１４０を透過する光１７０は、第２スペクトル２３０（図２）によって特徴付けられる。例えば、プラズモン層１２０での表面プラズモンポラリトンによって発生する電磁場は、プラズモン層１２０から離れる方向Ｚに指数関数的な減衰を示す。従って、物体１４０は、プラズモン層１２０での表面プラズモン伝搬にさらに影響を与えることがあり、さらにより少ない程度でプラズモン層１２０から影響を与えることがある。一例として、金属製である物体１４０は、第２表面から最大１００ｎｍまで離れていても、プラズモン層１２０での表面プラズモン伝搬および表面プラズモン共鳴ピーク２２０，２２１に検出可能なように影響を与えることがある。

図２に示すように、第２スペクトル２３０は、物体１４０がプラズモン層１２０内を伝搬する表面プラズモンに影響を与える結果として、固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０から波長シフトした１つ以上の第２表面プラズモン共鳴ピーク２４０を含む。

第２表面プラズモン共鳴ピーク２４０は、固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０と比較してより低い強度を有することがある。

第１表面１２５でプラズモンを発生する光に対応する固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２１の光の強度も、物体１４０が第２表面１２６に近接して配置される結果として増加することがある。

物体１４０（図１ａ）の画像１８０が、透過光１６０，１７０から構築できる。理由は、透過光１６０の第１部分のスペクトル２２０は、透過光１７０の第２部分のスペクトル２３０と異なることがあるためである。スペクトル２００，２３０間のこの相違は、画像コントラストとして現れる。画像１８０の構築は、より詳細に後述する。

図３を参照して、幾つかの実施形態において、プラズモン層１２０，３２０は、十字形のアパーチャ３２４の周期的アレイを画定する。アパーチャ３２４は、中央アパーチャ３２６から延びる複数の交差する細長いアーム３２５を画定する形状として記述できる。各アーム３２５は、近接するアーム３２５間にある角度が存在するように配向している。近接するアーム３２５間の角度は、必要に応じて３０°〜９０°の範囲である。幾つかの実施形態において、アパーチャ３２４が十字形として成形された場合、角度は９０°でもよい。アパーチャ３２４が８つの細長いアームを含む実施形態において、角度は４５°でもよい。アパーチャ３２４は、１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の最大開口を有する。例えば、図示したスケールバー３９０は３００ｎｍでもよく、十字形の最大開口は１６０ｎｍでもよい。好都合には、十字形のアパーチャ３２４は、円形アパーチャから得られる表面プラズモン共鳴ピーク２２０，２２１，２４０よりも鋭い表面プラズモン共鳴ピーク２２０，２２１，２４０を生成できる。これにより、より大きな画像コントラストが得られ、従って、表面プラズモン共鳴ピーク２２０，２２１，２４０の幅よりも少ない小さな波長シフトをもたらす物体１４０に対する検出感度が得られることがある。例えば、１０ｎｍ未満の厚さである物体または、類似の屈折率を有する物体のセクションは、小さな波長シフトをもたらすことがある。

アパーチャ３２４の周期的アレイは、第２軸Ｙに沿った第２間隔Ｂとは異なる第１軸Ｘに沿った第１間隔Ａを有してもよい。従って、周期的アレイは、非対称アレイとして記述できる。第２軸は、第１軸に対してある角度で配向している。該角度は、例えば、３０°〜９０°の範囲でもよい。幾つかの実施形態において、周期的アレイは長方形アレイである。一実施形態において、第１間隔Ａは４００ｎｍであり、第２間隔Ｂは３５０ｎｍである。

図４を参照して、幾つかの実施形態において、サンプルホルダ１００，４００はまた、プラズモン層１２０，４２０の機械的支持を提供するために、プラズモン層１２０，４２０の第１表面１２５，４２５に接続された光学的に透明な基板４１０を含む。光学的に透明な基板４１０は、光１５０が、これを通過してプラズモン層１２０，４２０まで０パーセントより大きい光透過（例えば、透過率）で通過可能にする。光学的に透明な基板４１０は、プラズモン層１２０，４２０内で伝搬表面プラズモンを生成するのに充分な光を透過させる。幾つかの実施形態において、基板４１０を通る光透過率は少なくとも５０％である。

基板４１０は、二酸化シリコン系ガラス、石英(quartz)、サファイア、透明金属酸化物、またはポリマーのうちの１つから選択された材料から形成してもよい。

幾つかの実施形態において、基板４１０は、プラズモン層１２０，４２０の第１表面１２５，４２５を露出させるウインドウ（不図示）を画定してもよく、光１５０がウインドウを通過してプラズモン層１２０，４２０と相互作用することを可能にする。これらの実施形態において、基板４１０は、必ずしも光学的に透明な材料から形成される必要はなく、基板４１０は、必ずしも光１５０に露出される必要はない。従って、基板４１０は、プラズモン層１２０，４２０の第１表面４２５の少なくとも一部に接続してもよい。

サンプルホルダ１００，４００は、従来の光学顕微鏡での撮像のために容易に使用できるように成形してもよい。サンプルホルダ１００，４００は、例えば、顕微鏡スライドの形態を成してもよい。

幾つかの実施形態において、サンプルホルダ１００，４００はさらに、プラズモン層１２０，４２０の第２表面１２６，４２６に連結または結合された光学的に透明な保護層４３０を含む。光学的に透明な保護層４３０は、光１６０，１７０がそこを通過して、プラズモン層１２０，４２０を化学的に隔離する。このことは、好都合にはプラズモン層１２０，４２０を保護するのに役立ち、サンプルホルダ１００，４００を洗浄および再利用することを可能にする。光学的に透明な保護層４３０は、表面プラズモン共鳴ピーク２２０の少なくとも１つの光がそこを通過することを可能にする。

光学的に透明な保護層４３０は、シリコン系酸化物（例えば、ＳｉＯ_２）、シリコン窒化物（例えば、Ｓｉ_３Ｎ_４）、透明金属酸化物、およびポリマーのうちのいずれか１つ以上を含んでもよい。光学的に透明な保護層４３０は、均一な薄膜を生成するための半導体産業で日常的に使用されるコーティング方法で形成できる。例えば、光学的に透明な保護層４３０は、「スピンオンガラス」である水素シルセスキオキサンなどの液体前駆体から形成してもよい。この技術では、液体前駆体は、プラズモン層１２０，４２０上に堆積され、その後、サンプルホルダ１００，４００が急速に回転して、液体前駆体は均一な薄膜を形成する。そして、液体前駆体は、電子ビーム、ＵＶ光および加熱の１つ以上を用いて硬化される。代替として、光学的に透明な保護層４３０は、化学気相堆積法を用いて堆積してもよい。光学的に透明な保護層４３０は、一般に、プラズモン層１２０，４２０上に形成することがある自然酸化物を含まない。

幾つかの実施形態において、光学的に透明な保護層４３０は、約１５０ｎｍ未満の厚さを有する。光学的に透明な保護層４３０が厚いほど、耐摩耗性が大きくなる。しかしながら、前述のように、表面プラズモンの電場は指数関数的に減衰する。従って、表面プラズモン生成に対する物体１４０の影響は、物体１４０が表面１２６から遠くなるほど減少する。従って、より厚い光学的に透明な層４３０では、波長シフトおよび画像コントラストがより低くなることがある。光学的に透明な保護層４３０は、０．５ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲の厚さを有してもよい。アモルファス二酸化シリコンから形成された光学的に透明な保護層４３０では、その厚さは、可視スペクトルにおいて増強された画像コントラストを生成するために８０ｎｍ未満でもよい。

幾つかの実施形態において、サンプルホルダ１００，４００は、サンプルホルダへの物体１４０の接着を促進するために、該技術分野で知られた任意の従来の方法を用いて処理してもよい。幾つかの例では、これは、接着剤、透過性保護フィルム、プラズマ処理または紫外光露出のいずれか１つ以上を使用することを含んでもよい。

図５を参照して、幾つかの実施形態に係る、物体５００を撮像する方法が示される。方法５００は、５１０において、サンプルホルダ１００，４００（図１ａと図４）のプラズモン層１２０，４２０上で物体１４０（図１ａ）を支持することを含むかまたは備える。上述のように、プラズモン層１２０，４２０は、物体１４０が支持される場合、物体１４０に近接するように配置されたサブミクロン構造１２４の周期的アレイ１２２を画定する。

方法５００はまた、５２０において、サンプルホルダ１００，４００を光１５０に露出することを含み、光の第１部分１６０がプラズモン層１２０，４２０を通過するが、物体１４０を通過せず、そして、光の第２部分１７０がサンプルホルダ１００，４００および物体１４０を通過する。光の第１部分１６０は、プラズモン層１２０，４２０と相互作用し、光の第１部分１６０は、１つ以上の固有の（第１）表面プラズモン共鳴ピーク２２０によって特徴付けられる。光の第２部分１７０は、プラズモン層１２０，４２０および物体１４０の少なくとも一部と相互作用し、物体１４０がプラズモン層１２０，４２０内を伝搬するプラズモンに影響を与える結果として、固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０から波長シフトした１つ以上の第２表面プラズモン共鳴ピーク２４０によって特徴付けられる。

従って、プラズモン層１２０，４２０を光１５０に露出することによって、表面プラズモン共鳴の結果として、伝搬する表面プラズモンがプラズモン層１２０，４２０に生成される。

方法はさらに、５３０において、透過光の第１部分１６０および第２部分１７０から物体１４０の画像１８０を構築することを含み、これにより物体１４０を空間的に分解可能にする。物体１４０は、画像から空間的に分解できる。理由は、物体１４０を通る透過光１７０は波長シフトしているため、プラズモン層１２０を通過したが、物体１４０を通過していない透過光１６０とは異なるように見えるためである。従って、透過光１６０から由来する画像１８０の第１領域１８２と、透過光１７０から由来する画像１８０の第２領域１８４との間で画像コントラストが生成される。

図７ａ〜図７ｂを参照して、幾つかの実施形態において、不均一な物体７４０が撮像できる。物体１４０の異なる構造も画像１８０から空間的に分解できる。これらの実施形態における光の第１部分７６０は、プラズモン層７２０および物体７４０の第１セクション７４１を通過する。光の第２部分７７０は、プラズモン層７２０および物体７４０の第２セクション７４２を透過する。物体７４０の第１セクション７４１および第２セクション７４２が表面プラズモン共鳴に異なるように影響を与える場合、これは、異なる表面プラズモン共鳴ピーク２２０，２２１，２４０（図２）をもたらし、従って、光の第１部分７６０と光の第２部分７７０との間の画像コントラストは、物体の異なる構造を空間的に分解可能にする。

幾つかの実施形態において、物体７４０は、プラズモン層７２０によって画定される周期的アレイ（不図示）を完全にカバーしてもよい。幾つかの実施形態において、物体７４０は、プラズモン層７２０によって画定される周期的アレイ（不図示）を部分的にのみカバーしてもよい。

幾つかの実施形態において、画像１８０（図１ａ）の構築は、例えば、光学顕微鏡で使用されるようなレンズを用いて、第１部分１６０および第２部分１７０からの透過光を画像平面（不図示）に投影することを含んでもよい。画像平面は、カメラまたは人間の眼などのセンサまたは検出器に設置してもよい。好都合には、物体１４０の画像１８０は、従来の光学顕微鏡法で使用される明視野撮像モードで構築できる。従って、特殊なサンプル調製、例えば、染色、特殊な顕微鏡、特殊な顕微鏡コンポーネント、または特殊な画像解析などは、画像コントラスト増強を提供するために必要とされない。好都合には、画像１８０は、広い視野を用いて取得できるため、物体１４０を走査して大きな領域に渡って画像を生成する必要がない。イメージングシステムが画像１８０内の関心のある構造を光学的に分解できるのであれば、アレイ１２２および撮像物体１４０のサイズに制限はない。

透過光１６０，１７０が可視の波長範囲内にある場合、画像コントラストは、色のコントラストとして現れることがある。幾つかの実施形態において、方法５００は、画像１８０を解析することも含んでもよい。例えば、透過光１６０，１７０はまたフィルタリング処理して、画像コントラストが強度コントラストとして現れるようしてもよい。このフィルタリング処理は、画像処理ソフトウェアを用いて画像１８０のスペクトルを解析することによって実施できる。

また、画像解析は、共鳴波長または物体１４０からの波長シフトを決定するために使用できる。これにより、物体１４０の未知のパラメータの計算を決定することが可能になる。例えば、物体１４０の誘電率が既知である場合、エバネッセント長範囲（例えば、最大４００ｎｍ）よりも小さければ、波長シフトを使用して物体１４０の厚さを決定できる。

幾つかの実施形態において、物体１４０の画像１８０は、プラズモン層１２０，４２０を、波長λのフィルタリングなしの範囲を含む入射光１５０に露出することによって取得できる。入射光１５０は、例えば、白色光源と見なされる光源１５２によって生成してもよい。代替として、画像１８０は、プラズモン層１２０，４２０を単色の入射光１５０に露出することによって取得できる。

好都合には、フィルタリングなしの光を用いた撮像は、波長λ_ｍ２２３の単色光または波長λ_ｍ２２３に近い狭帯域光の使用と比較して、増強された画像コントラストを提供できる。例えば、図２を参照して、波長シフトしたスペクトル２３０に見られるように、物体１４０からの透過光１７０の強度は、プラズモン層１２０，４２０を通過しただけの透過光１６０の強度と同じである。従って、波長λ_ｍの光を用いて撮像を実施した場合、画像１８０において物体１４０から画像コントラストは観察されない。

しかしながら、共鳴波長λ_Ｐ２２２を用いて撮像を実施し、スペクトル２００に類似した強度の他の共鳴ピークが存在しない場合、プラズモン共鳴ピーク２２０の波長シフトは、強度の変化を生じさせ、画像のコントラストを示す領域を生成する。

透過光１７０は、物体１４０との相互作用、例えば、散乱、分散、吸収などによっても影響を受けることがある。従って、より厚い物体は、従来の顕微鏡法のように、より低い強度で光１７０を通過させることがある。しかしながら、物体１４０がプラズモン層１２０，４２０で発生した表面プラズモンポラリトンと相互作用することに起因した波長シフトの結果として、画像コントラストが増強される。従って、プラズモン効果、散乱、分散、吸収の組合せに起因して波長シフトしたより低い強度の透過光１７０により、より厚い物体は、増加した画像コントラストを生成できる。

しかしながら、波長シフトは、光と物体の相互作用、例えば、散乱、分散、吸収などから独立していることがある。これにより、好都合には、光と弱く相互作用し、それ以外に透明であるか、または従来の光学顕微鏡法を用いて観察するのが非常に困難である物体１４０の撮像が可能になる。言い換えれば、方法５００は、色の変化を利用して、画像コントラスト増強を達成する。

幾つかの実施形態において、方法５００はさらに、５１２において第１偏光角での直線偏光した光１５０をさらに含む。方法５００はまた、サンプルホルダ１００，４００（プラズモン層３２０，８２０を含む）および物体１４０，８４０を直線偏光光１５０に露出することを含んでもよい（図８ａと図８ｂを参照）。ここで説明するように、プラズモン層３２０は、第２軸に沿った第２間隔Ｂとは異なる第１軸に沿った第１間隔Ａを有するアパーチャ１２４，３２４の周期的アレイを画定し、第２軸は、第１軸に対してある角度で配向している。光は、第１軸に対して第１偏光角で直線偏光しており、サンプルホルダ１００，４００および物体１４０，８４０を第１偏光角の直線偏光光１５０に露出することから構成される画像１８０，８８０が記録できる。そして、方法５００は、サンプルホルダ１００，４００および物体１４０，８４０を、第１軸に対して第２偏光角で直線偏光した光１５０に露出することによって繰り返してもよい。第２偏光角は、例えば、第２軸と整列してもよい。第２偏光角の直線偏光光１５０への露出から構築される画像１８０，８８２（図８ｂ）も記録できる。

好都合には、プラズモン層３２０，８２０および物体１４０，８４０を含むサンプルホルダ１００，４００を第１軸に対して異なる偏光角で直線偏光した光１５０に露出することから構成される画像１８０，８８０，８８２は、異なる波長シフトが画像コントラスト条件をもたらすことに起因して、異なる画像１８０，８８０，８８２を生成できる。例えば、図８ａにおいて０°直線偏光光を用いて画像８８０の領域８４１に見られる物体１４０，８４０は、オレンジ色に見える。しかしながら、図８ｂにおいて９０°直線偏光光を用いて画像８８２の領域８４５に見られる同じ物体１４０，８４０は、黄色に見える。従って、方法５００を使用して、従来の光学撮像方法からは容易に取得できない追加情報を物体１４０から好都合に取得できる。画像コントラストに対する偏光角変化の影響は、次第に厚くなる物体８４２，８４３ではそれほど顕著ではない。

異なる偏光角で得られた異なる画像８８０，８８２は、第１間隔Ａが第２間隔Ｂと異なるため、プラズモン層１２０，４２０，８２０および物体１４０，８４０と相互作用する偏光光から異なって生じる。偏光角が第１軸と整列する場合、表面プラズモン共鳴は、第２間隔Ｂに依存する。偏光角が第２軸と整列する場合、表面プラズモン共鳴は、第１間隔Ａに依存する。第１軸と第２軸の間で配向した偏光角は、第１間隔Ａと第２間隔Ｂの両方に依存する。

幾つかの実施形態において、方法５００はさらに、円偏光または楕円偏光の光１５０がサンプルホルダ１００，４００および物体１４０，８４０を露出することをさらに含む。サブミクロン構造１２４，３２４のアレイは、偏光が右回りか左回りか（時計回りまたは反時計回り）に応じて、異なる表面プラズモン共鳴を生成するように構成できる。

例示の実施形態において、サンプルホルダ４００は、約１５０ｎｍ厚の銀層から形成されたプラズモン層４２０を備えた従来のガラス顕微鏡スライドから形成された光学的に透明な基板４１０を含む。プラズモン層４２０は、約２００ｎｍだけ分離された直径約１６０ｎｍの円形アパーチャの周期的な三角形アレイを画定する。サンプルホルダ４００はさらに、約１０ｎｍ厚のアモルファス二酸化シリコンの光学的に透明な保護層４３０を含む。この構成において、サンプルホルダ４００を通過した透過光１６０からのスペクトル２００は、約５００ｎｍ（緑色光）の共鳴波長を備えた可視スペクトルでの固有の表面プラズモン共鳴ピーク２２０を含む。明視野構成の光学顕微鏡においてサンプルホルダ４００を用いて方法５００を実施すると、約３ｎｍ厚のＰｔ／Ｃ材料の層からなる物体６４０が、適正な画像コントラストを生成し、それが容易に認識できることが観察された（図６ａ）。しかしながら、領域６４１において単純なガラス顕微鏡スライド上で見られる同じ物体６４０は、従来の明視野光学顕微鏡法を用いて容易に観察できなかった（図６ｂ）。

図６ａはまた、次第に厚くなる物体６４２が、より大きな波長シフトに起因してより大きな画像コントラストを示すことを示す。物体６４２は、約８ｎｍ、約１３ｎｍおよび約１９ｎｍの厚さを有する。図６ｂは、領域６４３において見られるものとガラススライド上の同じ物体６４２は、より大きい画像コントラストを示すが、画像コントラストは、サンプルホルダ４００上で観察されるほど大きくないことを示す。

図９ａは、ミエリン鞘の明視野顕微鏡画像である。画像は、０°直線偏光光で物体５００を撮像する方法の実施形態を用いて取得した。図９ｂは、９０°直線偏光光で方法５００を用いて図９ａと同じ領域の明視野顕微鏡画像である。

図１０ａは、幾つかの離間した領域に渡ってイオン注入された薄膜の上面図を示す明視野顕微鏡画像である。図１０ｂは、従来の顕微鏡スライド上に支持された幾つかの離間した領域に渡ってイオン注入された薄膜の従来の明視野顕微鏡画像である。

図１１ａは、物体５００を撮像する方法の実施形態を用いて得られた子房の断面の明視野顕微鏡画像である。図１１ｂは、従来の顕微鏡スライド上に支持された子房の断面の従来の明視野顕微鏡画像である。

本開示の広い一般的範囲から逸脱することなく、上述した実施形態に対して多数の変形及び／又は変更を行ってもよいことは、当業者によって理解されるよう。従って、本実施形態は、全ての点で例示的かつ非限定的であると見做すべきである。

Claims (38)

1. 物体を撮像する方法であって、
   ・物体をサンプルホルダのプラズモン層の上で支持するステップであって、該プラズモン層は、物体に近接するサブミクロン構造の周期的アレイを画定する、ステップと、
   ・サンプルホルダを光に露出するステップであって、
   光の第１部分が、（ｉ）プラズモン層を通過するが、物体を通過しないか、あるいは、（ｉｉ）プラズモン層および物体の第１セクションを通過するようにし、
   光の第２部分が、プラズモン層および物体の少なくとも第２セクションを通過するようにし、
   光は、少なくともプラズモン層と相互作用し、
   透過光の第１部分は、１つ以上の第１表面プラズモン共鳴ピークによって特徴付けられ、
   透過光の第２部分は、物体がプラズモン層内を伝搬するプラズモンに影響を与える結果として、第１表面プラズモン共鳴ピークから波長シフトした、１つ以上の第２表面プラズモン共鳴によって特徴付けられる、ステップと、
   ・透過光の第１部分および第２部分から物体の画像を構築し、これにより物体を空間的に分解可能にするステップと、を含む方法。
2. 画像を解析して物体を空間的に分解することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 光は、２００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の複数の波長を有する、請求項１または２に記載の方法。
4. 第１および第２表面プラズモン共鳴ピークの少なくとも一方は、３００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲の波長でピーク強度を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. サブミクロン構造は、２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲のサブミクロン構造間の間隔を備えた周期的アレイ状に配置される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. サブミクロン構造は、５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の最大寸法を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. サブミクロン構造は、プラズモン層を通るアパーチャである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. アパーチャは、円、トーラス、楕円、十字形、および複数の交差する細長いアームを含む形状のいずれか１つ以上として成形される、請求項７に記載の方法。
9. 近接する細長いアーム間の角度は、３０°〜９０°の範囲である、請求項８に記載の方法。
10. サンプルホルダおよび物体を、偏光した光に露出することをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 偏光した光は、アパーチャの周期的アレイの第１軸に対して第１偏光角で直線偏光しており、周期的アレイは、第１軸に沿ったサブミクロン構造の第１間隔を有し、第１間隔は、第２軸に沿ったサブミクロン構造の第２間隔とは異なり、第２軸は、第１軸に対してある角度で配向している、請求項１０に記載の方法。
12. 第１軸に対して第２偏光角で直線偏光した光にサンプルホルダおよび物体を露出することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 該方法は、光学顕微鏡を用いて実施する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. プラズモン層は、Ａｌ，Ａｇ，Ａｕ，Ｎｉ，ＰｔおよびＰｄのいずれかから選択される１つ以上の金属から形成される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. プラズモン層は、２０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の厚さを有する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. サンプルホルダは、プラズモン層のための機械的支持を提供するために、プラズモン層の第１表面の少なくとも一部に接続された基板を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 基板は、光学的に透明であり、そのため基板を通る光透過率がゼロより大きく、基板は第１表面を化学的に隔離する、請求項１６に記載の方法。
18. サンプルホルダは、プラズモン層を隔離するために、プラズモン層の第２側に結合された光学的に透明な保護層を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
19. 光学的に透明な保護層は、１５０ｎｍ未満の厚さを有する、請求項１８に記載の方法。
20. 光学的に透明な保護層は、８０ｎｍ未満の厚さを有する、請求項１８に記載の方法。
21. 光学的に透明な保護層は、酸化シリコン、窒化シリコン、透明金属酸化物およびポリマーのいずれか１つ以上を含む、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
22. 物体は、均一な厚さ及び／又は密度を含むか、あるいは、物体は、不均一な厚さ及び／又は密度を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 光学顕微鏡で使用するためのサンプルホルダであって、
    サブミクロン構造の周期的アレイを画定するプラズモン層を含み、
    サンプルホルダは、
    物体を支持する場合、サブミクロン構造の周期的アレイが物体に近接するように物体を支持し、
    光がプラズモン層を透過できるようにし、光は、少なくともプラズモン層と相互作用し、透過光からのスペクトルは、
    １つ以上の第１表面プラズモン共鳴ピークによって特徴付けられる第１部分と、
    物体がプラズモン層内を伝搬するプラズモンに影響を与える結果として、第１表面プラズモン共鳴ピークから波長シフトした、１つ以上の第２表面プラズモン共鳴によって特徴付けられる第２部分とを含み、
    これにより透過光から物体の画像を構築し、物体を該画像から空間的に分解可能にする ように構成される、サンプルホルダ。
24. プラズモン層は、３００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲の波長でピーク強度を備えた少なくとも１つの表面プラズモン共鳴ピークを生成するように構成される、請求項２３に記載のサンプルホルダ。
25. サブミクロン構造は、２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲のサブミクロン構造間の間隔を備えた周期的アレイ状に配置される、請求項２３または２４に記載のサンプルホルダ。
26. サブミクロン構造は、５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の最大寸法を有する、請求項２３〜２４のいずれかに記載のサンプルホルダ。
27. サブミクロン構造は、プラズモン層を通るアパーチャである、請求項２３〜２５のいずれかに記載のサンプルホルダ。
28. アパーチャは、円、トーラス、楕円、十字形、および複数の交差する細長いアームを含む形状のいずれか１つ以上として成形される、請求項２６に記載のサンプルホルダ。
29. 近接する細長いアーム間の角度は、３０°〜９０°の範囲である、請求項２８に記載のサンプルホルダ。
30. プラズモン層は、Ａｌ，Ａｇ，Ａｕ，Ｎｉ，ＰｔおよびＰｄのいずれかから選択される１つ以上の金属から形成される、請求項２３〜２９のいずれかに記載のサンプルホルダ。
31. プラズモン層は、２０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の厚さを有する、請求項２３〜３０のいずれかに記載のサンプルホルダ。
32. プラズモン層のための機械的支持を提供するために、プラズモン層の第１表面の少なくとも一部に接続された基板をさらに含む、請求項２３〜３１のいずれかに記載のサンプルホルダ。
33. 基板を通る光透過率がゼロより大きく、基板は第１表面を化学的に隔離する、請求項３２に記載のサンプルホルダ。
34. プラズモン層を隔離するために、プラズモン層の第２側上に光学的に透明な保護層をさらに含む、請求項２３〜３３のいずれかに記載のサンプルホルダ。
35. 光学的に透明な保護層は、１５０ｎｍ未満の厚さを有する、請求項３４に記載のサンプルホルダ。
36. 光学的に透明な保護層は、８０ｎｍ未満の厚さを有する、請求項３４に記載のサンプルホルダ。
37. 光学的に透明な保護層は、酸化シリコン、窒化シリコン、透明金属酸化物およびポリマーのいずれか１つ以上を含む、請求項３４〜３６のいずれかに記載のサンプルホルダ。
38. 光学顕微鏡で使用される場合に請求項１〜２２のいずれかに記載の方法を実施する、請求項２３〜３７のいずれかに記載のサンプルホルダ。

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