JP2020508667A - 修飾されたaavキャプシドタンパク質およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年2月21日に出願された米国仮出願番号62/461,770、および2018年2月2日に出願された米国仮出願番号No. 62/625,486の利益を主張し、これらの全開示は、本明細書において参考として援用される。
本発明は、国立衛生研究所により付与されたRO1EY024280およびHL097088-05A1下における政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子は、遺伝子送達のために有用なビヒクルとして現れつつある。異なるAAV血清型は、特定の器官指向性を有し、このことは、遺伝子に基づく治療薬を標的器官に対してターゲティングするために有利であり得るが(例えば、Surace et al., Vision Res. 2008, 48(3):353-9;Zincarelli et al., Mol Ther. 2008,16(6):1073-80を参照)、一方で、AAVにおける特定の器官または組織を標的とすることについての効率の増大は、多大な利益となるであろう。かかる組織の一例は、網膜である。
AAV粒子の器官または組織への指向性は、完全にではないとしても高度に、粒子表面の構造またはキャプシドに依存する。AAV血清型2(AAV2)は、網膜に対する指向性を有し、網膜に遺伝子を送達するために用いられる(例えば、Vandenberghe et al., Gene Ther. 2012, 19(2):162-8を参照)。AAV2キャプシドは、3つのタンパク質、VP1、VP2およびVP3から構成される。本明細書において提供されるのは、バリアント(例えば修飾された)AAV(例えばAAV2)キャプシドタンパク質および網膜細胞(例えば視細胞(photoreceptor)、網膜神経節細胞および網膜神経細胞)に形質導入する効率が改善されている粒子についての組成物および方法である。本開示は、少なくとも部分的に、AAV2のキャプシドタンパク質中にアミノ酸の置換または変異を有するキャプシドバリアントを含むAAV2キャプシドライブラリーの、マウスモデルおよびマカクモデルにおけるin vivoスクリーニングを用いる、網膜細胞に形質導入する効率が野生型キャプシドタンパク質を含むrAAV2粒子と比較して高い修飾キャプシドタンパク質を含むAAV2(AAV2)バリアントタンパク質(例えば修飾AAV2キャプシドタンパク質)および組み換え粒子の同定に基づく。
(a)VRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4において記載されるとおり)、
(b)VRIにおけるNA;およびVRVIIにおけるSAAGADXAXDS(配列番号5において記載されるとおり)、
(c)VRIにおけるNA;およびVRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4において記載されるとおり)、
(d)VRVIIにおけるSAAGADXAXDS(配列番号5において記載されるとおり)置換、
(e)VRIにおけるNA;およびVRVIIにおけるSAAGADXAXDS(配列番号5において記載されるとおり)、
(f)ループIにおけるQからAへの置換;およびVRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4において記載されるとおり)、
(g)ループIにおけるQからAへの置換;VRVにおけるKからTへの置換;およびVRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4において記載されるとおり)、ならびに
(h)位置267におけるSからWへの置換;およびVRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4において記載されるとおり)
のうちのいずれか1つ以上を含む。Xは、任意のアミノ酸(例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンまたはバリン)であってよい。
(a’’’)VRIにおけるNA;位置444におけるF;およびVRIVにおけるDEAXSEXKXTXR(配列番号7において記載されるとおり)、
(b’’’)VRIIにおけるQ325K;Y444F;VRIVにおけるS452A、T454NおよびT455V;およびVRVIにおけるRXXDD(配列番号8において記載されるとおり)、
(c’’’)VRIにおけるQ263A;VRVにおけるK490T、S492P、E499DおよびY500F;ならびにVRVIにおけるE530D、
(d’’’)VRIにおけるNA;Y444F;VRIVにおけるP451A、T454N、T455VおよびR459T;およびVRVIにおけるRXXDD(配列番号8において記載されるとおり)、
(e’’’)VRVIにおけるE530D、
(f’’’)VRVにおけるQDXE(配列番号9において記載されるとおり)ならびに置換Y500FおよびT503P、ならびに
(g’’’)VRIにおけるEA;VRVにおけるT491VおよびY500F;ならびにVRVIIにおけるAAADDXEXDG(配列番号10において記載されるとおり)、
のうちのいずれか1つを含む、バリアント(例えば修飾された)組み換えAAV2キャプシドタンパク質である。Xは、任意のアミノ酸(例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンまたはバリン)であってよい。
いくつかの態様において、修飾されたAAV2キャプシドタンパク質は、VP3タンパク質である。いくつかの態様において、修飾されたAAV2キャプシドタンパク質は、VP2タンパク質である。いくつかの態様において、修飾されたAAV2キャプシドタンパク質は、VP1タンパク質である。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において開示される修飾されたAAV2キャプシドタンパク質のうちのいずれか1つを含む、rAAV粒子である。いくつかの態様において、バリアントrAAV2粒子は、逆位末端反復配列(ITR)を含む核酸を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントrAAV2粒子のうちのいずれか1つは、目的の遺伝子を含む核酸を含む。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において開示されるバリアントrAAV2粒子のうちのいずれか1つを複数含む組成物である。いくつかの態様において、rAAV粒子の組成物は、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において開示されるバリアントrAAV2キャプシドタンパク質のうちのいずれかを含むrAAV粒子である。いくつかの態様において、バリアントrAAV2粒子は、逆位末端反復配列(ITR)を含む核酸を含む。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントrAAV2粒子のうちのいずれか1つは、目的の遺伝子を含む核酸を含む。
いくつかの側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において開示されるバリアントrAAV2粒子のうちのいずれか1つを複数含む組成物である。いくつかの態様において、rAAV粒子の組成物は、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに示すために含まれており、本開示のある側面は、本明細書において提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせたこれらの図面のうちの1つ以上への参照により、よりよく理解され得る。図面において説明されるデータは、決して本開示の範囲を限定するものではないことが、理解されるべきである。
AAV由来のベクターは、他のベクターと比較して低い病原性、エピソームの局在、および安定な導入遺伝子発現に起因して、ヒト遺伝子治療の適用のための有望なツールである。AAV粒子は、眼への、特に網膜への治療用遺伝子の送達のために、多大な見込みを示す(Pierce et al. Cold Spring Harb Perspect Med. 2015, 5(9):a017285;Schon et al., Eur J Pharm Biopharm. 2015 95(Pt B):343-52;Barnard et al., Cold Spring Harb Perspect Med. 2014, 5(3):a017293;Trapani et al., Prog Retin Eye Res. 2014,43:108-28;Carvalho and Vandenberghe, Vision Res. 2015,111(Pt B):124-33;Dalkara and Sahel, C R Biol. 2014, 337(3):185-92;Petrs-Silva and Linden, Clin Ophthalmol. 2014;8:127-36)。網膜細胞に対する指向性を有するAAV粒子の形質導入効率を改善することは、したがって、非常に有益であろう。血清型2のAAVは、特定の眼細胞、例えば網膜細胞に対する指向性を有することが既に知られている。したがって、本明細書において提供されるのは、同じ細胞型におけるキャプシドバリアントのうちのいずれかを有していない対応するrAAVの形質導入効率と比較して(例えば、野生型AAV2キャプシドタンパク質を有する対応するrAAV2と比較して)、キャプシドタンパク質において置換を有する野生型AAV(例えばAAV2)粒子のバリアント、かかる粒子の組成物、ならびにこれらの組成物を用いて1つ以上の特定の細胞型(例えば視細胞、網膜神経節細胞、神経網膜細胞、プルキンエ細胞および上衣細胞)に形質導入する方法である。
AAVゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)から構成され、これは、プラス鎖(positive-sensed)またはマイナス鎖(negative-sensed)のいずれかである。DNA鎖の各々の末端に存在するのは、逆位末端反復配列(ITR)である。ITRの間に存在するのは、2つのオープンリーディングフレーム(OFR):repおよびcapである。rep ORFは、AAVの生活環にとって必要とされるRepタンパク質をコードする4つの重複する遺伝子からなる。cap ORFは、キャプシドタンパク質:VP1、VP2およびVP3の重複するヌクレオチド配列を含み、これらは、互いに相互作用して、正二十面体対称のキャプシドを形成する。
野生型AAV2 VP1アミノ酸配列:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(配列番号1)
野生型AAV2 VP2アミノ酸配列:
MAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(配列番号2)
野生型AAV2 VP3 アミノ酸配列:
MATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(配列番号3)
AAV粒子の組織指向性および形質導入効率は、キャプシドの表面において暴露されるアミノ酸残基の性質により決定される(Wu et al., J Virol. 2006, 80(22):11393-7)。したがって、キャプシドタンパク質のアミノ酸を操作することにより、粒子の組織指向性を微調整する、およびまた形質導入効率を改善する機会が提供される。しかし、キャプシドタンパク質の特定の操作(例えばアミノ酸の置換)によっては、キャプシドタンパク質がミスフォールディングされたり、全くキャプシドを形成しなかったりする場合がある。タンパク質のミスフォールディングおよびキャプシドのミスフォールディングの問題を回避するために、キャプシドタンパク質の可変ループのみにおいて置換を行うことにより構成されたバリアントAAV2キャプシドライブラリーから、本明細書において開示される組み換えAAV2(rAAV2)バリアントタンパク質および粒子を同定した。本明細書において、「可変ループ」はまた「可変領域」としても言及される。AAV2は、VRI〜VRIXと番号付けされた9つの可変領域を有する。図1Aは、可変ループを有する野生型AAV2タンパク質の構造を示す。Marsicら(Mol Ther. 2014, 22(11):1900-9)は、かかるAAV2キャプシドライブラリーを作製した方法、ならびにその特徴を記載する。
表1:AAV2キャプシドタンパク質可変領域および対応するアミノ酸
表2:バリアントrAAV(例えばバリアントrAAV2)キャプシドタンパク質におけるアミノ酸の置換または配列
本明細書において提供されるのはまた、本明細書において開示されるバリアントrAAVキャプシドタンパク質のうちのいずれか1つをコードする核酸である。いくつかの態様において、バリアントrAAVキャプシドタンパク質をコードする核酸は、プラスミド中に含まれる。
本明細書において提供されるのは、バリアントrAAV(例えばバリアントrAAV2)粒子である。いくつかの態様において、粒子は、空の粒子(例えば目的の遺伝子を含む核酸ベクターを含まないもの)である。いくつかの態様において、AAV2粒子は、目的の遺伝子を含む核酸ベクターを含む。本明細書において用いられる場合、「目的の遺伝子」とは、目的のRNAまたはタンパク質をコードする遺伝子である。
いくつかの態様において、1つ以上のプロモーターを、異種性核酸中のコードヌクレオチド配列に作動的に連結させてもよい。プロモーターは、プロモーター配列が、当該ヌクレオチド配列の転写を制御および/または調節する場合に、ヌクレオチド配列に「作動的に連結される」。プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターであってよい。
プロモーターは、プロモーターは、本明細書において開示されるプロモーターのうちのいずれか1つのフラグメント、または完全なプロモーターの部分的なプロモーター活性(例えば活性の10〜90、30〜60、50〜80、80〜99または90〜99.9%)を保持するものであってもよいことが理解されるべきである。
rAAV粒子および核酸ベクターを生成する多様な方法が知られている(例えば、本明細書において参考として援用されるZolotukhin et al. Production and purification of serotypes 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167;ならびに米国特許出願番号US20070015238およびUS20120322861;ならびにATCCおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能なプラスミドおよびキットを参照)。いくつかの態様において、目的の遺伝子を含むベクター(例えばプラスミド)は、核酸ベクターがキャプシドの内部にパッケージングまたはキャプシド形成されて、その後精製されるように、例えば、rep遺伝子(例えばRep78、Rep68、Rep52およびRep40をコードする)ならびにcap遺伝子(VP1、VP2およびVP3をコードし、これらは、本明細書において記載されるような修飾されたVP領域を含む)を含む、1つ以上のヘルパープラスミドと組み合わせて、ヘルパーまたは産生株(producer)細胞と称される組み換え細胞中に遺伝子導入されてもよい。
AAV血清型1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12および13の配列についてのGenebank参照番号は、特許公開WO 2012064960において列記され、これは、その全体において本明細書において参考として援用される。
シュードタイプ化rAAVベクターを生成および使用するための方法もまた、当該分野において公知である(例えば、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001;Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000;Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002;およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照)。
rAAV粒子の使用を容易にするための多様な処方が開発されてきた。例えば、rAAV粒子の注射可能な水溶液の投与のために、溶液を好適に緩衝化して、必要な場合には、液体の希釈剤をはじめに十分な塩またはグルコースで等張にしてもよい。いくつかの態様において、本明細書において提供されるような組成物は、本明細書において開示されるバリアントrAAV(例えばバリアントrAAV2)粒子のうちのいずれか1つを複数含む。いくつかの態様において、組成物は、本明細書において開示されるバリアントrAAV(例えばバリアントrAAV2)粒子の1つより多くを複数含む。いくつかの態様において、「投与すること」または「投与」は、対象に、その材料が薬理学的に有用である様式において材料を提供することを意味する。
であってよい。いくつかの態様において、キャリアは、緩衝化食塩水(例えばリン酸緩衝化食塩水、HEPES緩衝化食塩水)を含む。USPグレードのキャリアおよび賦形剤は、ヒト対象へのrAAV粒子の送達のために特に有用である。かかる組成物は、さらに任意にリポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロパーティクル、ナノスフェア、またはナノパーティクルを含んでもよく、あるいは、それを必要とする対象の細胞、組織、器官または身体への投与のために、別段に処方されてもよい。かかる組成物を作製するための方法は、周知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第22版(Pharmaceutical Press、2012年)において見出すことができる。
rAAV粒子のうちのいずれか1つ、または本明細書において開示されるrAAV粒子のうちのいずれか1つを含む組成物は、細胞、組織または器官に形質導入するために用いることができる。いくつかの態様において、本明細書において開示されるバリアントrAAVのうちのいずれか1つ(例えばバリアントrAAV2)の粒子を用いて形質導入される細胞、組織または器官は、治療用遺伝子であり得るか、または研究のために所望されるものである、目的の遺伝子を導入される。いくつかの態様において、細胞、組織または器官は、当該細胞、組織または器官が培地中でインキュベートされるかまたはこれを灌流されるin vitroでのセッティングにおいて、形質導入される。細胞は、特定の条件下において培養される多くの細胞のうちの1つであっても、採取される器官の一部であっても、オルガノイドの一部であっても、または生物であってもよい。
例1:AAVキャプシドライブラリー
AAVキャプシドライブラリーは、存在するパルボウイルスの「天然」のバリエーションのうちのなるべく多くを包含するように作製した(図1A〜1Cを参照)。キャプシドライブラリーは、AAV2 cap骨格により、構造情報に基づいたアプローチ(structure informed approach)を用いて構築した。多様化は、AAVキャプシドタンパク質の可変ループに限定し、このことは、適切に組み立てられてパッケージングされるバリアントを作製する可能性を増大する。AAVキャプト霊長類(それぞれ、例2および3)においてシドライブラリーを、次いで、マウスおよび非ヒスクリーニングして、最も出現率が高いAAVバリアントを同定し、これらをその後、検証して特徴づけた。
AAVキャプシドライブラリー(図1A〜1C)を、図2において示すとおり、マウスにおいてスクリーニングした。スクリーニングのために用いたトランスジェニックマウスは、神経網膜ロイシンジッパー(nrl)遺伝子プロモーターの制御下において、桿体視細胞(PR)において特異的に、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現する。
キャプシドバリアントは、切断型CBAプロモーター駆動性mCherry(sc−smCBA−mCherry)の発現を担持する自己相補的AAVゲノムを含んだ。形質導入を、眼細胞株を用いてin vitroで定量した。
AAVキャプシドライブラリー(図1A〜1C)をまた、マカク(Macacca fascicularis)において、硝子体内(Ivt)注射の後でPRおよびRGCを標的とするAAVバリアントを同定するために、スクリーニングした。
本明細書においてその全体において参考として援用される特許出願番号62/296,056において記載される方法を用いて、霊長類網膜において選別可能な細胞集団を作製した。この方法は、Choudhury, et al., Front Neurosci. 2016,10:551においてもまた記載される。簡略に述べると、マカクのPRおよびRGCを、それぞれ、AAV5−GRK1−GFPの網膜下注射および外側膝状核(LGN)からのMICRO-RUBY(商標)(TRITC−デキストラン−ビオチン)の逆行性輸送により蛍光標識した。図4において示されるとおり、キャプシドライブラリーを、注射の後で、生体内(in-life)相の間にIvt注射によりLGN中に送達した。網膜を、解剖学的に異なる領域に分離し、各々の領域からの細胞に、蛍光励起細胞分取(FACS)を行った(図4を参照)。
マウスおよびマカクモデルにおけるスクリーニングにより最も出現率が高いAAV2バリアントを同定した後、上記のとおり、最も出現率が高いバリアントを、ベクター化(vectorize)し、網膜細胞に形質導入する効率について試験した。
AAV2バリアントVaは、マウススクリーニングにおいては最も出現率が高く、マカクスクリーニングにおいては4番目に最も出現率が高いことを見出した。図6A〜6Cは、Nrl−GFPマウスに、1μlの2e12vg/mlのSc−smCBA−mCherryをVaバリアントAAV2キャプシド中にパッケージングしたものを硝子体内注射した後の、Vaの形質導入プロフィールを示す。注射の3週間後、眼底検査(図6Aを参照)およびFACS(図6Bおよび6Cを参照)により、形質導入を評価した。網膜細胞において増強された形質導入効率を有することが知られるAAV2バリアントであるAAV2(quadY−F+T−V)を、対照として含めた。図6Aにおいて、AAV2(quadY−F+T−V)と比較して、mCherryについての遺伝子を担持するAAV2 Vaバリアント粒子が、より多数ではないとしても同じくらい多くの網膜細胞を、かつ、細胞1つあたり、より高い発現量でないとしても、細胞1つあたり、同じくらい高い発現量で、形質導入することができたことが観察され得る。
AAV2バリアントVbは、マウススクリーニングにおいては2番目に最も出現率が高く、マカクスクリーニングにおいては最も出現率が高いことを見出した。図8A〜8Cは、Nrl−GFPマウスに、1μlの2e12vg/mlのSc−smCBA−mCherryをVbバリアントAAV2キャプシド中にパッケージングしたものを硝子体内注射した後の、Vbの形質導入プロフィールを示す。注射の3週間後、プロフィール(図8Aを参照)およびFACS(図8Bおよび8Cを参照)により、形質導入を評価した。変異Y272F、Y444F、Y500F、Y730FおよびT491Vを有するAAV2(quadY−F+T−V)と比較して、mCherryについての遺伝子を担持するAAV2 Vbバリアント粒子は、より多数の網膜細胞に、細胞1つあたりより高い発現量で形質導入することができた(図8A)。
図8Cは、硝子体内注射または網膜下注射のいずれかによりマウスに投与された場合の、AAV2バリアントVaについての形質導入率を示す。マウスを、AAV2バリアント粒子の注射の4週間後に安楽死させた。2x109vgを注射した。網膜下注射の後で桿体PRおよび非桿体の神経網膜細胞の両方において達成された形質導入のレベルは、2.5倍多くの野生型AAV2ウイルスにより達成されたものに匹敵した。
ARPE19細胞において形質導入効率を測定し、結果は、図9において観察することができる。AAV2(quadY−F+T−V)バリアントウイルスと比較して、AAV2−V2バリアントウイルスは、約7倍高いmCherryの発現レベルをもたらすことができた。
マウスにおいて、AAV2バリアントVaおよびVbと同様の様式において試験された場合、眼底検査により観察されるマウス網膜におけるAAV−V2の形質導入効率は、対照AAV2(quadY−F+T−V)と比較して、はるかに高かったことを見出した(図10A)。AAV2−V2で形質導入された網膜細胞についての特徴的なFACsプロットを、図10Bにおいて示す。AAV2(quadY−F+T−V)に相対的な形質導入効率を、図10Cにおいて示す。観察されるとおり、AAV2−V2バリアントは、AAV2(quadY−F+T−V)バリアントウイルスより優れている。
形質導入効率を、ARPE19細胞において測定し、結果は、図11において観察することができる。AAV2(quadY−F+T−V)バリアントウイルスと比較して、AAV2−V3バリアントウイルスは、約5倍高いmCherryの発現レベルをもたらすことができた。
マウスにおいて、AAV2バリアントVa、VbおよびV2と同様の様式において試験された場合、眼底検査により観察されるマウス網膜におけるAAV2−V3の形質導入効率は、対照AAV2(quadY−F+T−V)と比較して、はるかに高かった(図12A)。AAV2−V3により形質導入された網膜細胞についての特徴的なFACsプロットを、図12Bにおいて示す。AAV2(quadY−F+T−V)に相対的な形質導入効率を、図12Cにおいて示す。観察されるとおり、AAV2−V3 バリアントは、AAV2(quadY−F+T−V)バリアントウイルスより優れている。
特定の変異がAAV粒子が網膜細胞に形質導入する効率を増強することは知られているので、マウスおよびマカクモデルにおけるスクリーニングにより同定されたバリアントに対して、それらの能力をさらに改善するために、より高い網膜形質導入能力を有するように、これらの変異を重ねた。図13は、眼底検査を用いた、さらなるYからFへおよびTからVへの置換を有するAAV2バリアントVaおよびVbの形質導入プロフィールを示す。Va−YFは、バリアントVaの配列に加えて位置444および730においてさらなるフェニルアラニンを有するバリアントを表す。同様に、Vb−YFは、バリアントVbの配列に加えて位置444および730においてさらなるフェニルアラニンを有するバリアントを表す。AAV2バリアントVb−YF−TVは、バリアントVbの配列に加えて、位置272、444および730においてさらなるF、ならびに位置491においてバリンを有するバリアントを表す。これらの置換が形質導入効率を大きく増強することは、眼底画像におけるmCherryの蛍光から明らかである(図13)。FACSデータの定量もまた、これらのさらなる変異が、AAV2キャプシドバリアントが網膜細胞に形質導入する効率を大きく改善することを示す(図14)。
例1において記載される多様性が高いAAVキャプシドライブラリーであるCAPLIB−7から、非ヒト霊長類(NHP)において行った3回のin vivoでの選択により、アデノ随伴ウイルス(AAV)バリアントを単離した。選択は、初めに、選別可能な視細胞(AAV5−GRK1−GFPの網膜下注射を介して)および網膜神経節細胞(外側膝状核中への逆行性トレーサー色素の注射を介して)を有するNHPを作製することを含む。選別可能な細胞の作製の後で、NHPへのキャプシドライブラリーの硝子体内注射を行った。この後、NHPの視細胞(PR)と網膜神経節細胞(RGC)との個別の分離を行い、その後、各々の細胞型から個別にキャプシドバリアントを回収し、別々のPRとRGCとのサブライブラリーを再生した。その後のスクリーニングを、次いでRGCサブライブラリーを投与したNHPと平行して行い、RGCを単離した。PRサブライブラリーについても同様である。霊長類における2回目の選択の後で、多数の新規のキャプシドバリアントを同定した。これらのバリアントのサブセットを単離し、レポーターコンストラクトによりベクター化した場合、それらは、細胞培養において増大した形質導入効率を有することが示された。ベクターをマウスに硝子体内注射した場合、形質導入効率は、AAV2に対して大きく改善され、ほとんどの場合において、quadYF+T−Vよりも良好であった。この後に、霊長類における3回目のスクリーニングを行い、さらなるキャプシドバリアントを同定した。これらのさらなるキャプシドバリアントは、本明細書において開示され、これらのうちの多くは、最初の2回の選択においては観察されなかった。新たなキャプシドバリアントは、2つの広範なグループに分類される:1)2回目のスクリーニングから3回目のスクリーニングで、PRおよびRGCの両方においてそれらの相対量が増大しているキャプシドバリアント、および、2)網膜神経節細胞(RGC)または視細胞(PR)のいずれかに対して分布の偏りを示すキャプシドバリアント。グループ1のバリアントは、P3−8、Vb、P3−3およびP3−4を含む。グループ2のバリアントは、霊長類網膜神経節細胞において濃縮を、視細胞においては低い量を示すP3−RGC1、P3−RGC2およびP3−RGC3、ならびに逆に網膜神経節細胞よりも視細胞において実質的に濃縮されていたP3−PR1、P3−PR2およびP3−PR3を含む(図24および25)。
霊長類網膜においてキャプシドライブラリーをスクリーニングするための方法は、以下のとおりであった。それは、細胞内に含まれる核酸の完全性を維持しつつ網膜細胞を選択的に「選別」する能力に依存し、AAV5−GRK1−GFPの網膜下送達および/または外側膝状核(LGN)からの蛍光色素の注射による網膜神経節細胞(RGC)の逆行性標識を介する、視細胞における緑色蛍光タンパク質の発現により達成した。
3回目のスクリーニングの結果を評価し、視細胞およびRGCが濃縮されたバリアントを同定した(図24および25)。バリアントは、視細胞とRGCとの間で「偏った」分布で現れた。
表3.霊長類網膜において、「バーコード付けされた」レポーターコンストラクトを用いて、形質導入について選択されたキャプシドバリアント。結果を、図16において示す。
表4.NHPの情報
本明細書において開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせることができる。本明細書において開示される各々の特徴は、同じ、等価、または類似の目的にかなう代替的な特徴により置き換えることができる。したがって、別段に明示的に記述されない限り、開示される各々の特徴は、一般的な一連の等価または類似の特徴の一例に過ぎない。
上の記載から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、開示を多様な用途および条件に適用させるために、その多様な変更および改変を行うことができる。したがって、他の態様もまた、請求の範囲の範囲内である。
本発明のいくつかの態様を、本明細書において記載および説明してきたが、当業者は、機能を行うため、ならびに/または、本明細書において記載される結果および/もしくは利点のうちの1つ以上を得るための、多様な他の手段および/または構造を、容易に想起するであろう。本明細書において記載される利点のうちの1つ以上、ならびにかかるバリエーションおよび/または改変の各々は、本明細書において記載される本発明の態様の範囲内であるものとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料および立体構造が、例示的なものであることを意図されること、ならびに、実際のパラメーター、寸法、材料および/または立体構造は、それのために本発明の教示が用いられる特定の用途に依存するであろうことを、容易に理解するであろう。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書において記載される本発明の具体的な態様に対する多くの均等物を認識するかまたは確認することができるであろう。したがって、前述の態様は、単に例として提示されること、ならびに、添付の請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内において、本発明の態様は、具体的に記載され請求されるものとは別段に実施することができることが理解されるべきである。本開示の本発明の態様は、本明細書において記載される各々の個々の特徴、系、物品、材料、キットおよび/または方法に仕向けられている。加えて、かかる特徴、系、物品、材料、キットおよび/または方法のうちの2つ以上の任意の組み合わせは、かかる特徴、系、物品、材料、キットおよび/または方法が相互に不一致でない場合には、本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される手段に関して参考として援用され、これは、いくつかの場合においては、当該文書全体を包含し得る。
句「および/または(and/or)」は、本明細書において明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、そのように結合された要素、すなわち、いくつかの場合においては接続的に存在し、他の場合においては離接的に存在する要素のうちの「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および/または(and/or)」と共に列記される複数の要素は、同じ様式におけるもの、すなわち、そのように結合された要素のうちの「1つ以上」と解釈されるべきである。「および/または(and/or)」節により特に同定される要素以外の他の要素は、それらの特に同定された要素に関連するか関連しないかにかかわらず、任意に存在してよい。したがって、非限定的な例として、「Aおよび/またはB」への参照は、「含む」などのオープンエンド式の語法により接続して用いられる場合、一態様においてはAのみ(任意にB以外の要素を含む)を;別の態様においてはBのみ(任意にA以外の要素を含む)を;さらに別の態様においては、AおよびBの両方(任意に他の要素を含む)を指し得る、など。
Claims (72)
- 可変領域(VR)V(VRV)における配列DGEおよびDF、ならびに以下の配列および/または置換のセット:
(a)VRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4)、
(b)VRIにおけるNA;およびVRVIIにおけるSAAGADXAXDS(配列番号5)、
(c)VRIにおけるNA;およびVRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4)、
(d)VRVIIにおけるSAAGADXAXDS(配列番号5)置換,
(e)VRIにおけるNA;およびVRVIIにおけるSGREGDAEXXD(配列番号6)、
(f)ループIにおけるQからAへの置換;およびVRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4)、
(g)ループIにおけるQからAへの置換;VRVにおけるKからTへの置換;およびVRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4)、ならびに
(h)位置267におけるSからWへの置換;およびVRVIIにおけるEDATENXIXXDR(配列番号4);
ここで、Xは任意のアミノ酸であってよい、
のうちのいずれか1つを含む、バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)血清型2(AAV2)キャプシドタンパク質。 - 以下の配列および/または置換のセット:
(a)VRIにおけるNA;位置444におけるF;およびVRIVにおけるDEAXSEXKXTXR(配列番号7)、
(b)VRIIにおけるQ325K;Y444F;VRIVにおけるS452A、T454NおよびT455V;ならびにVRVIにおけるK527R、E530DおよびE531D、
(c)VRIにおけるQ263A;VRVにおけるK490T、S492P、E499DおよびY500F;ならびにVRVIにおけるE530D、
(d)VRIにおけるNA;Y444F;VRIVにおけるP451A、T454N、T455VおよびR459T;ならびにVRVIにおけるRXXDD(配列番号8)、
(e)VRVIにおけるE530D、
(f)QDXE(配列番号9)、ならびにVRVにおける置換Y500FおよびT503P、ならびに
(g)VRIにおけるEA;VRVにおけるT491VおよびY500F;ならびにVRVIIにおけるAAADDXEXDG(配列番号10)、
ここで、Xは任意のアミノ酸であってよい、
のうちのいずれか1つを含む、バリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。 - アミノ酸Xが、配列番号1に記載されるとおりの野生型AAV2配列におけるアミノ酸である、請求項1または2に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、VRVにおける配列DGEおよびDF、およびセット(a)の配列を含む、請求項1に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、VRVにおける配列DGEおよびDF、およびセット(b)の配列を含む、請求項1に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 置換Y444Fをさらに含む、請求項1に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、(c)および(e)〜(g)の配列および/または置換のセットのうちのいずれか1つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Y444Fをさらに含む、請求項2に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 置換Y730Fをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 置換Y272Fをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、(a)、(b)、(c)および(e)の配列および/または置換のセットのうちのいずれか1つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Y500Fをさらに含む、請求項2に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 置換T491Vをさらに含む、請求項1および6〜10のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、(a)〜(e)の配列および/または置換のセットのうちのいずれか1つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換T491Vをさらに含む、請求項2に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、VP3タンパク質である、請求項1〜12のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、VP2タンパク質である、請求項1〜12のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、VP1タンパク質である、請求項1〜12のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の組み換えAAVキャプシドタンパク質を含む、バリアント組み換えAAV2粒子。
- 逆位末端反復配列(ITR)を含む核酸をさらに含む、請求項16に記載のバリアント組み換えAAV2粒子。
- 目的の遺伝子を含む核酸をさらに含む、請求項16または17に記載のバリアント組み換えAAV2粒子。
- 核酸が、一本鎖である、16〜18のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV粒子。
- 核酸が、二本鎖である、16〜18のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV粒子。
- 16〜20のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2粒子を複数含む、組成物。
- 薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む、請求項21に記載の組成物。
- ある型の網膜細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法であって、網膜細胞に、請求項21または22に記載の組成物を提供することを含み、およびここで、組成物中のAAV2粒子が、目的の遺伝子を含む、前記方法。
- 組成物が、網膜細胞を担持する対象への硝子体内注射を介して網膜細胞に提供される、請求項23に記載の方法。
- 組成物が、網膜細胞を担持する対象への網膜下注射を介して網膜細胞に提供される、請求項23に記載の方法。
- 網膜細胞が、視細胞、線維柱帯網、網膜神経節細胞、双極細胞、ミュラー細胞、アマクリン細胞、星状膠細胞、水平細胞および網膜色素上皮細胞からなる群より選択される、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 上衣細胞またはプルキンエ細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法であって、請求項1に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質を含む組み換えAAV2粒子を複数含む組成物を提供することを含み、ここで、キャプシドタンパク質が、(b)の配列および/または置換のセットを含み、およびここで、組成物中のAAV2粒子が、目的の遺伝子を含む、前記方法。
- 組成物が、上衣細胞またはプルキンエ細胞を担持する対象への脳室内注射を介して上衣細胞またはプルキンエ細胞に提供される、請求項27に記載の方法。
- 対象が、哺乳動物である、請求項23〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物が、ヒトである、請求項29に記載の方法。
- 目的の遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項23〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 治療用タンパク質が、抗体または抗体フラグメント、ペプチボディ、増殖因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、酵素、遺伝子編集のために用いられるヌクレアーゼまたは他のタンパク質である、請求項31に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の配列および/または置換を含む、血清型2以外の血清型のバリアントrAAVキャプシドタンパク質であって、ここで、配列および/または置換が、AAV2の可変領域に対して相同である、血清型2以外の血清型のキャプシドタンパク質の可変領域中に位置する、前記血清型2以外の血清型のバリアントrAAVキャプシドタンパク質。
- 血清型1、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13のものである、請求項33に記載の血清型2以外の血清型のバリアントrAAVキャプシドタンパク質。
- バリアントrAAVキャプシドタンパク質が、血清型1または6のものである、請求項33に記載の血清型2以外の血清型のバリアントrAAVキャプシドタンパク質。
- 配列番号29の可変領域(VR)において、以下の配列:
(a)VRIにおけるXX;VRVにおけるQDXE;Y500F;およびT503P、
(b)VRIにおけるXX;Y444F;VRIVにおけるSD、ID、および/またはNXM;S492A;VRVにおけるDF;ならびにVRVIにおけるDG、
(c)VRIにおけるXXおよび/またはX;Y444F;T450D;T454S;VRIVにおけるMXTXR;T491V;Y500F;ならびにE531D、
(d)VRIにおけるNA;可変VRVにおけるDGEおよびDF;ならびにQ545E、
(e)VRIにおけるDAXXT;Y444F;VRIVにおけるAXMXKXH(配列番号30);VRVにおけるYN;Y500F;K507T;およびVRIVにおけるDXR、
(f)Y444F;VRIVにおけるGAXNMXTXAXR(配列番号31);可変VRVにおけるTXPおよびDF;ならびにE530D、
(g)VRIにおけるXX;T491V;Y500F;およびVRVIIにおけるAAADDXEXDG(配列番号10)、
(h)VRIにおけるXX;E530D;およびVRVIIにおけるAGRADIXXXS(配列番号33)、
(’)VRIにおけるXXおよび/またはX;VRVにおけるQDXE;Y500F;T503P;ならびにVRVIIにおけるSAAGADXAXDS(配列番号5)、
(j)Q545E、
(k)VRIにおけるNA;Y500F;T503P;およびK507T、
(l)Q263A;Y444F;P451A;T454N;T455V;R459T;およびVRVIにおけるRXXDD、
(m)Q263Aならびに可変VRVにおけるDGEおよびDF、
(n)VRIにおけるNA;ならびに可変VRVにおけるDGEおよびDF、
(o)Q263A;E530D;E531D、
(p)Q263A;可変VRVにおけるDGEおよびDF;ならびにVRVIIにおけるSAAGADXAXDS(配列番号5)、
(q)VRIにおけるNA;およびQ545E、
(r)VRIにおけるGT;Y500F;K507T;VRVIにおけるRXXDXR、ならびに/あるいは
(s)VRIにおけるXX;Y500F;K507T;VRVIにおけるRXXDXR、
ここで、Xは任意のアミノ酸であってよい
のうちの1つ以上を含む、バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)血清型2(AAV2)キャプシドタンパク質。 - アミノ酸Xが、配列番号1に記載されるとおりの野生型AAV2配列におけるアミノ酸である、請求項36に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 置換Y444Fをさらに含む、請求項36または37に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、(a)〜(d)および(e)〜(i)の配列および/または置換のセットのうちのいずれか1つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Y444Fをさらに含む、請求項36に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 以下の配列:
(i)VRIにおけるQS、NA、EA、DA、AS、AA、DT、NS、GA、GS、RS、TA、TS、ES、GT、QA、またはTT;VRVにおけるQDXE;Y500F;およびT503P、
(ii)VRIにおけるQS、NT、ES、GS、NA、AS、AA、GAまたはDS;Y444F;VRIVにおけるSD、ID、および/またはNXM;S492A;VRVにおけるDF;ならびにVRVIにおけるDG、
(iii)VRIにおけるQSGAS(配列番号46)、NAGAS(配列番号47)、TTGAT(配列番号48)、EAGAS(配列番号49)、TTGAS(配列番号50)またはGAGAS(配列番号51)、
(iv)VRIにおけるQS、EA、QA、NA、ASまたはES;T491V;Y500F;およびVRVIIにおけるAAADDXEXDG(配列番号10)、
(v)VRIにおけるQS、DS、NA、AS、DAまたはAT;E530D;およびVRVIIにおけるAGRADIXXXS(配列番号33)、ならびに/あるいは
(vi)VRIにおけるQSGAS(配列番号46)、NAGAS(配列番号47)、ASGAS(配列番号52)、GAGAS(配列番号51)、TAGAS(配列番号53)、QTGAS(配列番号54)またはTTGAS(配列番号50);VRVにおけるQDXE;Y500F;T503P;およびVRVIIにおけるSAAGADXAXDS(配列番号5)
のうちの1つ以上を含む、請求項36または37に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。 - 置換Y444Fをさらに含む、請求項40に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、(a)〜(i)または(i)−(vi)の配列および/または置換のセットのうちのいずれか1つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Y444Fをさらに含む、請求項40に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 置換Y730Fをさらに含む、請求項36〜42のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 置換Y272Fをさらに含む、請求項36〜43のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、(a)〜(i’)または(i)〜(vi)の配列および/または置換のセットのうちのいずれか1つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換Y500Fをさらに含む、請求項37または41に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 置換T491Vをさらに含む、請求項36〜45のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、(a)〜(i’)または(i)〜(vi)の配列および/または置換のセットのうちのいずれか1つを含み、およびここで、キャプシドタンパク質が、置換T491Vをさらに含む、請求項36〜46のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 図24または25において示される変異のうちの1つ以上を含む、バリアント組み換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)血清型2(AAV2)キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、VP3タンパク質である、請求項36〜48のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、VP2タンパク質である、請求項36〜49のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- キャプシドタンパク質が、VP1タンパク質である、請求項36〜49のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 請求項36〜51のいずれか一項に記載の組み換えAAVキャプシドタンパク質を含む、バリアント組み換えAAV2粒子。
- 逆位末端反復配列(ITR)を含む核酸をさらに含む、請求項52に記載のバリアント組み換えAAV2粒子。
- 目的の遺伝子を含む核酸をさらに含む、請求項52または53に記載のバリアント組み換えAAV2粒子。
- 核酸が、一本鎖である、請求項52〜54のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV粒子。
- 核酸が、二本鎖である、請求項52〜54のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV粒子。
- 請求項52〜56のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2粒子を複数含む、組成物。
- 薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む、請求項57に記載の組成物。
- ある型の網膜細胞に目的の遺伝子で形質導入する方法であって、網膜細胞に請求項57または58に記載の組成物を提供することを含み、ここで、組成物中のAAV2粒子が、目的の遺伝子を含む、前記方法。
- 組成物が、網膜細胞を担持する対象への硝子体内注射を介して網膜細胞に提供される、請求項59に記載の方法。
- 組成物が、網膜細胞を担持する対象への網膜下注射を介して網膜細胞に提供される、請求項59に記載の方法。
- 網膜細胞が、視細胞、線維柱帯網、網膜神経節細胞、双極細胞、ミュラー細胞、アマクリン細胞、星状膠細胞、水平細胞および網膜色素上皮細胞からなる群より選択される、請求項59〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、哺乳動物である、請求項59〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物が、ヒトである、請求項63に記載の方法。
- 目的の遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項59〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 治療用タンパク質が、抗体または抗体フラグメント、ペプチボディ、増殖因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化性または阻害性のペプチド、細胞内プロセスを標的とする細胞浸透性ペプチド、酵素、遺伝子編集のために用いられるヌクレアーゼまたは他のタンパク質である、請求項65に記載の方法。
- 請求項36〜51のいずれか一項に記載の配列および/または置換を含む、血清型2以外の血清型のバリアントrAAVキャプシドタンパク質であって、ここで、配列および/または置換が、AAV2の可変領域に対して相同である、血清型2以外の血清型のキャプシドタンパク質の可変領域中に位置する、前記血清型2以外の血清型のバリアントrAAVキャプシドタンパク質。
- バリアントrAAVキャプシドタンパク質が、血清型1、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13のものである、請求項67に記載の血清型2以外の血清型のバリアントrAAVキャプシドタンパク質。
- バリアントrAAVキャプシドタンパク質が、血清型1または6のものである、請求項68に記載の血清型2以外の血清型のバリアントrAAVキャプシドタンパク質。
- 以下のペプチド:LALGETTRPA(配列番号66)、NRGTEWD(配列番号67)、ADGVQWT(配列番号68)、GEARISA(配列番号69)、SGNSGAA(配列番号70)、ESGLSQS(配列番号71)、EYRDSSG(配列番号72)、DLGSARA(配列番号73)、PRSADLA(配列番号74)、PRSTSDP(配列番号75)、およびESGHGYF(配列番号76)のうちのいずれか1つを1つ以上さらに含む、請求項1〜15または36〜48のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- LALGETTRPA(配列番号66)、NRGTEWD(配列番号67)、ADGVQWT(配列番号68)、GEARISA(配列番号69)、SGNSGAA(配列番号70)、ESGLSQS(配列番号71)、EYRDSSG(配列番号72)、DLGSARA(配列番号73)、PRSADLA(配列番号74)、PRSTSDP(配列番号75)、およびESGHGYF(配列番号76)のうちの1つ以上が、アミノ酸585と588との間に存在する、請求項70に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
- 以下の置換:Y252F、Y272F、Y444F、Y700F、Y704F、Y730FおよびT491Vのうちのいずれか1つを1つ以上さらに含む、請求項1〜15、36〜48、70および71のいずれか一項に記載のバリアント組み換えAAV2キャプシドタンパク質。
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