JP2020505633A - 顕微分光測定の方法およびシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、光学顕微鏡（１０）と、分光システム（５０）と、前記少なくとも１つの顕微鏡対物レンズ（１１、１２）を通して試料上に励起光ビームを導き、試料からラマンまたはＰＬ光ビームを収集するように適合された光学システム（１４）とを備える、光学顕微分光システムに関する。本発明によると、光学顕微分光システムは、試料表面からの照明ビームの反射または透過によって、試料の第１の画像（７１）および第２の画像（７２）を取得するように構成された画像化システム（１６、４１）を備え、第１の画像（７１）は大視野を有し、第２の画像（７２）は小視野を有し、第１の画像（７１）の座標系において、前記第２の画像（７２）に対応する領域を決定するように構成された処理システム（４０）と、第１の画像（７１）、第２の画像（７２）、および前記領域を表す第３の画像（７３）を第１の画像（７１）上に重ねて前記領域を表示するように構成されている、表示システム（４４）と、を備える。

Description

本発明は、例えばミリメートルスケールからミクロンスケールまでの広い空間範囲にわたって２次元（２Ｄ）または３次元（３Ｄ）で、かつ横方向および軸方向の高い分解能を伴って、試料表面を視覚化しマッピングして、正確に選択された関心領域（ＲＯＩ）において顕微分光測定を実施するための方法およびシステムに関する。

本発明はまた、高精度で、かつ例えばミリメートルスケールからミクロンスケールまでの広い空間範囲にわたって、試料表面上を容易にナビゲートして、例えばフォトルミネッセンス（ＰＬ）またはラマン画像化などの分光分析または分光分析画像化を実施するための関心領域（ＲＯＩ）を選択するための方法およびシステムに関する。

最近２０年間で、光子検出器と光源開発の飛躍的発展により、ＰＬおよびラマン分光計の開発が劇的に進歩してきた。光子検出システムは、特にＣＣＤ、ＥＭＣＣＤおよびＣＭＯＳカメラ、ならびに改善された特性を有する新世代のアバランシェフォトダイオードおよび光電子増倍管を含む。新しい光源には、ＰＬまたはラマン信号を生成するのに十分な数十ｍＷの平均出力を有する、ＵＶ光から近赤外光に至るスペクトル範囲をカバーする小型の固体レーザが含まれる。

ＰＬおよびラマン技術の開発における重要なブレイクスルーは、分光技術と顕微鏡検査技術を組み合わせた結果として生まれている。両方の技術が非常に古い技術であるという事実にも関わらず、エレクトロニクスおよびフォトニクスにおける最近の発展により重要な革新が可能になった。

特に、最新の顕微鏡分光計は、試料表面を検知し追跡するためのオートフォーカスシステムを備えている。オートフォーカスシステムの機能の主体には、光学的または数値的な起源がある。

光学ハードウェア・オートフォーカスシステムは、レーザを使用して試料表面までの距離を測定するか、または白色光の干渉を使用して表面までの距離を一定に保っている。それらはまた、試料表面から反射された光強度か、または試料のスペクトル応答の強度を使用して、測定された信号の最大値を介して試料表面の位置を特定することができる。一般に、全ての光学ハードウェア・オートフォーカスシステムはポイントごとの測定方法であり、Ｎ×Ｎ画素の領域から情報を収集するための時間を必要とする。１つの画素に費やされる時間および画素数の関数として、総時間は数分から数時間まで変動し得る。光学オートフォーカス法の別の不都合な点は、試料表面の性質に対して、その方法が敏感なことである。拡散性が強く、半透明で、傾斜した、または起伏のある表面の場合には、この方法は不正確な結果をもたらすか、または全く機能しないであろう。その上、光学ハードウェア・オートフォーカス装置の価格は顕微鏡分光計の総コストを増加させる。

光学ハードウェア・オートフォーカスシステムの使用の代替形態は、デジタルまたは数値オートフォーカスシステムの使用である。これらのシステムは、既に存在する、光学式対物レンズなどのビデオ画像ハードウェア、光伝送光学系、およびＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラなどの検出装置を使用しているので、装置に追加費用を何らもたらすことはない。唯一の投資は、研究されたまたは測定された試料上で焦点を見つけて維持するためのソフトウェアの中に統合される数学的アルゴリズムの開発である。そのようなシステムは既に開発されており、デジタルフォトカメラ、スマートフォン、またはデジタル顕微鏡法で一般に使用されている。全ての特定の実現形態において、発明者らは、ハードウェア実現形態およびソフトウェア実現形態の、発明者らの特定の解決策を提案しており、適用形態は装置ごとに異なる。デジタルオートフォーカスの重要な利点は、視野に対応する広い作業領域である。デジタルオートフォーカスは、数百万画素の同時測定によって進行する。デジタルオートフォーカスシステムは、一般に、画像のコントラストまたは鮮鋭度解析に基づく。それらのソフトウェアは、ｚ座標の関数として画像のコントラストまたは鮮鋭度を解析し、最良の合焦位置を決定するアルゴリズムを含む。高コントラストまたは鮮鋭な画像が試料の合焦位置に対応することが、このソフトウェア手法を可能にしている。

概ね平坦で滑らかな試料の場合、オートフォーカスにより視野全体を鮮鋭に視覚化することが可能になる。しかし、大部分の試料はＯＺ軸に沿って大きな変動を有する粗い表面を呈しており、それにより、試料表面の視覚化のために、ならびにＰＬ、または、および／または、ラマン表面の画像化のために、ＲＯＩの各点において光学オートフォーカスを作動させることが必要となる。上述のように、これは非常に時間を要するという理由で、光学ハードウェア・オートフォーカスシステムの大きな欠点である。その上、顕微鏡対物レンズの視野内の試料表面の一部がぼやけるので、ユーザが試料のＰＬまたはラマン測定を実施するための関心領域（ＲＯＩ）を選択することは困難である。従って、このシステムの使用中にＲＯＩ領域を確定することは困難である。

従って、従来技術の欠点を改善するために、本発明の目的の１つは、分析対象の試料を保持するための試料ホルダ、および光軸（ＯＺ）を画定する少なくとも１つの顕微鏡対物レンズを備える光学顕微鏡と、励起光ビームを生成するように適合された光源、分光計、および検出システムを備える分光システムと、前記少なくとも１つの顕微鏡対物レンズを通して励起光ビームを試料上に導き、試料上で励起光ビームの散乱によって生成されたラマンまたはフォトルミネッセンス光ビームを収集するように適合された光学システムであって、前記ラマンまたはフォトルミネッセンス光ビームを前記分光計および前記検出システムに向けて導くように適合された、光学システムと、前記試料ホルダと少なくとも１つの顕微鏡対物レンズとの間の相対的な横方向および／または軸方向の移動を駆動するための作動システムと、を備える光学顕微分光システムを提供することである。

本発明によると、光学顕微分光システムは、照明ビームを生成するための別の光源と、前記少なくとも１つの顕微鏡対物レンズと組み合わせて配置され、試料の第１の画像を取得し、試料の第２の画像を取得するように構成された画像化システムであって、第１の画像および第２の画像は試料表面からの照明ビームの反射または透過によって形成されており、第１の画像は大視野を有し、第２の画像は小視野を有する、画像化システムと、第２の画像の小視野に対応する第１の画像の座標系における領域を決定するように構成された処理システムと、第１の画像および第２の画像を表示し、前記領域のグラフィック表現を第１の画像上に重ねて表示するように構成された表示システムと、第１の画像および／または第２の画像内の関心領域を選択するように構成されたユーザインタフェースと、を備え、作動システムは励起光ビームを受けるように前記関心領域を位置決めするように構成されており、分光測定システムは、前記関心領域から生成されたラマンまたはフォトルミネッセンス光ビームを検出するように構成されている。

特定の有利な実施形態によると、少なくとも１つの顕微鏡対物レンズは低倍率対物レンズおよび高倍率対物レンズを備え、低倍率対物レンズは第１の画像を画像化システム上に形成するように構成され、高倍率対物レンズは試料の第２の画像を画像化システム上に形成するように構成されている。

特定の有利な態様によると、画像化システムは第２の画像をリアルタイムで取得するように適合され、処理システムは第２の画像に対応する領域をリアルタイムで更新するように適合され、表示システムは第２の画像をリアルタイムで表示し、更新された領域のグラフィック表現をリアルタイムで表示するように適合されている。

好ましくは、ユーザインタフェースは、一体型コンピュータマウス、トラックボール、ジョイスティック、タッチパッドおよび／またはタッチスクリーンを備え、前記ユーザインタフェースは、ドラッグアンドムーブ操作を用いて、それぞれ第１の画像または第２の画像とインタラクトし、それにより、それぞれ第１の画像内の大視野または第２の画像内の小視野を、定められた水平変位量だけ移動させるように適合されており、作動システムは、それぞれ、第１の画像内のまたは第２の画像内の定められた水平変位量に比例した相対水平運動（ｄＸおよび／またはｄＹ）を駆動するように適合されている。

別の特定の有利な態様によると、作動システムは、少なくとも１つの顕微鏡対物レンズの軸方向位置を、前記光軸に沿って試料ホルダに対して変更するように構成された駆動ユニットを備え、画像化システムは、前記光軸（ＯＺ）に沿った複数の軸方向位置（Ｚ）において試料の複数の画像を取得するように構成され、処理システムは、複数の画像の各画像に対する中心領域内の隣接する画素強度の平均二乗差を計算し、そこから前記複数の画像のうちの各々の中心領域についての画像鮮鋭度を評価するように構成され、処理システムは、画像鮮鋭度から中心領域上の合焦位置を推定するように構成され、画像化システムは、前記第１の画像、および／または中心領域上の前記合焦位置における前記第２の画像を取得するように構成されている。

特定の実施形態によると、中心領域上の合焦位置は、前記複数の画像の各々についての平均二乗差（ＭＳＤ）値と、平均二乗差値のプロファイルとを、前記複数の軸方向位置（Ｚ）の関数として算出することによって決定され、中心領域上の合焦位置は、平均二乗差値の前記プロファイルの最大値を算出することによって決定される。

特定の実施形態によると、前記画像鮮鋭度は、前記複数の画像の各々について中心領域における平均強度導関数と平均強度プロファイル導関数とを、前記複数の軸方向Ｚ位置の関数として算出することによって評価され、合焦近傍位置範囲が、前記平均強度プロファイル導関数の最大値に向かう、軸方向（ＯＺ）の変位によって決定される。

有利には、処理システムは、そこから表面トポグラフィマップを推定するように構成されている。

別の特定の有利な態様によると、処理システムは、試料の前記複数の画像に対して、複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）を光軸に沿った前記複数の軸方向位置（Ｚ）の関数として決定するように構成され、処理システム（４０）は、複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）の各々、および関連する信頼水準の値に対して、勾配または一次導関数プロファイルまたは二次導関数プロファイルのそれぞれ、平均二乗差または変動量を使用して、鮮鋭度プロファイルまたはコントラストプロファイルを評価するように構成され、処理システムは、関連する信頼水準値を用いて、前記画素列ベクトル（Ｐｘ、Ｐｙ）の各々について前記鮮鋭度またはコントラストプロファイルを解析し、そこから複数の画素列ベクトル（Ｐｘ、Ｐｙ）の各々について合焦位置を推定するように構成され、処理システムは、複数の画素列ベクトル（Ｐｘ、Ｐｙ）の各々について合焦位置の３次元座標および対応する画素強度を決定し、試料表面を３次元で表す試料トポグラフィ画像を構築するように構成されている。

本発明の更なる目的は、
−光学顕微鏡の試料ステージの現在位置を決定するステップと、
−試料ステージ上に配置された試料に向けて照明光ビームを生成するステップと、
−光学顕微鏡上の顕微鏡対物レンズを選択するステップと、
−試料表面からの照明光ビームの反射または透過によって前記光学顕微鏡を通して形成された第１の画像を取得するステップであって、第１の画像は大視野を有する、ステップと、
−第１の画像をデータ記憶ユニットに記憶させるステップと、
−第１の画像を表示システム上に表示するステップと、
−試料表面からの照明ビームの反射または透過によって前記光学顕微鏡を通して形成された第２の画像を取得するステップであって、第２の画像は第１の画像の視野よりも小さい小視野を有する、ステップと、
−第２の画像を表示システム上に表示するステップと、
−小視野の第２の画像に対応する、第１の画像の座標系における領域を決定するステップと、
−前記領域のグラフィック表現を第１の画像上に重ね合わせて表示するステップと、
−表示システム上に表示された第１の画像内および／または第２の画像内の関心領域を選択するステップと、
−前記顕微鏡を通して励起光ビームを試料の関心領域上に導くように試料を位置決めし、試料の関心領域上で励起光ビームの散乱によって生成されたラマンまたはフォトルミネッセンス光ビームを収集するステップと、
を含む顕微分光測定方法を提供することである。

好ましくは、方法は更に、分光計システムを用いてラマンまたはフォトルミネッセンス光ビームを検出することを含む。

特定の実施形態では、第１の画像および第２の画像は、光軸を画定する同じ顕微鏡対物レンズを使用して形成され、第１の画像を取得するステップは、光軸を横断する平面内の複数の所定位置において複数の画像を取得すること、および前記複数の画像を、それらの所定位置の関数としてタイリングすることによって第１の画像を形成すること、を含む。

別の特定の実施形態では、第１の画像は低倍率対物レンズを使用して形成され、第２の画像は高倍率対物レンズを使用して形成される。

有益には、方法は更に以下の、
−光学顕微鏡に対する試料ホルダの複数の相対的軸方向（Ｚ）位置において、試料の複数の画像を取得するために顕微鏡対物レンズを使用するステップであって、前記相対的軸方向（Ｚ）位置は前記顕微鏡対物レンズ光軸に沿って取られている、ステップと、
−前記複数の画像の各画像について中心領域内の鮮鋭度を評価するステップと、
−前記複数の軸方向Ｚ位置について評価された鮮鋭度から中心領域内の合焦位置を推定するステップと、
−試料を中心領域内の前記合焦位置に配置するステップと、
を含み、
−前記第１の画像および／または前記第２の画像を取得するステップは前記合焦位置で行われる。

有利には、方法は更に、前記複数の画像の各々について中心領域内の平均強度導関数を算出することと、前記複数の軸方向Ｚ位置の関数として平均強度導関数プロファイルを決定することと、合焦位置を決定する前に、試料ホルダを前記平均強度導関数プロファイルの最小の方向に変位させ、それにより合焦近傍位置範囲を決定することと、を含む。

特定の実施形態では、前記合焦近傍位置範囲は、前記複数の画像の各々についての平均強度を使用して見つけられ、前記合焦近傍位置範囲は、前記平均強度の一次導関数を前記複数の軸方向Ｚ位置の関数として算出すること、およびＭＳＤ変動が非ゼロになるまで、算出された導関数の最小値の方向に試料を更にＺ変位させ、よって合焦近傍Ｚ範囲を画定することを通して見つけられる。

特定の実施形態では、鮮鋭度を評価するステップは、前記複数の軸方向Ｚ位置の関数として、前記複数の画像の各々についての中心領域における平均強度差値から、および平均二乗差（ＭＳＤ）プロファイルから推定され、合焦位置は、前記平均二乗差値プロファイルの最大値を算出することによって決定される。

更に別の実施形態では、鮮鋭度を評価するステップは、前記複数の画像の各々の中心領域における画像勾配を算出すること、および画像勾配プロファイルを前記複数の軸方向Ｚ位置の関数として算出することから推定され、前記合焦位置は、前記画像勾配プロファイルの最大値を算出することによって決定される。

別の特定の態様によると、顕微分光測定法は更に、
−試料の前記複数の画像に対して、複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）を、光軸（ＯＺ）に沿った前記複数の軸方向位置（Ｚ）の関数として決定するステップと、
−複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）の各々について、平均二乗偏差、変動、勾配、一次導関数プロファイルまたは二次導関数プロファイルのそれぞれ、および関連する信頼水準値を使用して、鮮鋭度プロファイルまたはコントラストプロファイルを評価するステップと、
−複数の画素列ベクトルの各々に対して、関連する信頼水準値を用いて前記鮮鋭度プロファイルまたはコントラストプロファイルを解析して、そこから複数の画素列ベクトルの各々に対して合焦位置を推定するステップと、
−合焦位置の３次元座標および対応する画素強度を抽出するステップと、
−合焦位置の３次元座標および対応する画素強度を記憶ユニット４５内に保存するステップと、
−合焦位置の３次元座標、および対応する画素強度を使用して、試料トポグラフィ画像Ｚ（Ｘ，Ｙ）、および／または３次元試料表面画像を構築するステップと、
を含む。

このシステムおよび方法は、試料表面上で迅速かつ容易なナビゲーションを提供する一方で、選択された関心領域（ＲＯＩ）におけるラマン信号取得を可能にしている。

好ましくは、ラマンまたはＰＬ測定のための関心領域は、矩形領域、円盤状領域、ユーザ指定領域、線、ランダムに選択された点のセット、およびユーザ指定点のセット、の中から選択される。

この方法およびシステムは高速であり、追加のハードウェア構成要素を必要としない。

本発明は添付の図面を参照したとき、よりよく理解されるであろう。

光学顕微鏡、フォトルミネッセンスまたはラマン分光計、および可視化装置を組み合わせた機器を概略的に表す。 可視化装置上に表示されたパターン化された試料の第１の画像および第２の画像の一例を示し、第２の画像に相当する領域を第１の画像上に重ね合わせた境界を示す。 加えてオートフォーカスプロセスを用いて得られた、別の試料の第１の画像および第２の画像の別の例を示す。 １０倍対物レンズを使用して異なるＺ軸方向位置で撮影された、ルチル試料について取得された画像のスタックからのいくつかの画像を示す。 それぞれ、図４Ａ〜図４Ｅの画像を含む画像のスタックからの処理に基づいて再構成された合焦画像を示す。 １０倍対物レンズを用いて得られた、アスピリン錠剤試料の実質的に鮮鋭化された画像を２Ｄで示す。 対応する表面トポグラフィマップを示す。 １００倍対物レンズを用いた、石膏試料の再構成された２Ｄ合焦画像を示す。 対応する全焦点３Ｄ再構成表面トポグラフィを示す。 １００倍でのルチル試料の２Ｄ表面トポグラフィ画像を示す。 対応するラマン分光法の画像を示す。

本明細書には、試料移動または試料表面ナビゲーション中に試料表面の焦点を自動発見することと、視野内の試料表面全体を同時可視化することと、視野内のこの全焦点の試料表面を登録して更にモザイク画像と組み合わせることと、正確および洗練された方法でＲＯＩを選択する目的で、その詳細に関するズームを伴う大きな試料画像上で容易にナビゲートして、更なるＰＬおよびラマン測定ならびに試料表面の画像化をすること、のための新しいデジタル手法が開示される。

装置
本開示の第１の態様は、試料表面上での容易なナビゲーションを提供する、ＰＬまたはラマン信号取得のための新しいシステムおよび方法に関する。

図１は、光学顕微鏡１０、フォトルミネッセンスまたはラマン分光システム５０、処理システム４０、および表示装置４４を組み合わせたシステムを概略的に示す。

光学顕微鏡１０は概して、顕微鏡スタンド、少なくとも１つの対物レンズ１１、および分析対象の試料を保持するための試料ホルダを備える。対物レンズ１１は、概して垂直な光軸ＯＺを画定している。好ましくは、光学顕微鏡１０は、低倍率対物レンズ１１および高倍率対物レンズ１２を備える。

顕微鏡１０は概して、試料ステージを対物レンズ１１に対して３次元で移動させるための電動アクチュエータ２０を備える。例えば、試料をＸ方向および／またはＹ方向に沿って並進移動させるように、試料ステージはＸＹ走査ステージ上に取り付けられていてもよく、顕微鏡本体はＺステージを備えて、焦点を調整するために顕微鏡対物レンズ１１をＯＺ軸に沿って移動させることを可能にしている。代替として、試料ステージをＸＹＺ走査ステージ上に取り付けて、試料を３Ｄで移動させることを可能にしてもよい。代替としてまたは補足として、試料ステージを回転ステージ上に取り付けてもよい。

本明細書では、ＸＹＺ正規直交座標系を想定し、ＯＺ軸が顕微鏡の光軸に対応し、ＯＸ軸およびＯＹ軸がＯＺ軸を横断している。概して、ＯＺ軸は垂直である。

光学顕微鏡１０は、照明光を対物レンズの中に導くために使用されるビームスプリッタ１３と、顕微鏡を分光計に結合させるために使用される切替ミラー１４と、ＣＭＯＳカメラ上に試料画像を生成するために使用されるチューブレンズ１５とを備える照明ターレットを含む。更に、光学顕微鏡１０は、白色光源１８および照明コンデンサ１７を備える。白色光源１８は、例えばＬＥＤランプまたはハロゲンランプから構成される。白色光源１８は、照明コンデンサ１７に導かれる白色光ビームを生成する。照明コンデンサ１７は、ビームスプリッタ１３上で反射されて試料表面に向かう照明光ビームを形成する。

加えて、光学顕微鏡１０は、試料表面のビデオ画像を取得するためのビデオカメラ１６を備える。試料表面のビデオ画像は、光学顕微鏡１０が反射で動作するように構成されている場合は反射光を使用して、または光学顕微鏡１０が透過で動作するように構成されている場合は透過光を使用して、それぞれ形成される。

ＰＬまたはラマン分光システム５０は、レーザ光源５１、レイリーフィルタ５２、結合光学系５４、分光計５５、およびＣＣＤカメラ６０を備える。レーザ光源５１は、所定波長において励起光ビームを発生させる。入力経路上で、レイリーフィルタ５２は、励起光ビームを光学顕微鏡のビーム経路内の切替ミラー１４に向かって伝達し、それにより励起光ビームは試料表面に向かって導かれる。対物レンズ１１は励起光ビームを試料上に集束させる。切替ミラー１４は、励起光ビームを試料表面に向けて導くことまたは導かないことを可能にしている。対物レンズ１１は、試料により後方散乱された光ビームを集光し、その後方散乱された光ビームを切替ミラー１４に向かって戻す。戻る経路において、レイリーフィルタ５２は、ＰＬまたはラマン散乱光から、レーザ波長のレイリー散乱光を分離する。例えば、レイリーフィルタ５２は、ノッチ型インジェクション−リジェクションスペクトルフィルタを備える。任意選択的に、共焦点ピンホール５３は、ラマンまたはＰＬ光ビームを試料中の特定の平面から選択するように配置されている。結合光学系５４は、ＰＬまたはラマン散乱光を分光計５５の入射スリット上に合焦させる。ＣＣＤカメラ６０は、ＰＬまたはラマンスペクトルを検出するように分光計５５の出力に配置されている。

概して、顕微分光システムは、取得ユニット４１と、処置ユニット４２と、制御ユニットまたは中央処理ユニット４３と、データ記憶ユニット４５とを含む処理システム４０を備える。取得ユニット４１は、ビデオカメラ１６からの画像、および／またはＣＣＤカメラ６０からのスペクトルのそれぞれを取得する。処置ユニット４２は、取得された画像および／またはスペクトルに対して数値処理を実行する。中央処理ユニット４３は、走査ステージ２０、白色光源１８、切替ミラー１４、レーザ光源５１、レイリーフィルタ５２、共焦点ピンホール５３、切替ミラー１４、および分光計５５の動作を同調させる。

最後に、顕微分光システムは、１つの画面またはいくつかの画面で構成される表示装置４４を含む。表示装置４４は、中央処理ユニット４３に接続されている。例えば、表示装置４４は、ビデオカメラ１６で取得された試料の画像、および／またはその試料のある点においてＣＣＤカメラ６０を使用して測定されたスペクトルをリアルタイムで表示する。

ここで、本開示の第１の態様による顕微分光システムの構成および動作について説明するが、そのシステムは、ＲＯＩを選択し、そのＲＯＩ内でラマンまたはＰＬ分光測定を実施するための、試料スケールでのナビゲーションマップを提供する。

例えば、顕微鏡は、４倍、５倍または１０倍の低倍率を有する第１の対物レンズ１１を使用している。

電動式または圧電作動式のＸＹ走査ステージ２０は、試料表面の調査または可視化の間にＸ方向および／またはＹ方向における変位を駆動するために使用される。好ましくは、顕微鏡は、試料ステージと対物レンズとの間のＯＺ軸に沿った相対変位のための電動式のＺステージまたは圧電作動式のＺステージを備える。制御ユニット４３は、ＸＹＺステージの現在位置をリアルタイムで受信する。

顕微鏡の第１の対物レンズ１１を使用して、顕微鏡カメラ１６は、白色光ビームの試料表面上での反射によって得られた、試料表面の第１の画像７１を検出する。顕微鏡カメラおよび第１の対物レンズは、ＸＹステージと、第１の対物レンズと組み合わされたカメラ１６の画素アレイの座標との間の座標伝達関数を決定するように較正される。従って、第１の画像７１の各画素は、試料ステージのＸＹ座標系における確定された位置を有する。第１の画像７１は、データ記憶ユニット４５内に割り当てられた仮想画像空間内に記憶される。この第１の画像７１は、図２に示すようにナビゲーションマップの内容を初期化するために使用される。第１の画像７１は、データ記憶ユニット４５内に記憶される。第１の画像７１はまた、表示装置４４上に静止画像として表示される。

次に、第２の対物レンズ１２が第１の対物レンズ１１を置換する。第２の対物レンズ１２は、例えば５０倍または１００倍の高倍率対物レンズである。好ましくは、第１の対物レンズ１１と第２の対物レンズ１２とは同じ光軸（ＯＺ）を有する。代替として、第１の対物レンズ１１の光軸と第２の対物レンズ１２の光軸との間のオフセットを決定するために較正が使用される。処理ユニット４０は、各対物レンズに対応する拡大率、および場合によってはオフセットを記憶する。第１の対物レンズにおけるのと同様に、顕微鏡カメラおよび第２の対物レンズは、ＸＹステージと、第２の対物レンズと組み合わされたカメラ１６の画素アレイの座標との間の座標伝達関数を決定するように較正される。任意選択的に、電動式のＺステージまたは圧電作動式のＺステージを使用して焦点が調整される。

第２の対物レンズ１２は、試料上の特定領域をズームし、試料表面上の白色光ビームの反射によって同じ試料表面の第２の画像７２を取得することを可能にする。第２の画像７２の各画素は、試料ステージのＸＹ座標系における確定された位置を有する。ＣＭＯＳビデオカメラ１６は、ズームされた領域をライブビデオとしてまたは画像として記録する。この第２の画像７２（静的またはライブ）は、図２（右側）に示すようにスクリーン４４上に表示される。倍率がより高いゆえに、第２の画像７２は、好ましくは少なくとも部分的に、第１の画像７１の視野に含まれる狭視野を呈する。カメラ１６上の視野は略矩形の形状を有する。

代替として、顕微鏡システムは、単一の顕微鏡対物レンズを使用して、パノラマ画像である第１の画像７１と、小視野を有する第２の画像７２とを形成する。この場合、第１の画像７１は、複数のＸ、Ｙ位置で撮影された複数の画像を取得し、この複数の画像をそれぞれの位置の関数としてパニングすることによって得られ、それにより、試料の大視野を提供するパノラマの第１の画像７１が得られる。

全ての場合について、第１の画像７１は大視野で取得され、第２の画像７２は試料の小視野で取得される。第１の画像と第２の画像とは別々の画面に表示されてもよい。代替として、第１の画像および第２の画像は、例えばモザイクウィンドウを使用して、同じスクリーン上の別々のウィンドウに表示される。

その上、処理ユニット４０は、第１の画像７１の座標系において、第２の画像７２の視野に対応する矩形ボックスの位置を計算する。この矩形ボックスの境界の画像７３は、表示装置４４上の第１の画像７１上に重ね合わせて表示される。従って、第１の画像７１と、重ね合わせて表示された矩形ボックス７３とを含むナビゲーションマップが得られる。ナビゲーションマップはまた、第１の画像７１の隣に同時に表示された第２の画像７２を含んでもよい。第２の画像７２は、一般に第１の画像７１よりも高い空間解像度および低い被写界深度を伴って、狭視野上にズームを提供する。第２の画像７２は、ＸＹステージの現在位置の関数としてリアルタイムに更新される。同時に、矩形ボックス７３の境界の位置もまた、ＸＹステージの現在位置の関数としてリアルタイムに更新される。

処理ユニット４０はまた、試料ステージを顕微鏡対物レンズに対して移動させるためのアクチュエータを駆動するために使用される。例えば、処理ユニットは試料ステージをＸ方向および／またはＹ方向に移動させる。カメラ１６は更新された第２の画像７２をリアルタイムで記録する。処理ユニットは、表示装置４４上の矩形ボックス７３の位置を、同じくリアルタイムで計算し更新する。

ユーザは、画像７１、７２、および７３を同時に視覚化し、一体型コンピュータマウス、トラックボール、ジョイスティック、タッチパッドまたはタッチスクリーンなどの任意の入力装置を使用し、試料表面上での容易なナビゲーションのためにそれら画像を使用する。ユーザは、第２の画像７２（顕微鏡画像）に対して「ドラッグアンドムーブ（ｄｒａｇ−ａｎｄ−ｍｏｖｅ）」機能を容易に使用することができる。ＸＹステージはリアルタイムで移動して、リアルタイムの第２の画像を所望のＸＹ位置に表示する。ユーザはまた、第１の画像７１上の領域をクリックまたはタッチして選択して、試料をその領域に向かって移動させることができる。

従って、ユーザは、第１の画像７１、第２の画像７２、および矩形ボックス７３を同時に見ることによって、試料表面上での相対移動を容易に制御する。

ユーザは、試料上の関心領域を選択し移動方向を決定することが容易にできる。

代替としておよび／または補足として、矩形ボックス７３は適切なユーザインタフェースを使用して目標位置に移動可能である。ユーザインタフェースは、例えば、コンピュータマウス、またはタッチパッド、またはタッチスクリーン、または任意の他のインタラクティブ装置を備える。制御ユニット４３は、表示装置４４上の矩形ボックス７３の移動を検出し、それに対応するＸＹステージの変位を計算する。制御ユニット４３は、対応する変位をＸＹ走査ステージに与えるように走査ステージ２０を駆動する。従って、ＸＹステージの目標位置への自動変位は、表示装置４４上でユーザインタフェースによって、かつ視覚的に制御することができる。

ＸＹステージが所望のＲＯＩに移動した場合、ユーザは、選択したＲＯＩ内においてＰＬまたはラマンスペクトルの取得を始動させることができる。

従って、システムは試料のマップを通して、視覚的にインタラクティブなナビゲーションを提供する。このシステムおよび方法は、試料の探査および解析の観点で特色のある経験を提供する。それはラマンまたはＰＬ測定のための関心領域を見つけることを極めて容易にする。

このシステムは、ズームされた試料の表面上をナビゲートすること、および試料表面の詳細を視覚化することを可能にする。図２に示す試料は、略平坦な表面を有し、高コントラストを有するフィーチャを呈している。

従って、低倍率対物レンズおよび大視野で得られた試料の第１の画像７１は、座標系を有するナビゲーションマップを提供する。同時に、高倍率対物レンズで得られ、試料表面の詳細を含む、ズームされた試料の第２の画像７２は、第１の画像の座標系内に配置される。この技術により、ユーザは関心領域内で、グローバルな試料の映像と、試料表面の詳細な映像とを同時に見ることができる。

しかし、いくつかの試料は、顕微鏡対物レンズの焦点深度よりも大きなフィーチャを有する、粗いまたは凹凸を有する表面、および／または表面トポグラフィを呈し得る。そのような試料からは一般に、少なくとも部分的にぼやけたビデオ画像が生成される。また、共焦点システムを使用することで、第１の画像７１および／または第２の画像７２は、焦点が合っていないために少なくとも部分的にぼやける場合がある。試料の画像がぼやけていると詳細なフィーチャが見えないため、試料表面上での簡単なナビゲーションが妨げられる。試料表面上でＲＯＩを決定し、正確なラマンまたはＰＬ顕微分光データを得ることも、より困難である。

本開示の第２の態様は、ナビゲーション中に対物レンズの視野を常に試料表面に合焦させ続けるための、ＣＭＯＳカメラ１６を使用した高速画像取得と組み合わせたＺステージ変位に関する（図３参照）。

本明細書ではこの技術はＮａｖＳｈａｒｐと呼ばれ、粗い、凹凸を有する試料表面上または表面起伏上での鮮鋭ナビゲーション（ｓｈａｒｐ ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ）を意味する。この技術は、粗い、凹凸を有するまたは起伏を有する試料上での鮮鋭ナビゲーションを提供するように、第１の態様で開示されたナビゲーションマップ技術と組み合わされる。

このシステムは、コンピュータ制御された電動式または圧電式のＸＹステージを使用する。電動式または圧電式の顕微鏡のＺステージは、ＯＺ軸に沿った変位に使用される。制御ユニット４３は、ユーザが選択した位置にＸＹステージを移動させる。ビデオカメラ１６は、現在の軸方向Ｚ位置で試料画像を取得する。制御ユニット４３は、Ｚステージを対物レンズの所定距離だけ移動させ、カメラ１６は別の画像を取得する。取得された画像の各々について、処置ユニット４２は画像解析を進める。処理アルゴリズムは画像の中心領域に適用される。第２の態様に関する以下の説明（ＮａｖＳｈａｒｐの説明）において、画像解析という用語は、数十画素からなる、画像の中心領域に解析が適用されることを意味する。

ここで、画像処置ユニット４２は、取得した各画像の中心領域におけるＸ方向およびＹ方向での画像画素強度の平均二乗差（ＭＳＤ）と、対応する軸方向Ｚ位置でのその値との組み合わせに基づいて、画像の鮮鋭度を評価する。

本開示の範囲内で、ＭＳＤは以下のように定義される。
ＭＳＤ＝（Σ（Ｉ_{ｘ＋ｄ，ｙ}−Ｉ_{ｘ−ｄ，ｙ}）^２＋Σ（Ｉ_{ｘ，ｙ＋ｄ}−Ｉ_{ｘ，ｙ−ｄ}）^２）⁄（２＊Ｍ＊Ｎ）

ここで、Ｉ_ｘ，ｙは、｛ｘ，ｙ｝座標を有する画素の画像強度を表し、Σは、Ｍ×Ｎ画素の中心領域の内側の全てのｘ座標およびｙ座標に対する合計を表し、ｄは横方向距離パラメータを表す。

詳細には、異なる軸方向Ｚ位置での画像鮮鋭度を評価するために、短距離（数画素）に対するＭＳＤ、および長距離（数十画素）に対するＭＳＤをそれぞれ計算する。異なる軸方向Ｚ位置における画像について、短い距離にわたるＭＳＤを比較することにより、画像にとって最良焦点の位置を規定するＭＳＤ最大値を見つけることが可能になる。異なるＺにおける非合焦画像について、長い距離にわたるＭＳＤを比較することにより、それらのうちのどれが焦点により近いかを評価することが可能になる。処置ユニット４２は、両方のＭＳＤに基づいて次のＺ移動に関する決定を下す。現在の軸方向Ｚ位置が焦点から遠すぎる場合は、長い距離にわたるＭＳＤの値から焦点面への方向を見つけることはできない。この場合、発明者らはカメラ１６によって取得された反射光の強度を使用している。処置ユニット４２は、軸方向Ｚ位置の各々における平均画像強度、およびＺに関するその導関数を計算する。制御ユニット４３は、試料ステージを導関数の最小値の方向に移動させ、並行して、処置ユニット４２は取得された画像に対してＭＳＤを計算する。新たに取得された画像に対するＭＳＤと、以前に取得された画像に対するＭＳＤとの比が、いったん所定の閾値レベルよりも大きくなったら、処置ユニット４２は焦点探索のためのＭＳＤの方法に切り替える。本開示において、発明者らは、導関数が最小になる位置は焦点に近い軸方向Ｚ位置の範囲内にあり、その位置はＭＳＤ変動が顕著に現れる位置に対応する、と主張する。発明者らは、異なる種類の試料を用いた実験において、この言明を経験的に確認した。

次の移動に関する決定を下すためには、異なる軸方向Ｚ位置、およびほぼ同じ（解析領域の４分の１未満だけシフトされた）ＸＹ位置における２つ以上の画像が必要である。処置ユニット４２は、取得された画像のＭＳＤおよび平均強度からなるＺプロファイルを解析する。

最大値の位置がプロファイルゾーン内にあることをＭＳＤのＺプロファイルが明確に示している場合、制御ユニット４３は、見つけられたＭＳＤ最大値に対応する軸方向Ｚ位置にＺステージを移動させ、このＺ合焦位置および対応するＸＹ位置を記憶させる。別の場合では、測定範囲内の最低または最高のそれぞれの軸方向Ｚ位置においてＭＳＤプロファイルが最大値を有する場合は、制御ユニット４３はそれぞれ、測定プロファイル範囲の下または上にある別の軸方向Ｚ位置にＺステージを移動させる。Ｚの関数としての画像取得が再開され、ＭＳＤプロファイルは更新される。測定されたプロファイル範囲内に最大値が位置する場合は、Ｚ合焦位置が見つかるまで、減少させたＺ変位を用いて新しいＭＳＤプロファイルの最大値が探索される。制御ユニット４３は、見つけられたＭＳＤ最大値に対応する新しい軸方向Ｚ位置にＺステージを移動させ、このＺ合焦位置および対応するＸＹ位置を記憶させる。

ＭＳＤプロファイルがほぼ平坦な場合は、Ｚ移動の方向を見つけることはできない。この場合、処置ユニット４２は、平均強度のＺプロファイルを解析する。この解析は、平均強度のＺプロファイルを評価するために、それらの間に大きな距離を有する、少なくとも３つの軸方向Ｚ位置での測定を必要とする。制御ユニット４３はＺステージをこれらの軸方向Ｚ位置に移動させ、カメラ１６は対応する画像を取得する。処置ユニット４２は、平均強度の導関数のＺプロファイルの最小値に応じて、ＯＺ軸に沿った移動方向を決定する。制御ユニット４３は、試料ステージをこの方向に移動させ、並行して、処置ユニット４２は取得された画像に対するＭＳＤを計算して、合焦位置を決定する、それらの最大値を見つける。Ｚステージは見つけられた合焦位置に移動される。

取得されたあらゆる画像に対して、処置ユニット４２はＭＳＤおよび平均画像強度を計算し、それらを現在の３Ｄ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）位置と共にデータ記憶ユニット４５内に保存する。ユーザがステージをあるＸ、Ｙ位置に移動させるごとに、制御ユニット４３は記憶された値をチェックし、それらのＸ、Ｙ値の実際の位置からのシフトが中心領域の４分の１のサイズ未満の場合は、それらの値を選択する。異なる測定値に対する、そのような選択された値が合焦位置を規定するのに十分な場合、制御ユニット４３はステージを直接、所定位置に移動させる。そうでない場合は、処理システム４０は欠測データを取得して合焦位置の発見を進める。提案されたアルゴリズムは焦点発見のための賢い有効な手順を提供する。以前に既にスキャンされた関心領域上をナビゲートする場合、最良合焦面が直接選択される。

従って、処理システム４０は、Ｚステージを迅速に移動させること、および、次の潜在的ターゲット候補のＺ値の各々を検出し、最も鮮鋭な平面を選択し、次いでステージを移動させるための１つの方法または方法の組み合わせを用いることによって、様々なＺ軸方向位置においていくつかの画像を取得するので、ユーザは自動的に試料を最良焦点で見ることができる。

このように、鮮鋭ナビゲーション方法は、制御可能なＺ軸方向位置をリアルタイムで調整することにより、画像の中心領域内の試料表面上における自動合焦を可能にする。この自動合焦は、ＸＹステージの移動中および取得された画像のリアルタイム更新中に適用される。また、ユーザは、画像の中心にないＲＯＩを選択し、ドラッグアンドムーブ機能を使用してＲＯＩをカメラの視野の中心に配置し、それにより選択されたＲＯＩ上で自動合焦を実施することができる。

その上、焦点面の選択を高速化し、また焦点面の発見を容易にするために、反射光における画像の平均強度の導関数のＺプロファイルを用いて合焦位置を求めるためのＺ方向が決定される。

最適焦点のＺ軸方向位置の検出は、特に共焦点ホールを使用する場合に、かつ／または試料が粗い、凹凸を有するまたは起伏を有する表面を有する場合に、試料表面上の容易なナビゲーションを可能にする。

この方法は、ユーザが試料上の関心領域（ＲＯＩ）を容易に見つけることを可能にする。この方法はまた、限られた視野を有する対物レンズおよびカメラを使用し、かつ電動式または圧電式のＸＹステージを使用して、試料表面の詳細を視覚化することを可能にする。

一例として、図３は、石膏の鉱物試料の第１の画像７１を表示装置の右隅に示す。石膏試料は、凹凸を有する表面および複雑な表面トポグラフィを有する。図３はまた、同じ石膏試料上のズーム領域の第２の画像７２と、第２の画像７２の視野に対応する領域を示す、第１の画像上に重ね合わせて表示された矩形ボックス７３とを示す。図３はまた、第２の画像の中心にある画素５６の位置を示す。ここに示す第２の画像７２は中心領域に合焦している。しかし、第２の画像７２は、その中心領域の外側の他のＸ、Ｙ位置ではぼやけて見える。図３は、複雑な試料表面上をナビゲートするための鮮鋭ナビゲーション技術の有効性を示している。

第２の画像７２上で、ユーザは、ラマンまたはＰＬ測定のためのＲＯＩに対応する領域７４をグラフィカルに定義することができる。

図３の例は、対物レンズ１１、１２の被写界深度よりも大きいＺ変動を有し、粗く、不規則な、かつでこぼこの表面トポグラフィを有する試料については、試料画像は中心領域でのみ合焦しており、他の部分ではぼやけていることを示し、それにより、ナビゲーションおよびＲＯＩの正確な決定が妨げられ、ならびにＰＬおよび／またはラマン測定のための試料表面へのアクセスが制限される。

従って、視野全体にわたって試料表面を可視化するための、本開示の第３の態様が開発され、方法が提供される。

この第３の態様はビューシャープ（ｖｉｅｗ ｓｈａｒｐ）と呼ばれ、鮮鋭に見ることを意味する。これは、上で詳述したように、鮮鋭ナビゲーションおよびナビゲーションマップと組み合わせて使用される。

このシステムは、コンピュータ制御の電動式または圧電作動式の顕微鏡Ｚステージを使用して、Ｚ軸に沿って変位させ、探査される試料を所望の高さに位置決めする。このシステムはまた、高解像度での迅速な画像取得のためにカメラ１６を使用する。対物レンズ１１または１２のうちの１つを選択して、ユーザ定義のＺ範囲から、広視野の顕微鏡構成で白色光で画像の取得を進める。試料表面のＺ変動に応じて、ユーザはｚ走査範囲を、「短」、「標準」、「広」および「最大」範囲の選択肢から選択する。これらの範囲の最小値、ｚｍｉｎ、および最大値、ｚｍａｘ、ならびに走査ステップ、ΔＺは、選択された対物レンズおよび表面粗さに応じて予め定義される。

制御ユニット４３は、電動式または圧電作動式の顕微鏡Ｚステージを使用して、選択されたＺ範囲内の試料表面を、選択されたΔＺステップを使用して走査する。各Ｚ位置に対して、ビデオカメラ１６は試料の同じＸＹ領域の画像１３１、１３２、１３３、１３４、１３５を取得する。換言すれば、試料の相対的なＸＹ位置は、Ｚ走査中に不変を維持している。図４Ａは、例えば、Ｚ＝１４０μｍの平面で撮影された試料領域の画像１３１を示す。図４Ｂは、Ｚ＝７０μｍの平面で撮影された同じ試料領域の別の画像１３２を示す。図４Ｃは、Ｚ＝０μｍの基準平面で撮影された同じ試料領域の別の画像１３３を示す。図４Ｄは、Ｚ＝−７０μｍの平面で撮影された同じ試料領域の別の画像１３４を示す。また、図４Ｅは、Ｚ＝−１４０μｍの平面で撮影された同じ試料領域の別の画像１３５を示す。

合焦中心領域に対応する基準面または作業面の上および下の複数の軸方向Ｚ位置で取得された画像スタックは、データ記憶ユニット４５内に記憶される。取得された各画像は、合焦領域、および非合焦領域またはぼやけた領域を含む。これら画像のスタックは、視野の内側の全焦点試料表面に関する情報を含み、これら情報は、画素のＺ位置に関する情報を考慮に入れない場合は２Ｄ画像で、または、画素のＺ位置情報を使用して画像のトポグラフィを再現する場合は３Ｄ画像で抽出され提示され得る。画像スタックの形で記憶された画素値は、あらゆるＸ、Ｙ位置に対して列ベクトル形式で表すことができる。Ｘ、Ｙ位置に対応する列ベクトル、すなわちＸ、Ｙ列ベクトルは、同一のＸ、Ｙ位置に対する、画像取得に使用される全てのＺ位置における画素強度値からなる。Ｎ×Ｍ画素によって特徴付けられる視野の場合、取得された画像スタック内の全画素は、Ｎ×Ｍ列ベクトルに整理されるであろう。

画像処置ユニット４２は、取得したあらゆる画像を解析する。従って、試料画像のスタックの取得後に、それらのリアルタイムでの処理が続く。取得された各画像は、任意選択的にノイズおよびアーチファクトを除去するために処理され、次いで、Ｚ方向にラプラシアン演算子を適用することによって鮮鋭化される。各画素値ｌ（ｚ）はｌ（ｚ）＋ｄｌ（ｚ）で置換され、ここで、ｄｌ（ｚ）は画素ビニング領域上で計算された局所微分である。より正確には、ｄｌ（ｚ）は、ｄＩ（ｚ）＝（Ｉ（ｚ）×２−Ｉ（ｚ−１）−Ｉ（ｚ＋１））×係数、と計算され、ここで係数は異なるレベルの鮮鋭度に相当する。この演算は観察された鮮鋭度を増幅して最大鮮鋭度の発見を容易にする。ラプラシアン演算子の数学的表現に応じて、強度値の行列Ｉ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）によって表される取得された画像を異なるレベルに鮮鋭化することが可能である。鮮鋭化された画素値を最後のＶｉｅｗＳｈａｒｐ画像再構成に使用することは可能である。

画像処置ユニット４２は鮮鋭度検出を改善するために全ての画像に画素ビニングを適用する。画素ビニング領域、例えば３×３画素または５×５画素はＭＳＤ値を計算するために使用される。得られたＭＳＤ値は、対応するＺ位置の対応するＸ、Ｙ列ベクトルに割り当てられる。そのようにして計算された列ベクトルはＸ、Ｙ ＭＳＤ Ｚプロファイルを表す。ＭＳＤ Ｚプロファイルは、その第１および第２の最大値について解析され、信頼水準基準に基づいて、見つけられた第１の最大値が選択されるか、または選択されない。処置ユニット４２は、見つけられた第１の最大値の各々について信頼値を計算する。ここではＣＶ（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）と呼ばれる信頼値は、第２のＭＳＤ最大値と平均ＭＳＤ値の合計に対する第１のＭＳＤ最大値の比によって定義される。

実験によって得られるデータに基づき、２（低）、３（中）、および４（高）に等しい信頼水準（ＣＬ：ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌ）を導入する。最大の選択基準は次のように定義される。計算されたＣＶがＣＬよりも高い場合、処置ユニット（４２）は最大値を選択する。低い信頼水準を選択すると、ＭＳＤ最大値のノイズとフォールスポジティブ信号をもたらす可能性がある。対照的に、非常に高い信頼水準を選択すると、いかなるＭＳＤ最大値の検出にも失敗する可能性がある。凹凸を有し、明るく、かつ均一に照らされた表面の場合は、鮮鋭度の最大値を見つけ、全視野の鮮鋭な画像を再構成するためには、低または中の信頼水準で十分であろう。滑らかな、または照度が劣る表面の場合は、処置ユニット４２は高水準の信頼度を使用し、ＣＶはＣＬを克服するには十分に高くない場合がある。この場合、補間法を使用して、同じ高い信頼水準に対して見つけられた隣接Ｘ、Ｙの最大ＭＳＤ値を使用してＭＳＤ値が決定される。

最大鮮鋭度の選択のための基準の定義は、試料表面決定の精度に影響を与えるので重要である。基準はまた、ＶｉｅｗＳｈａｒｐ手順の実行に必要な時間を定義する。この基準は、効率的な手順の実行のために使われるコンピュータのメモリおよびプロセッサリソースを実際に定義する。

処置ユニット４２は、鮮鋭度最大値を表すＭＳＤ最大値の実測値に対して後処理を施す。任意選択で、アーチファクトＭＳＤ値を削除するためにスムージングが適用される。見つけられたあらゆるＭＳＤ最大値に対して、処置ユニット４２は対応するＸ、Ｙ、Ｚ座標および強度値を取り込む。得られた座標は、試料表面トポグラフィＺ（Ｘ，Ｙ）を提示するために使用され得る。制御システム４０が試料表面を走査するのにΔＺステップを使用しているので、取り込まれたＺ位置の値はＺ軸に沿って間隔を開けており、それにより試料トポグラフィ画像上にテラスが形成される。実表面に接近するために、ＯＺ方向における最近隣のＭＳＤ値の解析に基づいて、ＯＺ軸に沿った補間ステップが適用される。いったんＺ軸に沿った補間が行われると、連続的な試料トポグラフィが得られる。得られた試料表面トポグラフィ画像は、鮮鋭度計算手順中の画素ビニング操作によって、ＸおよびＹ方向に縮小される。得られた試料トポグラフィ画像を高い空間分解能で元のサイズに復元するために、処置ユニット４２は、ＸおよびＹ方向に沿って別の補間手順を適用して、元の画素位置に対応する全てのＺ値を復元する。処置ユニット４２は全焦点表面トポグラフィ画像を提供し、ここで新しい画像は元の画像と同じ画素数を有する。このようにして得られたＸ、Ｙ、Ｚ値を用いて全焦点強度２Ｄおよび３Ｄ試料表面画像が構築され、ここで新たな画素強度値はそれぞれ、見つけられた最大鮮鋭度の強度値、または補間された中間強度値に対応する。

得られたＸ、Ｙ、Ｚおよび対応する強度値は記憶ユニットによって記憶される。試料表面の表面トポグラフィまたはＺマップはユニット４５によってメモリに記憶され、表示ユニット４４によって視覚化される。全焦点２Ｄおよび３Ｄ試料表面強度画像はユニット４５によってメモリに記憶され、表示ユニット４４によって視覚化される。図４Ｆは、そのような２Ｄ再構成画像１４１の一例を示す。再構成画像１４１は全視野にわたって鮮鋭に見える。この再構成画像１４１は、表示装置４４上に表示された第１の画像７１を少なくとも部分的に置換し、および／または第２の画像７２を置換し得る。再構成画像１４１は、粗い表面テクスチャおよび／または平坦でない表面トポグラフィを有する試料表面上での容易なナビゲーションを可能とする。再構成画像１４１はまた、ナビゲーションマップ内の第１の画像の少なくとも一部を更新するために使用され得る。従って、再構成画像により、試料表面の詳細を視覚化し、ラマンまたはＰＬ測定のためのＲＯＩをより正確に決定することが可能となる。

図５は、他の試料の２Ｄ全焦点表面強度画像の一例を示す。示された画像はカメラ１６の視野に対応する。全ての画像表面を鮮鋭に見ることができる。ぼやけた非合焦の画像領域は全て、鮮鋭な合焦画像領域に置換されている。図６は、同じ試料についての再構成された表面トポグラフィ画像を示す。試料表面トポグラフィ画像は、試料の全般的な像を与え、よって表面の詳細を視覚化すること、および方法の性能を全般的に評価する役割を担うことができる。

図７は、２Ｄ全焦点表面強度画像の他の例を示す。Ｚの変動が対物レンズの視野の何倍にもなる試料表面の非常に鮮鋭な画像を見ることができる。図８は、取り込まれた表面合焦Ｚ位置に基づく、対応する３Ｄ画像表面強度プロファイルを示す。この画像は表面起伏の詳細を表し、３Ｄ空間でＲＯＩを正確に選択することを可能にする。選択されたＲＯＩは、あらゆる選択された画素においてラマンまたはＰＬスペクトルを取得するために使用される。従って、高い水平方向および軸方向分解能を有するラマンまたはＰＬ分光測定が得られる。ラマンまたはＰＬスペクトルは、分光計５５およびＣＣＤカメラ６０を用いて取得される。

ラマンまたはＰＬマッピングは、見つけられたＺ値を使用してＲＯＩの画素ごとに走査することによって行われ、よって、あらゆる画素からのスペクトルが共焦点で取得される。代替として、スペクトルの最大値または積分値を画像鮮鋭化のための画素値として使用することができる。実際、励起レーザ光が試料の中に侵入しない場合は、白色光反射の代わりに、コントラスト値または強度値を用いたラマン応答を使用して、全焦点画像再構成を行うことができる。

図９は、上記の開示に従って処理された鮮鋭化された画像の別の例を示す。本明細書に開示されているＶｉｅｗＳｈａｒｐ法を使用して３Ｄ表面プロファイルを生成するために、白色光反射強度が使用されている。図１０は、トポグラフィマップから決定された合焦Ｚ軸方向位置において点ごとに測定された対応するラマンマッピングを示す。ラマンスペクトルマップは優れた空間分解能を有することが観察される。図９と図１０との比較から、化学組成についての追加の情報を与えるラマンまたはＰＬ測定を考慮すると、トポグラフィによって明白に示される形態的フィーチャを解析することが可能になる。

Claims (14)

1. 分析対象の試料を保持するための試料ホルダ、および光軸（ＯＺ）を画定する少なくとも１つの顕微鏡対物レンズ（１１、１２）を備える光学顕微鏡（１０）と、
   励起光ビームを生成するように適合された光源（５１）、分光計（５５）、および検出システム（６０）を備える分光システム（５０）と、
   前記少なくとも１つの顕微鏡対物レンズ（１１、１２）を通して前記励起光ビームを前記試料上に導き、前記試料上で前記励起光ビームの散乱によって生成されたラマンまたはフォトルミネッセンス光ビームを収集するように適合された光学システム（１４）であって、前記ラマンまたはフォトルミネッセンス光ビームを前記分光計（５５）および前記検出システム（６０）に向けて導くように適合された、光学システム（１４）と、
   前記試料ホルダと前記少なくとも１つの顕微鏡対物レンズ（１１、１２）との間の相対的な横方向（ｄＸ，ｄＹ）および／または軸方向（ｄＺ）の移動を駆動するための作動システム（２０）と、を備える光学顕微分光システムにおいて、
   前記光学顕微分光システムは、
   照明ビームを生成するための別の光源（１８）と、
   前記少なくとも１つの顕微鏡対物レンズ（１１、１２）と組み合わせて配置され、前記試料の第１の画像（７１）を取得し、前記試料の第２の画像（７２）を取得するように構成された画像化システム（１６、４１）であって、前記第１の画像（７１）および前記第２の画像（７２）は試料表面からの前記照明ビームの反射または透過によって形成されており、前記第１の画像（７１）は大視野を有し、前記第２の画像（７２）は小視野を有する、画像化システム（１６、４１）と、
   前記第２の画像（７２）の前記小視野に対応する前記第１の画像（７１）の座標系における領域を決定するように構成された処理システム（４０）と、
   前記第１の画像（７１）および前記第２の画像（７２）を表示し、前記領域のグラフィック表現（７３）を前記第１の画像（７１）上に重ねて表示するように構成された表示システム（４４）と、
   前記第１の画像および／または前記第２の画像内の関心領域を選択するように構成されたユーザインタフェースと、を備え、
   前記作動システム（２０）は前記励起光ビームを受けるように前記関心領域を位置決めするように構成されており、
   前記分光システム（５０）は、前記関心領域から生成されたラマンまたはフォトルミネッセンス信号を取得するように構成されていることを特徴とする、
   光学顕微分光システム。
2. 前記画像化システム（１６、４１）は前記第２の画像（７２）をリアルタイムで取得するように適合され、前記処理システム（４０）は前記第２の画像（７２）に対応する前記領域をリアルタイムで更新するように適合され、前記表示システム（４４）は前記第２の画像（７２）をリアルタイムで表示し、前記更新された領域の前記グラフィック表現（７３）をリアルタイムで表示するように適合された、請求項１に記載の光学顕微分光システム。
3. 前記ユーザインタフェースは、一体型コンピュータマウス、トラックボール、ジョイスティック、タッチパッドおよび／またはタッチスクリーンを備え、前記ユーザインタフェースは、ドラッグアンドムーブ操作を用いて、それぞれ前記第１の画像（７１）または前記第２の画像（７２）とインタラクトし、それにより、それぞれ前記第１の画像（７１）内の前記大視野または前記第２の画像（７２）内の前記小視野を、定められた水平変位量だけ移動させるように適合され、前記作動システム（２０）は、それぞれ前記第１の画像（７１）内のまたは前記第２の画像（７２）内の前記定められた水平変位量に比例した相対水平運動（ｄＸ，ｄＹ）を駆動するように適合された、請求項２に記載の光学顕微分光システム。
4. 前記作動システム（２０）は、前記少なくとも１つの顕微鏡対物レンズの軸方向位置（Ｚ）を、前記光軸（ＯＺ）に沿って前記試料ホルダに対して変更するように構成された駆動ユニットを備え、
   前記画像化システム（１６）は、前記光軸（ＯＺ）に沿った複数の軸方向位置（Ｚ）において前記試料の複数の画像を取得するように構成され、
   前記処理システム（４０）は、前記複数の画像の各画像に対する中心領域内の隣接する画素強度の平均二乗差（ＭＳＤ）を計算し、前記平均二乗差から前記複数の画像のうちの各々の前記中心領域についての画像鮮鋭度を評価するように構成され、前記処理システム（４０）は、前記画像鮮鋭度から前記中心領域上の合焦位置を推定するように構成され、
   前記画像化システム（１６）は、前記第１の画像（７１）、および／または前記中心領域上の前記合焦位置における前記第２の画像（７２）を取得するように構成されている、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の光学顕微分光システム。
5. 前記中心領域上の前記合焦位置は、前記複数の画像の各々についての平均二乗差（ＭＳＤ）値と、前記平均二乗差値のプロファイルとを、前記複数の軸方向位置（Ｚ）の関数として算出することによって決定され、前記中心領域上の前記合焦位置は、前記平均二乗差値の前記プロファイルの最大値を算出することによって決定される、請求項４に記載の光学顕微分光システム。
6. 前記画像鮮鋭度は、前記複数の画像の各々について中心領域における平均強度導関数と平均強度プロファイル導関数とを、前記複数の軸方向Ｚ位置の関数として算出することによって評価され、合焦近傍位置範囲が、前記平均強度プロファイル導関数の最大値に向かう、軸方向（ＯＺ）の変位によって決定される、請求項４または５に記載の光学顕微分光システム。
7. 前記処理システム（４０）は、前記試料の前記複数の画像に対して、複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）を前記光軸（ＯＺ）に沿った前記複数の軸方向位置（Ｚ）の関数として決定するように構成され、
   前記処理システム（４０）は、前記複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）の各々および関連する信頼水準の値に対して、勾配または一次導関数プロファイルまたは二次導関数プロファイルのそれぞれ、平均二乗差または変動量を使用して、鮮鋭度プロファイルまたはコントラストプロファイルを評価するように構成され、
   前記処理システム（４０）は、前記関連する信頼水準値を用いて、前記画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）の各々について前記鮮鋭度プロファイルまたはコントラストプロファイルを解析し、そこから前記複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）の各々について合焦位置を推定するように構成され、
   前記処理システム（４０）は、前記複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）の各々について前記合焦位置の３次元座標および対応する画素強度を決定し、前記試料表面を３次元で表す試料トポグラフィ画像を構築するように構成されている、
   請求項４〜６のいずれか一項に記載の光学顕微分光システム。
8. 光学顕微鏡の試料ステージの現在位置を決定するステップと、
   前記試料ステージ上に配置された試料に向けて照明光ビームを生成するステップと、
   前記光学顕微鏡（１０）上の顕微鏡対物レンズ（１１、１２）を選択するステップと、
   試料表面からの前記照明光ビームの反射または透過によって前記光学顕微鏡（１０）を通して形成された第１の画像（７１）を取得するステップであって、前記第１の画像（７１）は大視野を有する、ステップと、
   前記第１の画像（７１）をデータ記憶装置（４５）に記憶させるステップと、
   前記第１の画像（７１）を表示システム（４４）上に表示するステップと、
   前記試料表面からの前記照明ビームの反射または透過によって前記光学顕微鏡（１０）を通して形成された第２の画像（７２）を取得するステップであって、前記第２の画像（７２）は小視野を有する、ステップと、
   前記第２の画像（７２）を前記表示システム（４４）上に表示するステップと、
   前記第２の画像（７２）の前記小視野に対応する前記第１の画像（７１）の座標系における領域を決定するステップと、
   前記領域のグラフィック表現（７３）を前記第１の画像（７１）上に表示するステップと、
   前記表示システム（４４）上に表示された前記第１の画像（７１）内および／または前記第２の画像（７２）内の関心領域を選択するステップと、
   前記顕微鏡を通して励起光ビームを前記試料の前記関心領域上に導くように前記試料を位置決めし、前記試料の前記関心領域上で前記励起光ビームの散乱によって生成されたラマンまたはフォトルミネッセンス光ビームを収集するステップと、
   分光計システム（５５、６０）を使用してラマンまたはフォトルミネッセンス信号を取得するステップと、
   を含む顕微分光測定方法。
9. 前記光学顕微鏡に対する前記試料ホルダの複数の相対的軸方向（Ｚ）位置において、前記試料の複数の画像を取得するために顕微鏡対物レンズを使用するステップであって、前記相対的軸方向（Ｚ）位置は前記顕微鏡対物レンズの光軸（ＯＺ）に沿って取られている、ステップと、
   前記複数の画像の各画像について中心領域内の鮮鋭度を評価するステップと、
   前記複数の軸方向Ｚ位置について評価された前記鮮鋭度から前記中心領域内の合焦位置を推定するステップと、
   前記試料を前記中心領域内の前記合焦位置に配置するステップと、を更に含み、
   前記第１の画像（７１）および／または前記第２の画像（７２）を取得する前記ステップは前記合焦位置で行われる、
   請求項８に記載の顕微分光測定方法。
10. 前記複数の画像のそれぞれについて前記中心領域内の平均強度導関数を算出するステップと、前記複数の軸方向Ｚ位置の関数として平均強度導関数プロファイルを決定するステップと、前記試料ホルダを前記平均強度導関数プロファイルの最小の方向に変位させ、合焦近傍位置範囲を決定するステップと、を更に含む、請求項９に記載の顕微分光測定方法。
11. 鮮鋭度を評価する前記ステップは、前記複数の軸方向Ｚ位置の関数として、前記複数の画像の各々についての前記中心領域における平均強度差値から、および平均二乗差（ＭＳＤ）プロファイルから推定され、前記合焦位置は、前記平均二乗差値プロファイルの最大値を算出することによって決定される、請求項９または１０に記載の顕微分光測定方法。
12. 鮮鋭度を評価する前記ステップは、前記複数の画像の各々の中心領域における画像勾配を算出すること、および画像勾配プロファイルを前記複数の軸方向Ｚ位置の関数として算出することから推定され、前記合焦位置は、前記画像勾配プロファイルの最大値を算出することによって決定される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の顕微分光測定方法。
13. 前記試料の前記複数の画像に対して、複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）を、前記光軸（ＯＺ）に沿った前記複数の軸方向位置（Ｚ）の関数として決定するステップと、
    前記複数の画素列ベクトル（Ｐｘ，Ｐｙ）の各々について、平均二乗偏差、変動、勾配、一次導関数プロファイルまたは二次導関数プロファイルのそれぞれ、および関連する信頼水準値を使用して、鮮鋭度プロファイルまたはコントラストプロファイルを評価するステップと、
    前記複数の画素列ベクトルの各々に対して、前記関連する信頼水準値を用いて前記鮮鋭度プロファイルまたはコントラストプロファイルを解析して、そこから前記複数の画素列ベクトルの各々に対して合焦位置を推定するステップと、
    前記合焦位置の３次元座標および対応する画素強度を抽出するステップと、
    前記合焦位置の３次元座標および対応する画素強度を前記記憶ユニット４５内に保存するステップと、
    前記合焦位置の３次元座標、および対応する画素強度を使用して、試料トポグラフィ画像Ｚ（Ｘ，Ｙ）、および／または３次元試料表面画像を構築するステップと、を更に含む、
    請求項９〜１２のいずれか一項に記載の顕微分光測定方法。
14. ラマンまたはＰＬ測定のための前記関心領域は、矩形領域、円盤状領域、ユーザ指定領域、線、ランダムに選択された点のセット、およびユーザ指定点のセット、の中から選択される、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の顕微分光測定方法。