JP2020500525A

JP2020500525A - 対合が改善されたｔ細胞受容体ｔ細胞

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Publication number: JP2020500525A
Application number: JP2019529260A
Authority: JP
Inventors: バンク，ゼバスティアン; マウラー，ドミニク; フリッチェ，イェンス; ワーグナー，クラウディア; アルテン，レオニー; ホフガード，フランツィスカ; フェルベール，マティアス
Original assignee: イマティクスバイオテクノロジーズゲーエムベーハー
Priority date: 2016-12-08
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2020-01-16
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: BR112019010803A2; US20210380659A1; CR20190280A; EP3551653A1; CN110099923A; US11072645B2; MX2019006726A; AU2017371260C1; JP7346294B2; WO2018104407A1; US20180162922A1; DE102016123893A1; EP3551653B1; PE20191150A1; AU2017371260A1; CA3045230A1; AU2017371260B2; MA47359A; TWI710572B; TW201827460A

Abstract

本発明は、修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αもしくはβ鎖、または同鎖を含んでなるヘテロ二量体に関し、前記修飾αもしくはβ鎖の可変ドメインにおいて、ＩＭＧＴ番号による４４位のアミノ酸は、所望の鎖の対合を改善するために別の適切なアミノ酸によって置換されている。

Description

本発明は、修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖もしくはβ鎖、または同鎖を含んでなるヘテロ二量体に関し、前記修飾α鎖もしくはβ鎖の可変ドメインにおいて、ＩＭＧＴ番号による４４位のアミノ酸は、所望の鎖の対合を改善するために別の適切なアミノ酸で置換されている。

適応免疫系は、抗体、Ｂ細胞、ならびにＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞からなる。これらは、特定の免疫原性標的に対する非常に特異的な応答を可能にする。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の表面のインバリアントＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される高度に可変性のアルファ（α）およびベ−タ（β）鎖から通常なる、ジスルフィド結合膜固定型ヘテロ二量体タンパク質である。ＴＣＲヘテロ二量体を形成するプロセスにおける重要なステップは、「対合」と称される。対合受容体を発現するＴ細胞はα：β（またはαβ）Ｔ細胞と称されるが、少数のＴ細胞は可変ガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖によって形成される代替の受容体を発現し、γδＴ細胞と称される。

ＴＣＲはＴ細胞の表面に位置し、抗原受容体分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によってＴ細胞に提示される適切にプロセスされた抗原の認識に関与するので、Ｔ細胞の活性化および抗原に対する免疫応答を潜在的にもたらす。

ＴＣＲの各鎖は、どちらも免疫グロブリンス−パ−ファミリ−（ＩｇＳＦ）ドメイン形成逆平行βシ−トに属する、可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域の２つの細胞外ドメインから構成される。定常領域は細胞膜に近接し、膜貫通領域および短い細胞質尾部がそれに続く一方、可変領域は、抗原提示細胞のペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。

ＴＣＲα鎖およびβ鎖の双方の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）をそれぞれ有する。β鎖の可変領域は、いわゆる超可変性（ＨＶ４）のさらなる領域を有し、それは通常、抗原と接触せず、したがってＣＤＲとは見なされない。重要なことには、双方の鎖のＣＤＲ１および２が生殖系列コ−ドされる一方で、ＣＤＲ３αおよびβは大部分がテンプレ−トコ−ド化されておらず、体細胞組換えによって産生される（Ｄａｖｉｓ＆Ｂｊｏｒｋｍａｎ１９８８）。ヒトでは、ＴＣＲ分子の多様性は、４７のＶαおよび５４のＶβ配列からなるセットのαβ対合によって達成され、それらはＣＤＲ３の長さおよび配列の最終的な多様性を達成するために組み合わされる。

ＣＤＲ３は前記プロセスされた抗原の認識に関与する主要ＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１が、抗原性ペプチド（Ｃｏｌｅｅｔａｌ．２００９）のＮ末端部分と相互作用することが示されているのに対し、β鎖のＣＤＲ１は、時折ペプチドＣ末端部分とのみ相互作用する。

ＣＤＲ２は、主にＭＨＣを認識すると考えられてる。β鎖のＨＶ４領域は抗原認識に関与するとは考えられていないが、いわゆる超抗原と相互作用することが示されている（Ｌｉｅｔａｌ．１９９８）。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２が主にＭＨＣに結合し、ＣＤＲ３が抗原性ペプチドに結合するという一般的に認められているパラダイムにもかかわらず、いくつかの研究は、全てのＣＤＲ領域が時折、抗原およびＭＨＣの双方と相互作用し得ることを示すことによって、ＴＣＲによる抗原認識の真の複雑さを明らかにした（Ｂｕｒｒｏｗｓｅｔａｌ．２０１０、Ｒｏｏｍｐｅｔａｌ．２０１１）。

養子免疫伝達アプロ−チは、がん治療の機序を用いるために開発され（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．１９８８）、それによって腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖およびβ鎖をコ−ドする遺伝子で形質導入されたＴ細胞が、患者において抗腫瘍免疫を媒介する。近年、このアプロ−チが注目を集めている。１つのストラテジ−として、ＴＣＲ遺伝子治療は、遺伝子組換えＴＣＲ鎖で遺伝子操作された自己由来Ｔ細胞を患者に提供する。この技術は、がんおよび腫瘍の治療のための有望なアプロ−チを提供する。そうするために、特異的抗原−ＭＨＣ複合体を検出／結合するＴＣＲα鎖およびβ鎖が、患者から採取された野生型Ｔ細胞にクロ−ン化される。次に、遺伝子組換えＴ細胞が生体外で増殖され、例えば、腫瘍に対する免疫応答を提供するために、増殖した細胞が患者に戻される。

実質的に、このようにして生成された導入遺伝子Ｔ細胞は、野生型α鎖およびβ鎖を有する野生型ＴＣＲと、それぞれの組換え抗原−ＭＨＣ複合体に特異的なα鎖およびβ鎖を有する遺伝子組換えＴＣＲの双方を発現する。野生型α鎖およびβ鎖ならびに遺伝子組換えα鎖およびβ鎖はどちらも、通常は、依然として互いに対合できる（Ｓｈａｏｅｔａｌ．２０１０）。この望まれない可能性は「ＴＣＲ誤対合」と称され、ＴＣＲ（遺伝子）療法の分野において認識されている問題である。

遺伝子組換えＴＣＲα鎖またはβ鎖と内在性ＴＣＲβ鎖またはα鎖との間の誤対合および不正確な対合はそれぞれ、遺伝子組換えＴＣＲαβヘテロ二量体の表面発現の低下をもたらし、それは次に修飾Ｔ細胞の機能的結合活性を低下させる。さらに、誤対合ＴＣＲを発現し高ＩＬ−２条件下で増殖したＴ細胞は、前臨床モデルにおいて、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を誘発することが実証された（Ｂｅｎｄｌｅｅｔａｌ，２００９）。

治療用Ｔ細胞の機能的結合活性を増強するために、遺伝子組換えＴＣＲαおよびβ対合を最適化するためのいくつかのストラテジ−が、例えば、Ｇｏｖｅｒｓｅｔａｌ．（２０１０）などで論じられている。

誤対合を回避するためのこれらの可能性には、次のものがある。
１．マウス化ＴＣＲ：このアプロ−チでは、ヒトＴＣＲαおよびβ定常鎖が、対応するマウスドメインによって置換される。ヒトおよびマウスのＴＣＲ−Ｃドメインは高度な相同性を示すが、わずかな相違が、ＴＣＲ／ＣＤ３相互作用の安定性、したがってＴＣＲ表面発現レベルに影響を及ぼす。
２．システイン修飾ＴＣＲ：このアプロ−チは、構造的に好ましい位置にシステインアミノ酸を導入し、それ故、さらなるジスルフィド架橋の形成を可能にして、２つのＴＣＲ鎖間の正しい対合を促進する。ＴＣＲα定常鎖におけるＴ４８ＣおよびＴＣＲβ定常鎖におけるＳ５７Ｃなどの部位特異的変異は、２つの鎖間結合によって連結されたＴＣＲヘテロ二量体をもたらした（すなわち導入されたジスルフィド架橋と内在性膜貫通ジスルフィド架橋（α定常ドメインの９５位およびβ定常ドメインの１３１位）。
３．ドメイン交換：定常ドメインを腫瘍特異的Ｔ細胞受容体のα鎖とβ鎖との間で交換し、ドメイン交換（ｄｓ）ＴＣＲを作り出す。正しく対合した場合、これらのｄｓＴＣＲ鎖は、ＣＤ３タンパク質を動員してＴ細胞表面上で発現して標的抗原との係合時に機能的Ｔ細胞応答を媒介するのに必要である、全てのドメインを保持する。対照的に、１本のｄｓＴＣＲ鎖と１本の野生型ＴＣＲ鎖を含有する誤対合ＴＣＲは、ＣＤ３の動員、搬出、およびシグナル伝達に必要な重要なドメインを欠いており、したがって有害な自己免疫を媒介できない。
４．排他的ＴＣＲヘテロ二量体：このアプロ−チでは、立体力と静電気力を利用してＴＣＲαおよびβ導入遺伝子間の正しい対合を容易にし、同時に、外在性および内在性のＴＣＲα鎖およびβ鎖間のペアリングを阻害する。一例では、必要な静電荷の変化を得るために、部位特異的変異を用いてＳ８５Ｒがα定常ドメインに、Ｒ８８Ｇがβ定常ドメインに導入され、したがって相互の「ノブ−イン−ホ−ル」配置が生成し、これは二次および三次構造を最小限に歪ませるとされる。
５．各ＴＣＲ鎖がＣＤ３ζ分子に融合している、キメラＴＣＲ−ＣＤ３ζ鎖の使用。
６．規定のＴＣＲのＶαが、可撓性のペプチドリンカ−を使用してβ鎖に融合している、一本鎖ＴＣＲの使用。
７．内在性ＴＣＲの発現をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ配列またはジンクフィンガ−ヌクレア−ゼの使用。

別のアプロ−チがＯ’Ｓｈｅａｅｔａｌ．（１９９３）によって提案され、彼らは「ベルクロ」と称される一対のペプチドを設計し、それらは、ヘテロ二量体状態における好ましい静電相互作用のために、互いに対合できた。著者らは、２つのペプチドが単離形態では主に折り畳まれていないが、混合されると優先的に会合し、安定な平行コイルドコイルヘテロ二量体を形成することを実証した。このアプロ−チはまた、Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．（１９９４）によって可溶性ＴＣＲを生成するために適用され、その中では、ペプチドをそれぞれ切断型α鎖およびβ鎖に融合させることで、ヘテロ二量体複合体が支持された。

国際公開第２０１４／１５３４７０Ａ２号パンフレットは、ヌクレア−ゼ（ジンクフィンガ−ヌクレア−ゼまたはＴＡＬヌクレア−ゼ）を使用して、標的指向性中断によってＴＣＲ遺伝子を修飾する、ＴＣＲ遺伝子を修正するための方法および組成物を開示する。

国際公開第２０１４／０８３１７３号パンフレットは、免疫療法、特に養子Ｔ細胞移入における有害事象のリスクを低減させる、新規Ｔ細胞受容体を製造する方法に関する。

国際公開第２０１６／０７１３４３Ａ１号パンフレットは、修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、特にＴリンパ球を移入するための養子細胞療法（ＡＣＴ）におけるそれらの使用とに関する。ＴＣＲはα鎖およびβ鎖の膜貫通領域において変異され、変異は正しいＴＣＲ鎖対合に有利である。

上記アプロ−チは有望ではあるが、外在性ＴＣＲの適切な発現をはじめとするいくつかのハ−ドルが、それらの臨床的影響を妨げている。不十分な臨床的奏効は、数多くの問題が未だに解決されていないことを示す。Ｔ細胞機能的結合活性は、主にＴＣＲ親和性および発現されるＴＣＲ分子数の双方によって決定されるので、（ａ）ＴＣＲ親和性の改善、および（ｂ）ＴＣＲ発現の増強の２つの重要なアプロ−チを用いて、ＴＣＲ操作細胞におけるこれらの生物物理学的性質を改善するための多大な努力が払われている。ＴＣＲ親和性を改善するために、高親和性受容体を選択すること、または点変異によって転移受容体の親和性を高めることが試みられてきた。代案としては、形質導入細胞の表面上のＴＣＲの数を増やすために、様々なアプロ−チが考案されている。これらとしては、発現ベクタ−の操作、コドン最適化ＴＣＲ配列の使用、グリコシル化部位の排除、および導入されたＴＣＲ鎖の対合の改善が挙げられる。

したがって、ＴＣＲの誤対合を効果的に回避するためのアプロ−チを提供する必要が依然としてある。

これらのさらなるアプロ−チは、正しく対合したＴＣＲヘテロ二量体、すなわち遺伝子組換えα鎖およびβ鎖の対のそれぞれ修飾されたＴ細胞中の存在量を増加させる一方で、導入が容易であるべきで、誤対合ＴＣＲヘテロ二量体の発生を効率的に低下させるべきである。また、ＴＣＲ鎖および宿主Ｔ細胞の最小限の操作を必要とする方法論が望ましいであろう。

これらの目的およびさらなる目的は、本発明による方法および手段によって解決される。

本発明の第１の態様によれば、抗原−ＭＨＣ複合体に結合する能力を維持する、修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖もしくはβ鎖、またはその断片もしくは誘導体が提供され、その中では、前記修飾α鎖またはβ鎖の可変ドメインにおいて、ＩＭＧＴ番号付けによる４４位のＱまたは任意のその他のアミノ酸が、その他の適切なアミノ酸で置換されている。以下にも示されるように、適切なアミノ酸は、修飾されたＴＣＲα鎖およびβ鎖の対合特異性を維持しながら、例えば、非修飾鎖などの望まれないα鎖またはβ鎖との対合を減少させる。

４４位はＦＲ２領域に位置するので、それはＴＣＲ結合部位の標的と直接接触しないことが知られている。したがって、４４位における置換は、特定の標的エピト−プ認識にとって決定的に重要でなく、および／またはそれを妨害しないと想定される。

本発明によるアミノ酸は、生物において使用される２０種のα−アミノ酸（Ｌ−アミノ酸）から選択され得る。「適切な」アミノ酸は、これらのアミノ酸（すなわち生物において使用される２０種のα−アミノ酸およびＬ−アミノ酸）、ならびに「珍しい」アミノ酸（例えばｓ−アミノ酸、もしくはＤ−アミノ酸）または修飾アミノ酸の双方を含むものとする。生物において使用される２０種のα−アミノ酸が好ましい。

ＴＣＲα鎖およびβ鎖中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．（２００１）で開示されるようなＩＭＧＴ規格に従う。ＩＭＧＴ規格は、ＴＣＲαおよびβ可変鎖をはじめとする免疫グロブリン分子中のアミノ酸残基に、明白な数を割り当てるための一般的な規則体系である。ＩＭＧＴ番号付け（太字）とＫａｂａｔ番号付けの比較については、図１Ａ〜Ｃを参照されたい。図１Ｂでは、α鎖（ＴＲＡＶ）およびβ鎖（ＴＲＢＶ）中のＱ４４が、灰色で標識されている。ＩＭＧＴ規格による番号付けは、図１Ａ〜Ｃに見られるように、特にＣＤＲ配列中の空白のために、ＴＣＲ可変ドメインの所与のアミノ酸配列の単純な番号付けから逸脱することがある。

ＩＭＧＴ番号付けによるＱ４４は、フレームワーク２（ＦＲ２）領域における高度に保存された残基であり、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２９／ＤＶ５、およびＴＲＡＶ４０を除くほぼ全てのＴＣＲα鎖によって共有され、ＴＲＢＶ１４Ｑ４４を除く全てのＴＣＲβ遺伝子によって共有される（Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ，２００１、Ｓｔｒｏｎｇｅｔａｌ．，１９９９）。さらに、Ｑ４４はＷＹＸＱを含んでなる４ＡＡモチ−フの一部であることが非常に多く、Ｘは例えば、Ｒ、Ｖ、ＫまたはＱである（Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ，２００１）。

Ｋｎｉｅｓｅｔａｌ．（２０１６）は、バルク内在性ＴＣＲα／β−陽性Ｔ細胞のための安全な養子免疫療法を達成するために、最適化された一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）が残りのＴＣＲ誤対合を阻害することを記述する。３ドメインｓｃＴＣＲにおいて、Ｖαドメインと、Ｖβに近接したリンカ−の３’−尾部との間に設計された新規人工ジスルフィド結合によって、残りの誤対合の防止が達成された。

Ｈｏｆｆｍａｎｎｅｔａｌ．（２０１５）は、Ｖα／Ｖβ相対角度および可撓性に焦点を合わせた、結合および非結合ＴＣＲ分子の構造特性の系統的バイオインフォマティクス解析を記述する。いくつかの異なるＶα／Ｖβ角度に基づく構造クラスタ−が観察され得て、結合ＴＣＲよりも非結合ＴＣＲに対してより大きい角度柔軟性が存在することから、彼らの結果は、シグナル伝達に対するこの角度の重要性を実証した。特有の回転中心が同定され、この点周辺のコア領域は、ＶαドメインとＶβドメインとの間の中心に位置し、ＶαおよびＶβ双方の４４位に非常に近い。

本発明の文脈における置換は、例えば、コ−ドＤＮＡもしくはｃＤＮＡの部位特異的変異誘発もしくはランダム変異誘発、またはＣＲＩＳＰＲＣａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、アルゴノ−ト（ＮｇＡｇｏ）またはＣＲＩＳＰＲＣｐｆ１のようなゲノム編集技術のような、タンパク質変異誘発の標準法を用いて生成され得る。さらに、このような置換は、コ−ド遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを単に合成することによって行われ得る。現今では、サ−ビス提供会社が、所与の配列の核酸の合成を提供している。

部位特異的アミノ酸置換をもたらす、ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発の方法は当業者に周知であり、例えば、Ｌａｂｒｏｕｅｔａｌ．（２０１０）およびＴｒｅｈａｎｅｔａｌ．（２０１６）で開示されている。

所与のアミノ酸配列を修飾するためのゲノム編集の方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲＣａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、アルゴノ−ト（ＮｇＡｇｏ）またはＣＲＩＳＰＲＣｐｆ１）は当業者に周知であり、例えば、Ｍａｅｄｅｒ＆Ｇｅｒｓｂａｃｈ（２０１６）で開示されている。遺伝子の合成法は当業者に周知であり、例えば、Ｈｕｇｈｅｓｅｔａｌ．（２０１１）で開示されている。これらの参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に援用されると見なされるものとする。

上で考察されるように、いくつかの先行技術の方法は、マウス定常鎖を導入することによる、ＴＣＲα鎖および／またはβ鎖の修飾を示唆している。このアプロ−チは、非ヒト配列に起因する免疫原性増大のリスクを有し、これは本発明の方法および生成物によって回避される。

さらに、本発明者らは、４４位の置換が、標的ペプチドへの結合（すなわち標的抗原／ＭＨＣ複合体への親和性）に中程度の影響を及ぼし得ることを示し、それは、αおよびβ可変ドメインの三次構造において、Ｑ４４が、ＣＤＲによって形成される領域から最大限離れているという事実に起因するようである。

一実施形態によれば、同定および／または単離されたそれぞれの未修飾受容体と比較して、修飾α鎖およびβ鎖は、それらの定常ドメインおよび／またはそれらの膜貫通ドメイン中にいかなる置換も有しない。定常ドメインは、ＴＣＲα鎖とβ鎖との間の大きくかつ高度に保存された境界面を含むことから、可変ドメインにおける位置の置換と比較して、対合挙動、安定性、および免疫原性に関して、わずかな修飾でさえも影響を回避することは困難である。

一実施形態によれば、４４位の置換を有するα鎖は、可変ドメイン中の４４位が適切なアミノ酸で置換されているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖と対合することが好ましい。同様に、別の実施形態では、４４位の置換を有するβ鎖は、４４位が適切なアミノ酸によって置換されている可変ドメイン中のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖と対合することが好ましい。

それ故、特許請求された置換を有する第２の異種または遺伝子組換えＴＣＲを発現するように修飾されたＴ細胞において、遺伝子組換えα鎖と内在性β鎖との間の誤対合、またはその逆は減少しまたは回避さえされる。

このようにして、正しく対合した遺伝子組換えＴＣＲα／βヘテロ二量体の存在量の増加が達成され得て、それは修飾Ｔ細胞の全体的な結合活性を改善し、移植片対宿主病の誘発のような有害反応を回避する（Ｂｅｎｄｌｅｅｔａｌ，２００９）。

前記組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体の一実施形態によれば、少なくともα鎖またはβ鎖において、可変ドメインの４４位に存在するアミノ酸は、Ｑ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、およびＶからなる群から選択される１つのアミノ酸で置換されている。

さらなる一実施形態によれば、α鎖は、配列番号１または３と少なくとも９５％の配列同一性を共有する（有する）配列のフレームワーク領域を含んでなる可変ドメイン配列を少なくとも有し、その中ではその可変ドメイン中の４４位に存在するＱまたは任意のその他のアミノ酸が、本明細書で開示されるような別の適切なアミノ酸によって置換されており、またはβ鎖は、配列番号２または４と少なくとも９５％の配列同一性を共有する（有する）配列のフレームワーク領域を含んでなる可変ドメイン配列を有し、その中では可変ドメイン中の４４位に存在するＱまたは任意のその他のアミノ酸が、本明細書で開示されるような別の適切なアミノ酸によって置換されている。

好ましくは、前記αもしくはβ鎖は、それぞれ、配列番号１もしくは３、または配列番号２もしくは４と、少なくとも９６％、より好ましくは９７％、なおもより好ましくは少なくとも９８％、なおもより好ましくは少なくとも９９％、または最も好ましくは１００％の配列同一性を共有する（有する）配列のフレームワーク領域を少なくとも含んでなる、可変ドメイン配列を有する。

配列番号１は、ＴＣＲＲ７Ｐ１Ｄ５（ＴＲＡＶ５としても知られている、Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．２００１）のＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。配列番号２は、Ｒ７Ｐ１Ｄ５（ＴＲＢＶ１２−４としても知られている、Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．２００１）のＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。Ｒ７Ｐ１Ｄ５は、その内容が参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願第６２／３０８，９４４号明細書で開示される。Ｒ７Ｐ１Ｄ５は、ＭＨＣに結合すると、例えば、抗原提示細胞の「ＭＡＧ−００３」と称されるペプチドに結合する。ＭＡＧ−００３は、以下の一般式Ｉによるアミノ酸配列を含んでなる：
Ｘ_１Ｘ_２ＬＥＨＶＶＲＸ_３
式中、Ｘ_１はアミノ酸ＫおよびＹから選択され、Ｘ_２はアミノ酸Ｖ、Ｌ、およびＡから選択され、Ｘ_３はＶ、Ｌ、Ａ、およびＩから選択される。

配列番号３は、ＴＣＲα鎖可変ドメインＴＲＡＶ８−６のアミノ酸配列を示す（Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．２００１）。配列番号４は、ＴＣＲβ鎖可変ドメインＴＲＢＶ６−５のアミノ酸配列を示す（Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．２００１）。

図１および３では、配列はＩＭＧＴ番号付けで示されており、これは配列表中のそれぞれの配列の単純な番号付けから逸脱することに留意されたい。図３中の波状の下線は、アミノ酸残基によって占有されていないが、ＩＭＧＴ番号付けにおいて考慮される空白を示す。Ｑ４４は、添付の配列表から導き出されるような番号付けではなく、図１および３に示されるようなＩＭＧＴ番号付けを指すものと理解される。

α鎖およびβ鎖を有するＲ７Ｐ１Ｄ５（ＴＲＡＶ５およびＴＲＢＶ１２−４）、ならびにＴＲＡＶ８−６およびＴＲＢＶ６−５は、本発明の文脈において使用され得るＴＣＲ可変ドメインの単なる４つの例である。その他のＴＲＡＶおよびＴＲＢＶサブグル−プは、ＩＧＭＴウェブサイトで開示されている。ＴＲＡＶおよびＴＲＢＶは、特にＣＤＲ配列の適切な適応によって、異なる標的エピト−プ／ＭＨＣ複合体に対する特異性を取り入れ得ることに留意されたい。

上記の配列はシグナル配列なしで示されており、時には配列デ−タベ−スは、わずかに逸脱した配列を示すことにも留意されたい。例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔデ−タベ−スでは、ＴＲＡＶ８−６が配列番号３ならびに図１に示されるＮ末端Ａを欠く一方で、ＴＲＢＶ６−５は配列番号４ならびに図１に示されるＮ末端ＮおよびＡを欠く。

本発明の組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体の別の実施形態によれば、ＴＣＲは、以下のリストから選択される好ましい置換対の１つを含む。
αＱ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＱ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＱ４４Ｅ／βＱ４４Ｋ；αＱ４４Ｋ／βＱ４４Ｅ；αＱ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＱ４４Ｋ／βＱ４４Ｄ；αＱ４４Ｅ／βＱ４４Ｒ；αＱ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＱ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＱ４４Ｗ／βＱ４４Ｌ；αＱ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；およびαＱ４４Ｗ／βＱ４４Ｖ；
αＷ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＷ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＷ４４Ｅ／βＱ４４Ｋ；αＷ４４Ｋ／βＱ４４Ｅ；αＷ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＷ４４Ｋ／βＱ４４Ｄ；αＷ４４Ｅ／βＱ４４Ｒ；αＷ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＷ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＷ４４／βＱ４４Ｌ；αＷ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；およびαＷ４４／βＱ４４Ｖ；
αＨ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＨ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＨ４４Ｅ／βＱ４４Ｋ；αＨ４４Ｋ／βＱ４４Ｅ；αＨ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＨ４４Ｋ／βＱ４４Ｄ；αＨ４４Ｅ／βＱ４４Ｒ；αＨ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＨ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＨ４４Ｗ／βＱ４４Ｌ；αＨ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；およびαＨ４４Ｗ／βＱ４４Ｖ；
αＫ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＫ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＫ４４Ｅ／βＱ４４Ｋ；αＫ４４／βＱ４４Ｅ；αＫ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＫ４４／βＱ４４Ｄ；αＫ４４Ｅ／βＱ４４Ｒ；αＫ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＫ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＫ４４Ｗ／βＱ４４Ｌ；αＫ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；およびαＫ４４Ｗ／βＱ４４Ｖ；
αＥ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＥ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＥ４４／βＱ４４Ｋ；αＥ４４Ｋ／βＱ４４Ｅ；αＥ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＥ４４Ｋ／βＱ４４Ｄ；αＥ４４／βＱ４４Ｒ；αＥ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＥ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＥ４４Ｗ／βＱ４４Ｌ；αＥ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；およびαＥ４４Ｗ／βＱ４４Ｖ；
αＱ４４Ｄ／βＲ４４；αＱ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＱ４４Ｅ／βＲ４４Ｋ；αＱ４４Ｋ／βＲ４４Ｅ；αＱ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＱ４４Ｋ／βＲ４４Ｄ；αＱ４４Ｅ／βＲ４４；αＱ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＱ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＱ４４Ｗ／βＲ４４Ｌ；αＱ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；およびαＱ４４Ｗ／βＲ４４Ｖ；
αＷ４４Ｄ／βＲ４４；αＷ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＷ４４Ｅ／βＲ４４Ｋ；αＷ４４Ｋ／βＲ４４Ｅ；αＷ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＷ４４Ｋ／βＲ４４Ｄ；αＷ４４Ｅ／βＲ４４；αＷ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＷ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＷ４４／βＲ４４Ｌ；αＷ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；およびαＷ４４／βＲ４４Ｖ；
αＨ４４Ｄ／βＲ４４；αＨ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＨ４４Ｅ／βＲ４４Ｋ；αＨ４４Ｋ／βＲ４４Ｅ；αＨ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＨ４４Ｋ／βＲ４４Ｄ；αＨ４４Ｅ／βＲ４４；αＨ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＨ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＨ４４Ｗ／βＲ４４Ｌ；αＨ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；およびαＨ４４Ｗ／βＲ４４Ｖ；
αＫ４４Ｄ／βＲ４４；αＫ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＫ４４Ｅ／βＲ４４Ｋ；αＫ４４／βＲ４４Ｅ；αＫ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＫ４４／βＲ４４Ｄ；αＫ４４Ｅ／βＲ４４；αＫ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＫ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＫ４４Ｗ／βＲ４４Ｌ；αＫ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；およびαＫ４４Ｗ／βＲ４４Ｖ；
αＥ４４Ｄ／βＲ４４；αＥ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＥ４４／βＲ４４Ｋ；αＥ４４Ｋ／βＲ４４Ｅ；αＥ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＥ４４Ｋ／βＲ４４Ｄ；αＥ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＥ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＥ４４Ｗ／βＲ４４Ｌ；αＥ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；およびαＥ４４Ｗ／βＲ４４Ｖ。

上記において、例えば、「αＱ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ」は、例えば、α鎖の可変ドメインでＱ４４がＲによって置換されている一方で、β鎖の可変ドメインではＱ４４がＤによって置換されていることを意味するものとする。

前記組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体の好ましい実施形態によって、
ａ）修飾α鎖は、可変ドメインの４４位にＱまたは任意のその他の適切なアミノ酸を有する非修飾β鎖と比較して、好ましくは修飾β鎖と対合し、および／または
ｂ）修飾β鎖は、可変ドメイン中の４４位にＱまたは任意のその他の適切なアミノ酸を有する非修飾α鎖と比較して、好ましくは修飾α鎖と対合する。

本発明の別の態様によると、上記の説明による修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αまたはβ鎖をコ−ドする核酸分子、および／または上記の説明による組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体が提供される。一実施形態では、核酸分子は、
前記１つまたは複数のコ−ド核酸分子に作動可能に連結されるプロモ−タ−、および／または
前記１つまたは複数のコ−ド核酸分子に作動可能に連結されるシグナル配列
の少なくとも１つをさらに含んでなる。

シグナル配列は、α鎖またはβ鎖をＴ細胞の細胞表面に誘導するシグナルペプチドをコ−ドし、Ｔ細胞中では、それはその膜貫通ドメインによって固定され、α鎖およびβ鎖は細胞外表面に提示される。異なるα鎖およびβ鎖の可変ドメインサブタイプのシグナル配列が、当該技術分野で開示されている。

本発明の別の態様によると、上に記載される核酸分子の１つを少なくとも含んでなるプラスミドまたはベクタ−が提供される。

一実施形態では、前記ベクタ−は、好ましくはウイルスベクタ−、好ましくはレトロウイルスベクタ−またはレンチウイルスベクタ−である。ウイルスベクタ−を用いてαまたはβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子をＴ細胞に形質導入する方法は、例えば、ＰｏｇｕｌｉｓａｎｄＰｅａｓｅ（１９９８）、またはＺｏｎｇｅｔａｌ．（２０１０）で開示されている。ヒトＴ細胞への遺伝子移入のためのレンチウイルスベクタ−の使用が、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．（２００９）で開示されている。

その他の一実施形態では、前記ベクタ−はピギ−バック（ｐｉｇｇｙｂａｃｋ）または眠れる森の美女（ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙ）のようなトランスポゾンを含んでなり、それは次にそれぞれの核酸をＴ細胞に輸送できる。Ｔ細胞を遺伝的に操作するためにトランスポゾンを使用する方法は、例えば、Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．（２００８）で開示されている。

別の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、エレクトロポレ−ションによって、例えば、α鎖およびβ鎖をコ−ドする１つ以上のＲＮＡを導入することによって、一過性に形質移入され得る。このような方法は、例えば、ＫｉｍａｎｄＥｂｅｒｗｉｎｅ（２０１０）で開示されている。

本発明の別の態様によると、修飾Ｔ細胞を調製する方法が提供され、前記方法は、
対象からＴ細胞を得るステップと、
前記Ｔ細胞を本発明による１つまたは複数の核酸分子で、または本発明によるプラスミドもしくはベクタ−で、形質導入または形質移入するステップと
を含んでなる。

好ましい態様では、前記Ｔ細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子陰性ドナ−から得られた。例えば、修飾Ｔ細胞が、ＨＬＡ−Ａ^＊０２血清型ＡＰＣによって提示される抗原を検出することことが意図される場合、修飾されることが意図される起源は、好ましくはＨＬＡ−Ａ^＊０２血清型陰性ドナ−から得られる。このようにして、内在性ＴＣＲと標的抗原／ＭＨＣ複合体との交差反応性は減少するか、または回避すらされる。

好ましくは、このようにして得られた修飾Ｔ細胞は、前記対象の自己Ｔ細胞療法に適している。

本発明の別の態様によると、上記の説明による組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体のα鎖およびβ鎖をコ−ドする核酸のセットを保有する、修飾Ｔ細胞が提供される。

一実施形態では、前記細胞は、上記の説明による方法によって調製された。

本発明の別の態様によると、新生物疾患、炎症性疾患、感染性疾患または自己免疫疾患に罹患している、発症するリスクがある、および／またはそれらであると診断された患者を治療するための上記の説明の修飾Ｔ細胞の使用が提供され、その使用は、それを必要とする患者に前記修飾Ｔ細胞を含んでなる調製物を提供または投与することを含んでなる。

代案としては、上記の説明による修飾Ｔ細胞を用いて、新生物疾患、炎症性疾患、感染性疾患または自己免疫疾患に罹患している、発症するリスクがある、および／またはそうであると診断された患者を治療する方法が提供され、その方法は、前記修飾Ｔ細胞を含んでなる調製物をそれを必要とする患者に提供または投与することを含んでなる。

この文脈では、抗原提示細胞のＭＨＣによって提示された抗原を検出するために、それぞれの修飾ＴＣＲ、またはそれぞれの修飾Ｔ細胞の特異性が、α鎖およびβ鎖の可変ドメイン中のＣＤＲ配列に依存することを理解することが重要である。

Ｌｏｓｅｔｅｔａｌ．（２０１４）に記載されるように、特異的抗原−ＭＨＣ複合体のＴ細胞受容体は、Ｔ細胞関連ファ−ジディスプレイによって得られ得る。このようなアプロ−チでは、α鎖およびβ鎖の可変ドメインにおけるＱ４４置換は、ファ−ジディスプレイの基礎を形成するライブラリ−の全構成員において達成され得るか、またはその後、すなわちひとたび特異的抗原−ＭＨＣ複合体を検出する特有のＴＣＲが見いだされたら、導入され得る。

本発明のさらなる態様によると、上記の説明による、使用、方法、Ｔ細胞またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体が提供され、Ｔ細胞受容体によって検出されたＭＨＣ複合体によって提示される抗原は、がん特異的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドエピト−プから選択される。これらのペプチドは当該技術分野で公知であり、一例として、実施例で使用されたペプチドＭＡＧ−００３を含んでなる。これらのペプチドは、例えば、エピト−プデ−タベ−ス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）など、または好ましくは、国際公開第２０１６／１７７７８４号パンフレット；国際公開第２０１６／１７０１３９号パンフレット；国際公開第２０１６／１５６２３０号パンフレット；国際公開第２０１６／１５６２０２号パンフレット；国際公開第２０１６／１４６７５１号パンフレット；国際公開第２０１６／１０２２７２号パンフレット；国際公開第２０１６／１０７７４０号パンフレット；国際公開第２０１５／１９３３５９号パンフレット；国際公開第２０１５／１６９９４５号パンフレット；国際公開第２０１５／０６３３０２号パンフレット；国際公開第２０１５／０１８８０５号パンフレット；国際公開第２０１２／０６９４６２号パンフレット；国際公開第２０１２／０７９８７８号パンフレット；国際公開第２０１２／０３８４６３号パンフレット；国際公開第２０１１／１５１４０３号パンフレット；国際公開第２０１１／１２８４４８号パンフレット；国際公開第２０１１／１１３８８２号パンフレット；国際公開第２０１１／１１３８７２号パンフレット；国際公開第２０１１／１１３８１９号パンフレット；国際公開第２０１１／０７３２１５号パンフレット；国際公開第２０１０／０３７５１４号パンフレット；国際公開第２００９／１３８２３６号パンフレット；国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット；国際公開第２００７／０２８５７３号パンフレット；国際公開第２００６／１１４３０７号パンフレット；国際公開第２００５／１１６０５１号パンフレット；国際公開第２００５／０７６００９号パンフレット；国際公開第２００４／０８５４６１号パンフレット；国際公開第０３／１００４３２号パンフレット；国際公開第０３／１０２０２３号パンフレット；国際公開第２００９／０１５８４３号パンフレット；国際公開第２００９／０１５８４２号パンフレット；国際公開第２００９／０１５８４１号パンフレット；国際公開第２０１６／２０２９６３号パンフレット；国際公開第２０１６／２０７１６４号パンフレット；国際公開第２０１７／００１４９１号パンフレット；国際公開第２０１７／００５７３３号パンフレット；国際公開第２０１７／０２１５２７号パンフレット；国際公開第２０１７／０３６９３６号パンフレット；国際公開第２０１７／０６０１６９号パンフレット；国際公開第２０１７／０６０２０１号パンフレット；国際公開第２０１７／０９７６０２号パンフレット；国際公開第２０１７／０９７６９９号パンフレット；国際公開第２０１７／１０８３４５；または国際公開第２０１７／００９４００号パンフレットのいずれかで開示されるような文献に見いだされ得る（開示されるペプチドに関して、全て参照により本明細書に援用される）。

本発明を図面および前述の説明において詳細に図示および説明してきたが、このような図示および説明は例示的または例証的であり、限定的ではないと見なされるべきであり；本発明は、開示される実施形態に限定されない。開示された実施形態に対するその他のバリエ−ションは、特許請求される発明を実施する際に、および／または図面、開示、および添付の特許請求の範囲の検討から、当業者によって理解され達成され得る。

記載された装置もしくは組成物の特定の構成部分もしくは構造的特徴、または記載された方法の工程段階は変動することもあるので、本発明はこのような装置および方法に限定されないことが、さらに理解されるものとする。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを記述することを目的としており、制限は意図されないこともまた理解されるものとする。特定の手段が、相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用され得ないことを示すものではない。請求項中のいかなる参照符号も、範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。本明細書および添付の特許請求範囲の用法では、文脈上例外が明記されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数指示対象を含むことに留意すべきである。さらに、特許請求の範囲において、「含んでなる」という単語は、その他の要素またはステップを排除しない。特定の手段が、相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用され得ないことを示すものではない。数値で区切られたパラメ−タ範囲が与えられている場合、その範囲は、これらの限界値を含むと見なされると、さらに理解されるものとする。

本明細書で開示される実施形態は、互いに関係しない個々の実施形態として理解されることは意図されないと、さらに理解されるものとする。一実施形態で論じられた特徴は、本明細書で示されたその他の実施形態に関連してもまた、開示されることが意図される。ある場合、特定の特徴が一実施形態では開示されないが、別の実施形態で開示される場合、当業者は、それが必ずしも、前記特徴が前記他の実施形態と共に開示されることを意図しないわけではないことを理解するであろう。当業者は、他の実施形態についてもまた前記特徴を開示することが本出願の要旨であるが、単に明確さの目的のためにそして明細書を扱いやすい量に保つために、それが行われていないことを理解するであろう。

本明細書で開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端方向で示されており；本明細書で開示される全ての核酸配列は、５’→３’方向で示されている。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。これは、特に、標準的なまたは日常的な方法を開示する、先行技術の文書について言及している。その場合、参照による援用は、開示を実施可能にするのに十分なものを提供し、長い繰り返しを避けることを主な目的とする。

図面および添付の配列表において、
ＴＣＲα鎖およびβ鎖の可変ドメインのアミノ酸残基の番号付けを示す。図は、Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．（２００３）から採用され修正されている。配列は、ＴＲＡＶ８−６（遺伝子ＩＤ：２８６８０）（α鎖）およびＴＲＢＶ６−５（遺伝子ＩＤ：２８６０２）（β鎖）の例に示される。α鎖およびβ鎖中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けと比較して、ＩＭＧＴ標準（太字）に従う。 α鎖（ＴＲＡＶ）およびβ鎖（ＴＲＢＶ）中のＱ４４が、灰色のアンダ−クロスで標識される。ＩＭＧＴ番号付けによるＱ４４は、フレームワーク２（ＦＲ２）領域内の高度に保存された残基であり、１Ｇ４（ｐｄｂＩＤ：２ＢＮＲ（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００５））；ＴＲＡＶ８−６（遺伝子ＩＤ：２８６８０）（α鎖）およびＴＲＢＶ６−５（遺伝子ＩＤ：２８６０２）、（β鎖）およびＲ７Ｐ１Ｄ５（ＴＲＡＶ５およびＴＲＢＶ１２−４を含んでなる、Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．２００１）をはじめとする、全ＴＣＲ遺伝子の約８０％によって共有される（Ｓｔｒｏｎｇｅｔａｌ．，１９９９）。Ｑ４４は、ＷＹＸＱを含んでなる４つのＡＡモチ−フの一部であることが非常に多く、Ｘは、例えば、Ｒ、ＶまたはＫなどの任意のアミノ酸である。Ｗ４１は、ＴＣＲαおよびβ鎖中でさらにより高度に保存されている（＞９５％）（Ｓｔｒｏｎｇｅｔａｌ．，１９９９）。同上Ａ：ＴＣＲ１Ｇ４（ｐｄｂＩＤ：２ＢＮＲ（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００５））の可変ドメインからのαＱ４４／βＱ４４の構造的モチ−フを示す。Ｂ：１Ｇ４ＴＣＲの結晶構造に基づく、コンピュ−タシミュレ−ションによる二重変異体を示す。本発明者らは、立体的および／または電荷の対称性を破る一方で、野生型αＱ４４／βＱ４４対から、高レベルの分子接触（極性または無極性）を維持する可能な対を手動で選択して操作した。変異体は、ＵＣＳＦキメラを用いて作製された（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎｅｔａｌ．，２００４）。図面全体にわたり、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖が、それぞれ暗青色およびシアンのリボンで表される。関心のある側鎖はマゼンタで強調表示され、全ての重原子が示される。ＭＨＣに結合した場合、ＭＡＧ−００３と称されるペプチドを検出する、ＴＣＲ変異型Ｒ７Ｐ１Ｄ５αおよびβ鎖（ＴＲＡＶ５およびＴＲＢＶ１２−４）；ＴＲＡＶ８−６（α鎖可変ドメイン）；およびＴＲＢＶ６−５（β鎖可変ドメイン）の配列を示す。灰色のアンダ−クロスは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３と共に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のおよその位置を標識する。見られるように、Ｑ４４はＦＲ２に位置する。ＴＲ４Ｖ６−６およびＴＲＢＶ６−５と同様に、Ｑ４４は、その他のＴＣＲ変異体においても保存されていることに留意されたい。後者と同様に、Ｑ４４は、ＷＹＸＱを含んでなる４つのＡＡモチ−フのＲ７Ｐ１Ｄ５部分にある。標的化されるそれぞれの抗原次第で、ＣＤＲ配列はもちろん変化し得る。選択されたコンピュ−タシミュレ−ションによる操作された変異体について、計算された変異エネルギ−を示す。その結果生じるＴＲＡＶ／ＴＲＢＶ界面における形状および／または電荷相補性について、二重変異が選択される。荷電アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ）の選択を示す。中性アミノ酸（Ｗ、Ｖ、Ｌ）の選択を示す。提案された各対の相補的変異について、本発明者らは、二重変異体（緑色）ならびに個々の単一変異体（オレンジ色）を試験し、操作された鎖と野生型鎖との対合を模倣した。０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌより高い変異エネルギ−は不安定化させると考えられ、−０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌより低い変異エネルギ−は安定化させると考えられ、−０．５〜０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌの間の変異エネルギ−は中性であると考えられる（赤い線の間−ソフトウェアデフォルトパラメ−タ）。変異は、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ（ＤａｓｓａｕｌｔＳｙｓｔｅｍｅｓ，ＢＩＯＶＩＡ，２０１７）およびＳｐａｓｓｏｖａｎｄＹａｎ（２０１３）によって記載された変異エネルギ−アルゴリズムを用いて、１Ｇ４ＴＣＲの可変ドメイン（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００５）に対して行われた。ＴＣＲＲ７Ｐ１Ｄ５の野生型および変異体のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＡＧ−００３（例示的ペプチド）：ＨＬＡ−Ａ^＊０２四量体またはＮＹＥＳＯ１−００１（対照ペプチド）：ＨＬＡ−Ａ^＊０２四量体染色をそれぞれ示す。Ｒ７Ｐ１Ｄ５は、ＭＨＣと結合するとＭＡＧ−００３ペプチドを検出するが、ＮＹＥＳＯ１ペプチドは検出しない。模擬電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＣＲなし）が、対照の役割を果たした。ドナ−（左側パネル：ドナ−Ａ、右側パネル：ドナ−Ｂ）。ＴＣＲＲ７Ｐ１Ｄ５の野生型および変異体のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞の文脈における、ＨＬＡ−Ａ^＊０２の例示的ペプチドとしてのＭＡＧ−００３によるＩＦＮ放出を示す。全ての変異体（αＱ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ、αＱ４４Ｅ／βＱ４４Ｋ、αＱ４４Ｋ／βＱ４４Ｅ、αＱ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ、αＱ４４Ｋ／βＱ４４Ｄ、αＱ４４Ｅ／βＱ４４Ｒ）は未修飾Ｒ７Ｐ１Ｄ５野生型と比較した場合に、改善されたＭＡＧ−００３認識を示す。ＰＲＡＭＥ−００４特異的ＴＣＲＲ１１ＡおよびＲ１７Ａならびにそれらの対応するα４４Ｋ／β４４Ｅ変異体は、それぞれレンチウイルス移入を通じてヒトＴ細胞に形質導入された。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の活性は、漸減濃度のＰＲＡＭＥ−００４ペプチドが負荷されたＴ２細胞との同時インキュベ−ションによって評価された。変異体ＴＣＲＲ１１ＫＥＡは、未修飾Ｒ１１ＴＣＲと比較した場合に、大幅に改善されたＰＲＡＭＥ−００４認識を示す。ＰＲＡＭＥ−００４特異的ＴＣＲＲ１７ＡおよびＲ１１Ａならびにその対応する４４Ｋ／４４Ｅ変異体（Ｒ１１ＫＥＡ）は、レンチウイルス移入を通じて２人のドナ−のヒトＴ細胞に形質導入された。ＰＲＡＭＥ−００４を発現する腫瘍細胞株Ａ３７５およびＵ２ＯＳに対する形質導入Ｔ細胞の細胞傷害性は、ＩｎｃｕＣｙｔｅイメ−ジングシステムを通じて評価された。ＭＡＧ−００３特異的ＴＣＲが、対照として使用された（Ａ３７５およびＵ２ＯＳは、ＭＡＧ−００３もまた発現する）。未修飾Ｒ１１ＡＴＣＲと比較した場合、変異体ＴＣＲＲ１１ＫＥＡは、ＰＲＡＭＥ−００４陽性細胞株の殺傷率の増加を示す。

ＩＭＧＴ規格による番号付けは、図１Ａ〜Ｃに見られるように、特にＣＤＲ配列中の空白のために、ＴＣＲ可変ドメインの所与のアミノ酸配列の単純な番号付けから逸脱することがあることに留意されたい。これは、例えば、ＴＲＡＶ８−６およびＴＲＢＶ６−５に適用され、波状の下線は、アミノ酸残基によって占有されていないが、ＩＭＧＴ番号付けにおいて考慮される空白を示す。これらの配列は例としてのみ提供され、好ましくあるものの、特許請求を特定の実施態様に限定しないものとする。これは、本発明の教示が、特に可変ドメインに、特にＣＤＲにその他の配列を有する、その他のＴＣＲα鎖およびβ鎖、またはＴＣＲαβヘテロ二量体に適用可能であることを意味する。

さらに、本発明の教示は、好ましくは、しかしそれだけではないが、天然のＱ４４アミノ酸を含んでなる場合、好ましくはそれらがＷＹＸＱモチ−フを含んでなる場合に、その他の標的抗原／ＭＨＣ複合体に結合するその他のＴＣＲα鎖およびβ鎖またはＴＣＲαβヘテロ二量体にも適用できる。標的化されるそれぞれの抗原次第で、ＣＤＲ配列は変化してもよい。

一般に、Ｔ細胞受容体のクロ−ニングおよび発現方法は、Ｗａｌｃｈｌｉｅｔａｌ．（２０１１）で開示される。部位特異的アミノ酸置換をもたらすランダム変異誘発または部位特異的変異誘発の方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｌａｂｒｏｕ（２０１０）およびＴｒｅｈａｎｅｔａｌ．（２０１６）で開示されている。

所与のアミノ酸配列を修飾するためのゲノム編集の方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲＣａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、アルゴノ−ト（ＮｇＡｇｏ）またはＣＲＩＳＰＲＣｐｆ１）は当業者に周知であり、例えば、ＭａｅｄｅｒａｎｄＧｅｒｓｂａｃｈ（２０１６）で開示されている。遺伝子の合成法は当業者に周知であり、例えば、Ｈｕｇｈｅｓｅｔａｌ．（２０１１）で開示されている。これらの参考文献の開示は、それらの全体が参照により援用される。

コンピュ−タシミュレ−ションによる方法
１Ｇ４ＴＣＲの可変ドメイン（ｐｄｂＩＤ：２ＢＮＲ（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００５））を目視検査することによって、本発明者らは、立体的および／または電荷の対称性を破る一方で、潜在的に高レベルの分子接触（極性または無極性）を維持するであろう変異の対をα４４／β４４モチ−フについて手動で選択した。変異対は、（ｉ）対の総電荷がゼロであり、（ｉｉ）２つのアミノ酸が、潜在的に良好な形状相補性を示しおよび／または水素結合および／または塩橋を形成し、（ｉｉｉ）２つのアミノ酸が異なる分子量を有する（すなわち１つの大型アミノ酸と１つの小型アミノ酸）ように選択した。ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏソフトウェア（ＤａｓｓａｕｌｔＳｙｓｔｅｍｅｓ，ＢＩＯＶＩＡ，２０１７）を用いて、操作された位置がＴＣＲのαβ対合に及ぼす影響をさらに調べた。Ｓｐａｓｓｏｖｅｔａｌ．（ＳｐａｓｓｏｖａｎｄＹａｎ，２０１３）によって記載されたアルゴリズムを用いて変異エネルギ−を計算し、抗体のコンピュ−タシミュレ−ションによる設計を行った。変異エネルギ−は、野生型モチ−フαＱ４４／βＱ４４との比較で、変異の効果を反映すると予測された。本発明者らは、二重変異体ならびに野生型鎖と対合した各単一変異体を試験し、
−二重変異体の場合、変異エネルギ−は中立でありまたは安定化することが予測され、
−野生型鎖と対合する単一変異体の場合、変異エネルギ−は２つの側面の少なくとも１つで不安定化することが予測された。

ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＲＮＡなし（ＴＣＲなし）で、またはその野生型（Ｒ７Ｐ１Ｄ５ＴＣＲｗｔ）の、またはＴＣＲα可変ドメインにＱ４４Ｄ変異を組み込みＴＣＲβ可変ドメインにＱ４４Ｒ変異を組み込む変異型（Ｒ７Ｐ１Ｄ５ＴＣＲ αＱ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ）の、ペプチド特異的（例えばＭＡＧ−００、例えばＷｕｅｔａｌ．Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７４：６２０１１Ｄｅｃｐａｇｅｓ５６１−７で開示されるペプチド「ｐ２８６」）Ｔ細胞受容体鎖αおよびβをコ−ドする同量のＲＮＡと共に、電気穿孔した。一晩培養した後、Ｔ細胞をＭＡＧ−００３：ＨＬＡ−Ａ^＊０２四量体の結合（図５、上列）および無関係のペプチドＮＹＥＳＯ１−００１：ＨＬＡ−Ａ^＊０２対照四量体の結合（図５、下列）（上記のようなエピト−プデ−タベ−ス中のペプチドＮＹＥＳＯ−００１；エピト−プＩＤ５９２８３）について分析した。四量体陽性Ｔ細胞の比率は、２人の個々のドナ−について示される（図５左側パネル：ドナ−Ａ、右側パネル：ドナ−Ｂ）。

腫瘍特異的ＴＣＲ−α鎖およびＴＣＲ−β鎖をコ−ドするＴＣＲＲ７Ｐ１Ｄ５を、健常ドナ−のＴ細胞から単離し増幅した。健常ドナ−由来の細胞を以前記載された方法に従って生体外で刺激し（Ｗａｌｔｅｒｅｔａｌ．，２００３）、ＨＬＡ−Ａ^＊０２多量体を用いて標的特異的細胞を単細胞ソ−トし、次に引き続くＴＣＲ単離のために使用した。例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌｆｏｕｒｔｈｅｄｉｔｉｏｎｂｙＧｒｅｅｎａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋに記載されるように、標準法によって５’ＲＡＣＥを通じてＴＣＲ配列を単離した。ＴＣＲＲ７Ｐ１Ｄ５のαおよびβ可変領域を配列決定し、さらなる機能特性解析のためにクロ−ン化した。ＴＣＲＲ７Ｐ１Ｄ５は、ＨＬＡ−Ａ^＊０２陽性ドナ−に由来する。

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Claims

非修飾鎖のＩＭＧＴ番号付けによる４４位のアミノ酸が、修飾α鎖またはβ鎖と望まれないαまたはβ鎖との対合を減少させる、別の適切なアミノ酸で置換されている、抗原−ＭＨＣ複合体に結合する能力を維持する、修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖もしくはβ鎖、またはその断片もしくは誘導体。
前記望まれないα鎖またはβ鎖が修飾されていない、請求項に記載の１修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖またはβ鎖。
前記可変ドメイン中の４４位の前記アミノ酸が、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項１または２に記載の修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖またはβ鎖。
前記修飾α鎖が、配列番号１または３と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列のフレームワーク領域を少なくとも含んでなる可変ドメイン配列を有し、および／または前記修飾β鎖が、配列番号２または４と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列のフレームワーク領域を含んでなる可変ドメイン域配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖またはβ鎖。
前記ＴＣＲが抗原−ＭＨＣ複合体と結合する能力を維持する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾α鎖および／または修飾β鎖、またはその断片もしくは誘導体を含んでなる、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体。
前記αおよび／またはβ鎖の前記修飾が、Ｑ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸による４４位の置換から選択される、請求項５に記載の組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体。
前記α鎖およびβ鎖の前記修飾が、αＱ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＱ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＱ４４Ｅ／βＱ４４Ｋ；αＱ４４Ｋ／βＱ４４Ｅ；αＱ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＱ４４Ｋ／βＱ４４Ｄ；αＱ４４Ｅ／βＱ４４Ｒ；αＱ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＱ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＱ４４Ｗ／βＱ４４Ｌ；αＱ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；αＱ４４Ｗ／βＱ４４Ｖ；αＷ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＷ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＷ４４Ｅ／βＱ４４Ｋ；αＷ４４Ｋ／βＱ４４Ｅ；αＷ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＷ４４Ｋ／βＱ４４Ｄ；αＷ４４Ｅ／βＱ４４Ｒ；αＷ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＷ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＷ４４／βＱ４４Ｌ；αＷ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；αＷ４４／βＱ４４Ｖ；αＨ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＨ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＨ４４Ｅ／βＱ４４Ｋ；αＨ４４Ｋ／βＱ４４Ｅ；αＨ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＨ４４Ｋ／βＱ４４Ｄ；αＨ４４Ｅ／βＱ４４Ｒ；αＨ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＨ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＨ４４Ｗ／βＱ４４Ｌ；αＨ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；αＨ４４Ｗ／βＱ４４Ｖ；αＫ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＫ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＫ４４Ｅ／βＱ４４Ｋ；αＫ４４／βＱ４４Ｅ；αＫ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＫ４４／βＱ４４Ｄ；αＫ４４Ｅ／βＱ４４Ｒ；αＫ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＫ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＫ４４Ｗ／βＱ４４Ｌ；αＫ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；αＫ４４Ｗ／βＱ４４Ｖ；αＥ４４Ｄ／βＱ４４Ｒ；αＥ４４Ｒ／βＱ４４Ｄ；αＥ４４／βＱ４４Ｋ；αＥ４４Ｋ／βＱ４４Ｅ；αＥ４４Ｄ／βＱ４４Ｋ；αＥ４４Ｋ／βＱ４４Ｄ；αＥ４４／βＱ４４Ｒ；αＥ４４Ｒ／βＱ４４Ｅ；αＥ４４Ｌ／βＱ４４Ｗ；αＥ４４Ｗ／βＱ４４Ｌ；αＥ４４Ｖ／βＱ４４Ｗ；αＥ４４Ｗ／βＱ４４Ｖ；αＱ４４Ｄ／βＲ４４；αＱ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＱ４４Ｅ／βＲ４４Ｋ；αＱ４４Ｋ／βＲ４４Ｅ；αＱ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＱ４４Ｋ／βＲ４４Ｄ；αＱ４４Ｅ／βＲ４４；αＱ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＱ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＱ４４Ｗ／βＲ４４Ｌ；αＱ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；αＱ４４Ｗ／βＲ４４Ｖ；αＷ４４Ｄ／βＲ４４；αＷ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＷ４４Ｅ／βＲ４４Ｋ；αＷ４４Ｋ／βＲ４４Ｅ；αＷ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＷ４４Ｋ／βＲ４４Ｄ；αＷ４４Ｅ／βＲ４４；αＷ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＷ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＷ４４／βＲ４４Ｌ；αＷ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；αＷ４４／βＲ４４Ｖ；αＨ４４Ｄ／βＲ４４；αＨ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＨ４４Ｅ／βＲ４４Ｋ；αＨ４４Ｋ／βＲ４４Ｅ；αＨ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＨ４４Ｋ／βＲ４４Ｄ；αＨ４４Ｅ／βＲ４４；αＨ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＨ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＨ４４Ｗ／βＲ４４Ｌ；αＨ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；αＨ４４Ｗ／βＲ４４Ｖ；αＫ４４Ｄ／βＲ４４；αＫ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＫ４４Ｅ／βＲ４４Ｋ；αＫ４４／βＲ４４Ｅ；αＫ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＫ４４／βＲ４４Ｄ；αＫ４４Ｅ／βＲ４４；αＫ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＫ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＫ４４Ｗ／βＲ４４Ｌ；αＫ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；αＫ４４Ｗ／βＲ４４Ｖ；αＥ４４Ｄ／βＲ４４；αＥ４４Ｒ／βＲ４４Ｄ；αＥ４４／βＲ４４Ｋ；αＥ４４Ｋ／βＲ４４Ｅ；αＥ４４Ｄ／βＲ４４Ｋ；αＥ４４Ｋ／βＲ４４Ｄ；αＥ４４Ｒ／βＲ４４Ｅ；αＥ４４Ｌ／βＲ４４Ｗ；αＥ４４Ｗ／βＲ４４Ｌ；αＥ４４Ｖ／βＲ４４Ｗ；およびαＥ４４Ｗ／βＲ４４Ｖからなる群の置換対から選択され、好ましくはα４４Ｄ／β４４Ｒ；α４４Ｒ／β４４Ｄ；α４４Ｅ／β４４Ｋ；α４４Ｋ／β４４Ｅ；α４４Ｄ／β４４Ｋ；α４４Ｋ／β４４Ｄ；α４４Ｅ／β４４Ｒ；およびα４４Ｒ／β４４Ｅからなる群から選択される、請求項５または６に記載の組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体。
前記ＴＣＲの前記α鎖が、配列番号１または３と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列のフレームワーク領域を少なくとも含んでなる可変ドメイン配列を有し、および／または前記ＴＣＲの前記β鎖が、配列番号２または４と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列のフレームワーク領域を含んでなる可変ドメイン配列を有する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖またはβ鎖、および／または請求項５〜８のいずれか一項に記載の組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体をコ−ドする核酸分子。
請求項９に記載の核酸分子の少なくとも１つを含んでなる、プラスミドまたは発現ベクタ−。
請求項９に記載の１つまたは複数の核酸分子、または請求項１０に記載のプラスミドもしくは発現ベクタ−で、対象補助から得られたＴ細胞を形質導入または形質移入するステップを含んでなる、修飾Ｔ細胞を調製する方法。
請求項１１に従って生成される、修飾Ｔ細胞。
それを必要とする対象の自己由来Ｔ細胞療法で使用するための、請求項１２に記載の修飾Ｔ細胞。
前記それを必要とする対象に、前記修飾Ｔ細胞を含んでなる製剤を投与するステップを含んでなる、新生物疾患、炎症性疾患、感染性疾患もしくは自己免疫疾患に罹患している、またはそれらを発症するリスクがある、および／またはそれらであると診断された、治療を必要とする対象の治療で使用するための請求項１２に記載の修飾Ｔ細胞。
請求項５〜８のいずれか一項に記載の組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体であって、前記ＴＣＲがＭＨＣ複合体によって提示される抗原に特異的に結合し、前記抗原が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のエピト−プから選択される、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロ二量体。