JP2020188772A - プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、タンパク質工学の分野に属する。
二重特異性抗体は、癌治療剤としての見込みを示している。例えば、Bispecific T cell Engager(BiTE(登録商標))形式でCD3およびCD19の両方を標的とする二重特異性抗体は、低用量で目覚ましい有効性を示している。Bargou et al. (2008), Science 321 : 974-978(非特許文献1)。BiTE(登録商標)形式は、本質的に、リンカーによって連結された2つのscFvからなり、その一方はCD3を標的とし、そのもう一方は腫瘍抗原を標的とする。結果として得られた抗体はインビボ半減期が短く、そのため持続注入による投薬を必要とする。薬物動態特性が改善された二重特異性形式は、持続投薬の必要性を排除するために望ましいと考えられる。しかしながら、CD3の結合はT細胞活性化を引き起こすため、半減期がより長い形式は、容易に想像できるように、T細胞活性化の延長および不十分な局在化を引き起こし、望ましくない副作用をもたらし得る。Tsoukas et al. (1985), J. Immunol. 135(3): 1719-1723(非特許文献2)。したがって、当技術分野において、適度に長い半減期を有するが、疾患微小環境において、例えば腫瘍の近傍で、特異的に活性化される二重特異性抗体形式の必要性がある。
概して、プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質 (PABP)、PABPをコードする核酸、PABPを作製する方法、およびPABPを使用する方法が、本明細書において記載される。そのようなPABPは、少なくとも、標的細胞に結合する部分、エフェクター細胞に結合する部分、およびプロテアーゼ切断部位を含む。
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。標的細胞は、癌細胞であってよい。VH1およびVL1は、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) に結合し得る。
タンパク質分解切断によって活性化され得る二重特異性タンパク質、任意に二重特異性抗体のいくつかの形式が、本明細書において記載される。これらのタンパク質は、本明細書において、プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質 (PABP) と称される。PABPは、1種または複数種のプロテアーゼが局所的な疾患微小環境において大量に存在する疾患状態において、例えば、様々な癌、炎症性疾患、線維性疾患、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患において、用途を見出し得る。例えば、Broder and Becker-Pauly (2013), Biochem. J. 450: 253-264を参照されたい。そのような状況において、二重特異性タンパク質は、疾患細胞の存在下で活性化され得るが、疾患細胞の非存在下では活性化され得ない。したがって、本明細書において記載される二重特異性タンパク質は、疾患微小環境において特異的に活性化され得、身体の他の部位では活性がより低いかまたは不活性であり得る。
本明細書において意味される「抗体」は、少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖可変領域 (VH) または軽鎖可変領域 (VL)、多くの場合にはVHおよびVLを含有するタンパク質である。したがって、「抗体」という用語は、一本鎖Fv抗体(scFv、リンカーによって連結されたVH領域およびVL領域を含有する)、Fab、F(ab)2'、Fab'、scFv:Fc抗体(Carayannopoulos and Capra, Ch. 9 in FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3rd ed., Paul, ed., Raven Press, New York, 1993, pp. 284-286記載されている)、または哺乳動物に見られる天然IgG抗体などの2つの全長重鎖および2つの全長軽鎖を含有する全長抗体を含む、種々の形式を有する分子を包含する。同上。本明細書において「IgG抗体」と称されるそのような全長抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプのものであってよく、ヒト抗体であってよい。抗体の構造を記載しているCarayannopoulos and Capraの部分は、参照により本明細書に組み入れられる。さらに、「抗体」という用語は、ラクダおよび他のヒトコブラクダ種ならびにサメに見られる天然抗体のような、2つの重鎖を含有し軽鎖を含有しない二量体抗体を含む。例えば、Muldermans et al., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302;Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-90;Streltsov et al. (2005), Protein Science 14: 2901-2909を参照されたい。抗体は、「単一特異性」(すなわち、1種の抗原にのみ結合する)、「二重特異性」(すなわち、2種の異なる抗原に結合する)、または「多重特異性」(すなわち、2種以上の異なる抗原に結合する)であってよい。さらに、抗体は、一価、二価、または多価であってよく、これは、抗体が一度にそれぞれ1つ、2つ、または複数の抗原分子に結合し得ることを意味する。
を含む、384位と385位(表2に示されるEU番号付け)との間の半減期を延長する挿入物を含む。そのような挿入物を含有するPABPが企図される。
(二重特異性の存在下での腫瘍細胞の溶解率−二重特異性の非存在下での腫瘍細胞の溶解率)/(総細胞溶解率−二重特異性の非存在下での腫瘍細胞の溶解率)
総細胞溶解は、二重特異性分子を伴わずに、エフェクター細胞および標識標的細胞を含有する試料を、80%冷メタノールを用いて溶解することによって決定される。ADCCを増強する例示的な改変には、Fc領域のA鎖およびB鎖中の以下の改変が含まれる:(a) A鎖がQ311MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(b) A鎖がE233L、Q311M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(c) A鎖がL234I、Q311M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(d) A鎖がS298TおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(f) A鎖がA330MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(f) A鎖がA330FおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(g) A鎖がQ311M、A330M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(h) A鎖がQ311M、A330F、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、E294L、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(i) A鎖がS298T、A330M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(j) A鎖がS298T、A330F、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(k) A鎖がS239D、A330M、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(l) A鎖がS239D、S298T、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(m) A鎖がK334V置換を含み、かつB鎖がY296WおよびS298C置換を含むか、もしくはその逆である;(n) A鎖がK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である;(o) A鎖がL235S、S239D、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(p) A鎖がL235S、S239D、およびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である;(q) A鎖がQ311MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、F243V、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(r) A鎖がQ311MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である;(s) A鎖がS239DおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(t) A鎖がS239DおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である;(u) A鎖がF243VおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(v) A鎖がF243VおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である;(w) A鎖がE294LおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、K290Y、およびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;(x) A鎖がE294LおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234Y、Y296W、およびS298C置換を含むか、もしくはその逆である;(y) A鎖がA330MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がL234YおよびY296W置換を含むか、もしくはその逆である;または(z) A鎖がA330MおよびK334V置換を含み、かつB鎖がK290YおよびY296W置換を含むか、もしくはその逆である。
、およびAAAが含まれる。
上記で説明されたように、PABPの成分1は、病原体または内因性の疾患媒介細胞の表面に発現される標的分子に結合し得る、PABPの部分である。病原体は、例えば、ウイルス、細菌、または原生動物であってよい。いくつかの態様において、成分1は、標的分子に結合し得る重鎖および軽鎖可変(VHおよびVL)領域を共に含む。VH領域およびVL領域は、同じまたは異なるポリペプチド鎖上にあってよい。他の態様において、成分1は、VH領域またはVL領域が単独で疾患媒介細胞または病原体に結合し得る限り、VH領域またはVL領域であってよい。そのような単一可変ドメイン抗体は、例えばUS 2008/0008713に記載されており、その関連部分は参照により本明細書に組み入れられる。これらのVH領域および/またはVL領域のいずれも、哺乳動物起源のもの、例えばヒトVH領域および/またはVL領域であってよい。他の態様において、成分1は、抗体の一部ではないポリペプチドであってよい。例えば、標的分子がメソテリンである場合、成分1は、メソテリンに結合するポリペプチドの全体もしくは一部、またはメソテリンと結合するその能力によって選択された短いペプチドであってよい。
成分2は、エフェクター細胞分子に結合し得る。それは、VH領域およびVL領域を含み得る。いくつかの態様において、成分2は、単独でエフェクター細胞分子に結合し得るVH領域またはVL領域を含み得る。これらのVH領域および/またはVL領域のいずれも、哺乳動物起源のもの、例えばヒトVH領域および/またはVL領域であってよい。あるいは、成分2は、エフェクター細胞分子に結合し得る非抗体ポリペプチドであってよい。成分2は、エフェクター細胞の表面上に発現される、タンパク質であってよい分子に結合し得る。エフェクター細胞は、例えば、T細胞、NK細胞、単球、マクロファージ、または好中球であってよい。
任意の成分である成分3は、成分1または2に結合し得るポリペプチドであって、結合した場合に、成分1または2がエフェクター細胞または標的細胞に結合するのを阻止または阻害し得るポリペプチドである。いくつかの態様において、成分3は、成分1が結合し得る標的分子または成分2が結合し得るエフェクター細胞分子の一部または全体である。例えば、エフェクター細胞がT細胞である場合、成分3は、TCRα、TCRβ、TCRδ、TCRγ、pTα、CD3β、CD3γ、CD3δ、CD3ε、またはCD3ζなどの、TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドの一部または全体であってよい。あるいは、エフェクター細胞がNK細胞または細胞傷害性T細胞である場合、成分3は、NKG2D、CD352、NKp46、またはCD16aの一部または全体であってよい。同様に、エフェクター細胞がCD8+ T細胞である場合、4-1BB、OX40、GITR、CD28、CD27、またはICOSの一部または全体が、成分3であってよい。いくつかの態様において、成分3はCD3εの一部を含む。例えば、成分3は、成熟ヒトCD3ε (SEQ ID NO:50) であってよい、または異なる種、特にカニクイザル (SEQ ID NO:51) などの上掲の哺乳動物種のうちの1つに由来するCD3εであってよいCD3εの、最初の27アミノ酸を含み得る。
成分4は、プロテアーゼ切断部位を含む。切断部位は、病原体、病原体に感染した細胞、または疾患を媒介する細胞、例えば癌細胞の物理的近傍で特異的に発現されるプロテアーゼによって切断され得る。プロテアーゼは、数ある中でもとりわけ、例えば、メタロプロテイナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP)、例えば、MMP2、MMP9、もしくはMMP11など、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、フューリン、プラスミン、またはプラスミノーゲン活性化因子(ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子 (u-PA) または組織プラスミノーゲン活性化因子 (tPA) など)、線維芽細胞活性化タンパク質α (FAPα) であってよい。
、およびAAAが含まれる。
半減期延長部分は、例えば、Fcポリペプチド、アルブミン、アルブミン断片、アルブミンもしくは胎児性Fc受容体 (FcRn) に結合する部分、アルブミンもしくはその断片に結合するように操作されたフィブロネクチンの誘導体、ペプチド、単一ドメインタンパク質断片、または血清中半減期を増大させ得る他のポリペプチドであってよい。代替の態様において、半減期延長部分は、例えばポリエチレングリコール (PEG) などの非ポリペプチド分子であってよい。使用され得るヒトIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4 Fcポリペプチドの配列は、SEQ ID NO:84〜87に提供される。1つもしくは複数のヘテロ二量体化改変、半減期を延長する1つもしくは複数のFc改変、ADCCを増強する1つもしくは複数の改変、および/またはFcγ受容体 (FcγR) 結合を阻害する1つもしくは複数の改変を含有するこれらの配列の変種もまた、配列のアミノ酸100個あたり10個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入、または置換を含有する他の近縁変種として企図される。
図2は、本明細書において記載されるPABPの例の略図である。「VH1」および「VL1」と表示される楕円形は、疾患媒介細胞上に発現される標的分子、例えば癌細胞抗原、または感染細胞もしくは病原体上に発現される標的分子に共に結合し得る重鎖および軽鎖可変(VHおよびVL)領域を表す。示されるように、VH1およびVL1は、図1に関連して上記で考察された成分1を共に構成する。示されるように、「VH2」および「VL2」と表示される楕円形は、共にCD3εに結合し得、かつ成分2を構成するVH領域およびVL領域を表す。「CD3ε」と表示される、より小さな楕円形は、VH2およびVL2が結合するCD3εの一部を表し、したがって上記で定義された成分3を構成する。成分2および3に関連して上記で考察されたように、成分3は、T細胞、NK細胞、単球、マクロファージ、または好中球上に発現される、CD3ε以外のタンパク質であってもよい。「4」で示される破線および矢印は、プロテアーゼ切断部位(上記で考察された成分4に相当する)を表す。他の曲線は、非切断可能なリンカーを表す。水平線によって連結された、CH2領域から上方へ伸びる直線は、ジスルフィド結合されたヒンジ領域である。「CH2」および「CH3」と表示される楕円形は、ヒンジ領域の一部または全体と併せて、半減期を延長し得るFcポリペプチド鎖を表す。示されるように、Fc領域は成分5と見なされる。
本明細書において記載されるPABPをコードする核酸が提供される。VH、VL、ヒンジ、CH1、CH2、CH3、およびCH4領域を含む免疫グロブリン領域をコードする多数の核酸配列が、当技術分野において公知である。例えば、Kabat et al. in SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD, 1991を参照されたい。本明細書において提供される指針を用いて、当業者は、そのような核酸配列および/または当技術分野において公知の他の核酸配列を組み合わせて、本明細書において記載されるPABPをコードする核酸配列を創出することができる。
本明細書において記載されるPABPは、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。例えば、PABPの2つのポリペプチド鎖をコードする核酸は、例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核酸をコーティングした微粒子を用いた微粒子銃等などの種々の公知の方法によって、培養宿主細胞中に導入することができる。いくつかの態様において、PABPをコードする核酸は、宿主細胞中に導入される前に、宿主細胞における発現に適切なベクター中に挿入することができる。典型的には、そのようなベクターは、挿入された核酸の発現をRNAおよびタンパク質レベルで可能にする配列エレメントを含有し得る。そのようなベクターは、当技術分野において周知であり、多くが市販されている。核酸を含有する宿主細胞は、細胞による核酸の発現を可能にするような条件下で培養することができ、結果として得られたPABPは、細胞集団または培養液から収集することができる。あるいは、PABPは、インビボで、例えば、植物の葉(例えば、Scheller et al. (2001), Nature Biotechnol. 19: 573-577、およびその中に引用された参考文献を参照されたい)、鳥の卵(例えば、Zhu et al. (2005), Nature Biotechnol. 23: 1159-1169、およびその中に引用された参考文献を参照されたい)、または哺乳動物の乳汁(例えば、Laible et al. (2012), Reprod. Fertil. Dev. 25(1): 315を参照されたい)の中で生成することができる。
本明細書において記載されるPABPは、例えば、様々な形態の癌、感染症、線維性疾患、および/または自己免疫もしくは炎症状態を含む、多種多様な状態を処置するために使用することができる。
PABPは、成熟ヒトCD3εのアミノ酸1〜27をコードするDNAに加えて、リンカー、すなわち (G4S)3、および/またはプロテアーゼ切断部位を既存のDNA構築物に導入することにより作製した。例えば、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbodyの場合、既存のDNA構築物は、SEQ ID NO:6および93のアミノ酸配列を含む二重特異性タンパク質(aCD3-aHER2-Xbodyと称される)をコードし、これは国際出願PCT/US/2014/026658に記載されており、その関連部分は参照により本明細書に組み入れられる。CD3ε断片ならびにリンカーおよび/またはプロテアーゼ切断部位を含む挿入物は、適切なプライマーを用いてPCRにより導入し、構築物は、Gibson et al. (2009), Nature Methods 6(5): 343-343に説明されているようにGibsonアッセンブリーによって完成させた。この方法がどのように実施されるのかを説明しているこの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み入れられる。簡潔に説明すると、末端上に重複配列を有する二本鎖DNA断片を、T5エキソヌクレアーゼ(二本鎖DNAを5'末端側から後退させる)、PHUSION(登録商標)DNAポリメラーゼ (New England Biolabs)、およびTaqリガーゼと共に50℃でインキュベートし、その後これを用いて大腸菌を形質転換し、所望の配列を有するDNA構築物を含有するコロニーを得た。
MMP-2による様々なPABPの切断を評価するため、アッセイしようとするタンパク質を、30μM ZnCl2を含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で100 ng/μlに希釈した。PABPを含有する溶液20μl(2000 ngを含有する)に、MMP-2プロテアーゼ (Calbiochem (Cat#PF023)) を添加し(0.1 mg/mlで0.5μl)、37℃で一晩インキュベートした。その後、プロテアーゼ反応物(0.5 ul (50ng))からの消化タンパク質、それに加えて非消化タンパク質を、NUPAGE(登録商標)NOVEX(登録商標) 4〜12% Bis-Trisゲル(Life Technologies、Grand Island, New York)に負荷し、MES緩衝液で還元条件下にて泳動した。ウェスタンブロットによりゲルを転写し、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 結合抗ヒトFc抗体を用いて二重特異性タンパク質を検出した。
以下の実験では、図3に図示される一般式を有する、プロテアーゼ消化PABPおよびプロテアーゼ未消化PABPの、インビトロ細胞溶解活性(T細胞依存性細胞溶解 (TDCC))、およびT細胞を活性化するそれらの能力(CD25の発現として測定)を試験した。
図4に示される一般構造を有する抗HER2/CD3 PABPのTDCCアッセイおよびT細胞活性化アッセイもまた実施した。これらのPABPは、CD3ε断片と分子の残りの部分との間のリンカーを除いて同一のアミノ酸配列を有し、これらのPABPには以下のものが含まれた:CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb(MMP2切断部位を伴うリンカーを含む)、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxb(異なるMMP2切断部位を伴うリンカーを含む)、CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxb(フューリン切断部位を伴うリンカーを含む)、およびCD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb(非切断可能リンカーを含む)。結果を図12Aおよび12Bに示す。
図2に図示される形式を有するPABPを、T細胞への結合およびTDCCアッセイにおける活性について試験した。細胞溶解活性は、標的細胞が、細胞1個当たり約181,000分子のHER2タンパク質を発現するJIMT-1細胞であることを除いて、実施例3に記載されるように決定した。T細胞への結合は、蛍光活性化細胞選別 (FACS) 解析によって評価した。
SEQ ID NO:1 MMP-2切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:2 MMP-2切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:3 MMP-2切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:4 フューリン切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:5 フューリン切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:6 aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbody、CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbody、またはCD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbodyの第1ポリペプチド鎖のアミノ酸配列(シグナル配列を含む)
SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:6をコードする核酸配列
SEQ ID NO:8 CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列(シグナル配列を含む)
SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:8をコードする核酸配列
SEQ ID NO:10 CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:10をコードする核酸配列
SEQ ID NO:12 CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:12をコードする核酸配列
SEQ ID NO:14 CD3ε(1-27)-MMP-2csV3-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:14をコードする核酸配列
SEQ ID NO:16 CD3ε(1-27)-フューリンcsV1-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:16をコードする核酸配列
SEQ ID NO:18 CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:18をコードする核酸配列
SEQ ID NO:20 aCD3-aHER2-mxb、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxb、CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxb、CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxbの第1ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:20をコードする核酸配列
SEQ ID NO:22 CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:22をコードする核酸配列
SEQ ID NO:24 CD3ε(1-27)-MMP-2csV1-aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:24をコードする核酸
SEQ ID NO:26 CD3ε(1-27)-MMP-2csV2-aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:26をコードする核酸配列
SEQ ID NO:28 CD3ε(1-27)-フューリンcsV2-aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:28をコードする核酸配列
SEQ ID NO:30 aCD3-aHER2-Bi-Fc、CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Bi-Fc、CD3ε(1-27)-MMP-2cs-aCD3-aHER2-Bi-Fc、およびCD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-Bi-Fcの第1ポリペプチド鎖のアミノ酸配列(シグナル配列を伴う)
SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:30をコードする核酸配列
SEQ ID NO:32 aCD3-aHER2-Bi-Fcの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列(シグナル配列を伴う)
SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:32をコードする核酸配列
SEQ ID NO:34 CD3ε(1-27)-aCD3-aHER2-Bi-Fcの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列(シグナル配列を伴う)
SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:34をコードする核酸配列
SEQ ID NO:36 CD3ε(1-27)-MMP-2cs-aCD3-aHER2-Bi-Fcの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列(シグナル配列を伴う)
SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:36をコードする核酸配列
SEQ ID NO:38 CD3ε(1-27)-フューリンcs-aCD3-aHER2-Bi-Fcの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列(シグナル配列を伴う)
SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:38をコードする核酸配列
SEQ ID NO:40 抗CD3ε VH領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:40をコードする核酸配列
SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:40の重鎖CDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:40の重鎖CDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:40の重鎖CDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO:45 抗CD3ε VL領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:45をコードする核酸配列
SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:45の軽鎖CDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:45の軽鎖CDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:45の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO:50 成熟ヒトCD3εのアミノ酸配列
SEQ ID NO:51 カニクイザルの成熟CD3εのアミノ酸配列
SEQ ID NO:52 ヒトCD3εの細胞外ドメインのアミノ酸配列
SEQ ID NO:53 ヒトCD3εのアミノ酸1〜27
SEQ ID NO:54 ヒトCD3ε由来のペプチド配列
SEQ ID NO:55 メプリンαまたはメプリンβ切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:56 メプリンαまたはメプリンβ切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:57 メプリンαまたはメプリンβ切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:58 メプリンαまたはメプリンβ切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:59 u-PA切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:60 u-PA切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:61 u-PA切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:62 u-PA切断部位のアミノ酸配列
SGRSS
SEQ ID NO:63 u-PA切断部位のアミノ酸配列
SGRRA
SEQ ID NO:64 u-PA切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:65 u-PA切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:66 tPA切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:67 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:68 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:69 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:70 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:71 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:72 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:73 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:74 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:75 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
LAAANP
SEQ ID NO:76 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:77 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:78 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:79 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:80 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:81 カテプシンB切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:82 フューリン切断部位のアミノ酸配列
SEQ ID NO:83 ヒトフィブロネクチンの断片のアミノ酸配列
SEQ ID NO:84 ヒトIgG1 Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:85 ヒトIgG2 Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:86 ヒトIgG3 Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:87 ヒトIgG4 Fcポリペプチド鎖のアミノ酸配列
SEQ ID NO:88 リンカーのアミノ酸配列
(式中、nは1〜10の任意の整数である)
SEQ ID NO:89 リンカーのアミノ酸配列
SEQ ID NO:90 リンカーのアミノ酸配列
SEQ ID NO:91 リンカーのアミノ酸配列
SEQ ID NO:92 リンカーのアミノ酸配列
SEQ ID NO:93 aCD3-aHER2-Xbodyの第2ポリペプチドのアミノ酸配列(シグナル配列を含まない)
SEQ ID NO:94 aCD3-aHER2-mxbの第2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
[1]
(a) 標的細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第1対(VH1およびVL1)を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(b) エフェクター細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第2対(VH2およびVL2)を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(c) 第3ポリペプチド;ならびに
(d) (c) の第3ポリペプチドをタンパク質の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカー
を含むタンパク質であって、
該タンパク質の第1ポリペプチド鎖が、式:VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-X1を有するアミノ酸配列を含み、式中、L1、L2、およびL3がリンカーであり、L3は存在してもよくまたは存在しなくてもよく、X1が半減期延長部分であり、
該タンパク質の第2ポリペプチド鎖が、式:Y-L4-X2を有するアミノ酸配列を含み、式中、Yが (c) のポリペプチドであり、L4が (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、X2が半減期延長部分であり、かつ
プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合には、プロテアーゼ切断部位が切断されない場合に観察される結合と比較して、該タンパク質がより効果的に標的細胞に結合するか、またはより効果的にエフェクター細胞に結合するかのいずれかである、
前記タンパク質。
[2]
(c) の第3ポリペプチドが、前記タンパク質のエフェクター細胞への結合を阻害する、[1]のタンパク質。
[3]
(a) 標的細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第1対(VH1およびVL1)を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(b) エフェクター細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第2対(VH2およびVL2)を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(c) 細胞の細胞溶解アッセイにおけるタンパク質の細胞溶解活性を阻害する第3ポリペプチド;ならびに
(d) (c) の第3ポリペプチドをタンパク質の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカー
を含むタンパク質であって、
該タンパク質の第1ポリペプチド鎖が、式:VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-X1を有するアミノ酸配列を含み、式中、L1、L2、およびL3がリンカーであり、L3は存在してもよくまたは存在しなくてもよく、X1が半減期延長部分であり、
該タンパク質の第2ポリペプチド鎖が、式:Y-L4-X2を有するアミノ酸配列を含み、式中、Yが (c) のポリペプチドであり、L4が (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、X2が半減期延長部分であり、かつ
プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合の、細胞の細胞溶解アッセイにおける該タンパク質のE C 50が、プロテアーゼ切断部位が切断されていない場合の、同じアッセイにおける該タンパク質のE C 50の1/5以下である、
前記タンパク質。
[4]
エフェクター細胞がT細胞である、[1]〜[3]のいずれかのタンパク質。
[5]
エフェクター細胞がNK細胞である、[1]〜[3]のいずれかのタンパク質。
[6]
VH2およびVL2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドに結合する、[4]のタンパク質。
[7]
TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドがヒトCD3εである、[6]のタンパク質。
[8]
VH2が、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含み、VL2が、それぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、[7]のタンパク質。
[9]
VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含む、[8]のタンパク質。
[10]
プロテアーゼ切断可能部位が、MMP-2、MMP-9、またはMMP-11によって切断され得る、[1]〜[9]のいずれかのタンパク質。
[11]
プロテアーゼ切断可能部位が、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、[10]のタンパク質。
[12]
X1およびX2がFcポリペプチド鎖である、前記[1]〜[11]のいずれかのタンパク質。
[13]
第1ポリペプチド鎖がSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含み、第2ポリペプチド鎖がSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む、[12]のタンパク質。
[14]
標的細胞が癌細胞である、前記[1]〜[13]のいずれかのタンパク質。
[15]
VH1およびVL1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、以下のタンパク質:上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) のうちの1つに結合する、[14]のタンパク質。
[16]
以下のポリペプチド鎖の対:
(a) (i) 次式:VH1-CH1-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断可能部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式:VL1-CL-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびVL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーである、第2ポリペプチド鎖、または
(b) (i) 次式:VH1-CH1-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式:VL1-CL-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖、または
(c) (i) 次式:VL1-CL-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびV2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式:VH1-CH1-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2が重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖、または
(d) (i) 次式:VL1-CL-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL1が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断可能リンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式:VH1-CH1-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH1が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖
のうちの1つを含むタンパク質であって、
VL1およびVH1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合し、VL2およびVH2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する、
前記タンパク質。
[17]
エフェクター細胞がT細胞である、[16]のタンパク質。
[18]
VH2およびVL2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるタンパク質に結合する、[17]のタンパク質。
[19]
VH2およびVL2がヒトCD3εに結合する、[17]のタンパク質。
[20]
VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにそれぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、[19]のタンパク質。
[21]
VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含む、[20]のタンパク質。
[22]
プロテアーゼ切断部位が、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、[16]〜[21]のいずれかのタンパク質。
[23]
標的細胞が癌細胞である、[16]〜[22]のいずれかのタンパク質。
[24]
VH1およびVL1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) に結合する、[23]のタンパク質。
[25]
[1]〜[24]のいずれかのタンパク質のいずれかをコードする核酸。
[26]
[25]の核酸を含有するベクター。
[27]
[26]の核酸を含有する宿主細胞。
[28]
[1]〜[24]のいずれかのタンパク質を作製する方法であって、
該タンパク質が発現されるような条件下で、該タンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞を培養する段階、および
培養液または細胞集団から該タンパク質を回収する段階
を含む、前記方法。
[29]
[1]〜[24]のいずれかのタンパク質の治療有効用量を投与する段階を含む、癌患者を処置するための方法。
[30]
前記タンパク質の前に、後に、またはそれと同時に、放射線照射、化学療法剤、および/または非化学療法的抗新生物剤を投与する段階をさらに含む、[29]の方法。
[31]
患者の癌細胞が、プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼを発現する、[29]または[30]の方法。
[32]
[1]〜[12]および[16]〜[22]のいずれかのタンパク質の治療有効用量を投与する段階を含む、感染症、線維性疾患、神経変性疾患、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に罹患している患者を処置するための方法。
Claims (32)
- (a) 標的細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第1対(VH1およびVL1)を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(b) エフェクター細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第2対(VH2およびVL2)を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(c) 第3ポリペプチド;ならびに
(d) (c) の第3ポリペプチドをタンパク質の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカー
を含むタンパク質であって、
該タンパク質の第1ポリペプチド鎖が、式:VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-X1を有するアミノ酸配列を含み、式中、L1、L2、およびL3がリンカーであり、L3は存在してもよくまたは存在しなくてもよく、X1が半減期延長部分であり、
該タンパク質の第2ポリペプチド鎖が、式:Y-L4-X2を有するアミノ酸配列を含み、式中、Yが (c) のポリペプチドであり、L4が (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、X2が半減期延長部分であり、かつ
プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合には、プロテアーゼ切断部位が切断されない場合に観察される結合と比較して、該タンパク質がより効果的に標的細胞に結合するか、またはより効果的にエフェクター細胞に結合するかのいずれかである、
前記タンパク質。 - (c) の第3ポリペプチドが、前記タンパク質のエフェクター細胞への結合を阻害する、請求項1記載のタンパク質。
- (a) 標的細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第1対(VH1およびVL1)を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(b) エフェクター細胞に結合し、かつIgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第2対(VH2およびVL2)を含む、1つまたは複数のポリペプチド鎖、
(c) 細胞の細胞溶解アッセイにおけるタンパク質の細胞溶解活性を阻害する第3ポリペプチド;ならびに
(d) (c) の第3ポリペプチドをタンパク質の残りの部分に連結する、プロテアーゼ切断部位を含むリンカー
を含むタンパク質であって、
該タンパク質の第1ポリペプチド鎖が、式:VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-X1を有するアミノ酸配列を含み、式中、L1、L2、およびL3がリンカーであり、L3は存在してもよくまたは存在しなくてもよく、X1が半減期延長部分であり、
該タンパク質の第2ポリペプチド鎖が、式:Y-L4-X2を有するアミノ酸配列を含み、式中、Yが (c) のポリペプチドであり、L4が (d) のプロテアーゼ切断部位を含むリンカーであり、X2が半減期延長部分であり、かつ
プロテアーゼ切断部位が本質的に完全に切断される場合の、細胞の細胞溶解アッセイにおける該タンパク質のEC50が、プロテアーゼ切断部位が切断されていない場合の、同じアッセイにおける該タンパク質のEC50の1/5以下である、
前記タンパク質。 - エフェクター細胞がT細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載のタンパク質。
- エフェクター細胞がNK細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載のタンパク質。
- VH2およびVL2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドに結合する、請求項4記載のタンパク質。
- TCR-CD3複合体の一部であるポリペプチドがヒトCD3εである、請求項6記載のタンパク質。
- VH2が、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含み、VL2が、それぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、請求項7記載のタンパク質。
- VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含む、請求項8記載のタンパク質。
- プロテアーゼ切断可能部位が、MMP-2、MMP-9、またはMMP-11によって切断され得る、請求項1〜9のいずれか一項記載のタンパク質。
- X1およびX2がFcポリペプチド鎖である、前記請求項のいずれか一項記載のタンパク質。
- 第1ポリペプチド鎖がSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含み、第2ポリペプチド鎖がSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む、請求項12記載のタンパク質。
- 標的細胞が癌細胞である、前記請求項のいずれか一項記載のタンパク質。
- VH1およびVL1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、以下のタンパク質:上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) のうちの1つに結合する、請求項14記載のタンパク質。
- 以下のポリペプチド鎖の対:
(a) (i) 次式:VH1-CH1-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断可能部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式:VL1-CL-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびVL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーである、第2ポリペプチド鎖、または
(b) (i) 次式:VH1-CH1-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH1が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式:VL1-CL-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL1が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖、または
(c) (i) 次式:VL1-CL-L1-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VL1およびV2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断部位を含むリンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式:VH1-CH1-L2-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VH1およびVH2が重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖、または
(d) (i) 次式:VL1-CL-L1-VH2-CH1を有するアミノ酸配列を含む第1ポリペプチド鎖であって、式中、VH2が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、VL1が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域であり、L1がプロテアーゼ切断可能リンカーである、第1ポリペプチド鎖、ならびに
(ii) 次式:VH1-CH1-L2-VL2-CLを有するアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド鎖であって、式中、VL2が免疫グロブリン軽鎖可変領域であり、VH1が免疫グロブリン重鎖可変領域であり、L2がプロテアーゼ切断部位を含有しないリンカーであり、CH1が第1重鎖定常領域であり、CLが軽鎖定常領域である、第2ポリペプチド鎖
のうちの1つを含むタンパク質であって、
VL1およびVH1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に標的細胞に結合し、VL2およびVH2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合にエフェクター細胞に結合する、
前記タンパク質。 - エフェクター細胞がT細胞である、請求項16記載のタンパク質。
- VH2およびVL2が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、TCR-CD3複合体の一部であるタンパク質に結合する、請求項17記載のタンパク質。
- VH2およびVL2がヒトCD3εに結合する、請求項17記載のタンパク質。
- VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 42、43、および44のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにそれぞれSEQ ID NO: 47、48、および49のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、請求項19記載のタンパク質。
- VH2およびVL2が、それぞれSEQ ID NO: 40および45のアミノ酸配列を含む、請求項20記載のタンパク質。
- 標的細胞が癌細胞である、請求項16〜22のいずれか一項記載のタンパク質。
- VH1およびVL1が、IgGまたはscFv抗体の一部である場合に、上皮成長因子受容体 (EGFR)、EGFRvIII、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、メソテリン (MSLN)、葉酸受容体1 (FOLR1)、CD33、CDH19、または上皮成長因子2 (HER2) に結合する、請求項23記載のタンパク質。
- 請求項1〜24のいずれか一項記載のタンパク質のいずれかをコードする核酸。
- 請求項25記載の核酸を含有するベクター。
- 請求項26記載の核酸を含有する宿主細胞。
- 請求項1〜24のいずれか一項記載のタンパク質を作製する方法であって、
該タンパク質が発現されるような条件下で、該タンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞を培養する段階、および
培養液または細胞集団から該タンパク質を回収する段階
を含む、前記方法。 - 請求項1〜24のいずれか一項記載のタンパク質の治療有効用量を投与する段階を含む、癌患者を処置するための方法。
- 前記タンパク質の前に、後に、またはそれと同時に、放射線照射、化学療法剤、および/または非化学療法的抗新生物剤を投与する段階をさらに含む、請求項29記載の方法。
- 患者の癌細胞が、プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼを発現する、請求項29または30記載の方法。
- 請求項1〜12および16〜22のいずれか一項記載のタンパク質の治療有効用量を投与する段階を含む、感染症、線維性疾患、神経変性疾患、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に罹患している患者を処置するための方法。
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