JP2020186249A - 心疾患の処置のための組成物及び方法 - Google Patents

心疾患の処置のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

【課題】心疾患を処置及び／又は改善する組成物及び方法の提供。【解決手段】複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物であって、前記複数のｍｉＲアンタゴニストは、１つ以上のｍｉＲ−９９ａ−５ｐアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニスト及び１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストを含む、対象における心筋再生を促進するため又は対象における心疾患を処置するための組成物。【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６３，５１２
号及び２０１６年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４１９，８５２号に対
する優先権の利益を主張する。上記参照出願の開示は、それらの全体が、任意の図面を含
む本明細書に参照により明確に組み込まれる。
連邦政府支援による研究開発に関する陳述
本出願は、一部は、アメリカ国立衛生研究所の国立心肺血液研究所（National Heart,
Lung, And Blood Institute）によって授与された認可番号Ｒ４１ＨＬ１３４３８７及び
認可番号１２２３３０２７下での政府支援によりなされたものである。政府は、本発明に
ある特定の権利を有する。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０１７年７月５日作成
された、約５９ＫＢのサイズの「配列表ＪＡＡＮＢ００１ＷＯ（Sequence＿Listing＿JAA
NB001WO）」との表題のファイルとして提供する。電子形式の配列表情報は、その全体が
参照により本明細書に明確に組み込まれる。
本出願の態様は、生化学及び医薬の分野に関する。より詳細には、新規なマイクロＲＮ
Ａアンタゴニスト、１つ以上のそのようなマイクロＲＮＡアンタゴニストを含む治療用組
成物、並びにそのようなマイクロＲＮＡアンタゴニストを用いて心疾患及び／又は筋ジス
トロフィー障害を処置及び／又は改善する方法が、本明細書に開示される。本明細書に開
示される治療用組成物及び追加の治療剤を、心筋の再生が必要である心疾患及び／又は筋
ジストロフィー障害を有するか又は疑われる対象に付与する、併用療法も含まれる。
心疾患は、心筋の再生が必要である、心筋症、心筋梗塞、及び虚血性心疾患を含むがこ
れらの限定されない障害のファミリーを包含する。虚血性心疾患は、先進工業社会での罹
患及び死亡の主な原因である。心疾患範囲内の障害は、心筋細胞などの異なる細胞型の病
理変化から、一連の複雑な生化学的経路の変更を介して生じると理解される。例えば、心
疾患と関連するある特定の病理変化は、心筋細胞肥大を引き起こす心筋細胞遺伝子発現の
変更、並びに心筋細胞の生存及び収縮が損なわれることが原因であり得る。したがって、
心疾患処置の開発における継続中の課題は、例えば、心臓内の内因性心筋細胞の分裂を促
して損傷した心筋を修復することにより、様々な種類の心疾患に好適な効果的な治療薬を
同定することである。
筋ジストロフィー（muscular dystrophies、ＭＤ）は、３０を超える遺伝子疾患群であ
り、運動を制御する骨格筋の進行性の筋力低下及び変性によって特徴付けられる。ＭＤの
いくつかの形態は幼少期又は小児期で見られるが、他の形態は中年以降まで現れないこと
もあり得る。この障害は、筋力低下の分布と程度（ＭＤのいくつかの形態はまた、心筋に
影響を及ぼす）、発症年齢、進行度、及び遺伝形式の点で相違がある。
特に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne muscular dystrophy、ＤＭＤ）は
、最も広く行き渡った遺伝性の神経筋障害のうちの１つである。ＤＭＤは、ジストロフィ
ン遺伝子の突然変異によって引き起こされ、骨格及び心筋の変性をもたらし、その後に線
維化を伴う、ジストロフィンタンパク質の欠損に起因する進行性の筋力低下及び筋消耗に
よって特徴付けられる。ＤＭＤである人の一般的な死因は、心筋症及び心不全である。現
在利用可能な処置を行わなくても、ＤＭＤ患者の筋変性を予防する安全かつ有効な治療が
必要とされている。ヒト成人筋細胞が再生できないことが、ＤＭＤにおける主要な臨床的
問題となっている。これは、心筋再生を首尾よく刺激するために投与することができる薬
理学的な又は細胞性の補助処置を欠くと、より悪化する。現在、ヒトジストロフィンタン
パク質を完全に回復するＤＭＤのための治療は存在しない。早死となる予後不良を有する
患者では、新たな処置手法を開発することについて、深刻なまだ満たされていない医療ニ
ーズが存在する。
この項目は、本開示の一般的な概要を提供し、本開示の全範囲又はその特徴の全てを包
括するものではない。
本開示は一般的に、心疾患及び／又は筋ジストロフィー疾患を処置するための組成物及
び方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、ｍｉＲ−９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１００
−５ｐ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを含む、関心のあるいくつかのマイク
ロＲＮＡを特異的に標的化するアンタゴニストの治療及び送達システムの設計に関する。
一態様において、本明細書に開示される組成物及び方法は、心筋の再生、及び心筋再生が
必要である、例えば心筋梗塞又は任意の心外傷などの心疾患の処置を可能にする。いかな
る特定の理論にも拘束されるものではないが、損傷した心筋細胞の再生により、心臓発作
後に心筋の虚血傷害の逆転が起こり得ると考えられる。
一態様において、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−１０
０−５ｐアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニスト、及び
１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストを含む、複数のマイクロＲＮＡ（
microRNA、ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物の実施形態を本明細書に開示する。本発
明のこの態様及び他の態様に従った組成物の実施形態の実施は、以下の特徴のうちの１つ
以上を含むことができる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニストのうちの少な
くとも１つは、配列番号４７、４８、５０、５２、及び５４からなる群から選択されるヌ
クレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、
９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−９９ａを含
む。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニストのう
ちの少なくとも１つは、配列番号４６、４９、５１、５３及び５５からなる群から選択さ
れるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９
８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−１０
０−５ｐを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴ
ニストのうちの少なくとも１つは、配列番号３７、３９及び４０〜４５からなる群から選
択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７
、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−
Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５
ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号３６、３８及び４０〜４５からな
る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９
６％、９７、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む
抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニストのうちの少な
くとも１つは、配列番号４７、４８、５０、５２及び５４からなる群から選択される配列
に関して１つ以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−９
９ａを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニ
ストのうちの少なくとも１つは、配列番号４６、４９、５１、５３及び５５からなる群か
ら選択される配列に関して１つ以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を
含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＬｅｔ−
７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号３７、３９及び４０〜４
５からなる群から選択される配列に関して１つ以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌク
レオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含む。いくつかの実施形態において
、１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号３
６、３８及び４０〜４５からなる群から選択される配列に関して１つ以上のミスマッチの
核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを含む。
本明細書で開示される組成物の様々な実施形態において、抗ｍｉＲのうちの少なくとも
１つは、修飾ヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド、及び修飾糖部分、並びにそれらの
組み合わせからなる群から選択される１つ以上の化学修飾を含む。いくつかの実施形態に
おいて、１つ以上の化学修飾は、修飾ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態に
おいて、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メトキシエチル（
ＭＯＥ）、２’−フルオロ、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホ
スホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸トリエス
テル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル及びそれらの組み合わせからなる群
から選択される。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチ
オエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の化学修飾
のうちの少なくとも１つは、修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、修
飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）化学修飾、ペプチド
核酸（peptide nucleic acid、ＰＮＡ）、アラビノ核酸（arabino-nucleic acid、ＦＡＮ
Ａ）、それらの類似体、誘導体又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態にお
いて、修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの実施形態におい
て、ロックド核酸（ＬＮＡ）は、修飾抗ｍｉＲの一端又は両端において組み込まれている
。いくつかの実施形態において、１つ以上の化学修飾のうちの少なくとも１つは、修飾糖
部分を含む。いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、２’−Ｏ−メトキシエチル修
飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分、二環式糖部分又
はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、２’−Ｏ−
メチル糖部分を含む。本明細書で開示される組成物のいくつかの実施形態において、本組
成物は、更に薬学的製剤に製剤化される。
一態様において、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−１０
０−５ｐアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニスト、及び
１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を
含む発現カセットの実施形態が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、
１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号４７、４
８、５０、５２及び５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％
、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を
有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−９９ａを含む。いくつかの実施形態において、
１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号４
６、４９、５１、５３及び５５からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも
８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％又は１００％の配列同
一性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを含む。いくつかの実施形
態において、１つ以上のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、
配列番号３７、３９及び４０〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なく
とも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％又は１００％の配
列同一性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含む。いくつ
かの実施形態において、１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくと
も１つは、配列番号３６、３８、及び４０〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド
配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％又は
１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを
含む。
本明細書に開示される発現カセットの様々な実施形態において、以下のうちの１つ以上
が適用される。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニスト
のうちの少なくとも１つは、配列番号４７、４８、５０、５２及び５４からなる群から選
択される配列に関して１つ以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む
抗ｍｉＲ−９９ａを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−１００−５
ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号４６、４９、５１、５３及び５５
からなる群から選択される配列に関して１つ以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレ
オチド配列を含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを含む。いくつかの実施形態において、１つ以
上のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号３７、３９
及び４０〜４５からなる群から選択される配列に関して１つ以上のミスマッチの核酸塩基
を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含む。いくつかの実施
形態において、１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは
、配列番号３６、３８及び４０〜４５からなる群から選択される配列に関して１つ以上の
ミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを
含む。
本明細書に開示される発現カセットの様々な実施形態において、以下のうちの１つ以上
が適用される。いくつかの実施形態において、抗ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、修飾
ヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド、及び修飾糖部分、並びにそれらの組み合わせか
らなる群から選択される１つ以上の化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、１つ
以上の化学修飾は、修飾ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、修飾
ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、２
’−フルオロ、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエ
ート、ホスホロアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸トリエステル、アセト
アミデート、カルボキシメチルエステル及びそれらの組み合わせからなる群から選択され
る。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌク
レオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の化学修飾のうちの少な
くとも１つは、修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチ
ドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）化学修飾、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アラビノ核酸（ＦＡ
ＮＡ）、それらの類似体、誘導体又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態に
おいて、修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの実施形態にお
いて、ロックド核酸（ＬＮＡ）は、修飾抗ｍｉＲの一端又は両端において組み込まれてい
る。いくつかの実施形態において、１つ以上の化学修飾のうちの少なくとも１つは、修飾
糖部分を含む。いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、２’−Ｏ−メトキシエチル
修飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分、二環式糖部分
又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、２’−Ｏ
−メチル糖部分を含む。いくつかの実施形態において、本態様に従う組成物は、薬学的組
成物である。
一態様において、本出願のいくつかの実施形態は、本明細書に開示されるような発現カ
セットを含むクローニングベクター又は発現ベクターに関する。いくつかの実施形態にお
いて、本明細書に開示されるクローニングベクター又は発現ベクターは、１つ以上のｍｉ
Ｒ−９９ａアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニスト、１つ以上
のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニスト、及び１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−
５ｐアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。いくつか
の実施形態において、クローニングベクター又は発現ベクターは、ウイルスベクターであ
る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター又はア
デノ随伴ウイルス（adeno−associated viral、ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実
施形態において、本明細書に開示されるクローニングベクター又は発現ベクターは、配列
番号５９〜６４に記載のヌクレオチド配列の各々と少なくとも８０％、８５％、９０％、
９５％、９６％、９７、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド
配列を含むか、配列番号８６〜８９に記載のヌクレオチド配列の各々と少なくとも８０％
、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を
有するヌクレオチド配列を含むか、あるいはａ）及びｂ）に示される配列番号に記載のヌ
クレオチド配列の各々と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９
８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実
施形態において、本明細書中に開示されるクローニングベクター又は発現ベクターは、配
列番号８５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、
９７、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む発現カ
セットを含む。
一態様において、有効量の少なくとも１つの治療剤、並びに以下の（ａ）本明細書に開
示される複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニスト、（ｂ）本明細書に開示される
発現カセット、及び（ｃ）本明細書に開示されるクローニングベクター又は発現ベクター
のうちの１つ以上を含む、治療用組成物の実施形態が、本明細書に開示される。いくつか
の実施形態において、治療用組成物は、更に薬学的製剤に製剤化される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療剤が、イデベノン、エプレレノン
、ＶＥＣＴＴＯＲ、ＡＶＩ−４６５８、アタルレン／ＰＴＣ１２４／Ｔｒａｎｓｌａｒｎ
ａ、ＢＭＮ０４４／ＰＲＯ０４４、ＣＡＴ−１００４、マイクロジストロフィンＡＡＶ遺
伝子治療役（ＳＧＴ−００１）、ガレクチン１−治療薬（ＳＢ−００２）、ＬＴＢＢ４（
ＳＢ−００１）、ｒＡＡＶ２．５−ＣＭＶ−ミニジストロフィン、グルタミン、ＮＦＫＢ
阻害剤、サルコグリカン、デルタ（３５ｋＤａジストロフィン関連糖タンパク質）、イン
スリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され
る。いくつかの実施形態において、この態様に従う治療用組成物は、薬学的組成物である
。
一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、対象における心疾患を処置するため
の方法に関する。この方法は、心疾患の処置に好適な治療用組成物を対象に投与又は付与
することを含み、（ａ）治療用組成物が、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（
ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物であるか、（ｂ）治療用組成物が、本明細書に開示
される発現カセットを含むか、あるいは（ｃ）治療用組成物が、本明細書に開示されるク
ローニングベクター又は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、この方法は
、心疾患を有するか又は疑われる対象を同定することを更に含む。いくつかの実施形態に
おいて、心疾患は、心筋梗塞、虚血性心疾患、拡張型心筋症、心不全（例えば、鬱血性心
不全）、虚血性心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、アルコール性心筋症、ウイルス性
心筋症、頻脈誘発性心筋症、ストレス誘起性心筋症、アミロイド心筋症、不整脈源性右室
異形成、左室緻密化障害、心内膜線維弾性症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁逆流症、僧帽弁
狭窄症、僧帽弁逆流症、僧帽弁逸脱症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁逆流
症、三尖弁狭窄症、三尖弁逆流症、先天性障害、遺伝的障害又はそれらの組み合わせであ
る。
別の態様において、本開示のいくつかの実施形態は、対象における心筋再生を促進する
方法に関する。この方法は、治療用組成物を対象に投与又は付与することを含み、（ａ）
治療用組成物が、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニスト
を含む組成物であるか、（ｂ）治療用組成物が、本明細書に開示される発現カセットを含
むか、あるいは（ｃ）治療用組成物が、本明細書に開示されるクローニングベクター又は
発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、心疾患を有するか又は
疑われる対象を同定又は選択することを更に含む。いくつかの実施形態において、心疾患
は、心筋梗塞、虚血性心疾患、心不全（例えば、鬱血性心不全）、虚血性心筋症、肥大型
心筋症、拘束型心筋症、アルコール性心筋症、ウイルス性心筋症、頻脈誘発性心筋症、ス
トレス誘起性心筋症、アミロイド心筋症、不整脈源性右室異形成、左室緻密化障害、心内
膜線維弾性症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁逆流症、僧帽弁狭窄症、僧帽弁逆流症、僧帽弁
逸脱症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁逆流症、三尖弁狭窄症、三尖弁逆流
症、先天性障害、遺伝的障害又はそれらの組み合わせである。いくつかの他のある特定の
実施形態において、心疾患は、心筋再生が必要である、虚血性心疾患である。
更に別の態様において、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、心筋細胞及び／
又は筋細胞の増殖を調節する方法に関する。この方法は、（１）治療用組成物を心筋細胞
に導入することと、ここで、（ａ）治療用組成物が、本明細書に開示される複数のマイク
ロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物であるか、（ｂ）治療用組成物が、本明
細書に開示される発現カセットを含むか、あるいは（ｃ）治療用組成物が、本明細書に開
示されるクローニングベクター又は発現ベクターを含み、（２）（１）から得られる心筋
細胞の分裂を可能にし、それにより心筋細胞又は筋細胞の増殖を調節することと、を含む
。いくつかの実施形態において、心筋細胞への治療用組成物の導入は、心筋細胞及び／又
は筋細胞を、複数のｍｉＲアンタゴニストをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの
発現カセット又は少なくとも１つのウイルスベクターでトランスフェクトすることを含む
。いくつかの実施形態において、この方法は、心筋細胞及び／又は筋細胞の増殖を測定す
ることを更に含む。いくつかの実施形態において、心筋細胞及び／又は筋細胞の増殖は、
複数のｍｉＲアンタゴニストをコードする核酸配列を欠失している対照心筋細胞に比べて
増加する。いくつかの実施形態において、心筋細胞及び／又は筋肉は、インビボである。
いくつかの他の実施形態において、心筋細胞及び／又は筋肉は、エクスビボである。いく
つかの実施形態において、心筋細胞及び／又は筋肉は、ヒト対象のものである。いくつか
の実施形態において、ヒト対象は、心疾患に罹患している。
本明細書に開示される方法の実施形態の実施は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むこ
とができる。いくつかの実施形態において、複数のｍｉＲアンタゴニストは、同じ発現カ
セット又は発現ベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、複数のｍ
ｉＲアンタゴニストは、異なる発現カセット又は発現ベクターによってコードされる。い
くつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態
において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウ
イルス（ＡＡＶ）ベクターである。
いくつかの実施形態において、この方法は、併用療法のために、有効量の少なくとも１
つの追加の治療剤又は少なくとも１つの追加の治療薬を対象に投与することを更に含む。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬は、イデベノン
、エプレレノン、ＶＥＣＴＴＯＲ、ＡＶＩ−４６５８、アタルレン／ＰＴＣ１２４／Ｔｒ
ａｎｓｌａｒｎａ、ＢＭＮ０４４／ＰＲＯ０４４、ＣＡＴ−１００４、マイクロジストロ
フィンＡＡＶ遺伝子治療薬（ＳＧＴ−００１）、ガレクチン１−治療薬（ＳＢ−００２）
、ＬＴＢＢ４（ＳＢ−００１）、ｒＡＡＶ２．５−ＣＭＶ−ミニジストロフィン、グルタ
ミン、ＮＦＫＢ阻害剤、サルコグリカン、デルタ（３５ｋＤａジストロフィン関連糖タン
パク質）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）発現、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９シス
テムによるゲノム編集、機能性組換え型のヒトジストロフィン遺伝子を再導入することを
目的とした任意の遺伝子送達治療薬、エクソンスキッピング治療薬、ナンセンス突然変異
に対するリードスルー戦略、細胞ベースの治療薬、ユートロフィンアップレギュレーショ
ン、ミオスタチン阻害、抗炎症薬／抗酸化剤、機械補助装置、筋ジストロフィーのための
任意の標準的治療薬、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実
施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬は、生物学的製剤を含む。い
くつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬は、遺伝子治療薬
又は治療用遺伝子調節剤を含む。
いくつかの実施形態において、治療用組成物及び少なくとも１つの追加の治療剤又は治
療薬の各々は、別の製剤で投与される。いくつかの実施形態において、治療用組成物及び
少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬は、逐次投与される。いくつかの実施形態にお
いて、治療用組成物及び少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、同時投与される。
いくつかの実施形態において、治療用組成物及び少なくとも１つの追加の治療剤又は治療
薬が、輪番で（in rotation）投与される。いくつかの治療用組成物及び少なくとも１つ
の追加の治療剤又は治療薬は、単一製剤で一緒に投与される。
一態様において、筋ジストロフィー（ＭＤ）障害を治療するための方法の実施形態が本
明細書に開示される。この方法は、治療用組成物を対象に投与又は付与することを含み、
（ａ）治療用組成物が、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴ
ニストを含む組成物であるか、（ｂ）治療用組成物が、本明細書に開示される発現カセッ
トを含むか、あるいは（ｃ）治療用組成物が、本明細書に開示されるクローニングベクタ
ー又は発現ベクターを含み、治療用組成物の投与を、有効量の少なくとも１つの追加の治
療剤又は少なくとも１つの追加治療薬と組み合わせて行い、併用療法を提供する。いくつ
かの実施形態において、筋ジストロフィー障害は、筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic La
teral Sclerosis、ＡＬＳ）、シャルコー・マリー・トゥース病（Charcot-Marie-Tooth D
isease、ＣＭＴ）、先天性筋ジストロフィー（Congenital Muscular Dystrophy、ＣＭＤ
）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフ
ィー（Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy、ＥＤＭＤ）、遺伝性及び内分泌性ミオパチ
ー、筋肉の代謝疾患、ミトコンドリアミオパチー（Mitochondrial Myopathies、ＭＭ）、
筋強直性ジストロフィー（Myotonic Muscular Dystrophy、ＭＭＤ）、球脊髄性筋萎縮症
（Spinal-Bulbar Muscular Atrophy、ＳＢＭＡ）又はこれらの組み合わせに関連する。
心臓細胞の増殖を増加させるための、並びに／又は筋肉構造及び／若しくは機能及び／
若しくは再生に関与するタンパク質の発現及び／若しくは活性を増加させるための方法の
実施形態がまた、本明細書に開示され、この方法は、（１）治療用組成物と、ここで、（
ａ）治療用組成物が、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニ
ストを含む組成物であるか、（ｂ）治療用組成物が、本明細書に開示される発現カセット
を含むか、あるいは（ｃ）治療用組成物が、本明細書に開示されるクローニングベクター
又は発現ベクターを含む、（２）少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬と、の組み合
わせを心臓細胞に接触させるか又は投与することを含む。いくつかの実施形態において、
心臓細胞は、心臓線維芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞（vascular smo
oth muscle cells、VSMC）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、心
臓細胞は、心筋細胞及び骨格筋細胞からなる群から選択される。
標的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の発現を阻害又は低減するための方法の実施形態がまた
、本明細書に開示され、この方法は、（１）治療用組成物と、ここで、（ａ）治療用組成
物が、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成
物であるか、（ｂ）治療用組成物が、本明細書に開示される発現カセットを含むか、ある
いは（ｃ）治療用組成物が、本明細書に開示されるクローニングベクター又は発現ベクタ
ーを含む、（２）少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬と、の組み合わせを心臓細胞
に接触させるか又は投与することを含む。いくつかの実施形態において、心臓細胞は、心
臓線維芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）からなる群から選
択される。いくつかの実施形態において、心臓細胞は、心筋細胞及び骨格筋細胞からなる
群から選択される。
本開示の上記の態様に従った方法の実施形態の実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以
上を含むことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤又
は治療薬は、イデベノン、エプレレノン、ＶＥＣＴＴＯＲ、ＡＶＩ−４６５８、アタルレ
ン／ＰＴＣ１２４／Ｔｒａｎｓｌａｍａ、ＢＭＮ０４４／ＰＲＯ０４４、ＣＡＴ−１００
４、マイクロジストロフィンＡＡＶ遺伝子治療薬（ＳＧＴ−００１）、ガレクチン１−治
療薬（ＳＢ−００２）、ＬＴＢＢ４（ＳＢ−００１）、ｒＡＡＶ２．５−ＣＭＶ−ミニジ
ストロフィン、グルタミン、ＮＦＫＢ阻害剤、サルコグリカン、デルタ（３５ｋＤａジス
トロフィン関連糖タンパク質）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）発現調節剤、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集、機能性組換え型のヒトジストロフィ
ン遺伝子を再導入することを目的とした任意の遺伝子送達治療薬、エクソンスキッピング
治療薬、ナンセンス突然変異に対するリードスルー戦略、細胞ベースの治療薬、ユートロ
フィンアップレギュレーション、ミオスタチン阻害、抗炎症薬／抗酸化剤、機械補助装置
、筋ジストロフィーのための任意の標準的治療薬、及びそれらの組み合わせからなる群か
ら選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬
は、生物学的製剤を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤
又は治療薬は、遺伝子治療薬又は治療用遺伝子調節剤を含む。いくつかの実施形態におい
て、治療用組成物及び少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬の各々は、別の製剤で投
与される。いくつかの実施形態において、治療用組成物及び少なくとも１つの追加の治療
剤又は治療薬は、逐次投与される。いくつかの実施形態において、治療用組成物及び少な
くとも１つの追加の治療剤又は治療薬は、同時投与される。いくつかの実施形態において
、治療用組成物及び少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬は、輪番で投与される。い
くつかの治療用組成物及び少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬は、単一製剤で一緒
に投与される。
本明細書の開示は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニストを更に含む。いくつかの
実施形態において、ｍｉＲアンタゴニストは、（ａ）配列番号４７、４８、５０、５２、
及び５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０
％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有するヌク
レオチド配列、（ｂ）配列番号４６、４９、５１、５３、及び５５からなる群から選択さ
れるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９
８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号
３７、３９、及び４０〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８
０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％若しくは１００％の配列
同一性を有するヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号３６、３８、及び４０〜４５から
なる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、
９６％、９７、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含む。
上記の概要は単なる例示であって、決して限定することを意図するものではない。本明
細書に記載の例示的実施形態及び特徴に加えて、本開示の更なる態様、実施形態、目的及
び特徴は、図面及び発明の詳細説明並びに特許請求の範囲から十分に明らかになるであろ
う。
Ｈ１プロモーター及びＵ６プロモーターの制御下でＬｅｔ−７ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９９ａ−５ｐ阻害配列をそれぞれ発現する修飾ヘアピンＺｉｐ構築物をコードするヌクレオチド配列を含む、非限定的で例示的なクローニングベクター設計の略図である。この例示的な実施形態において、ベクターはまた、Ｈ１プロモーター及びＵ６プロモーターの制御下でＬｅｔ−７ｃ−５ｐ及びｍｉＲ−１００−５ｐ阻害配列をそれぞれ発現するヌクレオチド配列を含む。 心臓ＭＲＩ画像化実験の結果の概要を写真で示し、ここでは、対照ＧＦＰウイルス（図２Ａ）対ＪＢＴ−ｍｉＲ１（図２Ｂ）の心臓ＭＲＩ画像により、ＧＦＰを発現するウイルスと比較した場合、ＪＢＴ−ｍｉＲ１の心臓内注射の３週間後において、永久ＬＡＤ結紮を有するＣｄ１のマウスの左室（Left Ventricle、ＬＶ）の遅延ガドリニウム造影が低減することが観察された。 心臓ＭＲＩ画像化実験の結果の概要を写真で示し、ここでは、対照ＧＦＰウイルス（図２Ａ）対ＪＢＴ−ｍｉＲ１（図２Ｂ）の心臓ＭＲＩ画像により、ＧＦＰを発現するウイルスと比較した場合、ＪＢＴ−ｍｉＲ１の心臓内注射の３週間後において、永久ＬＡＤ結紮を有するＣｄ１のマウスの左室（Left Ventricle、ＬＶ）の遅延ガドリニウム造影が低減することが観察された。 非限定的で例示的な、ホタルレポーター遺伝子を含有するｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼｍｉＲＮＡ発現レポーターベクターを図示する。 非限定的で例示的な、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含むｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ β−ガラクトシダーゼ発現レポーターベクターを図示する。 Ｈｅｌａ細胞で行われた実験結果の概略を図示し、Ｈｅｌａ細胞内の内因性ｍｉＲ（Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ）が、以下の実施例５に記載されるそれぞれのＬＵＣレポーター構築物に結合し、ルシフェラーゼ活性を抑制することができることを実証している。 Ｈｅｌａ細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１１１、ＪＲＸ０１１２、ＪＲＸ０１１４、ＪＲＸ０１１６、ＪＲＸ０１１８ ｍｉＲ−９９ａ（ｍｉＲ−９９）抗ｍｉＲが、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼ（pMIR−REPORT（商標）Luciferase、ｐＭＩＲ）の多重クローニング部位にクローン化されたｍｉＲ−９９ａに相補的なｍｉＲ結合部位を含む、ルシフェラーゼ構築物１（Luciferase Construct 1、ＬＵＣ１、ｍｉＲ−９９ａ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが見出されたことを示している。 Ｈｅｌａ細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１１０、ＪＲＸ０１１３、ＪＲＸ０１１５、ＪＲＸ０１１７、ＪＲＸ０１１９ ｍｉＲ−１００−５ｐ抗ｍｉＲが、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼ（ｐＭＩＲ）の多重クローニング部位にクローン化されたｍｉＲ−１００−５ｐに相補的なｍｉＲ結合部位を含む、ルシフェラーゼ構築物２（Ｌuciferase Construct 2 LUC2、ｍｉＲ−１００−５ｐ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが観察されたことを実証している。 Ｈｅｌａ細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１０１、ＪＲＸ０１０３、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物３（Luciferase Construct 3、ＬＵＣ３、ｌｅｔ−７ａ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが見出されたことを実証している。ＬＵＣ３は、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼ（ｐＭＩＲ）の多重クローニング部位にクローン化されたｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐに相補的なｍｉＲ結合配列を含んでいた。 Ｈｅｌａ細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１０１、ＪＲＸ０１０３、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物３（Luciferase Construct 3、ＬＵＣ３、ｌｅｔ−７ａ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが見出されたことを実証している。ＬＵＣ３は、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼ（ｐＭＩＲ）の多重クローニング部位にクローン化されたｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐに相補的なｍｉＲ結合配列を含んでいた。 は、Ｈｅｌａ細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１００、ＪＲＸ０１０２、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物４（Luciferase Construct 4、ＬＵＣ４、ｌｅｔ−７ｃ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが観察されたことを実証している。ＬＵＣ４は、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼ（ｐＭＩＲ）の多重クローニング部位にクローン化されたｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐに相補的なｍｉＲ結合配列を含んでいた。 は、Ｈｅｌａ細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１００、ＪＲＸ０１０２、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物４（Luciferase Construct 4、ＬＵＣ４、ｌｅｔ−７ｃ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが観察されたことを実証している。ＬＵＣ４は、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼ（ｐＭＩＲ）の多重クローニング部位にクローン化されたｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐに相補的なｍｉＲ結合配列を含んでいた。 新生仔ラット心室心筋細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１１１、ＪＲＸ０１１２、ＪＲＸ０１１４、ＪＲＸ０１１６、ＪＲＸ０１１８ ｍｉＲ−９９ａ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物１（ＬＵＣ１、ｍｉＲ−９９）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが観察されたことを実証している。 新生仔ラット心室心筋細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１１０、ＪＲＸ０１１３、ＪＲＸ０１１５、ＪＲＸ０１１７、ＪＲＸ０１１９ ｍｉＲ−１００−５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物２（ＬＵＣ２、ｍｉＲ−１００）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが観察されたことを実証している。 新生仔ラット心室心筋細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１０１、ＪＲＸ０１０３、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物３（ＬＵＣ３、ｌｅｔ−７ａ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが見出されたことを実証している。 新生仔ラット心室心筋細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１０１、ＪＲＸ０１０３、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物３（ＬＵＣ３、ｌｅｔ−７ａ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが見出されたことを実証している。 は、新生仔ラット心室心筋細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１００、ＪＲＸ０１０２、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物４（ＬＵＣ４、ｌｅｔ−７ｃ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが観察されたことを実証している。 は、新生仔ラット心室心筋細胞で行われた実験結果の概略を図示し、ＪＲＸ０１００、ＪＲＸ０１０２、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物４（ＬＵＣ４、ｌｅｔ−７ｃ）活性を用量依存的に（ログ−１０Ｍ）増加することが観察されたことを実証している。
本開示の上記の他の特徴は、添付の図面と併せて、以下の詳細な説明及び付随する特許
請求の範囲からより十分に明らかになるであろう。これらの図面は本開示に従ったほんの
いくつかの実施形態を示しているだけであり、本開示の範囲を限定するとみなすものでは
ないと理解する。本開示は、添付の図面の使用による更なる特定及び詳細を伴って記載さ
れる。
本開示は、一般に、新規なマイクロＲＮＡアンタゴニスト、１つ以上のそのようなマイ
クロＲＮＡアンタゴニストを含む治療用組成物、並びにそこのようなマイクロＲＮＡアン
タゴニストを用いて心疾患及び／又は筋ジストロフィー障害を処置及び／又は改善する方
法に関する。本明細書で開示される治療用組成物及び追加の治療剤が、心疾患及び／又は
筋ジストロフィー障害を有するか又は疑われる対象に付与される、併用療法も含まれる。
特に、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、合成オリゴヌクレオチドであるｍｉ
Ｒ−９９Ａ−５Ｐ、ｍｉＲ−１００−５Ｐ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びＬｅｔ−７ｃ−５
ｐアンタゴニスト及び／若しくはウイルス送達されるｍｉＲ−９９Ａ−５Ｐ、ｍｉＲ−１
００−５Ｐ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニスト、化学療法剤
、並びに心疾患及び／又は筋ジストロフィー疾患処置のための生物学的薬剤の様々な組み
合わせの使用に関する。例えば、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、２つのア
デノウイルスＡＡＶ２／９送達システム（本明細書中では、ＪＢＴ−ｍｉＲ１及びＪＢＴ
−ｍｉＲ２と称する）、及びそれぞれの標的マイクロＲＮＡを阻害することができるｍｉ
Ｒ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐア
ンタゴニストについてのいくつかのバリアントを有する対応する発現ベクターを記載する
。本明細書では、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、
及びＬｅｔ−７ｃを特異的に標的化するように設計されたいくつかの合成オリゴヌクレオ
チドアンタゴニストが、個別に又は組み合わせて更に提供される。
以下の詳細な説明において、その一部を形成する添付の図面を参照する。詳細な説明、
図面、特許請求の範囲に記載されている例示的な実施形態は限定されることを何ら意味す
るものではない。本明細書で提供される主題の真意又は範囲から逸脱することなく、他の
実施形態を用いてもよいし、他の変形がなされもよい。本明細書で一般的に記載され、図
面によって例示される、本開示の実施形態は、非常に様々な異なる構成で調整し、置き換
えし、組み合わせ、設計することができ、その全てが明確に企図されて本開示の一部をな
すことは容易に理解されるであろう。
いくつかの定義
他に定義がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、及び他の科学用語
又は専門用語は、本開示に照らして読み取った際に本開示に属する当業者に一般的に理解
される意味を有することを意図する。いくつかの場合において、一般的に理解される意味
の用語は、明確性のため及び／又は参照を容易にするために本明細書中で定義し、本明細
書にそのような定義を含めることは、当該技術分野で一般的に理解されるものと実質的に
異なるものを表していると必ずしも解釈すべきではない。本明細書で記載又は参照される
技術及び手順の多くは、十分に理解されており、当業者によって従来の方法を用いて一般
的に使用される。（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２
ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）
；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に示さない限り
、複数の参照を含む。例えば、「分子」との用語は、混合物を含む１つ以上の分子を含む
。本開示及び付随する特許請求の範囲に使用する場合、「及び／又は」との用語は、単独
的又は包括的であることができる。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、本明細書において、
以下の代替物「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ及びＢ」の全てを含むように使用される。
「約」との用語は、本明細書で使用する場合、その通常の意味である、おおよそを意味
する。おおよその程度が文脈から別に明確ではないとき、「約」は、与えられた値からプ
ラス又はマイナス「１０％」内のいずれか、あるいは四捨五入して最も近い有効数字にす
ることを意味し、全ての場合において、与えられた値を含む。範囲が与えられている場合
、境界値を含む。
「投与」とは、薬剤又は組成物を対象に提供することを意味し、医療専門家による投与
及び自分での投与によって投与することを含むが、これらに限定されない。
「非経口投与」とは、注射又は輸液によって投与することを意味する。非経口投与は、
限定するものではないが、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、及び頭蓋内
投与を意味する。「皮下投与」とは、皮膚の直下に投与することを意味する。「静脈内投
与」とは、静脈内に投与することを意味する。「動脈内投与」とは、動脈内に投与するこ
とを意味する。
「アミノ酸」との用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存
在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在
するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるもの、及び後で修飾されるそれらのアミノ
酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ｙ−カルボキシグルタメート、及び０−ホスホセリン
である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物
を指し、例えば、炭素が、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合され、例え
ば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウ
ムがある。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプ
チド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸
模倣体とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミ
ノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。「天然に存在しないアミノ酸」及び「非天然ア
ミノ酸」との用語は、天然では見出されない、アミノ酸類似体、合成アミノ酸、及びアミ
ノ酸模倣体を指す。
アミノ酸は、本明細書において、一般的に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって参照される場合
がある。同様に、ヌクレオチドは、一般的に認められた１文字コードによって参照される
場合がある。
「アンチセンス化合物」とは、標的核酸へのハイブリダイゼーションを可能にする核酸
塩基配列を有する化合物を意味する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物
は、標的核酸に相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
「相補的な」又は「相補性」との用語は、第２のポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基
対を形成するポリヌクレオチド中の核酸の能力を指す。例えば、配列Ａ−Ｇ−Ｔは、配列
Ｔ−Ｃ−Ａと相補的である。相補性は、一部であってもよいし（この場合、一部の核酸の
みが塩基対形成に従って一致する）、完全であってもよい（この場合、全ての核酸が塩基
対形成に従って一致する）。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」との
用語は、互換的に使用され、アミノ酸ポリマー又は相互作用する又は結合した２つ以上の
アミノ酸ポリマーの組を示す。これらの用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の
アミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸並びに天然に存在するアミノ酸ポリマ
ー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーの人工化学的模倣体である、アミノ酸ポリマー
を含む。
「保存的に改変された（conservatively modified）バリアント」との句は、アミノ酸
及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリア
ントは、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、あるいは核酸
がアミノ酸配列をコードしていない場合、本質的に同一のヌクレオチド配列を指す。遺伝
子コードの縮重により、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードす
ることができる。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸の
アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される任意の位置に
おいて、コードされたポリペプチドを変更することなく、コドンを上記の対応するコドン
のいずれかに変更することができる。そのような核酸のバリエーションは、「サイレント
バリエーション」であり、これは、保存的に改変されたバリエーションの一種である。本
明細書に記載されたポリペプチドをコードする任意の１つの核酸配列はまた、核酸の全て
の可能なサイレントバリエーションを記載している。当業者は、核酸中の各コドン（通常
はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであ
るＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を生じさせることができることを認識
するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の全てのサイレントバリエー
ションは、実際のプローブ配列に関してではなく、その発現産物に対して記載された配列
の各々に潜在している。更に又はあるいは、バリアントは、参照ポリヌクレオチドと比較
して、５’末端、３’末端及び／又は１つ以上の内部位置において１つ以上のヌクレオチ
ドの欠失、置換、付加を含むことができる。バリアントと参照ポリヌクレオチドとの間の
配列の類似性及び／又は差異は、当該技術分野で知られている従来技術、例えば、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技
術を用いて検出することができる。バリアントポリヌクレオチドはまた、例えば部位特異
的突然変異誘発を使用して生成されるものなど、合成的に誘導化されるポリヌクレオチド
を含む。一般的に、ｍｉＲＮＡを含むがこれに限定するものではない本明細書に開示され
る特定のポリヌクレオチドのバリアントは、当業者に既知の配列アラメントプログラムに
より決定されるように、参照ポリヌクレオチドと少なくとも５０％、約５５％、約６０％
、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％
、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％以上の
配列同一性を有する。
「同一である」又は「パーセント同一性」との用語は、２つ以上の核酸又はタンパク質
の文脈において、２つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸が、以下に記載されるデフォルト
パラメータによるＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、ある
いは手動によるアラインメント及び視覚検査により測定したとき、同じであるか、あるい
は特定のパーセンテージの同じヌクレオチド又はアミノ酸（例えば、比較ウインド又は設
計領域での最大限の対応について比較及びアラインメントしたときに、特定の領域に対し
て約６０％の配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性）を有
することを指す。例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのｗｅｂサイ
トを参照のこと。そのような配列は、その結果、「実質的に同一である」と言う。この定
義はまた、試験配列の相補体を指し、あるいは試験配列の相補体に適用されてもよい。こ
の定義はまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列を含む。配列
同一性は、典型的には、少なくとも約５０個のアミノ酸又はヌクレオチド長さの領域にわ
たり、若しくは５０〜１００個のアミノ酸又はヌクレオチド長さの領域にわたり、又は所
与の配列の全長にわたり存在する。
本明細書で用いる場合、「構築物」との用語は、任意の供給源に由来し、ゲノムの組み
込み又は自律複製を可能にし、１つ以上の核酸配列が機能的に操作可能な（functionally
operative）形式で連結されている（例えば、作動可能に連結されている（operably lin
ked））核酸分子を含む、発現カセット、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製ポ
リヌクレオチド分子、ファージ、又は線状若しくは環状の一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ若
しくはＲＮＡポリヌクレオチド分子などの、任意の組換え核酸分子を意味することを意図
する。
「トランスフェクション（transfection）」又は「トランスフェクトする（transfecti
ng）」との用語は、非ウイルス又はウイルスベースの方法を用いて、細胞に核酸分子を導
入するプロセスとして定義される。核酸分子は、完全なタンパク質又はその機能性部分を
コードする配列であることができる。典型的には、核酸ベクターは、タンパク質発現に必
要な要素（例えば、プロモーター、転写開始部位など）を含む。非ウイルストランスフェ
クション法には、細胞内に核酸分子を導入するための送達系として、ウイルスＤＮＡ又は
ウイルス粒子を使用しない任意の適切なトランスフェクション法を含む。例示的な非ウイ
ルストランスフェクション法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム
トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショックによるト
ランスフェクション、マグネトフェクション、及びエレクトロポレーションが含まれるが
、これらに限定されない。ウイルスベースの方法については、当該技術分野で既知の有用
なウイルスベクターのうちの任意のものを、本明細書に記載された方法において使用する
ことができる。ウイルスベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウ
イルス、及びアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。いくつ
かの態様において、レトロウイルスベクターを用い、当該技術分野で既知の標準的手順に
従って、核酸分子を細胞に導入する。
「異種」との用語は、核酸又はタンパク質の部分に関して使用する場合、核酸又はタン
パク質が天然で互いに同じ関係で見出されない２つ以上の配列を含むことを示す。例えば
、核酸は、典型的には組換えにより生成され、ある供給源由来のプロモーター及び別の供
給源由来のコード領域などの、新しい機能性核酸を作製するために配列された関連のない
遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が天然に
おいて互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列（subsequence）を含むことを
示す（例えば、融合タンパク質）。
「遺伝子」との用語は、タンパク質をコードする又は機能性ＲＮＡに転写され得る核酸
分子の任意のセグメントを指すために、幅広く使用することができる。遺伝子は、転写さ
れるが最終、成熟、及び／又は機能性ＲＮＡ転写物の一部ではない配列を含むことができ
、タンパク質をコードする遺伝子は、転写されるが翻訳されない遺伝子、例えば、５’非
翻訳領域（5’untranslated regions、５’−ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（3’untranslat
ed regions、３’−ＵＴＲ）、イントロンなどを更に含むことができる。更に、遺伝子は
、その発現に必要な調節配列を任意選択で更に含むことができ、そのような配列は、例え
ば、転写されるが翻訳されない遺伝子であることができる。遺伝子は、関心のある供給源
からクローン化すること又は既知若しくは予測配列情報から合成することを含む、様々な
供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含むこと
ができる。
「ヌクレオシド間連鎖」との用語は、隣接するヌクレオシド間の共有結合を意味する。
「核酸塩基」との用語は、他の核酸塩基と非共有結合により対形成することが可能であ
る複素環式部分を意味する。
「ヌクレオシド」とは、糖に連結された核酸塩基を意味する。「連結ヌクレオシド」と
は、共有結合によって連結されたヌクレオシドを意味する。「ヌクレオチド」とは、ヌク
レオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を有するヌクレオシドである。
「ｍｉＲアンタゴニスト」とは、ｍｉＲＮＡの活性に干渉する又はそれを阻害するよう
に設計された作用剤（agent）を意味する。ある特定の実施形態において、ｍｉＲアンタ
ゴニストは、ｍｉＲＮＡを標的化するアンチセンス化合物を含む。ある特定の実施形態に
おいて、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡの核酸塩基配列又はその前駆体に相補的な
核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ｍ
ｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡの活性に干渉する又はそれを阻害する小分子などを含
む。
「ｍｉＲ−９ａ−５ｐアンタゴニスト」とは、ｍｉＲ−９ａ−５ｐの活性に干渉する又
はそれを阻害するように設計された作用剤を意味する。「ｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴ
ニスト」とは、ｍｉＲ−１００−５ｐの活性を妨害又は阻害するように設計された作用剤
を意味する。「Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニスト」とは、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの活性を
妨害又は阻害するように設計された作用剤を意味する。「Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニ
スト」とは、Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐの活性を妨害又は阻害するように設計された作用剤を意
味する。
「修飾オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する末端、糖、核酸塩基、及び／又はヌ
クレオシド間連結に関連する１つ以上の化学修飾を有するオリゴヌクレオチドを意味する
。
「修飾ヌクレオシド間連結」とは、天然に存在するヌクレオシド間連結からの任意の変
化を意味する。
「ホスホロチオエートヌクレオシド間連結」とは、非架橋原子のうちの１つが硫黄原子
である、ヌクレオシド間の連結を意味する。
「修飾糖」とは、天然糖からの置換及び／又は任意の変化を意味する。
「修飾核酸塩基」とは、天然の核酸塩基からの任意の置換及び／又は変化を意味する。
「５−メチルシトシン」とは、５’位に結合されたメチル基により修飾されたシトシン
である。
「２’−Ｏ−メチル糖」又は「２’−ＯＭｅ糖」とは、２’位にＯ−メチル修飾を有す
る糖を意味する。
「２’−Ｏ−メトキシエチル糖」又は「２’−ＭＯＥ糖」とは、２’位にＯ−メトキシ
エチル修飾を有する糖を意味する。
「２’−Ｏ−フルオロ糖」又は「２’−Ｆ糖」とは、２’位にフルオロ修飾を有する糖
を意味する。
「二環式糖部分」とは、２つの非ジェミナル環原子の架橋により修飾された糖を意味す
る。
「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド」とは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾を
有する２’−修飾ヌクレオシドを意味する。
「２’−フルオロヌクレオシド」とは、２’−フルオロ糖修飾を有する２’−修飾ヌク
レオシドを意味する。
「２’−Ｏ−メチルヌクレオシド」とは、２’−Ｏ−メチル糖修飾を有する２’−修飾
ヌクレオシドを意味する。
「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を有する２’−修飾ヌクレオシドを意味す
る。
本明細書で使用する場合、「ｍｉＲ」、「ｍｉｒ」、「ｍｉＲＮＡ」は、互換的に使用
され、コードＲＮＡとハイブリダイズし、このコードＲＮＡの発現を調節することができ
る小さなＲＮＡ分子類であるマイクロＲＮＡを指す。ある特定の実施形態において、ｍｉ
ＲＮＡは、酵素ダイサー（Dicer）によるプレ−ｍｉＲＮＡの切断の産物である。本明細
書で提供されるこれらの用語は、遺伝子又は標的遺伝子と同じ細胞中で発現したときに遺
伝子又は標的遺伝子の発現を低減又は阻害する能力を有する二本鎖ＲＮＡを形成する核酸
を指す。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成する核酸の相補部分は、典型的には実質的
又は完全な同一性を有する。一実施形態において、「マイクロＲＮＡ」とは、標的遺伝子
と実質的又は完全な同一性を有し、二本鎖ｍｉＲＮＡを形成する核酸を指す。いくつかの
実施形態において、本開示のｍｉＲＮＡは、相補的細胞ｍＲＮＡと相互作用し、それによ
り相補的ｍＲＮＡの発現に干渉することにより、遺伝子発現を阻害する。いくつかの実施
形態において、本開示の二本鎖ｍｉＲＮＡは、少なくとも約１５〜５０のヌクレオチド長
である（例えば、二本鎖ｍｉＲＮＡの各相補配列は、１５〜５０のヌクレオチド長であり
、二本鎖ｍｉＲＮＡは、約１５〜５０の塩基対長さである）。いくつかの実施形態におい
て、長さは、２０〜３０塩基のヌクレオチドであり、好ましくは約２０〜２５又は約２４
〜２９のヌクレオチド長、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２
８、２９、又は３０のヌクレオチド長である。本開示のいくつかの実施形態において、マ
イクロＲＮＡは、ｍｉＲ−９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及
びＬｅｔ−７ｃ−５ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡから選択されるか、又は
これらと実質的に類似する。
本明細書で使用する場合、「抗ｍｉＲＮＡ」との用語は、「抗ｍｉＲ」との用語と互換
的に使用され、１つ以上の標的マイクロＲＮＡの１つ以上の活性に干渉する又はそれを阻
害することができるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、抗ｍｉＲ
ＮＡは、化学合成されたオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、抗ｍ
ｉＲＮＡは、小分子である。いくつかの実施形態において、抗ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲアン
チセンス分子である。「シード領域」とは、成熟ｍｉＲＮＡ配列の５’末端から２〜６又
は２〜７のヌクレオチドを意味する。
「ｍｉＲＮＡ前駆体」との用語は、ゲノムＤＮＡに由来し、かつ１つ以上のｍｉＲＮＡ
を含む非コード構造化（structured）ＲＮＡを含む、転写物を意味する。例えば、ある特
定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ前駆体は、プレ−ｍｉＲＮＡである。ある特定の実施
形態において、ｍｉＲＮＡ前駆体は、プリ−ｍｉＲＮＡである。
「プレ−ｍｉＲＮＡ」又は「プレ−ｍｉＲ」とは、ｍｉＲＮＡを含む、ヘアピン構造を
有する非コードＲＮＡを意味する。ある特定の実施形態において、プレ−ｍｉＲＮＡは、
ドローシャ（Drosha）として知られる二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼによる、プリ
−ｍｉＲＮＡの切断の産物である。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、
細胞質中で、プレ−ｍｉＲＮＡヘアピンがＲＮａｓｅＩＩＩ酵素ダイサーによって切断さ
れると考えられる。このエンドリボヌクレアーゼは、ヘアピンの５’及び３’末端と相互
作用し、３’及び５’アームを繋いでいるループを切り取り、不完全ｍｉＲＮＡである約
２２ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ二重鎖（duplex）を生じさせる。二重鎖のいずれかの鎖
は機能性ｍｉＲＮＡとして潜在的に作用し得るが、一本鎖のみが、ｍｉＲＮＡ及びそのｍ
ＲＮＡ標的が相互作用するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に通常は組み込
まれると考えられる。残った鎖（センス鎖）は分解される。ＲＮＡ誘導サイレンシング複
合体又はＲＩＳＣは、多タンパク質複合体、特に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの
一本鎖ＲＮＡ（single−stranded RNA、ｓｓＲＮＡ）断片又は二本鎖小分子干渉ＲＮＡ（
double−stranded small interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）の一方の鎖を組み込んだ、リボ
核タンパク質である。
「調節」とは、機能又は活性の摂動（perturbation）を意味する。特定の実施形態にお
いて、調節とは、遺伝子発現の増加を意味する。ある特定の実施形態において、調節とは
、遺伝子発現の低下を意味する。本明細書で使用する「マイクロＲＮＡモジュレーター」
との用語は、マイクロＲＮＡ（例えば、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１００、
ｍｉＲ−９９）の発現レベルを調節することができる作用剤を指す。いくつかの実施形態
において、マイクロＲＮＡモジュレーターは核酸によってコードされる。他の実施形態に
おいて、マイクロＲＮＡモジュレーターは、小分子（例えば、化学化合物又は合成マイク
ロＲＮＡ分子）である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡモジュレーターは
、マイクロＲＮＡモジュレーター不存在下での発現レベルに比べて、マイクロＲＮＡの発
現レベルを低下させる。マイクロＲＮＡモジュレーターが、モジュレーター不存在の場合
に対してマイクロＲＮＡの発現レベルを低下させる場合、マイクロＲＮＡモジュレーター
は、マイクロＲＮＡのアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、マイクロＲ
ＮＡモジュレーターは、マイクロＲＮＡモジュレーター不存在下での発現レベルと比べて
、マイクロＲＮＡの発現レベルを増加させる。マイクロＲＮＡモジュレーターが、モジュ
レーター不存在の場合に対してマイクロＲＮＡの発現レベルを増加させる場合、マイクロ
ＲＮＡモジュレーターは、マイクロＲＮＡのアゴニストである。
本明細書で使用する場合、「心筋細胞」との用語は、ヒト心筋などの心筋から得られる
か若しくはそこに存在する任意の細胞、並びに／又は心筋と物理的及び／若しくは機能的
に関連する任意の細胞を含む。本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、心筋
の細胞（myocardial cell）は、心筋細胞（cardiomyocyte）である。
「ヌクレオチド」との用語は、天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌク
レオチドを包含する。したがって、「ヌクレオチド」は、既知のプリン及びピリミジン複
素環含有分子だけでなく、複素環類似体及びその互変異性体も含む。他の種類のヌクレオ
チドの非限定的な例には、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、
キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチ
ン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−
ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−
フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン（pseudoisocytosine）
、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン
、イノシン、及び米国特許第５，４３２，２７２号に記載された「天然に存在しない」ヌ
クレオチドを含有する分子が含まれる。「ヌクレオチド」との用語は、これらの例のどれ
も及び全て、並びにそれらの類似体及び互変異性体を包含することを意図する。
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」との用語は、本明細書では互換的に使用され、一本
鎖又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそ
れらのポリマー、並びにそれらの相補体を指す。「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌク
レオチドの直鎖状配列を含む。「ヌクレオチド」との用語は、典型的には、ポリヌクレオ
チドの単一ユニット、例えば単量体を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキ
シリボヌクレオチド又はそれらの修飾型であることができる。本明細書で企図されるポリ
ヌクレオチドの例には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ
を含む）、並びに一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子
が含まれる。この用語はまた、合成の、天然に存在する、及び天然に存在しないものであ
り、参照の核酸と同様の結合性を有し、かつ参照のヌクレオチドと同様の様式で代謝され
る、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基若しくは連結を含有する核酸を包
含する。そのような類似体の例には、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホ
スホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート及び２’−Ｏ−メチ
ルリボヌクレオチドが含まれる。したがって、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」との用
語は、ホスホジエステル連結又は修飾された連結、例えば、ホスホトリエステル、ホスホ
ロアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデー
ト、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート
、架橋ホスホロアミデート、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホス
ホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート
又はスルトン連結、及びそれらの連結の組み合わせ含む核酸を包含する。「核酸」及び「
ポリヌクレオチド」との用語はまた、５つの生物学的に存在する塩基（アデニン、グアニ
ン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基からなる核酸を特に含む。
「作動可能に連結される」との用語は、本明細書で使用する場合、２つ以上の配列間の
連結を表す。例えば、関心のあるポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）
との間の作動可能な連結は、関心のあるポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な結
合である。この意味で、「作動可能に連結される」との用語とは、調節領域が関心のある
コード配列の転写又は翻訳の調節に効果的であるように、調節領域及び転写されるコード
配列が配置されることを指す。本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、「作
動可能に連結される」との用語は、制御配列がポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ポリ
ペプチド、及び／又は機能性ＲＮＡの発現若しくは細胞局在化を指向若しくは調節するよ
うに、調節配列がポリペプチド又は機能性ＲＮＡをコードする配列に対して適切な位置に
配置された構成を表す。したがって、プロモーターは、これが核酸配列の転写を仲介する
ことができる場合、核酸配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結された要素は
、連続又は非連続であることができる。
「プロモーター」、「プロモーター領域」、又は「プロモーター配列」との用語は、本
明細書では互換的に使用され、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、５’から３’（「下流」）
方向に遺伝子転写を開始することができる核酸配列を指す。プロモーターの特異的配列が
、典型的にはプロモーターの強さを決定する。例えば、強力なプロモーターにより、高効
率の転写開始が引き起こされる。プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの結合が遺伝子転
写の主な原因である場合、この遺伝子はプロモーター「の制御下で」又はプロモーター「
によって制御される」。プロモーター又はプロモーター領域は、典型的には、ＲＮＡポリ
メラーゼの認識部位及び適切な転写開始に必要な他の要因を提供する。プロモーターは、
遺伝子のゲノムコピーの５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ）から単離することができる。ある
いは、プロモーターは、既知のＤＮＡ要素を変更することによって合成的に作製又は設計
することができる。あるプロモーター配列を別のプロモーター配列と組み合わせたキメラ
プロモーターも考慮される。プロモーターは、作動可能に連結されたポリヌクレオチド分
子、例えば、ポリペプチドのコード配列又は機能性ＲＮＡ配列などの発現を調節するため
の調節要素として用いることができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認
識される配列に加えて、好ましくは、他の転写因子、シス要素などの調節配列要素、又は
作動可能に連結された遺伝子の転写に影響を及ぼすエンハンサードメインを含有すること
ができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは「構成的」であることができる
。いくつかの実施形態において、プロモーターは、特異的な組織型における作動可能に連
結されたコード領域の転写にのみ活性であるように、「組織特異的」又は「組織優先的（
tissue−preferred）」に調節することができる。いくつかの実施形態において、治療目
的のために、プロモーターは、心臓及び骨格筋細胞における転写を支援する組織特異的プ
ロモーターであることができる。この点に関する更なる情報は、例えば、国際公開第２０
０４／０４１１７７（Ａ２）号に見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組
み込まれる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、「天然に存在する」又は「
合成的に」構築された核酸配列を含むことができる。
トランスフェクトされた遺伝子の発現は、宿主細胞において過渡的（transiently）又
は安定的に起こり得る。「過渡的発現」の間、トランスフェクトされた核酸は、宿主細胞
ゲノムに組み込まれず、細胞分裂時に娘細胞には移入されない。その発現はトランスフェ
クトされた細胞に制限されるので、遺伝子発現は時間経過によって失われ得る。対照的に
、トランスフェクトされた遺伝子の安定な発現は、この遺伝子が、トランスフェクトされ
た細胞に選択的利点を与える別の遺伝子とともに共トランスフェクトされた（co−transf
ected）ときに生じ得る。そのような選択的利点は、細胞に提示されるある特定の毒素に
対して抵抗性であり得る。トランスフェクトされた遺伝子の発現は、宿主ゲノムへのトラ
ンスポゾン媒介性の挿入によって更に達成され得る。トランスポゾン媒介性の挿入の際、
この遺伝子は、宿主ゲノムへの挿入及びその後の切除を可能にする、２つのトランスポゾ
ンリンカー配列の間で予測可能な様式で位置決めされる。
「阻害剤」、「抑制因子」、若しくは「アンタゴニスト」又は「ダウンレギュレーター
（downregulator）」との用語は、本明細書で互換的に使用され、対照と比較して、標的
遺伝子の検出可能的に低い（detectably lower）発現又は活性レベルをもたらす物質、作
用剤、又は分子を指す。阻害される発現又は活性は、対照のものより１０％、２０％、３
０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以下であることができる。
いくつかの実施形態において、阻害は、対照と比較して１．５倍、２倍、３倍、４倍、５
倍、又は１０倍以上である。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは抗ｍｉＲで
ある。
本明細書で使用する場合、「処置」とは、患者に顕在化した又は患者がかかりやすい可
能性がある疾患、障害、又は生理的状態に応答して行われる臨床的介入を指す。処置の目
的には、症状の緩和若しくは予防、疾患、障害若しくは状態の進行若しくは悪化の遅延又
は停止、及び／又は疾患、障害若しくは状態の回復が含まれるが、これらに限定するもの
ではない。「処置」とは、治療的処置及び予防又は予防的手段の一方又は両方を指す。処
置を必要とする対象には、疾患若しくは障害又は望ましくない生理学的状態に既に罹患し
ている対象、及び疾患若しくは障害又は望ましくない生理学的状態が予防される対象とが
含まれる。本開示のいくつかの実施形態において、「処置」、「治療」及び「改善」との
用語は、症状、例えば、神経変性障害又は神経傷害の重篤度の任意の低下を指す。本明細
書で使用する場合、「処置する」及び「予防する」との用語は、絶対的な用語であること
を意図していない。処置は、任意の発症遅延、症状の改善、及び患者生存の改善、生存時
間若しくは生存率の増加など、又はそれらの組み合わせを指すことができる。処置の効果
は、処置を受けていない個体若しくは個体プール、又は処置前若しくは処置中の異なる時
点の同じ患者と比較することができる。いくつかの実施形態において、個体における疾患
又は障害の重篤度は、例えば投与前の個体又は処置を受けてない対照個体と比較して少な
くとも１０％低減させることができる。いくつかの実施形態において、個体における疾患
又は障害の重篤度は、少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、又は９０％低減し、
あるいは、いくつかの実施形態において、標準的な診断技術を用いてもはや検出できない
。
本明細書で使用する場合、「有効量」又は「治療有効量」との用語は、有益な又は所望
の生物学的及び／又は臨床結果をもたらすのに十分な量を指す。いくつかの実施形態にお
いて、この用語は、所与の障害又は症状を改善するのに十分な治療剤の量を指す。例えば
、所与のパラメータについて、治療有効量は、対照と比較して、少なくとも５％、１０％
、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、又は少
なくとも１００％の増減を示すことができる。治療の効力はまた、「〜倍」の増減として
表すことができる。例えば、治療上有効量は、対照と比較して、少なくとも１．２倍、１
．５倍、２倍、又は５倍以上の効果を有することができる。
「対象」、「患者」、「処置を必要とする個体」との用語及び類似の用語は、互換的に
使用され、指示された場合を除き、処置、観察、又は実験の目的物である哺乳動物対象を
指す。本明細書で使用する場合、「哺乳動物」とは、哺乳綱に属する対象を指し、ヒト、
家畜及び農用動物、動物園の動物、スポーツ動物並びにペット動物を含むが、これらに限
定されない。哺乳動物の非限定例には、ヒト、及び非ヒト霊長類、マウス、ラット、ヒツ
ジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、並びにその他の哺乳動物種が含まれる。いく
つかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。しかしながら、いくつかの実施形態に
おいて、哺乳動物はヒトではない。この用語は、対象が特定の疾患又は障害を有すると診
断されていることを必ずしも示さないが、典型的には、医療監視下の対象を指す。「有す
ることが疑われる対象」とは、疾患又は状態の１つ以上の臨床指標を示す対象を意味する
。ある特定の実施形態において、疾患又は状態は筋ジストロフィー（ＭＤ）障害である。
「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、「標的ＲＮＡ転写」及び「核酸標的」は全て、アンタ
ゴニストによって標的化され得る核酸を意味する。「標的化」とは、標的核酸にハイブリ
ダイズし、所望の効果を誘発する核酸塩基配列の設計及び選択プロセスを意味する。「を
標的化する」とは、標的核酸にハイブリダイズし、所望の効果を誘発することが可能であ
る核酸塩基配列を有することを意味する。ある特定の実施形態において、所望の効果は標
的核酸の減少である。
本明細書で使用する場合、「バリアント」との用語は、参照ポリヌクレオチド（又はポ
リペプチド）と実質的に類似の配列を有するポリヌクレオチド（又はポリペプチド）を指
す。ポリヌクレオチドの場合、バリアントは、参照ポリヌクレオチドと比較して、５’末
端、３’末端、及び／又は１つ以上の内部部位において１つ以上のヌクレオチドの欠失、
置換、付加を有することができる。バリアントと参照ポリヌクレオチドとの間の配列の類
似性及び／又は差異は、当該技術分野で既知の従来技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技術を用いて検出することができる。バリアントポ
リヌクレオチドはまた、例えば、部位特的突然変異誘発を用いて生成されるものなど、合
成的に誘導されるポリヌクレオチドを含む。一般に、ＤＮＡを含むが限定されないポリヌ
クレオチドのバリアントは、当業者に既知の配列アラインメントプログラムによって決定
されるように、参照ポリヌクレオチドと少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６
５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９
３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％以上の配列同一
性を有することができる。ポリペプチドの場合、バリアントは、参照ポリペプチドと比較
して、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加を有することができる。バリアントと参照
ポリペプチドとの間の配列の類似性及び／又は差異は、当該技術分野で既知の従来技術、
例えばウエスタンブロットを用いて検出することができる。一般に、ポリヌクレオチドの
バリアントは、当業者に既知の配列アラインメントプログラムによって決定されるように
、参照ポリペプチドと少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、
約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、
約９７％、約９８％，又は約９９％以上の配列同一性を有することができる。
本明細書で使用する場合、「含む（comprising）」は、「含む（including）」、「含
有する」又は「によって特徴付けられる」と同義であり、包含的又は開放的であり（open
−ended）、追加の未引用の要素又は方法工程を排除しない。本明細書で使用する場合、
「からなる」とは、特許請求の範囲に記載の組成物又は方法で特定されていない任意の要
素、工程、又は成分を除く。本明細書で使用する場合、「から本質的になる」とは、特許
請求の範囲に記載の組成物又は方法の基本の及び新規な特性に実質的に影響を与えない材
料又は工程を除くものではない。特に、組成物の成分の記載又は方法の工程の記載におけ
る、「からなる」との用語の本明細書中での任意の引用は、引用した成分又は工程から本
質的になる及びそれらからなる組成物及び方法を包含すると理解する。
本明細書に記載の方法又はプロセスのいくつかの実施形態において、工程は、時間又は
操作シ−ケンスが明示的に挙げられる場合を除いて、任意の順序で行うことができる。更
に、いくつかの実施形態において、特定の工程は、別々に行われることを特許請求の範囲
の記載が明示的に述べていない限り、同時に行うことができる。例えば、いくつかの実施
形態において、請求項に記載のＸを実施する工程及び請求項に記載のＹを実行する工程を
、単一操作内で同時に行うことができ、得られる方法は、特許請求の範囲に記載の方法の
文言上の範囲内である。
項目の見出し、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、本明細書及び特許請求の範囲
を単に読みやすくするために提示しているだけであり、したがって構成目的のために本明
細書で使用され、記載された主題を限定すると解釈するものではない。本明細書及び特許
請求の範囲に見出しを使用することは、工程又は要素がアルファベット順若しくは数値順
又はそれらの提示順で行われることを必要とするものではない。特許、特許出願、論文、
書籍、手引書、及び学術論文を含むが限定するものではない、本出願で引用される全ての
文書又は文書の部分は、それらの全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
当業者によって理解されるように、明細書を提供する点からなどの任意及び全ての目的
のために、本明細書に記載される全ての範囲は、任意及び全ての可能な下位範囲及びその
下位範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙される範囲は、同一の範囲が少なくとも等
分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分けることできることを十分に記
載し、容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書中で議論される各々
の範囲は、下部の３分の１、中間の３分の１、上部の３分の１などに分けることができる
。また当業者に理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、及び「
より少ない」などの全ての文言は、引用された数字を含み、上記のように、続いて下位範
囲に分けることができる範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲に
は、各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個の物品を有する群は、１、
２、又は３個の物品を有する群を指す。同様に、１〜５個の物品を有する群は、１、２、
３、４、又は５個の物品を有する群を指し、その他同様である。
Ｉ．心疾患及びマイクロリボ核酸（Micro-Ribonucleic acid、ｍｉＲＮＡ）
心臓疾患又は心疾患は、いくつかの類又は型が存在する疾患であり（例えば、虚血性心
筋症（Ischemic Cardiomyopathy、ＩＣＭ）、拡張型心筋症（Dilated Cardiomyopathy、
ＤＣＭ）、大動脈弁狭窄症（Aortic Stenosis、ＡＳ））、多くは固有の処置戦略を必要
とする。したがって、心疾患は、単一の疾患ではなく、むしろ異なる細胞型（例えば、心
筋の細胞）から異なる病原性機構によって生じる障害のファミリーである。心疾患処置の
課題は、特定の心疾患型に対する特異的治療薬を標的とし、効力を最大化し、毒性を最小
化することとしてきた。したがって、心疾患の分類（類別）の改善が、心疾患処置向上の
中心となっている。本明細書で使用する場合、心臓疾患は、以下の非限定的な例を包含す
る：心不全（例えば、鬱血性心不全）、虚血性心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、ア
ルコール性心筋症、ウイルス性心筋症、頻脈誘発性心筋症、ストレス誘起性心筋症、アミ
ロイド心筋症、不整脈源性右室異形成、左室緻密化障害、心内膜線維弾性症、大動脈弁狭
窄症、大動脈弁逆流症、僧帽弁狭窄症、僧帽弁逆流症、僧帽弁逸脱症、肺動脈弁狭窄症、
肺動脈弁逆流症、三尖弁狭窄症、三尖弁逆流症、先天性障害、遺伝的障害又はそれらの組
み合わせ。
心臓細胞再生：２０世紀の間、ヒト心臓は、最終分化した有糸分裂後器官であり、傷害
後は回復することができないと考えられた。このことは、心筋細胞での有糸分裂が心筋梗
塞後に明らかになった２００１年で課題とされた。他者の研究から、成体哺乳動物の心臓
は、傷害時に初生の再生応答を起こすことができ、成熟分化した単核哺乳動物心筋細胞は
、特定のシグナル伝達経路を標的化する化学化合物を適用したときに、細胞周期に再び入
ることが確認された。
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲとも称する）は、植物、動物及びいくつかのウイルスに保存された
小さな非コードＲＮＡ分子であり、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節に
おいて機能する。ｍｉＲＮＡは、１９９３年に同定され、生命に必要である進化的な遺伝
子調節要素である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子内の塩基対形成及びサイレンシング相補
配列を介して機能し、それによって標的タンパク質発現及び下流のシグナル伝達経路を調
節する。ヒトゲノムには１０００の既知のｍｉＲがあり、これはヒト遺伝子の６０％を標
的化することができる。動物において、ｍｉＲＮＡは、２つのＲＮＡｓｅＩＩＩ酵素ドロ
ーシャ及びダイサーにより、約６０ｂｐのヘアピン前駆体（プレ−ｍｉＲＮＡ又はプレ−
ｍｉＲ）を介して、より大きな一次転写産物（プリ−ｍｉＲＮＡ又はプリ−ｍｉＲ）から
成熟型（ｍｉＲＮＡ）にプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡは、５０のリボ核タンパク
質複合体（ribonucleoprotein complex、ＲＩＳＣ）に充填され、これは典型的には、塩
基対相互作用により標的ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを導く。プリ−ｍｉＲＮＡは
、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写され、転写因子によって誘導的に調節されると予
測される。いくつかのｍｉＲＮＡは、偏在的な発現を示す一方、他のものは、限定的な発
達段階特異的若しくは組織特異的又は細胞型特異的な発現パターンのみを示す。
以下により詳細に記載するように、心筋組織において以前に行われた測定により、ｍｉ
ＲＮＡは、心筋の成長、線維化、及びリモデリングにおける調節的役割を行うことが示唆
されている。特に、リボ核酸干渉（ribonucleic acid interference、ＲＮＡｉ）技術は
、新たな心疾患治療の開発の熱心な研究領域であり、研究では、インビボでオリゴヌクレ
オチドを送達するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の有用性が実証されている。マイ
クロＲＮＡ（ｍｉＲ）ｌｅｔ−７ａ／ｌｅｔ−ｃ及びｍｉＲ−９９／１００のアンタゴニ
ストを発現する２つの別々のＡＡＶ２／９ウイルスは、単回注射後３ヶ月間まで、虚血性
マウス心臓における心筋細胞の増殖を誘導することができる。ウイルス送達されたｍｉＲ
アンタゴニストで処置したマウス心臓細胞及び組織のトランスクリプトーム及び翻訳解析
により、心臓の発達、増殖、並びに筋肉の構造及び機能に関与する遺伝子及びタンパク質
の発現における差異が示され、このことは、同様の再生効果が、これらのｍｉＲの標的化
を介して、ヒト心筋細胞及びＤＭＤモデルにおいて生じている可能性があることを意味し
ている。
ＲＮＡｉ技術は多くの形態を取ることができるが、典型的には、塩基対短鎖ヘアピン（
short hairpin、ｓｈ）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形態で細胞内で行われ、これは内因性ｍ
ｉＲ経路を介して約２０塩基対の小分子干渉ＲＮＡにプロセシングされる。ｍｉＲに相補
的な配列のウイルス送達は、一般的な手法である。ＡＡＶベクターは、心血管筋遺伝子送
達に最適であるが、その理由は、ＡＡＶベクターが、ａ）免疫応答を刺激するためにウイ
ルスタンパク質コード配列を含まず、ｂ）発現のために活発な細胞分裂が起こることを必
要とせず、ｃ）インビボ筋細胞における組換え遺伝子の安定した長期発現により、アデノ
ウイルスベクターよりも有意な利点を有するからである。遺伝子のウイルス送達は、ＤＭ
Ｄ処置のために開発中であり、ＬＧＭＤ治療薬としてのＡＡＶ１−ガンマ−サルコグリカ
ンベクター、ミニジストロフィン送達のための組換え（ｒ）ＡＡＶ２．５ベクター、及び
ｒＡＡＶ、アカゲザル血清型７４を含む。
本明細書に記載される場合、ｍｉＲＮＡアンタゴニストが標的ｍｉＲＮＡの活性を阻害
するように機能する機構は、何ら制限されない。例えば、核酸ベースのアンタゴニストは
、いくつかの実施形態において、標的ｍｉＲＮＡ配列と二重鎖を形成し、前駆体からの成
熟ｍｉＲＮＡ産物の適切なプロセシングを妨げることができ、あるいは成熟ｍｉＲＮＡが
その標的遺伝子に結合することを妨げることができ、あるいはプリ−ｍｉＲＮＡ、プレ−
ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡの分解を引き起こすことができ、あるいはいくつかのその
他の機構を介して作用することができる。
Ｌｅｔ−７ａ／ｃ及びｍｉＲ−１００／９９：ゼブラフィッシュ及び新生仔マウスにお
ける心臓再生機構の研究により、科学者らは、心臓再生が、成熟心筋細胞の脱分化、その
後の増殖、及び更なる再分化によって生じる一次心筋媒介プロセスであることを見出した
。エピジェネティックなリモデング及び細胞周期制御は、この再生プロセスを制御する２
つの重要な工程である。Ａｇｕｉｒｒｅら（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１４；
１５（５）：５８９〜６０４）は、非常に関連する研究を報告し、心臓再生の基礎的機構
を詳細に調べ、ゼブラフィッシュの心臓再生に強く関与する一連のｍｉＲを同定した。配
列及び３’ＵＴＲ結合部位の両方において、有意な発現の変化を与え、脊椎動物にわたっ
て保存されたそれらのｍｉＲに対して焦点を当てることにより、２つの明確に定義された
ゲノム位置において群をなす２つのｍｉＲファミリー（ｍｉＲ−９９／１００、ｌｅｔ−
７ａ／ｃ）が同定された。この発見は、脊椎動物の心筋形成の調節におけるｍｉＲ−９９
ａ／Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ群の共通の役割によって支持された。ＭＩＲＡＮＤＡに基づくｍ
ｉＲ−ＵＴＲ結合予測により、ｍｉＲ−９９／１００と、ゼブラフィッシュＦＮＴβ（フ
ァルネシルトランスフェラーゼのβサブユニット）及びＳＭＡＲＣＡ５（ＳＷＩ／ＳＮＦ
関連性、マトリクス関連性、クロマチンのアクチン依存性調節因子、サブファミリーａ、
メンバー５）と、の強い相互作用が示され、この作用が、ｍｉＲファミリーを心筋細胞で
の細胞周期及びエピジェネティックな制御と繋げている。興味深いことに、ｍｉＲ−９９
／１００及びｌｅｔ−７ａ／ｃレベルは、哺乳動物の初期の心臓発達時には低く、迅速な
心臓重量増大を促すが、後期の発達時には指数関数的に増加し、ＦＮＴβ及びＳＭＡＲＣ
Ａ５タンパク質レベルが対応して低減し、更に心筋細胞増殖を阻害する。損傷したヒト心
臓組織の死後解析により、これらのｍｉＲが、成人における心臓再生に対する保存された
障害となることが示唆される。Ｌｅｔ−７ａ／ｃ及びｍｉＲ−９９／１００に対する２つ
のアンタゴニスト（ウイルス送達される）が形質導された新生仔マウス心筋細胞について
のＲＮＡ−ｓｅｑトランスクリプトーム解析により、エピジェネティックなリモデリング
、脱メチル化、心臓発達、増殖、及び予想外に代謝経路、並びに筋肉構造及び機能に関与
する遺伝子の差異が明らかになった。実際に、ｍｉＲ−ｌｅｔ７ａ／ｃ及びｍｉＲ−９９
／１００阻害は、１０７２及び４７遺伝子をそれぞれ標的化する。
筋肉構造及び機能に関与するいくつかの選択的遺伝子には、アクチン／ミオシン、Ｒａ
ｓ様２と相互作用するＮＦＫＢ阻害剤、サルコグリカン、デルタ（３５ｋＤａジストロフ
ィン関連糖タンパク質）、及び筋ジストロフィーの現在の治療標的であるＩＧＦ−１（以
下の表１を参照のこと）が含まれる。表２に示すように、阻害剤で処置したマウス心臓の
臓器培養における半定量的質量分析により、代謝及びミトコンドリアプロセスが重要な主
体であると同定された一方、細胞骨格及び筋肉収縮に関与するタンパク質の変化も重視し
た。
ＩＩ．筋ジストロフィー
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、３０を超える遺伝子疾患群であり、運動を制御する骨格
筋の進行性の筋力低下及び変性によって特徴付けられる。ＭＤのいくつかの形態は幼少期
又は小児期で見られるが、他の形態は中年以降まで現れないこともあり得る。この障害は
、筋力低下の分布と程度（ＭＤのいくつかの形態はまた、心筋に影響を及ぼす）、発症年
齢、進行度、及び遺伝形式の点で差異がある。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、進行性の、Ｘ連鎖性劣性遺伝の筋消耗
性疾患であり、深刻な障害及び早死に至る。ＤＭＤは、Ｘ染色体短腕の２１．２バンドの
うちの１つの突然変異により引き起こされ、遺伝的欠失を有する母親の男児の半分が発症
する。この遺伝子は、細胞膜を通して周囲の細胞外マトリックスに筋繊維の細胞骨格を接
続する、タンパク質複合体の必須部分である、細胞質ヒトジストロフィンタンパク質の生
成をもたらす。ジストロフィンがないと、筋肉は変性する。この疾患の一次症状は、病巣
の線維化によって引き起こされる筋肉低下、呼吸障害、及び早期拡張機能障害であり、拡
張型心筋症（dilated cardiomyopathy、ＤＣＭ）へと進行し、殆どの患者で心不全及び不
整脈を併発する。ＤＭＤの現在の処置は、有症候性（symptomatic）だけである。以下の
表３は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー処置の現在の標準的手法の非限定例を列挙した
ものである。
２００を超えるＤＭＤ研究及び選択的介入研究が結果とともにある。以下の表４は、こ
れまでに報告されている介入ＤＭＤ試験のための選択的臨床試験治療薬の非限定例の列挙
を提供する。臨床開発における現在のＤＭＤ治療の手法は、１）機能性組換え型のヒトジ
ストロフィン遺伝子を再導入することを目的とした遺伝子送達治療、２）エクソンスキッ
ピング、３）ナンセンス突然変異に対するリードスルー戦略、４）細胞ベース療法、５）
ユートロフィンアップレギュレーション、ミオスタチン阻害、インスリン様成長因子−１
（ＩＧＦ−１）発現、６）承認された商用製品及び７）抗炎症薬／抗酸化剤を含む。
有効な処置を見出す主な問題点は、体における異なる筋肉を標的化する必要性、長期効
果の必要性、線維化の問題、及び異なる突然変異に対処するための様々なタイプの薬物の
必要性があることである。遺伝子治療薬を用いて長期発現が可能であるが、ウイルスベク
ターが担持することができない大きいサイズのジストロフィンｃＤＮＡにより、ジストロ
フィンタンパク質発現の回復が複雑となる。この問題に対処するために、より小さい型の
ジストロフィン（ミニ及びマイクロジストロフィン）が開発された。肢帯型筋ジストロフ
ィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ）について、臨床試験は有望な結果を示した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓ９システムによるゲノム編集は、前臨床マウスモデルでは望みを与える発見を実証した
が、ヒトではまだ可能ではない。
いくつかの試験的治療にもかかわらず、ジストロフィンタンパク質の完全な回復は達成
できていない。ＤＭＤ患者における代償的な（compensatory）遺伝子及びタンパク質の発
現を増加し、内因性心筋の両方を再生する代替の治療戦略を発見することが、早急に必要
とされている。
興味深いことに、心臓発作後に病理学的リモデリングを行わない心臓再生脊椎動物（新
生仔マウスを含む）は、心筋の脱分化及び増殖によって治癒され、２つの重要な事実：１
）心筋細胞は、幹細胞よりも大きくて効率的な再生前駆体のプールを現し、及び２）再生
は哺乳動物心臓の生来の特性であり、成体において、非効率的にも関わらず、機能的回復
をもたらし得ることを示している。
ＩＩＩ．本開示の組成物
マイクロＲＮＡアンタゴニスト
本明細書に開示には、複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物の
実施形態が含まれる。本明細書で使用される場合、「ｍｉＲアンタゴニスト」は、ｍｉＲ
ＮＡの活性に干渉する又はそれを阻害するように設計された薬剤である。ある特定の実施
形態において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡに標的化されるアンチセンス化合物
を含む。ある特定の実施形態において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡのヌクレオ
チド配列又はその前駆体に相補的なヌクレオチド配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを
含む。他の実施形態において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲＮＡの活性に干渉する又
はそれを阻害する小分子などを含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲアンタゴニス
トは、ｍｉＲ−９９ａアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲアン
タゴニストは、ｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニストである。いくつかの実施形態におい
て、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストである。いく
つかの実施形態において、ｍｉＲアンタゴニストは、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタ
ゴニストである。本明細書に開示されるｍｉＲアンタゴニストは、例えば、心筋（例えば
心筋組織、心筋細胞）における標的遺伝子発現を予防、阻害、又は低減するための組成物
及び方法の提供に有用である。したがって、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は
、心不全を含む心疾患を評価及び治療するための方法における本開示のｍｉＲアンタゴニ
ストの使用に関する。
本開示のこの態様及び他の態様に従う組成物の実施形態の実施は、以下の特徴のうちの
１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態において、複数のｍｉＲアンタゴニス
トは、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０のｍｉＲアンタゴ
ニスト、又は上記の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内のいくつかのアンタ
ゴニストを含む。いくつかの実施形態において、複数のｍｉＲは、ｍｉＲ−９９ａアンタ
ゴニスト、ｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニスト、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴ
ニスト−、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニスト、及びこれらの組み合わせから選
択される１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、複数のｍｉＲアンタゴニストは
、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴ
ニスト、１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニスト、及び１つ以上のｍｉＲ
−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストを含む。いくつかの実施形態において、各ｍｉＲア
ンタゴニスト群の数は、複数のｍｉＲアンタゴニストにおいて同じである。いくつかの実
施形態において、各ｍｉＲアンタゴニスト群の数は、複数のｍｉＲアンタゴニストにおい
て同じではない。
したがって、いくつかの実施形態において、複数のｍｉＲアンタゴニストは、本明細書
に開示される１つ以上のｍｉＲアンタゴニストと、８５％、９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、若しくは約８５％
、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％
、約９８％、約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の配
列同一性を有するヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのｍｉＲアンタゴニストを含む
。例えば、いくつかの実施形態において、ｍｉＲアンタゴニストは、本明細書に開示され
る１つ以上のｍｉＲアンタゴニストと、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少な
くとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は
少なくとも約９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それからなる
。いくつかの実施形態において、ｍｉＲアンタゴニストは、本明細書に開示される１つ以
上のｍｉＲアンタゴニストと、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約
９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくと
も約９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それからなる。いくつ
かの実施形態において、ｍｉＲアンタゴニストは、本明細書に開示される１つ以上のｍｉ
Ｒアンタゴニストと、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、
約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の配列同一性を有
するヌクレオチド配列を含むか、それからなる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニストのうちの少な
くとも１つは、配列番号４７、４８、５０、５２、及び５４からなる群から選択される配
列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９
５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７、少なくとも約９８％、少なくとも約９９
％、少なくとも約１００％、若しくは約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６
％、約９７、約９８％、約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任意の２つの間
の範囲の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−９９ａを含む。いくつか
の実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニストのうちの少なくと
も１つは、配列番号４６、４９、５１、５３、及び５５からなる群から選択される配列と
、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％
、少なくとも約９６％、少なくとも約９７、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、
少なくとも約１００％、若しくは約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、
約９７、約９８％、約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範
囲の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを含む。いくつ
かの実施形態において、１つ以上のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくと
も１つは、配列番号３７、３９、及び４０〜４５からなる群から選択される配列と少なく
とも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なく
とも約９６％、少なくとも約９７、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくと
も約１００％、若しくは約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７、
約９８％、約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の配列
同一性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含む。いくつか
の実施形態において、１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも
１つは、配列番号３６、３８及び４０〜４５からなる群から選択される配列と少なくとも
約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも
約９６％、少なくとも約９７、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約
１００％、若しくは約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７、約９
８％、約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の配列同一
性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを含む。
本明細書で開示される組成物のいくつかの実施形態において、以下のうちの１つ以上が
適用される。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニストの
うちの少なくとも１つは、配列番号４７、４８、５０、５２及び５４からなる群から選択
される配列に関して１つ以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗
ｍｉＲ−９９ａを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐ
アンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号４６、４９、５１、５３及び５５か
らなる群から選択される配列に関して１つ以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオ
チド配列を含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上
のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号３７、３９、
及び４０〜４５からなる群から選択される配列に関して１つ以上のミスマッチの核酸塩基
を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含む。いくつかの実施
形態において、１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは
、配列番号３６、３８、及び４０〜４５からなる群から選択される配列に関して１つ以上
のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ
を含む。
いくつかの実施形態において、複数のｍｉＲアンタゴニストは、本明細書に開示される
１つ以上のｍｉＲアンタゴニストのヌクレオチド配列に関して、１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、若しくは約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９
、約１０、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲のミスマッチの核酸塩基を有す
るヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのｍｉＲアンタゴニストを含む。例えば、いく
つかの実施形態において、ｍｉＲアンタゴニストは、本明細書に開示される１つ以上のｍ
ｉＲアンタゴニストのヌクレオチド配列に関して、少なくとも約１、少なくとも約２、少
なくとも約３、少なくとも約４、又は少なくとも約５以上のミスマッチの核酸塩基を有す
るヌクレオチド配列を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲア
ンタゴニストは、本明細書に開示される１つ以上のｍｉＲアンタゴニストのヌクレオチド
配列に関して、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、又
は少なくとも約１０以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含むか、そ
れらからなる。
したがって、いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニスト
のうちの少なくとも１つは、配列番号４７、４８、５０、５２、及び５４からなる群から
選択されるヌクレオチド配列に関して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若
しくは約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、又はこれらの
値のうちの任意の２つの間の範囲のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含
む抗ｍｉＲ−９９ａを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍｉＲ−１００−
５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号４６、４９、５１、５３、及び
５５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に関して、１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、若しくは約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約
１０、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲のミスマッチの核酸塩基を有するヌ
クレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを含む。いくつかの実施形態において、１
つ以上のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つは、配列番号３７、
３９、及び４０〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に関して、１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７
、約８、約９、約１０、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲のミスマッチの核
酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含む。いくつか
の実施形態において、１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも
１つは、配列番号３６、３８及び４０〜４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列
に関して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは約１、約２、約３、約
４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の
範囲のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−
５ｐを含む。
本明細書で開示される組成物の様々な実施形態において、抗ｍｉＲのうちの少なくとも
１つは、本明細書に記載される１つ以上の化学修飾を含む。好適な化学修飾には、核酸塩
基、糖、及び／又はヌクレオシド間連結への修飾が含まれるが、これらに限定されない。
修飾された核酸塩基、糖及び／又はヌクレオシド間連結は、未修飾の形態よりも、例えば
、細胞取り込みの向上、他のオリゴヌクレオチド又は核酸標的に対する親和性の向上、及
びヌクレアーゼ存在下での安定性の増加などの所望の性質により、選択され得る。したが
って、本明細書で開示される組成物のいくつかの実施形態において、抗ｍｉＲのうちの少
なくとも１つは、修飾ヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド、及び修飾糖部分、並びに
それらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の化学修飾を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の化学修飾は、修飾ヌクレオシド間連結を含む
。一般に、修飾ヌクレオシド間連結は、当該技術分野で既知の任意の修飾ヌクレオシド間
連結であることができる。好適な修飾ヌクレオシド間連結の非限定例には、ホスホロチオ
エート、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、２’−フルオロ、アルキルホスホネート
、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメ
ート、カルボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステ
ル及びそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド
間連結は、リン原子を含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間連結は、
リン原子を含まない。そのようなある特定の実施形態において、ヌクレオシド間連結は、
短鎖アルキルヌクレオシド間連結によって形成される。そのようなある特定の実施形態に
おいて、ヌクレオシド間連結は、シクロアルキルヌクレオシド間連結によって形成される
。そのようなある特定の実施形態において、ヌクレオシド間連結は、ヘテロ原子及びアル
キル混合のヌクレオシド間連結によって形成される。そのようなある特定の実施形態にお
いて、ヌクレオシド間連結は、ヘテロ原子及びシクロアルキル混合のヌクレオシド間連結
によって形成される。そのようなある特定の実施形態において、ヌクレオシド間連結は、
１つ以上の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結によって形成される。そのようなある特定
の実施形態において、ヌクレオシド間連結は、１つ以上の複素環ヌクレオシド間連結によ
って形成される。そのようなある特定の実施形態において、ヌクレオシド間連結は、アミ
ド骨格を有する。そのようなある特定の実施形態において、ヌクレオシド間連結は、混合
されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨｃ２構成要素を有する。いくつかの実施形態において、抗ｍｉ
Ｒのうちの少なくとも１つは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である修飾ヌクレ
オシド間連結を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の化学修飾のうちの少なくとも１つは、修飾ヌ
クレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、一般に、任意の修飾ヌクレオチドであることが
でき、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）化学修飾、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アラビノ核
酸（ＦＡＮＡ）、それらの類似体、誘導体又はそれらの組み合わせであることができる。
いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、５−メチルシトシンを含む。いくつ
かの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、５−ヒドロキシメチルシトシン、７−デア
ザグアニン及び７−デアザアデニンから選択される。ある特定の実施形態において、修飾
ヌクレオチドは、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及
び２−ピリドンから選択される。ある特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、５
−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２，Ｎ−６及びＯ−６置換プリンから
選択され、２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシト
シンが含まれる。ある特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、多環式複素環を含
む。ある特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、三環式複素環を含む。ある特定
の実施形態において、修飾したヌクレオチドは、フェノキサジン誘導体を含む。ある特定
の実施形態において、フェノキサジンを更に修飾して、当該技術分野でＧ−クランプとし
て既知の核酸塩基を形成することができる。
いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。い
くつかの実施形態において、１つ以上の化学修飾は、作用の効力、特異性及び持続時間を
向上させ、オリゴヌクレオチドの投与経路を広げるために少なくとも１つのロックド核酸
（ＬＮＡ）化学修飾を含む。これは、塩基ヌクレオチド配列中の核酸塩基のいくつかをＬ
ＮＡ核酸塩基で置換することにより達成することができる。ＬＮＡ修飾ヌクレオチド配列
は、親核酸塩基と同様のサイズを有することができ、あるいはより大きくすることができ
、あるいは好ましくは小さくすることができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＡ修
飾ヌクレオチド配列は、約７０％未満、約６５％未満、より好ましくは約６０％未満、約
５５％未満、最も好ましくは約５０％未満、約４５％未満のＬＮＡ核酸塩基を含み、その
サイズは、約５〜２５ヌクレオチド、より好ましくは約１２〜２０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ロックド核酸（ＬＮＡ）は、修飾抗ｍｉＲの一端又は両端
において組み込まれる。
いくつかの実施形態において、１つ以上の化学修飾は、少なくとも１つの修飾糖部分を
含む。いくつかの実施形態において、ある特定の実施形態において、糖修飾ヌクレオシド
は、２’−修飾ヌクレオシドであり、この糖環は天然リボース又は２’−デオキシリボー
ス由来の２’炭素で修飾されている。いくつかの実施形態において、２’−修飾ヌクレオ
シドは、二環式糖部分を有する。ある特定の実施形態において、二環式糖部分は、アルフ
ァ立体配置のＤ糖である。ある特定の実施形態において、二環式糖部分は、Ｄ糖ベータ立
体配置のＤ糖である。あるような実施形態において、二環式糖部分は、アルファ立体配置
のＬ糖である。ある特定の実施形態において、二環式糖部分は、ベータ立体配置のＬ糖で
ある。
いくつかの実施形態において、二環式糖部分は、２’及び４’炭素原子の間に架橋基を
含む。ある特定の実施形態において、架橋基は、１〜８個の連結されたビラジカル（bira
dical）基を含む。ある特定の実施形態において、二環式糖部分は、１〜４個の連結され
たビラジカル基を含む。ある特定の実施形態において、二環式糖部分は、２又は３個の連
結されたビラジカル基を含む。ある特定の実施形態において、二環式糖部分は、２個の連
結されたビラジカル基を含む。ある特定の実施形態において、連結されたビラジカル基は
、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ１
）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｓｉ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−Ｓ（＝
Ｏ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−及び−Ｃ（＝Ｓ）−から選択され、ここで、
各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜
Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２
アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０ア
リール、複素環基（radical）、置換複素環基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、
Ｃ５〜Ｃ７脂環式基、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環式基、水素、置換オキシ（−Ｏ−）、アミノ、
置換アミノ、アジド、カルボキシル、置換カルボキシル、アシル、置換アシル、ＣＮ、チ
オール、置換チオール、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｈ）若しくは置換スルホニル、スル
ホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｈ）又は置換スルホキシルであり、各置換基は、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置
換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ３２アルキニル、ア
ンモ、置換アンモ、アシル、置換アシル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１〜Ｃ１２ア
ミノアルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルコキシ
又は保護基である。
いくつかの実施形態において、二環式糖部分は、２’及び４’炭素原子の間で、−Ｏ−
（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（アルキル）−、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−、−Ｎ（アルキル）−（ＣＨ２）ｐ−、−Ｏ−ＣＨ（アルキル）
−、−（ＣＨ（アルキル））−（ＣＨ２）ｐ−、−ＮＨ−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−、−Ｎ（ア
ルキル）−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−、又は−Ｏ−Ｎ（アルキル）−（ＣＨ２）ｐ−から選択さ
れるビラジカル基と架橋され、ｐは、１、２、３、４又は５であり、各アルキル基は、更
に置換することができる。ある特定の実施形態において、ｐは、１、２又は３である。
いくつかの実施形態において、２’−修飾ヌクレオシドは、ハロ、アリル、アミノ、ア
ジド、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−、Ｓ−、又はＮ（Ｒｍ）−アルキル
、Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ（Ｒｍ）−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ（Ｒｍ）−アル
キニル、Ｏ−アルケニル−Ｏ−アルキル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−
アルカリール、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（
Ｒｍ）（Ｒｎ）又はＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択される２’−
置換基を含み、各Ｒｍ及びＲｎは、独立して、Ｈ、アミノ保護基、又は置換若しくは非置
換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。これらの２’−置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アル
コキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ２）、チオール、チオアルコキ
シ（Ｓ−アルキル）、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから独
立して選択される１つ以上の置換基で更に置換することができる。
いくつかの実施形態において、２’−修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、ＯＣＦ
３、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｃ
Ｈ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（
Ｒｍ）（Ｒｎ）、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、及びＮ−置換アセト
アミド（Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択される２’−置換基を含
み、各Ｒｍ及びＲｎは、独立して、Ｈ、アミノ保護基、又は置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ
１０アルキルである。
いくつかの実施形態において、２’−修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＦ３、Ｏ−ＣＨ３
、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ
（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ−（ＣＨ３）２、及びＯ−ＣＨ２−Ｃ（
＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３から選択される２’−置換基を含む。
いくつかの実施形態において、２’−修飾ヌクレオシドは、Ｆ、Ｏ−ＣＨ３、及びＯＣ
Ｈ２ＣＨ２ＯＣＨ３から選択される２’−置換基を含む。
いくつかの実施形態において、糖修飾ヌクレオシドは、４’−チオ修飾ヌクレオシドで
ある。ある特定の実施形態において、糖修飾ヌクレオシドは、４’−チオ−２’−修飾ヌ
クレオシドである。４’−チオ修飾ヌクレオシドは、４’−Ｏが４’−Ｓで置換されたβ
−Ｄ−リボヌクレオシドを有する。４’−チオ２’−修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏが２
’置換基で置換された４’−チオ修飾ヌクレオシドである。好適な２’−置換基は、２’
−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、及び２’−Ｆを含む。
したがって、本開示のいくつかの実施形態において、修飾糖部分は、２’−Ｏ−メトキ
シエチル修飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分、二環
式糖部分、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、修飾糖部分は
、２’−Ｏ−メチル糖部分を含む。
発現カセット
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｍｉＲアンタゴニストのうちの１つ以
上は、発現カセットによってコードされ、この発現カセットから発現される。したがって
、一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のｍｉＲ
アンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットに関する。本明細書で
使用する場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドの遺伝子情報が転写によってＲＮＡに変
換され、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって、リボソーム上のｍＲＮＡの翻訳
を介して、このＲＮＡがポリペプチドをコードする場合にはタンパク質へと触媒され、コ
ードされたタンパク質が産生されるプロセスを指す。「発現カセット」との用語は、本明
細書で使用する場合、プロモーターなどの発現制御要素と、任意選択により、転写ターミ
ネーター、リボソーム結合部位、スプライス部位若しくはスプライシング認識配列、イン
トロン、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び内部リボソーム進入部位などのこ
れらに限定されない、遺伝子の転写又は翻訳に影響を及ぼす他の核酸配列のいずれか又は
組合せと、に作動可能に連結された、遺伝子、タンパク質、又は機能性ＲＮＡをコードす
る核酸構築を指す。
クローニングベクター及び発現ベクター
関連する態様において、本明細書に記載のｍｉＲアンタゴニストのうちの１つ以上は、
クローニングベクター若しくは発現ベクターによってコードされ得、及び／又はクローニ
ングベクター若しくは発現ベクターから発現され得る。したがって、本出願のいくつかの
実施形態は、本明細書に開示される発現カセットを含むクローニングベクター又は発現ベ
クターを指向する。本明細書で使用する場合、「ベクター」との用語は、宿主細胞に遺伝
物質を伝達するために使用される核酸構築物、典型的にはプラスミド又はウイルスを指す
。ベクターは、例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド又はファージであることができ
る。本明細書で使用する場合のベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかからなることが
できる。いくつかの実施形態において、ベクターはＤＮＡからなる。いくつかの実施形態
において、ベクターはＲＮＡからなる。「ベクター」との用語は、クローニングベクター
及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組み込み型ベクターを含む。「発現ベク
ター」は、適切な環境に存在するときに、遺伝子の発現、又はベクターが担持する１つ以
上の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を指示することが可能なベクターであ
る。ベクターは、自律複製できることが好ましい。典型的には、発現ベクターは、転写プ
ロモーター、遺伝子、及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモータ
ーの制御下に置き、この遺伝子はプロモーターに「作動可能に連結される」と言う。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるクローニングベクタ
ー又は発現ベクターは、本明細書に記載される１つ以上のｍｉＲアンタゴニストをコード
するヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、本明細
書に開示される発現ベクター又は発現カセットは、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニ
スト、１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７
ａ−５ｐアンタゴニスト、及び１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストを
コードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
いくつかの実施形態において、クローニングベクター又は発現ベクターは、ウイルスベ
クターである。本明細書で使用する場合、「ウイルスベクター」は、別の核酸を細胞内に
輸送することができるウイルス由来の核酸分子である。ウイルスベクターは、適切な環境
に存在するときに、遺伝子の発現、又はベクターが担持する１つ以上の遺伝子によってコ
ードされるタンパク質の発現を指示することが可能である。ウイルスベクターの例には、
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びアデ
ノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
したがって、いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベク
ター若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又は任意の血清型である。本明細書
で使用する場合、「血清型（serotype）」又は「血清型（serovar）」との用語は、細菌
若しくはウイルスの種内における又は異なる個体の免疫細胞の間の異なるバリエーション
である。これらの微生物、ウイルス、又は細胞は、それらの細胞表面抗原に基づいて一緒
に分類され、生物を亜種レベルに疫学的に分類することを可能にする。一般に、ＡＡＶベ
クターは、任意の既存のＡＡＶベクターであることができ、例えば、血清型１、２、３、
４、５、６、７、８、９及び１０からなる群から選択されるＡＡＶベクター又はそれらに
由来するキメラＡＡＶであることができ、これらは関心のある組織における高効率の形質
導入に更により好適なものとなるであろう。トランスフェクションの際、ＡＡＶは、宿主
中で些細な免疫反応（もしあれば）しか誘導しない。したがって、ＡＡＶベクターは、遺
伝子治療手法に非常に適している。マウスでの形質導入のためには、ＡＡＶ血清型６及び
ＡＡＶ血清型９が特に好適であることが報告されている。ヒトへの遺伝子導入のためには
、ＡＡＶ血清型１、６、８及び９が一般的には好ましい。治療用遺伝子をパッケージング
するためのＡＡＶの容量は約４．９ｋｂに制限されるが、より長い配列はＡＡＶ粒子の切
断をもたらすと想定される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２
／９ベクターであり、例えば、ＡＡＶ２逆方向末端反復（inverted terminal repeat、Ｉ
ＴＲ）配列をＡＡＶカプシドにクロスパッケージングしたもの（cross−packaged）であ
る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターと、８５％、９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１０
０％、若しくは約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５
％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任
意の２つの間の範囲の配列同一性を有するクローニングベクター又は発現ベクターが本明
細書に開示される。例えば、いくつかの実施形態において、クローニングベクター又は発
現ベクターは、ＪＢＴ−ｍｉＲ１の全配列（配列番号８５）と、少なくとも約８５％、少
なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少
なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態において、このベクターは、ＪＢＴ−ｍ
ｉＲ２のヌクレオチド配列と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約
９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくと
も約９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それらからなる。いく
つかの実施形態において、このベクターは、ＪＢＴ−ｍｉＲ１の全配列（配列番号８５）
又はＪＢＴ−ｍｉＲ２と、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８
％、約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の配列同一性
を有するヌクレオチド配列を含むか、それらからなる。
いくつかの実施形態において、クローニングベクター又は発現ベクターは、配列番号５
９〜６４に記載のヌクレオチド配列の各々と、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、若しくは約８５％、約
９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約
９８％、約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の配列同
一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態において
、クローニングベクター又は発現ベクターは、配列番号８６〜８９に記載のヌクレオチド
配列の各々と、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％、１００％、若しくは約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、
約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％
、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態において、クローニングベクター又は発
現ベクターは、配列番号５９〜６４及び８６〜８９に記載のヌクレオチド配列の各々と、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％、１００％、若しくは約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９
４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、又はこれらの
値のうちの任意の２つの間の範囲の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それ
らからなる。いくつかの実施形態において、クローニングベクター又は発現ベクターは、
配列番号８に記載のヌクレオチド配列と、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、若しくは約８５％、約９０
％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８
％、約９９％、約１００％、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の配列同一性
を有するヌクレオチド配列を含むか、それらからなる。
治療用組成物及び薬学的製剤
別の態様において、有効量の少なくとも１つの治療剤と、以下のａ）本明細書で開示さ
れる複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物、ｂ）本明細書に開示
される発現カセット、及び本明細書に開示されるクローニングベクター又は発現ベクター
のうちの１つ以上と、を含む、治療用組成物の実施形態が、本明細書で開示される。
この作用剤を原料物質として投与することが可能であるが、その効力を考慮して、これ
らを薬学的製剤として付与することが好ましい。したがって、本明細書で開示される組成
物のいくつかの実施形態において、組成物は、薬学的製剤に更に製剤化される。「薬学的
製剤」とは、本明細書で使用する場合、薬剤を含む、個体に投与するのに好適な組成物を
指す。例えば、本開示のいくつかの態様及び実施形態に従う薬学的製剤は、本明細書に開
示される抗ｍｉＲアンタゴニスト及び無菌水溶液を含むことができる。例えば、ヒトでの
使用のための本開示の薬学的製剤は、作用剤を１つ以上の許容されるその担体及び任意選
択で他の治療成分と一緒に含む。担体は、製剤の他の成分と相溶性であり、その受容者に
有害ではないか、あるいは活性剤の阻害機能に有害ではないという意味で「許容され」な
ければならない。望ましくは、薬学的製剤は、作用剤と非相溶性であることが知られてい
る酸化剤及び他の物質を含むべきではない。
したがって、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の治療用組
成物及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤に関する。製剤はまた、希釈剤、安定
化剤、賦形剤、及びアジュバントなどの追加の成分を含むことができる。本明細書で使用
する場合、「薬学的に許容される」担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、又は安定化剤
は、使用される投薬量及び濃度において暴露される細胞又は対象に対して非毒性（好まし
くは不活性）であるか、あるいは熟練した専門家によって決定される許容される毒性レベ
ルを有するものである。
緩衝剤をまた、薬学的製剤に含めて製剤に好適なｐＨ値を提供することができる。好適
なそのような材料には、リン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムが含まれる。塩化ナトリウ
ム又はグリセリンを用いて、血液と等張な製剤を提供することができる。所望する場合、
製剤は、窒素などの不活性雰囲気下で容器内に充填するか、あるいは抗酸化剤を含有する
ことができ、例えば密封したアンプル中において単位用量又は複数用量（multi−dose）
形態で好都合に提供することができる。
担体、希釈剤及びアジュバントは、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプ
チド（例えば、約１０残基未満）、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどの
タンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アス
パラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース又はデキストリ
ンを含む、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトー
ル又はソルビトールなどの糖アルコール類、ナトリウムなどの塩を形成する対イオンをす
る、及び／又はＴｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むことができる。いくつかの実施形態に
おいて、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。
一般的に、本明細書に開示される薬学的製剤は、当該技術分野で既知の方法及び技術の
うちの任意のものによって調製することができる。例えば、固体剤形は、湿式造粒、乾式
造粒、直接圧縮などによって調製することができる。いくつかの実施形態において、本開
示の固体剤形は、持続作用の利点が得られる剤形を提供するようにコーティングするか、
さもなくば配合する（compounded）ことができる。例えば、錠剤又は丸剤は、内部投薬成
分（inner dosage component）及び外部投薬成分（outer dosage component）を含むこと
ができ、後者は、前者を包む外皮の形態にある。いくつかの実施形態において、２つの成
分を腸溶性層により分離することができ、この腸溶性層は胃での消化に耐え、内部成分を
無傷で十二指腸まで通過させるか、あるいは放出を遅延させるように作用する。これらの
例において、様々な材料をそのような腸溶性層又はコーティングに使用することができ、
そのような材料には、いくつかの高分子酸及び高分子酸とシェラック、セチルアルコール
、及び酢酸セルロースなどの材料との混合物が含まれる。
投与される発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストのうちの１つ以上の力価
は、例えば、特定の発現ベクター、投与形式、処置目的、個人、及び標的の細胞型に応じ
て変化し、当該技術分野における標準的な方法によって決定することができる。
当業者に容易に理解されるように、投与される発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアン
タゴニストのうちの１つ以上の有用なインビボ投与、及び特定の投与形式は、年齢、体重
、苦痛の重篤度、及び処置される動物種、使用される特定の発現ベクター、並びに発現ベ
クター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストのうちの１つ以上が使用される特定の用途に
応じて変化するであろう。所望の結果を達成するのに必要な投薬量レベルである有効な投
薬量レベルの決定は、ルーチンの薬理学的方法を用いて当業者によって達成することがで
きる。典型的には、製品のヒトへの臨床適用はより低い投薬量レベルで開始され、所望の
効果が達成されるまで投薬量レベルを増加する。あるいは、許容されるインビトロ研究を
用いて、確立した薬理学的方法を使用して本方法によって同定される組成物の有用な用量
及び投与経路を確立することができる。
例えば、最適な所望の応答を提供するように、投薬計画を調整することができる。例え
ば、単回用量を投与してもよいし、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよいし、あ
るいは治療状況の緊急性による適応があれば用量を比例的に増減してもよい。容易な投与
及び均一な投薬量のための単位剤形で非経口組成物及び製剤を投与することが、特に有利
である。単位剤形とは、本明細書で使用する場合、処置される哺乳動物対象のための単位
投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体に関連して
所望の治療効果を生じるように算出された所定量の活性化合物を含有する。本開示の単位
剤形の特定は、（ａ）治療剤の固有の特徴及び達成される特定の治療又は予防効果と、（
ｂ）個体における感受性（sensitivity）の処置のためのそのような活性化合物の配合の
当該技術分野での固有の制限と、によって決定され、かつそれらに直接的に依存する。
したがって、当業者は、本明細書に開示された開示に基づき、治療技術分野で周知の方
法に従って用量及び投与計画が調整されることを理解するであろう。すなわち、最大許容
用量は容易に定めることができ、患者に検出可能な治療利益を提供する有効量はまた、各
薬剤を投与して患者に検出可能な治療利益を提供する時間的要件に応じて決定することが
できる。したがって、ある特定の用量及び投与計画を本明細書で例示するが、これらの例
は、本開示を実施する際に患者に提供され得る用量及び投与計画を何ら限定するものでは
ない。
投薬量値は、緩和される状態のタイプ及び重篤度に応じて変えることができ、単回又は
複数回用量を含むことができることに注意されたい。任意の特定の対象について、特定の
投薬計画は、個々の必要性、及び組成物を投与する人又は組成物を投与することを指導す
る人の専門的判断に応じて経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載の投薬量範囲
は、単なる例示的であって、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲又は実施の限定を意図
するものではないことを更に理解されたい。例えば、用量は、毒性効果及び／又は実験値
などの臨床効果を含み得る薬物動態又は薬力学的パラメータに基づいて調整することがで
きる。したがって、本開示は、当業者によって決定される患者内用量漸増（dose−escala
tion）を包含する。治療剤の適切な投薬量及び投与計画の決定は、関連技術分野において
周知であり、本明細書で開示される教示が一度提供されると当業者は包含することを理解
するであろう。
本明細書に開示される発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストは、投与の必
要がある対象（例えば、ヒト）に投与することができる。投与経路は特に限定されない。
例えば、治療上有効量の組換えウイルスは、当該技術分野で標準的な経路により対象に投
与することができる。経路の非限定例には、筋肉内、膣内、静脈内、腹腔内、皮下、経皮
、皮内、直腸、眼内、肺、頭蓋内、骨内、経口、口腔内、又は経鼻が含まれる。いくつか
の実施形態において、組換えウイルスは、筋肉内注射により対象に投与される。いくつか
の実施形態において、組換えウイルスは、膣内注入により対象に投与される。いくつかの
実施形態において、発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストは、非経口経路（
例えば、静脈内、筋肉内又は皮下注射など）、若しくは表面の乱切（surface scarificat
ion）、又は対象の体腔内への接種により、対象に投与される。いくつかの実施形態にお
いて、発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストは、心筋の細胞などの筋細胞に
投与される。
これらの低分子ｍｉＲオリゴヌクレオチドアンタゴニスを注射により投与する場合、持
続注入又は単回若しくは複数回ボーラスにより投与することができる。投与されるｍｉＲ
アンタゴニストの投薬量は、患者の年齢、体重、性別、一般的な医学的状態、及びこれま
での病歴などの要因に依存して変化するであろう。典型的には、受容者に約１ｐｇ／ｋｇ
〜１０ｍｇ／ｋｇ（薬剤の量／患者の体重）の範囲の分子の投薬量を付与することが望ま
しいが、より低い又はより高い投薬量もまた投与することができる。
いくつかの実施形態において、他の臓器への治療薬の送達を制限しながら、心臓への治
療薬の送達を標的化することが望ましい可能性がある。これは、当該技術分野で既知のい
くつかの方法のうちの任意の１つによって達成することができる。いくつかの実施形態に
おいて、本明細書に記載の治療用組成物又は薬学的製剤の心臓への送達は、冠動脈注入を
含む。ある特定の実施形態において、冠動脈注入は、大腿動脈を通してカテーテルを挿入
し、大動脈を通して冠動脈の先端へとカテーテルを通過させることを含む。更にいくつか
の他の実施形態において、心臓への治療薬の標的化送達は、従前に記載されたもの（Ｓｏ
ｎｇ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５）など
の抗体−プロタミン融合タンパク質を用いて、本明細書に開示された低分子ｍｉＲアンタ
ゴニストを送達することを含む。
発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストの実際の投与は、発現ベクター及び
／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストを対象の標的組織内に輸送する任意の物理的方法を用い
ることによって達成することができる。例えば、発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアン
タゴニストは、筋肉、血流、及び／又は直接肝臓に注入することができる。薬学的製剤は
、経皮的輸送によって筋肉に送達するための注射用製剤又は局所製剤として調製すること
ができる。
筋肉内注射のために、胡麻油若しくは落花生油などのアジュバント又は水性プロピレン
グリコールの溶液、並びに滅菌水溶液を用いることができる。所望の場合、そのような水
溶液を緩衝化することができ、液体希釈剤をまず食塩水又はグルコースと等張にすること
ができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸塩を含有する）としての発現ベクター及び／若し
くはｍｉＲＮＡアンタゴニスト又は薬理学的に許容される塩の溶液は、ヒドロキシプロピ
ルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。発現ベク
ター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチ
レングリコール、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。通常の保
存及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有
する。
使用する発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストは、（凍結乾燥プロセス中
にウイルスを保護するための１つ以上の好適な防腐剤及び／又は保護剤と組み合わせて）
液体又は凍結乾燥形態で利用することができる。（例えば、特定の遺伝子産物によって改
善することができる神経学的障害の）遺伝子治療のために、治療用タンパク質を発現する
組換えウイルスの治療上有効用量をそのような処置を必要とする宿主に投与する。宿主内
で免疫を誘導する又は遺伝子治療薬を宿主に付与するための薬剤の製造における、本明細
書に開示される発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストの使用は、本出願の範
囲内である。
発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストに対するヒト用投薬量が少なくとも
いくつかの状態に対して確立されている例において、その同じ投薬量又は確立されたヒト
用投薬量の約０．１％〜約５００％、より好ましくは約２５％〜約２５０％の投薬量を用
いることができる。新たに発見された薬学的製剤の場合のようなヒト用投薬量が確立して
いない場合、好適なヒト用投薬量は、動物における毒性の研究及び効力の研究から定量化
される、ＥＤ５０若しくはＩＤ５０値又はインビトロ若しくはインビボにおける研究から
得られる他の適切な値から推測することができる。
治療上有効量の発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストを、様々な時点で対
象に投与することができる。例えば、発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニスト
を、ウイルスの感染前、感染中、又は感染後に対象に投与することができる。発現ベクタ
ー及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストをまた、疾患（例えば、癌）の発生前、発生中、
又は発生後に対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、発現ベクター
及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストを、癌寛解中に対象に投与することができる。いく
つかの実施形態において、発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストを、免疫予
防のためのウイルス感染前に対象に投与することができる。
あるいは又は更に、発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストの投与頻度を変
えることができる。例えば、発現ベクター及び／又はｍｉＲＮＡアンタゴニストを、毎週
約１回、２週間毎に約１回、１ヶ月毎に約１回、６ヶ月毎に約１回、１年毎に約１回、２
年毎に約１回、３年毎に約１回、４年毎に約１回、５年毎に約１回、６年毎に約１回、７
年毎に約１回、８年毎に約１回、９年毎に約１回、１０年毎に約１回、又は１５年毎に約
１回、対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、発現ベクター及び／
又はｍｉＲＮＡアンタゴニストを、毎週最大約１回、２週間毎に最大約１回、１ヶ月毎に
最大約１回、６ヶ月毎に最大約１回、１年毎に最大約１回、２年毎に最大約１回、３年毎
に最大約１回、４年毎に最大約１回、５年毎に最大約１回、６年毎に最大約１回、７年毎
に最大約１回、８年毎に最大約１回、９年毎に最大約１回、１０年毎に最大約１回、又は
１５年毎に最大約１回、対象に投与することができる。
いくつかの実施形態において、上記の治療用組成物及び薬学的製剤のいずれかと、（ａ
）製剤が、例えば心筋細胞などの心筋の細胞において心疾患に関連する遺伝子の機能を阻
害するのに有用であることを示す書面情報、及び／又は（ｂ）薬学的製剤の投与について
の指針を提供する書面情報と、を含む、薬学的キットを提供する。
ＩＶ．開示方法
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、対象における心臓疾患を処置するための
方法に関する。本方法は、心臓疾患の処置に好適な治療用組成物を対象に投与又は付与す
ることを含み、（ａ）治療用組成物は、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（ｍ
ｉＲ）アンタゴニストを含む組成物であり、（ｂ）治療用組成物は、本明細書に開示され
る発現カセットを含み、あるいは（ｃ）治療用組成物は、本明細書に開示されるクローニ
ングベクター又は発現ベクターを含む。
本開示のいくつかの実施形態は、対象における心筋再生を促進する方法に関する。本方
法は、治療用組成物を対象に投与又は付与することを含み、（ａ）治療用組成物は、本明
細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物であり、
（ｂ）治療用組成物は、本明細書に開示される発現カセットを含み、あるいは（ｃ）治療
用組成物は、本明細書に開示されるクローニングベクター又は発現ベクターを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される対象における心臓疾患を処置する
ため又は心筋の再生を促進するための方法は、心臓疾患を有するか又は疑いがある対象を
同定又は選択するプロセスを任意選択で含む。いくつかの実施形態において、同定又は選
択プロセスは、全ての治療用組成物及び治療剤又は治療薬の投与前に行われる。いくつか
の実施形態において、同定又は選択プロセスは、治療用組成物及び治療剤又は治療薬のう
ちの少なくとも１つの投与前に行われる。
いくつかの実施形態において、心臓疾患は、心筋梗塞、虚血性心疾患、心不全（例えば
、鬱血性心不全）、虚血性心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、アルコール性心筋症、
ウイルス性心筋症、頻脈誘発性心筋症、ストレス誘起性心筋症、アミロイド心筋症、不整
脈源性右室異形成、左室緻密化障害、心内膜線維弾性症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁逆流
症、僧帽弁狭窄症、僧帽弁逆流症、僧帽弁逸脱症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁狭窄症、肺
動脈弁逆流症、三尖弁狭窄症、三尖弁逆流症、先天性障害、遺伝的障害又はそれらの組み
合わせである。いくつかのある特定の実施形態において、心疾患は、心筋梗塞である。い
くつかの他のある特定の実施形態において、心疾患は、心筋再生が必要である、虚血性心
疾患である。更にいくつかの他のある特定の実施形態において、心疾患は、デュシェンヌ
型筋ジストロフィーである。
別の態様において、心筋細胞及び／又は筋細胞の増殖を調節するための方法の実施形態
が、本明細書に開示される。本方法は、（１）治療用組成物を心筋細胞に導入することと
、ここで、（ａ）治療用組成物は、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ
）アンタゴニストを含む組成物であり、（ｂ）治療用組成物は、本明細書に開示される発
現カセットを含み、あるいは（ｃ）治療用組成物は、本明細書に開示されるクローニング
ベクター又は発現ベクターを含み、（２）（１）から得られる心筋細胞を分裂させ、それ
により心筋細胞又は筋細胞の増殖を調節することを可能にすることと、を含む。いくつか
の実施形態において、心筋細胞への治療用組成物の導入は、心筋細胞及び／又は筋細胞を
、複数のｍｉＲアンタゴニストをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの発現カセッ
ト又は少なくとも１つのウイルスベクターでトランスフェクトすることを含む。いくつか
の実施形態において、本方法は、心筋細胞及び／又は筋細胞の増殖を測定することを更に
含む。いくつかの実施形態において、心筋細胞及び／又は筋細胞の増殖は、複数のｍｉＲ
−アンタゴニストをコードする核酸配列を欠損している対照の心筋細胞及び／又は筋細胞
と比較して増加する。
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、投与工程は、細胞培養にお
ける細胞（すなわち、エクスビボ）又は生体中の細胞に対して行うことができる。したが
って、いくつかの実施形態において、心筋細胞及び／又は筋細胞は、インビボである。い
くつかの他の実施形態において、心筋細胞及び／又は筋肉は、エクスビボである。いくつ
かの実施形態において、心筋細胞及び／又は筋細胞は、ヒト対象のものである。いくつか
の実施形態において、ヒト対象は、心疾患に罹患しているとして選択又は同定される。
治療的組成物又は薬学的製剤が、本明細書に開示される複数のｍｉＲ−アンタゴニスト
をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット又は発現ベクターを含む、本明細書に
開示される方法のいくつかの実施形態において、複数のｍｉＲ−アンタゴニストは、１つ
以上の発現カセット又は発現ベクターによってコードされることができる。いくつかの実
施形態において、複数のｍｉＲ−アンタゴニストは、単一の発現カセット又は発現ベクタ
ーによってコードされる。いくつかの実施形態において、複数のｍｉＲ−アンタゴニスト
は、２、３、４、５、又は６以上の発現カセット又は発現ベクターによってコードされる
。いくつかの実施形態において、複数のｍｉＲアンタゴニストは、同じタイプの発現カセ
ット又は発現ベクターによってコードすることができる。いくつかの実施形態において、
複数のｍｉＲアンタゴニストは、異なるタイプの発現カセット又は発現ベクターによって
コードすることができる。
治療的組成物又は薬学的製剤が、クローニングベクター又は発現ベクターを含む、本明
細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルス、プラスミ
ド、コスミド、ファージ、又はそれらの任意の組み合わせに由来することができる。いく
つかの実施形態において、ベクターは、組み込み型ベクターである。いくつかの実施形態
において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイル
スベクターは、レンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであ
る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
ベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶ２／９ベクタ
ーである。
一態様において、心臓細胞の増殖を増加させる、並びに／又は筋肉の構造及び／若しく
は機能及び／若しくは再生に関与するタンパク質の発現及び／若しくは活性を増加させる
方法の実施形態が、本明細書において開示される。この方法は、心臓細胞に、（１）治療
用組成物（ここで、（ａ）治療用組成物は、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ
（ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物であり、（ｂ）治療用組成物は、本明細書に開示
される発現カセットを含み、あるいは（ｃ）治療用組成物は、本明細書に開示されるクロ
ーニングベクター又は発現ベクターを含む）、及び（２）少なくとも１つの追加の治療剤
又は治療薬との組み合わせを接触させる又は提供することを含む。関連する態様において
、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、標的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の発現を
阻害又は減少するための方法に関する。この方法は、心臓細胞に、（１）治療用組成物（
ここで、（ａ）治療用組成物は、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）
アンタゴニストを含む組成物であり、（ｂ）治療用組成物は、本明細書に開示される発現
カセットを含み、あるいは（ｃ）治療用組成物は、本明細書に開示されるクローニングベ
クター又は発現ベクターを含む）、及び（２）少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬
の組み合わせを接触させる又は提供することを含む。上記の態様に従った方法において、
心臓細胞は、一般的に、任意の心臓細胞であることができる。本明細書に開示される方法
に好適な心臓細胞の非限定例には、心臓線維芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑
筋細胞（ＶＳＭＣ）が含まれる。いくつかの実施形態において、心臓細胞は、心筋細胞又
は骨格筋細胞である。いくつかの実施形態において、心臓細胞は、心筋細胞である。いく
つかの実施形態において、（ｍｉＲ）標的遺伝子は、心疾患に関連する遺伝子である。
更に別の態様において、筋ジストロフィー（ＭＤ）障害を処置するための方法の実施形
態が本明細書において開示され、この方法は、治療用組成物を対象に接触させる又は付与
することを含み、（ａ）治療用組成物は、本明細書に開示される複数のマイクロＲＮＡ（
ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物であり、（ｂ）治療用組成物は、本明細書に開示さ
れる発現カセットを含み、あるいは（ｃ）治療用組成物は、本明細書に開示されるクロー
ニングベクター又は発現ベクターを含み、治療用組成物の投与が、有効量の少なくとも１
つの追加の治療剤又は少なくとも１つの追加の治療と組み合わせて行われて、併用療法を
提供する。いくつかの実施形態において、筋ジストロフィーは、筋ジストロフィー障害は
、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、先天性
筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、エメリー・
ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、遺伝性及び内分泌性ミオパチー、筋肉の代
謝疾患、ミトコンドリアミオパチー（ＭＭ）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ）、球脊
髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）又はこれらの組み合わせに関連する。
Ｖ．併用療法
いくつかの実施形態において、配列表に提供されているマイクロＲＮＡアンタゴニスト
などの本明細書に開示されるマイクロＲＮＡアンタゴニストを含む治療的組成物若しくは
薬学的製剤、若しくは本明細書に開示されるマイクロＲＮＡアンタゴニストの組み合わせ
を含む治療的組成物若しくは薬学的製剤、若しくは本明細書中に開示される１つ以上のマ
イクロＲＮＡアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット、又はそ
のような発現カセットのうちの１つ以上を含むベクターを、１つ以上の追加の治療剤と組
み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、配列表に提供されてい
るマイクロＲＮＡアンタゴニストなどの本明細書に開示されるマイクロＲＮＡアンタゴニ
ストを含む治療的組成物若しくは薬学的製剤、若しくは本明細書に開示されるマイクロＲ
ＮＡアンタゴニストの組み合わせを含む治療的組成物若しくは薬学的製剤、若しくは本明
細書中に開示される１つ以上のマイクロＲＮＡアンタゴニストをコードするヌクレオチド
配列を含む発現カセット、又はそのような発現カセットのうちの１つ以上を含むベクター
を、１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて使用することができる。
一般的に、筋ジストロフィーのための薬理学的又は非薬理学的な任意の治療手法は、本
明細書で開示される方法において追加の治療剤及び治療薬として好適に使用できる。本明
細書に開示されるマイクロＲＮＡアンタゴニストと組み合わせて使用することができる追
加の治療剤及び治療薬、若しくは本明細書に開示されるマイクロＲＮＡアンタゴニストの
組み合わせを含む組成物若しくは製剤、若しくは本明細書に開示の１つ以上のマイクロＲ
ＮＡアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット、又はそのような
発現カセットのうちの１つ以上を含むベクターの例には、イデベノン、エプレレノン、Ｖ
ＥＣＴＴＯＲ、ＡＶＩ−４６５８、アタルレン／ＰＴＣ１２４／Ｔｒａｎｓｌａｒｎａ、
ＢＭＮ０４４／ＰＲＯ０４４、ＣＡＴ−１００４、マイクロジストロフィンＡＡＶ遺伝子
治療薬（ＳＧＴ−００１）を含むＭＤ用の任意の治療薬、ガレクチン１−治療薬（ＳＢ−
００２）、ＬＴＢＢ４（ＳＢ−００１）、ｒＡＡＶ２．５−ＣＭＶ−ミニジストロフィン
、グルタミン、ＮＦＫＢ阻害剤、サルコグリカン、デルタ（３５ｋＤａジストロフィン関
連糖タンパク質）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）発現、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓ９システムによるゲノム編集、機能性組換え型のヒトジストロフィン遺伝子を再導入す
ることを目的とした任意の遺伝子送達治療薬、エクソンスキッピング治療薬、ナンセンス
突然変異に対するリードスルー戦略、細胞ベースの治療薬、ユートロフィンアップレギュ
レーション、ミオスタチン阻害、抗炎症薬／抗酸化剤、機械補助装置、筋ジストロフィー
のための任意の標準的治療薬、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定され
ない。
本開示の方法に有用な追加の治療剤にはまた、抗血小板治療薬、血栓溶解薬、一次血管
形成剤（primary angioplasty）、ヘパリン、硫酸マグネシウム、インスリン、アスピリ
ン、コレステロール低下薬、アンジオテンシン受容体遮断薬（angiotensin-receptor blo
cker、ＡＲＢ）及びアンギオテンシン変換酵素（angiotensin-converting enzyme、ＡＣ
Ｅ）阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。特に、ＡＣＥ阻害剤は、慢性心不全及
び高危険度の急性心筋梗塞を有する患者を処置するために使用される場合に明確な利点を
有する。これは、可能性として、ＡＣＥ阻害剤が、アンジオテンシンＩＩによる炎症性サ
イトカインの生成を阻害するからである。追加の治療剤及び治療薬の非限定的な列挙には
、ＡＣＥ阻害剤、例えば、カプトプリル、エナラプリル、リジノプリル、若しくはキナプ
リル；アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、例えば、バルサルタン；β遮断薬、例えば、
カルベジロール、メトプロロール、及びビソプロロール；血管拡張薬（一酸化窒素を介す
る）、例えば、ヒドララジン、硝酸イソソルビド、及び一硝酸イソソルビド；スタチン、
例えば、シンバスタチン、アトロバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ロスバス
タチン若しくはプラバスタチン；抗凝固薬、例えば、アスピリン、ワルファリン若しくは
ヘパリン；又は変力薬、例えば、ドブタミン、ドーパミン、ミルリノン、アムリノン、ニ
トロプルシド、ニトログリセリン、若しくはネシリチド；強心配糖体、例えば、ジゴキシ
ン；抗不整脈薬、例えば、ベラパミル及びジルチアゼムなどのカルシウムチャネル遮断薬
、又はアミオダロン、ソタロール若しくはドフェチリドなどのクラスＩＩＩ抗不整脈薬；
利尿薬、例えば、フロセミド、ブメタニド、若しくはトルセミドなどのループ利尿薬、ヒ
ドロクロロチアジドなどのチアジド利尿剤、スピノロラクトン若しくはエプレレノンなど
のアルドステロン拮抗薬が含まれる。あるいは又は更に、心疾患の他の処置、例えば、ペ
ースメーカー、除細動器、カウンタパルセイションデバイス（大動脈内バルーンポンプ又
は非侵襲性カウンタパルセイション）などの機械的循環補助、心肺補助装置、又は左心室
補助装置もまた好適である。手術、例えば、心臓移植、心肺移植、若しくは心臓腎移植、
又は免疫抑制剤、例えば、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、シクロスポリ
ン、シロリムス、タクロリムス、コルチコステロイド、サイモグロブリン若しくはＡＴＧ
ＡＭなどの抗胸腺細胞グロブリン、ＯＫＴ３、バシリキシマブ又はダクリズマブなどのＩ
Ｌ−２受容体抗体もまた好適である。
いくつかの実施形態において、追加の治療剤又は治療薬のうちの少なくとも１つは、生
物学的薬物を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤又は治
療薬は、遺伝子治療薬又は治療用遺伝子調節剤を含む。本明細書で使用する場合、治療用
遺伝子調節とは、病気のいくつかの形態を緩和する目的で様々な段階で遺伝子の発現を変
化させるプラクティスを指す。遺伝子調節は、例えば新規な調節タンパク質をコードする
遺伝子の導入により内因性遺伝子の発現の変化を得ようとするが、遺伝子治療薬は、遺伝
子産物が受容者を直接的に救済する遺伝子の導入に関する点で、遺伝子調節は遺伝子治療
薬とは異なる。遺伝子発現の調節は、例えば人工転写因子、小分子、又は合成オリゴヌク
レオチドであり得るＤＮＡ結合剤により、転写のレベルで媒介され得る。あるいは又は更
に、それは、ＲＮＡ干渉により転写後に媒介され得る。
本明細書に開示される治療用組成物、薬学的製剤、及び追加の治療剤又は治療薬を、特
定の意図する用途に好適な最終的な薬学的調製物に更に製剤化することができる。いくつ
かの実施形態において、治療用組成物及び追加の治療剤又は治療薬は、単一の製剤で投与
される。いくつかの実施形態において、治療用組成物及び追加の治療剤又は治療薬の各々
は、別々の製剤で投与される。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において
、治療用組成物及び／又は追加の治療剤若しくは治療薬は、単回用量で対象に投与される
。いくつかの実施形態において、治療用組成物及び／又は追加の治療剤若しくは治療薬は
、複数回投薬量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、投薬量は互いに等し
い。いくつかの実施形態において、投薬量は互いに異なる。いくつかの実施形態において
、治療用組成物及び／又は追加の治療剤若しくは治療薬は、経時的に投薬量を徐々に増加
させて対象に投与される。いくつかの実施形態において、治療用組成物及び／又は追加の
治療剤若しくは治療薬は、経時的に投薬量を徐々に減少させて対象に投与される。
治療用組成物及び薬学的製剤、並びに１つ以上の追加の治療剤又は治療薬の投与の順序
は、変えてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示され治療的組成物又は
薬学的製剤は、全ての追加の治療剤又は治療薬を投与する前に投与することができる。い
くつかの実施形態において、本明細書に開示される治療用組成物又は薬学的製剤は、少な
くとも１つの追加の治療剤又は治療薬を投与する前に投与することができる。いくつかの
実施形態において、本明細書に開示される治療用組成物又は薬学的製剤は、１つ以上の追
加の治療剤又は治療薬と同時に投与することができる。更に他の実施形態において、本明
細書に開示される治療用組成物又は薬学的製剤は、少なくとも１つの追加の治療剤又は治
療薬の投与後に投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示さ
れる治療用組成物又は薬学的製剤は、全ての追加の治療剤又は治療薬の投与後に投与する
ことができる。更にいくつかの実施形態において、本明細書に開示される治療用組成物又
は薬学的製剤、及び少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬は、輪番（例えば、サイク
リング療法（cycling therapy））で投与される。例えば、いくつかの実施形態において
、本明細書に開示される治療用組成物又は薬学的製剤、及び少なくとも１つの追加の治療
剤又は治療薬が、対象に循環的に投与される。サイクリング療法は、ある期間の第１の活
性剤又は治療薬の投与に続く、ある期間の第２の活性剤又は治療薬の投与、及びこの逐次
投与の繰り返しを伴う。サイクリング療法は、１つ以上の治療薬に対するに抵抗性の発達
を低減させ、１つ以上の治療薬の副作用を回避若しくは低減させ、及び／又は処置の効力
を改善させることができる。
いくつかの実施形態において、間欠療法は、持続療法の代替物である。例えば、間欠療
法を６ヶ月間使用した後、６ヶ月間空けることができる。いくつかの実施形態において、
１つ以上の治療剤又は治療薬を１ヶ月間使用した後、１ヶ月間空けることができる。いく
つかの実施形態において、１つ以上の治療剤又は治療薬を３ヶ月間使用した後、３ヶ月間
空けることができる。したがって、本明細書に開示される治療用組成物又は薬学的製剤の
うちの１つ以上は、上記の１つ以上の治療剤又は治療薬の投与前、投与中、及び／又は投
与後に付与することができる。
本明細書で記載されている全ての公開物及び特許出願は、各々の公開物又は特許出願が
具体的に個々に示されて参照により組み込まれているのと同じ程度で、参照により本明細
書に組み込まれる。
本明細書で引用される任意の参照物が従来技術を構成すると認めるものではない。参照
物の議論はその著者が主張する事項を述べており、本出願人は引用する文書の正確性及び
妥当性に異議を唱える権利を留保する。雑誌論文、特許文書、及び教科書を含む多くの情
報源を本明細書で参照するが、この参照により、これらの文書のうちの任意のものが当該
技術分野における一般知識の一部をなすことを認めるものではないことは明確に理解され
るであろう。
本明細書で提供される一般的な方法の議論は、例示目的のためだけであることが意図さ
れる。他の代替方法及び代替物は、本開示を検討した際に当業者に明らかとなり、本出願
の趣旨及び範囲内に含まれる。
更なる実施形態は、以下の実施例において更に詳細に開示され、この実施例は、本開示
の範囲又は特許請求の範囲を限定することを何ら意図するものではない。
実施例１
特定のマイクロＲＮＡのための阻害オリゴヌクレオチドの設計
この実施例は、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、
及びＬｅｔ−７ｃ−５ｐのアンタゴニストとして用いることができる合成オリゴヌクレオ
チドの設計及び組成物について示す。
下記のヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列を分析した：ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍ
ｉＲ−１００−５ｐ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びＬｅｔ−７ｃ−５ｐ。これらのマイクロＲ
ＮＡの配列及び相補的なアンタゴニスト配列を以下の表５に示す。太字で強調した塩基は
、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びｌｅｔ−７ｃ−５ｐの間の差又はｍｉＲ−９９ａ−５ｐ及びｍ
ｉＲ−１００−５ｐの間の塩基の差に対応する。全てのマイクロＲＮＡのシード配列は、
５’末端から始まる塩基２〜８であると一般的に考えられる。任意の特定の理論により拘
束されることを望むことなく、マイクロＲＮＡのシード配列内の核酸塩基は、どのｍＲＮ
ＡがマイクロＲＮＡによって標的化されることかの決定に最大の寄与をする塩基であると
考えられる。下記の表５に列挙された配列において、シードの配列には下線を引いてある
。
異なる哺乳動物種由来の対応するマイクロＲＮＡ同族体の配列保存の更なる評価も検査
した。下記式６に示されるように、異なる哺乳動物種由来のｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉ
Ｒ−１００−５ｐ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びＬｅｔ−７ｃ−５ｐのヌクレオチド配列は、
高い配列相同性を示すことが観察された。Ｌｅｔ−７ａ−５ｐのヌクレオチド配列は、分
析した全ての種にわたって１００％相同である。Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐのヌクレオチド配列
はまた、分析した全ての種にわたって１００％相同である。イヌ由来のｍｉＲ−９９ａ−
５ｐの配列は、核酸塩基＃を欠失しており、その他の点では、全ての他の配列は相同であ
る。イヌはｍｉＲ−１００ｍｉＲＮＡがなく、その他の点では、全ての他の配列は相同で
ある。
合計で２０個（２０）の抗ｍｉＲオリゴヌクレオチド化合物を設計し、ｌｅｔ−７ａ−
５ｐ／ｌｅｔ−７ｃ−５ｐファミリーについて１０個及びｍｉＲ−９９ａ−５ｐ／ｍｉＲ
−１００−５ｐファミリーについて１０個を含んだ。Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを標的化する２
つの抗ｍｉＲ設計は、ＪＲＸ０１００、ＪＲＸ０１０２であり、それらを使用してＬｅｔ
−７ａ−５ｐを阻害することができた。Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを標的化する２つの抗ｍｉＲ
設計は、ＪＲＸ０１０１及びＪＲＸ０１０３であり、それらを使用してＬｅｔ−７ａ−５
ｐを阻害することができた。Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びＬｅｔ−７ｃ−５ｐの両方を標的化
する６つの抗ｍｉＲ設計は、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ
０１０７、ＪＲＸ０１０８、及びＪＲＸ０１０９である。ｍｉＲ−１００ａを標的化する
５つの抗ｍｉＲ設計は、ＪＲＸ０１１０、ＪＲＸ０１１３、ＪＲＸ０１１５、ＪＲＸ０１
１７、及びＪＲＸ０１１９である。ｍｉＲ−９９ａを標的化する５つの抗ｍｉＲ設計は、
ＪＲＸ０１１１、ＪＲＸ０１１２、ＪＲＸ０１１４、ＪＲＸ０１１６、及びＪＲＸ０１１
８である。この実験では、設計では、ロックド核酸（ＬＮＡ）化学修飾（＋）が使用され
、ここで、２’−Ｏ−酸素がメチレンリンカーを介して４’位に架橋されて剛性の二環（
ｂｉｃｙｃｌｅ）を形成し、Ｃ３’末端（ＲＮＡ）糖構造にロックされ、これにより、ヌ
クレアーゼ分解に対する抵抗性及びその相補的ＲＮＡ塩基に対する非常に高い親和性が可
能となる。これらの修飾は、エクソヌクレアーゼ抵抗性を向上することなどによる安定性
のために、表７の配列中の（＋）によって指定される分子の各端部において、及び標的化
されたｍｉＲに対する親和性を増加させることで、マイクロＲＮＡ阻害剤としての効力を
増加するために、シードに相補的な領域において、特に組み込まれる。抗ｍｉＲの骨格は
、ホスホロチオエートであり（下記の表７の＊によって示される）、これは動物での広い
分布を可能にする。この型の骨格は、ＲＩＳＣ複合体における特定のマイクロＲＮＡの立
体障害（steric blockade）により機能する。抗ｍｉＲオリゴヌクレオチド化合物は、ヘ
テロ二本鎖が形成される可能性を回避するために比較的短い状態を注意して保ったが、血
漿タンパク質を効率的に結合し、この血漿タンパク質が腎臓における循環から除去されな
いようにすることで、その生体内分布特性を改善するのに十分な長さを有していた。２０
個の抗ｍｉＲ設計及びそれぞれの標的マイクロＲＮＡの概要を下記の表７に示す。
表７に示すように、いくつかのｍｉＲ−７ファミリーの抗ｍｉＲは、関心のあるｌｅｔ
−７ｃ−５ｐ及びｃアイソフォームの両方と１００％相同であり、両方のメンバーを阻害
するであろう。対照的に、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ及びｍｉＲ−１００ファミリーの抗ｍｉ
Ｒは各々、これらのｍｉＲにおいて１塩基の位置が異なることにより、ファミリーメンバ
ーうちの１つと１００％相同のみとなる。しかしながら、実際には、２つのファミリーの
各々について設計された抗ｍｉＲの全てが、関心のあるファミリーメンバーの両方を阻害
することができるが、その理由は、標的認識と同様に、シード領域（塩基２〜８）が、抗
ｍｉＲ活性の決定に最も重要な領域だからである。
以下に更に詳細に記載するように、これらの合成抗ｍｉＲの阻害活性を、商業的なレポ
ーターベクターシステムである、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）に
より入手可能なｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ発現レポーターベクターシス
テム（部品番号ＡＭ５７９５、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（例えば、図３
を参照のこと）を用いて、続いて評価することができる。このシステムでは、関心のある
マイクロＲＮＡ結合部位が、レポータールシフェラーゼのコード配列の下流に位置する多
重クローニング部位に挿入される。
例２
アデノウイルスベクターＪＢＴ−ｍｉＲ１の設計
この実施例は、ＲＮＡｉ技術を用いて、修飾されたヘアピンＺｉｐ構築物、並びにマイ
クロＲＮＡ ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及
びｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐの阻害配列を発現するベクターの設計を例示する実験結果
の概要を示す。本発明の実験において、ＲＮＡｉ技術は、標的細胞内において塩基対単鎖
ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形態で行い、これは、内因性ｍｉＲ経路を介し
て約２０塩基対低分子干渉ＲＮＡにプロセシングされる。低分子ヘアピンＲＮＡ又は短鎖
ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、一般的に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的遺伝子
の発現をサイレンシングする（silence）のに使用することができる、密接なヘアピンタ
ーンを有する人工ＲＮＡ分子として定義される。マウス（murine）心臓において心筋を再
生するための抗ｍｉＲ−９９／１００及び抗Ｌｅｔ−７ａ／ｃの潜在的な治療用途を評価
するために、Ｌｅｔ−７ａ／ｃ及びｍｉＲ−９９／１００に相補的な阻害配列を発現する
２つの組換えウイルスを、ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列をＡＡＶ９キャプシド
（ＡＡＶ２／９）にクロスパッケージングすることによって作製した。ＡＡＶ２／９血清
型は、明確な心臓親和性を有する。ｍｉＲに相補的な配列のウイルス送達は、一般的な手
法である。この実験において、ＡＡＶベクターは、心臓血管遺伝子治療において最適であ
るとして選択されたが、その理由は、ＡＡＶベクターが、ａ）免疫応答を刺激するための
ウイルスタンパク質をコードする配列を含有せず、ｂ）発現のために活発な細胞分裂が起
こることを必要とせず、ｃ）インビボでの心筋細胞における組換え遺伝子の安定的な長期
発現により、アデノウイルスベクターよりも有意な利点を有するからである。
この実験において、修飾ヘアピンＺｉｐ構築物は、（１）Ｈｌプロモーター及びＵ６プ
ロモーター下で、それぞれ、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９９ａ−５ｐ阻害配列を発
現する、（２）Ｈｌプロモーター及びＵ６プロモーターの調節下で、それぞれ、Ｌｅｔ−
７ｃ−５ｐ及びｍｉＲ−１００−５ｐ阻害配列を発現する。ウイルスベクターＪＢＴ−ｍ
ｉＲ１を作製するためにｐＡＶ−４ｉｎｌｓｈＲＮＡ−ＧＦＰベクターに挿入される抗ｍ
ｉＲアンタゴニスト及びループ配列のヌクレオチド配列の概要を、以下の表８に示した。
この実験において、上記のアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列をｐＡＶ−４ｉ
ｎｌｓｈＲＮＡ−ＧＦＰ中でクローン化した（図１）。４つのｍｉＲ阻害配列に対応する
ヌクレオチド配列は、ベクターのＩＴＲ部位の間、具体的にはＢａｍＨ１及びＨｉｎｄＩ
ＩＩクローニング部位の間でｐＡＶ−４ｉｎｌｓｈＲＮＡ−ＧＦＰに挿入され、ループ配
列ＴＧＴＧＣＴＴ（配列番号５６）によって分離された。得られたベクターにおいて、各
阻害配列の発現を、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、１００、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びＬｅｔ−７
ｃに対する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現を駆動する代替ヒトＵ６プロモータ
ー又はＨｌプロモーターによって調節した。
図１に示すように、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein、ＧＦＰ）レポ
ーターの発現を駆動するＣＭＶプロモーター（これは次いで、前臨床研究のために様々な
組織での検出を可能にする）、続いてシミアンウイルス４０（Simian virus 40、ＳＶ４
０）配列（これは、複製起点においてＤＮＡ複製を開始するポリオーマウイルス結合部位
であり、ＳＶ４０ラージＴを発現する哺乳動物細胞における発現を可能にする）をまた、
ベクターに挿入する。しかしながら、これらの配列はまた、ヒト薬物の使用のために設計
されたベクターから好適に除去し得ることが企図される。
ＡＡＶ２ＩＴＲ配列を有するベクターゲノムを、ＡＡＶ−２９３細胞のトリプルトラン
スフェクションによりＡＡＶ９キャプシドにクロスパッケージングし（Ｊ．Ｆｒａｓｅｒ
Ｗｒｉｇｈｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０：６９８〜７０６，Ｊｕ
ｌｙ ２００９）、次いでイオジキサノール勾配遠心分離により精製した。次いで、ウイ
ルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬとして定義されるＡＡＶベクターの力価を、ｑＰＣＲベースの
アッセイによって決定した。この実験において、以下のプライマーを使用して、マウスＵ
６プロモーターを増幅させた：５’−ＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡ−３
’（配列番号５７）（順方向）及び５’ＣＧＣＡＣＡＴＴＡＡＧＣＣＴＣＴＡＴＡＧＴＴ
ＡＣＴＡＧＧ−３’（配列番号５８）（逆方向）。
対応する発現カセットを担持する、既知のコピー数のプラスミドを使用して、定量化の
ための標準曲線を構築した。ウイルスは、Ｖｉｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎ
ｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）により、製造者推奨の安全遵守事項及び手順を用いて
作製及び配列決定されたものである。
ＪＢＴ−ｍｉＲ１ウイルスベクター設計物のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号８
５に記載される。
実施例１で記載したように、合計で２０個（２０）の抗ｍｉＲオリゴヌクレオチド化合
物を設計した。これらの抗ｍｉＲオリゴヌクレオチド化合物の配列を以下の表９に示す。
以下の表９に記載の抗ｍｉＲオリゴヌクレオチド化合物の配列の任意の組み合わせを、ｐ
ＡＶ−４ｉｎ１ｓｈＲＮＡ−ＧＦＰベクターのＢａｍＨ１及びＨｉｎｄＩＩＩクローニン
グ部位に挿入し、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１００−５ｐ，Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びＬｅ
ｔ−７ｃ−５ｐ阻害のための他のウイルス送達システムを作製することができる。
ＪＢＴ−ｍｉＲ１ウイルスベクター設計物のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号８
５に記載される。
実施例３
インビボでの心筋におけるＪＢＴ−ｍｉＲ１ウイルスベクターの阻害活性
この実施例は、実施例２で記載したようにして構築されたウイルスベクターＪＢＴ−ｍ
ｉＲ１が、ＣＤ１マウスにおけるＬＶの遅延ガドリニウム造影を減少させることができる
ことを実証する実験結果の概要を示す。
この実験において、ＣＤ１マスウをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１
０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、圧換気装置（pressure ventilator）（Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ，ＣＴ）を用いて挿管した。手順の全体を通して、動物は気管を通して挿管さ
れ、室内空気で機械的に換気した（呼吸数５５〜６５呼吸／分、一回換気量２．５ｍＬ）
（モデル６８７−Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）。皮膚切開を胸骨中線から左脇
下に向かって行い、胸骨の左側に沿って１ｃｍ横方向に切断して胸を切開し、第３及び第
４の肋骨の間を切断してＬＶを露出させた。次いで、上昇大動脈及び主肺動脈を同定し、
左心室及び右心室（right ventricle、ＲＶ）の間に位置するＬＡＤを同定した。ＰＥ−
１０の部分上で８−０のＰＲＯＬＥＮＥ（登録商標）縫合結紮を結ぶことにより、ＬＡＤ
閉塞（occlusion）を行った。肢誘導心電図（ＥＫＧ）誘導での急なＳＴ部分上昇を伴う
、ＬＡＤ灌流領域のブランチング（blanching）、及びＬＶの白化（whitening）は、血管
閉塞を証明するものであろう。
次いで、ＪＢＴ−ｍｉＲ１又は対照ウイルスを、３０ゲージ針を組み込んだインスリン
注射器を用いて、６０ｐｉの生理食塩水中で希釈した６ｘ１０１１ｖｇ／マウスの用量で
、梗塞領域に面した心筋内に心臓内注射することにより投与した。マウスを３週間放置し
た後、心臓ＭＲＩに供した。表１０に示すように、ＪＢＴ−ｍｉＲ１で形質転換したマウ
スは、ＪＢＴ−ｍｉＲ１の心臓内注射の３週間後において、ＧＦＰを発現するウイルスと
比較して、永久ＬＡＤ結紮を伴うＣＤ１マウスにおけるＬＶの遅延ガドリニウム造影を低
減させることが見出されることが観察された。
図２Ａ〜２Ｂは、心臓ＭＲＩ画像化実験の結果の概要を写真で示し、ここで、対照ＧＦ
Ｐウイルスの心臓ＭＲＩ画像（図２Ａ）対ＪＢＴ−ｍｉＲ１の心臓ＭＲＩ画像（図２Ｂ）
により、ＪＢＴ−ｍｉＲ１ベクターの心臓内注射の３週間後では、ＧＦＰを発現するウイ
ルスと比較して、永久ＬＡＤ結紮を伴うＣＤ１マウスにおけるＬＶの遅延ガドリニウム造
影を低減することが実証された。この雄モデルにおいて、体重３０〜４０グラムのＣＤ１
マウス（８〜１２週齢）を、上記のように永久虚血に供した。この実験において、ｈｏｒ
ｉｚｏｎｔａｌ Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ（登録商標）７Ｔ／２０ＭＲＩシステム
（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、麻酔したマウス（ＳＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
，ＮＹ）について、ＭＲＩを行った。拡張末期（end-diastolic、ＥＤ）及び収縮末期（e
nd-systolic、ＥＳ）の画像について、区画領域及びスライス厚（１ｍｍ）の積から体積
データを決定した。全てのスライス及び得られた得られたＥＦの総和から、ＬＶＥＤ及び
ＥＳ体積（ＥＤＶ及びＥＳＶ）を計算した。ＥＤＶと心筋比重γ（１．０５５ｇ／ｃｍ３
）とを掛け合わせ、ＬＶ質量を算出する。ＭＩサイズ：各スライスのＥＤ画像を、瘢痕描
写のために選択した。ＭＲ画像における造影増強領域のサイズを、ＴＴＣ染色から得られ
た対応する領域に対してプロットした。梗塞サイズを、ＬＶ質量の％として表した。
表１１に示されるように、２次元（２Ｄ）心エコー分析により、ＪＢＴ−ｍｉＲ１ベク
ターの心臓内注射の３週間後には、ＧＦＰを発現するウイルスと比較して、永久ＬＡＤ結
紮を伴ったＣＤ１マウスの心拍出量の有意な増加が示された。この実験では、５日目、１
４日目及び２１日目に、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ／Ｐｈｉｌｌｉｐｓ５５００機
器及び１５−ＭＨｚ変換器を用いて、麻酔したマウスについて２Ｄエコーを行った。
実施例４
ウイルスベクターＪＢＴ−ｍｉＲ２の設計
この実施例は、ｚｉｐｓ（ＪＢＴ−ｍｉＲ１）よりも優れ得るｔｏｕｇｈ ｄｅｃｏｙ
（ＴｕＤとしても知られる）（Ｔａｋｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２００９）を発現する、Ｊ
ＢＴ−ｍｉＲ２と命名した別のウイルスベクターの設計を図示する実験結果の概要を示す
。要するに、４つの１２０塩基のオリゴヌクレオチド配列をベクターのＩＴＲ部位の間及
びＢａｍＨ１及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位に挿入して、ＴｕＤを作成し、これは
ウイルス送達システムに挿入されたときにｌｅｔ−７及びｍｉＲ−９９ａ−５ｐファミリ
ーを阻害することができる。以下に示す上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列にお
いて、太字はそれぞれのｍｉＲ結合部位に対応している。
ｌｅｔ−７ａ−５ｐ
［０１］

Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ逆相補体
［０２］

ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ
［０３］

ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ逆相補体
［０４］
いくつかの実験において、制限部位をオリゴヌクレオチドに付加することにより、適切
なベクターへのサブクローニングを容易にした。これらの配列の５’末端をプロモーター
配列（例えば、Ｕ６プロモーター）に隣接してクローン化し、３’末端をＰｏｌＩＩ末端
配列（例えば、ＴＴＴＴＴ）に対してクローン化した。
実施例５
抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドのインビトロ生物活性
この実施例は、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ発現レポーターベクターシ
ステム（部品番号ＡＭ５７９５、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））
を用いて、新生仔ラットの心室筋細胞及びＨｅｌａ細胞でのエクソビボにおいて、ｌｅｔ
−７ａ／ｃ及びｍｉＲ−９９／１００に対するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニスト
（抗ｍｉＲ）の活性を評価するために行った実験結果の概要を示す。ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯ
ＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ発現レポーターベクターシステムは、実験用ホタルルシフェラー
ゼレポーターベクター及び関連のＰ−ｇａｌレポーター対照プラスミドからなる。予測さ
れるｍｉＲＮＡ標的配列を、レポーターのコード配列の下流に位置する多重クローニング
部位に挿入することにより、これらのベクターは、ｍｉＲＮＡ機能の正確な定量的評価を
行うのにしばしば使用される。このシステムはまた、ｓｉＲＮＡ標的部位を評価し、遺伝
子発現に対する３’ＵＴＲ配列の影響を分析するためにしばしば使用される。
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、未修飾ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（
商標）は、Ｈｅｌａ細胞又は新生仔ラット心室心筋細胞にトランスフェクトされたときに
、最大のルシフェラーゼ活性を有するべきであると考えられる。別言すれば、ｍｉＲ−９
９（シフェラーゼレポーター１、ＬＵＣ１）、ｍｉＲ−１００（シフェラーゼレポーター
２、ＬＵＣ２）、及びＬｅｔ−７ａ−５ｐ（シフェラーゼレポーター３、ＬＵＣ３）並び
にＬｅｔ−７ｃ−５ｐ（シフェラーゼレポーター４、ＬＵＣ４）についての予測ｍｉＲＮ
Ａ標的配列をｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）の多重クローニング部位に挿入することに
より、得られるベクター（ＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３及びＬＵＣ４）のルシフェラー
ゼ活性が、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）単独よりも有意に低くなるであろう。
上記のように構築された修飾ルシフェラーゼｍｉＲＮＡ発現レポーターベクター、すな
わち、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ ＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３及びＬＵＣ４を使用して
、ｍｉＲＮＡ機能の正確な定量的評価を行うことができ、Ｈｅｌａ細胞及び心筋細胞にお
ける内因性ｍｉＲメンバーの阻害により、ＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３及びＬＵＣ４ベ
クターのみと比較して、ルシフェラーゼ活性の用量依存性の増加がもたらされるであろう
。
方法
マイクロＲＮＡ ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１００、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びＬｅｔ−７
ｃ−５ｐに相補的な配列を設計し、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ｍｉＲＮＡ発現レポ
ーターベクターシステムの多重クローニング部位にクローン化した。得られたベクターは
、それぞれＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３及びＬＵＣ４発現ベクターと命名した。Ｈｅｌ
ａ細胞を９６ウェル組織培養プレートで培養し、リポフェクタミン（登録商標）２０００
試薬（Life Technologies）を用いて、５時間まで抗ｍｉＲの濃度を増加させながら（０
〜５０ｎＭ）、５０ｎｇ／ウェルの修飾ＬＵＣベクター（すなわち、ＬＵＣ１、ＬＵＣ２
、ＬＵＣ３、又はＬＵＣ４ベクター）の精製ＤＮＡ、及び１０ｎｇ／ウェルのβ−タガラ
クトシダーゼ（β−ｇａｌ）レポータープラスミドを共トランスフェクトした。同様に、
新生仔ラット心室心筋細胞を２４ウェル組織培養プレートで培養し、５００ｎｇ／ウェル
のＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３、及びＬＵＣ４ＤＮＡ並びに１００ｎｇ／ウェルのβ−
ｇａｌレポータープラスミドを共トランスフェクトし、トランスフェクション効率を確認
した。トランスフェクションの４８時間後に、トランスフェクトされた細胞を採集し、細
胞溶解物をルシフェラーゼ活性及びβ−ｇａｌ活性についてアッセイした。ルシフェラー
ゼ活性をβ−ｇａｌに対して標準化し、ＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３、及びＬＵＣ４プ
ラスミド単独に対する活性化倍数（fold activation）として表した。
図３は、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼｍｉＲＮＡ発現レポーターベ
クターを図示し、このベクターは、カリフラワーウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／ター
ミネーションシステムの制御下のホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む。ルシフ
ェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲは、予測ｍｉＲＮＡ結合標的又は他のヌクレオチド配列を挿
入するための多重クローニング部位を含む。予測ｍｉＲＮＡ標的配列をｐＭＩＲ−ＲＥＰ
ＯＲＴベクターの多重クローニング部位に挿入することにより、ルシフェラーゼレポータ
ーを次にｍｉＲＮＡ標的を模した調節に供することができる。
図４は、レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼを担持したｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（
商標）ｍｉＲＮＡβ−ガラクトシダーゼ発現レポーターベクターを図示し、これは、トラ
ンスフェクションの標準化のために設計されている。典型的には、この制御プラスミド由
来のＰ−ｇａｌ発現を用いて、細胞生存能力及びトランスフェクション効率の差異に起因
する変動を標準化することができる。
ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１００、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びｌｅｔ−７ｃについてのｐＭ
ＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ベクターの構築：
以下のオリゴヌクレオチド（太字）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏから購入した。ｍｉＲＮＡに相補的な配列
に対応するｍｉＲＮＡ結合部位には下線を引き、これは、その後にルシフェラーゼ遺伝子
のコード配列の下流に挿入した。
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ ＭＩＭＡＴ０００００９７
［０５］

９９ａ順方向プライマー：
［０６］

９９ａ逆方向プライマー：
［０７］

＞ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ ＭＩＭＡＴ０００００９８
［０８］

１００順方向プライマー：
［０９］

１００逆方向プライマー：
［１０］

＞ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ ＭＩＭＡＴ０００００６２
［１1］

ＬＥＴ７Ａ順方向プライマー：
［１２］

ＬＥＴ７Ａ逆方向プライマー：
［１３］

＞ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ ＭＩＭＡＴ０００００６４
[１４]

ＬＥＴ７Ｃ順方向プライマー：
[１５]

ＬＥＴ７Ｃ逆方向プライマー：
［１６］
ベクターは、次の順序化された要素：５’ルシフェラーゼ多重クローニング部位（Mult
iple Cloning Site、ＭＣＳ）を含み、これは、所望のｍｉＲＮＡ結合部位に対応するヌ
クレオチド配列をその３’ＵＴＲに挿入することを可能にする。ＭＣＳは、次の順序化さ
れた制限部位：５’−ＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを含む。ＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）及び
ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）は、その両方が同じ緩衝液（ＮＥＢ２）中で良好に機能
するとの理由から、制限酵素として選択した。オリゴヌクレオチドは、次の順番の要素：
５’−ＡＡＣＡ−ＳｐｅＩ部位−（ｍｉＲＮＡ結合部位）−ＨｉｎｄＩＩＩ部位−ＧＴＴ
−３’を含む。ヌクレオチドＡＡＣ（及びＧＴＴ）は、制限酵素がより効果的に結合する
ことを可能にする追加的なヌクレオチドである。
ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１００、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びＬｅｔ−７ｃ−５ｐについて
のｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）ルシフェラーゼベクターのヌクレオチド配列（それぞ
れ、ＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３、及びＬＵＣ４）は、配列表の１０６〜１０９に記載
されている。
ＨＥＬＡ細胞トランスフェクション：Ｈｅｌａ細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム、１ｎＭ非必須アミノ酸、及び１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ）並びにペニ
シリンストレプトマイシンを補充した、アール平衡塩類溶液（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））
を含む最小必須培地で培養した。細胞を、トランスフェクション前の２４時間、９６ウェ
ルプレート（１×１０４細胞／ウェル）中の抗生物質を含まない血清含有培地でプレーテ
ィングし、トランスフェクション時には３０〜７０％コンフルエントであった。
次いで、細胞を、２００μｌ／ウェルの最終体積でのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培
地及び通常の増殖培地を用いて、製造者の指示書に従ってリポフェクタミン２０００（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１６６８−０１９）を用い、０．１
、１、１０又は５０ナノモル／Ｌ（ｎＭ）で、２時間、５０ｎｇ／ウェルのＬＵＣレポー
タープラスミド及び１０ｎｇ／ウェルのβ−ｇａｌレポータープラスミドをトランスフェ
クトした。レポータープラスミド（ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）又はＬＵＣプラスミ
ド）を単独でトランスフェクトした。
２×９６ウェル中のＨｅｌａ細胞のために設定した典型的なプレートを以下に示し、各
プレートのカラム６は、トランスフェクションに使用するためのＬＵＣベクターと同定す
る。
心筋細胞トランスフェクション：新生仔ラット心筋細胞を単離し、ウェルあたり８０，
０００個の細胞密度（２４ウェル）で、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）でコーティングしたプ
レートでプレーティングした。細胞のプレーティングの２４時間後、細胞を、６００ｐｌ
／ウェルの最終体積でのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地及び通常の増殖培地を用いて
、製造者の指示書に従ってリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，カタログ番号１１６６８−０１９）を用い、０．１、１、３、１０又は５０ナノモ
ル／Ｌ（ｎＭ）で、５時間、５００ｎｇ／ウェルのＬＵＣレポータープラスミド及び１０
０ｎｇ／ウェルのβ−ｇａｌレポータープラスミドでトランスフェクトした。レポーター
プラスミド（ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）又はＬＵＣプラスミド）を単独でトランス
フェクトした。
心筋細胞のために設定した典型的なプレートを以下に示す。
以上の実験を繰り返した。
プロモーター活性アッセイ
細胞を３７℃で増殖させ、ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）番
号Ｅ６１１０）、Ｂｅｔａ−Ｇｉｏ（登録商標）Ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）番号Ｅ
４７２０）及びＧｉｏＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）番号Ｅ２６
６１）を用いた通常の増殖培地でのルシフェラーゼ及びβ−ｇａｌアッセイのために、ト
ランスフェクションの４８時間後に採集した。ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ
Ｔを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。プロモーター活性をルシフェラーゼ１、２
、３又は４プラスミド単独に対する倍率で表し、β−ｇａｌ活性レベルに対して標準化し
た。
統計的分析
ルシフェラーゼ活性をβ−ｇａｌに対して標準化し、データをそれぞれのＬＵＣベクタ
ー単独に対する活性化倍率（fold activation）として表した。Ｈｅｌａ細胞実験の倍率
データは、単一の実験を表している。実験を繰り返し、結果を確認した。細胞を培養し、
同じ日にトランスフェクトしたので、２つの別個の心筋細胞実験から得られた倍率データ
を組み合わせた。平均標準偏差でデータを提示する。抗ｍｉＲ（ｙ軸）のログ−１０Ｍ濃
度に対するルシフェラーゼ活性（ｘ軸）の標準化された倍率の増加とともに、Ｇｒａｐｈ
Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを用いてグラフを描いた。
結果
ルシフェラーゼ構築物についての試験実験を行い、ルシフェラーゼ構築物１（ＬＵＣ１
、ｍｉＲ−９９）、ルシフェラーゼ構築物２（ＬＵＣ２、ｍｉＲ−１００）、ルシフェラ
ーゼ構築物３（ＬＵＣ３、ｌｅｔ−７ａ）、及びルシフェラーゼ構築物４（ＬＵＣ４、ｌ
ｅｔ−７ｃ）が、未修飾ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴベクターと比較して、有意に低いルシフ
ェラーゼ活性を有することを確認したが、このことは、Ｈｅｌａ細胞内の内因性ｍｉＲ（
Ｌｅｔ−７ａ−５ｐｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐ
、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ）がそれぞれのＬＵＣ構築物と結合し、ルシフェラーゼ活
性を抑制することができることを示している。この実験において、Ｈｅｌａ細胞をＬＵＣ
構築物の各々をトランスフェクトし、次いで対応する抗ｍｉＲで処置した。抗ｍｉＲは、
Ｈｅｌａ細胞において、その対応する内因性マイクロＲＮＡと競合するであろうことが企
図された。未修飾ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）は、Ｈｅｌａ細胞又はラット新生仔心
室心筋細胞においてトランスフェクトした場合に、最大のルシフェラーゼ活性を示すこと
が観察された。ｍｉＲ−９９（ルシフェラーゼレポーター１、ＬＵＣ１）、ｍｉＲ−１０
０（ルシフェラーゼレポーター２、ＬＵＣ２）及びＬｅｔ−７ａ−５ｐ（ルシフェラーゼ
レポーター３、ＬＵＣ３）及びＬｅｔ−７ｃ−５ｐ（ルシフェラーゼレポーター４、ＬＵ
Ｃ４）のための多重クローニング部位に予測ｍｉＲＮＡ標的配列を挿入したことにより、
ルシフェラーゼ活性は、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）単独よりも有意に低かった。修
飾ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ ＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３及びＬＵＣ４ルシフェラーゼ
ｍｉＲＮＡ発現レポーターベクターを用いて、ｍｉＲＮＡ機能の正確な定量的評価を行う
ことができ、Ｈｅｌａ細胞又は心筋細胞における内因性ｍｉＲメンバーの阻害によって、
ＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３及びＬＵＣ４ベクター単独と比較して、ルシフェラーゼ活
性の用量依存性の増加がもたらされるであろう。いかなる特定の理論にも拘束されるもの
ではないが、抗ｍｉＲは、ＲＩＳＣ複合体における特定のマイクロＲＮＡの立体障害を介
して作用し、対応するルシフェラーゼプロモーター活性を増加すると考えられた。この試
験結果を図５に図示して概要を示す。
Ｈｅｌａ細胞を用いて行ったその後の実験では、ＪＲＸ０１１１、ＪＲＸ０１１２、Ｊ
ＲＸ０１１４、ＪＲＸ０１１６、ＪＲＸ０１１８、ｍｉＲ−９９ａ抗ｍｉＲが、ルシフェ
ラーゼ構築物１（ＬＵＣ１、ｍｉＲ−９９）活性を用量依存的に増加させることが観察さ
れた（図６）。
同様に、図７に示すように、ＪＲＸ０１１０、ＪＲＸ０１１３、ＪＲＸ０１１５、ＪＲ
Ｘ０１１７、ＪＲＸ０１１９ ｍｉＲ−１００−５ｐ抗ｍｉＲが、Ｈｅｌａ細胞における
ルシフェラーゼ構築物２（ＬＵＣ２、ｍｉＲ−１００）活性を用量依存的に増加させるこ
とが観察された。
同様に、ＪＲＸ０１０１、ＪＲＸ０１０３、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ
０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ ｍ
ｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ抗ｍｉＲがまた、Ｈｅｌａ細胞におけるルシフェラーゼ構築物
３（ＬＵＣ３、ｌｅｔ−７ａ）活性を用量依存的に増加させることが見出され（図８Ａ〜
図８Ｂ）、ＪＲＸ０１００、ＪＲＸ０１０２、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ
０１０６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ ｍ
ｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐ抗ｍｉＲが、Ｈｅｌａ細胞におけるルシフェラーゼ構築物４（Ｌ
ＵＣ４、ｌｅｔ−７ｃ）活性を用量依存的に増加させることが観察された（図９Ａ〜図９
Ｂ）。
新生仔ラット心室心筋細胞を用いて行った様々な実験において、ＪＲＸ０１１１、ＪＲ
Ｘ０１１２、ＪＲＸ０１１４、ＪＲＸ０１１６、ＪＲＸ０１１８ ｍｉＲ−９９ａ抗ｍｉ
Ｒが、ルシフェラーゼ構築物１（ＬＵＣ１、ｍｉＲ−９９）活性を用量依存的に増加させ
ることが観察され（図１０）、ＪＲＸ０１１０、ＪＲＸ０１１３、ＪＲＸ０１１５、ＪＲ
Ｘ０１１７、ＪＲＸ０１１９ ｍｉＲ−１００−５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物
２（ＬＵＣ２、ｍｉＲ−１００）活性を用量依存的に増加させることが観察され（図１１
）、ＪＲＸ０１０１、ＪＲＸ０１０３、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０
６、ＪＲＸ０１０７、ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ ｍｉＲ−
Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ抗ｍｉＲが、ルシフェラーゼ構築物３（ＬＵＣ３、ｌｅｔ−７ａ）活
性を用量依存的に増加させることが観察され（図１２Ａ〜図１２Ｂ）、ＪＲＸ０１００、
ＪＲＸ０１０２、ＪＲＸ０１０４、ＪＲＸ０１０５、ＪＲＸ０１０６、ＪＲＸ０１０７、
ＪＲＸ０１０８、ＪＲＸ０１０９ Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ５ｐ抗ｍ
ｉＲが、ルシフェラーゼ構築物４（ＬＵＣ４、ｌｅｔ−７ｃ）活性を用量依存的に増加さ
せることが見出された（図１３Ａ〜図１３Ｂ）。
結論
総合すれば、上記で提示された実験データにより、特定の抗ｍｉＲの効力、特異性及び
活性を確認することができる。修飾プラスミドＬＵＣ１、ＬＵＣ２、ＬＵＣ３及びＬＵＣ
４は、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴ（商標）空（empty）プラスミドと比較して、有意に低い
ルシフェラーゼ活性を示すことが見出された。対応するｍｉＲファミリー由来の各アンタ
ゴニストが、それぞれのＬＵＣレポータープラスミドを用量依存的に活性化することが更
に観察された。更に、以下のマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１００、Ｌｅｔ−
７ａ−５ｐ、及びＬｅｔ−７ｃ−５ｐを阻害するように設計された抗ｍｉＲが、試験され
た両方の細胞型において、効率を変えて特定の標的ｍＲＮＡに結合したようであった。
雑誌論文、教科書、特許及び特許出願を含むが、これらに限定されない、本明細書で開
示される参考資料の全てを、本明細書で議論した主題及びそれらの全体について参照によ
り本明細書に組み込む。本開示の全体を通して、様々な情報源が参照され、参照により組
み込まれる。情報源には、例えば、雑誌論文、特許文書、教科書、及びワールド・ワイド
・ウェブブラウザ−非アクティブなページアドレスが含まれる。そのような情報源の参照
は、単に、出願時の一般的技術水準の指標を提供する目的のためである。情報源の各々及
びいずれの１つの内容及び教示を当業者が依拠し、使用して、本明細書に開示される実施
形態を作製し、使用することができるが、特定の情報源における任意の議論及び論評は、
そのような論評が当該分野における一般の意見として広く受け入れられているとみなすも
のでは決してない。

Claims (77)

  1. 複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニストを含む組成物であって、前記複数のｍ
    ｉＲアンタゴニストが、１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−
    １００−５ｐアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニスト、
    及び１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストを含む、組成物。
  2. 以下の、
    ａ．前記１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配列番
    号４７、４８、５０、５２、及び５４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％
    、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有
    するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−９９ａを含むこと、
    ｂ．前記１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、
    配列番号４６、４９、５１、５３、及び５５からなる群から選択される配列と少なくとも
    ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の同一
    性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを含むこと、
    ｃ．前記１つ以上のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配
    列番号３７、３９、及び４０〜４５からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、
    ８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有す
    るヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含むこと、
    ｄ．前記１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配
    列番号３６、３８、及び４０〜４５からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、
    ８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有す
    るヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを含むこと、のうちの１つ以上
    が適用される、請求項１に記載の組成物。
  3. 以下の、
    ａ．前記１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配列番
    号４７、４８、５０、５２、及び５４からなる群から選択される配列に関して１つ以上の
    ミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−９９ａを含むこと、
    ｂ．前記１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、
    配列番号４６、４９、５１、５３、及び５５からなる群から選択される配列に関して１つ
    以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを
    含むこと、
    ｃ．前記１つ以上のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配
    列番号３７、３９、及び４０〜４５からなる群から選択される配列に関して１つ以上のミ
    スマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含
    むこと、
    ｄ．前記１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配
    列番号３６、３８、及び４０〜４５からなる群から選択される配列に関して１つ以上のミ
    スマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを含
    むこと、のうちの１つ以上が適用される、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 前記抗ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、修飾ヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド
    、及び修飾糖部分、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の化学
    修飾を含む、請求項２又は３に記載の組成物。
  5. 前記１つ以上の化学修飾が、修飾ヌクレオシド間連結を含む、請求項４に記載の組成物
    。
  6. 前記修飾ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メトキシエチル（Ｍ
    ＯＥ）、２’−フルオロ、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホス
    ホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸トリエステ
    ル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、及びこれらの組み合わせからなる群
    から選択される、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記修飾ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、請求
    項５又は６に記載の組成物。
  8. 前記１つ以上の化学修飾のうちの少なくとも１つが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項
    ４〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）化学修飾、ペプチド核酸（ＰＮＡ）
    、アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、これらの類似体、誘導体、又は組み合わせを含む、請求項
    ８に記載の組成物。
  10. 前記修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項８又は９に記載の組
    成物。
  11. 前記ロックド核酸（ＬＮＡ）が、前記修飾抗ｍｉＲの一端又は両端において組み込まれ
    ている、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記１つ以上の化学修飾のうちの少なくとも１つが、修飾糖部分を含む、請求項４〜１
    １のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記修飾糖部分が、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分
    、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分、二環式糖部分、又はこれらの組み合わせを含む、請求
    項１２に記載の組成物。
  14. 前記修飾糖部分が、２’−Ｏ−メチル糖部分を含む、請求項１２又は１３に記載の組成
    物。
  15. 前記組成物が、薬学的組成物である、請求項８３〜１４のいずれか一項に記載の組成物
    。
  16. １つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニスト、１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴ
    ニスト、１つ以上のｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニスト及び１つ以上のｍｉＲ−
    Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含む、発現カセット
    。
  17. 以下の、
    ａ．前記１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配列番
    号４７、４８、５０、５２、及び５４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％
    、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有
    するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−９９ａを含むこと、
    ｂ．前記１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、
    配列番号４６、４９、５１、５３、及び５５からなる群から選択される配列と少なくとも
    ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の同一
    性を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを含むこと、
    ｃ．前記１つ以上のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配
    列番号３７、３９、及び４０〜４５からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、
    ８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有す
    るヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含むこと、
    ｄ．前記１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配
    列番号３６、３８、及び４０〜４５からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、
    ８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有す
    るヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを含むこと、のうちの１つ以上
    が適用される、請求項１６に記載の発現カセット。
  18. 以下の、
    ａ．前記１つ以上のｍｉＲ−９９ａアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配列番
    号４７、４８、５０、５２、及び５４からなる群から選択される配列に関して１つ以上の
    ミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−９９ａを含むこと、
    ｂ．前記１つ以上のｍｉＲ−１００−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、
    配列番号４６、４９、５１、５３、及び５５からなる群から選択される配列に関して１つ
    以上のミスマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−１００−５ｐを
    含むこと、
    ｃ．前記１つ以上のＬｅｔ−７ａ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配
    列番号３７、３９、及び４０〜４５からなる群から選択される配列に関して１つ以上のミ
    スマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを含
    むこと、
    ｄ．前記１つ以上のＬｅｔ−７ｃ−５ｐアンタゴニストのうちの少なくとも１つが、配
    列番号３６、３８、及び４０〜４５からなる群から選択される配列に関して１つ以上のミ
    スマッチの核酸塩基を有するヌクレオチド配列を含む抗ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｃ−５ｐを含
    むこと、のうちの１つ以上が適用される、請求項１６又は１７に記載の発現カセット。
  19. 前記抗ｍｉＲのうちの少なくとも１つが、修飾ヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド
    、及び修飾糖部分、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の化学
    修飾を含む、請求項１７又は１８に記載の発現カセット。
  20. 前記１つ以上の化学修飾が、修飾ヌクレオシド間連結を含む、請求項１９に記載の発現
    カセット。
  21. 前記修飾ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メトキシエチル（Ｍ
    ＯＥ）、２’−フルオロ、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホス
    ホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸トリエステ
    ル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、及びこれらの組み合わせからなる群
    から選択される、請求項２０に記載の発現カセット。
  22. 前記修飾ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、請求
    項２０又は２１に記載の発現カセット。
  23. 前記１つ以上の化学修飾のうちの少なくとも１つが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項
    １７〜２２のいずれか一項に記載の発現カセット。
  24. 前記修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）化学修飾、ペプチド核酸（ＰＮＡ）
    、アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、これらの類似体、誘導体、又は組み合わせを含む、請求項
    ２３に記載の発現カセット。
  25. 前記修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項２３又は２４に記載
    の発現カセット。
  26. 前記ロックド核酸（ＬＮＡ）が、前記修飾抗ｍｉＲの一端又は両端において組み込まれ
    ている、請求項２５に記載の発現カセット。
  27. 前記１つ以上の化学修飾のうちの少なくとも１つが、修飾糖部分を含む、請求項２０〜
    ２６のいずれか一項に記載の発現カセット。
  28. 前記修飾糖部分が、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分、２’−メトキシ修飾糖部分
    、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分、二環式糖部分、又はこれらの組み合わせを含む、請求
    項２７に記載の発現カセット。
  29. 前記修飾糖部分が、２’−Ｏ−メチル糖部分を含む、請求項２７又は２８に記載の発現
    カセット。
  30. 請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、クローニングベクター
    又は発現ベクター。
  31. 前記クローニングベクター又は発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３０
    に記載のクローニングベクター又は発現ベクター。
  32. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
    ベクターである、請求項３１に記載のクローニングベクター又は発現ベクター。
  33. 前記クローニングベクター又は発現ベクターが、
    ｉ．配列番号５９〜６４に記載のヌクレオチド配列の各々と少なくとも８０％、８５％
    、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する
    ヌクレオチド配列、
    ｉｉ．配列番号８６〜８９に記載のヌクレオチド配列の各々と少なくとも８０％、８５
    ％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有す
    るヌクレオチド配列、又は
    ｉｉｉ．ａ）及びｂ）に示した配列番号に記載のヌクレオチド配列の各々と少なくとも
    ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、若しくは１００％の
    同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のク
    ローニングベクター又は発現ベクター。
  34. 前記クローニングベクター又は発現ベクターが、配列番号８５に記載のヌクレオチド配
    列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は
    １００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に
    記載のクローニングベクター又は発現ベクター。
  35. 有効量の少なくとも１つの治療剤と、
    ａ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴ
    ニストを含む組成物、
    ｂ）請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の発現カセット、及び
    ｃ）請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のクローニングベクター又は発現ベクター
    、のうちの１つ以上と、を含む、治療用組成物。
  36. 前記少なくとも１つの治療剤が、イデベノン、エプレレノン、ＶＥＣＴＴＯＲ、ＡＶＩ
    −４６５８、アタルレン／ＰＴＣ１２４／Ｔｒａｎｓｌａｒｎａ、ＢＭＮ０４４／ＰＲＯ
    ０４４、ＣＡＴ−１００４、マイクロジストロフィンＡＡＶ遺伝子治療薬（ＳＧＴ−００
    １）、ガレクチン１−治療薬（ＳＢ−００２）、ＬＴＢＢ４（ＳＢ−００１）、ｒＡＡＶ
    ２．５−ＣＭＶ−ミニジストロフィン、グルタミン、ＮＦＫＢ阻害剤、サルコグリカン、
    デルタ（３５ｋＤａジストロフィン関連糖タンパク質）、インスリン様成長因子−１（Ｉ
    ＧＦ−１）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の治
    療用組成物。
  37. 前記治療用組成物が、薬学的組成物である、請求項３５又は３６に記載の治療用組成物
    。
  38. 対象における心疾患を処置するための方法であって、前記心疾患の治療に適した治療用
    組成物を前記対象に投与又は提供することを含み、
    （ａ）前記治療用組成物が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物であり、
    （ｂ）前記治療用組成物が、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の発現カセットを
    含み、かつ／又は
    （ｃ）前記治療用組成物が、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のクローニングベ
    クター若しくは発現ベクターを含む、方法。
  39. 対象における心筋再生を促進するための方法であって、治療用組成物を前記対象に投与
    又は提供することを含み、
    （ａ）前記治療用組成物が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物であり、
    （ｂ）前記治療用組成物が、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の発現カセットを
    含み、かつ／又は
    （ｃ）前記治療用組成物が、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のクローニングベ
    クター若しくは発現ベクターを含む、方法。
  40. 心疾患を有するか又はそれを有する疑いがある前記対象を同定又は選択することを更に
    含む、請求項３８又は３９に記載の方法。
  41. 前記心疾患が、心筋梗塞、虚血性心疾患、拡張型心筋症、心不全（例えば、鬱血性心不
    全）、虚血性心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、アルコール性心筋症、ウイルス性心
    筋症、頻脈誘発性心筋症、ストレス誘起性心筋症、アミロイド心筋症、不整脈源性右室異
    形成、左室緻密化障害、心内膜線維弾性症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁逆流症、僧帽弁狭
    窄症、僧帽弁逆流症、僧帽弁逸脱症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁逆流症、三尖弁狭窄症、
    三尖弁逆流症、先天性障害、遺伝的障害、又はこれらの組み合わせである、請求項４０に
    記載の方法。
  42. 心筋細胞及び／又は筋細胞の増殖を調節する方法であって、
    １）心筋細胞に治療用組成物を導入することであって、
    （ａ）前記治療用組成物が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物であり、
    （ｂ）前記治療用組成物が、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の発現カセット
    を含み、かつ／又は
    （ｃ）前記治療用組成物が、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のクローニング
    ベクター若しくは発現ベクターを含む、導入することと、
    ２）工程（１）から得た前記心筋細胞を分割させ、それにより前記心筋細胞又は筋細胞
    の増殖を調節することと、を含む、方法。
  43. 前記導入することが、前記心筋細胞及び／又は筋細胞を、前記複数のｍｉＲアンタゴニ
    ストをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの発現カセット又は少なくとも１つのウ
    イルスベクターでトランスフェクトすることを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記心筋細胞及び／又は金細胞の増殖を測定することを更に含む、請求項４２又は４３
    に記載の方法。
  45. 前記心筋細胞及び／又は筋細胞の増殖が、前記複数のｍｉＲアンタゴニストをコードす
    る前記核酸配列を欠失している対照心筋細胞に比べて増加する、請求項４２〜４４のいず
    れか一項に記載の方法。
  46. 前記心筋細胞及び／又は筋肉が、インビボである、請求項４２〜４５のいずれか一項に
    記載の方法。
  47. 前記心筋細胞及び／又は筋肉が、エクスビボである、請求項４２〜４５のいずれか一項
    に記載の方法。
  48. 前記心筋細胞及び／又は筋肉が、ヒト対象におけるものである、請求項４２〜４７のい
    ずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ヒト対象が、心疾患に罹患している、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記複数のｍｉＲアンタゴニストが、同じ発現カセット又は発現ベクターによってコー
    ドされている、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記複数のｍｉＲアンタゴニストが、異なる発現カセット又は発現ベクターによってコ
    ードされている、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３８〜５１のいずれか一項に記載の
    方法。
  53. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
    ベクターである、請求項５２に記載の方法。
  54. 併用療法のために、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤又は少なくとも１つの追加
    の治療薬を前記対象に投与することを更に含む、請求項３８〜５３のいずれか一項に記載
    の方法。
  55. 前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、イデベノン、エプレレノン、ＶＥＣ
    ＴＴＯＲ、ＡＶＩ−４６５８、アタルレン／ＰＴＣ１２４／Ｔｒａｎｓｌａｒｎａ、ＢＭ
    Ｎ０４４／ＰＲＯ０４４、ＣＡＴ−１００４、マイクロジストロフィンＡＡＶ遺伝子治療
    薬（ＳＧＴ−００１）、ガレクチン１−治療薬（ＳＢ−００２）、ＬＴＢＢ４（ＳＢ−０
    ０１）、ｒＡＡＶ２．５−ＣＭＶ−ミニジストロフィン、グルタミン、ＮＦＫＢ阻害剤、
    サルコグリカン、デルタ（３５ｋＤａジストロフィン関連糖タンパク質）、インスリン様
    成長因子−１（ＩＧＦ−１）発現、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集、
    機能性組換え型のヒトジストロフィン遺伝子を再導入することを目的とした任意の遺伝子
    送達治療薬、エクソンスキッピング治療薬、ナンセンス突然変異に対するリードスルー戦
    略、細胞ベースの治療薬、ユートロフィンアップレギュレーション、ミオスタチン阻害、
    抗炎症薬／抗酸化剤、機械補助装置、筋ジストロフィーのための任意の標準的治療薬、及
    びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、生物学的製剤を含む、請求項５４又
    は５５に記載の方法。
  57. 前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、遺伝子治療薬又は治療用遺伝子調節
    剤を含む、請求項５４又は５５に記載の方法。
  58. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬の各々が、別の製
    剤で投与される、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、逐次投与され
    る、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、同時投与され
    る、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、輪番で投与さ
    れる、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、単一製剤で一
    緒に投与される、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  63. 筋ジストロフィー（ＭＤ）障害を処置するための方法であって、治療用組成物を対象に
    投与又は提供することを含み、
    （ａ）前記治療用組成物が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物であり、
    （ｂ）前記治療用組成物が、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の発現カセットを
    含み、かつ／又は
    （ｃ）前記治療用組成物が、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のクローニングベ
    クター若しくは発現ベクターを含み、
    前記治療用組成物の前記投与が、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤又は少なくと
    も１つの追加の治療薬と組み合わせて行われて、併用療法を提供する、方法。
  64. 前記筋ジストロフィー障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シャルコー・マリー・
    トゥース病（ＣＭＴ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、デュシェンヌ型筋ジストロ
    フィー（ＤＭＤ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、遺伝性及び
    内分泌性ミオパチー、筋肉の代謝疾患、ミトコンドリアミオパチー（ＭＭ）、筋強直性ジ
    ストロフィー（ＭＭＤ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、又はこれらの組み合わせに関
    連する、請求項６３に記載の方法。
  65. 心臓細胞の増殖を増加させ、かつ／又は筋肉構造及び／若しくは機能及び／若しくは再
    生に関与するタンパク質の発現及び／若しくは活性を増加させるための方法であって、前
    記心臓細胞に、（１）治療用組成物であって、
    （ａ）前記治療用組成物が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物であり、
    （ｂ）前記治療用組成物が、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の発現カセットを
    含み、かつ／又は
    （ｃ）前記治療用組成物が、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のクローニングベ
    クター若しくは発現ベクターを含む、治療用組成物と、
    （２）少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬と、の組み合わせを接触させるか又は
    提供することを含む、方法。
  66. 標的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の発現を阻害又は減少させるための方法であって、心臓
    細胞に、治療用組成物であって、
    （ａ）前記治療用組成物が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物であり、
    （ｂ）前記治療用組成物が、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の発現カセットを
    含み、かつ／又は
    （ｃ）前記治療用組成物が、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のクローニングベ
    クター若しくは発現ベクターを含む、治療用組成物と、
    少なくとも１つの追加の治療薬又は治療薬と、の組み合わせを接触させるか又は提供す
    ることを含む、方法。
  67. 前記心臓細胞が、心臓線維芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞（ＶＳＭ
    Ｃ）からなる群から選択される、請求項６５又は６６に記載の方法。
  68. 前記心臓細胞が、心筋細胞及び骨格筋細胞からなる群から選択される、請求項６５〜６
    ７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、イデベノン、エプレレノン、ＶＥＣ
    ＴＴＯＲ、ＡＶＩ−４６５８、アタルレン／ＰＴＣ１２４／Ｔｒａｎｓｌａｒｎａ、ＢＭ
    Ｎ０４４／ＰＲＯ０４４、ＣＡＴ−１００４、マイクロジストロフィンＡＡＶ遺伝子治療
    薬（ＳＧＴ−００１）、ガレクチン１−治療薬（ＳＢ−００２）、ＬＴＢＢ４（ＳＢ−０
    ０１）、ｒＡＡＶ２．５−ＣＭＶ−ミニジストロフィン、グルタミン、ＮＦＫＢ阻害剤、
    サルコグリカン、デルタ（３５ｋＤａジストロフィン関連糖タンパク質）、インスリン様
    成長因子−１（ＩＧＦ−１）発現調節、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編
    集、機能性組換え型のヒトジストロフィン遺伝子を再導入することを目的とした任意の遺
    伝子送達治療薬、エクソンスキッピング治療薬、ナンセンス突然変異に対するリードスル
    ー戦略、細胞ベースの治療薬、ユートロフィンアップレギュレーション、ミオスタチン阻
    害、抗炎症薬／抗酸化剤、機械補助装置、筋ジストロフィーのための任意の標準的治療薬
    、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６３〜６８のいずれか一項
    に記載の方法。
  70. 前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、生物学的製剤である、請求項６３〜
    ６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、遺伝子治療薬又は治療用遺伝子調節
    剤を含む、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬の各々が、別の製
    剤で投与される、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、逐次投与され
    る、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、同時投与され
    る、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、輪番で投与さ
    れる、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記治療用組成物及び前記少なくとも１つの追加の治療剤又は治療薬が、単一製剤で投
    与される、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
  77. マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）アンタゴニストであって、
    （ａ）配列番号４７、４８、５０、５２、及び５４からなる群から選択されるヌクレオ
    チド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％
    、若しくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号４６、４９、５１、５３、及び５５からなる群から選択されるヌクレオ
    チドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、若
    しくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は
    （Ｃ）配列番号３７、３９、及び４０〜４５からなる群から選択されるヌクレオチドと
    少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、若しくは
    １００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は
    （ｄ）配列番号３７、３９、及び４０〜４５からなる群から選択されるヌクレオチドと
    少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、若しくは
    １００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）ア
    ンタゴニスト。
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