JP2020145944A - 肝細胞構造体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記肝細胞が、風船様肝細胞を含むことを特徴とする、肝細胞構造体。
[2] 前記接着細胞が、線維芽細胞または間葉系幹細胞である、[1]に記載の肝細胞構造体。
[3] 前記接着細胞が、霊長類線維芽細胞である、[1]〜[2]のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
[4] 前記接着細胞が、真皮由来の霊長類線維芽細胞である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
[5] 前記凝集体が、細胞シートである、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
[6] 正常肝細胞と比較して、細胞あたりのソニックヘッジホッグ(SHH)タンパク質の発現が高い、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
[7] Mallory−Denk体を含む、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
[8] 前記肝細胞が、初代肝細胞である、[1]〜[7]のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
[9] 前記肝細胞構造体が、α−SMAを発現している、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
[10] 前記肝細胞:前記接着細胞の比が、10:1〜1:10である、[1]〜[9]のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
[11] 前記肝細胞:前記接着細胞の比が、1:1〜1:10である、[1]〜[10]のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
(i)肝細胞と非肝細胞である接着細胞とを含む細胞群を凝集させて、凝集体を形成する工程;および、
(ii)前記凝集体を、培養する工程、
を含む、方法。
[13] 前記接着細胞が、線維芽細胞または間葉系幹細胞ある、[12]に記載の方法。
[14] 前記接着細胞が、霊長類線維芽細胞である、[12]〜[13]のいずれか1項に記載の方法。
[15] 前記肝細胞が、初代肝細胞である、[12]〜[14]のいずれか1項に記載の方法。
[16] 前記工程(i)が、
(i−1)第1培養基材の上に肝細胞を播種して、培養する工程;
(i−2)前記肝細胞が播種された前記第1培養基材の上に、前記接着細胞を播種し、培養する工程;および
(i−3)前記第1培養基材から前記肝細胞と前記接着細胞とを含む前記細胞群を剥離して、前記凝集体を形成する工程、
を含む、[12]〜[15]のいずれか1項に記載の方法。
[17] 前記工程(ii)が、前記凝集体を第2培養基材の上に接着させて、培養する工程である、[12]〜[16]のいずれか1項に記載の方法。
[18] 前記工程(i)において、前記肝細胞:前記接着細胞の比が、10:1〜1:10である、[12]〜[17]のいずれか1項に記載の方法。
[19] 前記肝細胞:前記接着細胞の比が、1:1〜1:10である、[12]〜[18]のいずれか1項に記載の方法。
[20] 前記方法で用いられる培地が、1mM〜100mMのグルコースを含有する培地である、[12]〜[19]のいずれか1項に記載の方法。
[21] 前記方法で用いられる培地が、0.1μM〜10μMのインスリンを含有する培地である、[12]〜[20]のいずれか1項に記載の方法。
[22] 前記第1培養基材が、刺激応答性培養基材である、[16]に記載の方法。
[23] 前記第1培養基材が、温度応答性培養基材である、[16]に記載の方法。
[24] 前記第1培養基材が、細胞接着性ハイドロゲルでコートされている、[16]及び[22]〜[23]のいずれか1項に記載の方法。
本発明は、肝細胞と、非肝細胞である接着細胞とを含む凝集体を含み、前記肝細胞が、風船様肝細胞を含むことを特徴とする、肝細胞構造体を提供する。また、本発明は、後述の肝細胞構造体の製造方法によって得られる肝細胞構造体も提供する。
本発明は、肝細胞構造体の製造方法であって、
(i)肝細胞と非肝細胞である接着細胞とを含む細胞群を凝集させて、凝集体を形成する工程;および、
(ii)前記凝集体を、培養する工程、
を含む、方法を提供する。工程(1)によって得られる凝集体を、工程(2)によって培養することにより、肝細胞と、非肝細胞である接着細胞とを含む凝集体を含み、前記肝細胞が風船様肝細胞を含むことを特徴とする、肝細胞構造体を作製することができる。
(i−1)第1培養基材の上に肝細胞を播種して、培養する工程;
(i−2)前記肝細胞が播種された前記第1培養基材の上に、前記接着細胞を播種し、培養する工程;および
(i−3)前記第1培養基材から前記肝細胞と前記接着細胞とを含む前記細胞群を剥離して、前記凝集体を形成する工程、
を含んでもよい。この場合、第1培養基材は、例えば「刺激応答性培養基材」であってもよい。
本発明の肝細胞構造体、または本発明の方法によって得られる肝細胞構造体は、肝疾患を治療または予防するための因子を評価する方法に用いることができる。例えば、一実施態様において、本発明の方法は、
(1)肝細胞構造体に、候補因子を適用し、培養する工程、
(2)前記肝細胞構造体において、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の肝細胞が有する特徴(例えば脂肪滴の沈着、Mallory−Denk体の形成、風船様変性等)を指標として、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含んでいる。
1.実験材料と方法
1−1.細胞
正常ヒト真皮線維芽細胞(NHDF;Lonza,Basel,Switzerland)は、10%ウシ胎児血清(FBS;ThermoFisher Scientific)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Corning)を添加した高グルコースDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM, Corning,NY,US)で維持し、37℃、5%CO2の加湿雰囲気下で培養した。NHDFは、プレコンフルエントの段階で、トリプシンを用いて継代した。3継代目〜7継代目までのNHDFを共培養実験に用いた。
温度応答性細胞培養用24ウェルプレート(UpCell(登録商標);CellSeed,Tokyo,Japan)を100μg/mLのrat tail collagen I solution(Corning)で一晩コーティングした。その後、UpCell(登録商標)24ウェルプレートをリン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄した。
Day0において、UpCell(登録商標)プレート上のPHH/線維芽細胞の共培養物を20℃で30分間インキュベートして、浮遊させた細胞シートとして剥離した。剥離したコンフルエントの単層の細胞シートは、迅速に収縮して、多層構造を有する収縮した厚い細胞シートへと変形した(図1参照)。
所定の時間で、細胞シートサンプルを予め温めておいたPBSを用いて2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で1時間固定した。固定した細胞シートをパラフィンに包埋し、4μm切片へとスライスし、ヘマトキシリン−エオシン(HE)を用いた標準的な組織学染色用に脱パラフィン化した。サイトケラチン8+18(CK8/18)の免疫染色用に、切片を、抗原回復のためのDako proteinase K(Agilent,Santa Clara,CA,US)で処理し、Dako REAL peroxidase−blocking solution(Agilent)中でインキュベートし、内在性のペルオキシダーゼ活性を消失させ、その後、Blocking One Histo(Nacalai Tesque,Kyoto,Japan)中でブロックした。その後、切片を25倍希釈したマウス抗ヒトCK8/18抗体(Abcam、Cambridge,UK)を添加してインキュベートし、続いてhorseradish peroxideコンジュゲート ロバ抗マウスIgG H&L(Abacam)を添加してインキュベートした。切片をDako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System(Agilent)で染色し、核はヘマトキシリンで染色した。最後に、切片をマウントし、乾燥させ、光学顕微鏡(Nikon)で撮像した。
簡単に述べると、パラフィン包埋切片を、以下の一次抗体を添加してインキュベートした:E−カドヘリン(Abcam)、α−smooth muscle actin(α−SMA)(Abcam)、及びCK8/18(Abcam)。染色用の二次抗体として、Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ抗体及びAlexa Fluor 594ヤギ抗マウス抗体を用いた。細胞核は、4’,6−diamidino−2−phenylindole(DAPI)で染色した。最後に、切片をマウントし、乾燥させ、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM;Olympus,Tokyo,Japan)又は蛍光顕微鏡(Nikon)を用いて撮像した。
細胞質の脂肪滴の染色のために、Day11の固定した細胞シートサンプルを2回PBSで洗浄し、1μg/mLのナイルレッド(Sigma Aldrich)を添加して、30分間インキュベートした。その後、免疫蛍光標識された脂肪滴を、CLSM(Olympus)を用いて撮像した。
所定の時間において、24時間の細胞培養上清を回収し、アッセイを行うまで−30℃で保存した。肝細胞からのアルブミンの分泌を、ヒトアルブミンELISA定量キット(Bethyl Laboratories,Montogomery,TX,US)で検出した。培養した肝細胞による尿素合成をcolorimetric assay kit(BioChain,Newark,CA,US)を用いて定量した。肝細胞が産生するSHHリガンドの量を、ヒトSHH ELISAキット(Abcam)で定量した。測定は、3つの独立した実験で実施した。それぞれの実験でおいて、3以上の反復試験サンプルを用いた。
簡単に述べると、細胞シートサンプルをPBSで洗浄し、その後、100μMのフェナセチン(PHE;Sigma Aldrich)及び50μMのミダゾラム(MDZ;Sigma Aldrich)(それぞれ、CYP1A2とCYP3A4の基質)を含む新鮮培地に置き換えた。細胞シート中のPHHは、2つのCYP基質を吸収して代謝し、その代謝産物を培地中に放出した。10分間のインキュベーション後、20μLの細胞培養上清を回収した。細胞培養上清中には、PHEとMDZの代謝産物、すなわち、アセトアミノフェンおよびヒドロキシミダゾラムを含んでいる。2つの代謝産物は、API5000 LC/MS/MS System(AB applied biosystems,Foster City,CA,US)で測定した。CYP基質の特異的な代謝産物への生体内変換率は、CYP酵素活性の指標として使用した。CYP活性の測定は、2つのロットのPHH(Hu8200_A ×2 + Hu1652×1)を用いて、3つの独立した実験で実施した。それぞれの実験において、3以上の反復試験サンプルを用いた。
それぞれの実験において、少なくとも3つ反復試験サンプル由来の値を得た。実験の全てを、PHHの2つのロットを用いて、3又は4回繰り返して行った。データは、平均±標準偏差(SD)で表した。2つの群の有意差は、Student’s t−testで検定した。3つの所定の時点における、PHH毎の断面の有意差は、分散分析(ANOVA)を用いて検定し、その後、IBM SPSS Statistics 25ソフトウェアを使用してDunnett’s post hoc testを行った。p<0.05の値を、統計的に有意であるものと見なした。
2−1.初代ヒト肝細胞(PHH)/線維芽細胞の共培養細胞シートの形態
PHHとNHDFの共培養比率が、肝細胞のダメージ及び変性の程度に影響を及ぼすかどうかを調べた(図8)。その結果、SHH産生は、PHH:NHDF=4:1の共培養と比較して、PHH:NHDF=1:4では3.5倍、PHH:NHDF=1:2では1.6倍上昇することが明らかとなった(図8(a))。肝細胞のサイズは、PHH:NHDF=1:2及び1:4よりも、4:1の共培養の方が小さくなることが明らかとなった(図8(b))。
1.実験材料と方法
1−1.細胞
脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC;LONZA)は、10%ウシ胎児血清(FBS;ThermoFisher Scientific)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Corning)を添加した高グルコースDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM;Corning,NY,US)で維持し、37℃、5%CO2の加湿雰囲気下で培養した。ADSCは、プレコンフルエントの段階で、トリプシンを用いて継代した。3継代目の細胞を共培養実験に用いた。
上記、NHDFの代わりにADSCを用いること以外、実施例1と同様の方法により、初代ヒト肝細胞/ADSCの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。ただし、ADSCは1×105個/ウェルで播種した。
図9はPHH/ADSC共培養細胞シート(aおよびb)、およびPHH/NHDF共培養細胞シート(cおよびd)の、剥離後28日目の位相差顕微鏡写真を示す。PHH/ADSC共培養細胞シート(aおよびb)とPHH/NHDF共培養細胞シート(cおよびd)のいずれも、NASHの特徴である脂肪滴の蓄積が確認された。
1.実験材料と方法
1−1.細胞
初代マウス肝細胞(PMH)はマウス肝臓から、改変2ステップコラゲナーゼ灌流法により単離し、45%percoll密度勾配遠心法で純化した。PMHの生存率は90%であった。
上記、PHHの代わりにPMHを用いること以外、実施例1と同様の方法により、初代マウス肝細胞(PMH)/NHDFの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。NHDFとして、PMHと共培養する前にmitomycin C(6μg/mL)で2.5時間処理したNHDFまたは無処理のNHDFを用いた(図10)。
mitomycin Cは、細胞の増殖を抑制する効果を有する。mitomycin C処理によって、肝細胞の風船様変化が抑制されることが明らかとなった(図10(a)参照)。
1−1.細胞
初代マウス肝細胞(PMH)は実施例3と同様の方法により取得した。
上記、PHHの代わりにPMHを用いること以外、実施例1と同様の方法により、初代マウス肝細胞(PMH)/NHDFの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。
オベチコール酸(OCA)およびメトホルミンの添加によって、肝細胞の風船様変化が抑制された(図11参照)。
1.実験材料と方法
1−1.細胞
PHHおよびNHDFは、実施例1で使用したPHHおよびNHDFを用いた。
上記実施例1と同様の方法により、初代ヒト肝細胞(PHH)/NHDFの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。
オベチコール酸(OCA)、メトホルミンそれぞれの添加によって、肝細胞の風船様変化が抑制された(図12参照)。
1.実験材料と方法
1−1.細胞
PHHおよびNHDFは、実施例1で使用したPHHおよびNHDFを用いた。
上記実施例1と同様の方法により、初代ヒト肝細胞(PHH)/NHDFの共培養、及び肝細胞構造体の作製を行った。
低グルコース濃度(5.6mM)+低インスリン濃度(1nM)の培地で培養することにより、ヒト肝細胞の風船様変化がある程度抑制されることが明らかとなった(図13参照)。
Claims (17)
- 肝細胞と、非肝細胞である接着細胞とを含む凝集体を含み、
前記肝細胞が、風船様肝細胞を含むことを特徴とする、肝細胞構造体。 - 前記接着細胞が、線維芽細胞または間葉系幹細胞である、請求項1に記載の肝細胞構造体。
- 前記接着細胞が、霊長類線維芽細胞である、請求項1または2に記載の肝細胞構造体。
- 前記凝集体が、細胞シートである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
- 正常肝細胞と比較して、細胞あたりのソニックヘッジホッグ(SHH)タンパク質の発現が高い、請求項1〜4のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
- Mallory−Denk体を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
- 前記肝細胞が、初代肝細胞である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
- 前記肝細胞構造体が、α−SMAを発現している、請求項1〜7のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
- 前記肝細胞:前記接着細胞の比が、10:1〜1:10である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の肝細胞構造体。
- 肝細胞構造体の製造方法であって、
(i)肝細胞と非肝細胞である接着細胞とを含む細胞群を凝集させて、凝集体を形成する工程;および、
(ii)前記凝集体を、培養する工程、
を含む、方法。 - 前記接着細胞が、線維芽細胞または間葉系幹細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記接着細胞が、霊長類線維芽細胞である、請求項10または11に記載の方法。
- 前記肝細胞が、初代肝細胞である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(i)が、
(i−1)第1培養基材の上に肝細胞を播種して、培養する工程;
(i−2)前記肝細胞が播種された前記第1培養基材の上に、前記接着細胞を播種し、培養する工程;および
(i−3)前記第1培養基材から前記肝細胞と前記接着細胞とを含む前記細胞群を剥離して、前記凝集体を形成する工程、
を含む、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。 - 前記工程(ii)が、前記凝集体を第2培養基材の上に接着させて、培養する工程である、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(i)において、前記肝細胞:前記接着細胞の比が、10:1〜1:10である、請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項10〜16のいずれか1項に記載の方法によって作製される肝細胞構造体。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120129207A1 (en) * | 2008-11-26 | 2012-05-24 | The General Hospital Corporation | Compositions and methods of functionally enhanced in vitro cell culture system |
JP2017119641A (ja) * | 2015-12-28 | 2017-07-06 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Nashの可能性の試験方法並びに経口組成物 |
JP2017163912A (ja) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター | 細胞構造体の製造方法 |
WO2018187380A1 (en) * | 2017-04-03 | 2018-10-11 | Greene Nguyen Deborah Lynn | Use of engineered liver tissue constructs for modeling liver disorders |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20180172668A1 (en) | 2015-06-23 | 2018-06-21 | Colorado State University Research Foundation | Engineered model of fibrotic diseases |
-
2019
- 2019-03-12 JP JP2019044725A patent/JP7425433B2/ja active Active
- 2019-07-03 US US16/502,232 patent/US20200291350A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120129207A1 (en) * | 2008-11-26 | 2012-05-24 | The General Hospital Corporation | Compositions and methods of functionally enhanced in vitro cell culture system |
JP2017119641A (ja) * | 2015-12-28 | 2017-07-06 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Nashの可能性の試験方法並びに経口組成物 |
JP2017163912A (ja) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター | 細胞構造体の製造方法 |
WO2018187380A1 (en) * | 2017-04-03 | 2018-10-11 | Greene Nguyen Deborah Lynn | Use of engineered liver tissue constructs for modeling liver disorders |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J. PATHOL., vol. 224, no. 3, JPN6023009374, July 2011 (2011-07-01), pages 401 - 410, ISSN: 0005118217 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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