JP2020142988A - 表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療効果を有する有効成分を提供すること。【解決手段】ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療剤。【選択図】なし

Description

本発明は、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療剤等に関する。
脂質は皮膚の恒常性を考える上で非常に重要な生体成分である。例えば、外界に接する皮膚表面の表皮角化細胞（ケラチノサイト）はセラミド（スフィンゴ脂質の一種）の層を作り、体内からの水分の蒸散または病原体などの侵入から体を守っている。ケラチノサイトの分化及び増殖のサイクルが壊れると、皮膚のバリアが乱れ、乾癬などの表皮肥厚性疾患をはじめ、魚鱗癬などの重篤な角質不全疾患、さらにはアトピー皮膚炎、接触性皮膚炎などのアレルギー疾患につながる。
スフィンゴ脂質に加えて、生体にはグリセロール骨格を持つ脂質が存在する。リン脂質の1種であるグリセロリン脂質は細胞膜の主要構成成分であり、その代謝異常は各種疾患に関与している。グリセロリン脂質には、グリセロール骨格のsn-1位の結合様式がエステル結合であるもの（アシル型）の他に、エーテル結合であるもの（アルキル型）又はビニルエーテル結合であるもの（アルケニル型）が存在する（図１）。これらのリン脂質は、複数の酵素によりリゾホスファチジン酸に代謝され、複数の特異的受容体を介して、癌浸潤、受精卵着床、血管新生、体毛形成等に関与する。アルキル型リゾリン脂質の代謝産物は、血小板活性化因子として、特異的受容体を介して気管支収縮作用を有する。アルケニル型リン脂質は、プラズマローゲンとも呼ばれ、生体内のリン脂質の約2割を占めており、特に脳神経、心筋、リンパ球、マクロファージでの含量が多い。プラズマローゲンの生合成不全は、致死性の神経疾患を呈することが知られているが（非特許文献１）、その機能については不明な点が多い。
近年、リン脂質の分解酵素であるホスホリパーゼA2（PLA2）が各種生体応答に関連することが報告されている（非特許文献２）。PLA2は、リン脂質を分解して脂肪酸とリゾリン脂質を遊離する酵素群の総称であり、脂質メディエーター（局所で一過的に酸性される、生理活性を発揮する生理活性脂質の総称）産生の初発酵素であると同時に、エネルギー代謝や脂肪酸バランスの調節、生体膜再構成にも関わる酵素である。哺乳類動物のゲノムにはPLA2に相応する名称を持つ分子が30種類以上コードされており、これらの分子は多様な生体応答を制御することが明らかとなっている。
PLA2の1種であるPLA2G2F（sPLA2-IIF）は、ある種のリゾリン脂質を産生することにより、表皮肥厚性疾患に関与することが報告されている（非特許文献３、図２）。そのメカニズムは次のとおりである。PLA2G2Fは、乾癬において増加するTh17サイトカイン（IL-22）により発現誘導され、表皮角化細胞から分泌された1-(1Z-octadecenyl)-2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（プラズマローゲン型ホスファチジルエタノールアミン、P-PE（18:0/22:6））を分解して、リゾ型の1-O-1'-(Z)-octadecenyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（プラズマローゲン型リゾホスファチジルエタノールアミン、P-LPE（18:0））を生成する。生成したP-LPEは、ケラチノサイトに作用して表皮の肥厚および炎症を悪化させることにより、表皮肥厚性疾患の増悪に関与している。
国際公開第2014/010667号
Braverman, N.E., Moser, A.B. Functions of plasmalogen lipids in health and disease. Biochim. Biophys. Acta 1822, 1442-1452. (2012) Murakami, M., Sato, H., Miki, Y., Yamamoto, K., and Taketomi, Y. A new era of secreted phospholipase A2. J. Lipid Res. 56, 1248-1261 (2015). Yamamoto, K., Miki, Y., Sato, M., Taketomi, Y., Nishito, Y., Taya, C., Muramatsu, K., Ikeda, K., Nakanishi, H., Taguchi, R., Kambe, N., Kabashima, K., Lambeau, G., Gelb, M.H., and Murakami, M. The role of group IIF secreted phospholipase A2 in epidermal homeostasis and hyperplasia. J. Exp. Med. 212, 1901-1919 (2015). Matsumoto, Y., Kashiwabara, N., Oyama, T., Murayama, K., Matsumoto, H., Sakasegawa, S., Sugimori, D. Molecular cloning, heterologous expression, and enzymatic characterization of lysoplasmalogen-specific phospholipase D from Thermocrispum sp. FEBS Open Bio. 6, 1113-1130 (2016). Stracke, M.L., Krutzsch, H.C., Unsworth, E.J., Arestad, A., Cioce, V., Schiffmann, E., Liotta, L.A. Identification, purification, and partial sequence analysis of autotaxin, a novel motility-stimulating protein. J. Biol. Chem. 267, 2524-2529 (1992). Umezu-Goto, M., Kishi, Y., Taira, A., Hama, K., Dohmae, N., Takio, K., Yamori, T., Mills, G.B., Inoue, K., Aoki, J., and Arai, H. Autotaxin has lysophospholipase D activity leading to tumor cell growth and motility by lysophosphatidic acid production. J Cell Biol. 158, 227-233 (2002). Tokumura, A., Majima, E., Kariya, Y., Tominaga, K., Kogure, K., Yasuda, K., and Fukuzawa, K. Identification of human plasma lysophospholipase D, a lysophosphatidic acid-producing enzyme, as autotaxin, a multifunctional phosphodiesterase. J Biol Chem. 277, 39436-39442. (2002). Tortola, L., Rosenwald, E., Abel, B., Blumberg, H., Schafer, M., Coyle, A.J., Renauld, J.C., Werner, S., Kisielow, J., and Kopf, M. Psoriasiform dermatitis is driven by IL-36-mediated DC-keratinocyte crosstalk. J. Clin. Invest. 122, 3965-3976 (2012).
本発明は、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療効果を有する有効成分を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を用いることにより、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療が可能であることを見出した。
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１． ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、表皮肥厚症状の予防又は改善剤．
項２． 前記ホスホリパーゼDがリゾリン脂質を基質として活性を示すホスホリパーゼDである、項１に記載の剤．
項３． 前記ホスホリパーゼDがアルケニル型リゾリン脂質を基質として活性を示すホスホリパーゼDである、項１又は２に記載の剤．
項４． 前記ホスホリパーゼDがアルケニル型リゾホスファチジルエタノールアミンを基質として活性を示すホスホリパーゼDである、項１又は２に記載の剤．
項５． 前記ホスホリパーゼDがThermocrispum属細菌由来ホスホリパーゼDである、項１〜４のいずれかに記載の剤．
項６． 前記ホスホリパーゼDが下記（a）〜（e）の特性：
（a）分子量が28〜38 kDaであること、
（b）至適温度が45〜53℃であること、
（c）至適pHが3.5〜10.5であること、
（d）カルシウムイオン又はアルミニウムイオンにより酵素活性が増加すること、及び
（e）マグネシウムイオンにより酵素活性が減少すること、
からなる群より選択される少なくとも1種を満たすホスホリパーゼDである、項１〜５のいずれかに記載の剤．
項７． 前記ホスホリパーゼDがThermocrispum sp.のRD004668株由来ホスホリパーゼDである、項１〜６のいずれかに記載の剤．
項８． 前記ホスホリパーゼDが下記（i）又は（ii）に記載のタンパク質：
（i）配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ii）配列番号1に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルケニル型リゾリン脂質に対してホスホリパーゼD活性を有するタンパク質
である、項１〜７のいずれかに記載の剤．
項９． ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、表皮肥厚性疾患の予防又は治療剤．
項１０． ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、乾癬、接触性皮膚炎（かぶれ）、皮膚がん、及びアトピー性皮膚炎からなる群より選択される少なくとも1種の疾患の予防又は治療剤．
項１１． 表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療のための、ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種。
項１２． 表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療剤の製造のための、ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種の使用。
項１３． 表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療のための、ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種の使用。
項１４． ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を対象に適用することを含む、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療方法
本発明によれば、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療剤を提供することができる。これらの本発明の剤によれば、例えば外用という簡便な適用方法により、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療効果を発揮することができる。
グリセロリン脂質における、グリセロール3リン酸骨格のsn-1位の結合様式による分類と、各種分類群が関連する受容体及び生理活性を示す。 PLA2の1種であるPLA2G2F（sPLA2-IIF）が、ある種のリゾリン脂質を産生することにより、表皮肥厚性疾患に関与するメカニズムを示す。 参考例2の結果を示す。A：アルケニル型リゾリン脂質がホスホリパーゼDによってリゾホスファチジン酸に代謝される想定を示す図である。B：アルケニル型リゾリン脂質代謝産物およびLPA(18:0)標品のマススペクトルを示す。C：クロマトグラムにより各種脂質の溶出パターンを示す。D：アルケニル型及びアシル型リゾリン脂質標品を基質とした時のオートタキシンに対する基質特異性を調べた結果を示す。縦軸は、各脂質の定量値を示し、横軸は作用させたオートタキシンの量を示す。 実施例1の結果を示す。横軸は、定量した脂質名を表し、縦軸は、ホスホリパーゼD（参考例1）を反応液に加えない場合（黒カラム）の定量値を100とした場合の相対値を表す。右上に示される濃度は、反応液中のホスホリパーゼD（参考例1）の濃度である。 実施例2の試験の概要及び結果を示す。A：試験概要を示す。B：耳介厚の測定結果を示す。縦軸は、試験開始前に測定した耳介厚との差を表し、横軸中の数値は塗布1回当たりのホスホリパーゼDの塗布量を示す。横軸中のLyPls-PLDはホスホリパーゼD投与群を示し、IMQはイミキモド投与群を示す。**はP値が0.01未満であることを示す。C：炎症マーカーTNFの定量結果を示す。縦軸は、炎症マーカーの発現量の、コントロール（Gapdh）の発現量に対する相対値を表し、横軸中のLyPls-PLDは、塗布1回当たりのホスホリパーゼDの塗布量を示し、横軸中のIMQはイミキモド投与の有（＋）無（−）を示す。D：各種脂質の定量結果を示す。縦軸は、各種脂質の定量値を示し、横軸中のLyPls-PLDは、塗布1回当たりのホスホリパーゼDの塗布量を示し、横軸中のIMQはイミキモド投与の有（＋）無（−）を示す。 実施例3の試験の概要及び結果を示す。A：試験概要を示す。B：耳介厚の測定結果を示す。縦軸は、試験開始前に測定した耳介厚との差を表し、横軸はホスホリパーゼD（LyPls-PLD）投与開始からの経過日数を示す。**はP値が0.01未満であることを示す。C：炎症マーカーTNFの定量結果を示す。縦軸は、炎症マーカーの発現量の、コントロール（Gapdh）の発現量に対する相対値を表し、横軸はLyPls-PLD投与の有（LyPls-PLD）無（Control）を示す。 D：各種脂質の定量結果を示す。縦軸は、各種脂質の定量値を示し、横軸はLyPls-PLD投与の有（LyPls-PLD）無（Control）を示す。
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
本発明は、その一態様において、ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、表皮肥厚症状の予防又は改善剤、表皮肥厚症状を呈する疾患の予防又は治療剤、或いは各種疾患の予防又は治療剤に関する。なお、本明細書において、これらを総称して、「本発明の剤」と示すこともある。以下、これらについて説明する。
1．有効成分
ホスホリパーゼDは、アルケニル型リゾリン脂質に対してホスホリパーゼD活性を有するものである限り特に制限されない。
なお、本明細書において、ホスホリパーゼD活性は次のようにして測定する。生体組織（好ましくは表皮）から精製したリン脂質及びリゾリン脂質を用いてリポソームを形成し、これを基質として用いる。測定対象の酵素と基質とを反応させ、反応後、各種脂質の量を定量する。得られた定量値に基づいて、各種脂質に対するホスホリパーゼD活性を、酵素活性の算出方法に従って算出する。定量値は、例えば実施例1の方法に従って又は準じて得ることができる。
アルケニル型リゾリン脂質とは、グリセロリゾリン脂質の内、グリセロール3リン酸のsn-1位の結合様式がビニルエーテル結合であるリゾリン脂質である。アルケニル型リゾリン脂質の構造式の一例は、一般式（1）：
［式中、R1は鎖式炭化水素基を示し、R2は親水性基を示す。］
で表される。
R1で示される鎖式炭化水素基は、一価の鎖式炭化水素基である限り特に制限されず、直鎖状又は分岐鎖状（好ましくは直鎖状）のいずれのものも包含する。鎖式炭化水素基の炭素数は、生体内に存在するアルケニル型リゾリン脂質が有する鎖式炭化水素基の炭素数である限り特に制限されないが、例えば4〜30、好ましくは8〜25、より好ましくは12〜22、さらに好ましくは14〜22、よりさらに好ましくは16〜22である。また、該炭素数は偶数であることが好ましい。鎖式炭化水素基は、飽和鎖式炭化水素基及び不飽和炭化水素基の何れも包含するが、好ましくは飽和鎖式炭化水素基である。鎖式炭化水素基としては、例えばブチル、ペンチル、へキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、9−ペンタデセニル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、cis−9−ヘプタデセニル、11−ヘプタデセニル、cis,cis−9,12−ヘプタデカジエニル、9,12,15−ヘプタデカントリエニル、6,9,12−ヘプタデカントリエニル、9,11,13−ヘプタデカントリエニル、ノナデシル、8,11−ノナデカジエニル、5,8,11−ノナデカトリエニル、5,8,11,14−ノナデカテトラエニル、ヘンイコシル、トリコシル、cis−15−トリコセニル、ペンタコシル、ヘプタコシル、ノナコシル等が挙げられる。
R2で示される親水性基は、親水性を有し、生体内に存在するアルケニル型リゾリン脂質が有する一価の親水性基である限り、特に制限されない。親水性基としては、例えば、エタノールアミンから水酸基が除かれてなる基、コリンから水酸基が除かれてなる基、イノシトールから水酸基が除かれてなる基、セリンから水酸基が除かれてなる基等が挙げられ、好ましくはエタノールアミンから水酸基が除かれてなる基、コリンから水酸基が除かれてなる基等が挙げられ、より好ましくはエタノールアミンから水酸基が除かれてなる基が挙げられる。
ホスホリパーゼDの上記定義において、「アルケニル型リゾリン脂質に対してホスホリパーゼD活性を有する」とは、アルケニル型リゾリン脂質のリン酸と親水性部位（例えば、コリン、エタノールアミン、イノシトール、セリン等）との間のリン酸エステル結合を、より詳細には、例えば一般式（1）で表される化合物中のリン原子と、R2に隣接する酸素原子との間の結合を、加水分解する活性である。
ホスホリパーゼDは、リゾリン脂質を基質として活性を示すホスホリパーゼDであることが好ましく、アルケニル型リゾリン脂質を基質として活性を示すホスホリパーゼDであることがより好ましく、アルケニル型リゾホスファチジルエタノールアミンを基質として活性を示すホスホリパーゼDであることがさらに好ましい。
ホスホリパーゼDは、アルケニル型リゾホスファチジルエタノールアミン特異的ホスホリパーゼDであることが好ましい。ここで、「特異的」とは、アルケニル型リゾホスファチジルエタノールアミンに対するホスホリパーゼD活性が、これ以外のリン脂質に対するホスホリパーゼD活性よりも高いことを意味し、例えば前者の活性が後者の活性の2倍、好ましくは5倍、より好ましくは10倍、さらに好ましくは20倍、よりさらに好ましくは50倍、よりさらに好ましくは100倍であることを意味する。
ホスホリパーゼDの由来生物は、特に制限されない。由来生物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳類動物； アフリカツメガエル等の両生類動物； ヘビ等の爬虫類動物； ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ等の魚類動物； ホヤ等の脊索動物； ハチ、ショウジョウバエ、カイコ等の節足動物；等の動物： 酵母、アカパンカビ等の菌類： 放線菌、大腸菌、枯草菌、藍藻等の細菌等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは細菌が挙げられ、より好ましくは放線菌が挙げられ、さらに好ましくはThermocrispum属細菌が挙げられ、よりさらに好ましくはThermocrispum sp.のRD004668株（特許生物寄託センター受託番号：NITE BP-01628、16S rDNA配列：DDBJデータベースのアクセッション番号：AB873024）が挙げられる。
本発明の好ましい一態様において、ホスホリパーゼDは下記（a）〜（e）の特性：
（a）分子量が28〜38 kDaであること、
（b）至適温度が45〜53℃であること、
（c）至適pHが3.5〜10.5であること、
（d）カルシウムイオン又はアルミニウムイオンにより酵素活性が増加すること、及び
（e）マグネシウムイオンにより酵素活性が減少すること、
の少なくとも1つ（好ましくは2つ、3つ、4つ、全部）を満たす。
特性（a）において、分子量は、好ましくは30〜36 kDaであり、より好ましくは32〜34 kDaである。
特性（b）において、至適温度は、好ましくは47〜52℃であり、より好ましくは49〜51℃である。なお、至適温度とは、酵素活性が最大を示す温度を意味する。
特性（c）において、至適pHは、好ましくは4〜10である。なお、至適pHとは、酵素活性が最大を示すpHを意味する。
特性（d）において、「カルシウムイオン又はアルミニウムイオンにより酵素活性が増加する」とは、カルシウムイオン又はアルミニウムイオンが添加された場合のアルケニル型リゾリン脂質に対するホスホリパーゼD活性が、金属イオンが添加されていない場合のアルケニル型リゾリン脂質に対するホスホリパーゼD活性の、例えば1.2倍、好ましくは1.5倍、より好ましくは2倍であることを意味する。
特性（e）において、「マグネシウムイオンにより酵素活性が減少する」とは、マグネシウムイオンが添加された場合のアルケニル型リゾリン脂質に対するホスホリパーゼD活性が、金属イオンが添加されていない場合のアルケニル型リゾリン脂質に対するホスホリパーゼD活性の、例えば0.8倍、好ましくは0.5倍、より好ましくは0.2倍であることを意味する。
本発明の好ましい一態様において、ホスホリパーゼDは、下記（i）又は（ii）に記載のタンパク質：
（i）配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ii）配列番号1に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルケニル型リゾリン脂質に対してホスホリパーゼD活性を有するタンパク質
である。
本明細書において、アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（Karlin S， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の「同一性」も上記に準じて定義される。
上記（ii）のタンパク質について、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対する同一性の程度は、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上である。
上記（ii）のタンパク質は、好ましくは下記（iia）に記載のタンパク質：
（iia）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が変異（例えば置換、欠失、付加、挿入等、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）したアミノ酸配列からなり、且つアルケニル型リゾリン脂質に対してホスホリパーゼD活性を有するタンパク質
である。
上記（iia）のタンパク質について、複数個とは、例えば2〜8個、好ましくは2〜4個、より好ましくは2個である。
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
ホスホリパーゼDは、上記「活性」を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
ホスホリパーゼDは、C末端がカルボキシル基（−COOH）、カルボキシレート（−COO−）、アミド（−CONH2）またはエステル（−COOR）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1−6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ホスホリパーゼDは、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ホスホリパーゼDには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
ホスホリパーゼDは、上記「活性」を有する限りにおいて、公知のタンパク質タグ、シグナル配列等のタンパク質又はペプチドが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。
ホスホリパーゼDは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩； 酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩； アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
ホスホリパーゼDは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
ホスホリパーゼD発現カセットは、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状の予防、改善、又は治療対象生物の細胞内でホスホリパーゼDを発現可能なポリヌクレオチドである限り特に制限されない。ホスホリパーゼD発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置されたホスホリパーゼDコード配列を含むDNAが挙げられる。
本明細書において、DNA、RNAなどのポリヌクレオチドには、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
ホスホリパーゼD発現カセットに含まれるプロモーターとしては、特に制限されず、例えばpol II系プロモーターを各種使用することができる。pol II系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。
ホスホリパーゼD発現カセットは、必要に応じて、他のエレメント（例えば、マルチクローニングサイト（MCS）、薬剤耐性遺伝子、複製起点など）を含んでいてもよい。例えば、ホスホリパーゼD発現カセットにおいて、5´側から、プロモーター、ホスホリパーゼDのコード配列の順に配置されている場合であれば、プロモーターとホスホリパーゼDのコード配列の間に（好ましくはいずれか一方或いは両方に隣接して）、ホスホリパーゼDのコード配列の3´側に（好ましくは隣接して）、MCSが配置されている態様が挙げられる。MCSは複数（例えば2〜50、好ましくは2〜20、より好ましくは2〜10）個の制限酵素サイトを含むものであれば特に制限されない。
薬剤耐性遺伝子としては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
ホスホリパーゼD発現カセットは、これのみで、或いは他の配列と共にベクターを構成していてもよい。ベクターの種類は、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミド等のプラスミドベクター； レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター； アグロバクテリウムベクター等が挙げられる。
ホスホリパーゼD及びその発現カセットは、必要に応じてホスホリパーゼDのアミノ酸配列又はコード配列等を利用し、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術、生物からの酵素精製技術等を利用して作製することができる。また、生物からの酵素精製技術の一例として、非特許文献４を参照することもできる。
2．用途
ホスホリパーゼDは、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療効果を有することから、ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種は、表皮肥厚性疾患及び／又は表皮肥厚性症状に対する予防、改善、又は治療剤（例えば医薬、化粧品、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）など）の有効成分としての利用が可能である。有効成分は、これをそのまま、あるいは慣用の成分とともに各種組成物となし、動物およびヒトに適用（例えば、投与、摂取、接種など）することができる。
表皮肥厚性疾患は、症状の1つとして表皮肥厚症状を伴うことがある疾患である限り特に制限されない。表皮肥厚性疾患としては、例えば乾癬、接触性皮膚炎（かぶれ）、皮膚がん、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。
本発明の剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。
本発明の剤の形態は、特に限定されず、本発明の代謝改善剤の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
形態としては、用途が医薬である場合は、例えば貼付剤（プラスター剤、硬膏剤等のテープ剤（リザーバー型、マトリックス型等）、パップ剤、パッチ剤、マイクロニードル等）、軟膏剤、外用液剤（リニメント剤、ローション剤等）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等、クリーム剤、ゲル剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤等の非経口摂取に適した製剤形態（特に、外用製剤形態）； 錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）が挙げられ、外用製剤形態が好ましく挙げられる。外用製剤形態の場合、好ましくは、表皮肥厚性症状を呈し得る患部に適用する。
形態としては、用途が健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、が挙げられる。
形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。
形態としては、用途が口腔用組成物である場合は、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液など）、半固体（ゲル、クリーム、ペーストなど）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体など）などの任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨など）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチなど）などが挙げられる。
本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、化粧品、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
本発明の剤の有効成分の含有量は、有効成分の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜100重量％、好ましくは0.001〜50重量％とすることができる。
本発明の剤の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、所望の効果を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1〜1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2〜3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
なお、実施例及び図面において、LPCはリゾホスファチジルコリンを示し、LPEはリゾホスファチジルエタノールアミンを示し、LPAは、リゾホスファチジン酸を示し、PCはホスファチジルコリンを示し、PEはホスファチジルエタノールアミンを示し、括弧中のP-はプラズマローゲン型であることを示し、X：Yなる表記は脂質中の長鎖炭化水素鎖の炭素数（X）及び二重結合の数（Y）を示す。
参考例1
Thermocrispum sp.のRD004668株（特許生物寄託センター受託番号：NITE BP-01628、16S rDNA配列：DDBJデータベースのアクセッション番号：AB873024）が有するホスホリパーゼD（配列番号1：非特許文献４に記載）を、特許文献１に記載の方法に従って、組換えタンパク質として製造した。具体的には、以下の様にして製造した。
Thermocrispum sp.のRD004668株の染色体DNAを、フェノール・クロロホルム法にて抽出した。配列番号2に記載の塩基配列をアンチセンスプライマー、配列番号3に記載の塩基配列をセンスプライマーとして、KOD FXを用いてPCRし、約900bpのPCR産物を得た。PCR産物をNdeIとEcoRIで消化し、発現ベクターであるpET−21a（＋）ベクターのNdeI−EcoRI部位に挿入して、T＿LyPLD／pET−21a（＋）を得た。T LyPLD／pET−21a（＋）を、One Shot BL21（DE3） Chemically Competent E.coliに形質転換して本発明の蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体T＿LyPLD／pET−21a（＋）／BL21（DE3）を得た。T LyPLD／pET−21a（＋）／BL21（DE3）を、50μg／mlのアンピシリンを含む、50mL（500mL三角フラスコ）のOvernight Express Instant TB Mediumに植菌した。37℃、pH6.8で24時間振とう培養して培養液を遠心分離して集菌し、20mM Tris／HCl緩衝液（pH8.5）に懸濁し超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗蛋白質液とした。粗蛋白質液中のThermocrispum sp. のRD004668株由来の組換えホスホリパーゼD 20Uを製造した。得られたホスホリパーゼDを以下の参考例及び実施例で用いた。
非特許文献４によれば、得られたホスホリパーゼDの特性は以下のとおりである。
（a1）分子量が33452 Daである。
（b1）至適温度が50℃である。
（c1）至適pHが4.1〜9.75である。
（d1）カルシウムイオン又はアルミニウムイオンにより酵素活性が増加する。
（e1）マグネシウムイオンにより酵素活性が減少する。
参考例2
非特許文献３で生理活性が明らかとなったアルケニル型リゾリン脂質であるP-LPEや心筋に多いとされるP-LPCは、報告されているアシル型のリゾリン脂質であるLPEやLPCと同様に、構造的にホスホリパーゼDによってリゾホスファチジン酸に代謝されることが想定される（図３Ａ）。このことを確認するために、市販のアシル型およびアルケニル型リゾリン脂質の両方に活性を示すホスホリパーゼDであるオートタキシン（Cayman社）及び上記の脂質標品（P-LPE (LPE(P-18:0), C18(Plasm)LPE)、P-LPC(LPC(P-18:0), C18(Plasm)LPC)、LPE (LPE(18:0), 18:0 Lyso PE)、LPC (LPC(18:0) 18:0 Lyso PC)、Avanti Polar Lipids社）を用いて、以下の実験を行った。
まず、アルケニル型リゾリン脂質代謝産物のマススペクトルを調べた。オートタキシンはLPEやLPCを分解してLPAを産生する分泌型ホスホリパーゼＤである（非特許文献５、６及び７）。全量50μLの反応系に、100 mM Tris-HCl (pH 9.0)、500 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.05% Triton X-100に終濃度1 mMのLPE(P-18:0)とオートタキシンを作用させ、37℃で1時間反応させた。反応終了後、Bligh & Dyer法により総脂質を抽出しトリプル四重極質量分析装置4000 QTRAP LC/MS/MSシステム（Sciex)を用いて定性分析をおこなった。結果を図３Ｂに示す。図３Ｂ上段に示されるように、アルケニル型リゾリン脂質代謝産物として想定される[LPA(P-18:0)]-のm/z 421.2のフラグメントが認められ、そのフラグメントを開裂させるとm/z 152.8が得られた。このm/z 152.8のフラグメントは、図３Ｂ下段のLPA(18:0)標品のマススペクトルに示されるように、[LPA(18:0)-H]-に相当するm/z 437.1の親フラグメントからグリセロール骨格sn-1位で開裂し代謝されたフラグメントと一致した。
次に、クロマトグラムにより各種脂質の溶出パターンを分析した。液体クロマトグラフィー（LC）はNexeraX2システム（島津）を用いて、カラム：KineteXカラム（1×150mm、内径1.7 μm：Phenomenex）、サンプル流入量：10 μL、流速：0.2 ml/min、カラム温度：50℃で、溶媒A（アセトニトリル／メタノール／水= 1:1:1(vol/vol/vol)、5 μM リン酸、1 mM ギ酸アンモニウム）および溶媒B（2−プロパノール、5 μM リン酸、1 mM ギ酸アンモニウム）のグラジエントにより分離した。各リン脂質分子は、トリプル四重極質量分析装置を用いて図中のQ1/Q3値を用いて測定した。結果を図３Ｃに示す。図３Ｃに示されるように、各リゾリン脂質の溶出時間は、LPE(18:0)：8.32分、LPC(18:0)：8.25分、LPA(18:0)：7.56分、LPE(P-18:0)：8.52分、LPC(P-18:0)：8.45分、LPA(P-18:0)：7.78分、となった。このことから、アシル型リゾリン脂質（LPA(18:0) > LPC(18:0) > LPE(18:0)）とアルケニル型リゾリン脂質（LPA(P-18:0) > LPC(P-18:0) > LPE(P-18:0)）の溶出パターンが同じ傾向であることが分かった。
さらに、リゾリン脂質を基質とした時のオートタキシンに対する基質特異性を調べた。各リゾリン脂質（1 mM）を基質とし、上記の条件で反応させ反応生成物を定量した。結果を図３Ｄに示す。図３Ｄに示されるように、LPE(18:0)を基質とした時の酵素活性はLPC(18:0)の25.4%であった。同様にLPE(P-18:0)を基質とした時の酵素活性はLPC(P-18:0)の32.0%であったことから、アルケニル型リゾリン脂質LPE(P-18:0), LPC(P-18:0) は、アシル型リゾリン脂質LPE(18:0)とLPC(18:0)と同様にオートタキシンに対して基質特異性を有することが分かった。以上より、アルケニル型リゾリン脂質（LPC(P-18:0)、LPE(P-18:0))によるホスホリパーゼD代謝産物は、アルケニル型リゾホスファチジン酸(LPA(P-18:0))であることが決定された。
実施例1
非特許文献４で採用されているホスホリパーゼD活性測定法は、1 mM リン脂質（1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）と0.4 mM リゾリン脂質を混合して作成されたリポソームを基質としている。しかしながら、一般的に生体膜には様々なリン脂質分子やリゾリン脂質分子などを含んでいるため、この方法は正確な基質特異性を反映していない。そこで、生体から採取したリン脂質及びリゾリン脂質から構成したリポソームを基質として、ホスホリパーゼDの基質特異性を調べた。具体的には以下の様にして行った。
イミキモドを5日間塗布したマウス耳介からBligh & Dyer法により総脂質を抽出し、得られた総脂質からSilicaカートリッジ（Waters社製）を用いてリン脂質及びリゾリン脂質を精製した。得られたリン脂質及びリゾリン脂質を超音波処理することによりリポソームを調製した。全量20 μLの反応液（組成：50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、2 mM CaCl2、100 μMの基質（上記で得たリポソーム）、各種濃度のホスホリパーゼDを調製し、37℃で1時間反応させた。反応終了後、Bligh & Dyer法により総脂質を抽出し、該総脂質中の各種脂質の量を脂質質量分析計を用いて定量した。ホスホリパーゼDを反応液に加えない場合の定量値を100として、相対値を算出した。
結果を図４に示す。ホスホリパーゼDを加えてもアシル型リゾリン脂質量に変化はなかったものの、アルケニル型リゾリン脂質（LPC(P-18:0), LPC(P-18:1), LPE(P-18:0), LPE(P-18:1))は、添加した酵素量に依存して低下した。酵素反応生成物のアルケニル型LPA（P-LPA(18:0)）量は添加した酵素に依存して増加した。また、アシル型およびアルケニル型リン脂質には変化はなかった。
実施例2
乾癬はTh17応答を介する表皮肥厚性疾患である。マウスの皮膚にイミキモド（IMQ）（ベセルナクリーム：持田製薬）を連続塗布することによりヒト乾癬と類似した皮膚炎が誘導されることが知られている（非特許文献８）。そこで、この乾癬モデルを用いて、ホスホリパーゼDの表皮肥厚性疾患に対する効果を調べた。具体的には以下の様にして行った。
Balb/cマウスの耳介の皮膚表皮角質層をセロテープ（登録商標）を用いて一部剥離し、10 mM Tris-HCl (pH8.5) 溶液で調製したホスホリパーゼD溶液を塗布した後にIMQを塗布した。これを連続5日間繰り返し塗布した（図５Ａ）。5日間の塗布終了後にノギスにより耳介厚を測定し、試験開始前に測定した耳介厚との差を算出した。結果を図５Ｂに示す。図５Ｂに示されるように、ホスホリパーゼDのみを添加した場合では耳介厚に変化はなかったが、IMQの塗布により肥厚した耳介はホスホリパーゼDを加えることで濃度に依存して緩和された。
また、5日間の塗布終了後に、耳介からRNAを抽出して、該RNA中に含まれる炎症マーカー TNFの発現量を定量的PCRにより定量した。結果を図５Ｃに示す。図５Ｃに示されるように、IMQの塗布により増加した炎症マーカーはホスホリパーゼDを加えることにより低下した。
さらに、5日間の塗布終了後に、耳介から総脂質をBligh & Dyer法により抽出し、該総脂質中の各種脂質の量を脂質質量分析計を用いて定量した。結果を図５Ｄに示す。図５Ｄに示されるように、ホスホリパーゼDのみを添加した場合、耳介中のLPE（P-18:0）量は対照と比較して低下した。IMQ塗布により著しく増加したLPE（P-18:0）量もホスホリパーゼDの塗布により低下した。酵素反応生成物のLPA(P-18:0)量はIMQ塗布に増加するとともに、ホスホリパーゼDの塗布によりさらに増加した。
この結果から、ホスホリパーゼDにはP-LPEを代謝することにより乾癬の発症を抑える予防効果があることが示された。
実施例3
イミキモドを連続5日間塗布したBalb/cマウスの耳介にホスホリパーゼD（10 μg/片面）を2日間塗布した（図６Ａ）。2日間の塗布終了後にノギスにより耳介厚を測定し、試験開始前に測定した耳介厚との差を算出した。結果を図６Ｂに示す。図６Ｂに示されるように、ホスホリパーゼDの塗布2日後に、肥厚した耳介は対照と比較して緩和された。
また、2日間の塗布終了後に、耳介からRNAを抽出して、該RNA中に含まれる炎症マーカー TNFの発現量を定量的PCRにより定量した。結果を図６Ｃに示す。図６Ｃに示されるように、IMQの塗布により増加した炎症マーカーはホスホリパーゼDを加えることにより低下した。
さらに、2日間の塗布終了後に、耳介から総脂質をBligh & Dyer法により抽出し、該総脂質中の各種脂質の量を脂質質量分析計を用いて定量した。結果を図６Ｄに示す。図６Ｄに示されるように、耳介中のP-LPE（18:0）はホスホリパーゼDの塗布により低下した。反応生成物のLPA(P-18:0)量はLyPls-PLDの塗布により増加した。この結果は、ホスホリパーゼDの外用により耳介中のP-LPE（18:0）が代謝されること、さらにIMQの塗布により肥厚した耳介が緩和されることを示している。
以上の結果から、ホスホリパーゼDはP-LPEを代謝することにより一度発症した乾癬を緩和する治療効果を持つことが示された。

Claims (10)

  1. ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、表皮肥厚症状の予防又は改善剤。
  2. 前記ホスホリパーゼDがリゾリン脂質を基質として活性を示すホスホリパーゼDである、請求項１に記載の剤。
  3. 前記ホスホリパーゼDがアルケニル型リゾリン脂質を基質として活性を示すホスホリパーゼDである、請求項１又は２に記載の剤。
  4. 前記ホスホリパーゼDがアルケニル型リゾホスファチジルエタノールアミンを基質として活性を示すホスホリパーゼDである、請求項１又は２に記載の剤。
  5. 前記ホスホリパーゼDがThermocrispum属細菌由来ホスホリパーゼDである、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
  6. 前記ホスホリパーゼDが下記（a）〜（e）の特性：
    （a）分子量が28〜38 kDaであること、
    （b）至適温度が45〜53℃であること、
    （c）至適pHが3.5〜10.5であること、
    （d）カルシウムイオン又はアルミニウムイオンにより酵素活性が増加すること、及び
    （e）マグネシウムイオンにより酵素活性が減少すること、
    からなる群より選択される少なくとも1種を満たすホスホリパーゼDである、請求項１〜５のいずれかに記載の剤。
  7. 前記ホスホリパーゼDがThermocrispum sp.のRD004668株由来ホスホリパーゼDである、請求項１〜６のいずれかに記載の剤。
  8. 前記ホスホリパーゼDが下記（i）又は（ii）に記載のタンパク質：
    （i）配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
    （ii）配列番号1に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルケニル型リゾリン脂質に対してホスホリパーゼD活性を有するタンパク質
    である、請求項１〜７のいずれかに記載の剤。
  9. ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、表皮肥厚性疾患の予防又は治療剤。
  10. ホスホリパーゼD及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、乾癬、接触性皮膚炎（かぶれ）、皮膚がん、及びアトピー性皮膚炎からなる群より選択される少なくとも1種の疾患の予防又は治療剤。
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