JP2020130181A - インジェクションピペット - Google Patents
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Abstract
Description
図13は、卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのコンベンショナル法を説明する図である。図13(a)に示すように、コンベンショナル法では、ホールディングピペット68に固定された卵子60の破膜に先端が鋭利なスパイク加工されたマイクロピペット(以下、「コンベンショナルピペットCV」と記す。)が用いられている。精子70は、コンベンショナルピペットCVの内部に吸引されている。
ここで、圧電微小駆動装置を用いた精子の卵子細胞質内への顕微注入操作について説明する。図14は、卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのピエゾICSI法を説明する図である。
図1は、本発明によるインジェクションピペットの外観、構成を示す図であり、図1(a)はインジェクションピペットの全体を示す図、図1(b)はインジェクションピペットの主テーパ部と主テーパ部の先端側に位置する先端テーパ部の外形を示す図、図1(c)は、図1(b)に示す破線円内の領域Aの先端テーパ部の構成を示す拡大断面図である。
次に、ブタ用のICSI操作に用いるインジェクションピペットの熱収縮部における先端の形状について説明する。
次に、インジェクションピペット1の作成について述べる。図1に示すインジェクションピペット1の作成には、素材がガラス管からなり、外径1mm、ガラス管肉厚約50μm、即ち、ガラス管の外径に対する内径の割合が90%のガラス管(以下、「90管」と記す。)、ガラス管肉厚約75μm(以下、「85管」と記す。)、ガラス管肉厚約125μm(以下、「75管」と記す。)を用いる。ガラス管をガラス管引き伸ばし機にセッティングし、目的の形状に合わせたプログラムにより、ガラス管を細く引き伸ばす。
次に、インジェクションピペット1が接続された圧電微小駆動装置の構成について説明する。
次に、本発明のインジェクションピペットを用いた培養液量の違いによるPMMの卵子透明体への穿刺性、操作性の実験評価について述べる。尚、以下に示す穿刺性の測定は、インジェクションピペットにオペレーションリキッドを使用することなしに、培養液量等で卵子透明体に穿刺可能であるかを測定したものである。
以下にインジェクションピペット毎の先端から培養液量の違いによるPMMの穿刺性の測定結果を図5を用いて説明する。図5は、インジェクションピペット1内に吸引した培養液量の違いによるPMMの穿刺性の測定結果を示すグラフであり、(a)はコントローラのスピード2における穿刺可能なコントローラのインテンシティー値の測定結果、(b)はコントローラのスピード5における穿刺可能なコントローラのインテンシティー値の測定結果である。
次に、図5に示すインジェクションピペット内に吸引した培養液量の違いによるインジェクタの操作性について説明する。このインジェクタの操作性とはインジェクタによるインジェクションピペット内への培養液等の吸引と吐出といった微妙な操作についての操作性を意味する。
次に、超薄肉ガラス90管を用いて作製した90−5−RD−Rのインジェクションピペット1をオペレーションリキッド無しの条件でピエゾマイクロマニピュレータ(PMM)に使用した場合の穿刺性能を評価した。同様に85管で作製した先端外径の大きさが6μm、主テーパ部のみで構成されたパラレルタイプP、先端形状が大きい丸めタイプHRからなる85−6−P−HRのインジェクションピペットについてもオペレーションリキッド無しの条件でPMMの穿刺性能の評価試験を行った。穿刺性能の評価は、図7に示すように、C1、T1、T2、T3、T4の5つの試験区に区分して、各試験区でのブタ卵子透明帯への穿刺操作のコントローラ54のSpeed、Intensityの数値を調査した。
次に、各種のインジェクションピペットによる卵細胞質膜の伸展性に関する測定結果について述べる。
次に、インジェクションピペット内にオペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精の結果について説明する。
更に、ピエゾICSI法におけるオペレーションリキッドの有無でのインジェクションピペットの形状の違いによる胚盤胞発生の優位性を明確にすべく、PMMを用いたブタ顕微授精を行い、ブタ顕微授精後における胚盤胞発生率の測定を基に インジェクションピペットの評価を行った。
以下にオペレーションリキッドの有無でのインジェクションピペットによるブタ顕微授精の操作手順の概要を説明する。
次に、インジェクションピペットの形状の違いによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における胚盤胞発生率の評価結果について説明する。
図11に、テーパ形状及び先端形状の異なる各種のインジェクションピペットにおけるOLの有無におけるICSI操作に使用した卵子数(図11に示す操作卵子数)及び生存した卵子の数(図11に示す生存卵子数)とその割合(卵子生存率(%))を示す。また、胚発生の欄には、使用した培養胚数及び胚盤胞発生数とその割合(胚盤胞発生率)を示す。
90−10−RD−HR及び90−10−RD−Rは、それぞれのOL有り、OL無しともに、胚盤胞発生率が高くなった。特に、90−10−RD−HRのOL有り、OL無し及び90−10−RD−RのOL無しにおける胚盤胞発生率は、90−10−P−FのOL有り、OL無しの胚盤胞発生率及び75−12−P−FのOL無しの胚盤胞発生率と比較して、顕著に高くなることが確認された。即ち、胚盤胞発生率に対して90−10−RD−HR及び90−10−RD−Rは、OL無しでも効果があることが確認された。
3 主テーパ部
4 主テーパ部の外周面
7 先端テーパ部
9 副テーパ部
10 副テーパ部の外周面
11 副テーパ部の内周面
12 熱収縮部(先端部)
14 円環部
19、21 移行部
25 曲げ部
27 基部(直管部)
30 圧電微小駆動装置(PMM)
35 ピペットホルダ
36 ホルダグリップ
40 スライドベース
41 クランプネジ
45 ドライブユニット
47 鍔部
48 圧電素子(ピエゾ)
49 慣性体
52 空圧式インジェクタ
53 チューブ
54 コントローラ
55 XYZθマニピュレータ
60 卵子
61 透明帯
64 卵細胞質膜
65 卵細胞質
66 第一極体
67 囲卵腔
68 ホールディングピペット
70 精子
75 コンベンショナルピペットの尖端部
CV コンベンショナルピペット
PI インジェクションピペット
F フラットタイプ
R 小さい丸めタイプ
HR 大きい丸めタイプ
do1、do2、do3 インジェクションピペットの外径
di、di1、di2、di3 インジェクションピペットの内径
df1、df2 インジェクションピペットの先端外径
t1、t2 移行部の長さ
Claims (13)
- 哺乳類における卵細胞質内注入法に使用され、かつ、圧電素子の駆動によって当該圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動される先端側の外周面及び内周面がテーパ状に構成された主テーパ部を有するインジェクションピペットであって、
当該インジェクションピペットは、前記主テーパ部よりさらに先端側において、前記インジェクションピペットの内周面のテーパ角度が前記主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を有することを特徴とするインジェクションピペット。 - 前記インジェクションピペットはガラス管であり、前記先端テーパ部は、先端に熱を加えて当該ガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部であることを特徴とする請求項1に記載のインジェクションピペット。
- 前記先端テーパ部は、さらに前記熱収縮部と前記主テーパ部との間において、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面を有し、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面を有する副テーパ部を有することを特徴とする請求項2に記載のインジェクションピペット。
- 前記先端テーパ部は、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面からなり、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面からなることを特徴とする請求項1に記載のインジェクションピペット。
- 前記インジェクションピペットの最先端に位置する卵細胞の透明体又は卵細胞質膜に接する円環部は、前記インジェクションピペットの先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、前記インジェクションピペットの前記円環部から前記外周面及び前記内周面への移行部は面取りがなされていることを特徴とする請求項1乃至請求項4のうち、いずれか1に記載のインジェクションピペット。
- 前記インジェクションピペットは、内部に注入する衝撃伝達液として培養液を利用可能であることを特徴とする請求項1乃至請求項5のうち、いずれか1に記載のインジェクションピペット。
- 前記インジェクションピペットの内部に注入された前記衝撃伝達液の当該インジェクションピペット先端側に隣接してミネラルオイルを吸引し、さらに当該ミネラルオイルの前記インジェクションピペット先端側に隣接して卵細胞質内に注入する液体を吸引して使用することを特徴とする請求項1乃至請求項6のうち、いずれか1に記載のインジェクションピペット。
- 前記インジェクションピペットの内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きいことを特徴とする請求項1乃至請求項7のうち、いずれか1に記載のインジェクションピペット。
- 前記インジェクションピペットの先端の内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きく、かつ、当該精子を前記インジェクションピペットの先端から出し入れするのに最低限必要な所定のクリアランスを前記精子の頭部の直径の値以外に有することを特徴とする請求項1乃至請求項3のうち、いずれか1に記載のインジェクションピペット。
- 前記熱収縮部は前記主テーパ部によりも外径に対する内径の割合が小さいことを特徴とする請求項2又は請求項3に記載のインジェクションピペット。
- 前記インジェクションピペットの前記主テーパ部における外径に対する内径の割合は80%以上100%未満であることを特徴とする請求項1乃至請求項10のうち、いずれか1に記載のインジェクションピペット。
- 前記圧電素子に置換して電歪素子の駆動によって当該電歪素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されることを特徴とする請求項1乃至請求項11のうち、いずれか1に記載のインジェクションピペット。
- 前記卵細胞質内注入法に換えて、核移植における徐核操作又はバイオプシーによる核球採取に使用されることを特徴とする請求項1乃至請求項12のうち、いずれか1に記載のインジェクションピペット。
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