WO2020171038A1 - インジェクションピペット - Google Patents

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WO2020171038A1
WO2020171038A1 PCT/JP2020/006168 JP2020006168W WO2020171038A1 WO 2020171038 A1 WO2020171038 A1 WO 2020171038A1 JP 2020006168 W JP2020006168 W JP 2020006168W WO 2020171038 A1 WO2020171038 A1 WO 2020171038A1
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WO
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injection pipette
injection
tip
pipette
peripheral surface
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/006168
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English (en)
French (fr)
Inventor
正樹 岩元
径子 高山
Original Assignee
プライムテック株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by プライムテック株式会社 filed Critical プライムテック株式会社
Publication of WO2020171038A1 publication Critical patent/WO2020171038A1/ja

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B25—HAND TOOLS; PORTABLE POWER-DRIVEN TOOLS; MANIPULATORS
    • B25J—MANIPULATORS; CHAMBERS PROVIDED WITH MANIPULATION DEVICES
    • B25J7/00—Micromanipulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/32—Micromanipulators structurally combined with microscopes

Definitions

  • the present invention relates to an injection pipette that punctures eggs, cells, etc., and particularly to an injection pipette that is used in the intracytoplasmic injection method and that is minutely driven by driving a piezoelectric element.
  • Micromanipulators are used that apply physical and mechanical operations to cells, nuclei, fertilized embryos, etc. that can be observed with an optical microscope. Micromanipulators are indispensable for artificial manipulation of cells and the like.
  • the micromanipulator is equipped with a microdevice (micropipette) and a micromovement device that moves the micropipette in a linear direction.
  • the micropipette is also called an injection pipette.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining a conventional method of a micropipette in the intracytoplasmic injection method.
  • a micropipette hereinafter, referred to as “conventional pipette CV”
  • conventional pipette CV a micropipette having a sharp tip on the ruptured membrane of the egg 60 fixed to the holding pipette 68
  • the sperm 70 is sucked inside the conventional pipette CV.
  • tip portion 75 (FIG. 13A) of the conventional pipette is sharply spiked, it is indicated by an arrow without sufficiently extending the egg cytoplasmic membrane 64 as shown in FIG. 13C. Stress is applied to the location, increasing the rate of membrane rupture.
  • piezoelectric micro-driving device piezoelectric micromanipulator (also referred to as "PMM") which pierces an egg with a micropipette having a flat tip using a piezoelectric element instead of the conventional method.
  • PMM piezoelectric micromanipulator
  • Patent Document 1 discloses a piezoelectric micro-driving device.
  • a piezoelectric micro-driving device includes a micro pipette micro instrument which is supported by a holding member with an appropriate frictional force through an abutting member, a collar portion formed on the micro instrument, and the collar portion.
  • a piezoelectric element that is provided in the piezoelectric device and is arranged concentrically with the microdevice, and an inertial body that is attached to the piezoelectric device and that applies an impact force to the microdevice by driving the piezoelectric device. It is disclosed that an impact force by an inertial body is generated by driving of the, and this is used to puncture an egg.
  • Patent Documents 2 to 4 it is disclosed that a piezoelectric element is driven to generate an impact force by an inertial body, and this is used to puncture an egg.
  • the piezoelectric micro-driving device in the so-called piezo ICSI method is provided with the inertial body fixed to the rear end of the piezoelectric element as described in the prior art document.
  • FIG. 14 is a diagram for explaining the piezo ICSI method of a micropipette in the intracytoplasmic injection method.
  • the first polar body 66 of the egg 60 to be injected is held by the holding pipette 68 at the 6 o'clock or 12 o'clock position, and when the egg 60 is punctured, it is directly below the polar body. Do not damage the egg nucleus of.
  • the tip of the injection pipette PI is lightly pressed against the transparent band 61.
  • the sperm 70 is positioned inside the injection pipette PI, which is slightly away from the tip of the injection pipette PI.
  • the piezoelectric element piezo
  • the injection pipette PI sticks into the transparent strip 61, and pushes the injection pipette PI to the final layer. Stop the piezoelectric element, leaving the last layer, and push open manually.
  • the drive setting of the piezoelectric element is performed with respect to the number of vibrations of the piezoelectric element and the magnitude of the vibration intensity. Further, the driving setting of the piezoelectric element is changed according to the puncture status of the transparent band 61 or the like.
  • the fragment of the transparent band 61 is contained in the injection pipette PI, it is discharged outside the egg 60 or into the perivitelline cavity 67.
  • the sperm 70 is moved to the tip of the injection pipette PI, and the tip of the injection pipette PI is pressed against the egg cytoplasmic membrane 64 to extend the egg cytoplasmic membrane 64. Advance the needle tip from the half of the egg cytoplasm 65 to the 2/3 position.
  • the egg cytoplasmic membrane 64 expands and deforms as shown in FIG. 14(c).
  • the piezoelectric element 48 is driven at a position 1 ⁇ 2 to 2 ⁇ 3 of the egg cytoplasm 65. That is, when the egg cytoplasmic membrane 64 is punctured in the microinsemination operation using the piezoelectric micro-driving device, the tip of the injection pipette PI is moved so as to be in contact with and pushed by the egg cytoplasmic membrane 64 to sufficiently extend the egg cytoplasmic membrane 64. After that, the piezoelectric element of the piezoelectric micro-driving device is activated to break the membrane, and the sperm 70 is injected into the egg 60 to complete the operation.
  • the egg cytoplasmic membrane 64 After puncturing (rupture) the egg cytoplasmic membrane 64, inject sperm 70 so as not to inject the culture solution as much as possible. At this time, as shown in FIG. 14(d), the egg cytoplasm 65 moves in the direction indicated by the arrow so as to restore the original state.
  • sperm 70 is injected without operating the piezoelectric micro-driving device. To do so. After injecting the sperm 70, the injection pipette or the like is slowly pulled out. This completes the microinjection operation into the egg cytoplasm of pigs.
  • the setting of the injection pipette for sperm injection is performed by setting a micropipetter which is a filler in which the operation liquid (Florinert) is previously sucked before being attached to the pipette holder 35 (shown in FIG. 3).
  • the operation liquid (Fluorinert) is filled in the vicinity of the center of the injection pipette with a width of about 1 to 1.5 cm.
  • the filling device is not limited to the micropipettor, and may be any device that can fill the operation liquid in the injection pipette.
  • This operation liquid (Florinert) into the injection pipette is performed in order to efficiently transmit the impact force from the piezoelectric element to the tip of the injection pipette, and it acts as an impact transmission liquid.
  • a piezoelectric micro-driving device is used when puncturing an egg, and an injection pipette normally punctures an egg by an impact force from an inertial body driven by a piezoelectric element.
  • minute driving at the time other positioning operations can be performed by other manipulators.
  • Japanese Patent Examination 6-98582 Japanese Patent Examination 6-48975 Japanese Patent Examination 6-98583 Japanese Patent Examination 7-73830
  • the operation liquid (Fluorinert) that has been sucked in advance is used.
  • Operation Liquid (Fluorinert) With a width of about 1 to 1.5 cm.
  • the present invention is an injection pipette that is used for intracytoplasmic injection method in mammals and is finely driven by impact force by an inertial body connected to the piezoelectric element by driving the piezoelectric element, which is the center of the injection pipette. It is not necessary to fill the operation liquid (Florinert) in the vicinity, and by using the existing components, it is possible to realize efficient driving of the PMM, further improving the operability, and before driving the piezoelectric element.
  • an injection pipette according to the present invention is used in an intracytoplasmic injection method in mammals, and a tip that is finely driven by an impact force by an inertial body connected to the piezoelectric element by driving the piezoelectric element.
  • An outer peripheral surface and an inner peripheral surface on the side, the injection pipette having a main taper portion formed in a taper shape, wherein the injection pipette is a taper of an inner peripheral surface of the injection pipette at a tip side further than the main taper portion. It is characterized in that it has a tip taper portion whose angle is larger than the taper angle of the main taper portion.
  • the injection pipette according to the present invention is a glass tube
  • the tip tapered portion is a heat shrinking portion formed by applying heat to a tip to shrink the glass tube.
  • the tip tapered portion of the injection pipette according to the present invention further has an outer peripheral surface having a taper angle larger than a taper angle of an outer peripheral surface of the main tapered portion between the heat shrinking portion and the main tapered portion. And a sub taper portion having an inner peripheral surface larger than the taper angle of the inner peripheral surface of the main taper portion.
  • the tip taper portion of the injection pipette comprises an outer peripheral surface having a taper angle larger than a taper angle of an outer peripheral surface of the main taper portion, and a taper angle of an inner peripheral surface of the main taper portion. It is characterized by having a larger inner peripheral surface.
  • annular portion in contact with the transparent body or egg cytoplasmic membrane of the egg cell located at the extreme end of the injection pipette according to the present invention is formed in a direction orthogonal to the axial direction of the tip side of the injection pipette. Further, the transition portion from the annular portion of the injection pipette to the outer peripheral surface and the inner peripheral surface is chamfered.
  • the injection pipette according to the present invention is characterized in that a culture solution can be used as an impact transfer solution to be injected into the inside.
  • a mineral oil is sucked adjacent to the injection pipette tip side of the impact transmission liquid injected into the injection pipette according to the present invention, and an egg is further adjacent to the injection pipette tip side of the mineral oil. It is characterized in that the liquid to be injected into the cytoplasm is sucked and used.
  • the inner diameter of the injection pipette according to the present invention is characterized in that it is larger than the maximum diameter of the head of sperm to be injected into the cytoplasm.
  • the inner diameter of the tip of the injection pipette according to the present invention is larger than the maximum diameter of the head of spermatozoa to be injected into the egg cytoplasm, and the minimum for inserting and removing the sperm from the tip of the injection pipette. It is characterized by having a necessary predetermined clearance other than the value of the diameter of the sperm head.
  • the heat contraction portion of the injection pipette according to the present invention is characterized in that the ratio of the inner diameter to the outer diameter is smaller than that of the main taper portion.
  • the ratio of the inner diameter to the outer diameter of the main tapered portion of the injection pipette according to the present invention is 80% or more and less than 100%.
  • the injection pipette according to the present invention is characterized in that it is finely driven by an impact force of an inertial body connected to the electrostrictive element by driving the electrostrictive element in place of the piezoelectric element.
  • injection pipette according to the present invention is characterized by being used for a slow nuclear operation in nuclear transfer or a nuclear collection by biopsy, in place of the intracytoplasmic injection method.
  • the intracytoplasmic injection method as for the work in a very small area called the intracytoplasmic injection method, although the principle is unknown in many parts, the inventor has found that as a result of trial and error, the following effects can be obtained. It is a thing.
  • the tip taper portion having the taper angle of the inner peripheral surface larger than the taper angle of the main taper portion is provided further on the tip side than the main taper portion.
  • the inner peripheral surface is reduced in diameter toward the tip, so that the flow of the culture solution or the like in the injection pipette can be adjusted and the operability of the injector is improved.
  • the tip tapered part of the injection pipette has a heat shrinking part formed by applying heat to the tip to shrink the glass tube, and the heat shrinking part has a rounded curved surface with a narrow inner diameter. Therefore, it becomes possible to finely adjust suction and discharge of the culture solution and the like by the injector, and the operability of the injector of the micromanipulator in the piezo ICSI method is improved.
  • the injection pipette according to the present invention is configured such that the circular ring portion located at the leading end is formed in a direction orthogonal to the axial direction of the tip side of the injection pipette, and the circular pipe portion of the injection pipette is connected to the outer peripheral surface and the inner peripheral surface.
  • the injection pipette according to the present invention uses the culture solution, which is a constituent element of the present invention, as an impact transfer liquid, and thus does not require an operational liquid such as Fluorinert to prepare an egg cytoplasm by a piezo ICSI method similar to the conventional one. Injectable inside.
  • the injection pipette of the present invention it is not necessary to inject the operation liquid into the injection pipette, and the injection process in the egg cytoplasm can be simplified.
  • the injection pipette according to the present invention has a reliable puncture performance when operating an egg/embryo by PMM. That is, the conventional method may cause variations in puncture due to the shape of the pipette, the quality of the ovum, and the skill of the operator, but the injection pipette according to the present invention has a stable puncture performance to sufficiently extend the membrane. It is possible to perform a similar puncture every time.
  • the injection pipette according to the present invention is particularly effective for injecting DNA and RNA, which are important for puncturing and injector operability, and for injecting ES cells into blastocysts. Further, in addition to these methods, it can be effectively used for enucleation operation in nuclear transfer and collection of neutrophils by biopsy in place of the intracytoplasmic injection method.
  • FIG. 1C is an enlarged cross-sectional view showing the configuration of the tip tapered portion of a region A in the broken line circle shown in FIG. 1B. It is the expanded sectional view which shows the shape of the side surface of the tip and the size of each part in the heat contraction part of the injection pipette used for ICSI operation, (a) is the shape which made the tip flat, (b) rounded the tip small.
  • the shape of the heat-shrinkable portion (c) shows the shape of the heat-shrinkable portion with its tip largely rounded.
  • the present invention relates to an injection pipette which is used for intracytoplasmic injection method (ICSI) in mammals and which is finely driven by an impact force of an inertial body connected to a piezoelectric element by driving the piezoelectric element,
  • the injection pipette according to the present invention has a tip taper portion where the taper angle of the inner peripheral surface of the injection pipette is larger than the taper angle of the main taper portion on the tip side further than the main taper portion, so that the injection pipette can be internally
  • the inventors have found by trial and error that the culture medium to be injected can be used as a shock transfer fluid.
  • FIG. 1 is a view showing the appearance and configuration of an injection pipette according to the present invention.
  • FIG. 1(a) is a view showing the entire injection pipette
  • FIG. 1(b) is a main taper portion and a main taper portion of the injection pipette.
  • FIG. 1C is an enlarged cross-sectional view showing the outer shape of the tip taper portion located on the tip end side
  • FIG. 1C is a configuration of the tip taper portion in a region A within a broken line circle shown in FIG. 1B.
  • the present invention is an improvement of the shape and operation method of the injection pipette PI of the piezo ICSI method of the micropipette in the intracytoplasmic injection method described in FIG. 12, and the same contents as those in FIG. To explain.
  • the injection pipette 1 is made of a glass tube and has a main tapered portion 3 formed in a tapered shape, a tip tapered portion 7 located on the tip side of the main tapered portion 3, and an opening. And a straight tubular base portion 27 attached to a pipette holder 35 (shown in FIG. 3) and having a predetermined length and a constant outer diameter. ing.
  • the boundary between the tip tapered portion 7 and the base portion 27 is indicated by a broken line.
  • the main taper portion 3 of the injection pipette 1 has a length of, for example, about 15 mm from the tip of the injection pipette 1 and is formed in a taper shape whose diameter decreases toward the tip. And has a taper angle ⁇ 1.
  • a tip taper portion 7 is provided further on the tip side than the main taper portion 3.
  • the tip taper portion 7 located on the tip side of the main taper portion 3 has a taper angle ⁇ 2. Further, the tip tapered portion 7 has a heat shrinking portion 12 whose tip is shrink-treated by heat.
  • FIG. 1B the boundary between the main taper portion 3 and the tip taper portion 7 is indicated by a broken line.
  • the taper angle ( ⁇ 2 shown in FIG. 1B) at the tip taper portion 7 located on the tip side of the main taper portion 3 is the taper angle of the main taper portion 3 (see FIG. It is larger than ⁇ 1) shown in b).
  • the outer peripheral surface 10 having a taper angle ⁇ 2 larger than the taper angle ⁇ 1 of the outer peripheral surface 4 of the main taper portion 3 between the heat shrinking portion 12 and the main taper portion 3.
  • the taper angle (not shown) is larger than the taper angle (not shown) of the inner peripheral surface (not shown) of the main taper portion 3 (shown in FIG. 1C).
  • the sub taper portion 9 has a length of, for example, about 0.25 mm from the tip of the injection pipette 1.
  • the tip taper portion 7 includes the heat shrinking portion 12 and the sub taper portion 9, and the sub taper portion 9 includes the outer peripheral surface 10 having a taper angle ⁇ 2 larger than the taper angle ⁇ 1 of the outer peripheral surface of the main taper portion 3.
  • the inner peripheral surface 11 (shown in FIG. 1C) is larger than the taper angle (not shown) of the inner peripheral surface of the main tapered portion 3.
  • the injection pipette 1 having the tapered tip portion 7 is referred to as a radish type (referred to as RD).
  • the injection pipette 1 Is composed of only the main taper portion 3.
  • the injection pipette 1 composed only of the main taper portion 3 will be referred to as a parallel type (denoted as P). Even in the parallel type, the heat shrinking portion 12 may be formed.
  • the heat contraction section 12 of the injection pipette 1 shown in FIG. 1(c) is a glass tube contracted by applying heat to the tip of the injection pipette 1 by a fire polish. By applying heat to the tip, the surface is melted, and an annular portion 14 having a chamfered periphery is formed at the tip of the heat shrinking portion 12.
  • the annular portion 14 is formed in a direction orthogonal to the axial direction on the tip side of the injection pipette 1, and the end surface of the transition portion 19 of the injection pipette 11 from the annular portion 14 to the outer peripheral surface 9 is It is chamfered.
  • the end face of the transition portion 21 from the annular portion 14 at the tip to the inner peripheral surface 11 is chamfered.
  • FIG. 1C the top portion sandwiched between the transition portion 19 and the transition portion 21 becomes the annular portion 14.
  • the annular portion 14 contacts the translucent body of the egg cell or the egg cytoplasmic membrane during intracytoplasmic injection, prevents the rise of internal pressure to the egg cytoplasm, and sufficiently extends the egg cytoplasmic membrane. It turned out as a result of trial and error by the person.
  • the inner diameter of the injection pipette 1 shown in FIG. 1(c) is larger than the maximum diameter of the sperm head injected into the egg cytoplasm 65 (shown in FIG. 12).
  • the diameter of the pig sperm head is about 3.5 micrometers ( ⁇ m)
  • the inner diameter of the injection pipette 1 used for pigs also referred to as pigs
  • a clearance other than the maximum diameter of the sperm head is required.
  • the minimum required inner diameter of the injection pipette 1 for pigs is about 6 ⁇ m, Since the clearance required depends on the experience of the person who operates the pipette 1 and the operating characteristics, the maximum value is about 9 ⁇ m.
  • the diameter of the head of human sperm is still around 3.5 micrometers ( ⁇ m), and since it is not sticky like pigs, it is not necessary to set a large clearance, and human (also referred to as human)
  • human also referred to as human
  • the minimum value of the minimum required inner diameter of the injection pipette 1 used in (1) is about 3.5 ⁇ m or more.
  • the injection pipette 1 maintains the clearance with respect to the inner diameter of the injection pipette 1 with respect to the diameter of the sperm head to more than 0% and not more than 65%, the inside of the injection pipette 1 is It can be taken in and out, and the inner diameter of the injection pipette 1 is set in consideration of the diameter of the mammalian sperm head and the clearance other than this diameter (inner diameter-maximum diameter of sperm head).
  • the inner diameter of the injection pipette 1 depends on the characteristics of sperm depending on the animal species (adhesion due to acrosome reaction of sperm, shape of sperm head such as hook like mouse sperm head). It is necessary to have a size larger than the maximum diameter of the head. Further, the clearance required varies depending on the experience of the person who operates the injection pipette 1 and the operating characteristics. Therefore, the maximum clearance of the inner diameter of the injection pipette 1 is 65% of the inner diameter. On the other hand, since the inner diameter of the injection pipette 1 may be approximately the same as the maximum diameter of the sperm head in some cases, the clearance of the inner diameter of the injection pipette 1 is at least 0 with respect to the inner diameter. % (A value slightly exceeding the maximum diameter of the sperm head).
  • the bending portion 25 provided at a predetermined distance from the opened tip has a bending position provided at a distance of, for example, 1 to 5 mm from the tip of the injection pipette 1.
  • the bending angle of the portion 25 is, for example, 20 degrees.
  • the bending angle is that when the bending angle from the base portion 27 forming the base of the injection pipette 1 is 0 degree, the entire injection pipette 1 is formed straight.
  • the injection pipette 1 is not limited to one having a bending angle, and a straight pipette may be used.
  • the base portion 27 attached to the pipette holder 35 has, for example, a length of about 50 mm, and has an internal space communicating with the heat shrinking portion 12 located at the tip.
  • One end of the straight tubular base portion 27 is connected to the main tapered portion 3, and the other end is fixed to the pipette holder 35.
  • FIG. 2 is an enlarged cross-sectional view showing the shape of the side surface of the tip and the size of each part in the heat-shrinkable portion of the injection pipette used for the ICSI operation for pigs
  • FIG. FIG. 2B shows the shape of the heat-shrinkable portion with the tip rounded small
  • FIG. 2C shows the shape of the heat-shrinkable portion with the tip largely rounded.
  • the outer diameter do1 of the injection pipette 1 having a flat tip shown in FIG. 2(a) is 10 ⁇ m (micron meter), and the inner diameter di1 is 9 ⁇ m.
  • An injection pipette with a flat tip will be referred to as a flat F.
  • the outer diameter do1 of the injection pipette with a flat tip is also referred to as the tip outer diameter.
  • Fig. 2(b) shows a glass tube having an outer diameter do2 of 11 ⁇ m, which is rounded by fire polishing so that the outer diameter df1 is 10 ⁇ m and the inner diameter di2 is 8 ⁇ m.
  • Transition section 19 19.
  • the injection pipette 1 having the heat-shrinkable portion 12 whose tip is rounded down is referred to as a less rounded type R.
  • the tip of a glass tube having an outer diameter do3 of 12 ⁇ m is fire-polished, and the tip is largely rounded so that the tip has an outer diameter df2 of 10 ⁇ m and an inner diameter di3 of 6.8 ⁇ m. ..
  • the transition unit 19 From the annular portion 14 of the heat-shrinkable portion 12 located at the extreme end of the injection pipette 1 to the outer peripheral surface of the sub-tapered portion 9 corresponding to 35 to 40 ⁇ m (t2 shown in FIG. 2C) in the axial direction, The transition unit 19.
  • the injection pipette 1 having the heat-shrinkable portion 12 whose tip is largely rounded is referred to as a large round type HR.
  • the thickness of the glass tube of the heat-shrinkable portion 12 at the tip is increased.
  • the dimensions of the injection pipette described above are examples, and the dimensions are not limited thereto.
  • the material is a glass tube, and the outer diameter is 1 mm, the glass tube wall thickness is about 50 ⁇ m, that is, the ratio of the inner diameter to the outer diameter of the glass tube is 90% (hereinafter, A glass tube having a wall thickness of about 75 ⁇ m (hereinafter referred to as “85 tube”) and a glass tube having a wall thickness of about 125 ⁇ m (hereinafter referred to as “75 tube”) are used.
  • the glass tube is set in the glass tube stretching machine, and the glass tube is stretched thinly by the program that matches the desired shape.
  • the glass tube processing machine heats a glass ball on a platinum wire attached to a heater to perform various kinds of processing.
  • a glass tube processing machine is used to quickly bond a heated glass ball to a portion having a predetermined thickness of the glass tube to break the glass tube.
  • the position of the heated glass beads of the glass tube processing machine is adjusted so that the broken glass tube has a length of 1 mm or more from the tip, and is bent at a predetermined angle if necessary.
  • the heat-shrinkable portion 12 is formed by applying heat to the tip of the injection pipette to melt the surface.
  • a transition portion 19 that is a transition portion from the outer peripheral surface 10 of the injection pipette 1 to the annular portion 14 and a transition portion 21 that is a transition portion from the annular portion 14 to the inner peripheral surface 11 are formed by the fire polish. It The tip shape shown in FIGS. 2B and 2C can be obtained by adjusting the heating time of the fire polish and the like.
  • FIG. 3 is a block diagram showing the configuration of the piezoelectric micro-driving device to which the injection pipette 1 is connected.
  • the piezoelectric micro-driving device 30 has a built-in pipette holder 35 to which the injection pipette 1 is attached, a slide base 40 which is a device for attaching the piezoelectric micro-driving device 30 to an XYZ ⁇ manipulator 55 of a microscope, and a piezoelectric element 48. And a drive unit 45.
  • the pipette holder 35 is provided with a holder grip 36 to which the injection pipette 1 is attached and fixed at the tip.
  • An O (O) ring is provided inside the holder grip 36, and the end of the straight pipe-shaped base portion 27 of the injection pipette 1 is inserted into the pipette holder 35 and tightened with the O (O) ring to inject the injection pipette 1. To fix.
  • the injection pipette 1 of the present invention is used without an operation liquid, but it is also possible to fill the operation liquid in the injection pipette 1 and use it as in the conventional case.
  • a drive unit 45 is attached between the holder grip 36 of the pipette holder 35 and the slide base 40.
  • the pipette holder 35 is fixed to the slide base 40 by the clamp screw 41 provided on the slide base 40.
  • the slide base 40 has a connecting portion (not shown) for connecting to an XYZ ⁇ manipulator 55 provided in the microscope. By connecting the connection part of the slide base 40 and the XYZ ⁇ manipulator 55 of the microscope, the tip of the injection pipette 1 moves in conjunction with the movement of the XYZ ⁇ manipulator 55.
  • the piezoelectric micro-driving device 30 is used when puncturing an egg, and the injection pipette 1 drives the egg by an impact force from an inertial body driven by the piezoelectric element.
  • minute driving at the time of puncturing other positioning operations can be performed by the movement of the XYZ ⁇ manipulator 55.
  • the piezoelectric micro-driving device 30 to which the injection pipette 1 is connected is connected to the XYZ ⁇ manipulator 55 of the microscope via the slide base 40.
  • the connection between the piezoelectric micro-driving device and the XYZ ⁇ manipulator 55 of the microscope is not limited to the use of the slide base 40, and other connections may be used.
  • the drive unit 45 which is located between the holder grip 36 of the pipette holder 35 and the slide base 40, incorporates an inertial body 49 connected to one main surface (vibrating surface) of the piezoelectric element 48, and the other of the piezoelectric elements 48. It is fixed to the pipe of the pipette holder 35 via a collar portion 47 having the main surfaces thereof joined together. Since the drive unit 45 is located between the holder grip 36 of the pipette holder 35 and the slide base 40, the force can be efficiently transmitted to the tip of the injection pipette 1.
  • the slide base 40 may be attached between the holder grip 36 of the pipette holder 35 and the drive unit 45.
  • the piezoelectric micro-driving device 30 includes a controller 54 that controls the piezoelectric element 48, a display panel (not shown) that is connected to the controller 54 and sets the driving condition of the piezoelectric element 48, and a switch that drives the piezoelectric element 48 ( And (not shown).
  • the controller 54 uses, for example, the speed that is the frequency applied to the piezoelectric element 48 (denoted as Speed in the drawing) and the intensity that is the magnitude of the vibration applied to the piezoelectric element 48 (denoted as Intensity in the drawing). Control element 48.
  • the controller 54 can set the speed to 1 to 16 and the intensity to 1 to 16, and the minimum value of the output is 1 and the maximum value is 16. The output to the piezoelectric element 48 with respect to the set value of the controller 54 changes linearly.
  • the injection pipette 1 is finely driven by the impact force of the inertial body 49 connected to the piezoelectric element 48 when the piezoelectric element 48 is driven. Since the details of the impact force generated in the injection pipette 1 by the inertial body 49 due to the driving of the piezoelectric element 48 are known and disclosed in Japanese Patent Publication No. 6-98582 and the like of Patent Document 1, description thereof will be omitted. Even if the piezoelectric element 48 is an electrostrictive element, the injection pipette 1 can be finely driven by the impact force of the inertial body 49 in the same manner.
  • a pneumatic injector 52 is connected via a tube 53 to the end of the pipette holder 35 opposite to the holder grip 36.
  • the air supplied from the pneumatic injector 52 flows through the drive unit 45 and the pipette holder 35 and is supplied to the other end of the injection pipette 1.
  • the pneumatic injector 52 only connects the tube 53 to the drive unit 45, and the suction and discharge can be finely adjusted. Therefore, a pneumatic injector is preferable as the injector.
  • a hydraulic injector may be used as the injector instead of the pneumatic injector.
  • the injection pipette 1 has the main taper portion on the tip side, and the taper angle of the inner peripheral surface is larger than the taper angle of the main taper portion on the tip side of the main taper portion.
  • the inner peripheral surface is reduced in diameter toward the tip, so that the flow of the culture solution or the like in the injection pipette can be adjusted and the operability of the injector is improved.
  • the tip tapered portion of the injection pipette 1 has a heat shrinking portion formed by applying heat to the tip to shrink the glass tube, and the heat shrinking portion has a rounded curved surface with an inner diameter of the tip. Since it becomes narrower, it becomes possible to finely adjust suction and discharge of the culture solution and the like by the injector, and the operability of the injector of the micromanipulator in the piezo ICSI method is improved.
  • FIG. 4 is a diagram showing a measurement and evaluation flow of punctureability and operability of a porcine egg transparent body by the injection pipette according to the present invention.
  • the intracytoplasmic injection method uses a piezoelectric micro-driving device 30 using a piezoelectric element 48 (piezo), and the piezoelectric micro-driving device 30 is attached to an XYZ ⁇ manipulator 55 provided in the microscope.
  • the injection pipette 1 is attached to the PMM (step S1).
  • the injection pipette 1 is a 90 tube, a radish type RD having a tip outer diameter of 5 ⁇ m, a tip tapered portion 7 on the tip side of the main tapered portion 3, and a rounded type R having a small tip shape. It is called -5-RD-R.
  • a holder grip 36 that connects the injection pipette 1 and the pipette holder 35 is provided at the tip of the piezoelectric micro-driving device 30.
  • the holder grip 36 of the pipette holder 35 attached to the piezoelectric micro actuator 30 is loosened to attach the injection pipette 1.
  • the 85-6-PF injection pipette 1 attached to the PMM is rinsed with a 7% PVP (polyvinylpyrrolidone) solution, and after the rinse, the PVP solution is discharged (step S2).
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • step S4 mineral oil is sucked into the tip of the injection pipette 1 (step S4).
  • the sucked mineral oil has the shape of an oil ball as an index indicating the boundary of different liquids.
  • the PVP liquid is sucked from the tip of the injection pipette 1 to the position of 1 mm of the bent portion 25 of the injection pipette 1 (step S5).
  • the puncture is measured on the porcine egg transparent body (step S6).
  • the first polar body 66 (see FIG. 12(a)) of the egg 60 to be initially injected is held by the holding pipette 68 at the 6 o'clock or 12 o'clock position.
  • the controller 54 sets the number of vibrations of the piezoelectric element 48 and the drive setting of the magnitude of vibration.
  • the speed which is the number of vibrations of the piezoelectric element 48, is set to 2.
  • the piezoelectric element (piezo) 48 is driven, and it is confirmed that the injection pipette 1 pierces the transparent strip 61 and a hole is opened in the transparent strip 61. Measure the intensity value when a hole is made in the.
  • the state where the PVP liquid is sucked into the tip of the injection pipette 1 is referred to as PVP+.
  • step S7 the operability of the injector with the tip of the injection pipette 1 lightly pressed against the transparent band 61 is confirmed, and the operability of the injector is evaluated on a scale of 1 to 5 (step S7).
  • the five-level evaluation shows that with respect to 5, the operation of sucking sperm or the like into the injection pipette 1 or discharging it to the outside of the pipette can be performed without any problems.
  • 4 indicates that the operation requires some attention.
  • 3 shows that the operation such as puncturing operation is possible, though the operation is required while paying attention as compared with 4 and 5.
  • the numbers 2 and 1 indicate the levels at which it is difficult to control the puncture operation and the like and cannot be operated.
  • the PVP liquid is discharged from the injection pipette 1 using the oil ball as an index, and the tip is replaced with the culture liquid (PZM) (step S8).
  • the state in which the PVP solution was discharged and the tip was replaced with the culture solution (PZM) is referred to as PVP-.
  • step S9 the puncture is measured by the same operation as in step S6 (step S9).
  • step S7 The operability of the injector is confirmed by the same operation as in step S7, and the evaluation is performed in five levels (step S10).
  • step S3 move to step S3 and suck 7 mm of PZM from the tip. Similarly, the measurement of the puncture property is repeated from step S3 so that the PZM is sucked by 10, 12, 13, 15 mm from the tip (step S11).
  • the speed which is the number of vibrations of the piezoelectric element 48, is set to 5, and the same experimental evaluation is performed from step S3.
  • FIG. 5 is a graph showing the measurement results of the PMM puncture property due to the difference in the amount of culture solution sucked into the injection pipette 1
  • FIG. , (B) are measurement results of the intensity value of the puncturable controller at the controller speed of 5.
  • the horizontal axis of the graph showing the measurement result of the puncture property of the PMM shown in FIG. 5 shows each distance (width) from the tip of the injection pipette 1 of the amount of the aspirated culture solution, and the vertical axis of the graph shows the intensity of the controller. Indicates the numerical value of.
  • Intensity value is 16.0, when the amount of culture solution is aspirated in the width of 7 mm, Intensity value is 15.0, when the amount of culture solution is aspirated in the width of 10 mm Intensity value is 11.0, when the amount of culture solution is aspirated in a width of 12 mm, Intensity value is 6.5, and when the amount of culture solution is aspirated in a width of 13 mm, Intensity value is 5.5, when the amount of the culture solution was aspirated in a width of 15 mm, the porcine egg could be punctured with the Intensity value set to 5.0.
  • the PVP solution in front of the oil ball in the injection pipette of 85-6-PF is discharged to be a culture solution (PZM).
  • PZM culture solution
  • the intensity value was 14.0 and the amount of culture solution was aspirated with a width of 7 mm.
  • the Intensity value is 7.0 and the amount of culture solution is aspirated in a width of 10 mm, the Intensity value is 4.0, and if the amount of culture solution is aspirated in a width of 12 mm, the Intensity value is Is 2.5, the Intensity value is 2.0 when the amount of the culture solution is aspirated in the width of 13 mm, and the Intensity value is 1.5 when the amount of the culture solution is aspirated in the width of 15 mm. I was able to puncture a pig egg.
  • the injection pipette of 85-6-PF has a speed value of 5 and the culture solution from the tip of the injection pipette
  • the Intensity value is 14.0
  • Intensity value is 12.0
  • the amount of culture solution is in a width of 10 mm.
  • the Intensity value When aspirated, the Intensity value is 9.0, when the amount of culture solution is aspirated in the width of 12 mm, Intensity value is 6.0, when the amount of culture solution is aspirated in the width of 13 mm, When the Intensity value was 5.0 and the amount of the culture solution was aspirated in a width of 15 mm, the porcine egg could be punctured with the Intensity value set to 4.5.
  • the PVP solution in front of the oil ball in the injection pipette of 85-6-PF is discharged to be a culture solution (PZM).
  • PZM culture solution
  • the speed value is set to 5
  • the amount of culture solution from the tip of the injection pipette is aspirated in a width of 5 mm
  • Intensity value is 12.0
  • the amount of culture solution is aspirated in a width of 7 mm
  • Intensity value is 6.0
  • Intensity value is 3.0
  • the amount of culture solution is aspirated in a width of 12 mm Intensity value is 2.0
  • the Intensity value is 1.5
  • the Intensity value is 1.5.
  • the Intensity value is 1.5.
  • a puncture was made into a pig egg.
  • the measurement results of PVP+ of the injection pipette 90-5-RD-R are 90-5-RD-R/PVP+, and the measurement results of PVP ⁇ are 90-5. It is shown by -RD-R/PVP-.
  • the 85-6-PF mounted without the operation liquid shows that the Intensity value of the controller 54 when the suction amount of the culture solution from the tip of the injection pipette is less than 12 mm.
  • the puncture property was extremely low.
  • the puncture property was slightly improved when the PVP liquid was contained by suctioning the culture liquid with a suction amount of 12 mm or more.
  • the 90-5-RD-R installed without the operation liquid had improved puncture properties when the suction volume of the culture solution was 7 mm or more, and the puncture properties were stable even when the PVP solution was included.
  • the difference between the two types of injection pipettes tested is that the thickness of the glass tube, the shape of the tapered portion and the tip shape are different, but the tapered portion Radish type RD injection pipette 90-5-RD-R has no operation liquid.
  • the puncture property at is extremely stable.
  • 85-6-PF has a tapered tapered shape, so that the actual volume of the culture medium is small even though the width of the culture medium being sucked from the tip is the same as 90-5-RD-R. Therefore, it was found from the experimental results that the puncture property was low.
  • both 90-5-RD-R and 85-6-PF injection pipettes can obtain puncture property by aspirating a large amount of culture solution, but the intensity in the condition that PVP solution is contained. Considering the stability such as low value of 90 and the labor required for setting the time for sucking the culture solution, 90-5-RD-R is much more practical.
  • the operability of the injector means the operability of delicate operations such as suction and discharge of the culture solution into the injection pipette by the injector.
  • FIG. 6 is a diagram showing the evaluation results of the operability of the pneumatic injector due to the difference in the amount of culture fluid sucked into the injection pipette.
  • 90-5-RD-R is superior to 85-6-PF in terms of puncture ability against porcine ovum transparent body and injector operability. That is, an injection pipette having 90 tubes, a radish type RD having a tapered tip portion and a rounded type R having a small tip shape is suitable.
  • the culture solution is the same as the conventional operation liquid. It was confirmed that if the same amount (amount corresponding to 10 to 15 mm in the injection pipette) is used, by combining with the shape of the injection pipette 1 according to the present invention, the puncture effect is exhibited without operation liquid.
  • the injection pipette 1 according to the present invention has almost no influence on the puncture performance due to the difference in the culture medium, although the type of the culture medium differs depending on the mammal species. Confirmed not to give.
  • test section C1 a small amount of oil balls (also referred to as small oil balls) was sucked at the tip of the injection pipette 1 of 90-5-RD-R, and a large amount of culture solution was sucked after sucking the small oil balls.
  • the small oil ball is held at the bending position of the injection pipette.
  • the bend position portion is about 1 mm from the tip of the injection pipette and is shown below and in FIG. 7 as “rearward”.
  • the puncture operation was performed not only in the rear position of the small oil ball in the injection pipette but also in the vicinity of the tip of the injection pipette.
  • the vicinity of the tip of the injection pipette is about 500 ⁇ m from the tip of the injection pipette, and is shown below and in FIG. 7 as “front”.
  • the test section T2 is a state in which the amount of oil balls is increased to 10 times that of the test section C1 and the oil balls in the injection pipette are positioned in the front and rear.
  • the test section T3 is a state where a large amount of PVP liquid is sucked into the injection pipette instead of the culture liquid. As described above, the test section T3 is a state in which a large amount of the PVP solution is sucked in place of the large amount of the culture solution of the test section C1.
  • test section T4 is a state in which each amount of the culture solution to be aspirated, each liquid amount of the oil ball, and the oil ball in the injection pipette are located rearward.
  • FIG. 7 is a figure which shows the measurement result of the puncture property of the porcine egg transparent body without operation liquid.
  • test section C1 when a 90-5-RD-R injection pipette prepared using 90 tubes was attached to the PMM without operation liquid, a large amount of culture solution was aspirated into the injection pipette. Then, a small amount of oil balls (small oil balls) can be sucked in, and the position of the small oil balls is set to the rear, and you can puncture a porcine egg with an Intensity value of 3.5-4.5 and a Speed value of 5, The operability of the injector was also stabilized.
  • test section T1 when the position of the small oil ball inside the injection pipette was held behind (A), puncture was possible with an Intensity value of 1.5 and a Speed value of 8, but the position of the oil ball was changed to (B ), the puncture was not possible at an Intensity value of 1.5 and a Speed value of 8, and the same puncture property was not obtained.
  • test section T3 when the culture fluid in the injection pipette was replaced with the PVP fluid as in (A) and the position of the small oil ball was rearward, the Intensity value was 5.0 and the Speed value was 3 and the culture fluid was The puncture performance was lower than that of. Further, in (B), similarly, the small oil ball was located rearward, the intensity value was 3.5 and the Speed value was 8, and the puncture performance was lower than that in the case of the culture solution.
  • test section T4 a puncture operation was performed using 85-6-P-HR produced using 85 tubes and with the oil ball position being backward in any of (A) to (E).
  • No operation liquid in the pipette environment (A) A puncture test was conducted under the condition that a large amount of culture solution and a small amount of oil beads (small oil beads) were aspirated. As a result, puncture was possible with an Intensity value of 4.5 and a Speed value of 5.
  • a puncture test was performed using 85-6-PR produced using 85 tubes under the same conditions as the pipette environment (A) in the test section T4 shown in FIG. 7 without operation liquid.
  • a puncture was performed with a value of 4.5 to 5.5 and a Speed value of 5.
  • FIG. 8 is a diagram showing measurement and evaluation results of puncture properties of various injection pipettes 1 and injector operability. The measurement and evaluation were performed on 75 tubes, 85 tubes, and 90 tubes.
  • a 75-7-PF injection pipette made of 75 tubes was attached to the PMM without operation liquid, and a large amount of culture solution was sucked from the tip of the injection pipette, and a small amount of oil was sucked, and then the PVP solution was bent to the bending part 25. Aspiration was performed and a puncture test was performed on the porcine egg zona pellucida. As shown in FIG. 8, in the state where the PVP liquid is aspirated at the tip of 75-7-PF marked with + in the column of presence or absence of PVP, setting speed value 2 and intensity value 16.0 Puncture was possible, and when the Speed value was increased to 5, the puncture was possible with an Intensity value of 15.0.
  • the ovary could be punctured by setting Speed value 2 and Intensity value 12.0. When it was raised to 5, it was possible to puncture with an Intensity value of 9.0.
  • an injection pipette made of 85 tubes has an end shape of 85-6-PF having a flat F and a rounding type R having a small shape of 85-6-PR.
  • 85-6-P-R with a rounded tip had a lower Intensity value than 85-6-PF with a flat tip, and the puncture property was improved.
  • the injection pipette 90-5-RD-R can be used with a small intensity of the controller 54 and thus has good puncture property and good operability of the injector.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of measuring the extensibility of the egg cytoplasmic membrane of various injection pipettes. The elongation of the egg cytoplasmic membrane was measured with a culture solution or the like without using the operation liquid for the injection pipette 1.
  • the injection pipette 1 used has a material of 90 tubes and a tip outer diameter of 10 ⁇ m, and the shape of the main taper portion 3 is RD (radish type) and P (parallel type). Has a tip shape of F, R, and HR, and is composed of a total of 6 types. The test was performed 4 times on each injection pipette 1, and a puncture operation was performed without operation liquid, and the number of manipulated eggs and the number of surviving eggs were totaled to count the number of membrane-fragile eggs.
  • “Membrane fragility puncture %” was 40% or more when the taper shape was RD and the tip shape was F, but the tip shape was R. , HR, the tip shape was about 20%, which is half of F. Further, when the taper shape is P and the tip shapes are R and HR, the “puncture% of membrane fragility” is lower than that of the tip shape F. Particularly, when the tip shape is HR, superiority was observed. ..
  • the "survival rate" of the number of eggs is high in injection pipettes with tapered shapes RD and P and tip shapes R and HR, and 99.0% with tapered shape RD.
  • the injection pipette 1 having the taper shape of RD or the tip shapes of R and HR is effective in improving the egg survival rate.
  • FIG. 10 is a diagram showing a result of pig microinsemination without operation liquid in the injection pipette.
  • the injection pipette 1 two types were used: 90-10-RD-R whose tip was rounded less by fire polishing, and 90-10-RD-HR whose tip was fired more rounded.
  • microfertilization was performed using 90-10-RD-R and 90-10-RD-HR produced using 90 tubes under the condition that the culture solution was aspirated without filling the operation liquid.
  • both pipettes had an Intensity value of 3.5-5.0 and a Speed value of 5-8 under the conditions of the PMM that was able to puncture the zona of porcine egg.
  • the ovum cytoplasmic membrane both pipettes could be punctured with an Intensity value of 4.0 and a Speed value of 1.
  • the survival rate after microfertilization was 100% for both pipettes.
  • an embryo that developed to a blastocyst was observed in both sections.
  • the blastocyst development rate was higher in 90-10-RD-R.
  • the injection pipette 1 used for the evaluation is 90 tubes, the tip outer diameter is 10 ⁇ m, the taper shapes are RD and P, and the tip shapes are HR, R and F 90-10-RD-HR and 90-10, respectively.
  • the dish for ICSI used in the injection pipette with operation liquid has one drop of high osmotic pressure PZM (hPZM) of 10-20 ⁇ l at the center and a drop of 7% PVP solution for rinsing and sperm suspension. Two of them were prepared and covered with mineral oil.
  • hPZM high osmotic pressure PZM
  • the petri dish for ICSI used in the injection pipette without operation liquid has one drop of 10-20 ⁇ l of hPZM in the center, one drop of PZM for setting the injection pipette, and 7 for rinsing and sperm suspension. Two drops of the% PVP liquid were prepared and covered with mineral oil.
  • the high osmotic pressure PZM (hPZM) is obtained by adding sorbitol to PZM so that the osmotic pressure is slightly higher than that of PZM.
  • the reason for using high osmotic pressure PZM (hPZM) in a culture medium containing an egg in the microinsemination operation is to make the cytoplasm slightly contracted to facilitate observation of the first polar body and grasping the position of the egg nucleus. This is to increase the size of the perivitelline space located in the gap between the zona pellucida and the cytoplasm.
  • the prepared petri dish was kept warm at 37-38.5°C in an incubator 1-2 hours before use, and the porcine in vitro matured ovum was transferred to a drop of hPZM in the kept warm petri dish. Further, an appropriate amount of sperm fluid was put in a drop of a 7% PVP solution for suspending sperm and suspended to prepare a dish for ICSI operation.
  • the injection pipette For setting the injection pipette with operation liquid, in order to efficiently transfer the impact force from the piezoelectric element to the tip of the injection pipette, before attaching it to the pipette holder, use a micropipette that has sucked the operation liquid (Fluorinert) in advance.
  • the operation liquid (Florinert) was filled near the center of the pipette with a width of about 1 to 1.5 cm.
  • the injection pipette was moved to the drop of 7% PVP liquid in which sperm was suspended, and the operation of immobilizing sperm was started.sperms were selected from those that were actively moving and had no deposits on the head and tail. The immobilization of sperm was carried out by immobilizing the sperm by driving the PMM while touching the tip of the injection pipette with the tail when aspirating and discharging the sperm from the tail into the injection pipette.
  • the spermatozoa confirmed to have stopped moving were aspirated into the injection pipette and used for the injection operation into the ova.
  • the puncture into the egg was performed by microinjection into the egg cytoplasm by the piezo ICSI method of the micropipette in the intracytoplasmic injection method shown in FIG.
  • the injection pipette was pulled out to confirm the number of surviving eggs.
  • the surviving ova were transferred to a PZM drop for culture and in vitro cultured in an incubator under the conditions of 5% O 2 , 5% CO 2 and 20% N 2 for 6 days.
  • the in vitro-cultured ICSI embryos were microscopically observed on the 6th day, and the number of the developed blastocysts was counted.
  • FIG. 11 shows the number and percentage of surviving ova in ovarian microinsemination with and without operation liquid using seven types of injection pipettes, the number of blastocysts and their proportion (blastocyst development). It is a figure which shows the result of a rate (%).
  • FIG. 12 is a graph showing the results of the blastocyst incidence in porcine microinsemination with and without operation liquid using the injection pipettes of the seven types shown in FIG.
  • + of presence or absence of OL in FIG. 11 and OL+ shown in FIG. 12 indicate that the puncture operation was performed by filling the operation liquid into the injection pipette during pig microinsemination (described as having OL), and in FIG.
  • the presence or absence of OL-and the OL-shown in FIG. 12 indicate that the puncture operation was performed without using the operation liquid inside the injection pipette (described as no OL).
  • FIG. 11 shows the number of eggs used for the ICSI operation (the number of manipulated eggs shown in FIG. 11) and the number of surviving eggs (the number of surviving eggs shown in FIG. 11) in the presence or absence of OL in various injection pipettes having different tapered shapes and tip shapes. ) And the ratio (ovum survival rate (%)) are shown.
  • the number of cultured embryos used, the number of blastocysts and their ratio (blastocyst incidence) are shown.
  • blastocyst development rate with and without OL of 90-10-RD-HR and 90-10-RD-R was as follows: The blastocyst with and without OL of 90-10-PF It was confirmed that it was significantly higher than the blastocyst incidence and the blastocyst incidence without OL of 75-12-PF. That is, it was confirmed that 90-10-RD-HR and 90-10-RD-R were effective even without OL on the blastocyst development rate.
  • the blastocyst occurrence rate of 75-12-PF with OL was as high as that of 90-10-RD-HR and 90-10-RD-R with and without OL. Which was significantly higher than the blastocyst incidence of 90-10-P-F with and without OL and the blastocyst incidence of 75-12-PF with no OL.
  • blastocyst occurrence rate of 75-12-PF without the OL was low in the ability to puncture an egg, and the microinsemination embryos that could be produced did not develop to the blastocyst.
  • the piezo using the 90-10-RD-HR, 90-10-RD-R, 90-10-P-HR, and 90-10-P-R without the OL that does not fill the operation liquid (OL) The ICSI method has the same result as the case of the injection pipette filled with the conventional operation liquid OL, and it was confirmed that the shapes of HR and R with the polished tip can be effectively used with the piezo micromanipulator (PMM) without the OL. did it.
  • 90-10-RD-HR and 90-10-RD-R have a high blastocyst incidence both with and without OL, and without OL, the taper shape is the same as that with OL.
  • the superiority of RD which is a type (radish type), was recognized. Further, it was found that the tip shape is HR, which is a heat-shrinking portion with a large rounded tip, and R, which is a heat-shrinking portion with a small rounded tip.
  • the 90-10-RD-HR and 90-10-RD-R without the OL allow the puncture performance and the injector operation to be the same as those of the conventional OL with the ICSI operation. Since there is no need to fill the operation liquid into the injection pipette as with the OL, the time required to confirm the setting can be shortened, so the handling time of eggs and sperms outside the body (outside the incubator) is minimized. It is presumed that this was possible and that it had a good effect on embryonic development.
  • 90-10-RD-HR, 90-10-RD-R, 90-10 are pipettes 90-10-RD-F and 90-10-PF with a flat tip using 90 tubes.
  • the cause of the lower blastocyst incidence compared to -P-HR and 90-10-PR is considered to be the material of the glass tube and the shape of the tip. That is, since the 90 glass tube is ultra-thin, in the case of 90-10-RD-F and 90-10-PF with a flat tip, the shape is sharp and the PMM puncture performance is high. However, it is thought that it affects the egg plasma membrane.
  • the blastocyst development rate was slightly higher in the 90-10-RD-F and 90-10-PF with the OL, compared to the case without the OL. It is considered that the operability was stable. Furthermore, 90-10-RD-F tended to have a higher blastocyst development rate than 90-10-PF, but this was due to the fact that RD, which is a radish type (radish type) It is presumed that this is because a suitable injector operability was obtained. As described above, the results of the blastocyst development rate in 90-10-RD-HR and 90-10-RD-R also confirmed that radish type RD was effective.
  • the tip shape is 90 because the thickness of the glass tube is not too thin. Not as sharp as a tube. Therefore, if the conventional method of using the PMM for filling the operation liquid was used, sufficient puncture performance could be obtained, and the operation could be performed without affecting the cytoplasmic membrane, resulting in good embryogenesis after ICSI. Thought to be something. However, since the injection pipette consisting of 75 tubes has a slightly thicker glass tube, the puncture performance by PMM was greatly reduced under the condition without operation liquid, and it was not possible to perform an accurate microinsemination operation. It is speculated that it did not occur. From this result, it became clear that the wall thickness of the glass tube in the injection pipette is important for the puncture performance.
  • the taper angle of the inner peripheral surface is larger on the tip side than the main taper portion than the taper angle of the main taper portion.
  • the tip tapered part of the injection pipette has a heat shrinking part formed by applying heat to the tip to shrink the glass tube, and the heat shrinking part has a rounded curved surface with a narrow inner diameter. Therefore, it becomes possible to finely adjust suction and discharge of the culture solution and the like by the injector, and the operability of the injector of the micromanipulator in the piezo ICSI method is improved.
  • the injection pipette according to the present invention is configured such that the circular ring portion located at the leading end is formed in a direction orthogonal to the axial direction of the tip side of the injection pipette, and the circular pipe portion of the injection pipette is connected to the outer peripheral surface and the inner circumference.
  • the injection pipette according to the present invention by using the culture solution, which is a constituent element of the present invention, as an impact transfer solution, without particularly preparing an operation liquid such as Fluorinert, an egg cytoplasm by the same piezoic method as the conventional method. Injectable inside.
  • the injection pipette of the present invention it is not necessary to inject the operation liquid into the injection pipette, and the injection process in the egg cytoplasm can be simplified.
  • the injection pipette according to the present invention has a reliable puncture performance when operating an egg/embryo by PMM. That is, the conventional method may cause variations in puncture due to the shape of the pipette, the quality of the ovum, and the skill of the operator, but the injection pipette according to the present invention has a stable puncture performance to sufficiently extend the membrane. It is possible to perform a similar puncture every time.
  • the injection pipette according to the present invention is particularly effective for injecting DNA and RNA, which are important for puncturing and injector operability, and for injecting ES cells into blastocysts. Further, in addition to these methods, it can be effectively used for enucleation operation in nuclear transfer and collection of neutrophils by biopsy in place of the intracytoplasmic injection method.
  • the injection pipette of the present invention it becomes possible to puncture the zona pellucida and the cytoplasmic membrane, so that not only sperm injection but also nuclear replacement technology and somatic cell nuclear transfer for the purpose of creating somatic cell clones It is also possible to apply to RNA injection for gene expression control, ES cell injection for producing transgenic animals, DNA injection and genome editing technology.

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Abstract

【課題】哺乳類の卵細胞質内注入法に使用され、圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されるインジェクションピペットにおいて、オペレーションリキッド（フロリナート）を充填する必要がなく、ＰＭＭの効率的な駆動を実現することができ、さらに操作性が向上し、インジェクションピペットによる卵子の膜の伸展性、穿刺性に優れたインジェクションピペットを提供する。 【解決手段】　インジェクションピペット１は、先端側の外周面４及び内周面がテーパ状に構成された主テーパ部３を有し、主テーパ部３よりさらに先端側において、インジェクションピペット１の内周面のテーパ角度が主テーパ部３のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部７を有する。

Description

インジェクションピペット
　本発明は、卵子、細胞等に穿刺するインジェクションピペットに関し、特に、卵細胞質内注入法に使用し、圧電素子の駆動によって微小駆動されるインジェクションピペットに関する。
　従来、バイオテクノロジーにおいては、遺伝子・細胞等に人工的操作を加え、新しい遺伝情報体、受精卵を作成することが行われている。光学顕微鏡で観察することできる細胞、核、受精胚等に対して、物理的・機械的操作を加えるマイクロマニピュレータが用いられている。マイクロマニピュレータは、細胞等の人工的操作に不可欠なものとなっている。
　マイクロマニピュレータには、微小器具（マイクロピペット）が装備され、マイクロピペットを直線方向に移動させる微小移動装置が備えられている。尚、マイクロピペットは、インジェクションピペットともいう。
　［コンベンショナル法による卵子細胞質内への顕微注入操作］
　図１３は、卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのコンベンショナル法を説明する図である。図１３（ａ）に示すように、コンベンショナル法では、ホールディングピペット６８に固定された卵子６０の破膜に先端が鋭利なスパイク加工されたマイクロピペット（以下、「コンベンショナルピペットＣＶ」と記す。）が用いられている。精子７０は、コンベンショナルピペットＣＶの内部に吸引されている。
　このため、図１３（ｂ）に示すように、卵子６０の透明帯６１をコンベンショナルピペットＣＶが貫通する間、卵子全体が内側に変形して、透明帯６１が押されることにより卵細胞質６５への内圧上昇が発生することがある。
　また、コンベンショナルピペットの尖端部７５（図１３（ａ））は鋭利にスパイク加工されているため、図１３（ｃ）に示すように卵細胞質膜６４の伸展が十分にされないままに、矢印で示す箇所にストレスがかかり破膜する割合が上昇する。
　また、図１３（ｄ）に示すように、卵細胞質膜６４の穿刺では、コンベンショナルピペットＣＶの内部に卵細胞質６５の一部を吸引するため、卵細胞質６５に攪拌が起こることがある。
　このため、鋭利な先端を有するマイクロピペットを用いるコンベンショナル法に代えて、圧電素子を使用して先端がフラットなマイクロピペットで卵子を穿刺する圧電微小駆動装置（ピエゾマイクロマニピュレータ（「ＰＭＭ」ともいう））が知られている。
　特許文献１には、圧電微小駆動装置が開示されている。特許文献１によれば、圧電微小駆動装置は、保持体に当接部材を介して適切な摩擦力で支持されるマイクロピペット微小器具と、該微小器具に形成される鍔部と、該鍔部に設けられ、かつ微小器具と同心円状に配置される圧電素子と、該圧電素子に取り付けられ、圧電素子の駆動により微小器具に衝撃力を付与する慣性体とを具備するものであり、圧電素子の駆動により、慣性体による衝撃力を発生させ、これを利用して卵子を穿刺することが開示されている。
　また、特許文献２乃至特許文献４においても、圧電素子の駆動により、慣性体による衝撃力を発生させ、これを利用して卵子を穿刺することが開示されている。
　このように、所謂ピエゾＩＣＳＩ法における圧電微小駆動装置においては、先行技術文献に記したような、圧電素子の後端部に固定される慣性体が設けられている。
　［ピエゾＩＣＳＩ法による卵子細胞質内への顕微注入操作］
　ここで、圧電微小駆動装置を用いた精子の卵子細胞質内への顕微注入操作について説明する。図１４は、卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのピエゾＩＣＳＩ法を説明する図である。
　図１４（ａ）に示すように、注入操作を行う卵子６０の第一極体６６を６時もしくは１２時の位置にホールディングピペット６８によって保持し、卵子６０の穿刺を行う際に極体の直下の卵子核にダメージを与えないようにする。
　図１４（ｂ）に示すように、透明帯６１にインジェクションピペットＰＩの先端を軽く押し当てる。このときの精子７０は、インジェクションピペットＰＩ先端から少し離れたインジェクションピペットＰＩの内部に位置するようにする。
　インジェクションピペットＰＩ先端が透明帯６１に軽く接触した状態で、圧電素子（ピエゾ）を駆動させ、インジェクションピペットＰＩが透明帯６１に刺さり最後の一層までインジェクションピペットＰＩを押し進める。最後の一層を残し、圧電素子を止めて、手動で押し開ける。
　尚、圧電素子の駆動設定は、圧電素子の振動回数、振動の強度の大きさについて行う。また、圧電素子の駆動設定は、透明帯６１等の穿刺状況に応じて変更する。インジェクションピペットＰＩ内に透明帯６１の断片が入っている場合は、卵子６０の外もしくは囲卵腔６７に排出する。
　図１４（ｃ）に示すように、精子７０をインジェクションピペットＰＩの先端までに移動させ、インジェクションピペットＰＩの先端を卵細胞質膜６４に押し当てて、卵細胞質膜６４を伸展させる。卵細胞質６５の半分から２／３の位置まで針先を進める。
　このとき、卵細胞質膜６４は伸展して、図１４（ｃ）に示すように、変形する。卵細胞質６５の半分から２／３の位置で圧電素子４８を駆動させる。即ち、圧電微小駆動装置を用いて顕微授精操作における卵細胞質膜６４を穿刺する際、インジェクションピペットＰＩの先端を卵細胞質膜６４に接触させて押すように移動させて、卵細胞質膜６４を充分伸展させた後に圧電微小駆動装置の圧電素子を稼働させて破膜し、精子７０を卵子６０に注入して操作を完了させる。
　卵細胞質膜６４を穿破（破膜）した後、なるべく培養液を注入しないように精子７０を注入する。このとき、図１４（ｄ）に示すように、卵細胞質６５は、元の状態に復元するように矢印で示す方向に移動する。
　尚、卵子細胞質膜６４を充分に伸展できず、卵子細胞質膜６４の伸展開始個所から中心に向けて伸展する途中で破膜した場合には、圧電微小駆動装置を稼働させずに精子７０を注入するようにする。精子７０を注入後、ゆっくりインジェクションピペット等を引き抜くようにする。これにより、ブタの卵子細胞質内への顕微注入操作が完了する。
　この場合、卵細胞質内注入法にあたり、精子注入用のインジェクションピペットのセッティングは、ピペットホルダ３５（図３に示す）に取り付ける前に、予めオペレーションリキッド（フロリナート）を吸引した充填器であるマイクロピペッターを用いてインジェクションピペットの中心付近にオペレーションリキッド（フロリナート）を約１から１．５ｃｍの幅で充填しておく。尚、充填器は、マイクロピペッターに限らず、インジェクションピペット内にオペレーションリキッドを充填できる器具であればよい。
　このオペレーションリキッド（フロリナート）のインジェクションピペットへの充填は、圧電素子からの衝撃力をインジェクションピペットの先端に効率よく伝えるために行うものであり、衝撃伝達液として作用するものである。
　尚、これら所謂ピエゾＩＣＳＩ法のマイクロマニピュレータにおいて、圧電微小駆動装は卵子を穿刺する際に使用するものであり、通常、インジェクションピペットは圧電素子の駆動による慣性体からの衝撃力による卵子を穿刺する際の微小駆動の他、他のマニピュレータによってその他の位置決め操作が可能である。
特公平６－９８５８２ 特公平６－４８９７５ 特公平６－９８５８３ 特公平７－７３８３０
　上述したように、精子注入用のインジェクションピペットのセッティングは、圧電素子からの衝撃力をインジェクションピペットの先端に効率よく伝えるために、ピペットホルダに取り付ける前に、予めオペレーションリキッド（フロリナート）を吸引したマイクロピペッターを用いてインジェクションピペットの中心付近にオペレーションリキッド（フロリナート）を約１から１．５ｃｍの幅で充填する。これによりピペットホルダに取り付ける前にインジェクションピペット内にオペレーションリキッドを充填する必要があり、操作に時間を要していた。
　このため、フロリナート等のオペレーションリキッドを使用することなく、インジェクションピペットに関する操作を簡略化してＰＭＭの効率的な駆動を実現することが求められている。
　このように、オペレーションリキッドを使用することなしに穿刺性、操作性及び膜高伸展性に優れたインジェクションピペットが求められている。
　そこで、本発明は、哺乳類における卵細胞質内注入法に使用され、かつ、圧電素子の駆動によって圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されるインジェクションピペットであって、インジェクションピペットの中心付近にオペレーションリキッド（フロリナート）を充填する必要がなく、既存の構成要素を用いることにより、ＰＭＭの効率的な駆動を実現することができ、さらに操作性が向上し、圧電素子を駆動する前のインジェクションピペットによる卵子の膜の伸展性、穿刺性に優れ、胚盤胞発生率を向上させることが可能であって、それにより卵子生存率の向上に繋げることが可能なインジェクションピペットを提供することを目的とする。
　上記目的達成のため、本発明に係るインジェクションピペットは、哺乳類における卵細胞質内注入法に使用され、かつ、圧電素子の駆動によって当該圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動される先端側の外周面及び内周面がテーパ状に構成された主テーパ部を有するインジェクションピペットであって、当該インジェクションピペットは、前記主テーパ部よりさらに先端側において、前記インジェクションピペットの内周面のテーパ角度が前記主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を有することを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットはガラス管であり、前記先端テーパ部は、先端に熱を加えて当該ガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部であることを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットの前記先端テーパ部は、さらに前記熱収縮部と前記主テーパ部との間において、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面を有し、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面を有する副テーパ部を有することを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットの前記先端テーパ部は、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面からなり、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面からなることを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットの最先端に位置する卵細胞の透明体又は卵細胞質膜に接する円環部は、前記インジェクションピペットの先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、前記インジェクションピペットの前記円環部から前記外周面及び前記内周面への移行部は面取りがなされていることを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットは、内部に注入する衝撃伝達液として培養液を利用可能であることを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットの内部に注入された前記衝撃伝達液の当該インジェクションピペット先端側に隣接してミネラルオイルを吸引し、さらに当該ミネラルオイルの前記インジェクションピペット先端側に隣接して卵細胞質内に注入する液体を吸引して使用することを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットの内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きいことを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットの先端の内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きく、かつ、当該精子を前記インジェクションピペットの先端から出し入れするのに最低限必要な所定のクリアランスを前記精子の頭部の直径の値以外に有することを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットの前記熱収縮部は前記主テーパ部によりも外径に対する内径の割合が小さいことを特徴とする。
　また、本発明に係る前記インジェクションピペットの前記主テーパ部における外径に対する内径の割合は８０％以上１００％未満であることを特徴とする。
　本発明に係る前記インジェクションピペットは、前記圧電素子に置換して電歪素子の駆動によって当該電歪素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されることを特徴とする。
　また、本発明に係るインジェクションピペットは、前記卵細胞質内注入法に換えて、核移植における徐核操作又はバイオプシーによる核球採取に使用されることを特徴とする。
　本発明によれば、卵細胞質内注入法という非常に微小な領域での作業について、原理が未知の部分が多いものの、発明者は試行錯誤の結果、以下のような効果を得られることを見出したものである。
　即ち、本発明によれば、先端側に主テーパ部を有するインジェクションピペットは、主テーパ部よりさらに先端側において、内周面のテーパ角度が主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を設けることにより、内周面が先端に向かって縮径されるため、インジェクションピペット内の培養液等の流れを調整することできインジェクタの操作性が向上する。
　また、インジェクションピペットの先端テーパ部は、先端に熱を加えてガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部を有し、熱収縮部は先端を丸めた曲面となって先端の内径が狭くなるため、インジェクタによる培養液等の吸引と吐出とを微妙に調節できるようになり、ピエゾＩＣＳＩ法におけるマイクロマニピュレータのインジェクタの操作性が向上する。
　本発明によるインジェクションピペットは、最先端に位置する円環部がインジェクションピペットの先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、インジェクションピペットの円環部から外周面及び内周面への移行部は面取りがなされていることにより、試行錯誤の結果、卵細胞質への内圧上昇が発生することがないことが判明した。これにより、穿刺性、操作性及び膜高伸展性に優れたインジェクションペットを提供することができる。
　また、本発明に係るインジェクションピペットは、そもそもの構成要素である培養液を衝撃伝達液として利用することによって、フロリナート等のオペレーションリキッドを殊更用意することなく、従来と同様のピエゾＩＣＳＩ法による卵細胞質内の注入が可能となる。
　また、本発明に係るインジェクションピペットによれば、インジェクションピペット内にオペレーションリキッドを注入する必要がなく、卵細胞質内の注入工程を簡素化することができる。
　また、本発明に係るインジェクションピペットは、ＰＭＭによる卵子・胚に対して操作を行う際に確実な穿刺性能を有している。即ち、コンベンショナル法は、ピペットの形状、卵子の質および操作者の熟練度により穿刺もばらつきが発生する恐れがあるが、本発明に係るインジェクションピペットは、安定した穿刺性能により膜を十分に伸展して毎回同じような穿刺を行うことが可能である。
　また、本発明に係るインジェクションピペットは先端形状を丸めることで、老化卵子の脆弱な卵細胞質膜を十分に伸展させることが可能となり、精子注入後の卵子生存率の向上が期待できる。
　本発明に係るインジェクションピペットは、特に、穿刺性とインジェクタの操作性が重要なＤＮＡ、ＲＮＡ注入や胚盤胞へのＥＳ細胞注入に有効である。また、それらのみならず、卵細胞質内注入法に換えて、核移植における除核操作、バイオプシーによる核球採取にも有効に使用可能である。
本発明によるインジェクションピペットの外観、構成を示す図であり、（ａ）は、インジェクションピペットの全体を示す図、（ｂ）はインジェクションピペットの主テーパ部と主テーパ部の先端側に位置する先端テーパ部の外形を示す図、（ｃ）は、図１（ｂ）に示す破線円内の領域Ａの先端テーパ部の構成を示す拡大断面図である。 ＩＣＳＩ操作に用いるインジェクションピペットの熱収縮部における先端の側面の形状及び各部の大きさを示す拡大した断面図であり、（ａ）は先端をフラットにした形状、（ｂ）は先端を小さく丸めた熱収縮部の形状、（ｃ）は先端を大きく丸めた熱収縮部の形状を示す。 本発明に係るインジェクションピペットが接続された圧電微小駆動装置の構成を示すブロック図である。 インジェクションピペットによるブタ卵子透明体への穿刺性、操作性の測定評価フローを示す図である。 インジェクションピペット内に吸引した培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はコントローラのスピード２における穿刺の測定結果、（ｂ）はコントローラのスピード５における穿刺の測定結果である。 図５に示すインジェクションピペット内に吸引した培養液量の違いによるインジェクタの操作性の評価結果を示す図である。 オペレーションリキッド無しでのブタ卵子透明体の穿刺性の測定結果を示す図である。 各種インジェクションピペットの穿刺性、操作性の測定評価結果を示す図である。 各種インジェクションピペットの卵細胞質膜の伸展性の測定結果を示す図である。 インジェクションピペット内にオペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精の結果を示す図である。 ７種類の形状のインジェクションピペットによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における生存卵子数とその割合（卵子生存率（％））及び胚盤胞発生数とその割合（胚盤胞発生率（％））の結果を示す図である。 図１１に示す７種類の形状のインジェクションピペットによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における胚盤胞発生率の結果をグラフで示す図である。 卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのコンベンショナル法を説明する図である。 卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのピエゾＩＣＳＩ法を説明する図である。
　以下、図面を参照して、本発明によるインジェクションピペットを実施するための形態について説明する。尚、本発明は、哺乳類における卵細胞質内注入法（ＩＣＳＩ）に使用され、かつ、圧電素子の駆動によって圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されるインジェクションピペットに関するものであり、本発明に係るインジェクションピペットは、主テーパ部よりさらに先端側において、インジェクションピペットの内周面のテーパ角度が主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を有することにより、オペレーションリキッド無しで内部に注入する培養液を衝撃伝達液として利用可能であることを発明者が試行錯誤の結果見出したものである。
　［インジェクションピペットの構成］
　図１は、本発明によるインジェクションピペットの外観、構成を示す図であり、図１（ａ）はインジェクションピペットの全体を示す図、図１（ｂ）はインジェクションピペットの主テーパ部と主テーパ部の先端側に位置する先端テーパ部の外形を示す図、図１（ｃ）は、図１（ｂ）に示す破線円内の領域Ａの先端テーパ部の構成を示す拡大断面図である。
　尚、本発明は図１２において説明した卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのピエゾＩＣＳＩ法のインジェクションピペットＰＩの形状及びその運用方法について改良を行ったものであり、図１２と同じ内容については同じ符合を使用して説明する。
　図１（ａ）に示すように、インジェクションピペット１は、ガラス管から成り、テーパ状に形成された主テーパ部３と、主テーパ部３の先端側に位置する先端テーパ部７と、開口された先端から所定の距離に設けられた曲げ部２５と、ピペットホルダ３５（図３に示す）に取り付けられ所定の長さを有し、外径が一定である直管状の基部２７とを有している。図１（ａ）では、先端テーパ部７と基部２７との境界を破線で示す。
　図１（ｂ）に示すように、インジェクションピペット１の主テーパ部３は、インジェクションピペット１の先端から例えば、約１５ｍｍの長さを有しており、先端に向かって縮径するテーパ状に形成され、テーパ角度θ１を有している。
　主テーパ部３よりさらに先端側に先端テーパ部７が設けられている。主テーパ部３の先端側に位置する先端テーパ部７は、テーパ角度θ２を有している。また、先端テーパ部７は、先端を熱で収縮加工した熱収縮部１２を有している。図１（ｂ）では、主テーパ部３と先端テーパ部７との境界を破線で示す。
　図１（ｂ）に示すように、主テーパ部３の先端側に位置する先端テーパ部７におけるテーパ角度（図１（ｂ）に示すθ２）は、主テーパ部３のテーパ角度（図１（ｂ）に示すθ１）よりも大きくなっている。
　図１（ｂ）に示す先端テーパ部７は、さらに熱収縮部１２と主テーパ部３との間において、テーパ角度θ２が主テーパ部３の外周面４のテーパ角度θ１よりも大きい外周面１０を有し、かつ、テーパ角度（図示せず）が主テーパ部３の内周面（図示せず）のテーパ角度（図示せず）よりも大きい内周面１１（図１（ｃ）に示す）を有する副テーパ部９を有している。副テーパ部９は、インジェクションピペット１の先端から例えば、約０．２５ｍｍの長さを有している。
　このように、先端テーパ部７は、熱収縮部１２と副テーパ部９からなり、副テーパ部９はテーパ角度θ２が主テーパ部３の外周面のテーパ角度θ１よりも大きい外周面１０からなり、かつ、主テーパ部３の内周面のテーパ角度（図示せず）よりも大きい内周面１１（図１（ｃ）に示す）からなる。これにより、主テーパ部３から先端テーパ部７に向かって急激に先細状態となっている。尚、先端テーパ部７を有するインジェクションピペット１をラディッシュタイプ（ＲＤと記す）と称する。
　また、先端テーパ部７における外周面及び内周面のテーパ角度が、主テーパ部３の外周面及び内周面のテーパ角度と同じ大きさの角度で形成している場合には、インジェクションピペット１は、主テーパ部３のみで構成される。以後、主テーパ部３のみで構成されるインジェクションピペット１をパラレルタイプ（Ｐと記す）と称する。尚、パラレルタイプでも熱収縮部１２が形成されることがある。
　図１（ｃ）に示すインジェクションピペット１の熱収縮部１２は、ファイアーポリシュによってインジェクションピペット１の先端に熱を加えてガラス管を収縮させたものである。先端に熱を加えることにより表面が溶けて、熱収縮部１２の先端に周囲が面取りされた円環部１４が形成される。
　即ち、円環部１４はインジェクションピペット１の先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、インジェクションピペット１１の円環部１４から外周面９への移行部１９の端面は面取りがされている。また、インジェクションピペット１は、先端の円環部１４から内周面１１への移行部２１の端面は面取りがされている。換言すれば、図１（ｃ）において、移行部１９と移行部２１に挟まれた頂部分が円環部１４となる。
　これにより、円環部１４は卵細胞質内注入における卵細胞の透明体又は卵細胞質膜に接して、卵細胞質への内圧上昇の発生を防止し、卵細胞質膜の伸展が十分に図られることが発明者の試行錯誤の結果判明した。
　図１（ｃ）に示すインジェクションピペット１の内径（図１（ｃ）に示すｄｉ）の大きさは、卵細胞質６５（図１２に示す）の中に注入する精子頭部の最大直径よりも大きくなっている。例えば、豚の精子頭部の直径が、約３．５マイクロンメータ（μｍ）前後であり、豚（ブタとも記す）に用いるインジェクションピペット１の内径は、ブタの精子特有の粘着性から、ピペットや、他の精子との癒着を防止するべく、精子頭部の最大直径以外のクリアランスが必要となり、その結果、ブタに用いるインジェクションピペット１の最低限必要な内径は、最小値が約６μｍとなり、インジェクションピペット１を操作する者の経験や操作特性によって必要となるクリアランスも異なるため、最大値が約９μｍとなる。
　また、人の精子の頭部の直径は、やはり約３．５マイクロンメータ（μｍ）前後であり、ブタのような粘着性もないことからクリアランスを大きく設定する必要もなく、人（ヒトとも記す）に用いるインジェクションピペット１の最低限必要な内径の最小値は、約３．５μｍを超える大きさである。
　そのため、通常、精子の頭部の直径に対して、インジェクションピペット１の内径に対するクリアランスを０％超６５％以下に保ったインジェクションピペット１であれば、インジェクションピペット１の内部に対して哺乳類の精子の出し入れが可能であり、インジェクションピペット１の内径は哺乳類の精子頭部の直径と、この直径以外のクリアランス（内径－精子頭部の最大直径）を考慮して設定される。
　即ち、インジェクションピペット１の内径は、動物種による精子の特性（精子の先体反応などによる粘着性や、例えば、マウスの精子頭部のような鈎状等の精子頭部の形状）により、精子頭部の最大直径よりも余裕を持った大きさが必要となる。また、インジェクションピペット１を操作する者の経験や操作特性によって必要となるクリアランスも異なる。このため、インジェクションピペット１の内径のクリアランスは、内径に対して最大で６５％である。一方、インジェクションピペット１の内径が、精子の頭部の最大直径の大きさとほぼ同じ大きさであってもよい場合もあることから、インジェクションピペット１の内径のクリアランスは、内径に対して最小で０％超（精子頭部の最大直径をわずかに超える値）である。
　図１（ａ）に示すように、開口された先端から所定の距離に設けられた曲げ部２５は、インジェクションピペット１の先端から例えば、１から５ｍｍの距離に曲げ位置が設けられており、曲げ部２５における曲げ角度は、例えば２０度である。
　曲げ角度は、インジェクションピペット１の基体を成す基部２７からの曲げ角度が０度のときは、インジェクションピペット１全体がストレートに形成されている。尚、インジェクションピペット１は、曲げ角度を有するものに限らず、ストレートのものを使用してもよい。
　ピペットホルダ３５に取り付けられる基部２７は、例えば約５０ｍｍの長さを有しており、先端に位置する熱収縮部１２と連通した内部空間を有している。直管状の基部２７の一方の端部は、主テーパ部３と連接されており、他の端部は、ピペットホルダ３５に固定される。
　［インジェクションピペットの先端の形状］
　次に、ブタ用のＩＣＳＩ操作に用いるインジェクションピペットの熱収縮部における先端の形状について説明する。
　図２は、ブタ用のＩＣＳＩ操作に用いるインジェクションピペットの熱収縮部における先端の側面の形状及び各部の大きさを示す拡大した断面図であり、図２（ａ）は先端をフラットにした形状、図２（ｂ）は先端を小さく丸めた熱収縮部の形状、図２（ｃ）は先端を大きく丸めた熱収縮部の形状を示す。
　図２（ａ）に示す先端をフラットにしたインジェクションピペット１の外径ｄｏ１は、１０μｍ（マイクロンメータ）であり、内径ｄｉ１は９μｍである。尚、先端がフラットのインジェクションピペットをフラットＦと記す。尚、先端がフラットのインジェクションピペットの外径ｄｏ１は、先端外径ともいう。
　図２（ｂ）は、外径ｄｏ２が１１μｍのガラス管の先端をファイアーポリシュにより、先端外径ｄｆ１が１０μｍ、内径ｄｉ２が８μｍとなるように先端を小さく丸め加工を行ったものである。また、インジェクションピペット１の最先端に位置する熱収縮部１２の円環部１４から軸方向に２５から３０μｍ（図２（ｂ）に示すｔ１）に対応する副テーパ部９の外周面１０までが、移行部１９である。先端を小さく丸め加工した熱収縮部１２を有するインジェクションピペット１を少ない丸めタイプＲと記す。
　図２（ｃ）は、外径ｄｏ３が１２μｍのガラス管の先端をファイアーポリシュにより、先端外径ｄｆ２が１０μｍ、内径ｄｉ３が６．８μｍとなるように先端を大きく丸め加工を行ったものである。また、インジェクションピペット１の最先端に位置する熱収縮部１２の円環部１４から軸方向に３５から４０μｍ（図２（ｃ）に示すｔ２）に対応する副テーパ部９の外周面までが、移行部１９である。先端を大きく丸め加工した熱収縮部１２を有するインジェクションピペット１を大きい丸めタイプＨＲと記す。
　図２（ｂ）、図２（ｃ）に示すように、インジェクションピペット１の先端を丸め加工することにより、先端の熱収縮部１２のガラス管の厚みが増加している。尚、上述したインジェクションピペットの寸法は、一例であり、これに限定するものではない。
　［顕微授精用ピペットの作製］
　次に、インジェクションピペット１の作成について述べる。図１に示すインジェクションピペット１の作成には、素材がガラス管からなり、外径１ｍｍ、ガラス管肉厚約５０μｍ、即ち、ガラス管の外径に対する内径の割合が９０％のガラス管（以下、「９０管」と記す。）、ガラス管肉厚約７５μｍ（以下、「８５管」と記す。）、ガラス管肉厚約１２５μｍ（以下、「７５管」と記す。）を用いる。ガラス管をガラス管引き伸ばし機にセッティングし、目的の形状に合わせたプログラムにより、ガラス管を細く引き伸ばす。
　引き伸ばしたガラス管は、ガラス管加工機のピペットホルダに装着する。ガラス管加工機は、ヒーターに取り付けられた白金線上のガラスの玉を加熱して各種の加工を行うものである。ガラス管加工機によって、ガラス管の所定の太さの部分に加熱したガラスの玉を素早く接着させることで、ガラス管を折るようにする。折ったガラス管は、先端から１ｍｍ以上の長さの部分にガラス管加工機の加熱したガラス玉の位置を調整して、必要があれば所定の角度に曲げるようにする。
　また、ガラス管からなるインジェクションピペット１は、ファイアーポリシュよって先端に熱を加えて表面を溶解させることにより、熱収縮部１２が形成される。また、ファイアーポリシュによってインジェクションピペット１の外周面１０から円環部１４への移行する部分である移行部１９及び円環部１４から内周面１１への移行する部分である移行部２１が形成される。尚、ファイアーポリシュの加熱時間等を調整することにより、図２（ｂ）、図２（ｃ）に示す先端形状が得られる。
　［圧電微小駆動装置の構成］
　次に、インジェクションピペット１が接続された圧電微小駆動装置の構成について説明する。
　図３は、インジェクションピペット１が接続された圧電微小駆動装置の構成を示すブロック図である。図３に示すように、圧電微小駆動装置３０は、インジェクションピペット１を取り付けるピペットホルダ３５と、圧電微小駆動装置３０を顕微鏡のＸＹＺθマニピュレータ５５に取り付ける器具であるスライドベース４０と、圧電素子４８を内蔵したドライブユニット４５とを有している。
　ピペットホルダ３５は、先端にインジェクションピペット１を取り付けて固定するホルダグリップ３６を備えている。ホルダグリップ３６の内部に、O（オー）リングが設けられており、インジェクションピペット１の直管状の基部２７における端部をピペットホルダ３５に挿入して、O（オー）リングで締めてインジェクションピペット１を固定する。
　尚、本発明のインジェクションピペット１は、オペレーションリキッド無しで使用するが、従来のように、インジェクションピペット１内にオペレーションリキッドを充填して使用することも可能である。
　図３に示すように、ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６とスライドベース４０との間には、ドライブユニット４５が取り付けられている。スライドベース４０に設けられているクランプネジ４１により、ピペットホルダ３５をスライドベース４０に固定する。スライドベース４０には、顕微鏡に備えられたＸＹＺθマニピュレータ５５に接続するための接続部（図示せず）を有している。スライドベース４０の接続部と顕微鏡のＸＹＺθマニピュレータ５５とを接続することにより、インジェクションピペット１の先端が、ＸＹＺθマニピュレータ５５の動きに連動して移動する。
　尚、本発明の所謂ピエゾＩＣＳＩ法のマイクロマニピュレータにおいて、圧電微小駆動装置３０は卵子を穿刺する際に使用するものであり、インジェクションピペット１は圧電素子の駆動による慣性体からの衝撃力による卵子を穿刺する際の微小駆動の他、ＸＹＺθマニピュレータ５５の動きによってその他の位置決め操作が可能である。
　このように、インジェクションピペット１が接続された圧電微小駆動装置３０は、スライドベース４０を介して顕微鏡のXYZθマニピュレータ５５に接続される。尚、圧電微小駆動装置と顕微鏡のＸＹＺθマニピュレータ５５の接続は、スライドベース４０を使用することに限定するものではなく、他のものであってもよい。
　ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６とスライドベース４０との間に位置するドライブユニット４５は、圧電素子４８の一方の主面（振動する面）に連結された慣性体４９を内蔵し、圧電素子４８の他方の主面を結合した鍔部４７を介してピペットホルダ３５のパイプに固定されている。ドライブユニット４５がピペットホルダ３５のホルダグリップ３６とスライドベース４０との間に位置することにより、インジェクションピペット１の先端に効率的に力を伝えることができる。尚、ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６とドライブユニット４５との間に、スライドベース４０を取り付けるようにしてもよい。
　圧電微小駆動装置３０には、圧電素子４８を制御するコントローラ５４と、コントローラ５４に接続され、圧電素子４８の駆動条件を設定する表示パネル（図示せず）と、圧電素子４８を駆動するスイッチ（図示せず）とが備えられている。
　コントローラ５４は、例えば圧電素子４８に印加する振動数であるスピード(図面にSpeedと記す。)と、圧電素子４８に印加する振動の大きさであるインテンシティー（図面にIntensityと記す。）によって圧電素子４８を制御する。コントローラ５４は、一例としてスピードが１から１６、インテンシティーが１から１６を設定することができ、出力の最小値は１であり、最大値は１６である。コントローラ５４の設定値に対する圧電素子４８への出力は、リニアに変化する。
　インジェクションピペット１は、圧電素子４８の駆動によって圧電素子４８に連結された慣性体４９による衝撃力により微小駆動される。尚、圧電素子４８の駆動による慣性体４９によるインジェクションピペット１に発生する衝撃力に関する詳細は公知であり、特許文献１の特公平６－９８５８２等に開示されているため、説明は省略する。尚、圧電素子４８は、電歪素子であっても同様にインジェクションピペット１を慣性体４９の衝撃力により微小駆動が可能である。
　また、図３に示すように、ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６と反対側の端部には、チューブ５３を介して空圧式インジェクタ５２が接続されている。空圧式インジェクタ５２から供給される空気は、ドライブユニット４５、ピペットホルダ３５を流れてインジェクションピペット１の他端に供給される。
　空圧式インジェクタ５２は、チューブ５３をドライブユニット４５に接続するのみであり、吸引と吐出を微妙に調整することが可能である。このため、インジェクタとして空圧式インジェクタは好適である。尚、インジェクタとして空圧式インジェクタに代えて、液圧式インジェクタを用いてもよい。
　以上の構成からなる圧電微小駆動装置３０では、インジェクションピペット１は先端側に主テーパ部を有し、主テーパ部よりさらに先端側において、内周面のテーパ角度が主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を設けることにより、内周面が先端に向かって縮径されるため、インジェクションピペット内の培養液等の流れを調整することできインジェクタの操作性が向上する。
　また、インジェクションピペット１の先端テーパ部は、先端に熱を加えてガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部を有し、熱収縮部は先端を丸めた曲面となって先端の内径が狭くなるため、インジェクタによる培養液等の吸引と吐出とを微妙に調節できるようになり、ピエゾＩＣＳＩ法におけるマイクロマニピュレータのインジェクタの操作性が向上する。
　［培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性の測定］
　次に、本発明のインジェクションピペットを用いた培養液量の違いによるＰＭＭの卵子透明体への穿刺性、操作性の実験評価について述べる。尚、以下に示す穿刺性の測定は、インジェクションピペットにオペレーションリキッドを使用することなしに、培養液量等で卵子透明体に穿刺可能であるかを測定したものである。
　図４は、本発明に係るインジェクションピペットによるブタ卵子透明体への穿刺性、操作性の測定評価フローを示す図である。
　最初に、哺乳類おける卵細胞質内注入法での卵子透明体への穿刺の準備及び操作について述べる。尚、以下に述べる卵細胞質内注入法での卵子透明体は、哺乳類としてブタを用いたものである。卵細胞質内注入法は、圧電素子４８（ピエゾ）を使用した圧電微小駆動装置３０を用いており、圧電微小駆動装置３０は、顕微鏡に設けられたＸＹＺθマニピュレータ５５に取り付けられている。
　使用する卵子６０（図１２に示す）を固定するためのホールディングピペット６８をピペットホルダ（図示せず）に取り付ける。その際、液圧式タイプのインジェクタに接続されている場合には、ピペットホルダ内のオイルを排出し気泡をしっかりと排出した後にホールディングピペット６８を取り付けるが、空圧式インジェクタ５２の場合はそのまま取り付ける。
　図４に示すように、インジェクションピペット１をＰＭＭに取り付ける（ステップＳ１）。使用したインジェクションピペット１は２種類であり、一方のインジェクションピペット１は、８５管、先端外径の大きさが６μｍ、主テーパ部３のみのパラレルタイプP、先端形状がフラットＦであり、これを８５－６－P－Ｆと称す。
　他方のインジェクションピペット１は、９０管、先端外径の大きさが５μｍ、主テーパ部３の先端側に先端テーパ部７を有するラディッシュタイプＲＤ、先端形状が少ない丸めタイプＲであり、これを９０－５－ＲＤ－Ｒと称す。
　図３に示すように圧電微小駆動装置３０の先端には、インジェクションピペット１とピペットホルダ３５とを接続するホルダグリップ３６が設けられている。圧電微小駆動装置３０に取り付けられたピペットホルダ３５のホルダグリップ３６をインジェクションピペット１を取り付けるために緩める。
　ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６と反対側に位置する端部側に空圧式インジェクタ５２が接続されている場合には、圧電微小駆動装置３０が取り付けてあるピペットホルダ３５のホルダグリップ３６を緩めて、そのままインジェクションピペット１を取り付ける。
　インジェクションピペット１をホルダグリップ３６内の４連になっているO（オー）リングを貫通するように挿入してホルダグリップ３６をしっかりと締め付ける。最初に、ＰＭＭに取り付けた８５－６－Ｐ－Ｆのインジェクションピペット１を７％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）液でリンスし、リンス後にＰＶＰ液を吐き出す（ステップＳ２）。
　ＰＶＰ液を吐き出した後に、培養液であるＰＺＭドロップに移動して、空圧式インジェクタ５２を操作して、培養液であるＰＺＭ（Porcine　Zygote　Medium）をインジェクションピペット１先端から５ｍｍ吸引する（ステップＳ３）。
　次に、インジェクションピペット１の先端にミネラルオイルを吸引する（ステップＳ４）。吸引したミネラルオイルは、異なる液の境界を示す指標としてオイル玉の形状を有している。
　ミネラルオイルを吸引後に、インジェクションピペット１の先端からインジェクションピペット１の曲げ部２５の１ｍｍの位置までＰＶＰ液を吸引する（ステップＳ５）。
　次に、ブタ卵子透明体に穿刺の測定を行う（ステップＳ６）。穿刺の測定は、最初に注入操作を行う卵子６０の第一極体６６（図１２（ａ）参照）を６時もしくは１２時の位置にホールディングピペット６８によって保持する。
　コントローラ５４により圧電素子４８の振動回数、振動の強度の大きさの駆動設定を行う。最初に圧電素子４８の振動回数であるスピード（Speed）を２に設定する。インジェクションピペット１先端が透明帯６１に軽く接触した状態で、圧電素子（ピエゾ）４８を駆動させ、インジェクションピペット１が透明帯６１に刺さり、透明帯６１に穴が開くことを確認し、透明帯６１に穴が開いたときのインテンシティー（Intensity）の値を測定する。インジェクションピペット１の先端にＰＶＰ液を吸引した状態をＰＶＰ＋と記す。
　さらに、透明帯６１にインジェクションピペット１の先端を軽く押し当てた状態でのインジェクタの操作性の確認を行って、インジェクタの操作性を１から５の５段階で評価をする（ステップＳ７）。５段階の評価は、５については何の問題もなくインジェクションピペット１内に精子等を吸引したり、ピペット外に排出したりする操作が行えることを示す。４は、操作に多少の注意が必要であることを示す。３は、４や５に比べると注意を払いながら操作が必要になるが、穿刺操作等のコントロールが可能であることを示す。２や１は、穿刺操作等のコントロールが難しく操作ができないレベルを示す。
　次に、オイル玉を指標に、インジェクションピペット１からＰＶＰ液を排出し、先端を培養液（ＰＺＭ）に置き換える（ステップＳ８）。ＰＶＰ液を排出して先端を培養液（ＰＺＭ）に置き換えた状態をＰＶＰ－と記す。
　次に、ステップＳ６と同様の操作により穿刺の測定を行う（ステップＳ９）。ステップＳ７と同様の操作によりインジェクタの操作性の確認を行って、５段階の評価をする（ステップＳ１０）。
　次に、ステップＳ３に移行して先端からＰＺＭを７ｍｍ吸引する。以下同様に先端からＰＺＭを１０、１２、１３、１５ｍｍ吸引するようにして穿刺性の測定をステップＳ３から繰り返す（ステップＳ１１）。
　また、圧電素子４８の振動回数であるスピードを５に設定して、ステップＳ３から同様の実験評価を行う。
　さらに、９０－５－ＲＤ－Ｒのインジェクションピペット１についても、同様の卵子透明体への穿刺性、インジェクタの操作性の実験評価を行う。
　［培養液量の違いによる穿刺性の測定の結果］
　以下にインジェクションピペット毎の先端から培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性の測定結果を図５を用いて説明する。図５は、インジェクションピペット１内に吸引した培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はコントローラのスピード２における穿刺可能なコントローラのインテンシティー値の測定結果、（ｂ）はコントローラのスピード５における穿刺可能なコントローラのインテンシティー値の測定結果である。
　図５に示すＰＭＭの穿刺性の測定結果を示すグラフの横軸は、吸引した培養液量のインジェクションピペット１の先端からの各距離（幅）を示し、グラフの縦軸は、コントローラのインテンシティーの数値を示す。
　図５（ａ）に８５－６－Ｐ－Ｆ／ＰＶＰ＋で示すように、８５－６－Ｐ－ＦのインジェクションピペットではSpeed値２の設定条件で、インジェクションピペット先端からの培養液の量を５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１６．０、培養液の量を７ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１５．０、培養液の量を１０ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１１．０、培養液の量を１２ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が６．５、培養液の量を１３ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が５．５、培養液の量を１５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が５．０の設定でブタ卵子への穿刺が行えた。
　図５（ａ）に８５－６－Ｐ－Ｆ／ＰＶＰ－で示すように、８５－６－Ｐ－Ｆのインジェクションピペット内のオイル玉の前のＰＶＰ液を排出して培養液（ＰＺＭ）に置き換えた場合、Speed値２の設定条件で、インジェクションピペット先端からの培養液の量を５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１４．０、培養液の量を７ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が７．０、培養液の量を１０ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が４．０、培養液の量を１２ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が２．５、培養液の量を１３ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が２．０、培養液の量を１５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１．５の設定でブタ卵子への穿刺が行えた。
　また、図５（ｂ）に８５－６－Ｐ－Ｆ／ＰＶＰ＋で示すように、８５－６－Ｐ－Ｆのインジェクションピペットは、Speed値５の設定条件で、インジェクションピペット先端からの培養液の量を５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１４．０、培養液の量を７ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１２．０、培養液の量を１０ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が９．０、培養液の量を１２ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が６．０、培養液の量を１３ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が５．０、培養液の量を１５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が４．５の設定でブタ卵子への穿刺が行えた。
　図５（ｂ）に８５－６－Ｐ－Ｆ／ＰＶＰ－で示すように、８５－６－Ｐ－Ｆのインジェクションピペット内のオイル玉の前のＰＶＰ液を排出して培養液（ＰＺＭ）に置き換えた場合、Speed値５の設定で、インジェクションピペット先端からの培養液の量を５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１２．０、培養液の量を７ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が６．０、培養液の量を１０ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が３．０、培養液の量を１２ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が２．０、培養液の量を１３ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１．５、培養液の量を１５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１．５の設定でブタ卵子への穿刺が行えた。
　同様に、図５（ａ）、図５（ｂ）にインジェクションピペット９０－５－ＲＤ－ＲのＰＶＰ＋の測定結果を９０－５－ＲＤ－Ｒ／ＰＶＰ＋で、ＰＶＰ－の測定結果を９０－５－ＲＤ－Ｒ／ＰＶＰ－で示す。
　図５に示す穿刺性の測定結果からオペレーションリキッド無しで取り付けた８５－６－Ｐ－Ｆは、インジェクションピペット先端からの培養液の吸引量が１２ｍｍの幅未満の場合には、コントローラ５４のIntensity値が高くなり穿刺性が極端に低下した。また、培養液の吸引量が１２ｍｍの幅以上吸引してＰＶＰ液が含まれた場合には、穿刺性がやや改善することが確認された。
　オペレーションリキッド無しで取り付けた９０－５－ＲＤ－Ｒは、培養液の吸引量が７ｍｍの幅以上あれば穿刺性が向上し、ＰＶＰ液が含まれていても穿刺性は安定していた。
　以上述べたように、試験によりオペレーションリキッド無しで取り付けたインジェクションピペットのセッティング条件として培養液の吸引量による影響を調べた結果、培養液を１２ｍｍの幅以上吸引すれば、両ピペットともに穿刺性が安定したものの、９０－５－ＲＤ－Ｒは培養液の吸引量が７ｍｍの幅以上で穿刺性が向上して安定するため、９０－５－ＲＤ－Ｒが８５－６－Ｐ－Ｆと比較して優位であることが分かった。
　供試した２種類のインジェクションピペットの差は、ガラス管肉厚、テーパ部分の形状および先端形状が異なるが、テーパ部がラディッシュタイプＲＤのインジェクションピペットである９０－５－ＲＤ－Ｒはオペレーションリキッド無しでの穿刺性が格段に安定している。
　８５－６－Ｐ－Ｆは、テーパ部分が緩やかに細くなる形状により、先端からの吸引している培養液の幅は９０－５－ＲＤ－Ｒと同じでも、実際の培養液容量は少なくなるため穿刺性が低くなることが実験結果から分かった。
　さらに、９０－５－ＲＤ－Ｒ及び８５－６－Ｐ－Ｆの両インジェクションピペットピペットは、培養液を多く吸引すれば穿刺性を得ることはできるものの、ＰＶＰ液が含まれる条件でのインテンシティーの値が低いこと等の安定性と、培養液を吸引する時間等のセッティングに要する手間を考慮すると９０－５－ＲＤ－Ｒの方が実用性が格段に高い。
　［培養液量の違いによる操作性］
　次に、図５に示すインジェクションピペット内に吸引した培養液量の違いによるインジェクタの操作性について説明する。このインジェクタの操作性とはインジェクタによるインジェクションピペット内への培養液等の吸引と吐出といった微妙な操作についての操作性を意味する。
　図６は、インジェクションピペット内に吸引した培養液量の違いによる空圧式インジェクタの操作性の評価結果を示す図である。
　図６に示すように、評価したインジェクションピペット８５－６－Ｐ－Ｆ、９０－５－ＲＤ－Ｒにおける培養液の吸引量に対する先端にＰＶＰ液を吸引した場合（ＰＶＰ＋と記す）とＰＶＰ液を排出した場合（ＰＶＰ－と記す）での評価結果を１から５までの５段階で示す。
　図６に示すように、空圧式インジェクタでの操作について培養液の吸引量による差は認められなかったが、ＰＶＰ液が含まれない場合には、８５－６－Ｐ－Ｆの方がインジェクタの操作性がやや低下し、９０－５－ＲＤ－Ｒの方が安定していた。
　これにより、ブタ卵子透明体に対する穿刺性、インジェクタの操作性とも９０－５－ＲＤ－Ｒが８５－６－Ｐ－Ｆより優れていることが判明した。即ち、９０管、先端テーパ部がラディッシュタイプＲＤ、先端形状が少ない丸めタイプＲを有するインジェクションピペットが好適である。
　以上のように、図５及び図６に示すインジェクションピペット１内に吸引した培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性及びインジェクタの操作性の測定結果を考慮すると、培養液はこれまでのオペレーションリキッドと同程度（インジェクションピペット内で１０～１５ｍｍに相当する量）の量を用いれば、本発明に係るインジェクションピペット１の形状と組み合わせることにより、オペレーションリキッド無しで穿刺効果を発揮することが確認できた。
　尚、培養液については、ブタ穿刺用のＰＺＭを用いた例を説明したが、哺乳種によって培養液の種類は異なるものの、本発明に係るインジェクションピペット１は培養液の違いによる穿刺性能にほとんど影響を与えないことを確認した。
　［インジェクションピペットの穿刺性能評価］
　次に、超薄肉ガラス９０管を用いて作製した９０－５－ＲＤ－Ｒのインジェクションピペット１をオペレーションリキッド無しの条件でピエゾマイクロマニピュレータ（ＰＭＭ）に使用した場合の穿刺性能を評価した。同様に８５管で作製した先端外径の大きさが６μｍ、主テーパ部のみで構成されたパラレルタイプＰ、先端形状が大きい丸めタイプＨＲからなる８５－６－Ｐ－ＨＲのインジェクションピペットについてもオペレーションリキッド無しの条件でＰＭＭの穿刺性能の評価試験を行った。穿刺性能の評価は、図７に示すように、Ｃ１、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４の５つの試験区に区分して、各試験区でのブタ卵子透明帯への穿刺操作のコントローラ５４のSpeed、Intensityの数値を調査した。
　セッティングが完了したインジェクションピペット９０－５－ＲＤ－Ｒを用いてブタ卵子に対して試験区Ｃ１、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３の設定条件で穿刺操作を行った。
　各試験区の概要をまず説明する。試験区Ｃ１は、９０－５－ＲＤ－Ｒのインジェクションピペット１の先端に少量のオイル玉（小オイル玉とも記す。)を吸引し、小オイル玉を吸引後にさらに多量の培養液を吸引して、小オイル玉をインジェクションピペット曲げ位置部分で保持した状態である。曲げ位置部分とは、インジェクションピペットの先端から約１ｍｍであり、以下及び図７において「後方」として示す。試験区Ｔ１では、小オイル玉のインジェクションピペット内での位置を後方のみならず、インジェクションピペットの先端付近にした状態でも穿刺操作をおこなった。インジェクションピペットの先端付近とは、インジェクションピペットの先端から約５００μｍであり、以下及び図７において「前方」として示す。試験区Ｔ２は、オイル玉の量を試験区Ｃ１の１０倍に増やして、インジェクションピペット内のオイル玉が前方及び後方に位置する状態である。試験区Ｔ３は、インジェクションピペット内に培養液の代わりにＰＶＰ液を多量に吸引した場合の状態である。このように、試験区Ｔ３は、試験区Ｃ１の多量の培養液に代えて多量のＰＶＰ液を吸引した状態である。
　次に、セッティングが完了したインジェクションピペット８５－６－Ｐ－ＨＲを用いて試験区Ｔ４の条件でのブタ卵子透明帯への穿刺操作を行いSpeedおよびIntensityの数値を調査した。また、先端形状が小さい丸めタイプＲからなる８５－６－Ｐ－Ｒのインジェクションピペットについても、ブタ卵子透明帯への穿刺性を有するかの確認を行った。試験区Ｔ４は、吸引する培養液の各量、オイル玉の各液量及びインジェクションピペット内のオイル玉が後方に位置する状態である。
　次に、各試験区の詳細な結果を説明する。図７は、オペレーションリキッド無しでのブタ卵子透明体の穿刺性の測定結果を示す図である。図７に示すように、試験区Ｃ１では、９０管を用いて作製した９０－５－ＲＤ－Ｒのインジェクションピペットをオペレーションリキッド無しでＰＭＭに取り付けた場合、インジェクションピペット内に多量の培養液を吸引し、少量のオイル玉（小オイル玉）を吸引し、小オイル玉の位置を後方とした条件で、Intensity値３．５－４．５、Speed値５の設定でブタ卵子への穿刺でき、インジェクタの操作性も安定させることができた。
　試験区Ｔ１では、インジェクションピペット内の小オイル玉の位置を（Ａ）の後方で保持した場合には、Intensity値１．５、Speed値８で穿刺ができたが、オイル玉の位置を（Ｂ）の前方で保持した場合には、Intensity値１．５、Speed値８で穿刺できず、同等の穿刺性は得られなかった。
　試験区Ｔ２では、インジェクションピペット内のオイル玉の量が試験区Ｃ１の約１０倍であってもオイル玉の位置を（Ａ）の後方で保持すれば、少量のオイル玉と同様の穿刺性能が得られた。オイル玉が大きい場合も、オイル玉の位置を（Ｂ）の前方で保持した場合には、穿刺できず穿刺性能が低下したが、（Ｃ）のようにオイル玉の位置を前方としてもコントローラ５４のIntensityの設定値を３．５に上げることで穿刺することができた。
　試験区Ｔ３では、（Ａ）のようにインジェクションピペット内の培養液をＰＶＰ液に入れ換えて小オイル玉の位置が後方の場合には、Intensity値５．０、Speed値３であり培養液の場合に比べて穿刺性能が低下した。また、（Ｂ）は同様に小オイル玉の位置が後方で、Intensity値３．５、Speed値８であり培養液の場合に比べて穿刺性能が低下した。
　試験区Ｔ４では、８５管を用いて作製した８５－６－Ｐ－ＨＲを用い、かつ、（Ａ）から（Ｅ）の何れもオイル玉の位置を後方として穿刺操作を行った。ピペット内環境（Ａ）のオペレーションリキッド無し大量の培養液と少量のオイル玉（小オイル玉）を吸引した条件で穿刺テストを行った結果、Intensity値は４．５、Speed値５で穿刺ができた。ピペット内環境（Ｂ）のさらに培養液を多量に吸引することでIntensity値３．０、Speed値５の設定で穿刺でき、ピペット内環境（Ｃ）のようにSpeed値を８まで上げた場合、Intensity値２．０から２．５で穿刺が行えた。さらにピペット内環境（Ｄ）のように、オイル玉の量を試験区Ｃ１の２倍とすると、Speed値を８まで上げた場合、Intensity値２．５から３．０で穿刺が行えた。これら（Ａ）から（Ｄ）に対してピペット内環境（Ｅ）に示すように、小オイル玉で、培養液を少量にした場合には、Intensity値８．０、Speed値８まで上げても穿刺できなかった。
　また、８５管を用いて作製した８５－６－Ｐ－Ｒを用いてオペレーションリキッド無しで、図７に示す試験区Ｔ４におけるピペット内環境（Ａ）と同一条件で穿刺テストを行った結果、Intensity値は４．５から５．５、Speed値５で穿刺が行えた。
　このように、９０－５－ＲＤ－Ｒのインジェクションピペットを使用した試験区Ｃ１と試験区Ｔ３との結果から、インジェクションピペット内に培養液を多量に吸引した場合には、インジェクションピペット内にＰＶＰ液を多量に吸引した場合と比較して、穿刺性能が高いことが分かった。
　また、試験区Ｔ１と試験区Ｔ２との結果から、ミネラルオイルからなるオイル玉のインジェクションピペット内での位置によって、卵子への穿刺性に影響を及ぼすことが判明した。即ち、オイル玉の位置がインジェクションピペットの先端付近である前方では、穿刺性が低下する。そのため、実際の運用にあたってはこの点について留意する。
　また、試験区Ｔ４の結果から、インジェクションピペット内に少量の培養液を吸引した場合には、穿刺できないことが分かった。
　次に、各種のガラス管素材におけるインジェクションピペット１の穿刺性、インジェクタの操作性の測定評価結果について述べる。
　図８は、各種のインジェクションピペット１の穿刺性、インジェクタの操作性の測定評価結果を示す図である。尚、測定評価は、７５管、８５管、９０管について行った。
　ＰＭＭに７５管で作製した７５－７－Ｐ－Ｆインジェクションピペットをオペレーションリキッド無しで取り付けて、インジェクションピペット先端から多量の培養液を吸引し、少量のオイルを吸引した後にＰＶＰ液を曲げ部２５まで吸引してブタ卵子透明帯へ穿刺テストを行った。図８に示すように、ＰＶＰの有無の欄に＋と記す７５－７－Ｐ－Ｆの先端にＰＶＰ液を吸引した状態では、Speed値２、Intensity値１６．０の設定でブタ卵子への穿刺でき、Speed値を５まで上げた場合、Intensity値１５．０で穿刺できた。ＰＶＰの有無の欄に－と記すＰＶＰ液を排出して先端を培養液（ＰＺＭ）に置き換えた状態では、Speed値２、Intensity値１２．０の設定でブタ卵子への穿刺でき、Speed値を５まで上げた場合、Intensity値９．０で穿刺できた。
　また、図８に示すように、８５管で作製したインジェクションピペットの先端の形状がフラットＦを有する８５－６－Ｐ－Ｆと先端の形状が少ない丸めタイプＲを有する８５－６－Ｐ－Ｒとでは、先端を丸めた８５－６－Ｐ－Ｒが、先端がフラットＦの８５－６－Ｐ－Ｆに比べてIntensity値が低くなり、穿刺性が向上した。
　また、図８に示すように、９０管で作製したインジェクションピペット９０－５－ＲＤ－Ｒは、オペレーションリキッド無しでＰＭＭに取り付けた場合、ＰＶＰが＋では、Speed値２、Intensity値４．５で穿刺でき、Speed値を５まで上げた場合、Intensity値３．０で穿刺できた。ＰＶＰが－では、Speed値２、Intensity値２．５の設定でブタ卵子への穿刺でき、Speed値を５まで上げた場合、Intensity値２．０で穿刺できた。
　このように、ＰＭＭにオペレーションリキッド無しで取り付けた７５－７－Ｐ－Ｆの穿刺性が、他のピペットに対して極端に低下した。一方、インジェクションピペット９０－５－ＲＤ－Ｒは、穿刺性能が他のインジェクションピペットと比べて高いことが確認できた。
　また、図８に示すように、インジェクタの操作性については、７５管、８５管、９０管とも培養液の注入、抽出等のコントロールが可能であった。
　これにより、インジェクションピペット９０－５－ＲＤ－Ｒはコントローラ５４のインテンシティーが小さい値で使用することができるため穿刺性が良く、インジェクタの操作性も良いことが判明した。
　［各種インジェクションピペットによる卵細胞質膜の伸展性の測定］
　次に、各種のインジェクションピペットによる卵細胞質膜の伸展性に関する測定結果について述べる。
　図９は、各種のインジェクションピペットの卵細胞質膜の伸展性の測定結果を示す図である。 卵細胞質膜の伸展性の測定は、インジェクションピペット１にオペレーションリキッドを使用すること無く、培養液等で行ったものである。
　図９に示すように、使用したインジェクションピペット１は、素材が９０管、先端外径が１０μｍであり、主テーパ部３の形状はＲＤ（ラディッシュタイプ）とＰ（パラレルタイプ）とであり、それぞれの先端形状がＦ、Ｒ、ＨＲであり、合計６種類からなる。それぞれのインジェクションピペット１に対して試験を４回行い、オペレーションリキッド無しでの穿刺操作を行い、操作卵子数、生存卵子数を集計して、膜脆弱の卵子の数を数えた。
図９に示すように、インジェクションピペット１にオペレーションリキッドを使用しないＰＭＭでは、「膜脆弱の穿刺％」はテーパ形状がＲＤで先端形状がＦでは、４０％以上であったが、先端形状がＲ、ＨＲでは、先端形状がＦの半分の２０％前後であった。また、テーパ形状がＰで先端形状がＲ、ＨＲでは、先端形状Ｆと比較して、「膜脆弱の穿刺％」が低い割合であり、特に、先端形状がＨＲでは、優位性が見られた。
　また、卵子数の「生存率」は、テーパ形状がＲＤ、Ｐで、その先端形状がＲ、ＨＲのインジェクションピペットが高い割合であり、テーパ形状がＲＤでは、９９．０％である。
　これにより、インジェクションピペット１にオペレーションリキッドを使用しないＰＭＭでは、テーパ形状がＲＤであり、又は、先端形状がＲ、ＨＲのインジェクションピペット１が卵子生存率の向上に有効であることが確認された。
　また、インジェクションピペットの先端形状を丸めることで、顕微授精を行う際に老化卵子（高齢の女性に見られる卵子）の脆弱な卵細胞質膜を十分に伸展させることが可能となり、精子注入後の卵子生存率が低下するとの課題を改善することが期待できる。
　［オペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精の結果］
　次に、インジェクションピペット内にオペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精の結果について説明する。
　図１０は、インジェクションピペット内にオペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精の結果を示す図である。インジェクションピペット１は、先端をファイアーポリッシュにより少ない丸め加工を行った９０－１０－ＲＤ－Ｒと先端をファイアーポリッシュにより大きい丸め加工を行った９０－１０－ＲＤ－ＨＲの２種類を用いた。
　図１０に示すように、９０管を用いて作製した９０－１０－ＲＤ－Ｒおよび９０－１０－ＲＤ－ＨＲを用いてオペレーションリキッドを充填せずに培養液を吸引した条件で顕微受精を行った結果、ブタ卵子透明帯（zona)を穿刺できたＰＭＭの条件は、両ピペットともにIntensity値は３．５－５．０、Speed値５－８だった。卵細胞質膜(membrane)は、両ピペットともにIntensity値は４．０、Speed値１で穿刺が行えた。
　また、顕微受精後の生存率は両ピペットともに、１００％だった。顕微受精した卵子を６日間体外培養した結果、両区ともに胚盤胞まで発生した胚が観察された。胚盤胞発生率は、９０－１０－ＲＤ－Ｒの方が高い結果となった。
　これにより、オペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精を行った結果、インジェクションピペットとして９０－１０－ＲＤ－Ｒが優位であることが分かった。
　［オペレーションリキッドの有無でのインジェクションピペットの形状の違いによる胚盤胞発生率の差異について］
　更に、ピエゾＩＣＳＩ法におけるオペレーションリキッドの有無でのインジェクションピペットの形状の違いによる胚盤胞発生の優位性を明確にすべく、PMMを用いたブタ顕微授精を行い、ブタ顕微授精後における胚盤胞発生率の測定を基に　インジェクションピペットの評価を行った。
　評価に用いたインジェクションピペット１は、９０管、先端外径が１０μｍ、テーパ形状がＲＤ、Ｐであり、それぞれの先端形状がＨＲ、Ｒ、Ｆからなる９０－１０－ＲＤ－ＨＲ、９０－１０－ＲＤ－Ｒ、９０－１０－ＲＤ－Ｆ、９０－１０－Ｐ－ＨＲ、９０－１０－Ｐ－Ｒ、９０－１０－Ｐ－Ｆの６種類及び、７５管、先端外径が１２μｍ、テーパ形状がＰであり先端形状がＦからなる７５－１２－Ｐ－Ｆの１種類の合計７種類である。７種類のインジェクションピペット１でオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精を行い、胚盤胞発生率の評価を行った。
　［ブタ顕微授精の操作手順］
　以下にオペレーションリキッドの有無でのインジェクションピペットによるブタ顕微授精の操作手順の概要を説明する。
　オペレーションリキッド有りのインジェクションピペットで使用するＩＣＳＩ用のシャーレは、その中心に１０－２０μｌの高浸透圧ＰＺＭ（ｈＰＺＭ）のドロップを１つ、リンス用、精子懸濁用の７％ＰＶＰ液のドロップを２つ作製し、ミネラルオイルでカバーして作製した。
　オペレーションリキッド無しのインジェクションピペットで使用するＩＣＳＩ用のシャーレは、その中心に１０－２０μｌのｈＰＺＭのドロップを１つ、インジェクションピペットのセッティング用ＰＺＭのドロップを1つ、リンス用、精子懸濁用の７％ＰＶＰ液のドロップを２つ作製し、ミネラルオイルでカバーして作製した。
　尚、高浸透圧ＰＺＭ（ｈＰＺＭ）は、ＰＺＭにソルビトールを添加して、浸透圧をＰＺＭより多少高めたものである。顕微授精操作で、卵子が入った培養液に高浸透圧ＰＺＭ（ｈＰＺＭ）を使用する理由は、卵細胞質を少し収縮させて、第一極体の観察と卵子核の位置の把握とを容易にするためであり、また、透明帯と卵細胞質との隙間に位置する囲卵腔を大きくするためである。囲卵腔を大きくすることにより、ＰＭＭを駆動させて透明帯を穿刺した際に、囲卵腔が衝撃をやわらげて卵細胞質膜にダメージを与えるのを防ぐことができる。通常のＰＺＭは、オペレーションリキッド無しでのセッティングにインジェクションピペット内に大量に吸引して培養液として使用される。
　作製したシャーレは、使用する１－２時間前にはインキュベータ内で３７－３８．５℃に保温し、保温したシャーレのｈＰＺＭのドロップに操作するブタ体外成熟卵子を移した。また、精子懸濁用の７％ＰＶＰ液のドロップに精子液を適量入れて懸濁し、ＩＣＳＩ操作のシャーレを準備した。
　オペレーションリキッド有りのインジェクションピペットのセッティングは、圧電素子からの衝撃力をインジェクションピペットの先端に効率よく伝えるために、ピペットホルダに取り付ける前に、予めオペレーションリキッド（フロリナート）を吸引したマイクロピペッターを用いてインジェクションピペットの中心付近にオペレーションリキッド（フロリナート）を約１から１．５ｃｍの幅で充填した。
　オペレーションリキッド有りのインジェクションピペットは、ピペットホルダに取り付け後に、最初にリンス用の７％ＰＶＰ液のドロップに落としこみ、インジェクタにより吸引・排出を繰り返し、操作性を確認すると同時にインジェクションピペットの内外をリンスした。
　オペレーションリキッド無しのインジェクションピペットは、ピペットホルダに取り付け後に、インジェクションピペット内にＰＺＭを吸引し、その後ミネラルオイルを吸引し、液境界用のオイル玉を形成した。リンス用７％ＰＶＰ液のドロップに移動し、インジェクタにより吸引・排出を繰り返し、オイル玉の動きを指標にして操作性を確認すると同時にインジェクションピペットの内外をリンスした。
　以下の操作は、オペレーションリキッド有りのインジェクションピペット、オペレーションリキッド無しのインジェクションピペットとも同様である。
　インジェクションピペットを精子が懸濁された７％ＰＶＰ液のドロップに移動して、精子不動化の操作を開始した。精子は、動きが活発で頭部および尾部に付着物がない物を選別した。精子の不動化は、インジェクションピペット内に精子を尾部から吸引して排出する際、尾部にインジェクションピペット先端を触れさせながら、ＰＭＭを駆動し、精子を不動化する方法を用いた。
　完全に動きの止まったことを確認した精子をインジェクションピペット内に吸引し、卵子への注入操作に用いた。
　精子をインジェクションピペット内に吸引後に、精子が含まれる７％ＰＶＰ液から卵子への注入操作を行うｈＰＺＭドロップへ移動した。
卵子への穿刺は、図１２に示す卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのピエゾＩＣＳＩ法により、卵子細胞質内への顕微注入操作を行った。
　卵子に精子を注入後、インジェクションピペットを引き抜き、生存した卵子の数を確認した。生存した卵子は培養用のＰＺＭドロップに移し、５％Ｏ2、５％ＣＯ2、２０％Ｎ2の条件のインキュベータで６日間体外培養した。体外培養したＩＣＳＩ胚は、６日目で顕微鏡観察し、胚盤胞まで発生した個数を計数した。
　［ブタ顕微授精での胚盤胞発生率の評価結果］
　次に、インジェクションピペットの形状の違いによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における胚盤胞発生率の評価結果について説明する。
　図１１は、７種類の形状のインジェクションピペットによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における生存卵子数とその割合（卵子生存率（％））及び胚盤胞発生数とその割合（胚盤胞発生率（％））の結果を示す図である。図１２は、図１１に示す７種類の形状のインジェクションピペットによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における胚盤胞発生率の結果をグラフで示す図である。
　尚、図１１におけるＯＬの有無の＋及び図１２に示すＯＬ＋は、ブタ顕微授精でインジェクションピペット内部にオペレーションリキッドを充填して穿刺操作を行ったこと（ＯＬ有りと記す）を示し、図１１におけるＯＬの有無の－及び図１２に示すＯＬ－は、インジェクションピペット内部にオペレーションリキッドを使用しないで穿刺操作を行ったこと（ＯＬ無しと記す）を示す。
　［インジェクションピペット毎のＯＬの有無による胚盤胞発生率の影響］
　図１１に、テーパ形状及び先端形状の異なる各種のインジェクションピペットにおけるＯＬの有無におけるＩＣＳＩ操作に使用した卵子数（図１１に示す操作卵子数）及び生存した卵子の数（図１１に示す生存卵子数）とその割合（卵子生存率（％））を示す。また、胚発生の欄には、使用した培養胚数及び胚盤胞発生数とその割合（胚盤胞発生率）を示す。
　図１１及び図１２に示すように、９０－１０－ＲＤ－ＨＲ、９０－１０－ＲＤ－Ｒ、９０－１０－Ｐ－ＨＲ及び９０－１０－Ｐ－ＲにおけるそれぞれのＯＬ有り（ＯＬ＋）とＯＬ無し（ＯＬ－）でのブタ顕微授精後の胚盤胞発生率は、ＯＬ有りとＯＬ無しとの差が少なく、ほぼ同一の値であった。
　また、９０－１０－ＲＤ－Ｆ及び９０－１０－Ｐ－ＦにおけるそれぞれのＯＬ有りとＯＬ無しでのブタ顕微授精後の胚盤胞発生率は、顕著な差はなかったが、９０－１０－ＲＤ－Ｆ及び９０－１０－Ｐ－Ｆはともに、胚盤胞発生率はＯＬ有りの方が高くなる傾向が見られた。
　また７５－１０－Ｐ－Ｆにおいては、ＯＬ有りとＯＬ無しでのブタ顕微授精後の胚盤胞発生率は、顕著な差があり、胚盤胞発生率は、ＯＬ有りが高くなることが明らかとなった。一方、７５－１２－Ｐ－ＦのＯＬ無しは、卵子への穿刺能が低く、作出できた顕微授精胚は、胚盤胞まで発生しなかった。
　［インジェクションピペットの形状及びＯＬの有無の組み合わせによる胚盤胞発生率の影響］
　９０－１０－ＲＤ－ＨＲ及び９０－１０－ＲＤ－Ｒは、それぞれのＯＬ有り、ＯＬ無しともに、胚盤胞発生率が高くなった。特に、９０－１０－ＲＤ－ＨＲのＯＬ有り、ＯＬ無し及び９０－１０－ＲＤ－ＲのＯＬ無しにおける胚盤胞発生率は、９０－１０－Ｐ－ＦのＯＬ有り、ＯＬ無しの胚盤胞発生率及び７５－１２－Ｐ－ＦのＯＬ無しの胚盤胞発生率と比較して、顕著に高くなることが確認された。即ち、胚盤胞発生率に対して９０－１０－ＲＤ－ＨＲ及び９０－１０－ＲＤ－Ｒは、ＯＬ無しでも効果があることが確認された。
　また、７５－１２－Ｐ－ＦのＯＬ有りの胚盤胞発生率は、９０－１０－ＲＤ-ＨＲ及び９０－１０－ＲＤ-ＲのＯＬの有無の胚盤胞発生率と同様に高い割合であり、９０－１０－Ｐ-ＦのＯＬの有無の胚盤胞発生率及び７５－１２－Ｐ－ＦのＯＬ無しの胚盤胞発生率に比べて顕著に高くなった。
　また、７５－１２－Ｐ－ＦのＯＬ無しの胚盤胞発生率は、卵子への穿刺能が低く、作出できた顕微授精胚は、胚盤胞まで発生しなかった。
　このように、オペレーションリキッド（ＯＬ）を充填しないＯＬ無しの９０－１０－ＲＤ－ＨＲ、９０－１０－ＲＤ－Ｒ、９０－１０－Ｐ－ＨＲ及び９０－１０－Ｐ-Ｒを用いたピエゾＩＣＳＩ法は、従来のオペレーションリキッドＯＬを充填したインジェクションピペットの場合と同等の結果であり、先端をポリッシュするＨＲ、Ｒの形状は、ＯＬ無しでもピエゾマイクロマニピュレータ(ＰＭＭ)で有効に使用できることが確認できた。
　特に、９０－１０－ＲＤ－ＨＲ及び９０－１０－ＲＤ－Ｒでは、ＯＬ有り、ＯＬ無しともに胚盤胞発生率が高く、ＯＬ無しはＯＬ有りと同等以上であることから、テーパ形状がラディッシュタイプ（大根型）であるＲＤの優位性が認められた。さらに、先端形状は先端を大きく丸め加工した熱収縮部であるＨＲ、先端を小さく丸め加工した熱収縮部であるＲが優位であることが分かった。
　即ち、ＯＬ無しの９０－１０－ＲＤ－ＨＲ及び９０－１０－ＲＤ－Ｒは、穿刺性能及びインジェクタ―の操作が、従来のＯＬ有りの条件と遜色なくＩＣＳＩ操作が可能となること、さらに、ＯＬ有りのようにインジェクションピペット内にオペレーションリキッドを充填する操作が必要なく、セッティングの確認に要する時間を短縮できるため、体外（インキュベータの外）での卵子及び精子の取り扱い時間を最小限にすることが可能となり、胚発生に良い結果をもたらしたものと推測される。
　一方、９０管を用いた先端がフラットの形状のピペット９０－１０－ＲＤ－Ｆ及び９０－１０－Ｐ－Ｆが、９０－１０－ＲＤ－ＨＲ、９０－１０－ＲＤ－Ｒ、９０－１０－Ｐ－ＨＲ及び９０－１０－Ｐ－Ｒに比べて胚盤胞発生率が低下した原因は、ガラス管の素材及び先端の形状が考えられる。即ち、９０管のガラス管は超薄肉のため、先端加工がフラットの９０－１０－ＲＤ－Ｆ及び９０－１０－Ｐ－Ｆの場合には、鋭利な形状となりＰＭＭの穿刺性能は高くなるが、卵細胞質膜に影響を与えていると考えられる。
　尚、９０－１０－ＲＤ－Ｆ及び９０－１０－Ｐ－ＦのＯＬ有りの方が無しに比べて、胚盤胞発生率がやや高くなったのは、ＯＬが充填されることでインジェクタの操作性が、安定したことが考えられる。さらに９０－１０－ＲＤ－Ｆの方が９０－１０－Ｐ－Ｆよりも胚盤胞発生率が高くなる傾向が認められたが、これは、ラディッシュタイプ（大根型）であるＲＤがＩＣＳＩに適したインジェクタの操作性が得られているためと推察される。このように、９０－１０－ＲＤ-ＨＲ及び９０－１０－ＲＤ－Ｒにおける胚盤胞発生率の結果からも大根型であるＲＤが有効であることが認められた。
　また、従来、マニピュレーション操作に用いられている７５管からなる先端形状がフラットな７５－１２－Ｐ－Ｆについては、ガラス管の肉厚が薄肉ではあるが、薄過ぎないため、先端形状は９０管ほど鋭利ではない。そのため、オペレーションリキッドを充填する従来のＰＭＭの使用方法であれば、十分な穿刺性能が得られ、卵細胞質膜にも影響を及ぼすことなく操作できたため、ＩＣＳＩ後、良好な胚発生が得られたものと考えられた。ただし、７５管からなるインジェクションピペットは、ガラス管の肉厚が少し厚い分、オペレーションリキッド無しの条件ではＰＭＭによる穿刺性能が大きく低下し、正確な顕微授精操作ができなかったため、その後胚盤胞まで発生しなかったと推察される。この結果からインジェクションピペットにおけるガラス管の肉厚が、穿刺性能にとって重要であることが明確となった。
　以上述べたように、本発明によれば、先端側に主テーパ部を有するインジェクションピペットは、主テーパ部よりさらに先端側において、内周面のテーパ角度が主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を設けることにより、内周面が先端に向かって縮径されるため、インジェクションピペット内の培養液等の流れを調整することできインジェクタの操作性が向上する。
　また、インジェクションピペットの先端テーパ部は、先端に熱を加えてガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部を有し、熱収縮部は先端を丸めた曲面となって先端の内径が狭くなるため、インジェクタによる培養液等の吸引と吐出とを微妙に調節できるようになり、ピエゾＩＣＳＩ法におけるマイクロマニピュレータのインジェクタの操作性が向上する。
　本発明によるインジェクションピペットは、最先端に位置する円環部がインジェクションピペットの先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、インジェクションピペットの円環部から外周面及び内周面への移行部は面取りがなされていることにより、試行錯誤の結果、卵細胞質への内圧上昇が発生しないことが判明した。これにより、穿刺性、操作性及び膜高伸展性に優れたインジェクションペットを提供することができる。
　また、本発明に係るインジェクションピペットは、そもそもの構成要素である培養液を衝撃伝達液として利用することによって、フロリナート等のオペレーションリキッドを殊更用意することなく、従来と同様のピエゾイクシー法による卵細胞質内の注入が可能となる。
　また、本発明に係るインジェクションピペットによれば、インジェクションピペット内にオペレーションリキッドを注入する必要がなく、卵細胞質内の注入工程を簡素化することができる。
　また、本発明に係るインジェクションピペットは、ＰＭＭによる卵子・胚に対して操作を行う際に確実な穿刺性能を有している。即ち、コンベンショナル法は、ピペットの形状、卵子の質および操作者の熟練度により穿刺もばらつきが発生する恐れがあるが、本発明に係るインジェクションピペットは、安定した穿刺性能により膜を十分に伸展して毎回同じような穿刺を行うことが可能である。
　また、本発明に係るインジェクションピペットは先端形状を丸めることで、老化卵子の脆弱な卵細胞質膜を十分に伸展させることが可能となり、精子注入後の卵子生存率の向上が期待できる。
　本発明に係るインジェクションピペットは、特に、穿刺性とインジェクタの操作性が重要なＤＮＡ、ＲＮＡ注入や胚盤胞へのＥＳ細胞注入に有効である。また、それらのみならず、卵細胞質内注入法に換えて、核移植における除核操作、バイオプシーによる核球採取にも有効に使用可能である。
　本発明のインジェクションピペットによれば、卵子透明帯および卵細胞質膜を穿刺することが可能となることで、精子の注入のみならず、核置換技術、体細胞クローンを作出する目的での体細胞核移植、遺伝子発現制御のためのＲＮＡ注入、遺伝子組換え動物を作出するためのＥＳ細胞注入およびＤＮＡ注入やゲノム編集技術にも応用することが可能となる。
　この発明は、その本質的特性から逸脱することなく数多くの形式のものとして具体化することができる。よって、上述した実施形態は専ら説明上のものであり、本発明を制限するものではないことは言うまでもない。
１　　　　　インジェクションピペット
３　　　　　主テーパ部
４　　　　　主テーパ部の外周面
７　　　　　先端テーパ部
９　　　　　副テーパ部
１０　　　　副テーパ部の外周面
１１　　　　副テーパ部の内周面
１２　　　　熱収縮部（先端部）
１４　　　　円環部
１９、２１　移行部
２５　　　　曲げ部
２７　　　　基部（直管部）
３０　　　　圧電微小駆動装置（ＰＭＭ）
３５　　　　ピペットホルダ
３６　　　　ホルダグリップ
４０　　　　スライドベース
４１　　　　クランプネジ
４５　　　　ドライブユニット
４７　　　　鍔部
４８　　　　圧電素子（ピエゾ）
４９　　　　慣性体
５２　　　　空圧式インジェクタ
５３　　　　チューブ
５４　　　　コントローラ
５５　　　　ＸＹＺθマニピュレータ
６０　　　　卵子
６１　　　　透明帯
６４　　　　卵細胞質膜
６５　　　　卵細胞質
６６　　　　第一極体
６７　　　　囲卵腔
６８　　　　ホールディングピペット
７０　　　　精子
７５　　　　コンベンショナルピペットの尖端部
ＣＶ　　　　コンベンショナルピペット
ＰＩ　　　　インジェクションピペット
Ｆ　　　　　フラットタイプ
Ｒ　　　　　小さい丸めタイプ
ＨＲ　　　　大きい丸めタイプ
ｄｏ１、ｄｏ２、ｄｏ３　　インジェクションピペットの外径
ｄｉ、ｄｉ１、ｄｉ２、ｄｉ３　インジェクションピペットの内径
ｄｆ１、ｄｆ２　　　　　インジェクションピペットの先端外径
ｔ１、ｔ２　　　　　　　移行部の長さ

Claims (13)

  1. 　哺乳類における卵細胞質内注入法に使用され、かつ、圧電素子の駆動によって当該圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動される先端側の外周面及び内周面がテーパ状に構成された主テーパ部を有するインジェクションピペットであって、
    　当該インジェクションピペットは、前記主テーパ部よりさらに先端側において、前記インジェクションピペットの内周面のテーパ角度が前記主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を有することを特徴とするインジェクションピペット。
  2. 　前記インジェクションピペットはガラス管であり、前記先端テーパ部は、先端に熱を加えて当該ガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部であることを特徴とする請求項１に記載のインジェクションピペット。
  3. 　前記先端テーパ部は、さらに前記熱収縮部と前記主テーパ部との間において、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面を有し、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面を有する副テーパ部を有することを特徴とする請求項２に記載のインジェクションピペット。
  4. 　前記先端テーパ部は、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面からなり、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面からなることを特徴とする請求項１に記載のインジェクションピペット。
  5. 　前記インジェクションピペットの最先端に位置する卵細胞の透明体又は卵細胞質膜に接する円環部は、前記インジェクションピペットの先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、前記インジェクションピペットの前記円環部から前記外周面及び前記内周面への移行部は面取りがなされていることを特徴とする請求項１乃至請求項４のうち、いずれか１に記載のインジェクションピペット。
  6. 　前記インジェクションピペットは、内部に注入する衝撃伝達液として培養液を利用可能であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のうち、いずれか１に記載のインジェクションピペット。
  7. 　前記インジェクションピペットの内部に注入された前記衝撃伝達液の当該インジェクションピペット先端側に隣接してミネラルオイルを吸引し、さらに当該ミネラルオイルの前記インジェクションピペット先端側に隣接して卵細胞質内に注入する液体を吸引して使用することを特徴とする請求項１乃至請求項６のうち、いずれか１に記載のインジェクションピペット。
  8. 　前記インジェクションピペットの内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きいことを特徴とする請求項１乃至請求項７のうち、いずれか１に記載のインジェクションピペット。
  9. 　前記インジェクションピペットの先端の内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きく、かつ、当該精子を前記インジェクションピペットの先端から出し入れするのに最低限必要な所定のクリアランスを前記精子の頭部の直径の値以外に有することを特徴とする請求項１乃至請求項３のうち、いずれか１に記載のインジェクションピペット。
  10. 　前記熱収縮部は前記主テーパ部によりも外径に対する内径の割合が小さいことを特徴とする請求項２又は請求項３に記載のインジェクションピペット。
  11. 　前記インジェクションピペットの前記主テーパ部における外径に対する内径の割合は８０％以上１００％未満であることを特徴とする請求項１乃至請求項１０のうち、いずれか１に記載のインジェクションピペット。
  12. 　前記圧電素子に置換して電歪素子の駆動によって当該電歪素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されることを特徴とする請求項１乃至請求項１１のうち、いずれか１に記載のインジェクションピペット。
  13. 　前記卵細胞質内注入法に換えて、核移植における徐核操作又はバイオプシーによる核球採取に使用されることを特徴とする請求項１乃至請求項１２のうち、いずれか１に記載のインジェクションピペット。
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