JP2020062054A - ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドによるキメラ抗原受容体の共刺激 - Google Patents

ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドによるキメラ抗原受容体の共刺激 Download PDF

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Abstract

【課題】ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドによるキメラ抗原受容体の共刺激の提供。【解決手段】本技術は、一般に免疫学の分野に関連し、部分的には、標的抗原に対する免疫応答を生じるＴ細胞および他の細胞を活性化するための方法に関する。本技術はまた、キメラＭｙＤ８８由来およびＣＤ４０由来のポリペプチドを使用して標的抗原を認識するキメラ抗原レセプターを発現する治療用細胞の共刺激に関する。本技術はさらに、部分的には、キメラ抗原レセプターであって、ここで上記キメラ抗原レセプターは、ＭｙＤ８８由来およびＣＤ４０由来のポリペプチドを含む内部ドメインを有するキメラ抗原レセプターを発現する治療用細胞、ならびにその改変された治療用細胞を使用して患者を処置するための方法に関する。【選択図】なし

Description

関連出願
２０１４年９月２日に出願した「Costimulation of Chimeric Antigen Receptors
by MyD88 and CD40 Polypeptides」との表題の米国仮特許出願第６２／０４４，８
８５号に対する優先権、２０１５年２月１３日に出願した「Costimulation of Chimeri
c Antigen Receptors by MyD88 and CD40 Polypeptides」との表題の米国仮特許
出願第６２／１１５，７３５号に対する優先権、および２０１５年４月６日に出願した「
Costimulation of Chimeric Antigen Receptors by MyD88 and CD40 Polypepti
des」との表題の米国仮特許出願第６２／１４３，５０３号に対する優先権を主張する。
上記出願の内容全体は、すべての本文、表および図面を含め、その全体がすべての目的で
本明細書に参考として援用される。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参考により本明細書
に援用される配列表を含む。このＡＳＣＩＩコピーは、２０１５年１０月２日に作成され
、ＢＥＬ−２０１６−ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、そのサイズは２２８，８４４バイ
トである。
分野
この技術は、一般に免疫学の分野に関連し、部分的には、標的抗原に対する免疫応答を
生じるＴ細胞および他の細胞を活性化するための方法に関する。この技術はまた、キメラ
ＭｙＤ８８由来およびＣＤ４０由来のポリペプチドを使用して標的抗原を認識するキメラ
抗原レセプターを発現する治療用細胞の共刺激に関する。この技術はさらに、部分的には
、ＭｙＤ８８由来およびＣＤ４０由来のポリペプチドを含む内部ドメインを有する、キメ
ラ抗原レセプターを発現する治療用細胞、ならびにその改変された治療用細胞を使用して
患者を処置するための方法に関する。
背景
Ｔ細胞の活性化は、病原微生物（例えば、ウイルス、細菌および寄生生物）、外来タン
パク質および環境内の有害な化学物質に対する防御免疫において、ならびにがんおよび他
の過剰増殖性疾患に対する免疫としても、重要なステップである。Ｔ細胞は、その表面上
に、細胞表面上に提示された抗原を認識するレセプター（すなわち、Ｔ細胞レセプター）
を発現する。正常な免疫応答の間、ＭＨＣ抗原提示の状況において、これらの抗原がＴ細
胞レセプターに結合することにより、細胞内の変化が惹起され、Ｔ細胞の活性化に至る。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、ＭＨＣ抗原提示の必要なくＴ細胞に抗原特異性を
伝えるためにデザインされた人工レセプターである。それらは、Ｔ細胞を活性化し、特異
免疫をもたらすように選択された、抗原特異的成分、膜貫通成分および細胞内成分を含む
。キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞は、がん治療をはじめとした様々な治療に
おいて使用され得る。共刺激ポリペプチドは、標的抗原に対するＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性
化を高め、ゆえに養子免疫療法の効力を高めるために使用され得る。
概要
形質導入されたもしくはトランスフェクトされたＴ細胞および他の細胞は、キメラ抗原
レセプターを発現し得、標的抗原の存在下でＴ細胞免疫の活性化を生じ得る。キメラ抗原
レセプター（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞に抗原特異性を伝えるためにデザインされた人工レセプ
ターである。それらは、一般的に、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択さ
れた、抗原特異的成分、膜貫通成分および細胞内成分を含む。キメラ抗原レセプターを発
現しているＴ細胞は、がん治療をはじめとした様々な治療において使用され得る。
キメラ抗原レセプターポリペプチドは、キメラ抗原レセプター改変された細胞の有効性
を増大させるために内因性シグナル伝達もしくは活性化ドメインを含み得る。他の例では
、このシグナル伝達もしくは活性化ドメインは、別個のポリペプチド、キメラ刺激分子へ
と組み込まれ得、これは、その改変された細胞においてキメラ抗原レセプター、例えば、
第１世代ＣＡＲと共発現され得る。Ｔ細胞活性化は、例えば、炎症性サイトカインおよび
ケモカインの発現および分泌によって観察され得る。その活性化された細胞は、疾患に対
する免疫応答を増大させるために、または例えば、腫瘍のサイズを減少させることによっ
てがんを処置するために、使用され得る。処置の治療過程は、種々のイメージングモダリ
ティー（例えば、ＣＴ、骨スキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャン、Ｔｒｏｆｅｘスキャン）
によって、種々の標準的血液バイオマーカー（例えば、ＰＳＡ、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）
）によって、または種々の炎症性，低酸素サイトカイン（inflammatory, hypoxic cyto
kines）、もしくはその処置される患者における他の因子の血清レベルによって、腫瘍の
サイズおよび血管分布を決定することによってモニターされ得る。
いくつかの治療例において、患者は、キメラ抗原レセプター−改変された細胞を使用す
る治療の間に有害な（negative）症候を経験し得る。場合によっては、これら治療は、健
康な組織に対する非特異的攻撃に一部起因して、副作用をもたらした。従って、いくつか
の実施形態において、その改変されたＴ細胞がまた誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを
発現する、核酸、細胞、および方法が提供される。例えば、キメラ抗原レセプター改変Ｔ
細胞の数を減少する必要性がある場合、誘導性リガンドが上記患者に投与され得、それに
よって、その改変されたＴ細胞のアポトーシスを誘導し得る。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）分子の効力を高めるためにＣＡＲ分子にさらなるシグ
ナル伝達ドメインを組み込んだとき、ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞による免
疫療法の抗腫瘍の効能は、着実に改善した。腫瘍細胞は、完全なＴ細胞活性化にとって必
要な必須の共刺激分子を欠くことが多いので、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達分子だけを含
む第１世代ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、養子移入後にインビボにおいて不良な存続
および増殖（expansion）を明らかに示した（Ｔｉｌｌ ＢＧ，Ｊｅｎｓｅｎ ＭＣ，Ｗ
ａｎｇ Ｊら：ＣＤ２０−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ
ａｐｙ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅ
ｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ＣＤ２８ ａｎｄ ４−１ＢＢ ｄｏｍａ
ｉｎｓ：ｐｉｌｏｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｂｌｏｏｄ １
１９：３９４０−５０，２０１２；Ｐｕｌｅ ＭＡ，Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ，Ｍｙｅｒｓ
ＧＤら：Ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ
ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｅｒｓ
ｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉ
ｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １４：１２６４
−７０，２００８；Ｋｅｒｓｈａｗ ＭＨ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ＪＡ，Ｐａｒｋｅｒ Ｌ
Ｌら：Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ
ｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｏｖａ
ｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：６１０６−１５，２
００６）。第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞は、それらの細胞の増殖（proliferation）および生
存を改善するようにデザインされた。ＣＤ２８または４−１ＢＢ由来の細胞内の共刺激ド
メインを組み込んでいる第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ Ｃ，Ｍｉｌｏｎ
ｅ ＭＣ，Ｈａｓｓａｎ Ｒら：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓ
ｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅ
ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａ
ｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
１０６：３３６０−５，２００９；Ｓｏｎｇ ＤＧ，Ｙｅ Ｑ，Ｐｏｕｓｓｉｎ Ｍら：
ＣＤ２７ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ
ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｕ
ｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６−７０６，２０
１２）は、養子移入後に、改善された生存およびインビボでの増殖を示し、これらの共刺
激分子を含む、抗ＣＤ１９ ＣＡＲによって改変されたＴ細胞を用いたより最近の臨床試
験では、ＣＤ１９＋白血病の処置に対して顕著な効能が示された（Ｋａｌｏｓ Ｍ，Ｌｅ
ｖｉｎｅ ＢＬ，Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬら：Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ
ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ
ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｃａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｐａｔ
ｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ
Ｍｅｄ ３：９５ｒａ７３，２０１１；Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｋａ
ｌｏｓ Ｍら：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ
Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：７２５−３３，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ＲＪ
，Ｄａｖｉｌａ ＭＬ，Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｉら：ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ ｃｅ
ｌｌｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ
ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａ
ｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍ
ｅｄ ５：１７７ｒａ３８，２０１３）。
他の研究者らは、「第３世代」ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）フ
ァミリータンパク質（例えば、ＯＸ４０および４−１ＢＢ）由来のさらなるシグナル伝達
分子を探索した（Ｆｉｎｎｅｙ ＨＭ，Ａｋｂａｒ ＡＮ，Ｌａｗｓｏｎ ＡＤ：Ａｃｔ
ｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ
ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆ
ｒｏｍ ＣＤ２８，ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ，ＣＤ１３４，ａｎ
ｄ ＣＤ１３７ ｉｎ ｓｅｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ＴＣＲ ｚｅｔａ ｃｈａｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：１０４−１３，２００４
；Ｇｕｅｄａｎ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｍａｄａｒ Ａら：ＩＣＯＳ−ｂａｓｅｄ ｃｈｉ
ｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｂｉｐｏｌａｒ
ＴＨ１７／ＴＨ１ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，２０１４）が、活性化Ｔ細胞のＣＤ３ζ核
因子（ＮＦＡＴ）経路と異なるＴ細胞シグナル伝達を誘導する他の分子が、Ｔ細胞の生存
および増殖に必要な共刺激を提供する可能性があり、おそらく、従来の共刺激分子によっ
て供給されない、価値のあるさらなる機能をＣＡＲ Ｔ細胞に与える。いくつかの第２お
よび第３世代ＣＡＲ Ｔ細胞は、高度に活性化されたＴ細胞によって引き起こされるサイ
トカインストームおよび腫瘍崩壊症候群に起因する患者の死に関係していた。
新規なＴ細胞共刺激分子、誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）（Ｎａｒａｙａｎａ
ｎ Ｐ， Ｌａｐｔｅｖａ Ｎ， Ｓｅｅｔｈａｍｍａｇａｒｉ Ｍら： Ａ ｃｏｍｐ
ｏｓｉｔｅ ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ｓｗｉｔｃｈ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ
ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ
ｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｊ Ｃｌｉ
ｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２１：１５２４−３４， ２０１１）は、ヒトＴ細胞にコントロー
ルされた共刺激を提供することが見出された。ｉＭＣは、「ユニバーサルな」Ｔｏｌｌ様
レセプターアダプターであるＭｙＤ８８およびＴＮＦファミリーメンバーであるＣＤ４０
の両方に由来するシグナル伝達エレメントを含む強力な二量体化薬物（dimerizer drug
）（ＡＰ１９０３）誘導性分子である。これらの研究において、ｉＭＣでのＴ細胞のレト
ロウイルス形質導入は、ＡＰ１９０３依存性シグナル伝達を可能にするが、この共刺激シ
グナル単独では、ＩＬ−２生成およびＴ細胞増殖を駆動するには十分でなかった。しかし
、第１世代のＣＡＲ（ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのみ）でｉＭＣを補完すると、ｉＭ
ＣおよびＣＡＲを介する腫瘍認識の両方を要した完全なＴ細胞活性化が可能になり、ＩＬ
−２生成、ＣＤ２５レセプターアップレギュレーションおよびＴ細胞増殖が生じ、治療の
効能は、ＡＰ１９０３によってインビボでコントロールされた。さらに、ｉＭＣを含む細
胞は、二量体化リガンドの非存在下では、基底活性（これは共発現されるＣＡＲ分子およ
び抗原（例えば、腫瘍抗原）認識の存在下では、Ｔ細胞活性化を提供する）のレベルをな
お維持する。従って、これら研究は、キメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）エレメントが
、細胞外ＣＡＲドメインを介する腫瘍抗原の認識後にＣＤ３ζ活性化を受容するＴ細胞の
ための強力な共刺激分子であることを示す。
二元のｉＭＣ／ＣＡＲ系を使用するこれら初期の観察を拡げるために、ＭＣを、共刺激
をＣＤ２８もしくは４−１ＢＢの代わりにＣＡＲ改変されたＴ細胞へと提供するために、
Ｔ細胞生存および増殖を増強するために必須のシグナル伝達を提供するために、細胞内シ
グナル伝達部分として含まれるＭＣの能力について評価した。ここで、ＭＣが、ＣＡＲ認
識前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＣＤ１９抗原、もしくはＨｅｒ２／Ｎｅｕ抗原の細胞
質領域へと安定して組み込まれ得、この共刺激分子からのシグナル伝達が、腫瘍細胞殺滅
、ならびに腫瘍細胞認識後のＴ細胞生存および増殖を増強することが示される。
さらに、キメラ共刺激分子ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）は、多量体リガンド結合領域
の非存在下では、ＣＡＲ分子とは別個のポリペプチドとして発現される場合、ＣＡＲ発現
細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を活性化する細胞内シグナル伝達部分である。ＭｙＤ８
８／ＣＤ４０キメラ刺激分子をコードする核酸でのＣＡＲ−Ｔ細胞の形質導入は、このＣ
ＡＲ発現細胞を活性化する。この効果は、膜標的化領域を欠いている細胞質ＭｙＤ８８／
ＣＤ４０キメラ刺激分子で、ならびにＭｙＤ８８／ＣＤ４０および膜標的化領域（例えば
、ミリストイル化領域のような）を含むキメラ刺激分子で観察される。
従って、いくつかの実施形態において、キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸が提供され、ここで上記キメラ刺激分子
は、ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型（truncated）Ｍ
ｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポ
リペプチド領域；および（ｉｉｉ）膜標的化領域を含む。細胞質キメラ刺激分子をコード
するポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸も提供され、ここ
で上記細胞質キメラ刺激分子は、ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いて
いる切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４
０細胞質ポリペプチド領域を含む。本出願のキメラ刺激分子は、上記キメラ刺激分子にリ
ガンドが直接結合することによって引き起こされるリガンド誘導多量体化または二量体化
ができず、多量体化もしくは二量体化リガンド結合部位（例えば、ＦＫＢＰ領域のような
）を含まない。いくつかの実施形態において、キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオ
チドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸がまた提供され、ここで上記キメラ
刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型
ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質
ポリペプチド領域；および（ｉｉｉ）膜標的化領域から本質的になる。いくつかの実施形
態において、細胞質キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され
たプロモーターを含む核酸がまた提供され、ここで上記細胞質キメラ刺激分子は、（ｉ）
ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチ
ド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領
域から本質的になる。キメラ刺激分子の状況において「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓ
ｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、上記キメラ刺激分子が、上記（ｉ）、（
ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の領域の機能を改変せずかつリガンド誘導多量体化もしくは二
量体化領域を含まない、さらなる配列または領域（例えば、リンカー領域のような）をさ
らに含み得ることを意味する。
いくつかの実施形態において、キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたプロモーターならびにキメラ抗原レセプターをコードする第２のポ
リヌクレオチドを含む核酸が提供され、ここで上記キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８
ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉ
）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および（ｉｉ
ｉ）膜標的化領域を含む。いくつかの実施形態において、細胞質キメラ刺激分子をコード
する第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターならびにキメラ抗原レ
セプターをコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸が提供され、ここで上記細胞質
キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切
断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ
４０細胞質ポリペプチド領域を含む。
いくつかの実施形態において、キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたプロモーター、ならびにＴ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプター
ベースのキメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸が提供さ
れ、ここで上記キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメイン
を欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いて
いるＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および（ｉｉｉ）膜標的化領域を含む。いくつか
の実施形態において、細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動
可能に連結されたプロモーター、ならびにＴ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベー
スのキメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸が提供され、
ここで上記細胞質キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメイ
ンを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメイン
を欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む。
いくつかの実施形態において、キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたプロモーター、ならびに多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ
−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌク
レオチドを含む核酸が提供され、ここで上記キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペ
プチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉ）ＣＤ
４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および（ｉｉｉ）膜
標的化領域を含む。いくつかの実施形態において、細胞質キメラ刺激分子をコードする第
１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、ならびに多量体リガンド結
合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコ
ードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸が提供され、ここで上記細胞質キメラ刺激分
子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８
８ポリペプチド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポ
リペプチド領域を含む。いくつかの実施形態において、キメラ刺激分子をコードする第１
のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；キメラ抗原レセプター、Ｔ細
胞レセプター、もしくはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードする第
２のポリヌクレオチド；ならびに多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプ
チドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含
む核酸が提供され、ここで上記キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたは
ＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ド
メインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および（ｉｉｉ）膜標的化領域を
含む。
いくつかの実施形態において、細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結されたプロモーターならびにキメラ抗原レセプター、Ｔ細胞レセプタ
ー、もしくはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌ
クレオチド；ならびに多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含む
キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む核酸が提
供され、ここで上記細胞質キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩ
Ｒドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外
ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む。
ある特定の実施形態において、上記核酸は、膜標的化領域を含まないキメラ刺激分子を
コードする。ある特定の実施形態において、上記核酸は、上記第２のポリヌクレオチドに
作動可能に連結された第２のプロモーターをさらに含む。ある特定の実施形態において、
上記核酸は、上記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターお
よび第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第３のプロモーターをさらに含む。
他の実施形態において、１つのプロモーターは、上記第１および第２のポリヌクレオチド
の両方に作動可能に連結されるか、または上記第１、第２、および第３のポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、上記核酸は、上記第１のポリヌクレオチドと第２のポリ
ヌクレオチドとの間に、リンカーポリペプチドをコードするリンカーポリヌクレオチドを
さらに含み、ここで上記リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、上記第１およ
び第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する。他の実施形態において、上記核酸は
、上記３つのポリヌクレオチドの間に、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドをさらに含み、ここで上記３つのポリヌクレオチドは、上記第１、第２、および第３
のポリヌクレオチドを含み、ここで上記リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に
、上記３つのポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する。いくつかの実施形態において、
上記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである。
本出願のいくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレ
オチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸が提供され、ここで上記キメラ抗
原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメ
インを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを
欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｖ）
抗原認識部分を含む。いくつかの実施形態において、上記キメラ抗原レセプターは、スト
ークポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターを
コードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；ならびに多量
体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリ
ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸が提供され、ここで上記キメラ
抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲド
メインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメイン
を欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｖ
）抗原認識部分を含む。いくつかの実施形態において、１つのプロモーターは、上記第１
のおよび第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結される。いくつかの実施形態に
おいて、上記核酸は、上記第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に、
リンカーポリペプチドをコードするリンカーポリヌクレオチドをさらに含み、ここで上記
リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、上記第１および第２のポリヌクレオチ
ドの翻訳生成物を分断する。いくつかの実施形態において、上記リンカーポリペプチドは
、２Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記核酸は、上記第２のポリ
ヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターをさらに含む。
ある特定の実施形態において、上記膜標的化領域は、ミリストイル化領域、パルミトイ
ル化領域、プレニル化領域、およびレセプターの膜貫通配列からなる群より選択される。
ある特定の実施形態において、上記膜標的化領域は、ミリストイル化領域である。
ある特定の実施形態において、上記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号１４７
のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する。ある特定の実施形態において
、上記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列、またはその機能的フ
ラグメントを有する。ある特定の実施形態において、上記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは
、配列番号１４９のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する。
いくつかの実施形態において、上記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる。いくつか
の実施形態において、上記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、マウス白血病
ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター
、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニ
アウイルスベクターからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記核酸
は、プラスミド内に含まれる。
本出願の核酸によってコードされるキメラ刺激分子ポリペプチドがまた、提供される。
従って、いくつかの実施形態において、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメ
インを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠
いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および（ｉｉｉ）膜標的化領域を含むキメラ
刺激分子ポリペプチドが提供される。上記ポリペプチドは、いくつかの実施形態において
、膜と会合していてもよいし、膜に結合されていてもよい。他の実施形態において、上記
ポリペプチドは、単離され得る。他の実施形態において、上記ポリペプチドは、膜標的化
領域を含み得るが、膜と会合しなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＭｙＤ８８
ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および
ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むキメラ刺激
分子ポリペプチドが、提供される。上記キメラ刺激分子ポリペプチドは、単離されていて
もよいし、いくつかの実施形態において、細胞の細胞質に存在していてもよい。
いくつかの実施形態において、本出願の核酸によってコードされる、ＭｙＤ８８ポリペ
プチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドおよびＣＤ４０
細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むキメラ抗原レセプタ
ーがまた、提供される。上記キメラ抗原レセプターは、いくつかの実施形態において単離
され得る。他の実施形態において、上記キメラ抗原レセプターは、膜と会合していてもよ
いし、膜に結合されていてもよい。
いくつかの実施形態において、本出願のキメラ刺激分子をコードする核酸でトランスフ
ェクトまたは形質導入された、改変された細胞がまた、提供される。いくつかの実施形態
において、上記キメラ刺激分子は、構成的に発現される。いくつかの実施形態において、
上記キメラ刺激分子は、構成的に活性である。いくつかの実施形態において、上記核酸は
、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本出願のキメラ刺激分子をコードする核酸でトランスフ
ェクトまたは形質導入された、改変された細胞がまた提供され、ここで上記核酸は、キメ
ラ抗原レセプターをコードせず；そして上記改変された細胞は、キメラ抗原レセプターを
コードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本出願のキメラ刺激分子をコードする核酸でトランスフ
ェクトまたは形質導入された、改変された細胞がまた提供され、ここで上記核酸は、Ｔ細
胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードせず；そし
て上記改変された細胞は、Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原
レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本出願の改変された細胞は、キメラカスパーゼ−９ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに含み、ここで上記キメラカスパ
ーゼ−９ポリペプチドは、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを
含む。
いくつかの実施形態において、改変された細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−
Ｔ細胞、ＴＣＲを発現している細胞、またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態におい
て、上記細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、骨髄から得
られるかまたは骨髄から調製される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、臍帯血
から得られるかまたは臍帯血から調製される。いくつかの実施形態において、上記細胞は
、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される。いくつかの実施形態において、上
記細胞は、末梢血単核球から得られるかまたは末梢血単核球から調製される。いくつかの
実施形態において、上記細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、上記細
胞が、エレクトロポレーション、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、バイ
オリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）（例えば、Ａｕ粒子を用いた遺伝子銃）、脂質
トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子またはポリプレックス
（ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ）からなる群より選択される方法を用いて、核酸ベクターによっ
てトランスフェクトされるかまたは形質導入される。
いくつかの実施形態において、上記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメ
インを欠いているカスパーゼ−９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、上
記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実
施形態において、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列か
ら本質的になる。ある特定の実施形態において、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配
列番号１５３のアミノ酸配列を含み、表１中のカスパーゼバリアントからなる群より選択
されるアミノ酸置換をさらに含む。ある特定の実施形態において、上記カスパーゼ−９ポ
リペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列から本質的になり、表１中のカスパーゼバ
リアントからなる群より選択されるアミノ酸置換をさらに含む。ある特定の実施形態にお
いて、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｎ４０５Ｑの置換されたアミノ酸残基を有す
る。ある特定の実施形態において、上記カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号１５３
のアミノ酸配列から本質的になり、Ｎ４０５Ｑの置換されたアミノ酸残基をさらに含む。
いくつかの実施形態において、上記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドの多量体リガン
ド結合ドメインは、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テト
ラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可動性リンカ
ードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とでタンデムに構成される一
本鎖抗体、およびこれらの変異された配列からなる群より選択される。いくつかの実施形
態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である。いくつかの実施形態におい
て、上記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である。いくつかの実施形態にお
いて、ＦＫＢＰ領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである。いくつかの実施形態において、上記リガ
ンドは、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６アナログリガンドである。いくつか
の実施形態において、上記リガンドは、ＡＰ１９０３（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）またはＡＰ
２０１８７である。
本出願の核酸は、いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターをコードするポ
リヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターは、本
出願の核酸を含む改変された細胞において発現される。他の実施形態において、ＭｙＤ８
８または切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドおよびＣＤ４０細胞質領域ポリペプチドを含むキ
メラ抗原レセプターが、提供される。本出願のこれらキメラ抗原レセプターは、いくつか
の実施形態において、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）
抗原認識部分を含み得る。いくつかの実施形態において、上記キメラ抗原レセプターは、
ＣＤ２８、ＯＸ４０、および４−１ＢＢからなる群より選択される共刺激分子をさらに含
む。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１
を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（Ｆｃε
Ｒ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される。いくつかの実施形態にお
いて、上記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態において
、上記抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に、またはウイルス抗原
もしくは細菌抗原に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗原認識部分は、ＰＳ
ＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍ
ＵＣ１６、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、お
よびＥＧＦＲｖＩＩＩからなる群より選択される抗原に結合する。いくつかの実施形態に
おいて、上記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メ
ソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選
択される抗原に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ
に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗原認識部分は、ＣＤ１９に結合する。
いくつかの実施形態において、上記抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する。
いくつかの実施形態において、上記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである。
いくつかの実施形態において、上記膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域またはＣＤ８膜貫
通領域である。いくつかの実施形態において、上記キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８スト
ーク領域をさらに含む。
いくつかの実施形態において、被験体においてＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための
方法が提供され、上記方法は、本出願の改変された細胞の有効量を上記被験体に投与する
工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞媒介性免疫応答は、標的細胞
に向けられる。いくつかの実施形態において、上記改変された細胞は、標的細胞上の抗原
に結合する、キメラ抗原レセプター、Ｔ細胞レセプター、またはＴ細胞レセプターベース
のキメラ抗原レセプターを含む。いくつかの実施形態において、上記標的細胞は、腫瘍細
胞である。いくつかの実施形態において、上記被験体における標的細胞の数または濃度は
、上記改変された細胞の投与後に減少する。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記改変された細胞を投与する前に、上記
被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、上記改
変された細胞の投与後に上記被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または
濃度を測定する工程、および上記第１のサンプルにおける標的細胞の数または濃度と比べ
て、上記第２のサンプルにおける標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定する工
程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記第２のサンプルにおける標的細
胞の濃度は、上記第１のサンプルにおける標的細胞の濃度と比べて減少する。他の実施形
態において、上記第２のサンプルにおける標的細胞の濃度は、上記第１のサンプルにおけ
る標的細胞の濃度と比べて増大する。いくつかの実施形態において、さらなる用量の改変
された細胞が、上記被験体に投与される。
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法がまた提供され、上記方法は、本出願の改変
された細胞の有効量を上記被験体に投与する工程を包含する。標的抗原の上昇した発現と
関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法がまた提供され、上記方法
は、本出願の改変された細胞の有効量を上記被験体に投与する工程を包含する。いくつか
の実施形態において、上記標的抗原は、腫瘍抗原である。
いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍のサイズを減少させるための方法が
また提供され、上記方法は、本出願の改変された細胞を上記被験体に投与する工程を包含
し、ここで上記細胞は、腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含む、キメラ抗原レセプ
ター、Ｔ細胞レセプター、またはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターを含む
。
いくつかの実施形態において、上記被験体は、腫瘍を有すると診断されている。いくつ
かの実施形態において、上記被験体は、がんを有する。いくつかの実施形態において、上
記被験体は、固形腫瘍または白血病を有する。いくつかの実施形態において、上記改変さ
れた細胞は、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である。いくつかの実施形態において、上記
改変された細胞は、腫瘍床に送達される。いくつかの実施形態において、上記がんは、上
記被験体の血液または骨髄に存在する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、血
液または骨髄の疾患を有する。いくつかの実施形態において、上記被験体は、任意の状態
または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている。いくつかの実施形態にお
いて、上記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている
。いくつかの実施形態において、上記被験体は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ
組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態（inherited marrow
failure condition）、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる
群より選択される状態と診断されている。いくつかの実施形態において、上記被験体は、
重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損
症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内
分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、Ｃ
Ｄ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−
１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛
髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血
、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミ
ア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される
疾患または状態と診断されている。
いくつかの実施形態において、上記被験体は、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウ
イルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス
６，Ｉ）、およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と
診断されているか、または肺炎、結核、および梅毒からなる群より選択される細菌病因の
感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ト
リコモナス症、およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断
されている。
さらなる用量の上記改変された細胞が上記被験体に投与されるべきかどうかを決定する
工程をさらに包含する本出願の方法がまた、提供される。いくつかの実施形態において、
上記方法は、さらなる用量の上記改変された細胞を上記被験体に投与する工程をさらに包
含し、ここで上記疾患または状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検
出される。いくつかの実施形態において、上記方法は、被験体における状態または疾患の
有無またはステージを同定する工程；および上記被験体において同定される状態または疾
患の有無またはステージに基づいて、本出願の改変された細胞を投与する指示（indicati
on）、上記改変された細胞のその後の投与量を維持する指示、または上記患者に投与され
る改変された細胞のその後の投与量を調整する指示を伝える工程をさらに包含する。
いくつかの実施形態において、本出願の方法は、多量体リガンド結合領域およびカスパ
ーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞を
被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記被験
体への上記改変された細胞の投与後に、上記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リ
ガンドを上記被験体に投与する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上
記多量体リガンドの投与後に、上記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された
細胞の数は、減少する。いくつかの実施形態において、上記キメラカスパーゼ−９ポリペ
プチドを含む改変された細胞の数は、上記被験体への上記多量体リガンドの投与後に、５
０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少する。いくつかの実
施形態において、上記方法は、上記被験体への上記改変された細胞の投与後に、上記被験
体が有害な症候を経験していることを決定する工程、および上記有害な症候を減少または
緩和するために上記リガンドを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、
上記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である。いくつかの実施形態におい
て、上記改変された細胞は、自己Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、上記改変
された細胞は、同種異系のＴ細胞である。
いくつかの実施形態において、本出願の改変された細胞は、インビボでトランスフェク
トまたは形質導入される。いくつかの実施形態において、上記改変された細胞は、エキソ
ビボでトランスフェクトまたは形質導入される。
ある特定の実施形態において、細胞において、キメラ刺激分子またはＭｙＤ８８ポリペ
プチドおよびＣＤ４０細胞質ポリペプチドを含むキメラ抗原レセプターを発現するための
方法がまた提供され、上記方法は、本出願の核酸と細胞とを、上記核酸が細胞の中に組み
込まれる条件下で接触させ、それによって、上記細胞が上記キメラ刺激分子または上記キ
メラ抗原レセプターを上記組み込まれた核酸から発現させる工程を包含する。いくつかの
実施形態において、上記核酸は、上記細胞とエキソビボで接触させられる。いくつかの実
施形態において、上記核酸は、上記細胞とインビボで接触させられる。
いくつかの実施形態において、上記方法は、治療剤を投与する工程をさらに包含する。
ある特定の実施形態において、選択される上記化学療法剤は、リンパ球枯渇化学療法剤で
ある。いくつかの実施形態において、上記改変された細胞、または上記核酸、および上記
化学療法剤は、上記被験体における上記疾患または状態を処置するために有効な量で投与
される。いくつかの実施形態において、上記化学療法剤は、カルボプラチン、リン酸エス
トラムスチン（Ｅｍｃｙｔ）およびサリドマイドからなる群より選択される。いくつかの
実施形態において、上記化学療法剤は、タキサンである。そのタキサンは、例えば、ドセ
タキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、パクリタキセルおよびカバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔ
ａｘｅｌ）からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態において、上記タキサンは
、ドセタキセルである。いくつかの実施形態において、上記化学療法剤は、上記改変され
た細胞もしくは核酸の投与と同時にまたはその投与後１週間以内に投与される。他の実施
形態において、上記化学療法剤は、上記改変された細胞または核酸の投与後の１〜４週間
または１週間から１ヶ月間、１週間〜２ヶ月間、１週間〜３ヶ月間、１週間〜６ヶ月間、
１週間〜９ヶ月間、または１週間〜１２ヶ月間、投与される。いくつかの実施形態におい
て、上記化学療法剤は、上記細胞または核酸を投与する前の少なくとも１ヶ月投与される
。
いくつかの実施形態において、上記方法は、２つまたはそれを超える化学療法剤を投与
する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、それらの化学療法剤は、カルボプ
ラチン、リン酸エストラムスチンおよびサリドマイドからなる群より選択される。いくつ
かの実施形態において、少なくとも１つの化学療法剤は、タキサンである。そのタキサン
は、例えば、ドセタキセル、パクリタキセルおよびカバジタキセルからなる群より選択さ
れ得る。いくつかの実施形態において、上記タキサンは、ドセタキセルである。いくつか
の実施形態において、上記化学療法剤は、上記改変細胞もしくは核酸の投与と同時または
その投与後１週間以内に投与される。他の実施形態において、上記化学療法剤は、上記細
胞または核酸の投与後の１〜４週間または１週間から１ヶ月間、１週間〜２ヶ月間、１週
間〜３ヶ月間、１週間〜６ヶ月間、１週間〜９ヶ月間、または１週間〜１２３ヶ月間、投
与される。他の実施形態において、上記方法は、上記細胞または核酸の投与前の１〜４週
間または１週間から１ヶ月間、１週間〜２ヶ月間、１週間〜３ヶ月間、１週間〜６ヶ月間
、１週間〜９ヶ月間、または１週間〜１２３ヶ月間、上記化学療法剤を投与する工程をさ
らに包含する。
いくつかの実施形態において、上記被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態に
おいて、上記被験体は、ヒトである。
本出願は、米国特許出願第１４／２１０，０３４号（標題 ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ
ＣＯＮＴＲＯＬＬＩＮＧ Ｔ ＣＥＬＬ ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ、２０１４年３月
１３日出願）；米国特許出願第１４／６２２，０１８号（２０１５年２月１３日出願、標
題 ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＡＣＴＩＶＡＴＩＮＧ Ｔ ＣＥＬＬＳ ＵＳＩＮＧ Ａ
Ｎ ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ ＣＨＩＭＥＲＩＣ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ）；米国特許出願
第１３／１１２，７３９号（２０１１年５月２０日出願、標題 ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ
ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ）；米国特許出願第１３
／７９２，１３５号（２０１３年３月１０日出願、標題 ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＣＡＳＰＡ
ＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ）；および米国特
許出願第１４／２９６，４０４号（２０１４年６月４日出願、標題 ＭＥＴＨＯＤＳ Ｆ
ＯＲ ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＰＡＲＴＩＡＬ ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ ＵＳＩＮＧ ＣＡＳＰ
ＡＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ）を参考として援用する；これらは全て、それらの全
体において本明細書に参考として援用される。
米国特許第７，４０４，９５０号（２００８年７月２９日にＳｐｅｎｃｅｒ， Ｄらに
発行）；米国特許第８，６９１，２１０号（２００４年４月８日にＳｐｅｎｃｅｒらに発
行）；Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願第１２／５３２，１９６号（２００９年９月
２１日出願）；ＰＣＴ出願 ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５７７３８（Ｓｐｅｎｃｅｒら、
２００８年４月２４日にＷＯ２０１０／０３３９４９として公開）；Ｓｌａｗｉｎらによ
る米国特許出願第１３／０８７，３２９号（２０１１年４月１４日出願）；ＰＣＴ出願
ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２５７２（２０１１年１０月２０日にＷＯ２０１１／１３０
５６６として公開）；Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願第１４／２１０，３２４号（
２０１４年３月１３日出願）；ＳｐｅｎｃｅｒらによるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０
１４／０２６７３４（２０１５年２月５日にＷＯ２０１４／２５１９６０として公開）；
Ｆｏｓｔｅｒらによる米国特許出願第１４／６２２，０１８号（２０１５年２月１３日出
願）；ＦｏｓｔｅｒらによるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１５８２９（２０
１５年８月２０日にＷＯ２０１５／１２３５２７として公開）もまた、それらの全体にお
いて参考として援用される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで該キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）膜標的化領域
を含む、核酸。
（項目２）
細胞質キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで該細胞質キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域
を含む、核酸。
（項目３）
以下を含む、核酸：
ａ）キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）膜標的化領域
を含む、プロモーター；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド。
（項目４）
以下を含む、核酸：
ａ）細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該細胞質キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、プロモーター；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド。
（項目５）
以下を含む、核酸：
ａ）キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドの作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）膜標的化領域
を含む、プロモーター；ならびに
ｂ）Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド。
（項目６）
以下を含む、核酸：
ａ）細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該細胞質キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、プロモーター；ならびに
ｂ）Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド。
（項目７）
以下を含む、核酸：
ａ）キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）膜標的化領域、
を含む、プロモーター；ならびに
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド。
（項目８）
以下を含む、核酸：
ａ）細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該細胞質キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域
を含む、プロモーター；ならびに
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド。
（項目９）
以下を含む、核酸：
ａ）キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）膜標的化領域、
を含む、プロモーター；
ｂ）キメラ抗原レセプター、Ｔ細胞レセプター、もしくはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド；ならびに
ｃ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド。
（項目１０）
以下を含む、核酸：
ａ）細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該細胞質キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域
を含む、プロモーター；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプター、Ｔ細胞レセプター、もしくはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド；ならびに
ｃ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド。
（項目１１）
前記キメラ刺激分子は、膜標的化領域を含まない、項目２、４、６、８、または１０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１２）
前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む、項目３〜１１のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１３）
前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターおよび前記第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第３のプロモーターを含む、項目９〜１１のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１４）
１つのプロモーターは、前記第１および第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結される、項目３〜１３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１５）
１つのプロモーターは、前記第１、第２、および第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結される、項目９〜１１のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１６）
前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間に、リンカーポリペプチドをコードするリンカーポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドの翻訳産物を分断する、項目１４に記載の核酸。
（項目１７）
３つのポリヌクレオチドの間に、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該３つのポリヌクレオチドは、前記第１、第２、および第３のポリヌクレオチドを含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該３つのポリヌクレオチドの翻訳産物を分断する、項目１５に記載の核酸。
（項目１８）
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目１６または１７のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１９）
キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｖ）抗原認識部分を含む、核酸。
（項目２０）
前記キメラ抗原レセプターは、ストークポリペプチドをさらに含む、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
以下を含む、核酸：
ａ）キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで該キメラ抗原レセプターは、
（ｉ）膜貫通領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子；および
（ｖ）抗原認識部分
を含む、プロモーター；ならびに
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド。
（項目２２）
１つのプロモーターは、前記第１および第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結される、項目２１に記載の核酸。
（項目２３）
前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間に、リンカーポリペプチドをコードするリンカーポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１および第２のポリヌクレオチドの翻訳産物を分断する、項目２２に記載の核酸。
（項目２４）
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目２３に記載の核酸。
（項目２５）
前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターをさらに含む、項目２１に記載の核酸。
（項目２６）
前記膜標的化領域は、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化領域、およびレセプターの膜貫通配列からなる群より選択される、項目１、３、５、７、９、または１０〜１８のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２７）
前記膜標的化領域は、ミリストイル化領域である、項目１、３、５、７、９、または１０〜１８のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２８）
前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号１４７のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する、項目１〜２７のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２９）
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する、項目１〜２８のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３０）
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号１４９のアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを有する、項目１〜２９のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３１）
前記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる、項目１〜３０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３２）
前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群より選択される、項目３１に記載の核酸。
（項目３３）
前記核酸は、プラスミド内に含まれる、項目１〜３０のいずれか１項に記載の核酸。
（項目３４）
項目１〜１８、または２２〜３３のいずれか１項に記載の核酸によってコードされる、キメラ刺激分子ポリペプチド。
（項目３５）
項目１９〜２５または２８〜３３のいずれか１項に記載の、ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドおよびＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、キメラ抗原レセプター。
（項目３６）
項目１〜３３のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
（項目３７）
前記キメラ刺激分子は、構成的に発現される、項目３６に記載の改変された細胞。
（項目３８）
前記キメラ刺激分子は、構成的に活性である、項目３６または３７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目３９）
ａ）前記細胞は、項目１〜３３のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトまたは形質導入され、ここで該核酸は、キメラ抗原レセプターをコードしない；および
ｂ）前記改変された細胞は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに含む、
項目３６〜３８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４０）
ａ）前記細胞は、項目１〜３３のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトまたは形質導入され、ここで該核酸は、Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードしない；および
ｂ）前記改変された細胞は、Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに含む、
項目３６〜３８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４１）
ａ）前記細胞は、項目１〜３３のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトまたは形質導入され、ここで該核酸は、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードしない；
および
ｂ）前記改変された細胞は、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに含み、ここで該キメラカスパーゼ−９ポリペプチドは、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、
項目３６〜４０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４２）
前記改変された細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲ発現細胞、もしくはＮＫ細胞である、項目３６〜４１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４３）
前記細胞は、Ｔ細胞である、項目３６〜４１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４４）
前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、項目３６〜４１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４５）
前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、項目３６〜４１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４６）
前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、項目３６〜４１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４７）
前記細胞は、末梢血単核球から得られるかまたは末梢血単核球から調製される、項目３６〜４１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４８）
前記細胞は、ヒト細胞である、項目３６〜４１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目４９）
前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、項目３６〜４１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５０）
ＣＡＲＤドメインを欠いているカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで該カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む、項目７〜１８または２１〜２５のいずれか１項に記載の核酸、あるいは項目３６〜４９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５１）
ＣＡＲＤドメインを欠いているカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで該カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列を含み、表１中のカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換をさらに含む、項目７〜１８または２１〜２５のいずれか１項に記載の核酸、あるいは項目３６〜４９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５２）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｎ４０５Ｑの置換されたアミノ酸残基を有する、項目５１に記載の核酸または改変された細胞。
（項目５３）
ＣＡＲＤドメインを欠いているカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをタンデムで含む一本鎖抗体、およびこれらの変異配列からなる群より選択されるリガンド結合領域である、項目７〜１８、２１〜２５、または５０〜５２のいずれか１項に記載の核酸、あるいは項目３６〜５２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目５４）
前記リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である、項目５３に記載の核酸または改変された細胞。
（項目５５）
前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、項目５４に記載の核酸または改変された細胞。
（項目５６）
前記ＦＫＢＰ領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、項目５４に記載の核酸または改変された細胞。
（項目５７）
前記リガンドは、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６アナログリガンドである、項目５３〜５６のいずれか１項に記載の核酸または改変された細胞。
（項目５８）
前記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目５３〜５６のいずれか１項に記載の核酸または改変された細胞。
（項目５９）
キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目３、４、９、１０、または１２〜２５のいずれか１項に記載の核酸、あるいは項目３６〜５８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目６０）
前記キメラ抗原レセプターは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および４−１ＢＢからなる群より選択される共刺激分子をさらに含む、項目５９に記載の核酸または改変された細胞。
（項目６１）
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目５９または６０のいずれか１項に記載の核酸または改変された細胞。
（項目６２）
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原に結合する、項目５９〜６１のいずれか１項に記載の核酸または改変された細胞。
（項目６３）
前記抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に、またはウイルス抗原もしくは細菌抗原に結合する、項目５９〜６１のいずれか１項に記載の核酸または改変された細胞。
（項目６４）
前記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、およびＥＧＦＲｖＩＩＩからなる群より選択される抗原に結合する、項目５９〜６１のいずれか１項に記載の核酸または改変された細胞。
（項目６５）
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目５９〜６４のいずれか１項に記載の核酸または改変された細胞。
（項目６６）
前記膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域またはＣＤ８膜貫通領域である、項目５９〜６５のいずれか１項に記載の核酸または改変された細胞。
（項目６７）
前記キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、項目６６に記載の核酸または改変された細胞。
（項目６８）
被験体においてＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、項目３６〜６７のいずれか１項に記載の改変された細胞の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目６９）
前記Ｔ細胞媒介性免疫応答は、標的細胞に向けられる、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記改変された細胞は、標的細胞上の抗原に結合する、キメラ抗原レセプター、Ｔ細胞レセプター、またはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターを含む、項目６８または６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記標的細胞は、腫瘍細胞である、項目６９または７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後に減少する、項目６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
（項目７３）
前記改変された細胞の投与前に前記被験体から得られた第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られた第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプルにおける標的細胞の数または濃度と比べて、該第２のサンプルにおける標的細胞の数または濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、項目６９〜７２のいずれか１項に記載の方法。
（項目７４）
前記第２のサンプルにおける標的細胞の濃度は、前記第１のサンプルにおける標的細胞の濃度と比べて減少する、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記第２のサンプルにおける標的細胞の濃度は、前記第１のサンプルにおける標的細胞の濃度と比べて増大する、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
さらなる用量の改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目６８〜７５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７７）
被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、項目３６〜６７のいずれか１項に記載の改変された細胞の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目７８）
標的抗原の上昇した発現と関連する疾患もしくは状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、項目３６〜６７のいずれか１項に記載の改変された細胞の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目７９）
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であって、該方法は、項目３６〜６７のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与する工程を包含し、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含む、キメラ抗原レセプター、Ｔ細胞レセプター、またはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターを含む、方法。
（項目８１）
前記被験体は、腫瘍を有すると診断されている、項目６８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
（項目８２）
前記被験体は、がんを有する、項目６８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
（項目８３）
前記被験体は、固形腫瘍または白血病を有する、項目８１に記載の方法。
（項目８４）
前記改変された細胞は、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、項目６８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、項目６８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８６）
前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、項目８２に記載の方法。
（項目８７）
前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、項目６８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８８）
前記被験体は、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断されている、項目６８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８９）
前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目６８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９０）
前記被験体は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目６８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９１）
前記被験体は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）もしくはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ ８不全症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される疾患または状態と診断されている、項目６８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９２）
さらなる用量の前記改変された細胞が前記被験体に投与されるべきかどうかを決定する工程をさらに包含する、項目６８〜９１のいずれか１項に記載の方法。
（項目９３）
さらなる用量の前記改変された細胞を前記被験体に投与する工程をさらに包含し、ここで前記疾患もしくは状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検出される、項目６８〜９２のいずれか１項に記載の方法。
（項目９４）
被験体において状態もしくは疾患の有無またはステージを同定する工程；および
該被験体において同定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、項目６８〜９３のいずれか１項に記載の改変された細胞を投与する指示、該改変された細胞のその後の投与量を維持する指示、または該患者に投与される該改変された細胞のその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに包含する、項目６８〜９２のいずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
前記被験体は、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）、およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、または肺炎、結核、および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されているか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、およびアメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、項目６８〜９２のいずれか１項に記載の方法。
（項目９６）
前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、項目６８〜９５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９７）
前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを該被験体に投与する工程をさらに包含する、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数が減少する、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、５０％減少する、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、７５％減少する、項目９８に記載の方法。
（項目１０１）
前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、９０％減少する、項目９８に記載の方法。
（項目１０２）
前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、該被験体が有害な症候を経験していることを決定する工程、および該有害な症候を減少または緩和するために前記リガンドを投与する工程を包含する、項目９６〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０３）
前記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目９６〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
前記改変された細胞は、自己Ｔ細胞である、項目９６〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０５）
前記改変された細胞は、同種異系のＴ細胞である、項目９６〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０６）
前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目６８〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０７）
前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される、項目３６〜６７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
（項目１０８）
細胞において、キメラ刺激分子またはＭｙＤ８８ポリペプチドおよびＣＤ４０細胞質ポリペプチドを含むキメラ抗原レセプターを発現させるための方法であって、該方法は、項目１〜３３のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞の中に組み込まれる条件下で接触させ、それによって該細胞が、該組み込まれた核酸から該キメラ刺激分子または該キメラ抗原レセプターを発現する工程を包含する、方法。
（項目１０９）
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目１０８に記載の方法。
ある特定の実施形態は、以下の説明、実施例、請求項および図面においてさらに説明さ
れる。
図面は、本技術の実施形態を図示するものであって、限定するものではない。図示を明
確にするためおよび容易にするために、図面は、一定の割合で拡大縮小して作成されてお
らず、場合によっては、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が、誇張
または拡大されて示されていることがある。
図面の簡単な説明
図面は、本技術の実施形態を図示するものであって、限定するものではない。図示を明
確にするためおよび容易にするために、図面は、一定の割合で拡大縮小して作成されてお
らず、場合によっては、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が、誇張
または拡大されて示されていることがある。
図１は、キメラ抗原レセプター、ならびにＣＤ２８および４−１ＢＢポリペプチドを含むキメラ刺激分子の一例で形質導入またはトランスフェクトされた細胞の細胞膜の部分模式図である。 図２は、キメラ抗原レセプター、ならびに誘導性キメラＣＤ４０／ＭｙＤ８８ポリペプチドを含むキメラシグナル伝達分子の一例で形質導入またはトランスフェクトされた細胞の細胞膜の部分模式図である。 図３Ａ〜図３Ｄは、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８ポリペプチドを含む誘導性キメラ刺激分子の例を提供する。図３Ａは、上記誘導性キメラ刺激分子の一般的ポリペプチドエレメントのグラフによる図示を提供する。図３Ｂは、上記キメラ刺激分子を発現するＴ細胞におけるＣＤ１９マーカー検出のフローサイトメトリー結果を提供する。図３Ｃは、上記キメラ刺激分子を発現するＴ細胞におけるＩＦＮγ生成の棒グラフである。図３Ｄは、上記キメラ刺激分子を発現するＴ細胞におけるＩＬ−６生成の棒グラフである。 図３Ａ〜図３Ｄは、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８ポリペプチドを含む誘導性キメラ刺激分子の例を提供する。図３Ａは、上記誘導性キメラ刺激分子の一般的ポリペプチドエレメントのグラフによる図示を提供する。図３Ｂは、上記キメラ刺激分子を発現するＴ細胞におけるＣＤ１９マーカー検出のフローサイトメトリー結果を提供する。図３Ｃは、上記キメラ刺激分子を発現するＴ細胞におけるＩＦＮγ生成の棒グラフである。図３Ｄは、上記キメラ刺激分子を発現するＴ細胞におけるＩＬ−６生成の棒グラフである。 図４Ａ〜図４Ｄは、キメラ抗原レセプターの例を提供する。図４Ａは、細胞膜の一般的状況において、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドを含むキメラ抗原レセプターのグラフによる図示を提供する。図４Ｂは、形質導入された細胞におけるＣＡＲ発現の棒グラフである。図４Ｃは、形質導入された細胞におけるＣＡＲ発現を示すフローサイトメトリー結果を提供する。図４Ｄは、上記ＣＡＲ発現Ｔ細胞によるＰＳＣＡ＋腫瘍細胞の特異的溶解を示す棒グラフである。 図５Ａ〜図５Ｃは、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドによるＣＡＲ分子の内因性共刺激の例を提供する。図５Ａは、上記キメラ抗原レセプターを発現する細胞によるＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ細胞の殺滅を測定するフローサイトメトリー結果を提供する。図５Ｂは、ＣＡＲ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞の１：１比におけるＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ細胞の殺滅の棒グラフである。図５Ｃは、ＣＡＲ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞の１：１０比におけるＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ細胞の殺滅の棒グラフである。 図６Ａ〜図６Ｄは、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターを発現する細胞の細胞生存率および増殖の結果を提供する。図６Ａは、Ｔ細胞生存率のグラフである。図６Ｂは、細胞増殖のグラフである。図６Ｃは、ＩＬ−２生成のグラフである。図６Ｄは、ＩＬ−６生成のグラフである。 図７は、誘導性カスパーゼ分子と共発現されるキメラ抗原レセプターをコードするプラスミドマップである。 図８は、キメラ刺激分子およびＣＤ１９ポリペプチドマーカーをコードするプラスミドマップである。 図９Ａ〜図９Ｄ： 図９Ａは、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドを含むキメラ抗原レセプターの模式図である。図９Ｂは、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドを含むキメラ抗原レセプターをコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞のＩＬ−２アッセイの棒グラフである。図９Ｃは、第１世代キメラ抗原レセプターと共発現されるＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子の模式図である。図９Ｄは、ＭｙＤ８８共刺激分子およびキメラ抗原レセプターの両方を発現する細胞のＩＬ−２アッセイの棒グラフである。 図１０は、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドと共発現されるＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターをコードするプラスミドマップである。 図１１は、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドと共発現されるＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲの導入遺伝子の模式図である。 図１２Ａ〜図１２Ｃは、第１世代ＣＡＲ（ＣＤ１９ζ）、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢポリペプチドを含むＣＡＲ、ならびにＣＤ３ζおよびＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドを含むＣＡＲを比較する実験の結果を提供する。図１２Ａは、形質導入効率のフローサイトメトリー結果を提供する。図１２Ｂは、形質導入効率のグラフである。図１２Ｃは、ＣＡＲ発現レベルのグラフである。 図１３Ａ〜図１３Ｂは、ＣＤ１９＋ Ｄａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞との共培養後にＩＬ−２生成およびＩＬ−６生成に関して、第１世代ＣＡＲ（ＣＤ１９ζ）、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢポリペプチドを含むＣＡＲ、ならびにＣＤ３ζおよびＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドを含むＣＡＲを比較する実験の結果を提供する。ＮＴは、非形質転換細胞を示す。図１３Ａは、ＩＬ−２生成のグラフである。図１３Ｂは、ＩＬ−６生成のグラフである。 図１４Ａ〜図１４Ｂは、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞との共培養後にＩＬ−２生成およびＩＬ−６生成に関して、第１世代ＣＡＲ（ＣＤ１９ζ）、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢポリペプチドを含むＣＡＲ、ならびにＣＤ３ζおよびＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドを含むＣＡＲを比較する実験の結果を提供する。ＮＴは、非形質転換細胞を示す。図１４Ａは、ＩＬ−２生成のグラフである。図１４Ｂは、ＩＬ−６生成のグラフである。 図１５Ａ〜図１５Ｂは、図１５ＡのＣＤ１９＋ Ｄａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞および図１５ＢのＣＤ１９＋ Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞との６日間の共培養後に、第１世代ＣＡＲ（ＣＤ１９ζ）、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢポリペプチドを含むＣＡＲ、ならびにＣＤ３ζおよびＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドを含むＣＡＲを比較する腫瘍細胞殺滅実験の結果を提供する。ＮＴは、非形質転換細胞を示す。 図１６Ａ〜図１６Ｂは、第１世代タイプのキメラ抗原レセプター（図１６Ａ）およびＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプター（図１６Ｂ）の模式図を提供する。 図１７は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ抗原を認識する抗原認識部分を含むＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターをコードするプラスミドマップである。 図１８Ａ〜図１８Ｂは、Ｈｅｒ２／Ｎｅｗ標的化キメラ抗原レセプターの例を提供する。図１８Ａは、ＭＣシグナル伝達ドメインありおよびなしのＨｅｒ２／Ｎｅｕ標的化ＣＡＲの模式図を提供する；図１８Ｂは、Ｔ細胞の形質導入のソーティングマップ結果、およびフローサイトメトリーによってＣＤ３４エピトープをマーカーとして使用するＴ細胞上で発現されるＣＡＲのその後の測定を提供する。 図１９Ａ〜図１９Ｂは、ＣＡＲ Ｔ細胞（ここで上記キメラ抗原レセプターの抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ抗原を認識する）とＨｅｒ２＋乳がん細胞株ＭＣＦ−７との７日間の共培養後のＴ細胞生存率およびＴ細胞カウントのグラフを提供する。これらグラフは、共培養後のＴ細胞の生存率、および全Ｔ細胞数を示し、これは、ＭＣ分子を含むＣＡＲが、よりよい生存および増強された増殖を有することを示す。図１９Ａは、Ｔ細胞生存率のグラフである。図１９Ｂは、Ｔ細胞カウントのグラフである。 図２０Ａ〜図２０Ｂは、ＣＡＲ改変Ｔ細胞（ここで上記キメラ抗原レセプターの抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ抗原を認識する）との共培養アッセイの結果を示すデータを提供する。図２０ＡのＴ細胞を、Ｈｅｒ２＋ ＭＣＦ−７−ＧＦＰ腫瘍細胞と培養し、腫瘍殺滅を、７日後に培養物中に残っているＧＦＰ細胞のパーセンテージを測定することによって評価した。図２０Ｂは、２回の別個の実験からの累積データのグラフである。 図２１Ａ〜図２１Ｅは、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１９ ＣＡＲにおいてＴ細胞活性を増強することを示すデータを提供する。図２１Ａは、５：１ エフェクター 対 標的（Ｅ：Ｔ）比において、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ腫瘍細胞に対する非形質導入（ＮＴ）、ＣＤ１９．ζおよびＣＤ１９．ＭＣ．ζＣＡＲ改変Ｔ細胞の細胞傷害性のフローサイトメトリーデータを提供する。図２１Ｂは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞に対するＣＡＲ構築物の細胞傷害性希釈（cytotoxicity dilution）の線グラフである。図２１Ｃは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞との共培養の４８時間後のＩＬ−２生成の棒グラフである。図２１Ｄは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞との共培養の４８時間後のＩＬ−６生成の棒グラフである。図２１Ｅは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞との培養の４日後のＣＡＲ改変Ｔ細胞の細胞数の棒グラフである。 図２２は、ＣＤ１９を認識する抗原認識部分、および誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを含むＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターをコードするプラスミドマップである。 図２３は、ＰＳＣＡを認識する抗原認識部分を含むＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターをコードするプラスミドマップである。 図２４は、ＣＤ１９を認識する抗原認識部分を含むＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターをコードするプラスミドマップである。 図２５は、キメラ抗原レセプターと共発現されるＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子をコードするプラスミドマップである。 図２６Ａ〜図２６Ｄは、実施例１７において論じられるＣＡＲベクターデザインを示す模式図である。ｉカスパーゼ−９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ９）を有する４種のベクターを構築した。図２６Ａは、標準的な第１世代ＣＡＲ分子を表す。図２６Ｂは、ＣＤ２８内部ドメインを含むＣＡＲを示す。図２６Ｃ： ＭＣは、ＣＡＲ分子内で、または第２の２Ａを使用して構成的に発現されるタンパク質として発現される（図２６Ｄ）。 図２７Ａおよび図２７Ｂは、異なるＭＣ形式を有するＣＡＲ分子で形質導入したＴ細胞におけるＣＤ３＋ＣＤ３４＋％（図２７Ａ）およびＭＦＩ（図２７Ｂ）のグラフを提供する。Ｔ細胞を、上記４種のベクターの各々で形質導入し、ＣＡＲ形質導入効率（図２７Ａ）およびＣＡＲ発現レベル（図２７Ｂ）に関して、ＣＤ３およびＣＤ３４抗体標識後の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）と比較した。 図２８Ａおよび図２８Ｂは、ＣＤ１９＼＋ Ｒａｊｉ共培養後のＩＬ−２（図２８Ａ）およびＩＬ−６（図２８Ｂ）生成のグラフを提供する。Ｔ細胞を、上記４種のベクターの各々で形質導入し、Ｒａｊｉ腫瘍細胞を使用する１：１ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞比の共培養アッセイ後のサイトカイン生成に関して、非形質導入Ｔ細胞と比較した。４８時間で上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２およびＩＬ−６に関して測定した。 図２９Ａおよび図２９Ｂは、異なるＭＣ形式の抗腫瘍活性をアッセイする、ＣＤ３＋％（図２９Ａ）およびＲａｊｉ−ＧＦＰ％（図２９Ｂ）のグラフである。Ｔ細胞を、上記４種のベクターの各々で形質導入し、Ｒａｊｉ−ＧＦＰ腫瘍細胞を使用する１：１ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞比での共培養後の腫瘍殺滅に関して非形質導入Ｔ細胞と比較した。１４日後、培養物を採取し、ＣＤ３＋ Ｔ細胞およびＧＦＰ＋腫瘍細胞に関してフローサイトメトリーによって分析した。 図３０Ａおよび図３０Ｂは、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞のＭＣ共刺激後のＴ細胞数（図３０Ａ）およびＲａｊｉ−ＧＦＰ（図３０Ｂ）のグラフである。Ｔ細胞を、上記４種のベクターの各々で形質導入し、Ｒａｊｉ−ＧＦＰ腫瘍細胞を使用する１：１ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞比での共培養後の腫瘍殺滅に関して非形質導入Ｔ細胞と比較した。１４日後、培養物を採取し、ＣＤ３＋ Ｔ細胞およびＧＦＰ＋腫瘍細胞に関してフローサイトメトリーによって分析し、その細胞数を、総細胞数に基づいて（base off）計算した。 図３１は、Ｈｅｒ２標的化ＣＡＲを使用する、異なるＭＣ形式を有するＣＡＲ分子の発現のＦＡＣｓプロットである。Ｔ細胞を、Ｈｅｒ２を標的化する５種の異なるベクターで形質導入し、その後、ＣＤ３およびＣＤ３４抗体を使用して、形質導入後４日目および８日目にＣＡＲ発現に関してフローサイトメトリーによって分析した。 図３２Ａおよび図３２Ｂは、ＣＤ３＋ＣＤ３４＋％（図３２Ａ）およびＭＦＩ（図３２Ｂ）のＨＥＲ２ ＣＡＲ構築物に関するＣＡＲ形質導入パーセントおよびＭＦＩのグラフである。 図３３Ａおよび図３３Ｂは、ＨＥＲ２ ＣＡＲ構築物に関するＩＬ−２生成（図３３Ａ）およびＩＬ−６生成（図３３Ｂ）のグラフである。 図３４Ａおよび図３４Ｂは、異なるＭＣ形式の抗腫瘍活性のグラフを提供する；図３４Ａ：ＣＤ３＋％、図３４Ｂ：ＳＫ−ＢＲ−３−ＧＦＰ％。Ｔ細胞を、上記５種のベクターの各々で形質導入し、Ｈｅｒ２＋ ＳＫ−ＢＲ−３−ＧＦＰ腫瘍細胞を使用する１：１ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞比での共培養後の腫瘍殺滅に関して、非形質導入Ｔ細胞と比較した。１４日後に、培養物を採取し、ＣＤ３＋ Ｔ細胞およびＧＦＰ＋腫瘍細胞に関してフローサイトメトリーによって分析した。 図３５Ａおよび図３５Ｂは、ＭＣ共刺激がＨｅｒ２標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞のＴ細胞増殖を増強することを示すグラフを提供する。図３５Ａ：Ｔ細胞数、図３５Ｂ：ＳＫ−ＢＲ−３−ＧＦＰ。Ｔ細胞を、上記４種のベクターの各々で形質導入し、ＳＫ−ＢＲ−３−ＧＦＰ腫瘍細胞を使用する１：１ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞比での共培養後の腫瘍殺滅に関して非形質導入Ｔ細胞と比較した。１４日後に、培養物を採取し、ＣＤ３＋ Ｔ細胞およびＧＦＰ＋腫瘍細胞に関してフローサイトメトリーによって分析し、細胞数を、総細胞数に基づいて計算した。 図３６Ａおよび図３６Ｂは、２Ａポリペプチドを使用して構成的に発現されるＭＣが、インビボで増強された抗腫瘍活性を実証することを示すグラフを提供する。図３６Ａ：腫瘍サイズ、図３６Ｂ：体重変化％。免疫不全マウス（ＮＳＧ）に、１×１０６ ＳＫ−ＢＲ−３−ＥＧＦＰルシフェラーゼ腫瘍細胞を右側腹部においてｓ．ｃ．注射した。７日後に、その腫瘍を、７日目および１０日目に、１×１０７ Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲ改変Ｔ細胞、もしくは非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞を用いて２回の腫瘍内注射で処置した。腫瘍サイズおよび体重を、その群の各々に関して１週間に２回測定した。 図３７Ａ〜図３７Ｅは、ＣＤ１９およびＨｅｒ２に特異的な一本鎖可変フラグメントを含むキメラ抗原レセプターを発現するために使用されるレトロウイルス構築物の模式図を提供する。上記構築物はまた、ＣＤ２８共刺激ドメイン、またはＭｙＤ８８、ＣＤ４０、もしくはＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）などの種々の共刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含んだ。上記構築物はまた、カスパーゼ−９セーフティースイッチ（ｉＣ９）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。図３７Ａ：ｉＣ９−ｓｃＦｖ．ζ。図３７Ｂ：ｉＣ９−ｓｃＦｖ．２８．ζ。図３７Ｃ：ｉＣ９−ｓｃＦｖ．ζ−ＣＤ４０。図３７Ｄ：ｉＣ９−ｓｃＦｖ．ζ−ＭｙＤ８８。図３７Ｅ：ｉＣ９−ｓｃＦｖ．ζ−ＭＣ。 図３８Ａ〜図３８Ｆは、図３７Ａ〜図３７Ｅの構築物を使用するＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）共刺激アッセイの結果を提供する。図３８Ａは、Ｔ細胞においてＣＡＲ／キメラ共刺激分子構築物の発現を示すフローサイトメトリー結果を提供する。図３８Ｂは、種々の構築物を発現するＴ細胞におけるＩＬ−２生成の棒グラフを提供する。図３８Ｃは、異なるＣＡＲ構築物との共培養実験からのＴ細胞数の棒グラフを提供する。図３８Ｄは、異なるＣＡＲ構築物との共培養実験からの腫瘍細胞数の棒グラフを提供する。図３８Ｅは、種々の構築物を発現するＴ細胞との共培養後の腫瘍細胞排除の効能を示すフローサイトメトリー結果を提供する。図３８Ｆは、種々の構築物を使用する共培養アッセイからのＩＬ−２生成の棒グラフを提供する。 図３９Ａ〜図３９Ｆは、図３７Ａ〜図３７Ｅの構築物を使用するＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ共刺激分子による、インビボでのＨｅｒ２ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力の増強の結果を提供する。図３９Ａ Ｔ細胞を、Ｈｅｒ２．ζ ＣＡＲ、Ｈｅｒ２．２８．ζ ＣＡＲもしくはＨｅｒ２．ζ−ＭＣ ＣＡＲで形質導入し、ＮＳＧマウス（ｎ＝５）へと移植した皮下のルシフェラーゼ発現Ｈｅｒ２＋ ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍へと、直接注射した。腫瘍細胞のバイオルミネッセンス（ＢＬＩ）は、図３９Ａの写真において示されるとおり、ＩＶＩＳによって測定した。図３９Ｂは、カリパスによって測定した腫瘍サイズおよび生存のグラフである。図３９Ｃは、７５日にわたって計算した腫瘍サイズのグラフである。図３９Ｄは、ＣＡＲおよびルシフェラーゼでのＴ細胞のその後の共形質導入、およびＮＳＧマウス（ｎ＝５）へと移植した皮下のＨｅｒ２＋ ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍へと直接注射した後のバイオルミネッセンスを示す写真である。図３９Ｅは、ＩＶＩＳイメージングを使用する目的領域ＲＯＩによって計算したＣＡＲ−Ｔ細胞増殖のグラフである。図３９Ｆは、カリパス測定によって計算した腫瘍サイズのグラフであり、各処置群における個々のマウスを示す。＊Ｐ値≦０．０５。 図３９Ａ〜図３９Ｆは、図３７Ａ〜図３７Ｅの構築物を使用するＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ共刺激分子による、インビボでのＨｅｒ２ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力の増強の結果を提供する。図３９Ａ Ｔ細胞を、Ｈｅｒ２．ζ ＣＡＲ、Ｈｅｒ２．２８．ζ ＣＡＲもしくはＨｅｒ２．ζ−ＭＣ ＣＡＲで形質導入し、ＮＳＧマウス（ｎ＝５）へと移植した皮下のルシフェラーゼ発現Ｈｅｒ２＋ ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍へと、直接注射した。腫瘍細胞のバイオルミネッセンス（ＢＬＩ）は、図３９Ａの写真において示されるとおり、ＩＶＩＳによって測定した。図３９Ｂは、カリパスによって測定した腫瘍サイズおよび生存のグラフである。図３９Ｃは、７５日にわたって計算した腫瘍サイズのグラフである。図３９Ｄは、ＣＡＲおよびルシフェラーゼでのＴ細胞のその後の共形質導入、およびＮＳＧマウス（ｎ＝５）へと移植した皮下のＨｅｒ２＋ ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍へと直接注射した後のバイオルミネッセンスを示す写真である。図３９Ｅは、ＩＶＩＳイメージングを使用する目的領域ＲＯＩによって計算したＣＡＲ−Ｔ細胞増殖のグラフである。図３９Ｆは、カリパス測定によって計算した腫瘍サイズのグラフであり、各処置群における個々のマウスを示す。＊Ｐ値≦０．０５。 図４０Ａ〜図４０Ｃは、図３７Ａ〜図３７Ｅの構築物を使用するＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ共刺激分子によるインビボでのＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力の増強の結果を示す。図４０Ａ：ＮＳＧマウス（ｎ＝５／群）に、Ｒａｊｉ−ルシフェラーゼ腫瘍細胞を移植し、次いで、非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞またはｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ ＣＡＲ改変Ｔ細胞で、３日目に処置した。腫瘍成長を、ＩＶＩＳイメージングによって測定し、写真で示されるように、全身ＢＬＩによって計算した。図４０Ｂは、バイオルミネッセンスカウント（ＢＬＩカウント）のグラフを提供し、図４０Ｃは、（（Ａ）のカプラン・マイアー分析）のグラフを提供する。ｓＣＲＳの客観的証拠では、rimiducid（ＡＰ１９０３）を投与したところ（グレーのボックス、図４０Ａ；第３行の中間の列、第２行の右列）、２４時間以内のサイトカインの正常化および腫瘍コントロールを損なうことなく臨床上のｓＣＲＳの完全な解決（complete resolution）をもたらした。 図４１Ａ〜図４１Ｃは、図３７Ａ〜図３７Ｅの構築物を使用して、rimiducidでの誘導性キメラカスパーゼ−９発現細胞の滴定のアッセイの結果を提供する。図４１Ａおよび図４１Ｂ：ＮＳＧマウス（ｎ＝５／群）に、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉリンパ腫細胞を移植し、５×１０６ ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ／ルシフェラーゼ形質導入Ｔ細胞で３日目に処置した。６日後、マウスを、rimiducidの対数希釈物（０．００００５〜５ ｍｇ／ｋｇ）でｉ．ｐ．処置した。ＣＡＲ−Ｔ細胞のＢＬＩを、rimiducid処置の前、注射の２４時間後および４８時間後に評価した。図４１Ａは、バイオルミネッセンスを示す写真を提供し、図４１Ｂは、このアッセイの結果のグラフを提供する。図４１Ｃは、rimiducidの投与前（黒線）および投与の２４時間後（グレーの線）に各群から測定した、血清サイトカインレベルのグラフを提供する。＊Ｐ値≦０．０１。 図４２Ａ〜図４２Ｅは、図３７Ａ〜図３７Ｅの種々のＨｅｒ２−キメラ抗原レセプター構築物の有効性および安全性アッセイの結果を提供する。図４２Ａは、このアッセイのタイムラインを提供する。図４２Ｂ〜図４２Ｅは、コントロールＴ細胞（図４２Ｂ）および形質導入されたＴ細胞の投与後のマウスにおける腫瘍サイズを示すグラフを提供する。図４２Ｃ：Ｈｅｒ２．ζ。図４２Ｄ：Ｈｅｒ２．２８．ζ。図４２Ｅ：Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣ。 図４３Ａ〜図４３Ｃは、図３７Ａ〜図３７Ｅの種々のＨｅｒ２−キメラ抗原レセプター構築物の有効性および安全性アッセイの結果を提供する。図４３Ａは、このアッセイのタイムラインを提供する。図４３Ｂは、形質導入されたＴ細胞の投与後のマウスにおけるバイオルミネッセンスを示す写真を提供する。図４３Ｃは、バイオルミネッセンスアッセイのグラフである。 図４４Ａ〜図４４Ｄは、図３７Ａ〜図３７ＥのＣＤ１９特異的ＣＡＲ構築物を使用して、rimiducidでの誘導性キメラカスパーゼ−９発現細胞の滴定のアッセイの結果を提供する。図４４Ａは、形質導入されたＴ細胞の投与後のマウスにおけるバイオルミネッセンスを示す写真を提供する。図４４Ｂは、カスパーゼ−９活性を誘導するためにrimiducidを投与した後のマウスにおけるバイオルミネッセンスのグラフである。図４４Ｃは、rimiducidの投与後のＩＬ−６分泌のグラフであり、図４４Ｄは、rimiducidの投与後のＴＮＦ−α分泌のグラフである。 図４５Ａ〜図４５Ｄは、Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲ構築物の投与後の日数での腫瘍サイズのグラフを提供する。図４５Ａ：非形質導入Ｔ細胞コントロール。図４５Ｂ：ｉＣ９−Ｈｅｒ２。図４５Ｃ：ｉＣ９−Ｈｅｒ２．２８。図４５Ｄ：ｉＣ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣ。 図４６Ａ〜図４６Ｃは、ＭＣを使用できる（ＭＣ−ｅｎａｂｌｅｄ）Ｈｅｒ２ ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ増殖のアッセイの結果を提供する。図４６Ａは、形質導入されたＴ細胞の投与後のマウスにおけるバイオルミネッセンスを示す写真を提供する。図４６Ｂは、投与後の日数での腫瘍サイズのグラフを提供する。図４６Ｃは、投与後の日数でのバイオルミネッセンスのグラフを提供する。 図４７Ａ〜図４７Ｃは、ＭＣを使用できるＨｅｒ２ ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後のマウスの生存のアッセイの結果を提供する。図４７Ａは、腫瘍サイズのグラフを提供する。図４７Ｂは、バイオルミネッセンスのグラフを提供し、図４７Ｃは、Ｔ細胞の注射後の日数でのパーセント生存のグラフを提供する。 図４８Ａ〜図４８Ｆは、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子を発現させるために使用されるＤＮＡ構築物の模式図を提供する。図４８Ａ：構築物は、ＣＤ１９特異的キメラ抗原レセプター、誘導性キメラカスパーゼ−９ポリペプチド、およびＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子をコードする。図４８Ｂ：構築物は、ＣＤ１９特異的キメラ抗原レセプターおよび誘導性キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする。図４８Ｃ：構築物は、ＣＤ１９特異的キメラ抗原レセプターをコードする。図４８Ｄ：構築物は、膜標的化ＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子およびＣＤ１９特異的キメラ抗原レセプターをコードする。図４８Ｅ：構築物は、ＣＤ３４に向けられるＱＢＥＮＤ１０抗体に対するエピトープ（Ｑエピトープ）を含む膜標的化ＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子をコードする。図４８Ｆ：構築物は、多量体リガンド結合部位およびＣＤ１９特異的キメラ抗原レセプターを含む膜標的化誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子をコードする。 図４９は、図４８における構築物によって生成されるタンパク質の模式図を提供する。点は、１１５２において、Ｎ末端ミリステートで膜につなぎとめられたＭＣを有する形質膜を表す。 図５０Ａおよび図５０Ｂは、示された組換えレトロウイルスで形質導入されたＴ細胞からのＩＬ−２分泌のグラフである。図５０Ａ：形質導入の２４時間後に行われたアッセイ。図５０Ｂ：形質導入の４８時間後に行われたアッセイ。 図５１Ａおよび図５１Ｂは、示された組換えレトロウイルスで形質導入されたＴ細胞からのＩＬ−６分泌のグラフである。図５１Ａ：形質導入の２４時間後に行われたアッセイ。図５１Ｂ：形質導入の４８時間後に行われたアッセイ。
（詳細な説明）
腫瘍細胞上で発現される抗原を認識するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するよ
うに遺伝子操作されたＴ細胞の養子移入は、臨床試験において有望であることが示され始
めている。ＣＡＲは、抗原結合領域、例えば、抗原特異的モノクローナル抗体に由来する
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）およびＴ細胞活性化分子（例えば、Ｔ細胞レセプタ
ー（ＣＤ３）のζ鎖）から構成される。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の基本的成分としては、以下が挙げられる。腫瘍特異
的モノクローナル抗体の可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖は、Ｔ細胞レセプター
複合体由来のＣＤ３ ζ鎖（ζ）とインフレームで融合される。そのＶＨおよびＶＬは、
通常、グリシン−セリン可動性リンカーを使用して互いに接続され、次いで、スペーサー
（ＣＨ２ＣＨ３）によって膜貫通ドメインに付着されることにより、腫瘍抗原と相互作用
できるようにｓｃＦｖが細胞表面から離れて伸長する。
形質導入後、ここでは、Ｔ細胞はＣＡＲをその表面に発現し、腫瘍抗原と接触およびラ
イゲーションすると、ＣＤ３ ζ鎖を介してシグナル伝達し、細胞傷害性および細胞活性
化を誘導する。
研究者らは、ＣＤ３ζを介したＴ細胞の活性化が、腫瘍特異的殺滅を誘導するのに十分
であるが、Ｔ細胞の増殖および生存を誘導するには不十分であることを述べている。ζ鎖
のみを発現しているＣＡＲによって改変されたＴ細胞を使用した初期の臨床試験は、遺伝
子が改変されたＴ細胞が、インビボにおいて不良な生存および増殖を示すことを示した。
これらの構築物を第一世代ＣＡＲと呼ばれる。
Ｂ７軸を介した共刺激が、完全なＴ細胞活性化にとって必要であるので、研究者らは、
共刺激ポリペプチドＣＤ２８シグナル伝達ドメインをＣＡＲ構築物に付加した。この領域
は、通常、膜貫通領域（ＣＤ３ζバージョンの代わりに）、ならびにＰＩ３ＫおよびＬｃ
ｋに結合するためのＹＭＮＭモチーフを含む。ζだけを有するＣＡＲまたはζとＣＤ２８
の両方を有するＣＡＲを発現しているＴ細胞の間のインビボでの比較から、活性化後のＩ
Ｌ−２産生の増加に部分的に起因して、ＣＤ２８がインビボにおいて増殖を促進すること
が実証された。ＣＤ２８を含んでいるものは、第２世代ＣＡＲと呼ばれる。最もよく使用
される共刺激分子としては、ＣＤ２８および４−１ＢＢが挙げられ、これらは、腫瘍認識
後に、ＮＦ−κＢの活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを惹起し得、Ｔ細胞の増殖
と細胞生存の両方を促進する。
ＣＡＲのデザインにおいて共刺激ポリペプチド４−１ＢＢまたはＯＸ４０を使用するこ
とにより、Ｔ細胞の生存および効力がさらに改善された。４−１ＢＢは、特に、Ｔ細胞の
増殖および生存を大幅に増強するとみられる。この第３世代のデザイン（３つのシグナル
伝達ドメインを有する）は、ＰＳＭＡ ＣＡＲ（Ｚｈｏｎｇ ＸＳら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ
．２０１０ Ｆｅｂ；１８（２）：４１３−２０）およびＣＤ１９ ＣＡＲにおいて、最
も著しくはＣＬＬの処置のために、使用されている（Ｍｉｌｏｎｅ，Ｍ．Ｃ．ら（２００
９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１４５３−１４６４；Ｋａｌｏｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ．Ｔｒ
ａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１１）３：９５ｒａ７３；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．ら（２０１１）
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５−５３３）。これらの細胞は、インビボにお
いて１０００倍超増殖して、３人の患者において目覚ましい機能を示し、３人の患者すべ
てにおいて持続的な緩解をもたらした。
Ｔ細胞レセプターシグナル伝達は、二量体化のための化学的誘導物質（ＣＩＤ）に結合
する多量体化領域を含むキメラレセプターと組み合わせて、ＣＩＤを使用して誘導され得
る。Ｔ細胞を、ＣＤ３ ζ鎖（これは、１個、２個、もしくは３個のＦＫＢＰフラグメン
トと連結させた）を発現するように操作した。 The cells expressed the chimeric
receptor, and demonstrated CID-dependent T cell activation (Spencer, D
. M., et al., Science, 1993. 262: p. 1019-1024). ＣＡＲ改変Ｔ細胞の活
性化のための誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）分子を試験したところ、ＡＰ１９０
３（rimiducid）によるｉＭＣの活性化が、Ｔ細胞生存、増殖、活性化および腫瘍細胞殺
滅を増大させる強力な共刺激を提供することが見出された。
誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）分子は、Ｔ細胞において、ＣＤ３ζを含むＣＡＲ
分子と共発現させる場合、共刺激を提供することが見出された。このアッセイにおいて、
このＭｙＤ８８／ＣＤ４０分子はまた、多量体化領域を含み、ＡＰ１９０３リガンドの存
在下で誘導可能であった。この誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドを、ＣＤ１９結
合キメラ抗原レセプターと共発現した。二量体化リガンドの非存在下では、基底活性が観
察され、高いＩＬ−２生成を可能にした。
次に、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０分子を、これがまた、ＣＡＲデザインにおいて、ＣＤ２８
または４−１ＢＢ共刺激を置き換えるために使用され得るかどうかを決定するためにアッ
セイした。前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）標的化ＣＡＲへの共刺激分子としてのＭｙＤ８
８／ＣＤ４０の機能性を、ＣＤ３ζ（ＰＳＣＡ．ζ）またはＣＤ２８．ＣＤ３ζ（ＰＳＣ
Ａ．２８．ζ）内部ドメインのいずれかでアッセイしたところ、そのデータは、ＭＣの組
み込みが、Ｔ細胞生存および増殖を促進し、共培養アッセイにおいて、ＰＳＣＡ＋腫瘍細
胞株（Ｃａｐａｎ−１）に対する腫瘍殺滅を増強し、ＰＳＣＡ．ζのみで形質導入したＴ
細胞と比べて、サイトカイン生成（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−６）を改善することを
示した。ＭｙＤ８８／ＣＤ４０は、従って、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能を増強するために、例
えば、共刺激内部ドメインとして使用され得る。
本明細書中で使用されるとき、請求項および／または明細書において用語「含む（ｃｏ
ｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときの単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「
１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１つもしくは
１つより多くの」の意味とも一致する。なおもさらに、用語「有する」、「含む（ｉｎｃ
ｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉ
ｎｇ）」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな（ｏｐｅ
ｎ ｅｎｄｅｄ）用語であると認識している。
本明細書中で使用される用語「同種異系」は、宿主細胞とドナー細胞との間で抗原的に
異なるＨＬＡ遺伝子座またはＭＨＣ遺伝子座のことを指す。
したがって、同じ種から移植される細胞または組織は、抗原的に異なり得る。同系マウ
スは、１つ以上の遺伝子座が異なり得（コンジェニック）、同種異系マウスは、同じバッ
クグラウンドを有し得る。
本明細書中で使用される用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される
。この免疫応答は、抗体の産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化またはその両方を含
み得る。抗原は、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺滅されたまたは不活性化さ
れたホールセルまたは溶解産物に由来し得る。例示的な生物としては、ヘリコバクター、
カンピロバクター、クロストリジウム、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈ
ｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、インフルエンザウイルス、パ
ラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｉ、プラスモディウム、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマ
ウイルス、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、大腸菌、麻疹ウイルス、ロタウイルス、赤痢
菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａが挙
げられるが、これらに限定されない。ゆえに、実質的にすべてのタンパク質またはペプチ
ドを含む任意の高分子が、抗原として働き得る。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡに由来し得る。病原性ゲノム、または免疫応答を誘発するタンパク質に対する
遺伝子もしくは遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を
含む任意のＤＮＡは、抗原の合成をもたらす。さらに、本方法は、遺伝子またはゲノムの
核酸配列全体の使用に限定されない。本組成物および方法は、１つより多くの遺伝子また
はゲノムの部分的核酸配列の使用、およびこれら核酸配列が所望の免疫応答を誘起する種
々の組み合わせで配置されることを含むが、これらに限定されない。
用語「抗原提示細胞」は、少なくとも１つの抗原または抗原性フラグメントをその細胞
表面上に（または細胞表面に）ディスプレイするか、獲得するかまたは提示することがで
きる種々の細胞のいずれかである。一般に、用語「細胞」は、抗原または抗原性組成物に
対する免疫応答（すなわち、免疫系のＴ細胞またはＢ細胞のアームからの免疫応答）の強
化を助けるという目標を達成する任意の細胞であり得る。例えば、Ｋｕｂｙ，２０００，
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｐ．４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｙ（参照により本明細書中に援用される）において論じられ、ある
特定の実施形態において本明細書中で使用されるように、正常にまたはクラスＩＩ主要組
織適合分子もしくは主要組織適合複合体とともに免疫細胞に抗原をディスプレイするかま
たは提示する細胞が、「抗原提示細胞」である。ある特定の態様において、細胞（例えば
、ＡＰＣ細胞）は、別の細胞、例えば、組換え細胞または所望の抗原を発現している腫瘍
細胞と融合され得る。２つまたはそれを超える細胞の融合物を調製するための方法は、例
えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．６５−６６，７１−７４（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉ
ｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
．１３，Ｂｕｒｄｅｎ ＆ Ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｗ，ｐｐ．７５−８３，１９８４； Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５；Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６，Ｇｅｆｔｅｒら
、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，３：２３１−２３６，１９７７（これらの
各々は参照により本明細書中に援用される）において論じられている。場合によっては、
細胞が抗原をディスプレイするかまたは提示する免疫細胞は、ＣＤ４＋ＴＨ細胞である。
ＡＰＣ上または他の免疫細胞上に発現されるさらなる分子は、免疫応答の強化を助け得る
か、または改善し得る。分泌分子または可溶性分子、例えば、サイトカインおよびアジュ
バントもまた、抗原に対する免疫応答を助け得るかまたは高め得る。様々な例が、本明細
書中で論じられる。
「抗原認識部分」は、抗原に結合する任意のポリペプチドまたはそのフラグメント、例
えば、天然に由来するかまたは合成の抗体フラグメント可変ドメインであり得る。抗原認
識部分の例としては、抗体由来のポリペプチド（例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃ
Ｆｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントのような）；Ｔ細
胞レセプター由来のポリペプチド（例えば、ＴＣＲ可変ドメインのような）；シグナル伝
達ドメインに人工的に融合され得る分泌因子（例えば、サイトカイン、成長因子）（例え
ば、「ザイトカイン」）、および細胞外の同種（ｃｏｇｎａｔｅ）タンパク質に結合する
任意のリガンドまたはレセプターフラグメント（例えば、ＣＤ２７、ＮＫＧ２Ｄ）が挙げ
られるが、これらに限定されない。コンビナトリアルライブラリーはまた、腫瘍関連標的
に高親和性で結合するペプチドを同定するために使用され得る。さらに、「ユニバーサル
」ＣＡＲは、ビオチン化腫瘍標的化抗体と組み合わせてシグナル伝達ドメインにアビジン
(ａｖｉｄｅｎ)を融合することによって（Ｕｒｂａｎｓｋａ （１２） Ｃａ Ｒｅｓ）
、またはＦｃガンマレセプター／ＣＤ１６を使用して、ＩｇＧ標的化腫瘍に結合させるこ
とによって（Ｋｕｄｏ Ｋ （１３） Ｃａ Ｒｅｓ）、作製され得る。
用語「自己の」は、細胞、核酸、タンパク質、ポリペプチドなどであって、これが後に
個体に投与されるその同じ個体に由来するものを意味する。本方法の改変された細胞は、
例えば、自己細胞（例えば、自己Ｔ細胞のような）であり得る。
本明細書中で使用される用語「がん」は、そのユニークな特質である正常なコントロー
ルの喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす、
細胞の過剰増殖として定義される。例としては、メラノーマ、非小細胞肺がん、小細胞肺
がん、肺がん、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉がん、
舌がん、神経芽細胞腫、頭部がん、頚部がん、乳がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、骨
がん、精巣がん、卵巣がん、中皮腫、子宮頸がん、消火器がん、リンパ腫、脳がん、結腸
がん、肉腫または膀胱がんが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能
に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代のそれら
の子孫も含まれる。故意または偶然の変異に起因して、すべての子孫が同一でない可能性
があることが理解される。
「キメラ抗原レセプター」または「ＣＡＲ」は、例えば、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫
をもたらすように選択された、膜貫通ポリペプチドおよび細胞内ドメインポリペプチドに
連結された、標的抗原を認識するポリペプチド配列（抗原認識ドメイン）を含むキメラポ
リペプチドのことを意味する。その抗原認識ドメインは、一本鎖可変フラグメント（Ｓｃ
Ｆｖ）であり得るか、または例えば、他の分子（例えば、Ｔ細胞レセプターまたはパター
ン認識レセプターなど）に由来し得る。細胞内ドメインは、Ｔ細胞の活性化を引き起こす
少なくとも１つのポリペプチド（例えば、例えば、ＣＤ３ゼータであるがこれに限定され
ない、および、例えば、共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢであ
るがこれらに限定されない）を含む。用語「キメラ抗原レセプター」とは、抗体に由来す
るのではなくキメラＴ細胞レセプターに由来するキメラレセプターのことも指すことがあ
る。これらのキメラＴ細胞レセプターは、標的抗原を認識するポリペプチド配列を含み得
、ここで、その認識配列は、例えば、Ｔ細胞レセプターまたはｓｃＦｖに由来する認識配
列であり得るがこれらに限定されない。細胞内ドメインポリペプチドは、Ｔ細胞を活性化
するように作用するポリペプチドである。キメラＴ細胞レセプターは、例えば、Ｇｒｏｓ
ｓ，Ｇ．，ａｎｄ Ｅｓｈａｒ，Ｚ．，ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：３３７０−３
３７８（１９９２）およびＺｈａｎｇ，Ｙ．ら、ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：１
−１３（２０１０）において論じられている。
１つのタイプのキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）では、腫瘍特異的モノクローナル抗体
についての可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖が、Ｔ細胞レセプター複合体由来の
ＣＤ３ゼータ鎖（ζ）とインフレームで融合される。そのＶＨおよびＶＬは、通常、グリ
シン−セリン可動性リンカーを使用して互いに接続され、次いで、スペーサー（ＣＨ２Ｃ
Ｈ３）によって膜貫通ドメインに結合されることにより、腫瘍抗原と相互作用できるよう
にｓｃＦｖが細胞表面から離れて伸長する。形質導入の後、Ｔ細胞は、この時点で、その
表面上にＣＡＲを発現し、腫瘍抗原と接触し、ライゲーションすると、ＣＤ３ゼータ鎖を
介してシグナル伝達し、細胞傷害および細胞活性化を誘導する。
研究者らは、ＣＤ３ゼータを介したＴ細胞の活性化が、腫瘍特異的殺滅を誘導するのに
十分であるが、Ｔ細胞の増殖および生存を誘導するには不十分であることを述べている。
ゼータ鎖のみを発現している第１世代ＣＡＲによって改変されたＴ細胞を使用した初期の
臨床試験は、遺伝子が改変されたＴ細胞が、インビボにおいて不良な生存および増殖を示
すことを示した。
「抗原認識部分」は、抗原に結合する任意のポリペプチドまたはそのフラグメント、例
えば、天然に由来するかまたは合成の抗体フラグメント可変ドメインなどであり得る。抗
原認識部分の例としては、抗体に由来するポリペプチド、例えば、一本鎖可変フラグメン
ト（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；Ｔ細胞レ
セプターに由来するポリペプチド、例えば、ＴＣＲ可変ドメインなど；ならびに細胞外の
同種タンパク質に結合する任意のリガンドまたはレセプターフラグメントが挙げられるが
、これらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡのことを指すと意図されている。ゲノムＤＮＡ
、またはゲノムＲＮＡ鋳型、プロセシングされていないＲＮＡ鋳型もしくは部分的にプロ
セシングされたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡに対立するものとしてｃＤＮＡを使用す
ることの利点は、ｃＤＮＡが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含む点である。
完全または部分的なゲノム配列が使用されるときがあり、例えば、最適な発現のために非
コード領域を必要とする場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンススト
ラテジーにおいて標的化される場合が存在する。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、遺伝子産
物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物として定義され、ここで、核酸コ
ード配列の一部または全部が転写されることが可能であり、該構築物は、ベクターに挿入
され得る。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしも翻訳されるわけではない。
ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳
の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写だ
けを含む。用語「治療的な構築物」は、発現構築物または導入遺伝子のことを指すために
も使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、過剰増殖性疾患または過剰増
殖性障害（例えば、がん）を処置する治療として、使用され得、ゆえに、発現構築物また
は導入遺伝子は、治療的な構築物または予防的な構築物である。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝
子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを指す。場合によっ
ては、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。
他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成では、これらの配列は、翻
訳されない。発現ベクターは、種々の調節配列を含み得、それらの調節配列は、特定の宿
主生物において、作動可能に連結されたコード配列を転写するためおよびおそらく翻訳す
るために必要な核酸配列のことを指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳
を支配する調節配列に加えて、同様に他の機能を果たす核酸配列を含み得、それらは、下
で論じられる。
「構成的に活性な」は、キメラ刺激分子のＴ細胞活性化活性が、本明細書で示されるよ
うに、誘導物質の非存在下で活性であることを意味する。本出願において構成的に活性な
キメラ刺激分子は、多量体リガンド結合領域、または機能的多量体リガンド結合領域を含
まず、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、または他のＣＩＤによって誘導可能でない。
本明細書中で使用されるとき、用語「エキソビボ」は、身体の「外側」のことを指す。
用語「エキソビボ」および「インビトロ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「機能的に等価な」は、それがＣＤ４０に関すると
き、例えば、ＣＤ４０核酸フラグメント、バリアントまたはアナログについて言及してい
るとき、腫瘍もしくは過剰増殖性疾患を破壊するように免疫応答を刺激するＣＤ４０ポリ
ペプチドをコードする核酸またはＣＤ４０ポリペプチドのことを指す。ＣＤ４０ポリペプ
チドの「機能的に等価な」または「機能的フラグメント」とは、例えば、細胞外ドメイン
を欠いているが、抗原提示分子の樹状細胞の発現をアップレギュレートすることによって
Ｔ細胞媒介性の腫瘍殺滅応答を増幅することができるＣＤ４０ポリペプチドのことを指す
。用語「機能的に等価な」が、他の核酸またはポリペプチド、例えば、ＰＳＡペプチド、
ＰＳＭＡペプチド、ＭｙＤ８８または切断型ＭｙＤ８８などに適用されるとき、その用語
は、本明細書中の方法の参照ポリペプチドと同じまたは類似の活性を有するフラグメント
、バリアントなどのことを指す。例えば、腫瘍抗原ポリペプチド、例えば、ＰＳＭＡなど
の機能的フラグメントは、抗原性であり得、特定の腫瘍抗原を認識する抗体を産生させ得
る。リガンド結合領域の機能的フラグメント、例えば、Ｆｖｌｓは、適切なリガンドに結
合するのに十分なリガンド結合領域ポリペプチドの部分を含む。「機能的に等価な」とは
、例えば、細胞外ドメインを欠いているが、Ｔ細胞において発現されたとき、Ｔ細胞媒介
性の腫瘍殺滅応答を増幅することができる、共刺激ポリペプチドのことを指す。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的
な過剰増殖性疾患としては、がんまたは自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定され
ない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または
炎症性腸疾患が挙げられ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチド
またはペプチドをコードする単位として定義される。理解されるように、この機能的な用
語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペ
プチド、融合タンパク質および変異体を発現するかまたは発現するように適合された、よ
り小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。
用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を引き起こすことができる物質
のことを指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を
果たす自己抗原、およびがん細胞上に発現された腫瘍関連抗原が挙げられる。
本明細書中で使用される用語「免疫無防備状態」は、免疫系が衰えているかまたは弱く
なっている被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機
能不全または感染および／もしくは疾患への感受性を高める他の要因に起因し得る。その
ような分類は、評価に対して概念的基礎を与えるが、免疫無防備状態の個体は、一方の群
または他方の群に完全に当てはまらないことが多い。身体の防御機構における２つ以上の
欠損が、影響され得る。例えば、ＨＩＶによって引き起こされる特定のＴリンパ球欠損を
有する個体は、抗ウイルス治療のために使用される薬物によって引き起こされる好中球減
少症も有し得るか、または皮膚および粘膜の完全性が破られたために免疫無防備状態であ
り得る。免疫無防備状態の状況は、留置中心ライン（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ ｃｅｎｔｒ
ａｌ ｌｉｎｅｓ）もしくは静脈内薬物乱用に起因する他のタイプの機能障害に起因し得
るか；または続発性悪性疾患、栄養失調によって引き起こされ得るか、または他の感染病
原体（例えば、結核）もしくは性行為感染症、例えば、梅毒もしくは肝炎に感染している
ことに起因し得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、動物
またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の
有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。いく
つかの実施形態において、被験体は、哺乳動物である。
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、任意およびすべ
ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤な
どを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分
野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、本明細書中に提示されるベクター
または細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図さ
れる。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。いくつかの実施形態にお
いて、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである
。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として
定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中
で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互交換可能である。核酸は、モノマーの
「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドである。モノマーのヌクレオチド
は、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチド
には、当該分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含ま
れるが、これらに限定されず、そのような手段としては、組換え手段、すなわち、通常の
クローニング技術およびＰＣＲＴＭなどを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノム
からの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段が挙げられるが、これらに限定されな
い。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの変異を含み、当該分野で周知の方
法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異を含むが、これらに限定されない。核酸
は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、通常、規定の配列を有する、
アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドという
用語は、タンパク質という用語と相互交換可能であり得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始
するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識される
ＤＮＡ配列として定義される。
本明細書中で使用されるとき、用語「免疫応答を制御する」、「免疫応答を調節する」
または「免疫応答をコントロールする」とは、免疫応答を改変できることを指す。例えば
、組成物は、免疫応答を増強することおよび／または活性化することができる。なおもさ
らに、組成物は、免疫応答を阻害することもできる。制御の形態は、組成物とともに使用
されるリガンドによって決定される。例えば、化学物質の二量体アナログが、共刺激性ポ
リペプチドの二量体化をもたらし、Ｔ細胞活性化をもたらすが、しかしながら、その化学
物質のモノマーアナログは、共刺激ポリペプチドの二量体化をもたらさず、Ｔ細胞を活性
化しない。
用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、相互交換可能であり、外来性Ｄ
ＮＡ配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスのことを指す。トランスフェクション
（または形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃
送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション（ｓｕｐｅｒｆｅ
ｃｔｉｏｎ）などを含むいくつかの手段のうちのいずれか１つによって達成され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「同系」とは、同一の遺伝子型、または組織移植が
可能であるのに十分密接な関係がある遺伝子型、または免疫学的に適合性の遺伝子型を有
する細胞、組織または動物のことを指す。例えば、同じ近交系の一卵性双生児または動物
。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用され得る。
用語用語「患者」または「被験体」は、相互交換可能であり、本明細書中で使用される
とき、生物または動物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウ
ス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ
または他の非ヒト哺乳動物を含む）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物の脊椎動物、例え
ば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類、および非哺乳動物の無脊椎動物
を含む）を含むが、これらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形
態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワ
クチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を
含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途
処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体、サ
イトカインおよび／または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されない免疫応答を
引き起こすことができる。
本明細書中で使用されるとき、用語「転写支配下」または「作動可能に連結された」は
、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現をコントロールする核
酸に対して正しい位置および方向で存在することとして定義される。
「Ｔ細胞活性化分子」とは、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞に組み込まれたと
き、Ｔ細胞の活性化を増強するポリペプチドのことを意味する。例としては、ＩＴＡＭを
含みシグナル１を与える分子（ＩＴＡＭ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ，Ｓｉｇｎａｌ １ ｃ
ｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、例えば、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦ
ｃレセプターガンマ、例えば、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユ
ニットなど（Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１８２−７（２
００１））．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置さ
れる」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、予防法および／または治療のこと
を指す。その用語は、例えば、がん性の固形腫瘍などの固形腫瘍に関して使用されるとき
、固形腫瘍またはがんに対する被験体の抵抗性を高める予防的処置による予防のことを指
す。いくつかの例において、被験体は、がんを予防するために処置され得、ここで、その
がんは、家族性であるか、または遺伝的に関連する。その用語は、例えば、感染症に関し
て使用されるとき、病原体による感染に対する被験体の抵抗性を高める予防的処置、すな
わち換言すれば、その被験体が病原体に感染する可能性もしくはその感染症に起因し得る
疾病の徴候を示す可能性を低下させる予防的処置、ならびに感染症と闘うための、例えば
、感染症を弱めるためもしくは排除するための、または悪化するのを防ぐための、その被
験体が感染した後の処置のことを指す。
本明細書で提供される方法は、例えば、腫瘍抗原の上昇した発現が存在する疾患、障害
、または状態を処置するために使用され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形
態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワ
クチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を
含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途
処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体の産
生、サイトカインの産生および／または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されな
い免疫応答を引き起こすことができる。
血液疾患：本明細書中で使用される用語「血液疾患」、「血液疾患」および／または「
血液の疾患」は、血液およびその成分（血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質を含む
が、これらに限定されない）の産生、凝固のメカニズム、血液の産生、血液タンパク質の
産生などおよびそれらの組み合わせに影響する状態のことを指す。血液疾患の非限定的な
例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液学的新生物、アルブミン血症（ａｌｂｕｍｉ
ｎｅｍｉａｓ）、血友病などが挙げられる。
骨髄疾患：本明細書中で使用される用語「骨髄疾患」は、血液細胞および血小板の産生
の減少をもたらす状態のことを指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄の構造が、感
染症（例えば、結核）または悪性疾患によって取って代わられ得、その後、血液細胞およ
び血小板の産生の減少に至り得る。骨髄疾患の非限定的な例としては、白血病、細菌感染
症（例えば、結核）、放射線宿酔または放射線中毒、汎血球減少症（ａｐｎｏｃｙｔｏｐ
ｅｎｉａ）、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。
Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞：Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、リンパ球と称され
る白血球の一群に属する。リンパ球は、一般に、細胞性免疫に関わる。「Ｔ細胞」におけ
る「Ｔ」とは、胸腺に由来する細胞またはその成熟が胸腺に影響される細胞のことを指す
。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターとして知られる細胞表面タンパク質の存在によって、他の
リンパ球のタイプ（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）と区別され得
る。本明細書中で使用される用語「活性化Ｔ細胞」は、クラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨ
Ｃ）マーカーにおいて提示された抗原決定基の認識によって免疫応答（例えば、活性化Ｔ
細胞のクローン性増殖）をもたらすように刺激されたＴ細胞のことを指す。Ｔ細胞は、抗
原決定基、サイトカインおよび／またはリンフォカインならびに分化クラスター細胞表面
タンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などおよびそれらの組み合わせ）の存在に
よって活性化される。差次的なタンパク質のクラスターを発現する細胞は、しばしば、Ｔ
細胞表面上のそのタンパク質の発現について「陽性」であると言われる（例えば、ＣＤ３
またはＣＤ４の発現について陽性の細胞は、ＣＤ３＋またはＣＤ４＋と称される）。ＣＤ
３およびＣＤ４タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接的および／または間接
的に関わり得る細胞表面レセプターまたはコレセプターである。
末梢血：本明細書中で使用される用語「末梢血」は、血液の循環プールから得られるか
または調製され、リンパ系、脾臓、肝臓もしくは骨髄内に隔絶されない、血液の細胞成分
（例えば、赤血球、白血球および血小板）のことを指す。
臍帯血：臍帯血は、末梢血、およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔絶された血
液とは異なる。交換可能に使用され得る用語「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ
）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌ
ｏｏｄ）」は、胎盤および出産後のつながったままの臍帯に残存する血液のことを指す。
臍帯血は、造血細胞をはじめとした幹細胞を含むことが多い。
例えば、細胞の場合におけるような「得られるかまたは調製される」は、細胞または細
胞培養物が、その供給源から単離されること、精製されることまたは部分的に精製される
ことを意味し、ここで、その供給源は、例えば、臍帯血、骨髄または末梢血であり得る。
これらの用語は、元の供給源または細胞培養物が培養され、細胞が複製される場合、およ
び子孫細胞がその元の供給源に由来する場合にも適用され得る。
あるパーセントの細胞が殺滅される場合におけるような「殺滅する（ｋｉｌｌ）」また
は「殺滅する（ｋｉｌｌｉｎｇ）」は、アポトーシスを計測するための公知の任意の方法
を用いて計測されるときの、アポトーシスによる細胞の死を意味する。その用語は、細胞
剥離のことも指し得る。
ドナーＴ細胞：ここで使用される用語「ドナーＴ細胞」は、同種異系の幹細胞移植の後
に抗ウイルス免疫および／または抗腫瘍免疫をもたらすためにレシピエントにしばしば投
与されるＴ細胞のことを指す。ドナーＴ細胞は、骨髄移植片拒絶反応を阻害するためおよ
び同種異系生着（ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の成功を増加させるために利用され
ることが多いが、しかしながら、同じドナーＴ細胞は、宿主抗原に対する同種異系攻撃反
応（ａｌｌｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こし得、それはその後
、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらし得る。ある特定の活性化ドナーＴ細胞は、他の
活性化Ｔ細胞よりも高いまたは低いＧｖＨＤ反応を引き起こし得る。ドナーＴ細胞は、レ
シピエントの腫瘍細胞に対しても反応性であり得、有益な移植片対腫瘍効果を引き起こす
。
機能保存的バリアントは、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化
させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、ある
アミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有す
るアミノ酸で置き換えることが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的
にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である
。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の
特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異
なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配
列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき
、例えば、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、およ
び例えば少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は
、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類
似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の
「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味
する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（
およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロ
セスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための
数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ
法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡなど）が、当該分野で公知であ
る。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、特定の実施形態で使用される
設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。
間葉系ストローマ細胞：本明細書中で使用される用語「間葉系ストローマ細胞」または
「骨髄由来間葉系ストローマ細胞」は、エキソビボ、インビトロおよびインビボにおいて
脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得、標準的な培養条件においてプラスチッ
ク培養皿に接着する単核骨髄細胞の一部としてさらに定義され得る、多分化能幹細胞のこ
とを指し、造血系マーカーが陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性で
ある。
胚性幹細胞：本明細書中で使用される用語「胚性幹細胞」は、５０〜１５０個の細胞の
初期胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する、多能性幹細胞のことを指す。胚性幹細胞
は、それ自体を無限に再生する能力、ならびに３つの一次胚葉である外胚葉、内胚葉およ
び中胚葉のすべての誘導体に分化する能力を特徴とする。多能性細胞は、すべての細胞型
を生み出せるが、多分化能細胞（例えば、成体幹細胞）は、限られた数の細胞型しか生み
出せないという点で、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）は、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏ
ｔｅｎｔ）と区別される。
誘導性多能性幹細胞：本明細書中で使用される用語「誘導性多能性幹細胞」または「人
工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞などの、すべての細胞型ではないが多くの細胞型に分化
できる細胞を作製するように、遺伝的操作（例えば、後に多能性を活性化する遺伝子の発
現）、生物学的操作（例えば、ウイルスまたはレトロウイルスによる処理）および／また
は化学的操作（例えば、小分子、ペプチドなど）によって「再プログラムされた」または
誘導された、成体の細胞または分化細胞のことを指す。誘導性多能性幹細胞は、それらが
、中間に分化したまたは最終分化した状況（例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など
）を達成し、次いで、脱分化するように誘導され、それにより、多分化能細胞または多能
性細胞を作製する能力の一部または全部を回復するという点で胚性幹細胞と区別される。
ＣＤ３４＋細胞：本明細書中で使用される用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上
にＣＤ３４タンパク質を発現している細胞のことを指す。本明細書中で使用される「ＣＤ
３４」は、細胞間接着因子としてしばしば働き、リンパ節にＴ細胞が入ることに関与し、
「分化クラスター」遺伝子ファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質（例えば
、シアロムチンタンパク質）のことを指す。ＣＤ３４は、骨髄、細胞外マトリックスに、
またはストローマ細胞に直接、幹細胞が付着することも媒介し得る。ＣＤ３４＋細胞は、
臍帯および骨髄において造血細胞として、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆体細胞、
リンパ管（胸膜のリンパ管を除く）ではなく血管の内皮細胞、マスト細胞、皮膚の真皮の
間質におよび付属器周辺における樹状細胞の部分集団（ＸＩＩＩａ因子が陰性である）、
ならびにある特定の軟部組織の腫瘍（例えば、胞状軟部肉腫、プレＢ急性リンパ芽球性白
血病（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＭＬ−Ｍ７、隆起性皮膚
線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪
性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜（ｍｅｎｇｉｎｇｅａｌ）血管周囲細胞腫
、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫および甲状腺乳頭癌）における細胞に見られることが多
い。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、標的化された様式（ｍａｎｏｒ）で、腫瘍に浸潤し、
腫瘍細胞を殺滅する、様々なレセプターを有するＴ細胞のことを指す。本願の方法を使用
してＴＩＬの活性を制御することは、腫瘍細胞の排除のより直接的なコントロールを可能
にし得る。
遺伝子発現ベクター：本文書全体を通じて交換可能に使用され得る、本明細書中で使用
される用語「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」または「発現ベクター」は、
宿主細胞内で複製され得、単数または複数の遺伝子を宿主細胞に導入するために利用され
得る、核酸分子（例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、人工染色体
、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ））のことを広く指す。発現ベクター上に導入された
遺伝子は、内在性遺伝子（例えば、宿主細胞または宿主生物に通常見られる遺伝子）また
は異種遺伝子（例えば、ゲノムに通常見られない遺伝子または宿主細胞もしくは宿主生物
の染色体外核酸上の遺伝子）であり得る。発現ベクターによって細胞に導入される遺伝子
は、天然の遺伝子、または改変されたもしくは操作された遺伝子であり得る。遺伝子発現
ベクターは、発現ベクター上に保有された単数または複数の遺伝子の効率的な転写を促進
し得るかまたは増強し得る、エンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミ
ネーター配列として時折、機能し得る、５’および３’非翻訳制御配列を含むようにも操
作され得る。遺伝子発現ベクターは時折、特定の細胞型、細胞位置または組織タイプにお
ける複製および／または発現の機能性（例えば、転写および翻訳）について操作される。
発現ベクターは時折、宿主細胞またはレシピエント細胞においてベクターを維持するため
の選択マーカーを含む。
発生的に制御されるプロモーター：本明細書中で使用される用語「発生的に制御される
プロモーター」は、発生のプログラムまたは経路によってコントロールされるか、開始さ
れるか、または影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するＲＮＡポリメ
ラーゼに対する最初の結合部位として作用するプロモーターのことを指す。発生的に制御
されるプロモーターは、発生のプログラムまたは経路の一部である遺伝子の転写に影響し
得る転写のアクチベーターまたはリプレッサーに結合するためのさらなる調節領域をプロ
モーター領域にまたはプロモーター領域付近に有することが多い。発生的に制御されるプ
ロモーターは、時折、遺伝子産物が細胞の発生分化に影響する遺伝子の転写に関与する。
発生的に分化した細胞：本明細書中で使用される用語「発生的に分化した細胞」は、発
生的に制御される特定の遺伝子の発現を伴うことが多く、特定の機能を果たすために、そ
の細胞がそれほど特殊化されていない形態からより特殊化された形態に発展するプロセス
を経た細胞のことを指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、
皮膚細胞、神経細胞、血液細胞などである。発生分化の変化は、通常、遺伝子発現の変化
（例えば、遺伝子発現のパターンの変化）、遺伝子の再編成（例えば、サイレンシングさ
れるかまたは発現される遺伝子をそれぞれ隠すかまたは曝すリモデリングまたはクロマチ
ン）を含み、時々、ＤＮＡ配列の変化（例えば、免疫多様性の分化）を含む。発生中の細
胞分化は、遺伝子制御ネットワークの結果として理解され得る。制御遺伝子およびそのシ
ス制御のモジュールは、インプット（例えば、発生の経路またはプログラムの上流で発現
されるタンパク質）を受け取り、そのネットワークの別の箇所でアウトプットをもたらす
、遺伝子制御ネットワークにおける分岐点（ｎｏｄｅ）である（例えば、発現された遺伝
子産物は、その発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に対して作用する）。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的
な過剰増殖性疾患としては、がんまたは自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定され
ない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または
炎症性腸疾患が挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。ある特定
の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベ
クターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、細胞は、エ
キソビボにおいてウイルスベクターと接触され、いくつかの実施形態において、細胞は、
インビボにおいてウイルスベクターと接触されることが理解される。
ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキ
ソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。
いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対しても
たらされる。時折、免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答である。時折
、免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、細胞は、
アジュバントの添加なしに活性化される。
いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボにおいて核酸を形質導入され、皮内
投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソビボに
おいて核酸を形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。時折、その細胞は、
エキソビボにおいて核酸を形質導入される。時折、その細胞は、インビボにおいて核酸を
形質導入される。
ＭｙＤ８８、またはＭｙＤ８８ポリペプチドは、例えば、骨髄系分化一次応答遺伝子８
８（ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｐｏｎ
ｓｅ ｇｅｎｅ ８８）のポリペプチド生成物を意味するが、ｎｃｂｉ遺伝子ＩＤ ４６
１５として引用されるヒトバージョンに限定されない。ＭｙＤ８８ポリペプチドの一例は
、配列番号２８２として示される。「切断型」は、タンパク質が全長ではなく、例えば、
ドメインを欠いていてもよいことを意味する。例えば、切断型ＭｙＤ８８は、全長ではな
く、例えば、ＴＩＲドメインを失っていてもよい。切断型ＭｙＤ８８の一例は、本明細書
でＭｙＤ８８Ｌとして示され、配列番号５（核酸配列）および配列番号６（ペプチド配列
）としても示される。配列番号５は、サブクローニングの間に付加されたリンカーを含む
。「切断型ＭｙＤ８８」をコードする核酸配列は、切断型ＭｙＤ８８ペプチドをコードす
る核酸配列を意味し、この用語はまた、クローニングの人工物として付加される任意のア
ミノ酸（リンカーによってコードされる任意のアミノ酸を含む）をコードする部分を含む
核酸配列を指し得る。方法または構築物が切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを指す場合、そ
の方法がまた、別のＭｙＤ８８ポリペプチド（例えば、全長ＭｙＤ８８ポリペプチド）を
指すために使用され得るか、または、その構築物が別のＭｙＤ８８ポリペプチド（例えば
、全長ＭｙＤ８８ポリペプチド）を指すようデザインされ得ることは、理解される。方法
または構築物が、全長ＭｙＤ８８ポリペプチドを指す場合、その方法はまた、切断型Ｍｙ
Ｄ８８ポリペプチドを指すために使用され得るか、またはその構築物が切断型ＭｙＤ８８
ポリペプチドを指すようデザインされ得る。
本明細書中の方法において、ペプチドのＣＤ４０部分は、ＭｙＤ８８または切断型Ｍｙ
Ｄ８８ポリペプチド部分から上流または下流のいずれかに位置し得る。
いくつかの実施形態における細胞は、時折、エキソビボにおいて抗原と接触される。あ
る特定の実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答、例えば、細胞傷害性
Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答が、その抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態
において、免疫応答が、腫瘍抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に対してもたらされる。いくつか
の実施形態において、核酸は、エキソビボにおいて調製され、例えば、皮内投与または皮
下投与によって、被験体に投与される。時折、細胞は、エキソビボまたはインビボにおい
て核酸を形質導入されるかまたはトランスフェクトされる。
いくつかの実施形態において、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された
プロモーター配列を含む。あるいは、核酸は、キメラタンパク質のタンパク質コード領域
を含む、エキソビボにおいて転写されるＲＮＡを含む。
固形腫瘍の「腫瘍サイズを減少させる」または「腫瘍の成長を阻害する」とは、標準的
なガイドライン、例えば、例えば、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（Ｒｅ
ｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏ
ｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）基準に従う、処置に対する応答または疾患の安定化のことを意味
する。例えば、これは、固形腫瘍の直径の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５
０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少、または腫瘍、循環腫瘍
細胞もしくは腫瘍マーカーの数の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６
０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少を含み得る。腫瘍のサイズは、例
えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、胸部Ｘ線（肺の腫瘍の場合）また
は分子イメージング、例えば、ＰＥＴスキャン、例えば、阻害剤がＴＲＯＦＥＸＴＭ／Ｍ
ＩＰ−１０７２／１０９５である場合など、例えば、ヨウ素１２３で標識されたＰＳＡ、
例えば、ＰＳＭＡリガンドを投与した後のＰＥＴスキャン、または分子イメージング、例
えば、ＳＰＥＣＴ、またはＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、１１１−イリジウム
で標識されたＰＳＭＡ抗体であるカプロマブ（ｃａｐｒｏｍａｄ）ペンデチド（ｐｅｎｄ
ｅｔｉｄｅ）（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）などを用いるＰＥＴスキャンをはじめとした任
意の方法によって解析され得る。
「腫瘍の血管新生を減少させるか、遅延させるかまたは阻害する」とは、処置前の腫瘍
の血管新生の量と比べたときの、腫瘍の血管新生の約５％、１０％、２０％、３０％、４
０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の減少または新しい血
管構造の出現の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８
０％、９０％もしくは１００％の減少のことを意味する。その減少は、１つの腫瘍につい
て言及していることもあるし、１つより多い腫瘍における血管新生の合計または平均でも
あり得る。腫瘍の血管新生を測定する方法としては、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩ、
例えば、ＣＴ−ＭＲＩ、または分子イメージング、例えば、ＳＰＥＣＴもしくはＰＥＴス
キャン、例えば、阻害剤がＴＲＯＦＥＸＴＭ／ＭＩＰ−１０７２／１０９５である場合な
ど、例えば、ヨウ素１２３で標識されたＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡリガンドの投与後のＰ
ＥＴスキャンなど、またはＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡ抗体、例えば、１１１−イリジウム
で標識されたＰＳＭＡ抗体であるカプロマブペンデチド（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）など
を用いるＰＥＴスキャンが挙げられる。
例えば、腫瘍が、前立腺に存在するものであるか、または前立腺における腫瘍に由来す
るかもしくは前立腺における腫瘍から転移したものであるか、またはＰＳＡを産生するも
のであるとき、その腫瘍は、前立腺がんの腫瘍などと分類されるかまたは器官の一部とし
て命名される。例えば、腫瘍が、被験体の前立腺における腫瘍と同じまたは同様の染色体
切断点を有すると決定されるとき、その腫瘍は、前立腺における腫瘍から転移したもので
ある。
前立腺がん
米国では、前立腺がんは、男性において最も一般的な固形腫瘍の悪性疾患である。２０
０８年の前立腺がんの新しい症例は推定１８６，３２０例であり、２８，６６０人が死亡
すると予想された。Ｊｅｍａｌ Ａら、Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００８
．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．５８：７１−９６，２００８。一次療法の後にＰ
ＳＡ−進行を経験する患者のおよそ７０％が、その疾患の経過中の任意の時点において転
移する。Ｇｉｔｔｅｓ ＲＦ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３２４：２３６−４５，１９
９１。アンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）は、転移性前立腺がんに対する標準的な治療法で
あり、８０〜８５％の患者において、一時的な腫瘍のコントロールまたは後退を達成する
。Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＥＤら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３２１：４１９−２４，１９
８９；Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ ＰＦら、Ｊ Ｕｒｏｌ．１５７：１７３１−５，１９
９７；Ｓｃｈｅｒ ＨＩ ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ ＷＫ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１１
：１５６６−７２，１９９３；Ｓｍａｌｌ ＥＪ ａｎｄ Ｓｒｉｎｉｖａｓ Ｓ，Ｃａ
ｎｃｅｒ．７６：１４２８−３４，１９９５。
ホルモン療法に対する奏効期間ならびにホルモン療法開始後の生存時間は、いくつかの
因子に依存することが示されており、その因子としては、原発性腫瘍のグリーソン和（Ｇ
ｌｅａｓｏｎ Ｓｕｍ）、ＡＤＴ開始後に検出不可能な最下点ＰＳＡを達成する能力、お
よびＡＤＴ開始前のＰＳＡ倍加時間が挙げられる。ホルモン療法にもかかわらず、転移性
前立腺がんを有する実質的にすべての患者が、最終的には進行性疾患を発症する。Ｋｅｌ
ｌｙ ＷＫ ａｎｄ Ｓｌｏｖｉｎ ＳＦ，Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．２：３９４
−４０１，２０００；Ｓｃｈｅｒ ＨＩら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８
８：１６２３−３４，１９９６；Ｓｍａｌｌ ＥＪ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ ＮＪ
，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１５：３８２−８，１９９７。原発性腫瘍のグリーソン和
、すなわちグリーソンスコアを用いることにより、その腫瘍の微視的評価に基づいて男性
の前立腺がんのレベルがグレーディングされる。より高いグリーソンスコアは、そのがん
が、より高悪性度であり、広がる可能性がより高いので、より不良な予後を有するがんで
あることを意味する。このグレーディングシステムの例は、Ｇｌｅａｓｏｎ ＤＦ．，Ｔ
ｈｅ Ｖｅｔｅｒａｎ’ｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ
Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ：ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｇｒａｄｉ
ｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｒ
ｃｉｎｏｍａ．Ｉｎ Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ Ｍ（ｅｄ．）Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈ
ｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ．Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａ
ｄｅｌｐｈｉａ，１９７７；１７１−１９８において論じられている。
ＡＤＴを開始した前立腺がんを有するほとんどの患者は、一次療法（例えば、前立腺全
摘除術、近接照射療法、外照射療法、凍結切除（cryo-ablation）など）が失敗した後の
上昇性のＰＳＡに対して処置される。臨床転移が無い場合、これらの患者は、７〜１１年
間の範囲の比較的長い無病期間を経験するが；しかしながら、これらの患者の大部分は、
最終的には、去勢レベルの血清テストステロンにもかかわらず上昇性のＰＳＡレベルの再
発によって証明されるようなホルモン抵抗性疾患を発症する。これらの患者もまた、予後
不良であり、大部分は、９ヶ月以内に臨床転移を発症し、２４ヶ月という生存期間中央値
を有する。Ｂｉａｎｃｏ ＦＪら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ：Ａｂｓｔｒａｃ
ｔ ２７８，２００５．用語「前立腺がん」は、種々の形態またはステージを含み、それ
らには、例えば、転移性、転移性去勢抵抗性、転移性去勢感受性、局所進行性および限局
性の前立腺がんが含まれる。
（発現構築物の操作）
本発明のキメラ刺激分子を発現する発現構築物は、キメラ刺激分子コード領域およびプ
ロモーター配列（全て作動可能に連結される）を含む。本発明のＭｙＤ８８／ＣＤ４０コ
ードキメラ抗原レセプターを発現する発現構築物は、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レ
セプターコード領域およびプロモーター配列（全て作動可能に連結される）を含む。一般
に、用語「作動可能に連結された」は、プロモーター配列が第２の配列に機能的に連結さ
れていることを示すと意味され、ここで、そのプロモーター配列は、第２の配列に対応す
るＤＮＡの転写を開始および媒介する。
ある特定の例では、キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドまたはＭｙＤ８８／
ＣＤ４０キメラ抗原レセプターコード領域は、第２のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドと同じベクター（例えば、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターのよう
な）の中に含まれる。この第２のポリペプチドは、例えば、カスパーゼポリペプチド（本
明細書で論じられるとおり）またはマーカーポリペプチドであり得る。このベクターが、
キメラ刺激分子を発現する場合、この第２のポリペプチドはまた、例えば、非ＭｙＤ８８
／ＣＤ４０含有キメラ抗原レセプターであり得る。これらの例では、上記構築物は、切断
可能な２Ａポリペプチドによって連結されたその２種のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む核酸に作動可能に連結された１つのプロモーターとともにデザインされ
得る。この例では、その第１および第２のポリペプチドは、翻訳の間に分離され、キメラ
刺激分子またはＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターのポリペプチドのいずれか、
および第２のポリペプチドを生じる。他の例では、この２種のポリペプチドは、同じベク
ターから別個に発現されてもよく、ここでは上記ポリペプチドのうちの一方をコードする
ポリヌクレオチドを含む各核酸が、別個のプロモーターに作動可能に連結される。なお他
の例では、１つのプロモーターが、上記２種のポリヌクレオチドに作動可能に連結され得
、２種の別個のＲＮＡ転写産物、および従って２種のポリペプチドの産生を誘導し得る；
一例では、上記プロモーターは、２方向性であってもよいし、そのコード領域は、反対の
方向５’−３’にあってもよい。従って、本明細書で論じられる発現構築物は、少なくと
も１つ、または少なくとも２つのプロモーターを含み得る。
さらに他の例では、２種のポリペプチド（例えば、キメラ刺激分子またはＭｙＤ８８／
ＣＤ４０キメラ抗原レセプターポリペプチド、および第２のポリペプチドのような）は、
２種の別個のベクターを使用して細胞において発現され得る。その細胞は、ベクターでコ
トランスフェクトされてもよいし、共形質導入されてもよいか、または上記ベクターは、
異なる時点で上記細胞に導入されてもよい。
そのポリペプチドは、それらの順序において、アミノ末端からカルボキシ末端へと変動
し得る。例えば、キメラ刺激分子では、ＭｙＤ８８ポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド
、および任意のさらなるポリペプチドの順序が、変動し得る。このキメラ抗原レセプター
では、ＭｙＤ８８ポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド、および任意のさらなるポリペプ
チド（例えば、ＣＤ３ζポリペプチドのような）の順序が、変動し得る。種々のドメイン
の順序は、最適な発現および活性を得るために、例えば、本明細書で論じられる方法など
の方法を使用してアッセイされ得る。
ある特定の実施形態において、以下を含む核酸分子が提供される：
キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモー
ターであって、ここでこのキメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩ
Ｒドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外
ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、ここでこのキメラ刺激分
子は、膜標的化領域を含まない、プロモーター；および
ｂ）Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプター、またはキメ
ラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド；および
ｃ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド。上記ポリヌクレオチドの順序
は変動し得、任意の特定の方法に関して上記構築物が適切であることを決定するために試
験され得、従って、この核酸は、種々の順序（これはまた、上記第１のポリヌクレオチド
中のＭｙＤ８８ポリペプチドまたは切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドコード配列およびＣＤ
４０細胞質ポリペプチド領域コード配列の順序のバリエーションを考慮に入れる）で、上
記ポリヌクレオチドを含み得ることが理解される。従って、上記第１のポリヌクレオチド
は、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０、切断型ＭｙＤ８８／ＣＤ４０、ＣＤ４０／ＭｙＤ８８、また
はＣＤ４０／切断型ＭｙＤ８８を有し、かつこの順序を有するポリペプチドをコードし得
る。そして、この核酸は、上記第１から第３のポリヌクレオチドを、以下の順序（ここで
、１、２、３は、５’から３’へと、上記核酸の中のポリヌクレオチドの第１、第２、ま
たは第３の順序を示す）のうちのいずれかで含み得る。他のポリヌクレオチド（例えば、
２Ａポリペプチドをコードするもの）は、例えば、その３つの列挙されたポリヌクレオチ
ドの間に存在し得ることは、理解される；この表は、上記第１から第３のポリヌクレオチ
ドの順序を指定することが意味される：
同様に、上記核酸は、上記の表中で提供されるポリペプチドのうちの２種をコードする
、上記ポリヌクレオチドのうちの２種のみを含み得る。いくつかの例では、細胞は、上記
の表Ａの中に含まれる３種のポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトまたは形質
導入される。他の例では、細胞は、例えば、表Ｂ中で提供されるとおりのポリペプチドの
うちの２種をコードする、ポリヌクレオチドのうちの２種をコードする核酸でトランスフ
ェクトまたは形質導入される。
いくつかの実施形態において、上記細胞は、上記ポリヌクレオチドのうちの２種をコー
ドする核酸でトランスフェクトまたは形質導入され、上記細胞はまた、上記第３のポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。例えば、細胞は、上記第１のお
よび第２のポリヌクレオチドを含む核酸を含み得、そして上記細胞はまた、キメラカスパ
ーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み得る。同様に、細
胞は、上記第１および第３のポリヌクレオチドを含む核酸を含み得、そして上記細胞はま
た、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプター、またはキメラ
抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み得る。
Ｔ細胞レセプターは、Ｔ細胞の表面に存在する２種の異なるポリペプチドから構成され
る分子である。それらは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合した抗原を認識する；上
記抗原での認識の際に、上記Ｔ細胞は活性化される。「認識する」は、例えば、Ｔ細胞レ
セプターまたはそのフラグメント（単数または複数）、例えば、ＴＣＲαポリペプチドお
よびＴＣＲβが一緒に、上記抗原と接触し、これを標的として同定することができること
を意味する。ＴＣＲは、αおよびβポリペプチド、または鎖を含み得る。このαポリペプ
チドおよびβポリペプチドは、２つの細胞外ドメイン、可変ドメインおよび定常ドメイン
を含む。このαおよびβポリペプチドの可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ
）を有する；ＣＤＲ３は、エピトープの認識を担う主要なＣＤＲであると考えられる。そ
のαポリペプチドは、ＶＪ組換えによって生成される、Ｖ領域およびＪ領域を含み、その
βポリペプチドは、ＶＤＪ組換えによって生成される、Ｖ領域、Ｄ領域、およびＪ領域を
含む。ＶＪ領域およびＶＤＪ領域の交差は、ＣＤＲ３領域に相当する。ＴＣＲはしばしば
、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ （ＩＭＧＴ） ＴＣＲ
命名を使用して命名される（ＩＭＧＴデータベース、ｗｗｗ．ＩＭＧＴ．ｏｒｇ； Ｇｉ
ｕｄｉｃｅｌｌｉ， Ｖ．ら，ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ、免疫グロブリンおよびＴ細胞
レセプターヌクレオチド配列のＩＭＧＴ（登録商標）包括的データベース、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３４， Ｄ７８１−Ｄ７８４ （２００６）． ＰＭＩＤ：
１６３８１９７９；Ｔ細胞レセプター Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ， ＬｅＦｒａｎｃ ａｎｄ
ＬｅＦｒａｎｃ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ＩＳＢＮ ０−１２−４４１３
５２−８）。Ｔ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプター、またはＴＣＲ様キメラ抗
原レセプターは、例えば、Ｚｈａｎｇ， Ｇ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４， Ａｒｔｉｃｌｅ ３５７１ （２０１４）およびＺｈａｎｇ
， Ｇ．ら， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ ９１（１０）： ６１５−２
４ （２０１３）（これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）
において論じられるように、ＴＣＲ様特異性を有するキメラ抗原レセプターである。
提供される方法の工程は、任意の好適な方法を使用して行われ得、これらの方法として
は、本明細書中に提示される細胞に核酸を形質導入する方法、形質転換する方法または別
途提供する方法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、
切断型ＭｙＤ８８ペプチドは、配列番号５のヌクレオチド配列（ＤＮＡリンカー有りもし
くは無しで、または配列番号６のアミノ酸配列を有する）によってコードされる。いくつ
かの実施形態において、ＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域は、配列番号１におけるポリヌ
クレオチド配列によってコードされる。
選択マーカー
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めること
によってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そ
のようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変
化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび
形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシ
ン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子
は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（
ｔｋ）などの酵素が使用される。免疫学的表面マーカーを含む細胞外の非シグナル伝達ド
メインまたは様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）もまた使用
され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方
法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現
されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例として
は、例えば、レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ベータ−ｇａｌまたはクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が挙げられる。ある特定の実施形態
において、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９などは、例えば、免疫磁気選択などに
おいて、移入するための細胞の選択のために使用される。本明細書中で論じられるように
、ＣＤ１９マーカーは、抗ＣＤ１９抗体、すなわち、例えば、ＣＤ１９に結合するｓｃＦ
ｖ、ＴＣＲまたは他の抗原認識部分と区別される。
ある特定の実施形態において、マーカーポリペプチドは、誘導性キメラ刺激分子に連結
される。例えば、マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列、例えば、切断可能な２Ａ
様配列などを介して誘導性キメラ刺激分子に連結され得る。マーカーポリペプチドは、例
えば、ＣＤ１９、ΔＣＤ１９であり得るか、または例えば誘導性キメラ刺激分子の活性に
影響しないように選択される異種タンパク質であり得る。
２Ａ様配列または「ペプチド結合スキッピング」２Ａ配列は、例えば、Ｔｈｏｓｅａ
ａｓｉｇｎａ由来のものを含む、例えば、多くの異なるウイルスに由来する。これらの配
列は、時折、「ペプチドスキッピング配列」としても知られる。このタイプの配列が、分
断されるように意図された２つのペプチドの間のシストロン内に配置されるとき、リボソ
ームは、ペプチド結合をスキップするとみられ、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａの配列の場
合、カルボキシ末端「Ｐ−Ｇ−Ｐ」におけるＧｌｙアミノ酸とＰｒｏアミノ酸との間の結
合が省略される。これにより、２つから３つのポリペプチド、この場合、共刺激ポリペプ
チド細胞質領域およびマーカーポリペプチドが残される。この配列が使用されるとき、２
Ａ配列の５’側でコードされるペプチドは、カルボキシ末端において、Ｇｌｙ残基および
２Ａ配列内の任意の上流残基を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。２Ａ配列の３
’側でコードされるペプチドは、アミノ末端において、Ｐｒｏ残基および２Ａ配列の後ろ
の任意の下流残基を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞をソートする一助とするために、
発現ベクターの中に含まれ得る。例えば、ＣＤ３４最小エピトープは、ベクターの中に組
み込まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキメラ抗原レセプタ
ーまたはキメラ刺激分子を発現させるために使用される発現ベクターは、１６アミノ酸の
ＣＤ３４最小エピトープをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書中の例に
おいて提供されるある特定の実施形態などのいくつかの実施形態において、ＣＤ３４最小
エピトープは、ＣＤ８ストークのアミノ末端位置において組み込まれる。
共刺激ポリペプチド
共刺激ポリペプチド分子は、細胞の生存および増殖に関与するシグナル伝達経路の活性
化によって細胞媒介性の免疫応答を増幅することができる。企図される共刺激タンパク質
としては、例えば、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバー（すなわ
ち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）およびＣＤ２８フ
ァミリーのメンバー（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。共
刺激タンパク質には、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＣＤ３ζ鎖、また
は例えばそれらの細胞質領域が含まれ得る。２つ以上の共刺激ポリペプチドまたは共刺激
ポリペプチドの細胞質領域が、本明細書中で論じられる誘導性キメラ刺激分子において使
用され得る。
共刺激ポリペプチドには、ＮＦ−κＢ経路、Ａｋｔ経路および／またはｐ３８経路を活
性化する任意の分子またはポリペプチドが含まれる。細胞活性化システムは、１つ以上の
リガンド結合ドメイン（すなわち、小分子結合ドメイン）に融合された組換えシグナル伝
達分子の利用に基づき、ここで、共刺激ポリペプチドは、オリゴマー化をもたらすリガン
ド（すなわち、脂質透過性の有機二量体化薬物）によって活性化されるおよび／または制
御される。共刺激ポリペプチドの架橋またはオリゴマー化のために使用され得る他のシス
テムは、抗体、天然のリガンドおよび／または人工の交差反応リガンドもしくは合成リガ
ンドを含む。なおもさらに、企図される別の二量体化のシステムは、クーママイシン／Ｄ
ＮＡジャイレースＢシステムを含む。
使用され得る共刺激ポリペプチドは、ＮＦ−κＢおよび他の可変性のシグナル伝達カス
ケード、例えば、ｐ３８経路および／またはＡｋｔ経路を活性化するポリペプチドを含む
。そのような共刺激ポリペプチドとしては、ＣＤ２８ファミリーメンバー（例えば、ＣＤ
２８、ＩＣＯＳ）、ＴＮＦレセプター（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−
Ｒ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的実施形態において、上記共刺激ポリペプチド分子は、ＣＤ４０、切断型ＭｙＤ８
８、またはキメラ切断型ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドである。
ＣＤ４０分子は、（１）ストリンジェントな条件下において、公知のＣＤ４０遺伝子の
配列を有する核酸にハイブリダイズし、（２）ＣＤ４０ポリペプチドをコードする、核酸
分子を含む。ＣＤ４０ポリペプチドは、ある特定の例では、細胞外ドメインを欠くことが
ある。ＣＤ４０ポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチド配列としては、配列
番号１および他の種に由来するＣＤ４０アイソフォームが挙げられるが、これらに限定さ
れない。ＣＤ４０の他の正常なバリアントまたは変異体バリアントが、本方法および組成
物において使用され得ることが企図される。したがって、ＣＤ４０領域は、１つまたはそ
れを超えるアミノ酸の置換、欠失および／または挿入によって天然の配列とは異なるアミ
ノ酸配列を有し得る。例えば、１つまたはそれを超えるＴＮＦレセプター関連因子（ＴＲ
ＡＦ）結合領域が、排除され得るかまたは効果的に排除され得る（例えば、ＣＤ４０アミ
ノ酸配列は、ＴＲＡＦタンパク質が、天然のＣＤ４０配列に結合しないかまたは天然のＣ
Ｄ４０配列に結合するときよりも低親和性で結合するように、欠失されるかまたは変更さ
れる）。特定の実施形態において、ＴＲＡＦ３結合領域は、それが排除されるかまたは効
果的に排除されるように、欠失されるかまたは変更される（例えば、アミノ酸２５０〜２
５４が、変更され得るかまたは欠失され得る；Ｈａｕｅｒら、ＰＮＡＳ １０２（８）：
２８７４−２８７９（２００５））。
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、発現構築物を生成するために遺伝子材
料の操作を要する。このような方法は、例えば、本明細書で論じられるキメラ刺激分子ま
たはキメラ抗原レセプターをコードする異種核酸配列を含む発現構築物の生成、およびそ
れらの発現のための手段を要する。上記ベクターは、適切なヘルパー細胞中で複製され得
、ウイルス粒子は、そこから生成され得、細胞は、この組換えウイルス粒子に感染し得る
。
遺伝子治療の文脈において、遺伝子は、ベクターの骨格を提供するウイルスゲノム以外
の起源に由来する異種ポリヌクレオチド配列であり得る。遺伝子は、原核生物または真核
生物の起源（例えば、細菌、ウイルス、酵母、寄生生物、植物またはさらには動物）に由
来する。また、異種ＤＮＡは、２つ以上の起源に由来し、すなわち、多重遺伝子構築物ま
たは融合タンパク質である。また、異種ＤＮＡは、１つの起源に由来する制御配列および
異なる起源に由来する遺伝子を含み得る。
共刺激ポリペプチドは、本明細書中に提供されるアミノ酸配列を含み得るが、これらに
限定されず、欠失または切断をはじめとした機能的な保存的変異を含み得、本明細書中に
提供されるアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１０
０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
リガンド結合領域
リガンド結合領域は、本明細書で論じられるキメラポリペプチドの中に、例えば、誘導
性カスパーゼポリペプチドの一部として含まれ得る。発現構築物のリガンド結合（「二量
体化」）ドメインは、天然または非天然のリガンド、例えば、非天然の合成リガンドを使
用して誘導を可能にし得る任意の好都合なドメインであり得る。多量体化領域、多量体リ
ガンド結合領域、多量体化領域、またはリガンド結合ドメインは、構築物の性質およびリ
ガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内側または外側であり得る。上に示された細胞質
領域と会合されるリガンド結合タンパク質を含むレセプターをはじめとした多種多様のリ
ガンド結合タンパク質が公知である。本明細書中で使用されるとき、用語「リガンド結合
ドメインは、用語「レセプター」と相互交換可能であり得る。リガンド（例えば、小さい
有機リガンド）が公知であるかまたは容易に生成され得るリガンド結合タンパク質が、特
に興味深い。これらのリガンド結合ドメインまたはレセプターには、ＦＫＢＰおよびシク
ロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上に示さ
れた他のレセプターなど、ならびに抗体から得ることができる「非天然の」レセプター、
特に、重鎖または軽鎖サブユニット、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリ
アル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列が含まれる。ある特定の実施形態に
おいて、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリ
ガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリ
ガンド結合領域およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択
される。しばしば、リガンド結合領域は、ＦｖＦｖｌｓ配列を含む。時折、Ｆｖ’Ｆｖｌ
ｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさらに含む。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，Ｓ
．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３１３−３２１（２０００）
およびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ．＆
Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １０：６６７−６７５（２００
７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ（２００６）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ６７
：４４０−２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆ
ｒｏｍ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｓ．ら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，
２００７））において論じられているものが挙げられる。
おおむね、リガンド結合ドメインまたはレセプタードメインは、天然のドメインまたは
その切断された活性な一部として、少なくとも約５０アミノ酸、および約３５０アミノ酸
未満、通常、２００アミノ酸未満であり得る。結合ドメインは、例えば、低分子（ウイル
スベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にする＜２５ｋＤａ）であり得、モ
ノマーであり得、非免疫原性であり得、二量体化のために形成され得る、合成的に入手可
能な細胞透過性の無毒性リガンドを有し得る。
レセプタードメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの利用可能性に応
じて、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のい
ずれの側であってもよいが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガン
ドを結合にとって利用可能な形態で内部移行させるための輸送系が存在しない場合、結合
ドメインは、通常、細胞膜に対して外側であり得る。細胞内レセプターの場合、構築物は
、レセプタードメイン配列の５’または３’においてシグナルペプチドおよび膜貫通ドメ
インをコードし得るか、またはレセプタードメイン配列の５’に脂質付着シグナル配列を
有し得る。レセプタードメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間に存在する
場合、レセプタードメインは、細胞外であり得る。
レセプターをコードする発現構築物の一部は、種々の理由のために変異誘発に供され得
る。変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を提供し得、天然に存在するレセ
プターと変異誘発されたレセプターとのリガンドによる区別を可能にし得、レセプター−
リガンド対などをデザインする機会を提供し得る。レセプターの変更は、結合部位におけ
るコンビナトリアル法を使用したランダム変異誘発と知られているアミノ酸の変更を含み
得、ここで、結合部位に関連するアミノ酸または立体構造変化に関連する他のアミノ酸に
対するコドンが、特定のアミノ酸に対するコドン（複数可）を公知の変化によってまたは
ランダムに変更し、得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現し、次いで、
得られたタンパク質を結合についてスクリーニングすることによって、変異誘発に供され
得る。
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特にフラグメント、より詳
細には、可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合をもたらす重鎖と軽鎖との融
合物が、結合ドメインとして使用され得る。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさ
ず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）では発現されない細胞外ドメインな
どの異所的に発現されたヒト生成物であるものが含まれる。そのような例としては、低親
和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）および胚表面タンパク質（すなわち、癌胎児
抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。
なおもさらに、抗体は、生理的に許容され得るハプテン分子、および結合親和性につい
てスクリーニングされる個別の抗体サブユニットに対して調製され得る。そのサブユニッ
トをコードするｃＤＮＡは、単離され、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の変
異誘発などによって改変されることにより、リガンドに対して適切な親和性を有する結合
タンパク質ドメインを得ることができる。このように、ほとんどの生理的に許容され得る
任意のハプテン化合物が、リガンドとして使用され得るか、またはリガンドに対するエピ
トープを提供するために使用され得る。抗体単位の代わりに、結合ドメインが公知であっ
て、結合のための有用なリガンドが存在する、天然のレセプターが使用され得る。
オリゴマー化
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマ
ー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得る
が、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用
され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの
反復の数に関して、変動し得る。
カスパーゼ−９ポリペプチドを多量体化する場合、キメラ誘導性カスパーゼ−９ポリペ
プチドのリガンド結合ドメイン／レセプタードメインに対するリガンドは、通常、少なく
とも２つの結合部位を有し、それらの結合部位の各々がリガンドレセプタードメインに結
合することができるという意味において、多量体であり得る。「多量体リガンド結合領域
」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合領域のことを意味する。用語「多量体リ
ガンド」には、二量体のリガンドが含まれる。二量体のリガンドは、リガンドレセプター
ドメインに結合することができる２つの結合部位を有し得る。望ましくは、対象のリガン
ドは、二量体またはそれより高次のオリゴマー、通常、約四量体以下の、小さい合成有機
分子であり得、個々の分子は、代表的には、少なくとも約１５０Ｄａおよび約５ｋＤａ未
満、通常、約３ｋＤａ未満であり得る。合成リガンドとレセプターとの種々の対が、使用
され得る。例えば、天然のレセプターを含む実施形態において、二量体のＦＫ５０６は、
ＦＫＢＰ１２レセプターとともに使用され得、二量体化されたシクロスポリンＡは、シク
ロフィリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたエストロゲンは、エストロゲ
ンレセプターとともに使用され得、二量体化された糖質コルチコイドは、糖質コルチコイ
ドレセプターとともに使用され得、二量体化されたテトラサイクリンは、テトラサイクリ
ンレセプターとともに使用され得、二量体化されたビタミンＤは、ビタミンＤレセプター
とともに使用され得るなど。あるいは、それより高次のリガンド、例えば、三量体が、使
用され得る。非天然のレセプター、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニ
ット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタ
ンデムで含む一本鎖抗体、または改変されたレセプターならびにその変異された配列など
を含む実施形態の場合、多種多様な化合物のうちのいずれかが使用され得る。これらのリ
ガンド単位の有意な特色は、各結合部位が、高親和性でレセプターに結合することができ
る点、およびそれらのリガンド単位が、化学的に二量体化されることができる点である。
また、リガンドが、機能的なレベルで血清に溶解することができ、なおもほとんどの用途
のために原形質膜を横断して拡散することができるように、それらのリガンドの疎水性／
親水性のバランスをとる方法も利用可能である。
ある特定の実施形態において、本方法は、条件的にコントロールされるタンパク質また
はポリペプチドを生成するために、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）の手法を利用
する。この手法は、誘導可能であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノ
マーの競合的阻害剤の投与に起因して、可逆的である。ＣＩＤの例としては、ＡＰ１９０
３およびＡＰ２０１８７が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＩＤシステムは、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合ドメインに融合された
シグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面タンパク質（Ｓｐｅｎｃ
ｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４；Ｓｐ
ｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９６，６：８３９−８４７；Ｂｌａ
ｕ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７，９４：３
０７６−３０８１）またはサイトゾルタンパク質（Ｌｕｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９
９６，３８３：１８１−１８５；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８，９５：３６５５−３６６０）のオリゴマー化お
よび活性化、転写を調節するＤＮＡエレメントへの転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，
Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８２：８２２−８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ
．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８−１０３２）またはシグナル伝達を刺激
する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２：９８０５−９８０９
；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
１９９５，９５：９８１０−９８１４）を引き起こすために使用されている。
ＣＩＤシステムは、表面レセプターの凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効率的
に活性化するという概念に基づく。最も単純な実施形態において、ＣＩＤシステムは、脂
質透過性免疫抑制薬ＦＫ５０６の二量体アナログを使用し、その二量体アナログは、その
正常な生物活性を失っているが、ＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２に遺伝的
に融合された分子を架橋する能力を獲得している。１つ以上のＦＫＢＰおよびミリストイ
ル化配列を、標的レセプターの細胞質シグナル伝達ドメインに融合することによって、二
量体化薬物に依存的であるがリガンドおよび外部ドメインに非依存的な様式でシグナル伝
達を刺激することができる。これにより、時間的なコントロール、モノマー薬物アナログ
を使用して可逆性、および高い特異性を備えたシステムが提供される。第３世代のＡＰ２
０１８７／ＡＰ１９０３ ＣＩＤの、それらの結合ドメインであるＦＫＢＰ１２に対する
高親和性は、インビボにおいて、内在性のＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用を誘導す
ることなく、組換えレセプターの特異的な活性化を可能にする。二量体化薬物に結合する
、アミノ酸の置換および欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアント（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ
３６）もまた使用され得る。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵抗性
であり、それにより、インビボにおけるレセプターの活性化において、送達されるほとん
どのタンパク質剤よりも効率的になる。
使用されるリガンドは、リガンド結合ドメインの２つ以上に結合することができる。キ
メラタンパク質は、２つ以上のリガンド結合ドメインを含むとき、２つ以上のリガンドに
結合することができる場合がある。そのリガンドは、代表的には、非タンパク質または化
学物質である。例示的なリガンドとしては、二量体のＦＫ５０６（例えば、ＦＫ１０１２
）が挙げられるが、これに限定されない。
他のリガンド結合領域は、例えば、二量体の領域、またはゆらぎ置換によって改変され
たリガンド結合領域、例えば、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）などであり得る：Ｆ３６がＶに置
換されたヒト１２ｋＤａ ＦＫ５０６結合タンパク質、完全に成熟したコード配列（アミ
ノ酸１〜１０７）は、合成二量体化薬物ＡＰ１９０３に対する結合部位を提供する（Ｊｅ
ｍａｌ，Ａ．ら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００８
）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１，１５６６−７２（１９９３））。上記タンパク
質の２つのタンデムなコピーは、より高次のオリゴマーが、ＡＰ１９０３による架橋の際
に誘導されるようにその構築物においても使用され得る。
Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰのコドンゆらぎ
バージョンである。それは、 Ｆ３６Ｖ−ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードす
るが、ヌクレオチドレベルでは６２％の相同性しか有しない。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、
レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた（Ｓｃｈｅｌ
ｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７，１７３１−５（１９９７））。Ｆ
３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、ＰＣＲアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、
１コピーのＦ３６Ｖ−ＦＫＢＰに直接連結された１コピーのＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰを含む
。
いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子である。選択されたリガンド結合領
域に対する適切なリガンドが、選択され得る。しばしば、リガンドは、二量体であり、時
折、リガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６アナログである。ある特
定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカル
ボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチ
ル］−、１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキ
シ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン
］］エステル、［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］
］］−（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４
Ｏ２０ 分子量：１４１１．６５）である。ある特定の実施形態において、リガンドは、
ＡＰ２０１８７である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７アナ
ログ、例えば、ＡＰ１５１０などである。いくつかの実施形態において、ある特定のアナ
ログは、ＦＫＢＰ１２に対して適切であり得、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２のゆ
らぎバージョンに対して適切であり得る。ある特定の実施形態において、１つのリガンド
結合領域が、キメラタンパク質に含められる。他の実施形態において、２つ以上のリガン
ド結合領域が、含められる。例えば、リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２である場合、こ
れらの領域の２つが含められる場合、一方は、例えば、ゆらぎバージョンであり得る。
そのような方法において、多量体分子は、ＣＤ４０細胞外ドメインにおけるエピトープ
に結合する抗体（例えば、ヒト化抗ＣＤ４０抗体；Ｔａｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ６４，２８４６−２８５２（２００４））であり得るか、ＣＤ４０リガンド（例
えば、米国特許第６，４９７，８７６号（Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら））であり得るか、
または別の共刺激分子（例えば、Ｂ７／ＣＤ２８）であり得る。本明細書中でアッセイさ
れるとき、機能に影響しない配列の保存的バリエーションは、本請求項の範囲内であると
理解される。
企図される他の二量体化システムとしては、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシ
ステムが挙げられる。クーママイシンによって誘導される二量体化は、改変されたＲａｆ
タンパク質を活性化し、ＭＡＰキナーゼカスケードを刺激する。Ｆａｒｒａｒら、１９９
６を参照のこと。
ＡＰ１９０３ ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって製造
されており、ＡＰ１９０３ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは
、ＡＡＩ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐによって作製されている。それは
、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２
５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、
この製剤は、透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、長期の貯蔵において可逆的
な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。室温に再度温めると、この相転移は、元に戻る
。１本分は、１０ｍＬのガラスバイアルにおける８ｍＬである（バイアル１本あたり合計
約４０ｍｇのＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
使用するために、ＡＰ１９０３は、投与前に、室温に温め、希釈される。５０ｋｇを超
える被験体の場合、ＡＰ１９０３は、１００ｍＬの生理食塩水に希釈された４０ｍｇの用
量で、１時間あたり５０ｍＬの速度で２時間にわたって、ＤＥＨＰフリー食塩水バッグお
よび溶液セットを使用して、ｉ．ｖ．注入によって投与される。５０ｋｇ未満の被験体は
、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を投与される。
すべての試験薬が、２℃〜８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、ア
クセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。
ＡＰ１９０３を投与する必要性、ならびに改変されたＣＡＲ発現Ｔ細胞のアポトーシス
を誘導するためぶカスパーゼ−９を活性化する必要性を決定する際、患者には、例えば、
非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットを使用して、２時間にわたるＩ
Ｖ注入によって、単一の固定された用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（
０．４ｍｇ／ｋｇ）が投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、すべての患者に対して個別
に計算され、体重が≧１０％変動しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入
前に０．９％生理食塩水において１００ｍＬに希釈される。
ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相研究では、２４人の健常志願者を、２時間にわたって、Ｉ
Ｖ注入される０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０ｍｇ／ｋｇという用量レ
ベルにおいて、単一用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで処置した。ＡＰ
１９０３血漿レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋ
ｇの用量の範囲にわたって、およそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲だった。最初の注入
期間の後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿レベルは、投与の０．５、２および１
０時間後にそれぞれ最高濃度のおよそ１８、７および１％に減少した。ＡＰ１９０３ ｆ
ｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、すべての用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいこ
とが示され、好ましい薬物動態プロファイルを示した。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ ＪＤら、Ｊ
Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１。
使用されるＡＰ１９０３ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎの固定された用量は、例えば、
２時間にわたって静脈内に注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の効率的なシグ
ナル伝達のためにインビトロにおいて必要とされるＡＰ１９０３の量は、約１０〜１００
ｎＭ（ＭＷ：１４１２Ｄａ）である。これは、１４〜１４０μｇ／Ｌまたは約０．０１４
〜０．１４ｍｇ／ｋｇ（１．４〜１４０μｇ／ｋｇ）に等しい。投与量は、用途に応じて
変動することがあり、ある特定の例では、０．１〜１０ｎＭの範囲内、または５０〜１５
０ｎＭ、１０〜２００ｎＭ、７５〜１２５ｎＭ、１００〜５００ｎＭ、１００〜６００ｎ
Ｍ、１００〜７００ｎＭ、１００〜８００ｎＭもしくは１００〜９００ｎＭの範囲内であ
り得る。１ｍｇ／ｋｇまでの用量が、上に提供されたＡＰ１９０３の第Ｉ相研究において
耐容性がよかった。
膜標的化
膜標的化配列は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列
または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会
合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタ
ンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつ
かのタンパク質は、アシル化される配列をＮ末端またはＣ末端に含み、これらのアシル部
分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識
され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一
のアシル部分（その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電
した残基（例えば、ヒトｃ−Ｓｒｃ：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ａ−Ｓ
−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ（配列番号２８３））が続くことが多い）によって修飾されることがで
き、他のものは、複数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク
質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重ア
シル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサ
ブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）およびＧタンパク質アルファサブユニット
）のＮ末端領域内に配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパ
ク質の最初の１８アミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフＭｅｔ−
Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓ（配列番号２８４）に一致し、ここで、Ｍｅｔは、切断
され、Ｇｌｙは、Ｎ−アシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つは、Ｓ−アシル化される。
Ｇｌｙは、ミリストイル化されることが多く、Ｃｙｓは、パルミトイル化され得る。配列
モチーフＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に一致する
アシル化領域は、Ｇタンパク質ガンマサブユニットのＣ末端由来のＣ１５またはＣ１０イ
ソプレニル部分によって修飾され得、他のタンパク質（例えば、ワールドワイドウェブア
ドレスｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙＩｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａ
ｃ＝ＩＰＲ００１２３０）もまた使用され得る。これらのおよび他のアシル化モチーフと
しては、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １５：２２０５−２２１７（２００４）；Ｇｌａｂ
ａｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：６９７−７００（１９９４）およびＺｌａｋｉ
ｎｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０：６７３−６７９（１９９７）において
論じられているものが挙げられ、そのモチーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子
に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、アシル化モチーフを含むタンパク質由
来の天然の配列が、キメラタンパク質に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態にお
いて、Ｌｃｋ、ＦｙｎもしくはＹｅｓまたはＧタンパク質アルファサブユニットのＮ末端
部分（例えば、そのようなタンパク質由来の最初の２５個のＮ末端アミノ酸またはそれよ
り少ないアミノ酸（例えば、随意の変異を有する、その天然の配列の約５〜約２０アミノ
酸、約１０〜約１９アミノ酸または約１５〜約１９アミノ酸））が、キメラタンパク質の
Ｎ末端の中に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ＣＡＡＸボックスモチーフ
配列を含むＧタンパク質ガンマサブユニット由来の約２５アミノ酸以下のＣ末端配列（例
えば、随意の変異を有する、天然の配列の約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約１８アミノ
酸または約１５〜約１８アミノ酸）が、キメラタンパク質のＣ末端に連結され得る。
いくつかの実施形態において、アシル部分は、＋１から＋６というｌｏｇ ｐ値を有し
、時折、＋３から＋４．５というｌｏｇ ｐ値を有する。Ｌｏｇ ｐ値は、疎水性の尺度
であり、オクタノール／水の分配研究に由来することが多く、ここで、より高い疎水性を
有する分子は、より高い頻度でオクタノールに分配し、より高いｌｏｇ ｐ値を有すると
特徴付けられる。Ｌｏｇ ｐ値は、いくつかの親油性分子に対して公表されており、ｌｏ
ｇ ｐ値は、公知の分配プロセスを使用して計算され得る（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．７１，Ｉｓｓｕｅ ６，ｐａｇｅ ５９９、エントリー４４９
３は、４．２というｌｏｇ ｐ値を有するラウリン酸を示している）。任意のアシル部分
が、上で論じられたペプチド組成物に連結され得、公知の方法および本明細書中以後に論
じられる方法を用いて抗菌活性について試験され得る。アシル部分は、時折、例えば、Ｃ
１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ３−Ｃ６シ
クロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２シクロアルキルアルキル（ｃｙｃ
ｌａｌｋｙｌａｌｋｙｌ）、アリール、置換アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ４）アル
キルである。任意のアシル含有部分は、時折、脂肪酸であり、脂肪酸部分の例は、プロピ
ル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）
、オクチル（Ｃ８）、ノニル（Ｃ９）、デシル（Ｃ１０）、ウンデシル（Ｃ１１）、ラウ
リル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）
、アラキジル（Ｃ２０）、ベヘニル（Ｃ２２）およびリグノセリル部分（Ｃ２４）であり
、各部分は、０、１、２、３、４、５、６、７または８つの不飽和（すなわち、二重結合
）を含み得る。アシル部分は、時折、脂質分子（例えば、ホスファチジル脂質（例えば、
ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン
、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン（ｓｈｉｎｇ
ｏｍｙｅｌｉｎ）、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド））また
はそれらの改変バージョンである。ある特定の実施形態において、１、２、３、４もしく
は５個またはそれより多くのアシル部分が、膜会合領域に連結される。宿主において機能
性であり、キメラタンパク質の他のドメインのうちの１つと会合されていることもあるし
会合されていないこともある、任意の膜標的化配列が、使用され得る。いくつかの実施形
態において、そのような配列としては、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的
化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化、ＣＡＡＸ
ボックス）、タンパク質間相互作用モチーフ、またはレセプター由来の膜貫通配列（シグ
ナルペプチドを利用する）が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、例えば
、ｔｅｎ Ｋｌｏｏｓｔｅｒ ＪＰら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（２０
０７）９９，１−１２，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ２１：９３６−４０，１０９８（２００３）において論じられているものが挙げ
られる。
様々な膜におけるタンパク質の保持を高め得るさらなるタンパク質ドメインが存在する
。例えば、約１２０アミノ酸のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインが、代表的には細胞
内のシグナル伝達に関与する２００個を超えるヒトタンパク質において見られる。ＰＨド
メインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質（例えば、ＰＩ（３，
４，５）−Ｐ３、ＰＩ（３，４）−Ｐ２、ＰＩ（４，５）−Ｐ２）に結合し得るので、種
々の膜コンパートメントまたは細胞内コンパートメントにタンパク質をリクルートする際
に鍵となる役割を果たし得る。しばしば、ＰＩ脂質のリン酸化状態は、例えば、ＰＩ−３
キナーゼまたはＰＴＥＮによって制御されるので、膜とＰＨドメインとの相互作用は、ア
シル脂質による相互作用ほど安定でない。
ポリペプチドが膜標的化領域（例えば、本明細書で提供されるある特定のキメラ刺激分
子）を含まない場合、このポリペプチドは、細胞膜へのキメラタンパク質の輸送を提供す
る領域を含まない。膜標的化領域を含むポリペプチドが、膜に標的化され得、細胞の２次
元表面に位置づけられ得る場合、膜標的化領域または機能的膜標的化領域を含まないポリ
ペプチドは、サイトゾルの中に位置づけられない。このポリペプチドは、例えば、このポ
リペプチドを細胞表面の膜に輸送する配列を含んでいなくてもよいし、このポリペプチド
は、例えば、このポリペプチドを細胞表面の膜に輸送しない機能不全の膜標的化領域（例
えば、ミリストイル化標的化領域の機能を破壊するプロリンを含むミリストイル化領域）
を含んでいてもよい（例えば、Ｒｅｓｈ， Ｍ．Ｄ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ． Ａｃｔａ． １４５１：１−１６ （１９９９）を参照のこと）。膜へと輸送さ
れないポリペプチドは、細胞質ポリペプチド（例えば、本明細書で論じられる細胞質キメ
ラ刺激分子のような）であると考えられる。このような細胞質キメラ刺激分子は、膜標的
化領域を欠いていてもよいし、例えば、機能的膜標的化領域を欠いていてもよい。「細胞
質キメラ刺激分子」は、ポリペプチドを細胞表面の膜へと輸送するアミノ酸配列を含まな
いかまたは機能不全の膜標的化領域を含むポリペプチド（例えば、本明細書で論じられる
ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチド）を意味する。細胞質キメラ刺激分子、または細胞質
キメラ刺激分子を含むポリペプチドは、脂質膜と会合する脂質へとポリペプチドを直接結
合させることを担うアミノ酸配列、または改変されたアミノ酸配列を含まない；細胞質キ
メラ刺激分子は、膜の脂質とは直接相互作用しない。従って、用語「細胞質キメラ刺激分
子」は、ＣＡＲポリペプチド配列の一部であるキメラ刺激分子または他の膜結合ポリペプ
チドを含むことを意味しない。細胞質キメラ刺激分子を含む細胞の蛍光標識もしくは他の
標識の後に、上記細胞質刺激分子は、細胞の細胞質の中に存在し、細胞膜の細胞質疎水性
脂質部分とは、安定して触れないかまたは長期間にわたって直接相互作用しない。
膜貫通領域
本明細書中のキメラタンパク質は、一回貫通型（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）または複数
回貫通型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｓｓ）の膜貫通配列を含み得る（例えば、キメラタン
パク質のＮ末端またはＣ末端に）。一回貫通型膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロ
シンキナーゼレセプター、セリン／トレオニンキナーゼレセプター、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、
アクチビンおよびホスファターゼに見出される。一回貫通型膜貫通領域は、シグナルペプ
チド領域および約２０〜約２５アミノ酸（それらの多くは、疎水性アミノ酸であり、アル
ファヘリックスを形成し得る）の膜貫通領域を含むことが多い。短いトラックの正に帯電
したアミノ酸が、タンパク質を膜に繋ぎ止めるために膜貫通の範囲の後に続くことが多い
。複数回貫通型タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネルおよびトランスポーター
が含まれ、膜を複数回またぐ２つまたはそれを超えるらせんを含む。複数回貫通型タンパ
ク質のすべてまたは実質的にすべてが、時折、キメラタンパク質に組み込まれる。一回貫
通型および複数回貫通型膜貫通領域に対する配列は、公知であり、キメラタンパク質分子
に組み込むために選択され得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合され
る。１つの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと天然に会合する膜
貫通ドメインが使用される。他の実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１
つと天然に会合しない膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、そのレセプター複
合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タン
パク質の膜貫通ドメインにそのようなドメインが結合するのを回避するために膜貫通ドメ
インは、選択され得るか、またはアミノ酸置換によって改変され得る（例えば、代表的に
は、疎水性残基に変更される（ｃｈａｒｇｅｄ））。
膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞レセプターのアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、
ＣＤ３−ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２
２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ
１３７またはＣＤ１５４に由来し得る。または、いくつかの例では、主に疎水性残基、例
えば、ロイシンおよびバリンなどを含む膜貫通ドメインが、新規に合成され得る。ある特
定の実施形態において、短いポリペプチドリンカーは、キメラ抗原レセプターの膜貫通ド
メインと細胞内ドメインとの間に結合を形成し得る。それらのキメラ抗原レセプターは、
ストーク、すなわち、細胞外領域のアミノ酸を細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に
さらに含み得る。例えば、そのストークは、選択された膜貫通ドメインに天然に会合する
アミノ酸の配列であり得る。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターは、Ｃ
Ｄ８膜貫通ドメインを含み、ある特定の実施形態において、キメラ抗原レセプターは、Ｃ
Ｄ８膜貫通ドメインおよびその膜貫通ドメインの細胞外部分におけるさらなるアミノ酸を
含み、ある特定の実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインお
よびＣＤ８ストークを含む。キメラ抗原レセプターは、膜貫通ドメインと細胞質ドメイン
との間にアミノ酸の領域をさらに含み得、それらのアミノ酸は、その膜貫通ドメインが由
来するポリペプチドと天然に会合するものである。
調節領域
１．プロモーター
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモ
ーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができ
る限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌ
クレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモ
ーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そ
のようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモー
ター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、β−アクチ
ン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素が、目
的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所与の目的にと
って十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成すると当該分野で周知である他の
ウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーター
の使用も同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、
トランスフェクション後または形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパタ
ーンが、最適化され得る。
特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選
択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能にし得る。例えば、１つの導入遺伝子の発現、また
はマルチシストロニックなベクターが使用されるときは複数の導入遺伝子の発現が、ベク
ターが生成される細胞にとって有毒である場合、それらの導入遺伝子のうちの１つ以上の
発現を妨げるかまたは減少させることが望ましい。産生細胞株にとって有毒である導入遺
伝子の例は、アポトーシス促進遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導
性プロモーターシステムが、導入遺伝子産物が有毒である場合のウイルスベクターの作製
に利用可能である（より誘導性のプロモーターを付加する）。
エクジソンシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（以前はＩｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、１つのそのようなシステムである。このシステム
は、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするようにデザインさ
れる。そのシステムは、導入遺伝子の基底レベルの発現ではなく２００倍超の誘導能を実
質的に可能にする厳しく制御された発現機構からなる。そのシステムは、ショウジョウバ
エのヘテロ二量体エクジソンレセプターに基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなど
のアナログが、そのレセプターに結合すると、そのレセプターは、プロモーターを活性化
して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写産物がもたらされる
。このシステムでは、ヘテロ二量体レセプターの両方のモノマーが、１つのベクターから
構成的に発現されるのに対し、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモー
ターは、別のプラスミド上に存在する。ゆえに、このタイプのシステムを目的の遺伝子ト
ランスファーベクターに遺伝子操作して導入することが、有用であり得る。次いで、産生
細胞株において目的の遺伝子を含むプラスミドとレセプターモノマーを含むプラスミドと
をコトランスフェクションすることにより、潜在的に有毒な導入遺伝子を発現させずに、
遺伝子トランスファーベクターの作製が可能になり得る。適切な時点において、導入遺伝
子の発現が、エクジソンまたはムリステロンＡによって活性化され得る。
有用であり得る別の誘導可能なシステムは、もともとはＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒ
ｄによって開発された（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，１９９５）、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭまたはＴｅ
ｔ−ＯｎＴＭシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシ
ステムもまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイク
リン）に応答して高レベルの遺伝子発現を制御することが可能である。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭ
システムでは、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現がオンになるのに対し、Ｔ
ｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの非存在下において遺伝子発現がオン
になる。これらのシステムは、大腸菌のテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する２つ
の制御エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリン
オペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質。目的の遺伝子は、
プラスミドの中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有するプロモーターの後
ろでプラスミド中にクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリンによっ
てコントロールされるトランス活性化因子と呼ばれる制御エレメントを含み、その制御エ
レメントは、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ド
メインおよび野生型テトラサイクリン（ｔｅｒｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）リプレッサーから
構成される。したがって、ドキシサイクリンの非存在下において、転写は、恒常的にオン
である。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムでは、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でな
く、ドキシサイクリンの存在下において転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製す
る場合、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下において産生細胞が生育され
得、潜在的に有毒な導入遺伝子の発現を妨げ得るように、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムが
使用され得るが、そのベクターが患者に導入されると、遺伝子発現は恒常的にオンになり
得る。
いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御するこ
とが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する種々のウイルスプロモーターが、所望の
発現レベルに応じて使用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ前初期プロモーターが、強力
な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎ
ｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−
４８において概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強
力でないＣＭＶプロモーターの改変バージョンもまた、使用されている。造血細胞におけ
る導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウ
イルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用される他のウイル
スプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ Ｌ
ＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のも
の）、ＡＡＶ ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
同様に、組織特異的プロモーターは、標的化されていない組織に対する潜在的な毒性ま
たは望ましくない効果を減少させるように、特定の組織または細胞において転写をもたら
すために使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプ
ロモーターと比べて低い発現をもたらし得るが、より限定された発現および免疫原性もも
たらし得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１９７５−７９；
Ｃａｚｅａｕｘ．，Ｎ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：３３２２−３１）。例え
ば、組織特異的プロモーター（例えば、ＰＳＡ関連プロモーター）または前立腺特異的腺
性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、必要に応じて使用され得る。
組織特異的プロモーターまたは分化特異的プロモーターの例としては、以下が挙げられ
るが、これらに限定されない：Ｂ２９／ＣＤ７９ｂ（Ｂ細胞）；ＣＤ１４（単球性細胞）
；ＣＤ４３（白血球および血小板）；ＣＤ４５（造血細胞）；ＣＤ６８（マクロファージ
）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ−１（膵腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；
フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）；およびＦｌｔ−１（内皮細胞）；Ｇ
ＦＡＰ（アストロサイト）。
ある特定の適応症では、遺伝子治療ベクターを投与した後の特定の時点において転写を
活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインによって制御可能であ
るようなプロモーターを用いて行われる。使用され得るサイトカイン応答性プロモーター
および炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノー
ゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５−
２３５１）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−α、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら（１９８８
）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５−３２０７）、ハプトグロビ
ン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．，６，１９０５−１９１２）、血清
アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｓ
ｅ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２−
８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６
１８１−６１９１）、ＩＬ−８、α−１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ ａｎｄ Ｂａ
ｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８，４２−５１）、α−１抗ト
リプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
，２３９４−２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら（１９９１）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７−２８９５）、フィブリノゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホ
ルボールエステル、ＴＮＦ−α、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導
可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、
メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボ
ールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦによって誘導可能）、α−２マクログ
ロブリンおよびα−１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとしては、例え
ば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、
エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロ
ビンおよびクレアチンが挙げられる。
上記プロモーターのいずれか単独または別のプロモーターとの併用が、所望の作用に応
じて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の制御エレメントは、それ
らが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモ
ーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく；他のプロモータ
ーが、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
２．エンハンサー
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写
を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かつい
くつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに関連する
エンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０お
よびレトロウイルスＬＴＲ）は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントの
ように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。
すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以
上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操
作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、
転写を刺激する；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントには必ずしも当て
はまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでＲＮＡ合成の開
始を指示する１つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性
を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しば
しば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットには
、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配
列から転写性エレメントを（インスレーターエレメントとともに）隔離するのを助け得る
、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）が含まれる。
任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏ
ｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢのように）が、遺伝子の発現を駆動するために使
用され得るが、多くは、特定の組織タイプまたは組織のサブセットに発現を限定し得る（
例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：７７６−８８に概説されている）。
例としては、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ由来のエ
ンハンサー、ならびにウイルスＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来の配列が挙げられるが、
これらに限定されない。適切なエンハンサーが、特定の用途に対して選択され得る。適切
な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提
供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得
る。
３．ポリアデニル化シグナル
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもた
らすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましい。ポリアデニル化シグナ
ルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のその
ような配列（例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シ
グナルならびにＬＴＲポリアデニル化シグナル）が、使用される。１つの非限定的な例は
、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現
カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高
めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち
得る。終止シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’末端
における保存配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１〜３０ヌクレオチド下流に位置し得る（Ｍ
ｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９３．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７７
７−８３；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８）。
４．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。こ
れらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンをは
じめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、イン
サート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置
される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現
の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使
用は、多重遺伝子すなわちポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される
。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデ
ルを迂回することができ、内部部位において翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔ
ｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５，１９８
８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩ
ＲＥＳエレメントが、論じられており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒ
ｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも論じられている（Ｍａｃ
ｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１）。Ｉ
ＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がＩＲ
ＥＳによって分断されている複数のオープンリーディングフレームが、共に転写され得、
ポリシストロニックなメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープ
ンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の
遺伝子が、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用
して効率的に発現され得る（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８
１９号（各々が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。
配列の最適化
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得
る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、
コドンが最適化されることにより、最適化されたＲＮＡが生成され得、それにより、より
効率的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することによって
、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し
得るｍＲＮＡ二次構造、またはｍＲＮＡの核外輸送を阻害し得るクリプティック（ｃｒｙ
ｐｔｉｃ）配列などのエレメントが、除去され得る（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ
Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８
８；Ｙａｎ．，Ｊ．ら、２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４１１−２１；Ｃｈｅｕｎ
ｇ，Ｙ．Ｋ．ら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：６２９−３８；Ｎａｒｕｍ．，Ｄ．
Ｌ．ら、２００１．６９：７２５０−５５；Ｙａｄａｖａ，Ａ．，ａｎｄ Ｏｃｋｅｎｈ
ｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，２００３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６２−６９；Ｓ
ｍｉｔｈ．，Ｊ．Ｍ．ら、２００４．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ ２０：１３３５−４７；Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、２００２．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．８８：１２７−５１；Ｗｕ，Ｘ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：８９−９６；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、２００６．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：６９−７８；Ｄｅｍｌ，Ｌ．
Ａ．ら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９−１１００１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３；Ｗａｎｇ，Ｓ．
Ｄ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０；ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ
．ら、２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５）。例えば、ＦＢＰ１２ま
たは他の多量体化領域ポリペプチド、共刺激ポリペプチド細胞質シグナル伝達領域および
ＣＤ１９配列が、コドンの変更によって最適化され得る。
リーダー配列
リーダー配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすた
めに付加され得る。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡを小胞体に標的化することに関与す
る。例としては、自身の切断を遅延させる、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎ
ｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌ
ｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．
Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｌｉ，Ｖ．ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７２：４１
７−２８；Ｘｕ，Ｚ．Ｌ．ら、２００１．Ｇｅｎｅ ２７２：１４９−５６；Ｍａｌｉｎ
，Ａ．Ｓ．ら、２０００．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２：１６７７−８５；Ｋｕ
ｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１１２−１２５；Ｙ
ａｎｇ．，Ｊ．Ｓ．ら、２００２．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１３７９−
８４；Ｋｕｍａｒ．，Ｓ．ら、２００６．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：３８３−
９２；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１−４０）。ＩｇＥ
リーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る（Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉら（１９８
９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９１２）。
導入遺伝子の発現は、発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、最
適化され得るおよび／またはコントロールされ得る。これらの方法は、例えば、プロモー
ター、送達方法および遺伝子配列を最適化する工程を含む（例えば、Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ
．ら、２００８．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ ３ ｅ２５１７；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎ
ｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−
８８に提示されているような）。
核酸
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは
その誘導体もしくはアナログの分子（１本、２本またはそれより多くの鎖）のことを指す
。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「
Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）
に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用
語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核
酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、
２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３
４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７
、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、
６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７
４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７
、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００
、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０
、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０
、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０
、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０
、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００
、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００
、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００
、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００
、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００
、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは
１０００ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
本明細書中に提供される核酸は、別の核酸に対して同一または相補的である領域を有し
得る。その相補的または同一である領域は、少なくとも５つ連続した残基であり得ること
が企図されるが、その領域は、少なくとも、多くとも、または約６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６
４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７
、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、
９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１
３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２
３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３
３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４
３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５
２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６
２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７
２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８
２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９
２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００個連続
したヌクレオチドであることが特に企図される。
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」
または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または
部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解され
る。本明細書中で使用される用語「アニールする」は、「ハイブリダイズする」と同義で
ある。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイ
ズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリ
ンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件
（複数可）」を包含する。
本明細書中で使用されるとき、「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高スト
リンジェンシー」は、相補的な配列（複数可）を含む１つ以上の核酸鎖の間のまたはその
１つ以上の核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリ
ダイゼーションを妨げる条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間の
ミスマッチを、たとえあったにしてもほとんど許容しない。そのような条件は、公知であ
り、高選択性が要求される用途のために使用されることが多い。非限定的な用途としては
、核酸（例えば、遺伝子またはその核酸セグメント）の単離、または少なくとも１つの特
異的なｍＲＮＡ転写産物もしくはその核酸セグメントの検出などが挙げられる。
ストリンジェントな条件は、約４２℃〜約７０℃の温度における約０．０２Ｍ〜約０．
５Ｍ ＮａＣｌによって提供されるような、低塩および／または高温の条件を含み得る。
所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸（複数可）の長さ、標
的配列（複数可）の長さおよび核酸塩基含有量、核酸（複数可）の電荷組成、ならびにハ
イブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他
の溶媒（複数可）の存在または濃度によって部分的に決定されることが理解される。
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単なる非限定的な
例という目的で言及されていること、特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望の
ストリンジェンシーは、１つ以上のポジティブコントロールまたはネガティブコントロー
ルとの比較によって経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される用途に
応じて、標的配列に対する様々な程度の核酸選択性を達成するために、様々なハイブリダ
イゼーション条件が使用され得る。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下におい
て核酸にハイブリダイズしない関係する標的核酸の同定または単離は、低温および／また
は高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件
は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリ
ンジェンシーの非限定的な例としては、約２０℃〜約５０℃の温度範囲における約０．１
５Ｍ〜約０．９Ｍ ＮａＣｌで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。低または
高ストリンジェンシー条件は、特定の用途に適合させるためにさらに改変され得る。
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を
変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、
あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を
有するアミノ酸で置き換えたものが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺
伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知で
ある。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ
酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異
なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配
列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき
、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、
および例えば、少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似
性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列
間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細
書中の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度
を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同
一性（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べ
るプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価する
ための数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓ
ｔｅｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡなど）が、当該分野で公
知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、特定の実施形態では、
その設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。
核酸修飾
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、ＲＮＡ
もしくはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が
挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および／または塩基が、修飾さ
れ得る（例えば、独立して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％
、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、β−Ｄ−リボ−
フラノースの１’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウ
ラシルのうちのいずれか１つである。
修飾塩基は、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌク
レオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジン−
４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキ
シベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−
アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リ
ボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミ
ジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが挙
げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル（例えば、３−ニトロ
ピロリル）、ニトロインドリル（例えば、４−、５−、６−ニトロインドリル）、ヒポキ
サンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロ
イミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ア
ミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベ
ンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、
５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、
７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチ
ル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイ
ソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニ
ル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎ
ａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニ
ル、テトラセニル、ペンタセニルなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、例えば、核酸は、リン酸骨格修飾を有する修飾された核
酸分子を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジ
チオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カル
バメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホン
アミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび／またはアル
キルシリル修飾が挙げられる。ある特定の場合において、ヌクレオシドに天然に存在する
リボース糖部分は、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で
置き換えられる。ある特定の場合において、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、
グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはそれらの
誘導体である。ヘキソースは、Ｄ−ヘキソース、グルコースまたはマンノースであり得る
。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、環内に１つの酸素原子を含む二
環式環であり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、ビシクロ［２
．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシクロ［３．３．１］ノ
ナンである。
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として
公知の化合物のクラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重
鎖の融解挙動または活性に実質的に影響せずに４つの天然に存在する塩基のいずれかを置
き換え得る化合物である。天然に存在する核酸塩基に関連する安定化する水素結合相互作
用とは対照的に、３−ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタ
ッキング相互作用によって単独で安定化され得る。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水
素結合相互作用が無いことにより、特定の相補性塩基に対する特異性は不必要になる。さ
らに、４−、５−および６−ニトロインドリルは、４つの天然塩基に対して非常に低い特
異性しか示さない。１−（２’−Ｏ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロイ
ンドールを調製するための手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，Ｇ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００４，４５，５６２９に論じられている。他のユ
ニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、
７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダ
ゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびそれらの構
造的誘導体が挙げられる。
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然の核酸塩基である。ジフ
ルオロトリルは、天然の核酸塩基チミンの同配体である。しかしながら、チミンとは異な
り、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても、顕著な選択性を示さない。ユニ
バーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミ
ダゾールおよび４−メチルベンゾイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカル
ボスチリリル誘導体である３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチ
リリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含む
オリゴヌクレオチド配列と比べてオリゴヌクレオチド二重鎖の不安定化をわずかにしか引
き起こさないユニバーサル塩基である。他の非天然の核酸塩基としては、７−アザインド
リル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピ
リジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリ
リル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチル
インドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、
フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれ
らの構造的誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイ
ミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾールおよび上で言及された他の非天然塩基の合成
手順を含むより詳細な考察については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ
．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）を参照のこと。
さらに、化学的置換基、例えば、架橋剤が、反応物に対して安定性または不可逆性をさ
らに付加するために使用され得る。架橋剤の非限定的な例としては、例えば、１，１−ビ
ス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミド
エステル（ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミ
ジルプロピオネート）を含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−
１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミ
デートなどの作用物質が挙げられる。
ヌクレオチドアナログは、「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸も含み得る。ある特定の
組成物は、内因性の核酸を特定の構造に本質的に「繋ぎ止める」または「ロックする」た
めに使用され得る。配列を繋ぎ止めることは、核酸複合体の解離を防ぐために役立ち、ゆ
えに、複製を防ぎ得るだけでなく、内在性配列の標識、修飾および／またはクローニング
も可能にし得る。ロックされた構造は、遺伝子発現を制御し得る（すなわち、転写または
複製を阻害し得るかまたは増強し得る）か、または内在性の核酸配列を標識するためもし
くはその他の方法で修飾するために使用され得る安定した構造として使用され得るか、ま
たはその内在性配列を単離するために、すなわちクローニングのために使用され得る。
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡだけを含む分子に必ずしも限定されず、化学的に修飾
されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾
ヌクレオチドのパーセントは、１％〜１００％（例えば、約５、１０、１５、２０、２５
、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０ま
たは９５％）であり得る。
核酸調製物
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおけるコントロールまたは標準物質
として、または治療薬として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公
知の任意の手法（例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など）によって作製
され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、
組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る（
細胞のゲノムから産生され得る）。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高め
るような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび
界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解する工程を含み得る。
核酸合成はまた、標準的な方法に従って行われ得る。合成核酸（例えば、合成オリゴヌ
クレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホス
ホルアミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相法によってまたはデオキシ
ヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。様々な異な
るオリゴヌクレオチド合成機構が、他の箇所に開示されている。
核酸は、公知の手法を用いて単離され得る。特定の実施形態において、小さい核酸分子
を単離するためおよび／またはＲＮＡ分子を単離するための方法が、使用され得る。クロ
マトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離するためまたは単離するた
めに使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動
、フィルターカラム、アルコール沈殿および／または他のクロマトグラフィーを含み得る
。細胞からの核酸が、使用されるかまたは評価される場合、方法は、一般に、特定のＲＮ
Ａ集団を単離するためのプロセスを実行する前に、細胞をカオトロピック（例えば、グア
ニジニウムイソチオシアネート）および／または界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサ
ルコシン）で溶解する工程を含む。
方法は、核酸を単離するための有機溶媒および／またはアルコールの使用を含み得る。
いくつかの実施形態において、細胞溶解産物に加えられるアルコールの量は、約５５％〜
６０％というアルコール濃度に達する。種々のアルコールを使用できるが、エタノールが
うまく機能する。固体支持体は、任意の構造であってよく、それには、電気陰性基を有す
る無機物またはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルターおよびカラムが含まれる
。ガラス繊維のフィルターまたはカラムは、そのような単離手順にとって有効である。
核酸単離プロセスは、時折、ａ）サンプル中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で
溶解する工程（ここで、少なくとも約１Ｍグアニジニウムの濃度を有する溶解産物が生成
される）；ｂ）その溶解産物から核酸分子を、フェノールを含む抽出液を用いて抽出する
工程；ｃ）その溶解産物にアルコール溶液を加えることにより、溶解産物／アルコール混
合物を形成する工程（ここで、その混合物中のアルコールの濃度は、約３５％〜約７０％
である）；ｄ）その溶解産物／アルコール混合物を固体支持体に適用する工程；ｅ）イオ
ン性溶液を用いてその固体支持体から核酸分子を溶出する工程；およびｆ）その核酸分子
を捕捉する工程を含み得る。サンプルは、乾燥され得、その後の操作にとって適切な液体
および体積で再懸濁され得る。
遺伝子移入の方法
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必
要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによら
ない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が
提供される。
発現ベクターを含む形質転換された細胞は、その細胞に発現ベクターを導入することに
よって作製される。本方法とともに使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物の
形質転換のためのポリヌクレオチド送達に適した方法は、ポリヌクレオチド（例えば、Ｄ
ＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入し得る実質的に任意の方法を含む。
宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして使用され得るし、使用されてきた。
宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターによってコードされ
るポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるかに応じて、原核生物または真
核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物が、宿主細胞として使用するため
に利用可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝物質に対する保管所として
の機能を果たす組織であるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる。具体的な実施形態では、宿主細胞
は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞
である。
適切な宿主は、決定され得る。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基
づく。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために、原核生物
宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使
用される細菌細胞としては、ＤＨ５α、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにいくつかの商
業的に入手可能な細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌ
ｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標
），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））が挙げられる。あるいは、大腸菌ＬＥ３９２などの細菌
細胞が、ファージウイルスに対する宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用さ
れ得る真核細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられるが、これらに限定され
ない。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例として
は、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓおよび
ＰＣ１２が挙げられるが、これらに限定されない。酵母株の例としては、ＹＰＨ４９９、
ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、
ならびにウイルスベクターを含み得る。細胞をこれらのワクチンで形質転換する方法およ
びこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり、それ
らの方法も本明細書中で論じられる。
核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例
細胞、例えば、Ｔ細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または
本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用さ
れ得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン
性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、ＩＮ−ＶＩＶＯ−ＪＥＴ Ｐ
ＥＩなどを使用した送達などの方法が挙げられる。
１．エキソビボ形質転換
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフ
ェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロ
におけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された（Ｗｉ
ｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９）。別の例では、
ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし
、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９）。したがって、細胞または組織
が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおい
てトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞ま
たは組織は、生物の中に配置され得る。例えば、Ｔ細胞は、動物から得られ得、上記細胞
は、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入され得、次いで、その動物へと投与
して戻され得る。
２．注射
ある特定の実施形態において、細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、
１つ以上の注射（すなわち、針による注射）、例えば、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静
脈内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）、腫瘍内、腹腔内などを介して、細胞小
器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば（ｆｏｅ ｅ
ｘａｍｐｌｅ）、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直
接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベク
ターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じ
て変動し得る。
皮内注射、結節内注射またはリンパ管内注射は、ＤＣ投与のより一般的に使用される方
法の一部である。皮内注射は、血流への吸収が低速度であるがリンパ系への取り込みが迅
速であることを特徴とする。真皮に多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより
、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領域リンパ節に輸送され得る
。これを正しく行うためには、適切な部位の準備が必要である（すなわち、適切な針の留
置を観察するために、毛を刈り込む）。結節内注射は、リンパ系組織への抗原の直接的な
送達を可能にする。リンパ管内注射は、ＤＣの直接投与を可能にする。
３．エレクトロポレーション
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して
細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およ
びＤＮＡの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、あ
る特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的レシピエント細
胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性に
する（参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２５３号）。
エレクトロポレーションを使用した真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功し
ている。この様式で、マウスプレＢリンパ球がヒトκ免疫グロブリン遺伝子でトランスフ
ェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８１，７１６１−７１６５）、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら（１９８６）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，７１６−７１８）。
インビボにおけるワクチン用エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ
ｎ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ）、すなわちｅＶａｃは、単純な注射法を介して臨床で実
行されている。腫瘍抗原をコードするＤＮＡベクターが、患者の皮内に注射される。次い
で、電極によって皮内の空間に電気的パルスが適用されることにより、そこに局在化して
いる細胞、特に、常在の皮膚樹状細胞が、ＤＮＡベクターを取り込み、コードされる腫瘍
抗原を発現するようになる。次いで、局所炎症によって活性化された、腫瘍抗原を発現し
ているこれらの樹状細胞が、リンパ節に遊走し、腫瘍抗原を提示し、腫瘍抗原特異的Ｔ細
胞をプライムし得る。核酸が、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る場合
、その核酸は、例えば、限定されないが、核酸の注射または他の任意の投与手段の後で、
エレクトロポレーションを使用して投与されるとき、電気穿孔的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ
ｒｅｔｉｃａｌｌｙ）投与される。
エレクトロポレーションの方法は、例えば、Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ｗ
ｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ
ａｐｙ ２３：４２１−９（２０１１）およびＦｅｒｒａｒｏ，Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｖ
ａｃｃｉｎｅｓ ７：１２０−１２７（２０１１）（これらの全体が本明細書中で参照に
より援用される）に論じられている。
４．リン酸カルシウム
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入さ
れる。この手法を用いて、ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクト
された（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
，５２，４５６−４６７）。また、この様式において、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２
７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマー
カー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７）、ラット肝細胞が、種々
のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）。
５．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、ＤＥＡＥ−デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して
、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、
マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，Ｔ．Ｖ．，Ｍｏｌ Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８５ Ｍａｙ；５（５）：１１８８−９０）。
６．音波処理負荷（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ Ｌｏａｄｉｎｇ）
さらなる実施形態は、直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ ｓｏｎｉｃ ｌｏａｄｉｎｇ）に
よるポリヌクレオチドの導入を含む。ＬＴＫ線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジ
ンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら（１９８７）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８４６３−８４６７）。
７．リポソーム媒介性トランスフェクション
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームな
どの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特
徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質
層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。
それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶
質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ，（１９９
１）Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａ
ｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ
Ｌｉｇａｎｄｓ．ｐｐ．８７−１０４）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されたポリヌクレオチドも
企図される。
レセプター媒介性トランスフェクション
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞
に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイト
ーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布
に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
ある特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンド
およびポリヌクレオチド結合剤を含む。他のものは、送達されるべきポリヌクレオチドに
作動可能に付着された細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レ
セプター媒介性遺伝子移入のために使用され（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８７）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９−４４３２；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（９）：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｅｒａ
ｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６−４０９０
，１９９４；Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ ０２７３０８５）、これにより、この手法の実施可能
性が確立される。別の哺乳動物細胞型における特異的送達も論じられている（Ｗｕ ａｎ
ｄ Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，１
９９３；参照により本明細書中に援用される）。ある特定の態様では、標的細胞の集団上
に特異的に発現されるレセプターに対応するリガンドが、選択される。
他の実施形態において、細胞特異的ポリヌクレオチド標的化ビヒクルのポリヌクレオチ
ド送達ビヒクル成分は、リポソームとともに特異的結合リガンドを含み得る。送達される
べきポリヌクレオチド（複数可）は、そのリポソーム内に収容され、特異的結合リガンド
は、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。このようにして、そのリポソームは、標的細
胞のレセプター（複数可）に特異的に結合し、細胞にその内容物を送達し得る。そのよう
なシステムは、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレ
ーションを示す細胞へのポリヌクレオチドのレセプター媒介性送達において使用されるシ
ステムを使用して機能的であると示された。
なおもさらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達
ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、そのリポソームは、例えば、細胞特異的結合
を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端の
アシアロガングリオシドであるラクトシル−セラミドが、リポソームに組み込まれ、肝細
胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７
）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９，１５７−１７６）。組織特異的な形質転
換構築物が、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが企図される。
８．微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生
物に導入するために使用され得る（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５
３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６
９９；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。この方法は、ＤＮＡでコ
ーティングされた微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺滅
せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）
Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３）。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し
、それらの多くは、本方法に適用可能である。
この微粒子銃では、１つ以上の粒子が、少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティ
ングされ、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するためのいくつかのデバ
イスが、開発された。１つのそのようなデバイスは、電流を発生させ、その後その電流が
輸送力を提供する高圧放電に依存する（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５６８−９５７２）。使用される微小発射体は、生
物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズ）からなった
。例示的な粒子としては、タングステン、白金、およびある特定の例では、金から構成さ
れた粒子（例えば、ナノ粒子を含む）が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのＤ
ＮＡ沈殿が、微粒子銃を使用したレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要としないことが
企図される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡでコーティングされるのではなく、ＤＮＡを
含み得ることが企図される。ＤＮＡでコーティングされた粒子は、粒子銃を介したＤＮＡ
送達のレベルを上昇させ得るが、本質的に必要ない。
ウイルスベクター媒介性移入方法の例
被験体内の単数または複数の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発
現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細
胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使
用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介す
るウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞
に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方
法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される
。
アデノウイルス
アデノウイルスは、その中程度のサイズのＤＮＡゲノム、操作の容易性、高力価、広範
囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するの
に特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製およびパ
ッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む１００〜２００塩基対（ｂｐ）の末端
逆位配列（ＩＴＲ）が境を接している。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期（Ｅ）領域
および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される。
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転
写の制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現に
より、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、Ｄ
ＮＡの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の切り離しに関与する（Ｒｅｎａｎ，Ｍ．
Ｊ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．，１９，１９７−２１８）。ウイル
スキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５
）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってもたらされる単一の一次転写産物
の有意なプロセシングの後にだけ、発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する
）は、感染の後期において特に有効であり、このプロモーターからもたらされたすべての
ｍＲＮＡは、それらを翻訳にとって有用にする５’トリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａ
ｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）（ＴＬ）配列を有する。
アデノウイルスが遺伝子治療に対して最適化されるために、大きなＤＮＡセグメントを
含むことができるように運搬能を最大にする必要がある。ある特定のアデノウイルス産物
に関連する毒性および免疫学的反応を減少させることも非常に望ましい。これらの２つの
目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方の目的にかなうという点で、ある程度重なり
合っている。本方法の実施によって、治療的な構築物を比較的容易にマニピュレートする
能力を保持しつつ、これらの両方の目標を達成することができる。
ウイルスＤＮＡの複製に必要とされるシスエレメントがすべて、直鎖状のウイルスゲノ
ムのいずれかの末端の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）に局在化する
ので、ＤＮＡの大きな置き換えが可能である。ＩＴＲを含むプラスミドは、非欠陥アデノ
ウイルスの存在下において複製し得る（Ｈａｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１
９８４ Ｊｕｎ ５；１７５（４）：４９３−５１０）。ゆえに、これらのエレメントを
アデノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になり得る。
さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１
９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）に局在する（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（
１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。このシグナルは、左端に近いが
付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのＤＮＡの挿入に必要とされるタンパク
質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を
模倣している。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０〜１
．２５マップ単位）フラグメントが２９３細胞においてパッケージングを指示し得ること
を実証した（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１０１：１９５−２０２，１９９１）。
以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込ま
れ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示された。これらの細
胞株は、その細胞株によってコードされる、アデノウイルス機能を欠いたアデノウイルス
ベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスま
たは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する
。
複製欠損性アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され
得る。しかしながら、複製機能を提供するのに必要なヘルパーウイルスが存在するせいで
、いずれの調製物も汚染され得るので、この知見だけでは、複製欠損性ベクターの単離が
可能にならない。したがって、複製欠損性ベクターの複製および／またはパッケージング
に特異性を付加し得るさらなるエレメントが必要だった。そのエレメントは、アデノウイ
ルスのパッケージング機能に由来する。
アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左
端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら（１９７７）Ｃｅｌｌ，１２，２
４３−２４９）。後の研究から、ゲノムのＥ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領域に欠失を有
する変異体が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞株においてさえ不十分にしか成長しな
いことが示された（Ｈｅａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６７，８０９−８２２）。代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）アデノウイ
ルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイル
スは、正常にパッケージングされた。さらなる変異解析から、Ａｄ５ゲノムの左端に、短
い反復性の位置依存性エレメントが同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に
存在する場合、効率的なパッケージングには１コピーで十分であるが、Ａｄ５ ＤＮＡ分
子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された（Ｈｅａｒｉｎｇら
、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。
パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することによって、様々な効率でパッ
ケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。代表的には、変異は、
点変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細
胞内で生育させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとし
てもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、こ
れらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞
内で生育させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先
的に認識される。パッケージング因子の量が限られていることを考慮すると、野生型シグ
ナルを含むウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分
大きい場合、均質に近い系統（stock）が達成され得る。
特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物の向性を改善するために、レセプター結合フ
ァイバー配列は、しばしばアデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウ
イルス５において見出されたコクサッキー−アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）リガン
ドは、アデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト
造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。得られた「シ
ュードタイプ化された」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発された
ウイルス分離株の基礎となった。さらに、例えばＴ細胞などの標的細胞に対してウイルス
を再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。
方法は、二機能性抗体（一方の末端はＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配
列に結合する）の使用、およびカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの
会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。あるいは、リガンド（例えば
、抗ＣＤ２０５）をヘテロ二機能性リンカー（例えば、ＰＥＧ含有）によってアデノウイ
ルス粒子に付着することができる。
１．レトロウイルス
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖Ｄ
ＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，（１
９９０）Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ
，ｐｐ．１４３７−１５００）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染
色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、
レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイ
ルスゲノムは、３つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素および
エンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、
ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするための
シグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’
および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列
を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。した
がって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオ
チドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ウイル
スゲノム内のある特定のウイルス配列の位置に挿入することにより、複製欠損であるウイ
ルスが作製される。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含
むがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら（
１９８３）Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９）。レトロウイルスのＬＴＲ配列およびｐｓ
ｉ配列とともにヒトｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入するとき（例え
ば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのｐｓｉ配列は、その組換えプラスミドのＲＮ
Ａ転写産物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いでそれを培養培地中に分泌させ
る（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒ．，（１９
８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ ａｎｄ
Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．）．Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔ
ｅｍｉｎら（１９８６）Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ
（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８；Ｍ
ａｎｎら、１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し
、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染
することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定
な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら（１９７５）Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，６７，２４２−２４８）。
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされたアプローチ
は、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化
学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞など
の細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれる場合がある。
組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、その
アプローチは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特
異的な細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用した。それらの抗体は、ストレプト
アビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら（１９８
９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９０７９−９０８３）。
主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、それ
らの表面抗原を有する種々のヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感
染することが実証された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
２．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを使用する。末端逆位反復配列は
、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子
産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２およびＶＰ−３と命名され
た３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つ
の非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上は、Ａ
ＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置によって、マップ単位
で命名されている。これらは、左から右へ、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写によ
って、６つの転写産物が生じ、２つは、３つの各プロモーターにおいて開始され、各対の
一方がスプライシングされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は、各転
写産物にとって同じである。４つの非構造タンパク質は、より長い転写産物に由来すると
みられ、３つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写産物から生じる。
ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な
複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、
仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「
補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウ
イルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、ＡＡＶの複製を支援すると
示された。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現は、ＡＡＶ構造発現を抑制すると
考えられており、ヘルパーウイルス感染は、この阻止を取り消すと考えられている。
ＡＡＶベクターの末端反復配列は、ＡＡＶまたは改変されたＡＡＶゲノムを含むｐ２０
１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．，６１：３０９６−３１０１（１９８７））またはＡＡＶの公開配列に基づ
く末端反復配列の化学的合成もしくは酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法
によって得ることができる。それは、例えば、機能、すなわち安定した部位特異的な組み
込みを可能にするために必要とされるＡＡＶ ＩＴＲの最小の配列または一部を、欠失分
析によって決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端
反復配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを決定することも
できる。
ＡＡＶベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビ
ヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発されており、エキソビボ
とインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段
階および臨床段階において試験されている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，（１
９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０；７９−９０；Ｃｈａｔｔｅｉｊ
ｅｅら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０，７９−９０；Ｆｅｒ
ｒａｒｉら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，３２２７−３２３４；Ｆｉｓｈｅｒら
（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３）；
Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９４），Ｂｌｏｏｄ，８４，１４９２−１５００；Ｋａｐｌｉｔ
ｔら（１９９４）Ｎａｔ’ｌ Ｇｅｎｅｔ．，８，１４８−１５３；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ
．Ｇ．ら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ．１９９６ Ｄｅｃ；６２（６）：１６６９
−７６；Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，９３，１４０８２−１４０８７；Ｋｏｅｂｅｒｌら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’
ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４２６−１４３１；Ｍｉｚｕｋａｍｉら（１９
９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１７，１２４−１３０）。
肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入および遺伝子発現は、嚢胞性線維症の処
置のための臨床試験に至っている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，１９９５；Ｆ
ｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−
１０６１７，（１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介性
の遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送
達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの処置、
および潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、こ
れらの器官におけるＡＡＶ媒介性の導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示された
ので、有望であるとみられる（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５
２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３；Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４；１９９６；Ｋ
ｏｅｂｅｒｌら、１９９７；ＭｃＣｏｗｎら（１９９６）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７１３
，９９−１０７；Ｐｉｎｇら（１９９６）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，３，２２
５−２２８；Ｘｉａｏら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８０９８−８１０８）。
３．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いら
れる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ
ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，ｐｐ．４６７−４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄ
ｅｎ，（１９８６）Ｉｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．１１７−１４８；Ｃｏｕ
ｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）カナリアポックスウイルスおよびヘル
ペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様
々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
いったん、構築物が細胞内に送達されたら、導入遺伝子をコードする核酸は、種々の部
位に位置づけられ、発現される。ある実施形態おいて、導入遺伝子をコードする核酸は、
細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同組換えを介して同種の（ｃｏ
ｇｎａｔｅ）位置および向きである（遺伝子置換）かまたはランダムで非特異的な位置に
組み込まれる（遺伝子増強）。なおもさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別個
のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持される。そのような核酸セグメン
トまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係のまたはそれと同期した維持および複
製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、
その核酸が細胞のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
疾患を処置するための方法
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による
細胞の投与が、有益であり得る。
細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラー
Ｔ細胞、または前駆体細胞など、例えば、造血幹細胞、間葉系ストローマ細胞、幹細胞、
多能性幹細胞および胚性幹細胞などが、細胞治療のために使用され得る。それらの細胞は
、ドナーに由来し得るか、または患者から得られた細胞であり得る。それらの細胞は、例
えば、病的な細胞の機能を置き換えるための、例えば、再生において使用され得る。それ
らの細胞は、生物学的作用物質が、特定の微小環境、例えば、病的な骨髄または転移性の
沈着物（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｅｐｏｓｉｔ）などに送達され得るように、異種遺伝
子を発現するようにも改変され得る。間葉系ストローマ細胞は、例えば、免疫抑制活性を
提供するためにも使用されており、移植片対宿主病および自己免疫障害の処置において使
用され得る。本願において提供される細胞は、細胞治療後に治療用細胞の活性が増加され
るか、または減少される必要がある状況において価値のあるものであり得る安全スイッチ
を含む。例えば、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞が患者に提供される場合、場合
によっては、またはオフターゲット毒性などの有害事象が存在し得る。リガンドの投与を
終了すると、治療用Ｔ細胞は非活性化状態に戻り、無毒性の低い発現レベルで残存し得る
。または、例えば、その治療用細胞は、腫瘍細胞または腫瘍サイズを減少させるように働
き得、もはや必要とされなくなることがある。この状況では、リガンドの投与は、終了し
てもよく、治療用細胞は、もはや活性化されない。最初の治療後に腫瘍細胞が再発する（
ｒｅｔｕｒｎ）かまたは腫瘍サイズが増加する場合、キメラ抗原レセプターを発現してい
るＴ細胞を活性化させ、患者を再処置するために、リガンドが再度投与され得る。
「治療用細胞」とは、細胞治療のために使用される細胞、すなわち、状態または疾患を
処置するためまたは予防するために被験体に投与される細胞のことを意味する。
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量（ｕ
ｎｉｔａｒｙ ｄｏｓａｇｅｓ）として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単
位は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫刺激効果をもたらすと計算された所定の
量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量に対する詳述は、薬学的組成物のユニーク
な特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、それらに依存する。
本明細書中に提示される多量体リガンドなどの薬学的組成物の有効量は、６０％、７０
％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９７％超または８０％、７０％、６０％、
５０％、４０％、３０％、２０％もしくは１０％未満の治療用細胞が殺滅されるような、
カスパーゼ−９を発現する細胞Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導するこの選択された結
果を達成する量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。薬学的組成物が
改変Ｔ細胞である場合の有効量は、所望の治療的応答（例えば、リガンド誘導物質が投与
される前の時点と比べて、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞のレベルの低下、またはＣＤ１９
発現白血病細胞のレベルの低下）を達成する量でもあり得る。
任意の特定の用途に対する有効量は、処置される疾患もしくは状態、投与される特定の
組成物、被験体のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などのような因子に応
じて変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要と
せずに、経験的に決定され得る。
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき
、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬
などが、標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセス、または標的細胞、組織もし
くは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細
胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質（
複数可）が、細胞（複数可）を殺滅するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計
量で１つ以上の細胞に送達される。
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）よ
り先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と同時であり得る、および／または他の作用
物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に
細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複
数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮
することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証
され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用い
て、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成
物と接触させ得ることが企図される。他の態様では、１つ以上の作用物質が、発現ベクタ
ーを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時
間、約７日間、約１〜約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き
出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ
以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
最適化されたおよび個別化された治療的処置
改変された細胞の投与量および投与スケジュールは、処置される疾患または状態のレベ
ルを決定することによって最適化され得る。例えば、任意の残存している固形腫瘍のサイ
ズ、または標的化される細胞、例えば、患者の中に残存している、腫瘍細胞またはＣＤ１
９発現Ｂ細胞などのレベルが、決定され得る。
例えば、患者が臨床的に関連するレベルの腫瘍細胞を有するか、または最初の治療の後
に固形腫瘍を有するという決定は、改変されたＴ細胞を投与する必要があり得るという指
示を臨床医に提供する。別の例では、改変された細胞で処置した後に、患者が、低下した
レベルの腫瘍細胞または減少した腫瘍サイズを有するという決定は、追加の用量の改変さ
れた細胞が必要ないと臨床医に指示し得る。同様に、改変された細胞で処置した後、患者
が、疾患もしくは状態の症状を示し続けているかまたは症状の再発に苦しんでいるという
決定は、少なくとも１つのさらなる用量の改変された細胞を投与する必要があり得ると臨
床医に指示し得る。
用語「投与量」は、投与の用量と投与の頻度（例えば、次の投与のタイミングなど）の両
方を含むことが意味される。用語「投与量レベル」とは、被験体の体重との関係から投与
される改変された細胞の量のことを指す。
ある特定の実施形態において、上記細胞は、動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ
、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類における細胞である。被験体は
、例えば、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、
ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類であり得る。上記被験体は、例えば、ヒト、例
えば、感染症に罹患している患者、および／または免疫無防備状態であるかもしくは過剰
増殖性疾患に罹患している被験体であり得る。
したがって、例えば、ある特定の実施形態において、上記方法は、改変された細胞また
は核酸の投与後の腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞数と比べて、被験体における腫瘍サ
イズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在または不在を決定する工程、ならびに
腫瘍サイズの増加および／または腫瘍細胞数の増加の存在が決定された場合、さらなる用
量の改変された細胞または核酸を被験体に投与する工程を含む。上記方法は、例えば、改
変された細胞または核酸の投与後のＣＤ１９発現Ｂ細胞のレベルと比べて、被験体におけ
るＣＤ１９発現Ｂ細胞の増加の存在または不在を決定する工程、および被験体におけるＣ
Ｄ１９発現Ｂ細胞の増加の存在が決定された場合、さらなる用量の改変された細胞または
核酸を被験体に投与する工程も含む。これらの実施形態では、例えば、患者は最初に、本
明細書中に提供される方法に従って治療用細胞または核酸で処置される。最初の処置の後
、例えば、腫瘍サイズ、腫瘍細胞数またはＣＤ１９発現Ｂ細胞数は、最初の処置の前の時
点と比べて減少し得る。この最初の処置の後のある特定の時点において、患者は、再度試
験されるか、または患者は、疾患症状について継続的にモニターされ得る。例えば、腫瘍
サイズ、腫瘍細胞数またはＣＤ１９発現Ｂ細胞数が、最初の処置の直後の時点と比べて増
加していると決定される場合、改変された細胞または核酸は、さらなる用量のために投与
され得る。このモニタリングおよび処置スケジュールは、キメラ抗原レセプターまたはキ
メラ刺激分子を発現する治療用細胞が、患者の中に残っていることに注意しながら継続さ
れ得る。
他の実施形態において、改変された細胞またはインビボで改変された細胞の数を減少す
ることが必要な事象において、改変された細胞または核酸が誘導性カスパーゼ−９ポリペ
プチドを発現する改変された細胞または核酸の投与後に、多量体リガンドは、上記患者に
投与され得る。これら実施形態において、上記方法は、有害な症候または状態（例えば、
移植片対宿主病、またはオフターゲット毒性）の有無を決定する工程、および上記多量体
リガンドのある用量を投与する工程を包含する。上記方法は、上記症候または状態をモニ
ターする工程、および上記症候もしくは状態が持続する事象において、さらなる用量の上
記多量体リガンドを投与する工程をさらに包含し得る。このモニタリングおよび処置スケ
ジュールは、キメラ抗原レセプターまたはキメラ刺激分子を発現する治療用細胞が上記患
者の中に残っている間は継続し得る。
その後の薬物の用量、例えば、その後の、改変された細胞または核酸の用量、および／
またはその後の薬物投与量などを調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で
提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体ま
たは電子媒体において）提供され得る。例えば、腫瘍細胞のサイズ、またはサンプル中の
腫瘍細胞の数もしくはレベルが、表に提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストま
たは表とその症状を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量
（drug dose）に対する指示を確認し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それ
らの症状がコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた
後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、この情報
は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れら
れ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータ
に送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもし
くは維持するための指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量（subsequent
drug dose amount）を提供し得る。
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を
投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示（instructio
n）を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し
、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつか
の実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプ
ットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づ
いて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る
（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば
、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。
本明細書中に提示されるような方法は、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれを
コードする発現構築物の送達を含むが、これらに限定されない。活性化された細胞、核酸
または発現構築物の「有効量」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能におよび繰
り返し達成するのに十分な量、例えば、疾患またはその症状を回復させるか、減少させる
か、最小にするか、またはその程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排
除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用され得る。いくつかの実施形態に
おいて、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカ
ー、または腫瘍サイズもしくは腫瘍抗原発現などの他の疾患症状をモニターする工程が存
在し得る。
さらなる実施形態において、発現構築物および／または発現ベクターは、細胞を活性化
する組成物または物質として利用され得る。「細胞を活性化する」または「細胞の活性を
増強する」そのような組成物とは、細胞に関連する１つまたはそれを超える活性を刺激す
る能力のことを指す。例えば、本方法の発現構築物またはベクターなどの組成物は、細胞
上の共刺激分子のアップレギュレーションを刺激し得るか、細胞におけるＮＦ−κＢの核
移行を誘導し得るか、細胞におけるｔｏｌｌ様レセプター、またはサイトカインもしくは
ケモカインを含む他の活性を活性化し得る。
発現構築物、発現ベクターおよび／または形質導入された細胞は、例えば、より弱い抗
原（例えば、高度に精製された抗原または組換え抗原）の免疫原性を高めること、免疫応
答に必要な抗原の量を減少させること、防御免疫をもたらすのに必要な免疫化の頻度を減
少させること、免疫応答が低下しているかまたは弱まっている被験体（例えば、新生児、
高齢および免疫無防備状態の個体）におけるワクチンの効力を改善すること、および粘膜
免疫などの標的組織における免疫を増強することによって、ワクチンの有効性を高め得る
かもしくはワクチンの有効性に寄与し得るか、または特定のサイトカインプロファイルを
誘発することによって細胞媒介性免疫もしくは体液性免疫を促進し得る。
ある特定の実施形態において、細胞は、抗原とも接触される。しばしば、細胞は、エキ
ソビボにおいて抗原と接触される。時折、細胞は、インビボにおいて抗原と接触される。
いくつかの実施形態において、細胞は、被験体内に存在し、免疫応答が、抗原に対しても
たらされる。時折、その免疫応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答である。
時折、その免疫応答は、腫瘍抗原に対してもたらされる。ある特定の実施形態において、
その細胞は、アジュバントの添加なしに活性化される。
ある特定の実施形態において、エキソビボまたはインビボにおいて、キメラタンパク質
をコードする核酸が細胞に形質導入され得る。細胞は、その細胞が多量体リガンドと接触
されるのと同時に抗原に対して感作され得るか、または細胞は、その細胞が多量体化リガ
ンドと接触される前に、予めその抗原に感作され得る。いくつかの実施形態において、細
胞は、エキソビボにおいて抗原と接触される。
いくつかの実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、
皮内投与によって上記被験体に投与される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、
エキソビボで、上記核酸で形質導入され、皮下投与によって上記被験体に投与される。と
きおり、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入される。ときおり、上記細胞は
、インビボで、上記核酸で形質導入される。
ある特定の実施形態において、上記細胞は、エキソビボで、上記核酸で形質導入され、
皮内投与によって上記被験体へと投与され、ときおり上記細胞は、エキソビボで、上記核
酸で形質導入され、皮下投与によって上記被験体へと投与される。抗原は、腫瘍抗原であ
り得、流入領域リンパ節への細胞の遊走によってＣＴＬ免疫応答が誘導され得る。腫瘍抗
原は、宿主において免疫応答を引き起こす任意の抗原、例えば、ペプチドまたはポリペプ
チドなどである。腫瘍抗原は、新生物腫瘍細胞に関連する腫瘍関連抗原であり得る。
いくつかの実施形態において、免疫無防備状態の個体または被験体は、免疫応答が低下
したまたは弱まった被験体である。そのような個体には、化学療法または免疫系を弱める
他の任意の治療を受けた被験体、移植レシピエント、現在、免疫抑制剤を摂取している被
験体、高齢化している個体、またはＣＤ４ ヘルパーＴ細胞が減少しているおよび／もし
くは損なわれている任意の個体も含まれ得る。本方法は、免疫無防備状態の被験体におけ
るＣＤ４ ヘルパーＴ細胞の量および／または活性を高めるために利用され得ることが企
図される。
抗原
キメラ抗原レセプターは、標的抗原に結合する。インビトロまたはエキソビボでＴ細胞
活性化をアッセイする場合、標的抗原は、種々の供給源から得られ得るかまたは単離され
得る。標的抗原は、本明細書中で使用されるとき、抗原または抗原上の免疫学的エピトー
プであり、それは、哺乳動物における、免疫認識および疾患を引き起こす作用因子（agen
t）または疾患状態の最終的な排除またはコントロールにおいてきわめて重大である。そ
の免疫認識は、細胞性および／または体液性であり得る。細胞内の病原体およびがんの場
合、免疫認識は、例えば、Ｔリンパ球応答であり得る。
標的抗原は、例えば、病原性の微生物、例えば、ＨＩＶ（Ｋｏｒｂｅｒら編 ＨＩＶ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘ．１９
７７）、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒトパピローマウイルス（米国特許第５，７１
９，０５４号）、Ｂ型肝炎（米国特許第５，７８０，０３６号）、Ｃ型肝炎（米国特許第
５，７０９，９９５号）、ＥＢＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などを含むウイルス
に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。標的抗原は、病原菌、例えば、クラミジ
ア（米国特許第５，８６９，６０８号）、マイコバクテリア、レジオネラ、髄膜炎菌（Ｍ
ｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ）、Ａ群連鎖球菌、サルモネラ、リステリア、Ｈｅｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（米国特許第５，９５５，５９６号）など）に由来し得
るかまたはそれらから単離され得る。
標的抗原は、例えば、アスペルギルス、侵襲性カンジダ（米国特許第５，６４５，９９
２）、ノカルジア、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、クリプトスポリ
ジウムなどを含む病原性の酵母に由来し得るかまたはそれらから単離され得る。
標的抗原は、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、トリパノソーマ、
リーシュマニア（米国特許第５，９６５，２４２号）、マラリア原虫（米国特許第５，５
８９，３４３号）およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉを含むがこれらに限定され
ない、病原性の原生動物および病原性の寄生生物に由来し得るかまたはそれらから単離さ
れ得る。
標的抗原には、新生物発生前または過形成の状態に関連する抗原が含まれる。標的抗原
はまた、がんに関連し得るか、またはがんの原因となり得る。そのような標的抗原は、例
えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または組織特異的抗原、それらのエピト
ープおよびそれらのエピトープアゴニストであり得る。そのような標的抗原としては、癌
胎児抗原（ＣＥＡ）およびそのエピトープ、例えば、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄなど
（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２９５４０）、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｒｎ
ｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７−３５２，１９９４）、ＭＡＧＥ−１（米国
特許第５，７５０，３９５号）、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ（米国特許第５，６４８，２２
６号）、ＧＰ−１００（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９１：６４５８−６４６２，１９９２）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点変異し
たｒａｓがん遺伝子、正常なおよび点変異したｐ５３がん遺伝子（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：３５５１−３５５５，１９９４）、ＰＳ
ＭＡ（Ｉｓｒａｅｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７−２３０，１９９３）、
チロシナーゼ（Ｋｗｏｎら、ＰＮＡＳ ８４：７４７３−７４７７，１９８７）ＴＲＰ−
１（ｇｐ７５）（Ｃｏｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８：２８０７−
２８０８，１９９０；米国特許第５，８４０，８３９号）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎ
ら、ＰＮＡＳ ９４：１９１４−１９１８，１９９７）、ＴＲＰ−２（Ｊａｃｋｓｏｎら
、ＥＭＢＯＪ，１１：５２７−５３５，１９９２）、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５
、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（米国特許第５，５５０，２１４号）
、ＢＲＣ−Ｉ、ＢＲＣ−ＩＩ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−
１、ＴＡＡおよび組織特異的抗原の改変物、ＴＡＡのスプライスバリアント、エピトープ
アゴニストなどが挙げられるがこれらに限定されない。他のＴＡＡは、当該分野で公知の
方法、例えば、米国特許第４，５１４，５０６号に開示されている方法によって同定され
、単離され、クローニングされ得る。標的抗原は、１つまたはそれを超える成長因子およ
び各々のスプライスバリアントも含み得る。
ある抗原は、非がん細胞よりもがん細胞において、頻繁に発現され得る。その抗原は、
改変された細胞を、前立腺特異的膜抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）また
はそのフラグメントと接触させた結果、生じ得る。
前立腺抗原（ＰＡ００１）は、ＰＳＭＡ抗原の細胞外の一部からなる組換えタンパク質
である。ＰＳＭＡは、ニューロペプチダーゼ活性および葉酸加水分解酵素活性を有する約
１００ｋＤａ（グリコシル化前は８４ｋＤａであり、二量体としては約１８０ｋＤａ）の
タイプＩＩ膜タンパク質であるが、ＰＳＭＡの真の機能は、現在のところ不明である。Ｃ
ａｒｔｅｒ ＲＥら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９３：７４９−
５３，１９９６；Ｉｓｒａｅｌｉ ＲＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７−３０
，１９９３；Ｐｉｎｔｏ ＪＴら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１４４５−５
１，１９９６。
発現は、広く前立腺特異的ではあるが前立腺特異的に限らず、進行型のホルモン不応性
疾患において維持される。Ｉｓｒａｅｌｉ ＲＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１８
０７−１１，１９９４。前立腺以外の正常な組織における弱い検出が、唾液腺、脳、小腸
、十二指腸粘膜、近位尿細管および結腸陰窩の神経内分泌細胞においても見られた。Ｓｉ
ｌｖｅｒ ＤＡら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：８１−５，１９９７；Ｔｒｏ
ｙｅｒ ＪＫら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．６２：５５２−８，１９９５。さらに、Ｐ
ＳＭＡは、アンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）の後にアップレギュレートされる。Ｗｒｉｇ
ｈｔ ＧＬ，Ｊｒ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ．４８：３２６−３４，１９９６。ほとんどのＰ
ＳＭＡは、細胞質タンパク質として発現されるが、選択的スプライシングされた膜貫通型
は、新生物前立腺細胞の頂端表面上の優勢型（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅ ｆｏｒｍ）であ
る。Ｓｕ ＳＬら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１４４１−３，１９９５；Ｉｓｒａｅ
ｌｉ ＲＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６３０６−１０，１９９４。
さらに、ＰＳＭＡは、架橋後に内部移行され、結合した抗体または放射性ヌクレオチド
もしくはウイルスおよび他の高分子複合体と複合体化したリガンドを内部移行するために
使用されている。Ｌｉｕ Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：４０５５−６０，１９９
８；Ｆｒｅｅｍａｎ ＬＭら、Ｑ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．４６：１３１−７，２００２
；Ｋｒａａｉｊ Ｒら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ．６２：２５３−９，２００５。Ｂａｎｄｅｒ
および共同研究者らは、腫瘍を微小管阻害剤で前処置すると、ＰＳＭＡの異常な基底面標
的化および抗体媒介性の内部移行が増加することを実証した。Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ
ＪＪら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．４：７０４−１４，２００５。腫瘍の標的
化は、前立腺腫瘍だけでなく腎臓腫瘍および他の腫瘍の腫瘍血管内皮においてもＰＳＭＡ
の異所性発現が観察されることによって容易になり得る。Ｌｉｕ Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５７：３６２９−３４，１９９７；Ｃｈａｎｇ ＳＳら、Ｕｒｏｌｏｇｙ．５７
：８０１−５，２００１；Ｃｈａｎｇ ＳＳら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：
２６７４−８１，１９９９。
ＰＳＭＡは、対応する良性の組織の血管内皮細胞には見られない。Ｄｅ ｌａ Ｔａｉ
ｌｌｅ Ａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ．２４：５７９−８８，２０００
。転移性前立腺疾患の初期の組織学的研究の１つは、約５０％（１８個中８個）の骨転移
（８個中７個のリンパ節転移）だけしかＰＳＭＡを発現しなかったことを示唆したが、Ｐ
ＳＭＡの外部ドメインに標的化された、より感度の高い試薬である１７７Ｌｕで放射標識
されたＭｏＡｂ Ｊ５９１は、３０人中３０人の患者において骨および軟部組織の転移の
既知のすべての部位を標的化することができたことから、進行した前立腺疾患におけるほ
ぼ普遍的な発現が示唆される。Ｂａｎｄｅｒ ＮＨら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２３
：４５９１−６０１，２００５。
前立腺特異的抗原、すなわちＰＳＡは、ＰＳＡ、例えば、例えば、ＰＳＭＡに対して免
疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得、かつ任意の抗ＰＳＡ抗体によっ
て特異的に認識され得る、任意の抗原を含むことが意味される。本方法において使用され
るＰＳＡは、従来の方法を用いてアッセイされるとき、細胞を負荷するために使用される
ことができる。したがって、「前立腺特異的抗原」または「ＰＳＡ」は、例えば、ＰＳＡ
の野生型アミノ酸配列を有するタンパク質、またはＰＳＡタンパク質の一部を含むポリペ
プチドのことを指すことがある。
前立腺特異的膜抗原、すなわちＰＳＭＡは、ＰＳＭＡに対する免疫応答、例えば、例え
ば、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得、かつ抗ＰＳＭＡ抗体によって特異的に認識さ
れ得る、任意の抗原を含むことが意味される。本方法において使用されるＰＳＭＡは、従
来の方法を用いてアッセイされるとき、細胞を負荷するために使用されることができる。
従って、「前立腺特異的膜抗原」または「ＰＳＭＡ」は、例えば、ＰＳＭＡの野生型アミ
ノ酸配列を有するタンパク質、またはこのＰＳＭＡタンパク質の一部を含むポリペプチド
（例えば、配列番号３、または配列番号３のヌクレオチド配列の一部によってコードされ
るもの）、または配列番号４のポリペプチドを有するタンパク質、またはその一部を指し
得る。この用語はまた、例えば、配列番号４の一部のアミノ酸配列を有するペプチド、ま
たはＰＳＭＡに対する免疫応答を誘導し得る任意のペプチドを指し得る。前述のもののい
ずれかのバリアントも含まれ、そのバリアントとしては、例えば、置換および欠失を有す
るバリアントが挙げられる。野生型ＰＳＭＡからの差次的な翻訳後プロセシング（例えば
、グリコシル化の差異）を有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドもまた、本方
法において使用され得る。さらに、ＰＳＭＡに対する免疫応答を誘導することができる様
々な糖分子もまた企図される。
ＰＳＡ（例えば、ＰＳＭＡ）ポリペプチドは、上記改変された細胞に負荷するために使
用され得る。ある特定の実施形態において、上記改変された細胞は、配列番号４のアミノ
酸配列（例えば、配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる）を有するＰＳＭ
Ａポリペプチドフラグメント、またはそのフラグメントと接触させられる。いくつかの実
施形態において、上記ＰＳＡ（例えば、ＰＳＭＡ）ポリペプチドフラグメントは、シグナ
ルペプチド配列を含まない。他の実施形態において、上記改変された細胞は、上記ポリペ
プチドの中のアミノ酸の置換または欠失を含むＰＳＡ（例えば、ＰＳＭＡ）ポリペプチド
フラグメントと接触させられ、上記フラグメントは、細胞に負荷するために十分である。
前立腺特異的タンパク質抗原、すなわちｓＰＳＰＡは、本明細書では前立腺特異的抗原
またはＰＳＡとも称され、前立腺特異的タンパク質抗原に対する免疫応答、例えば、例え
ば、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る任意の抗原を含むことが意味される。これに
は、例えば、前立腺特異的タンパク質抗原または前立腺特異的抗原が含まれる。本方法に
おいて使用されるＰＳＰＡは、従来の方法を用いてアッセイされるとき、細胞を負荷する
ために使用されることができる。前立腺特異的抗原、すなわちＰＳＡは、例えば、ＰＳＡ
の野生型アミノ酸配列を有するタンパク質またはそのＰＳＡタンパク質の一部を含むポリ
ペプチドのことを指すことがある。
前立腺特異的膜抗原、すなわちＰＳＭＡは、ＰＳＭＡに対する免疫応答、例えば、例え
ば、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得、かつ抗ＰＳＭＡ抗体によって特異的に認識さ
れ得る、任意の抗原を含むことが意味される。本方法において使用されるＰＳＭＡは、従
来の方法を用いてアッセイされるとき、細胞を負荷するために使用されることができる。
従って、「前立腺特異的膜抗原」または「ＰＳＭＡ」は、例えば、ＰＳＭＡの野生型アミ
ノ酸配列を有するタンパク質、またはこのＰＳＭＡタンパク質の一部を含むポリペプチド
（例えば、配列番号３、または配列番号３のヌクレオチド配列の一部によってコードされ
るもの）、または配列番号４のポリペプチドを有するタンパク質、またはその一部を指し
得る。この用語はまた、例えば、配列番号４の一部のアミノ酸配列を有するペプチド、ま
たはＰＳＭＡに対する免疫応答を誘導し得る任意のペプチドを指し得る。前述のもののい
ずれかのバリアントも含まれ、そのバリアントとしては、例えば、置換および欠失を有す
るバリアントが挙げられる。野生型ＰＳＭＡからの差次的な翻訳後プロセシング（例えば
、グリコシル化の差異）を有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドもまた、本方
法において使用され得る。さらに、ＰＳＭＡに対する免疫応答を誘導することができる様
々な糖分子もまた企図される。
ＰＳPＡ（例えば、ＰＳＭＡ）ポリペプチドは、上記改変された細胞に負荷するために
使用され得る。ある特定の実施形態において、上記改変された細胞は、配列番号４のアミ
ノ酸配列（例えば、配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる）を有するＰＳ
ＭＡポリペプチドフラグメント、またはそのフラグメントと接触させられる。いくつかの
実施形態において、上記ＰＳＡ（例えば、ＰＳＭＡ）ポリペプチドフラグメントは、シグ
ナルペプチド配列を含まない。他の実施形態において、上記改変された細胞は、ポリペプ
チドの中のアミノ酸の置換または欠失を含むＰＳPＡ（例えば、ＰＳＭＡ）ポリペプチド
フラグメントと接触させられ、上記フラグメントは、細胞に負荷するために十分である。
腫瘍抗原は、宿主において腫瘍に対する免疫応答を引き起こす任意の抗原、例えば、例
えば、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原、すなわち新
生物腫瘍細胞に関連するものである。
前立腺がん抗原、すなわちＰＣＡは、宿主において前立腺がん腫瘍に対する免疫応答を
引き起こす任意の抗原、例えば、例えば、ペプチドまたはポリペプチドである。前立腺が
ん抗原は、前立腺がん腫瘍に特異的である場合もあるし、または前立腺がん腫瘍に特異的
でない場合もある。前立腺がん抗原は、他のタイプの腫瘍または新生物細胞に対しても免
疫応答を引き起こし得る。前立腺がん抗原としては、例えば、前立腺特異的タンパク質抗
原、前立腺特異的抗原および前立腺特異的膜抗原が挙げられる。
上記細胞は、例えば、未分画の腫瘍溶解産物、ＭＨＣから溶出したペプチド、腫瘍由来
の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ（ペプチドまたはタンパク質
））を未熟なＤＣにパルスすること、またはバルク腫瘍ｍＲＮＡ、すなわちＴＡＡをコー
ドするｍＲＮＡでＤＣをトランスフェクトすること（Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ．＆ Ｖｉｅｗｅ
ｇ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９，２５１−６３（２００４）；Ｇｉｌｂｏａ
，Ｅ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４，４０１−１１（２００４）に概説）をはじめ
とした様々な方法によって、腫瘍抗原、例えば、ＰＳＡ、例えば、ＰＳＭＡポリペプチド
と接触され得る。
ＤＮＡゲノムを含む生物の場合、標的抗原またはその目的の免疫学的エピトープをコー
ドする遺伝子は、そのゲノムＤＮＡから単離される。ＲＮＡゲノムを有する生物の場合、
所望の遺伝子は、そのゲノムのｃＤＮＡコピーから単離され得る。そのゲノムの制限酵素
地図が入手可能である場合、目的の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、日常的な方法に
よる制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断される。所望の遺伝子が以前にクローニン
グされていた場合、それらの遺伝子は、入手可能なクローンから容易に得られることがあ
る。あるいは、その遺伝子のＤＮＡ配列が既知である場合、その遺伝子は、デオキシリボ
核酸を合成するための任意の従来の手法によって合成することができる。
目的の抗原をコードする遺伝子は、例えば、その遺伝子を細菌宿主にクローニングする
ことによって、増幅され得る。この目的のために、様々な原核生物のクローニングベクタ
ーが使用され得る。例は、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣおよびｐＥＭＢＬである。
少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的エピトープをコードする遺伝子は、標準
的な手法によるウイルスを用いた組換えのためにデザインされたプラスミドベクターに挿
入するために調製され得る。一般に、クローニングされた遺伝子は、制限酵素消化によっ
て原核生物クローニングベクターから切り取られ得る。ほとんどの場合、切り取られたフ
ラグメントは、その遺伝子のコード領域全体を含む。クローニングされた遺伝子を有する
ＤＮＡフラグメントは、例えば、ウイルスを用いた組換えのために使用されるＤＮＡベク
ターの挿入部位と適合するフラグメントの末端を作製するために、必要に応じて改変され
得、次いで、精製された後、そのベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断部位（クローニ
ング部位）に挿入される。
細胞、例えば、例えば、樹状細胞の、抗原による抗原負荷は、例えば、例えば、細胞、
例えば、樹状細胞または前駆体細胞を抗原と接触させることによって、例えば、細胞を抗
原とともにインキュベートすることによって、達成され得る。負荷は、例えば、抗原をコ
ードするＤＮＡ（裸のものまたはプラスミドベクター内のもの）またはＲＮＡをインキュ
ベートする；または抗原を発現している組換え細菌またはウイルス（例えば、ワクシニア
、水痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター）とともにインキュベートするこ
とによっても達成され得る。負荷の前に、抗原は、Ｔ細胞を助ける免疫学的パートナー（
例えば、キャリア分子）に共有結合的に結合体化されてもよい。あるいは、樹状細胞は、
別々にまたはポリペプチドの存在下において、結合体化されていない免疫学的パートナー
でパルスされ得る。細胞またはＭＨＣ分子由来の抗原は、酸溶出または他の方法によって
得ることができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６．１８３：
８７−９７を参照のこと）。それらの細胞は、それらの細胞が抗原で負荷される前、負荷
された後、または負荷されるのと同時に、本方法に従って、キメラタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列を形質導入され得るかまたはトランスフェクトされ得る。特定の実施
形態において、抗原負荷は、形質導入またはトランスフェクションの後に行われる。
さらなる実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞ｍＲＮＡでトランスフェ
クトされる。形質導入され、トランスフェクトされた細胞は、動物に投与されて、細胞傷
害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その細胞
は、二量体のＦＫ５０６および二量体のＦＫ５０６アナログによって制御される。腫瘍細
胞ｍＲＮＡは、例えば、前立腺腫瘍細胞由来のｍＲＮＡであり得る。
いくつかの実施形態において、形質導入された細胞は、腫瘍細胞溶解産物でパルスする
ことによって負荷され得る。パルスされ、形質導入された細胞は、動物に投与されて、細
胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍抗原免疫応答をもたらし、その
細胞は、二量体のＦＫ５０６および二量体のＦＫ５０６アナログを用いて制御される。そ
の腫瘍細胞溶解産物は、例えば、前立腺腫瘍細胞溶解産物であり得る。
免疫細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球応答
Ｔリンパ球は、本明細書中で論じられる発現ベクターを含む細胞との接触によって活性
化され得、ここで、その細胞は、抗原でチャレンジされているか、トランスフェクトされ
ているか、パルスされているか、または電気融合されている。
Ｔ細胞は、その膜上にユニークな抗原結合レセプター（Ｔ細胞レセプター）を発現し、
そのレセプターは、他の細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と会合
している抗原のみを認識することができる。Ｔ細胞にはいくつかの集団、例えば、ヘルパ
ーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞がある。ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞は、第
一に、それぞれ、膜結合糖タンパク質ＣＤ４およびＣＤ８のディスプレイによって区別さ
れる。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージおよび他の免疫系
細胞の活性化にとってきわめて重大な様々なリンフォカインを分泌する。対照的に、抗原
−ＭＨＣ複合体を認識するナイーブＣＤ８Ｔ細胞は、増殖し、細胞傷害性ＣＤ８Ｔリンパ
球（ＣＴＬ）と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。ＣＴＬは、細胞溶解をもたらす物
質を産生することによって、抗原をディスプレイしている体内の細胞（例えば、ウイルス
に感染した細胞および腫瘍細胞）を排除する。
ＣＴＬの活性は、例えば、本明細書中で論じられる方法によって評価され得る。例えば
、ＣＴＬは、単離されたばかりの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において評価され得るか、Ｐ
ＢＭＣから確立された、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ
）によって刺激され、ＩＬ−２によって増殖した細胞株において評価され得るか（Ｂｅｒ
ｎａｒｄら、ＡＩＤＳ，１２（１６）：２１２５−２１３９，１９９８）、または予め免
疫された被験体から単離され、抗原を含むアデノウイルスベクターに感染したＤＣで６日
間にわたって再刺激されたＴ細胞によって、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出マイクロ毒性
アッセイを用いて評価され得る。１つのタイプのアッセイは、クローン化Ｔ細胞を用いる
。クローン化Ｔ細胞は、再指向化（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）細胞傷害性アッセイにおいて
パーフォリン依存性の殺滅とＦａｓリガンド依存性の殺滅の両方を媒介する能力について
試験された（Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１５（４）：８
４９−８５５，１９９８）。クローン化細胞傷害性Ｔリンパ球は、Ｆａｓ依存性殺滅とパ
ーフォリン依存性殺滅の両方を示した。最近になって、新しい蛍光増幅システムを利用す
るインビトロデヒドロゲナーゼ放出アッセイが開発された（Ｐａｇｅ，Ｂ．ら、Ａｎｔｉ
ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１８（４Ａ）：２３１３−６）。こ
のアプローチは、高感度であり、迅速であり、再現性があり、混合リンパ球反応（ＭＬＲ
）に対して有益に使用され得る。このアプローチは、細胞膜の完全性を用いる、大規模な
細胞傷害性試験のためにさらに容易に自動化され得るので、考慮に入れられる。細胞媒介
性の細胞傷害性を検出するために開発された別の蛍光測定アッセイでは、使用されるフル
オロフォアは、無毒性分子のＡｌａｍａｒＢｌｕｅである（Ｎｏｃｉａｒｉら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１３（２）：１５７−１６７，１９９８）。Ａｌａｍａ
ｒＢｌｕｅは、ミトコンドリアの還元が生じ、それによってＡｌａｍａｒＢｌｕｅの蛍光
強度の劇的な増加（すなわち、量子収量の増加）がもたらされるまで、蛍光消光される（
すなわち、低量子収量）。このアッセイは、極めて高感度であり、特異的であると報告さ
れており、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイよりも有意に少ない数のエフェクター細胞しか
必要としない。
本方法によって誘導され得る他の免疫細胞としては、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）が
挙げられる。ＮＫは、抗原特異的レセプターを欠き、自然免疫系の一部である、リンパ系
細胞である。代表的には、感染した細胞は、通常、細胞表面ＭＨＣに結合した外来粒子に
よって警告されたＴ細胞によって破壊される。しかしながら、ウイルスに感染した細胞は
、抗体によって認識されるウイルスタンパク質を発現することによって感染をシグナル伝
達する。これらの細胞は、ＮＫによって殺滅され得る。腫瘍細胞では、その腫瘍細胞が、
ＭＨＣ Ｉ分子の発現を失っている場合、それは、ＮＫに感受性であり得る。
患者に投与するための製剤および経路
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク
質、形質導入された細胞、活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞、および負荷されたＴ細
胞）を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは
、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まな
い組成物を調製することを伴い得る。
多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３などは、例えば、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ被
験体体重、約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重
、約０．０５〜１．０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０
．２〜４ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜３ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜２ｍｇ
／ｋｇ被験体体重または約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、例えば、約０．１、０．２
、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２
．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重
の用量で送達され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、１用量あたり０．４
ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。リガンドを、例えば、バイアル
１本あたり約０．２５ｍｌ〜約１０ｍｌ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２
、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５
、９、９．５または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含むバイアルまたは他の容器が
提供され得る。
ＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
ＡＰ１９０３ ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって製造
されており、ＡＰ１９０３ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは
、Ｆｏｒｍａｔｅｃｈ Ｉｎｃによって作製されている。それは、非イオン性可溶化剤Ｓ
ｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０
３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、この製剤は、わずかに黄
色の透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、可逆的な相転移を起こし、乳白色の
溶液になる。この相転移は、室温に再度温めると、元に戻る。１本分（the fill）は、
３ｍＬのガラスバイアルにおける２．３３ｍＬである（バイアル１本あたり合計約１０ｍ
ｇのＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
ＡＰ１９０３は、患者に投与する前の夜に冷蔵庫から取り出され、およそ２１℃の温度
で一晩保管され、その結果、その溶液は、希釈前に透明になる。その溶液は、注入開始の
３０分以内にガラスボトルもしくはポリエチレンボトルまたは非ＤＥＨＰバッグにおいて
調製され、投与するまでおよそ２１℃で保管される。
すべての試験薬が、２℃〜８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、ア
クセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。
投与
１つの例において、患者には、非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セッ
トを使用して、２時間にわたるＩＶ注入によって、単一の固定された用量のＡＰ１９０３
ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（０．４ｍｇ／ｋｇ）が投与される。ＡＰ１９０３の用量
は、すべての患者に対して個別に計算され、体重が≧１０％変動しない限り、再計算され
ない。計算された用量は、注入前に０．９％生理食塩水で１００ｍＬに希釈される。
患者は、注入終了後１５分間、都合の悪い有害作用について観察される。
送達ベクターを安定にするためおよび標的細胞による取り込みを可能にするために適切
な塩および緩衝剤を使用することが一般に望ましい場合がある。緩衝剤は、組換え細胞が
患者に導入されるときにも使用され得る。水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリア
または水性媒質に溶解されたまたは分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。
そのような組成物は、接種材料とも称される。句「薬学的にまたは薬理学的に許容され得
る」とは、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー
反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のこ
とを指す。薬学的に許容され得るキャリアは、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーテ
ィング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な
物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、公知である。任意の従来の媒質ま
たは作用物質が、ベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物
におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る
。
活性な組成物は、従来の医薬品を含み得る。これらの組成物の投与は、標的組織がその
経路を介して利用可能である限り、任意の通常の経路を介し得る。これには、例えば、経
口、経鼻、頬側、直腸、膣または局所的が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、
皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であり得る。そのような組成物は、通
常、本明細書中で論じられる薬学的に許容され得る組成物として投与され得る。
注射可能な使用に適した薬学的な形態としては、滅菌された水溶液または分散液、およ
び滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる。
すべての場合において、その形態は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性で
ある。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚
染作用から保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グ
リセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの
好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例え
ば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合、必要とされる粒径を維
持すること、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用
の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノ
ール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。ある特定の例では、等張
剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが、含められ得る。注射可能な組成物の持続性の吸
収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチ
ンを組成物において使用することによってもたらされ得る。
経口投与の場合、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取不可能なうがい薬およ
び歯磨剤の形態で使用され得る。必要とされる量で活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ド
ーベル液）などの適切な溶媒に組み込んでいるうがい薬が、調製され得る。あるいは、活
性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組み
込まれ得る。活性成分は、例えば、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤
にも分散され得る。活性成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、香味料、起泡剤および湿
潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療有効量で加えられ得る。
組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、
例えば、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マ
ンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と
ともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩
基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウ
ムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン
、プロカインなどのような有機塩基からも得ることができる。
製剤化されると、溶液は、投与製剤（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に適合
した様式で、および治療的に有効であるような量で、投与され得る。それらの製剤は、種
々の剤形（例えば、注射可能な液剤、薬物放出カプセル剤など）で容易に投与される。例
えば、水性液剤での非経口投与の場合、その液剤は、必要であれば適切に緩衝され得、最
初に、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグルコースで等張性にされ得る。これらの特定
の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この文脈では
、滅菌された水性媒質が使用され得る。例えば、１投与量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶
液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられ得るか、または提案される注入部
位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５−１０３８および１５７０−
１５８０頁を参照のこと）。処置されている被験体の状態に応じて、投与量のいくつかの
バリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与に関与する者が、個々の被験体
に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏ
ｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準が要求するような、無菌性、発熱性ならび
に一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。
投与スケジュールは、患者にふさわしいように決定され得、例えば、核酸が０週目に投
与された後、二量体化の化学誘導物質の投与による誘導が行われ、それに続いて、さらな
る誘導物質が、有効な治療結果を得るのに必要なとき、または例えば、その後、２、４、
６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０間隔で、例えば、合計２、４、６、８、１
０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０、４０、５０、
６０、７０、８０、９０または１００週間わたって、投与される投薬スケジュールを含み
得る。
投与スケジュールは、患者にふさわしいように決定され得、例えば、核酸を形質導入さ
れたＴ細胞または他の細胞が０週目に投与された後、二量体化化学誘導物質の投与による
誘導が行われ、それに続いて、さらなる誘導物質が、有効な治療結果を得るのに必要なと
き、または例えば、その後、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０週間
の間隔で、例えば、合計２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、
２４、２６、２８または３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００週間わ
たって、投与される投薬スケジュールを含み得る。
形質導入されたＴ細胞の投与の場合、おそらく、１回の投与で十分であるが、Ｔ細胞は
、１回よりも多く提供されてもよいし、他の細胞（例えば、本明細書中で論じられる非樹
状細胞および非Ｂ細胞）が、複数回投与されてもよい。さらに、本技術の非Ｔ細胞の態様
に標的化された核酸が、最適な治療効果のために、１回よりも多く投与されてもよい。ゆ
えに、例えば、投与スケジュールは、患者にふさわしいように決定され得、例えば、核酸
または核酸を形質導入された細胞が０週目に投与された後、さらなる核酸または核酸を形
質導入された細胞および誘導物質がその後２週間間隔で、例えば、合計２、４、６、８、
１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０週間にわたっ
て投与される投薬スケジュールを含み得る。
ある用量の細胞の投与は、１セッションでまたは１セッションより多いセッションで行
われ得る。
必要であれば、上記方法は、処置において使用されるより多くの細胞を得るためにさら
なる白血球アフェレーシスをさらに含み得る。
疾患を処置するための方法
本方法は、病原微生物によって引き起こされる疾患および／または過剰増殖性疾患の処
置または予防の方法も包含する。
処置され得るかまたは予防され得る疾患としては、ウイルス、細菌、酵母、寄生生物、
原生動物、がん細胞などによって引き起こされる疾患が挙げられる。薬学的組成物（形質
導入されたＴ細胞、発現ベクター、発現構築物など）は、全身性の免疫賦活物（Ｔ細胞を
活性化する組成物またはシステム）として使用され得、それ自体、疾患を処置する際の有
用性を有する。処置され得るおよび／または予防され得る例示的な疾患としては、ウイル
ス病因の感染症（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ウイルス性肝炎、エプスタイ
ン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、パピローマウイルスなど）；または細
菌病因の感染症（例えば、肺炎、結核、梅毒など）；または寄生生物病因の感染症（例え
ば、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症など
）が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的組成物（形質導入されたＴ細胞、発現ベクター、発現構築物など）を使用して処
置され得るかまたは予防され得る新生物発生前または過形成の状態としては、結腸ポリー
プ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳房病変などのような新生物発生前または過形成の状態
が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的組成物を使用して処置され得る、固形腫瘍を含むがんとしては、原発性または転
移性メラノーマ、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、
肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺
がん、卵巣がん、膵がん、結腸がん、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ＮＰＣ、膀胱がん、
子宮頸がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に提示されるＴ細胞活性化システムおよび他の治療的細胞活性化システムを
使用して処置され得る、固形腫瘍を含む他の過剰増殖性疾患としては、関節リウマチ、炎
症性腸疾患、変形性関節症、平滑筋腫、アデノーマ、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞
、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、新生物発生前の病変（例えば、腺腫様過形成および
前立腺上皮内新形成）、上皮内癌、口腔毛状白斑症または乾癬が挙げられるが、これらに
限定されない。
処置方法において、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、形質
導入された細胞、および活性化Ｔ細胞、形質導入されたＴ細胞および負荷されたＴ細胞）
の投与は、「予防的」または「治療的」な目的であり得る。薬学的組成物は、予防的に提
供されるとき、任意の症候よりも先に提供される。薬学的組成物の予防的投与は、その後
の任意の感染または疾患を予防するためまたは回復させるために役立つ。薬学的組成物は
、治療的に提供されるとき、感染または疾患の症候の発生時または発生後に提供される。
したがって、本明細書中に提示される組成物は、疾患を引き起こす作用因子もしくは疾患
状態への予想される曝露の前または感染もしくは疾患の開始後に提供され得る。したがっ
て、本明細書中で論じられる核酸および細胞を用いる、固形腫瘍（例えば、がんに見出さ
れる固形腫瘍、または例えば前立腺がんであるがこれに限定されない）の予防的処置のた
めの方法が、本明細書中に提供される。例えば、被験体において腫瘍を予防的に防止する
かまたはそのサイズを減少するための方法が提供され、上記方法は、本明細書で論じられ
る核酸または細胞を投与し、それによって上記核酸または細胞が、被験体において腫瘍を
防止するかまたはそのサイズを減少するために有効な量で投与される工程を包含する。
任意の組織または器官由来の固形腫瘍が、本方法を用いて処置され得るが、例えば、そ
の固形腫瘍としては、血管構造において、例えば、ＰＳＡ、例えばＰＳＭＡを発現してい
る任意の腫瘍、例えば、肺、骨、肝臓、前立腺または脳、ならびにまた、例えば、乳房、
卵巣、腸、精巣、結腸、膵臓、腎臓、膀胱、神経内分泌系、軟部組織、骨性腫瘤（ｂｏｎ
ｅｙ ｍａｓｓ）およびリンパ系に存在する固形腫瘍が挙げられる。処置され得る他の固
形腫瘍としては、例えば、神経膠芽腫および悪性骨髄腫が挙げられる。
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量とし
て好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤と共同して
、所望の免疫原性効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料
の単位用量についての規格（specification）は、薬学的組成物のユニークな特色および
達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、その特色に依存する。
薬学的組成物の有効量は、免疫応答を増強するこの選択された結果を達成する量であり
、そのような量は、決定され得る。例えば、免疫系不全を処置するための有効量は、免疫
系の活性化を引き起こし、抗原に曝露されたときに抗原特異的な免疫応答を発生させるた
めに必要な量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。
任意の特定の用途に対する有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与される特
定の組成物、被験体のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などの因子に応じ
て変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要とせ
ずに、経験的に決定され得る。したがって、例えば、１つの実施形態において、形質導入
されたＴ細胞または他の細胞は、例えば、免疫応答を誘導するのに有効な量で、または例
えば、腫瘍サイズを減少させるかもしくは腫瘍血管構造の量を減少させるのに有効な量で
、被験体に投与される。
いくつかの実施形態において、改変された細胞が、被験体に複数回投与され、その複数
回投与の間で投与量レベルを漸増させながら投与される。いくつかの実施形態において、
投与量レベルの漸増は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性のレベルを上げ、ゆえに、治療効果（例え
ば、例えば、標的細胞、例えば、例えば、腫瘍細胞の量または濃度の減少）を高める。
いくつかの実施形態において、個別化された処置が提供され、ここで、その疾患または
状態のステージまたはレベルは、改変された細胞を投与する前、さらなる用量の改変され
た細胞を投与する前、または改変された細胞の投与に関与する方法および投与量を決定す
る際に、決定される。これらの方法は、本願の方法のいずれかにおいて使用され得る。改
変された細胞を投与する前に患者を評価するこれらの方法は、例えば固形腫瘍を有する被
験体の処置の文脈において論じられるが、これらの方法は、他の状態および疾患の処置に
も同様に適用され得ると理解される。したがって、例えば、本願のいくつかの実施形態に
おいて、本方法は、本願の改変された細胞を被験体に投与する工程を含み、さらに、腫瘍
サイズの有効な減少レベルを達成するための改変された細胞の適切な用量を決定する工程
を含む。細胞の量は、例えば、被験体の臨床的状態、体重、および／または性別もしくは
他の関連する理学的特性に基づいて決定され得る。上記被験体に投与される改変された細
胞の量をコントロールすることによって、有害事象（例えば、サイトカインストームなど
）の可能性は減少され得る。
用語「投与量」は、投与の量（amount of the dose）と投与の頻度（例えば、例え
ば、次の投与のタイミング）の両方を含むことが意味される。例えば、キメラカスパーゼ
−９ポリペプチドを誘導するための、用語「投与量レベル」とは、被験体の体重と関係し
て投与される多量体リガンドの量のことを指す。したがって、投与量レベルの上昇は、被
験体の体重に対して投与されるリガンドの量の増加を意味する。さらに、投与される用量
（例えば、例えば、多量体リガンドが持続注入ポンプを使用して投与されるとき）の濃度
の上昇は、１分あたりまたは１秒あたりに投与される濃度（ひいては、投与される量）が
上昇することを意味する。
その後の薬物の用量、例えば、例えば、その後の多量体リガンドの用量、および／また
はその後の薬物投与量を調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され
得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体または電子
媒体において）提供され得る。例えば、疾患または状態の症候が、表として提供され得、
臨床医は、疾患のステージのリストまたは表とその症候を比較し得る。次いで、その臨床
医は、その表から、その後の薬物用量に対する指示を確認し得る。ある特定の実施形態に
おいて、指示は、それらの症候またはステージがコンピュータに提供された後（例えば、
コンピュータ上のメモリに入れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば
、表示され得る）。例えば、この情報は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザー
によってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリ
モートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが
、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持することについての指示を生成し得、およ
び／またはその後の薬物用量の量を提供し得る。
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を
投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示を提供し得る
。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施
形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態におい
て、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、そ
のコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて、保健サービ
ス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る（例えば、その後
の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば、ポンプパラメー
タが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。
本明細書中に提示されるような方法は、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれを
コードする発現構築物の送達を含むが、これらに限定されない。薬学的組成物の「有効量
」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能におよび繰り返し達成するのに十分な量
、例えば、疾患またはその症候を回復させるか、減少させるか、最小にするか、またはそ
の程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他
のより厳密な定義が、適用され得る。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価
するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカーをモニターする工程が存在
し得る。
Ａ．遺伝子に基づく治療
ある特定の実施形態において、共刺激ポリペプチド（例えば、本明細書中で論じられる
もの）を提供することができる発現構築物が、細胞に、および例えばＴ細胞に備わってい
る。発現ベクターおよびその中に使用される遺伝的エレメントに関する長い考察が、参照
によりこの項に援用される。ある特定の例では、発現ベクターは、ウイルスベクター（例
えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスお
よびレトロウイルス）であり得る。別の例では、ベクターは、リソソームによって被包さ
れた発現ベクターであり得る。
遺伝子送達は、インビボとエキソビボの両方の状況において行われ得る。ウイルスベク
ターの場合、一般に、ウイルスベクターストックが調製され得る。エキソビボおよびイン
ビボにおけるウイルスベクター媒介性の遺伝子送達の例は、本願において提示される。イ
ンビボで送達する場合、ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、例えば、約１、
２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０４、１、２、３、４、５、６、７、８もし
くは９×１０５、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０６、１、２、３、４
、５、６、７、８もしくは９×１０７、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１
０８、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０９、１、２、３、４、５、６、
７、８もしくは９×１０１０、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１１ま
たは１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０１２個の感染性粒子が患者に送達
され得る。類似の数字は、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソーム製
剤または他の非ウイルス製剤に対して外挿され得る。薬学的に許容され得る組成物として
の製剤は、下記で論じられる。多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３などは、例えば、
約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０
、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／
ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。
Ｂ．細胞に基づく治療
企図される別の治療は、形質導入されたＴ細胞の投与である。それらのＴ細胞は、イン
ビトロにおいて形質導入され得る。薬学的に許容され得る組成物としての製剤は、本明細
書中で論じられる。
細胞に基づく治療では、形質導入される細胞は、例えば、標的抗原核酸（例えば、ｍＲ
ＮＡまたはＤＮＡ）もしくはタンパク質でトランスフェクトされ得るか；細胞溶解産物、
タンパク質もしくは核酸でパルスされ得るか；または細胞と電気的に融合され得る。それ
らの細胞、タンパク質、細胞溶解産物または核酸は、腫瘍細胞などの細胞、または他の病
原微生物、例えば、ウイルス、細菌、原生動物などに由来し得る。
Ｃ．併用療法
本明細書中に提示される発現ベクターの有効性を高めるために、これらの組成物および
方法をその疾患の処置において有効な作用物質と組み合わせることが、望ましい場合があ
る。
ある特定の実施形態において、抗がん剤が、本方法と組み合わせて使用され得る。「抗
がん」剤は、例えば、１つ以上のがん細胞を殺滅すること、１つ以上のがん細胞において
アポトーシスを誘導すること、１つ以上のがん細胞の成長速度を低下させること、転移の
発生率もしくは数を減少させること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍の成長を阻害
すること、腫瘍もしくは１つ以上のがん細胞への血液の供給を減少させること、１つ以上
のがん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を予防するかもし
くは阻害すること、またはがんを有する被験体の寿命を延長することによって、被験体に
おけるがんに悪影響を与えることができる。抗がん剤としては、例えば、化学療法剤（化
学療法）、放射線治療剤（放射線治療）、外科手技（手術）、免疫治療剤（免疫療法）、
遺伝的治療剤（遺伝子治療）、ホルモン治療、他の生物学的薬剤（生物療法）および／ま
たは代替療法が挙げられる。
さらなる実施形態では、感染症を処置するためおよび／または予防するために、抗生物
質が薬学的組成物と組み合わせて使用され得る。そのような抗生物質としては、アミカシ
ン、アミノグリコシド類（例えば、ゲンタマイシン）、アモキシシリン、アンホテリシン
Ｂ、アンピシリン、アンチモン類（ａｎｔｉｍｏｎｉａｌｓ）、アトバコン、スチボグル
コン酸ナトリウム、アジスロマイシン、カプレオマイシン、セフォタキシム、セフォキシ
チン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クリンダマイシ
ン、クロファジミン、サイクロセリン、ダプソン、ドキシサイクリン、エタンブトール、
エチオナミド、フルコナゾール、フルオロキノロン類、イソニアジド、イトラコナゾール
、カナマイシン、ケトコナゾール、ミノサイクリン、オフロキサシン）、パラ−アミノサ
リチル酸、ペンタミジン、ポリミキシン、ディフェンシン類（ｄｅｆｉｎｓｉｎｓ）、プ
ロチオナミド、ピラジナミド、ピリメタミン、スルファジアジン、キノロン類（例えば、
シプロフロキサシン）、リファブチン、リファンピン、スパルフロキサシン、ストレプト
マイシン、スルホンアミド類、テトラサイクリン類、チアセタゾン、トリメトプリム（ｔ
ｒｉｍｅｔｈａｐｒｉｍ）−スルファメトキサゾール、バイオマイシンまたはそれらの組
み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
より一般的には、そのような薬剤は、がん細胞および／もしくは微生物を殺滅するため
またはがん細胞および／もしくは微生物の増殖を阻害するために有効な発現ベクターとと
もに、合計量で提供され得る。このプロセスは、細胞（複数可）を薬剤（複数可）および
薬学的組成物と同時にまたはある時間内に接触させる工程を含み得、ここで、細胞、組織
または生物への薬学的組成物と薬剤との別個の投与によって、所望の治療的な利益がもた
らされる。これは、薬学的組成物と１つ以上の薬剤の両方を含む単一の組成物または薬理
学的製剤と細胞、組織もしくは生物を接触させることによって、または２つ以上の別々の
組成物もしくは製剤（ここで、一方の組成物は薬学的組成物を含み、他方は１つ以上の薬
剤を含む）と細胞を接触させることによって達成され得る。
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき
、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬
などが標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセスを記述するために本明細書中で
使用されるか、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記
述するために本明細書中で使用される。細胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的
組成物および／またはさらなる作用物質（複数可）が、細胞（複数可）を殺滅するのに有
効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）よ
り先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と同時であり得る、および／または他の作用
物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に
細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複
数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮
することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証
され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用い
て、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成
物と接触させ得ることが企図される。他の態様において、１つ以上の作用物質が、発現ベ
クターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２
４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の
導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と
１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
いくつかの実施形態において、上記化学療法剤は、リンパ球枯渇化学療法剤であり得る
。他の実施形態において、化学療法剤は、タキソテール（ドセタキセル）または別のタキ
サン、例えば、カバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ）などであり得る。化学療法剤
は、細胞および誘導物質による処置の前、処置中または処置の後に投与され得る。例えば
、化学療法剤は、第１の用量の活性化された核酸を投与する約１年前、１１、１０、９、
８、７、６、５もしくは４ヶ月前、または１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２，
１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２週間前もしくは１週間前に、投与され得る
。または、例えば、化学療法剤は、第１の用量の細胞または誘導物質を投与した約１週間
後、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１７もしくは１８週間後、または４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１ヶ月後
、または１年後に投与され得る。
化学療法剤の投与は、２つ以上の化学療法剤の投与を含み得る。例えば、シスプラチン
は、タキソテールまたは他のタキサン、例えば、カバジタキセルなどに加えて投与され得
る。
特定の腫瘍または疾患に標的化された免疫応答の発生
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞に抗原特異性を伝えるためにデザインされ
た人工レセプターである。それらは、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択
された、抗原特異的成分、膜貫通成分および細胞内成分を含む。それらは、膜貫通成分と
ともに、ストークポリペプチドをさらに含み得る。キメラ抗原レセプターを発現している
Ｔ細胞は、がん治療をはじめとした様々な治療において使用され得る。
誘導性ＣＤ４０、誘導性ＭｙＤ８８または誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０を形質導入され
たＴ細胞および他の細胞には、キメラ抗原レセプター、すなわちＣＡＲをコードする核酸
も形質導入され得る。そのキメラ抗原レセプターは、処置されるべき腫瘍の表面上に存在
する腫瘍抗原または疾患に関連する他の抗原を標的とするように選択され得る。次にその
キメラ抗原レセプターを発現している活性化Ｔ細胞は、腫瘍または他の疾患を標的とする
。形質導入されたＴ細胞には、特定の腫瘍または疾患に対する免疫防御を維持するメモリ
ーＴ細胞も含まれ得る。上記改変されたＴ細胞の投与後に、改変されたメモリーＴ細胞は
、上記被験体に存在し得る。
最適化されたおよび個別化された治療的処置
例えば前立腺がんを含む固形腫瘍がんに対する処置は、処置のコース中にＩＬ−６、Ｉ
Ｌ６−ｓＲまたはＶＣＡＭ−１の濃度を決定することによって、最適化され得る。ＩＬ−
６とは、インターロイキン６のことを指す。ＩＬ−６ｓＲとは、ＩＬ−６可溶性レセプタ
ーのことを指し、そのレベルは、ＩＬ−６のレベルと密接に相関することが多い。ＶＣＡ
Ｍ−１とは、血管細胞接着分子のことを指す。異なるステージまたはタイプのがんを有す
る異なる患者は、様々な治療に対して異なって反応し得る。処置に対する応答は、様々な
体液中または組織内のＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲまたはＶＣＡＭ−１の濃度またはレベルを
追跡することによってモニターされ得る。ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲまたはＶＣＡＭ−１な
どのポリペプチドの濃度、レベルまたは量の決定には、完全長ポリペプチドまたはそのフ
ラグメントもしくはバリアントの検出が含まれ得る。そのフラグメントまたはバリアント
は、例えば、免疫学的方法、質量分析、核酸ハイブリダイゼーションなどによって検出さ
れるのに十分であり得る。個々の患者に対する処置の最適化は、過量投与の結果としての
副作用を回避するのに役立つこともあるし、その処置がいつ無効であるかを決定し、処置
のコースを変更するのに役立つこともあるし、いつ用量を増加させ得るかを決定するのに
役立つこともある。本明細書中で論じられる技術は、臨床医がバイオマーカー、例えば、
ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲまたはＶＣＡＭ−１などを追跡すること、および被験体に投与す
るための薬物またはワクチンのその後の用量を維持し得るか、減少させ得るかまたは増加
させ得るかを決定すること、およびその後の用量のためのタイミングを決定することを可
能にすることによって、固形腫瘍がんを処置するための治療方法を最適化する。
例えば前立腺がんを含む固形腫瘍がんに対する処置は、処置のコース中にウロキナーゼ
型プラスミノゲンアクチベーターレセプター（ｕＰＡＲ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、
上皮成長因子（ＥＧＦ）または血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の濃度を決定することによ
っても最適化され得る。異なるステージまたはタイプのがんを有する異なる患者は、様々
な治療に対して異なって反応し得る。処置のコースにわたり、被験体１００３に対するｕ
ＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦおよびＶＥＧＦのレベルが測定された。被験体１００３は、血清
中の低酸素因子の全身の乱れ（perturbation）を示し、これは、処置に対する正の応答を
示し得る。この知見の解釈を限定するものではないが、これは、処置に応答した腫瘍によ
る低酸素因子の分泌を示し得る。したがって、処置に対する応答は、例えば、様々な体液
中または組織内のｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦまたはＶＥＧＦの濃度またはレベルを追跡す
ることによってモニターされ得る。ｕＰＡＲ、ＨＧＦ、ＥＧＦまたはＶＥＧＦなどのポリ
ペプチドの濃度、レベルまたは量の決定には、完全長ポリペプチドまたはそのフラグメン
トもしくはバリアントの検出が含まれ得る。そのフラグメントまたはバリアントは、例え
ば、免疫学的方法、質量分析、核酸ハイブリダイゼーションなどによって検出されるのに
十分であり得る。個々の患者に対する処置の最適化は、過量投与の結果としての副作用を
回避するのに役立つこともあるし、その処置がいつ無効であるかを決定し、処置のコース
を変更するのに役立つこともあるし、いつ用量を増加させ得るかを決定するのに役立つこ
ともある。本明細書中で論じられる技術は、臨床医がバイオマーカー、例えば、ｕＰＡＲ
、ＨＧＦ、ＥＧＦまたはＶＥＧＦなどを追跡すること、および被験体に投与するための薬
物またはワクチンのその後の用量を維持し得るか、減少させ得るかまたは増加させ得るか
を決定すること、およびその後の用量のためのタイミングを決定することを可能にするこ
とによって、固形腫瘍がんを処置するための治療方法を最適化する。
例えば、ある特定のバイオマーカーの量または濃度が、固形腫瘍の処置のコース中に変
化することが決定されてきた。薬物を必要とする被験体（例えば、固形腫瘍、例えば、前
立腺腫瘍などを有する被験体）に投与される薬物のその後の用量を増加させ得るか、減少
させ得るかまたは維持し得るかを臨床医が決定することを可能にする、そのようなバイオ
マーカーの所定の標的レベル、すなわちバイオマーカーの閾値は、正常な被験体において
特定され得、提供される。臨床医は、バイオマーカーの有無または量が、ある特定の実施
形態において、それぞれ、バイオマーカーの閾値より低いか、高いか、またはほぼ同じで
あるかに基づいて、そのような決定を行い得る。
例えば、薬物処置またはワクチン接種の後に、過大に示されたバイオマーカーのレベル
が有意に減少しているおよび／または過少に示されたバイオマーカーのレベルが有意に増
加しているとの決定は、投与された薬物が治療効果を発揮しているという指標を臨床医に
提供する。「レベル」とは、流体中もしくは組織内のバイオマーカーの濃度または組織内
の絶対量のことを意味する。そのようなバイオマーカーの測定に基づいて、臨床医は、そ
の薬物のその後の用量を維持するかまたはその後の用量を上げるかもしくは下げること（
投与のタイミングを変更することを含む）を決定し得る。用語「薬物」は、従来の医薬（
例えば、小分子）、ならびに生物製剤（例えば、核酸、抗体、タンパク質、ポリペプチド
、改変された細胞など）を含む。別の例では、過大に示されたバイオマーカーのレベルが
有意に減少していないおよび／または過少に示されたバイオマーカーのレベルが有意に増
加していないとの決定は、投与された薬物が治療効果を有意に発揮していないという指標
を臨床医に提供する。そのようなバイオマーカーの測定に基づいて、臨床医は、その薬物
のその後の用量を増加させることを決定し得る。薬物は、被験体にとって有毒である場合
があり、副作用を及ぼすことがあることを考えると、本明細書中に提供される方法は、薬
物の有効な投与量に「ダイヤルイン（ｄｉａｌ ｉｎ）」する能力および副作用を最小限
に抑える能力を臨床医に提供するので、該方法は、治療的アプローチを最適化する。特定
の例では、本明細書中に提供される方法は、臨床医が、薬物の用量を治療的に効果的なレ
ベルに「ダイヤルアップ（ｄｉａｌ ｕｐ）」することを可能にし、ここで、ダイヤルア
ップされた投与量は、毒性閾値レベル未満である。したがって、本明細書中で論じられる
処置方法は、効力を高め、有毒な副作用の可能性を低下させる。
サイトカインは、多種多様な起源の細胞によって全身で広く産生されるポリペプチド制
御因子の多種多様な大きなファミリーである。サイトカインは、小さな分泌タンパク質で
あり、それには、ペプチドおよび糖タンパク質が含まれ、免疫、炎症および造血を媒介し
、制御する。サイトカインは、免疫刺激に応答して新規に産生される。サイトカインは、
通常、短い距離および短い時間枠にわたって低濃度で作用する（が必ずしもそうではない
）。サイトカインは、通常、特定の膜レセプターに結合することによって作用し、次いで
その結合によって、セカンドメッセンジャー（チロシンキナーゼであることが多い）を介
して細胞にシグナルを伝達し、それにより、細胞の挙動（例えば、遺伝子発現）を変化さ
せる。サイトカインに対する応答としては、例えば、膜タンパク質（サイトカインレセプ
ターを含む）の発現の増加または減少、エフェクター分子の増殖および分泌が挙げられる
。
用語「サイトカイン」は、タンパク質および糖タンパク質の大きなファミリーの総称で
ある。他の名称としては、リンフォカイン（リンパ球によって作られるサイトカイン）、
モノカイン（単球によって作られるサイトカイン）、ケモカイン（化学走性活性を有する
サイトカイン）およびインターロイキン（１種類の白血球によって作られ、他の白血球に
対して作用するサイトカイン）が挙げられる。サイトカインは、サイトカインを分泌する
細胞に対して作用することもあるし（オートクライン作用）、近くの細胞に対して作用す
ることもあるし（パラクリン作用）、場合によっては、遠く離れた細胞に対して作用する
こともある（内分泌作用）。
サイトカインの例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−
３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ
−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、
ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなど）、腫瘍壊
死因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなど）、リンフォカイン、モノカインおよびケ
モカイン；成長因子（例えば、トランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−α、Ｔ
ＧＦ−βなど））；コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子
（Ｇ−ＣＳＦ）など）；などが挙げられるがこれらに限定されない。
サイトカインは、細胞表面レセプター対応物を介して作用することが多い。次いで、そ
の後の細胞内のシグナル伝達のカスケードは、細胞の機能を変化させる。このシグナル伝
達には、他のサイトカインの産生をもたらす、いくつかの遺伝子およびそれらの転写因子
のアップレギュレーションおよび／もしくはダウンレギュレーション、他の分子に対する
表面レセプターの数の増加、またはフィードバック阻害によるそれら自体の作用の抑制が
含まれ得る。
ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６とも呼ばれる血管細胞接着分子−１）は、６つまたは７つの
免疫グロブリンドメインを含み、内皮細胞がサイトカインによって刺激された後だけ、大
血管と小血管の両方において発現される。したがって、ＶＣＡＭ−１の発現は、サイトカ
イン発現についてのマーカーである。
サイトカインは、完全長（例えば、全）タンパク質、ポリペプチド、代謝産物、メッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに前述のものの様々な中
間生成物およびフラグメント（例えば、切断産物（例えば、ペプチド、ｍＲＮＡフラグメ
ント））として検出され得る。例えば、ＩＬ−６タンパク質は、完全な完全長分子として
、または様々なレベルの陽性の同定を提供するのに十分大きな任意のフラグメントとして
、検出され得る。そのようなフラグメントは、総数が１０未満、１０〜２０、２０〜５０
、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００およびそれ超を有するアミノ酸を含み
得る。同様に、ＶＣＡＭ−１タンパク質は、完全な完全長アミノ酸分子として、または様
々なレベルの陽性の同定を提供するのに十分大きな任意のフラグメントとして、検出され
得る。そのようなフラグメントは、総数が１０未満、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１
００、１００〜１５０およびそれ超を有するアミノ酸を含み得る。
ある特定の実施形態において、サイトカインのｍＲＮＡは、完全な配列または特異的な
検出にとって十分な任意のフラグメントを標的化することによって検出され得る。ｍＲＮ
Ａフラグメントは、１０個より少ないヌクレオチドまたはそれより多い任意の数のヌクレ
オチドを含み得る。フラグメントは、ｍＲＮＡ鎖の任意の部分を含むその鎖の３’末端、
その鎖の任意の部分を含む５’末端、およびその鎖の任意の中心部分を含み得る。
検出は、任意の好適な方法を用いて行われ得、これらの方法としては、質量分析（例え
ば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、エレクトロ
スプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ））、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核酸の親和性（例えば、ハイブリダイゼーション
）、増幅および検出（例えば、リアルタイムまたは逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ））、ならびに抗体アッセイ（例えば、抗体アレイ、酵素結合免疫吸着測定法
（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳ
Ａ））が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ−６および他のサイトカインのアッ
セイの例としては、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．が提供するアッセイ（Ｍｉｌ
ｌｉｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｐａｎｅｌ）が挙
げられる。ＩＬ６−ｓＲアッセイの例としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ
が提供するアッセイ（Ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ−６Ｒ：（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｕｍｉ
ｎｅｘ（登録商標）Ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ））が挙げられる。ＶＣＡＭ−１
アッセイの例としては、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓが提供するアッセイ（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ製の（ＣＤ１０６）ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｋｉｔ，Ｄｕ
ｏＳｅｔ（＃ＤＹ８０９））が挙げられる。
バイオマーカーの供給源
バイオマーカーの有無または量は、被験体内（例えば、インサイチュ）または被験体外
（例えば、エキソビボ）において決定され得る。いくつかの実施形態において、バイオマ
ーカーの有無または量は、細胞（例えば、分化細胞、幹細胞）において決定され得、ある
特定の実施形態では、バイオマーカーの有無または量は、実質的に無細胞の媒質（例えば
、インビトロ）において決定され得る。用語「被験体においてバイオマーカーの有無また
は量を同定すること」は、本明細書中で使用されるとき、バイオマーカーを評価するため
、およびその被験体における有無または量を推定するための当該分野で公知の任意の方法
（例えば、インサイチュ、エキソビボにおいてまたはインビトロにおける方法）のことを
指す。
体液または組織サンプルは、エキソビボにおいてバイオマーカーの有無または量を決定
するために被験体から得られることが多い。組織サンプルを得ることができる身体の非限
定的な部分としては、いくつかの実施形態において、脚、腕、腹部、上背部、下背部、胸
部、手、指、爪、足、足指、足指爪、頸部、直腸、鼻部、咽頭、口、頭皮、顔、脊椎、咽
頭、心臓、肺、乳房、腎臓、肝臓、腸、結腸、膵臓、膀胱、子宮頸部、精巣、筋肉、皮膚
、毛髪、腫瘍または腫瘍の周囲の領域などが挙げられる。組織サンプルは、当該分野で公
知の任意の好適な方法によって得ることができ、ある特定の実施形態において、その方法
としては、生検（例えば、薄片生検、パンチ生検、切開生検、切除生検、掻爬生検、穿刺
吸引生検、へら（ｓｃｏｏｐ）生検、スキャロップ（ｓｃａｌｌｏｐ）生検、コア針生検
、真空補助下生検、開放外科的（ｏｐｅｎ ｓｕｒｇｉｃａｌ）生検）などが挙げられる
がこれらに限定されない。被験体から得ることができる体液の例としては、いくつかの実
施形態において、血液、脳脊髄液、髄液、洗浄液（lavage fluid）（例えば、気管支肺
胞洗浄液、胃洗浄液、腹膜洗浄液、管洗浄液、耳洗浄液、関節鏡下洗浄液）、尿、間質液
、便、痰、唾液、鼻粘液（nasal mucous）、前立腺液、洗浄液（lavage）、精液、リン
パ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁、炎症領域からの流体、筋消耗領域からの流体などが挙
げられるがこれらに限定されない。
被験体由来のサンプルは、バイオマーカーの有無または量を決定する前に処理され得る
。例えば、被験体由来の血液サンプルは、ある特定の画分を得るために処理され得、その
画分としては、血漿、血清、バフィーコート、赤血球層などが挙げられるがこれらに限定
されず、バイオマーカーの有無または量は、その画分において決定され得る。ある特定の
実施形態において、組織サンプル（例えば、腫瘍生検サンプル）は、組織サンプルをスラ
イスし、バイオマーカーを視覚化する作用物質（例えば、抗体）とスライスされたサンプ
ルを接触させる前および／または接触させた後にそのサンプルを顕微鏡下で観察すること
によって、処理され得る。いくつかの実施形態において、組織サンプルは、以下の非限定
的な条件のうちの１つまたはそれを超える条件に曝露され得る：洗浄、高塩溶液または低
塩溶液（例えば、高張液、低張液、等張液）への曝露、剪断条件への曝露（例えば、超音
波処理、プレス（例えば、フレンチプレス））、ミンシング、遠心分離、細胞の分離、組
織の分離など。ある特定の実施形態において、バイオマーカーは、組織から分離され得、
有無または量が、インビトロにおいて決定され得る。サンプルは、バイオマーカーの有無
または量を決定する前に、ある期間にわたって保管されることもある（例えば、サンプル
は、凍結され、凍結保存され、保存媒質（例えば、ホルムアルデヒド）中で維持され得る
）。
サンプルは、薬物を被験体に送達した後、任意の好適な回収時点において被験体から得
ることができる。例えば、サンプルは、薬物を被験体に送達した後、約１時間以内（例え
ば、薬物送達の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５または６
０分以内）、薬物を被験体に送達した後、約１日以内（例えば、薬物送達の約２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３または２４時間以内）または薬物を被験体に送達した後、約２
週間以内（例えば、薬物送達の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３または１４日以内）に回収され得る。回収は、例えば、毎時間、毎日、週２回、週１
回、隔週、毎月、隔月、年４回および年１回などを含む指定のスケジュールにおいて行わ
れ得る。薬物が、ある期間にわたって持続的に投与される場合（例えば、注入）、薬物が
被験体に導入された最初の時点、薬物投与が終わる時点またはその中間の時点（例えば、
投与時間枠の中間点または他の時点）からの遅延時間が決定され得る。
バイオマーカーの検出
１つまたはそれを超えるバイオマーカーの有無または量は、当該分野で公知の任意の好
適な方法によって決定され得、非限定的な決定方法は、本明細書中で論じられる。バイオ
マーカーの有無または量の決定は、時折、生物学的アッセイの使用を含む。生物学的アッ
セイにおいて、そのアッセイにおいて検出される１つまたはそれを超えるシグナルは、バ
イオマーカーの有無または量に変換され得る。そのアッセイにおいて検出されたシグナル
の変換は、例えば、検量線、１つまたはそれを超える標準物質（例えば、内部標準、外部
標準）、チャート、シグナルをバイオマーカーの有無または量に変換するコンピュータプ
ログラムなど、および前述のものの組み合わせの使用を含み得る。
アッセイにおいて検出されるバイオマーカーは、例えば、完全長のバイオマーカー、バ
イオマーカーのフラグメント、変更されたもしくは改変されたバイオマーカー（例えば、
バイオマーカー誘導体、バイオマーカー代謝産物）または２つもしくはそれを超える前述
のものを足し合わせたものであり得る。改変されたバイオマーカーは、本明細書中で論じ
られるバイオマーカーに対して実質的な配列同一性を有することが多い。例えば、改変さ
れたバイオマーカーと本明細書中で論じられるバイオマーカーとの間の同一性パーセント
は、１５〜２０％、２０〜３０％、３１〜４０％、４１〜５０％、５１〜６０％、６１〜
７０％、７１〜８０％、８１〜９０％および９１〜１００％の範囲内（例えば、１５、１
６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９
、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、
４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５
６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９
、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、
８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９
６、９７、９８、９９および１００パーセントの同一性）であり得る。改変されたバイオ
マーカーは、本明細書中で論じられるバイオマーカーの配列と９０％またはそれを超えて
同一である配列（例えば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）を有することが多い。
パーセント配列同一性は、当該分野で公知のアラインメント方法を用いて決定され得る。
バイオマーカーの検出は、当該分野で公知の任意の好適な方法を用いて行われ得、その
方法としては、質量分析、抗体アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、核酸親和性、マイクロ
アレイハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、逆ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲが挙げ
られるがこれらに限定されない。例えば、ＲＮＡの純度および濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ
１０００において、分光光度的に決定され得る（２６０／２８０＞１．９）。ＲＮＡの
質は、当該分野で公知の方法（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚ
ｅｒ；ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）など）を用いて評価さ
れ得る。
その後の薬物用量を調整することまたは維持することについての指示
その後の薬物用量を調整することまたは維持することについての指示は、バイオマーカ
ーの有無に基づき得る。例えば、（ｉ）バイオマーカーのレベルの低感度の測定が利用可
能であるとき、（ｉｉ）バイオマーカーのレベルが、薬物に応答して急激に変化するとき
、（ｉｉｉ）低レベルもしくは高レベルのバイオマーカーが存在するとき、および／また
は（ｉｖ）薬物が、投与のレベルにおいて明らかに有毒でないとき、バイオマーカーの有
無は、その後の薬物用量を調整するかまたは維持する指示を作製するのに十分であり得る
。
その後の薬物用量を調整することまたは維持することについての指示は、バイオマーカ
ーの量またはレベルに基づくことが多い。バイオマーカーの量は、いくつかの実施形態に
おいて、平均値、中央値、名目上の量（nominal）、範囲、間隔、最大値、最小値または
相対量であり得る。バイオマーカーの量は、ある特定の実施形態において、測定誤差範囲
を伴ってまたは測定誤差範囲なしで表現され得る。いくつかの実施形態において、バイオ
マーカーの量は、バイオマーカーの濃度、単位重量あたりのバイオマーカーの重量、単位
体積あたりのバイオマーカーの重量、バイオマーカーのモル、単位体積あたりのバイオマ
ーカーのモル、単位重量あたりのバイオマーカーのモル、単位細胞あたりのバイオマーカ
ーの重量、単位細胞数（unit cells）あたりのバイオマーカーの体積、単位細胞数あた
りのバイオマーカーのモルなどとして表現され得る。重量は、例えば、フェムトグラム、
ピコグラム、ナノグラム、マイクログラム、ミリグラムおよびグラムとして表現され得る
。体積は、例えば、フェムトリットル、ピコリットル、ナノリットル、マイクロリットル
、ミリリットルおよびリットルとして表現され得る。モルは、例えば、ピコモル、ナノモ
ル、マイクロモル、ミリモルおよびモルで表現され得る。いくつかの実施形態において、
単位重量は、被験体の重量または被験体由来のサンプルの重量であり得、単位体積は、被
験体由来のサンプルの体積（例えば、血液サンプルの体積）であり得、単位細胞数は、１
つの細胞あたりまたはある特定の数の細胞あたりであり得る（例えば、１０００個の細胞
あたりのバイオマーカーのマイクログラム）。いくつかの実施形態において、１つの組織
または体液から決定されたバイオマーカーの量は、当該分野で公知であるように、別の体
液中または組織内のバイオマーカーの量に相関し得る。
その後の薬物用量を調整することまたは維持することについての指示は、被験体におけ
るバイオマーカーの決定されたレベルをバイオマーカーの所定のレベルと比較することに
よって作製されることが多い。ある特定の実施形態において、バイオマーカーの所定のレ
ベルは、時折、被験体における薬物の治療的な量または効果的な量に関連し、時折、薬物
の毒性レベルに関連し、時折、ある状態の存在に関連し、時折、処置の中間点に関連し、
時折、処置の終点に関連する。バイオマーカーの所定のレベルは、時折、エレメントとし
て時間を含み、いくつかの実施形態において、閾値は、時間依存的シグネチャである。
例えば、正常レベルよりも約８倍高い（例えば、正常レベルよりも約９、１０、１１、
１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２
５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８
、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、
５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６
５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５倍高い）ＩＬ−
６またはＩＬ６−ｓＲレベルは、薬物の投与量または投与の頻度がその後の投与において
高められ得ることを示し得る。
用語「投与量」は、投与の用量の量と投与の頻度（例えば、次の用量のタイミングなど
）の両方を含むことが意味される。正常レベルよりも約８倍高いレベルより低いＩＬ−６
またはＩＬ−６ｓＲのレベル（例えば、正常レベルよりも約７、６、５、４、３、２もし
くは１倍高いか、または正常レベル未満もしくは正常レベルと等しいレベル）は、その後
の投与において投与量が維持され得るかまたは減少され得ることを示し得る。正常レベル
よりも約８倍またはそれを超えて高い（例えば、例えば、正常レベルよりも約９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６
４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５倍高い）
ＶＣＡＭ−１レベルは、その後の投与においてその薬物の投与量が増加され得ることを示
し得る。正常レベルよりも約８倍高いレベルよりも低いＶＣＡＭ−１レベル（例えば、正
常レベルよりも約７、６、５、４、３、２もしくは１倍高いか、または正常レベル未満も
しくは正常レベルと等しいレベル）は、その後の投与において投与量が維持され得るかま
たは減少され得ることを示し得る。ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲまたはＶＣＡＭ−１の正常レ
ベルは、固形腫瘍を有すると診断されていない被験体において、または患者において処置
中の固形腫瘍のタイプについて評価され得る。
薬物の用量を調整することまたは維持することについての他の指示としては、例えば、
個々の分泌因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、Ｉ
ＦＮ−γ、ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦもしくはＨＧＦなどの濃度の乱れ、または分泌因子のパ
ネル（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、
ＲＡＮＴＥＳ、ＥＧＦおよびＨＧＦからなる群より選択される２つまたはそれを超えるマ
ーカー）の平均濃度の乱れが挙げられる。この乱れは、例えば、個々の分泌因子の濃度の
少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、
９０％もしくは１００％の増加または減少、あるいは分泌因子のパネルの血清濃度の平均
相対変化の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％
、８０％、９０％または１００％の増加または減少からなり得る。この増加の後、次の投
与の前に、ベースライン血清濃度に戻ることもあるし、戻らないこともある。血清濃度の
平均相対変化の増加または減少は、例えば、パネルの中の各因子の相対値の重みづけを含
み得る。また、その増加または減少は、例えば、収集されたデータの各時点の相対値の重
みづけを含み得る。各時点または各因子に対する重みづけされた値は、がん、転移または
腫瘍量の状態または程度に応じて変動し得る。薬物の用量を調整することまたは維持する
ことについての指示は、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０回またはそれ
を超える投与の後の個々の分泌因子の濃度または分泌因子のパネルの平均濃度の乱れを含
み得る。例えば、処置のコースにわたって、例えば、薬物または本明細書中で論じられる
ワクチンもしくは組成物の６回の投与にわたって、個々の分泌因子の濃度または分泌因子
のパネルの平均濃度が、少なくとも１回の投与の後に乱されることが観察される場合、こ
れは、投与の頻度もしくはその後の投与量を維持するか、減少させるか、もしくは増加さ
せる指示であり得るか、または例えば、さらなる薬物、アデノウイルスワクチン、または
アデノウイルスでトランスフェクトされたもしくは形質導入された細胞を調製することに
よって処置を継続する指示であり得る。
いくつかの処置方法は、（ｉ）１回またはそれを超える投与（例えば、１、２、３、４
、５、６、７、８、９または１０回の用量）で被験体に薬物を投与する工程、（ｉｉ）（
ｉ）の後、被験体におけるバイオマーカーまたは被験体由来のバイオマーカーの有無また
は量を決定する工程、（ｉｉｉ）被験体への投与についてその薬物のその後の用量を増加
させるか減少させるかまたは維持する指示を提供する工程、および（ｉｖ）必要に応じて
、被験体にその後の用量を投与する工程（ここで、上記その後の用量は、（ｉ）における
より初期の用量（複数可）と比べて増加しているか、減少しているか、または維持されて
いる）を含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの有無または量は、薬物の
各用量が被験体に投与された後に決定され、時折、バイオマーカーの有無または量は、薬
物の各用量が投与された後に決定されない（例えば、バイオマーカーは、１、２、３、４
、５、６、７、８、９または１０回目の用量のうちの１回または複数回の用量の後に評価
されるが、各用量が投与された後に毎回評価されるわけではない）。
その後の薬物用量を調整することについての指示は、その後の薬物用量を増加させる必
要性または減少させる必要性を考慮され得る。その後の薬物用量を調整することまたは維
持することについての指示は、臨床医によって考慮され得、臨床医は、ある特定の実施形
態において、その指示に従って行動し得る。いくつかの実施形態において、臨床医は、指
示に従って行動しないことを選択することができる。したがって、臨床医は、提供された
指示に基づいてその後の薬物用量を調整することまたは調整しないことを選択することが
できる。
その後の薬物用量および／またはその後の薬物投与量を調整するまたは維持する指示は
、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で
（例えば、物理的媒体または電子媒体において）提供され得る。例えば、バイオマーカー
の閾値が、表として提供され得、臨床医は、被験体に対して決定されたバイオマーカーの
有無または量をその閾値と比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬
物用量に対する指示を確認し得る。ある特定の実施形態において、指示は、バイオマーカ
ーの有無または量がコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入
れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、
被験体に対して決定されたバイオマーカーの有無または量は、コンピュータに提供され得
（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータ
ネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ
内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持することについての指
示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量を提供し得る。その後の用量は、例
えば、バイオマーカーの有無または量以外のある特定の因子（例えば、被験体の重量、そ
の被験体に対する１つまたはそれを超える代謝産物のレベル（例えば、肝機能に関する代
謝産物のレベル）など）に基づいて決定され得る。
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を
投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示（instructio
n）を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し
、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつか
の実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプ
ットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づ
いて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る
（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば
、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。
被験体は、特定のバイオマーカーの有無または量が決定され得るか否かを決定するため
に、事前にスクリーニングされ得る。事前のスクリーニングの非限定的な例としては、遺
伝子マーカー（例えば、多型、特定のヌクレオチド配列）の有無の同定；特定の代謝産物
の有無または量の同定が挙げられる。事前のスクリーニングの結果は、その後の薬物用量
が調整され得るかまたは維持され得るかを決定するために、バイオマーカーの有無または
量と組み合わせて、臨床医によって使用され得る。
本明細書中の改変されたＴ細胞および核酸の効果を評価するためのバイオマーカーとし
ては、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ
−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、
ＴＧＦβ、Ｃ反応性タンパク質および他が挙げられ得る。
（抗体および小分子）
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおいてコントロールまたは標準物質
として使用するため、または治療薬として使用するために、抗体または小分子が提供され
る。いくつかの実施形態において、抗体または他の小分子は、サイトカインもしくはサイ
トカインレセプター（ＩＬ−６、ＩＬ−６ｓＲを含むがこれらに限定されない）に結合し
、そのサイトカインの作用を変化させるように形成されているか、またはＶＣＡＭ−１に
結合するように形成されていることがある。ある特定の実施形態において、抗体または他
の小分子は、サイトカインまたはレセプターをコードするｍＲＮＡの構造に結合し得る。
本明細書中で使用される小分子という用語は、およそ８００ダルトンまたはそれより小
さいダルトンの有機分子のことを意味する。ある特定の実施形態において、小分子は、細
胞膜を横断して拡散することにより、細胞間の作用部位に到達し得る。いくつかの実施形
態において、小分子は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸または多糖）に高親和性
で結合し、時折、その生体高分子の活性または機能を変化させ得る。様々な実施形態にお
いて、小分子は、天然のもの（例えば、二次代謝産物）または人工のもの（例えば、抗ウ
イルス薬）であり得；それらは、疾患に対して有益な効果を有し得る（例えば、薬物）か
、または有害であり得る（例えば、催奇形物質および発がん性物質）。
非限定的な例によって、小分子としては、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌク
レオチド、アミノ酸、モノサッカリドおよび小さなオリゴマー、例えば、ジヌクレオチド
、ペプチド（例えば、抗酸化物質グルタチオン）、およびジサッカリド（例えば、スクロ
ース）が挙げられ得る。
用語抗体は、本明細書で使用される場合、脊椎動物の血液または他の体液中に見られ、
細菌およびウイルスなどの外来の物体を識別し、中和するために免疫系によって使用され
るガンマグロブリンタンパク質を意味すると理解されるべきである。抗体は、代表的には
、２本の大きな重鎖および２本の小さな軽鎖という基本的構造単位を含む。
抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその親和性に関して選択される抗体
を要する。例えば、特定のタンパク質、多型バリアント、対立遺伝子、オルソログ、およ
び保存的に改変されたバリアント、またはスプライスバリアント、またはこれらの一部に
対して産生されるポリクローナル抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αまたはＮＦ−κ−Ｂ
調節タンパク質と特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質とはそうではないそれらの
ポリクローナル抗体のみを得るために選択され得る。この選択は、他の分子と交差反応す
る抗体を差し引きすることによって達成され得る。
本明細書で示されるとおりの方法は、限定なしに、活性化された細胞、核酸、またはこ
れをコードする発現構築物の有効量の送達を含む。薬学的組成物の「有効量」は、一般に
、検出可能にかつ反復して、述べられる所望の結果を達成するために、例えば、上記疾患
またはその症候を回復するか、減少するか、最小にするか、またはその程度を制限するた
めに、十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定
義が、適用されることもある。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するた
めおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカーをモニターする工程が存在しても
よい。
改変された細胞の有効量は、個々の患者を考慮して、医師によって決定され得る。考慮
されるべき因子としては、例えば、疾患もしくは状態の程度、腫瘍サイズ、感染症の程度
、転移、年齢、および体重が挙げられ得る。投与量および投与回数は、医師、または他の
臨床医によって、疾患もしくは状態の症候について患者をモニターすることによって、お
よび以前の投与量への応答に関しては、例えば、腫瘍サイズ、または腫瘍抗原のレベルも
しくは濃度をモニターすることによって、決定され得る。ある特定の例では、改変された
細胞は、１０４〜１０９個の改変された細胞／ｋｇ 体重、１０５〜１０６個、１０９〜
１０１１個、または１０１０〜１０１１個の改変された細胞／ｋｇ 体重の投与量で、投
与され得る。
下記に示される実施例は、ある特定の実施形態を例証するものであって、本技術を限定
しない。インビトロまたはエキソビボにおいて細胞を形質転換するためまたはトランスフ
ェクトするための方法を論じている本明細書中の実施例は、キメラポリペプチドを発現す
る核酸の使用例を提供するがこれに限定されない。実験動物またはヒト被験体への、トラ
ンスフェクトされたまたは形質導入された細胞の送達およびリガンド誘導物質の送達の例
は、それを必要とする被験体において、キメラポリペプチドを発現する核酸、腫瘍抗原お
よびリガンド誘導物質の直接的な投与の例を提供するがこれに限定されない。
（誘導性キメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドの発現）
実施例１〜７は、キメラ刺激分子の誘導可能な形態の発現に関連し、本明細書で論じら
れるＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子を発現させるために使用され得る方法の例を提
供する。これらの実施例は、本明細書で論じられるキメラ刺激分子およびキメラ抗原レセ
プターを構築、アッセイ、および使用するための参照として使用され得る。実施例８（お
よび以下参照）は、本明細書で論じられる非誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子
およびＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターの発現および適用に関する。
（実施例１：誘導性キメラ刺激分子）
誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ共刺激分子を、Ｔ細胞において発現させた；このＴ
細胞とrimiducid（ＡＰ１９０３）との接触は、キメラ抗原レセプターを共発現したＴ細
胞を含め、共刺激活性の活性化およびＴ細胞の活性化を生じた。
以下の特許、出願、および特許公報は、本明細書中の例において使用され得る材料およ
び方法を含み得る：例えば、米国特許第７，４０４，９５０号（Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．
らに対して２００８年７月２９日発行）；米国特許第８，６９１，２１０号（Ｓｐｅｎｃ
ｅｒらに対して２００４年４月８日に発行）；Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願第１
２／５３２，１９６号（２００９年９月２１日出願）；ＰＣＴ出願 ＰＣＴ／ＵＳ２００
９／０５７７３８（Ｓｐｅｎｃｅｒら、２００８年４月２４日にＷＯ２０１０／０３３９
４９として公開）；Ｓｌａｗｉｎらによる米国特許出願第１３／０８７，３２９号（２０
１１年４月１４日出願）；ＰＣＴ出願 ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２５７２（２０１１
年１０月２０日にＷＯ２０１１／１３０５６６として公開）；Ｓｐｅｎｃｅｒらによる米
国特許出願第１４／２１０，３２４号（２０１４年３月１３日出願）；Ｓｐｅｎｃｅｒら
によるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２６７３４（ＷＯ２０１４／２５１９６
０として２０１５年２月５日に公開）；Ｆｏｓｔｅｒらによる米国特許出願第１４／６２
２，０１８号（２０１５年２月１３日出願）；ＦｏｓｔｅｒらによるＰＣＴ出願番号ＰＣ
Ｔ／ＵＳ２０１５／０１５８２９（ＷＯ２０１５／１２３５２７として２０１５年８月２
０日に公開）は全て、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子の発現のために使用されるアデノウイルス
ベクターの例は、本明細書で提供される。これらベクターは、本出願の非誘導性キメラ刺
激分子を発現するアデノウイルスベクターを得るために、ＦＫＢＰ領域を除去するように
改変され得る。
以下のヌクレオチド配列を、Ａｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬおよびＡｄ５ｆ３５−
ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬベクターを構築するために使用した。そのヌクレオチド配列に
よってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列もまた提供される。



ｐＡｄ１１２７−０２．ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬは、Ａｄ５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−
ＦＬおよび血清型３５偽型Ａｄ５ｆ３５−ｉＭＣ−Ｐ２Ａ−Ｐ−ＦＬの両方を作製するた
めに使用されるシャトルベクターである。それは、ＣＭＶｐおよびウシ成長ホルモンポリ
Ａ部位によって駆動されるその同じ転写産物上に誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０および全長
ＰＳＭＡを含む。
（注釈付きベクター配列）








（実施例２：治療のためのヒト細胞における誘導性ＣＳＭの使用）
発現構築物、およびヒト細胞においてこの発現構築物を使用する方法が、この実施例で
示される。この実施例は、誘導性キメラ刺激分子を指すが、任意の適切な改変を含め、非
誘導性キメラ刺激分子をコードするベクター、およびＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レ
セプターも使用され得る。
これらの方法は、他の細胞、例えば、ＮＫおよびＮＫＴ細胞など、ならびに腫瘍浸潤リ
ンパ球に対して適合され得、本明細書中で論じられるような他の共刺激ポリペプチド細胞
質領域を含むキメラ刺激ポリペプチドに対しても適合され得る。
材料および方法
遺伝子改変されたＴ細胞の大規模産生
Ｔ細胞は、標準的な方法を用いて健常志願者から生成される。簡潔には、健常ドナーま
たはがん患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、可溶性αＣＤ３およびαＣＤ２８（Ｍ
ｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、増殖および形質導入
のために活性化する。ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）が
補充されたＣｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、０．２
μｇ／ｍｌ αＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ αＣＤ２８可溶性抗体で刺激する。次い
で、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４日間培養する。４日目に、ＩＬ−２を含む１ｍ
ｌの新鮮培地を加える。７日目に、形質導入に向けて、細胞を収集し、Ｃｅｌｌｇｅｎｉ
ｘ ＤＣ培地に再懸濁する。
プラスミドおよびレトロウイルス
ＳＦＧプラスミドは、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒトＣＤ１９に連結された
誘導性ＣＳＭからなる。その誘導性ＣＳＭは、Ｆ３６Ｖ変異を有し、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（配列番号２８５）を介してヒトＣＳＭに接続された、ヒ
トＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）か
らなる。そのＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に
対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を高める。その２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇ
ｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロ
リン残基との間での＞９５％の切断を媒介して、誘導性ＣＳＭのＣ末端に１９個の追加の
アミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、
細胞質内ドメインを２４２アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的
な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲ
ＲＦ）（配列番号２８６）で切断される、完全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１
７７０）からなる。
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）シュードタイプ化レトロウイルスを産生する
安定したＰＧ１３ベースのクローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ ｐｒ
ｏｄｕｃｔ ＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧプラスミド
で一過性にトランスフェクトすることによって、作製する。これは、Ｅｃｏシュードタイ
プ化レトロウイルスを産生する。そのＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅ
ｃｏシュードタイプ化レトロウイルスで３回形質導入することにより、細胞１つあたり複
数のＳＦＧプラスミドプロウイルス組み込み体を含む産生株を作製する。単一細胞クロー
ニングを行い、最も高い力価をもたらしたＰＧ１３クローンを、増殖させ、ベクター作製
のために使用する。
レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞の活性化および増殖のための培養培地は、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｅｌｌ
ｇｅｎｉｘ）が補充された無血清Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）
である。レトロウイルスベクターで形質導入する前の７日間にわたって、Ｔ細胞を可溶性
抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって活性化する。必
要であれば、ΔＣＤ１９の免疫磁気選択を形質導入後の４日目に行い；陽性画分をさらに
２日間にわたって増殖させ、凍結保存する。
遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞のスケールアップ産生
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップは、非組織培養処理Ｔ７５フラス
コ（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を使用する。このフラスコは、１０ｍｌ
の抗ＣＤ３ ０．５ｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ２８ ０．２μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィ
ブロネクチン ７ｇ／ｍｌで、４℃で一晩コーティングされている。細胞接着の増大のた
めにコロナ放電処理したフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ， Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ， ＭＤ）もまた、使用する。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８によってコー
ティングされたフラスコに、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中、１×１０６
細胞／ｍｌで播種する。レトロウイルス形質導入に向けて、レトロネクチンでコーティン
グされたフラスコまたはバッグを、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清で２〜３時間、一
度負荷する。活性化Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された、３：１の比のレ
トロウイルスベクター含有新鮮培地およびＴ細胞培養培地中に１×１０６細胞／ｍｌで播
種する。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたＴ７５またはＴ１７５フラスコ内
、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培養培地中で、約５×１０５細胞／ｍｌ〜８×
１０５細胞／ｍｌの播種密度で増殖させる。
ＣＤ１９免疫磁気選択
ＣＤ１９に対する免疫磁気選択は、例えば、形質導入の４日後に行われ得る。細胞を、
モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化された常磁性マイクロビーズ（Ｍｉ
ｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）で標識し、小規模実験ではＭＳま
たはＬＳカラムにおいて、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動選択
デバイスにおいて、選択する。ＣＤ１９によって選択された細胞を、さらに４日間増殖さ
せ、形質導入後の８日目に凍結保存する。これらの細胞は、「遺伝子改変細胞」と称され
る。
免疫表現型分析および五量体解析
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフト
ウェア；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行う：ＣＤ３、
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５Ｒ
Ｏ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（クローン４Ｇ７；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色をもたらすと見出されており、その後のすべての解析に
おいて使用された。形質導入されていないコントロールを、ＣＤ１９に対するネガティブ
ゲートを設定するために使用する。ＣＡＲ発現を、抗Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ
ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，
ＰＡ）を使用して評価する。
統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を決
定する。すべてのデータを平均±１標準偏差として表す。
実施例３：白血病患者の処置
本願の方法を使用して、進行した治療抵抗性白血病を有する白血病患者を処置する本実
施例は、他の状態または疾患、例えば、他の過剰増殖性疾患または固形腫瘍などにも適用
され得る。これらの方法は、標的抗原に応じて一本鎖可変フラグメントが変化し得るとい
う理解の下で、本質的には論じられるように使用され得る。
Ｔ細胞を、本出願のキメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸で形質導
入する。このＴ細胞をまた、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む
核酸で形質導入する。他の例では、このＴ細胞を形質導入するために使用される核酸は、
例えば、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み得る。このキメラ抗
原レセプターは、ＣＤ１９を認識する一本鎖可変フラグメントを含む。
患者は、リンパ球枯渇の前処置を受けた後、形質導入されたＣＤ１９標的化Ｔ細胞を投
与される。それらのＴ細胞は、自己、同種異系または非同種異系であり得る。その用量は
、例えば、毎日、１週間に２回、または毎週、提供され得る。制御されない速すぎる速度
のＴ細胞の増殖、活性化および腫瘍細胞殺滅は、不必要に患者を害するより重度のサイト
カインストームをもたらし得るという懸念を理由に、投薬スケジュールは、毒性を制限し
、患者に対して多大な害を引き起こさない割合で、例えば、患者を病院の集中治療室の外
で維持して、完全な回復を達成するようにデザインされる。
（実施例４：ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるｉＭＣ活性の測定）
この実施例は、誘導性キメラ刺激分子の使用を論じるが、本明細書で論じられる方法は
また、非誘導性キメラ刺激分子に適用され得る。
目的：２つのＦＫＢＰｖ３６分子に連結されたシグナル伝達分子をコードするレトロウ
イルスベクターで初代Ｔ細胞を形質導入することにより、そのＴ細胞のＡＰ１９０３活性
化を可能にすること。この実験は、切断型ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドを含む
誘導性共刺激分子が、Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞上に高度に発現される前立腺幹細胞抗原（
ＰＳＣＡ）を認識するＣＡＲで形質導入されたＴ細胞によるＧＦＰ改変Ｃａｐａｎ−１（
膵臓腺癌）細胞の殺滅を改善するかを調べるためにデザインされる。
方法：
誘導性Ｔ細胞分子のデザインおよびクローニング：
１．Ｔ細胞の形質導入は、ＲＶ−１７２（ＳＦＧ−Ｍｙｒ．ＭｙＤ８８／ＣＤ４０．Ｆ
ｖ．Ｆｖ’．２Ａ．ΔＣＤ１９）およびＲＶ−８９（ＳＦＧ．ＰＳＣＡｓｃＦｖ．ＣＨ２
ＣＨ３．ＣＤ２８．ζ）を用いて行う。そのｓｃＦｖは、ヒト化モノクローナル抗体１Ｇ
８（ＵＳ２０１２０７７９６２Ａ１におけるヒト化抗ＰＳＣＡから得られる）由来のｓｃ
Ｆｖを使用してＰＳＣＡを標的化する。これは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ＣＨ３領域に連結
され、それは続いて、その分子の膜貫通部分と細胞質部分の両方を含むＣＤ２８に連結さ
れる。ＣＤ２８は、ＣＤ３ζの細胞質部分に連結される。
レトロウイルスの産生：
２．本質的には、前の実施例と同じである。
ＧＦＰによってマークされたＣａｐａｎ−１（膵臓腺癌）細胞株の作製：
３．Ｃａｐａｎ−１をＡＴＣＣから購入する。続いて、ＥＧＦＰ／ホタルルルシフェラ
ーゼ融合タンパク質に対する遺伝子、ならびに安定にトランスフェクトされた細胞が、Ｇ
４１８抗生物質とともに培養することによって長い時間にわたって選択されるのを可能に
するネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＰ０１６８−ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＧＦＰｌｕｃ
によるトランスフェクションによって、その細胞株を遺伝子改変する。培養後、高いＧＦ
Ｐ発現を有するクローンを選択し、＞９５％ＧＦＰを有する細胞株が得られるまで継代培
養する。
ｉＭＣ対応Ｔ細胞とＣａｐａｎ−１腫瘍細胞との共培養：
４．形質導入されていないＴ細胞またはＲＶ−８９（ＰＳＣＡ ＣＡＲ）およびＲＶ−
１７２（ｉＭＣベクター）で共形質導入されたＴ細胞を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありま
たはなしで５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２が補充された培地中においてＴ細胞と腫瘍細胞とが５
：１の比で培養する。次いで、共培養物を３７℃および５％ＣＯ２において７２時間イン
キュベートする。続いて、蛍光顕微鏡法によって、および０．２５％トリプシン／ＥＤＴ
Ａを用いて培養物を回収し、培養物中のＧＦＰ＋ＣＤ３−腫瘍細胞の頻度をフローサイト
メトリーによって計測することによって、ＧＦＰ＋腫瘍細胞の存在について培養物を解析
する。
結果：
１．培養物を蛍光顕微鏡法によって調べることにより、誘導性共刺激分子およびキメラ
抗原レセプターを形質導入されたＴ細胞を含むウェルおよびＡＰ１９０３を投与されたウ
ェルにおける腫瘍細胞殺滅の改善を評価する。
２．フローサイトメトリーを使用して、トリプシン処理後の培養物中のＧＦＰ＋細胞を
解析することにより、ＡＰ１９０３がこの短い培養期間（７２時間）において腫瘍細胞数
の減少に寄与するかを決定する。培養の時間は、およそ５日間まで延長され得る。フロー
サイトメトリーのプロットは、５：１の比において、両方のウイルスで形質導入され、Ａ
Ｐ１９０３を投与されたウェル内のＧＦＰ＋細胞の減少を示し得る。
３．残存している生存可能なＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ細胞を、ＡＰ１９０３なしのＮＴ
Ｔ細胞の条件に正規化することにより、腫瘍細胞殺滅に対するｉＭＣ活性化の効果が示
される。
実施例５：特定の核酸配列およびアミノ酸配列の例
以下の配列は、本明細書で提供されるキメラ抗原レセプターまたはキメラ刺激分子をコ
ードする発現ベクターのデザインにおいて使用され得る。

以下は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）配列のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
（順番に、ｓｃＦｖフラグメントなし）の例である。


（さらなるキメラ刺激分子配列）

（さらなる配列）





（実施例６：材料および方法）
本明細書中の方法は、誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０構築物の使用を論じるが、非誘導性
ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子に関しても適切な改変を伴って使用され得る。
細胞株、培地および試薬。２９３Ｔ（ＨＥＫ ２９３Ｔ／１７）およびＣａｐａｎ−１
、Ｒａｊｉ、ならびにＤａｕｄｉ細胞株を、アメリカンタイプカルチャーコレクションか
ら得た。細胞株を、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および２ｍＭ グルタマックス（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓ
ｌａｎｄ， ＮＹ）中で、３７℃および５％ ＣＯ２で維持した。末梢血単核球（ＰＢＭ
Ｃ）から生成したＴ細胞を、別段注記されなければ、４５％ ＲＰＭＩ １６４０、４５
％ クリック培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ
グルタマックス（Ｔ細胞培地； ＴＣＭ）および１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｍｉｌｔ
ｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充）中で培養した。臨床グレードのＡＰ１９０３を、イン
ビトロアッセイのために１００ｍＭ 作業溶液へとエタノールで希釈し、または動物研究
のために０．９％ 食塩水で希釈した。
レトロウイルス構築物およびプラスミド構築物。ミリストイル化標的化配列（Ｍ）（２
０）、ＴＬＲアダプター分子ＭｙＤ８８、ＣＤ４０細胞質領域、および２個のタンデムリ
ガンド結合ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン（Ｆｖ’Ｆｖ）を含む誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４
０（ｉＭＣ）を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，
Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）を使用してＳＦＧレトロウイルス骨格の中の２Ａ−ΔＣＤ１
９とインフレームでクローニングして、ＳＦＧ−Ｍ．ＭｙＤ８８／ＣＤ４０．Ｆｖ’Ｆｖ
−２Ａ−ΔＣＤ１９を生成した。同様に、ミリストイル化配列およびタンデムＦＫＢＰ１
２ｖ３６結合ドメインのみを含むコントロールベクター（ＳＦＧ−Ｍ．Ｆｖ’Ｆｖ−２Ａ
−ΔＣＤ１９）を生成した。さらなるレトロウイルスベクターを、合成ＤＮＡアプローチ
（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）を使用して構築して、ＭｙＤ８８もしくはＣＤ４０のみの構築物（それぞれ、Ｓ
ＦＧ−Ｍ．ＭｙＤ８８．Ｆｖ’．Ｆｖ−２Ａ−ΔＣＤ１９またはＳＦＧ−Ｍ．ＣＤ４０．
Ｆｖ’．Ｆｖ−２Ａ−ΔＣＤ１９と称される）を生成した。ＣＤ１９またはＰＳＣＡを認
識する２種の第１世代ＣＡＲを、合成した。このＣＤ１９ ＣＡＲを、抗ＣＤ１９単鎖（
single chin）フラグメント可変（ｓｃＦｖ）、ＦＭＣ６３を使用してデザインする一方
で、ＰＳＣＡ認識を、マウスｓｃＦｖ ｂｍ２Ｂ３を使用して達成した。両方のＣＡＲは
、Ａｎｕｒａｔｈａｐａｎら， ２０１３ （１３）において論じられるように、ＩｇＧ
１ ＣＨ２ＣＨ３スペーサー領域、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζ細胞質ドメイ
ン（ＰＳＣＡ．ζ）を含んだ。ＣＤ２８膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（ＰＳＣＡ
．２８．ζ）を含む第２世代ＣＡＲを、ＰＣＲ増幅によって構築した。ＭＣを含むＰＳＣ
Ａ ＣＡＲを生成するために、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０を合成し、ＣＤ３ζに対して５’側
に挿入した（図３ａ）。共培養アッセイのために、Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞を、ＧＦＰを
発現するプラスミド（ｐＩＲＩＩ−ＧＦＰ−２Ａ−ピューロマイシン）でｐｉｇｇｙＢａ
ｃトランスポザーゼによって改変し、１μｇ／ｍｌ ピューロマイシンによって安定して
選択した。
レトロウイルス上清。レトロウイルス上清を、以前に論じられるとおり（１４）製造業
者によって推奨されるようにＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）トランスフェクション試薬を使用して、ＳＦＧベクタープ
ラスミド、ＭｏＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌの配列を含むＰｅｇ−Ｐａｍ−ｅプラスミド、お
よびＲＤ１１４エンベロープをコードするＲＤ１１４プラスミドでの、２９３Ｔ細胞の一
過性の共トランスフェクションによって生成した。レトロウイルスを含む上清を、トラン
スフェクションの４８時間後および７２時間後に集めた。
活性化Ｔ細胞の生成。Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ（Ｈｏｕｓｔｏｎ
， ＴＸ）から得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用して、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活
性化Ｔ細胞を、本質的に以前に提供されたように（２２）、生成した。簡潔には、５×１
０６ ＰＢＭＣをＴＣＭ中に再懸濁し、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（Ｍｉｌｔｅ
ｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の各０．５μｇ／ｍｌでコーティングした非組織培養処理２４ウ
ェルプレート上で、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２の存在下で刺激した。３日目に、活性化Ｔ
細胞を採取し、レトロウイルスベクターで形質導入したかまたは以下で論じられるとおり
ＩＬ−２を補充した培地中で増殖させた。
Ｔ細胞の形質導入。非組織培養処理２４ウェルプレートを、７μｇ／ｍｌ レトロネク
チン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ， Ｏｔｓｕ， Ｓｈｉｇａ， Ｊａｐａｎ）で一晩、４℃
においてコーティングした。そのウェルを、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、次いで、レトロ
ウイルス上清でコーティングした。その後、活性化Ｔ細胞を、１００ Ｕ／ｍｌ ＩＬ−
２を補充したウイルス上清中３×１０５ 細胞／ウェルを蒔いた。培養して３日後、細胞
を採取し、ＴＣＭ＋１００ Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を含む組織培養処理プレート中で増殖さ
せた。２遺伝子もしくは３遺伝子の形質導入に関しては、そのプロトコルは、上記細胞を
等量の各レトロウイルス上清でコーティングし、次いで活性化Ｔ細胞を、１００ Ｕ／ｍ
ｌ ＩＬ−２を補充した等量のウイルス上清を含む各ウェルへと蒔いたことを除いて、上
記と同一である。
免疫表現型決定。遺伝子改変Ｔ細胞を、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５およびＣＤ１９−
ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用することによって、形質導入の１０〜１４日後に、ｉ
ＭＣ導入遺伝子発現に関して分析した。ＣＡＲ形質導入細胞を検出するために、Ｔ細胞を
また、レセプターのＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３ 成分を認識する、ＡＰＣに結合体化したＦ
ｃ特異的モノクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）で染色した。全てのフローサイ
トメトリーを、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，
Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ， ＮＪ）を使用して行い、そのデータを、Ｆｌｏｗ
Ｊｏ（Ｔｒｅｅ ｓｔａｒ， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ）を使用して分析した。
サイトカインおよびケモカイン生成。ｉＭＣ、コントロールベクターで改変したＴ細胞
による、またはＣＡＲ改変Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−６の生成を、
製造業者のプロトコル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に従
って、ＥＬＩＳＡによって分析した。このアッセイにおいて、非形質導入Ｔ細胞およびｉ
ＭＣ改変Ｔ細胞またはコントロールベクター改変Ｔ細胞を、１０ｎＭ ＡＰ１９０３また
はビヒクル（ＥｔＯＨ）で活性化し、上清を４８時間で集めた。ＣＡＲ改変Ｔ細胞の分析
のために、Ｔ細胞を、１：１ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞比でＣａｐａｎ−１腫瘍細胞と共培
養し、上清を、２４時間および４８時間で採取した。
細胞傷害アッセイ。 Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞の特異的細胞傷
害性を、製造業者の推奨（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｍｏｕｎｔ
ａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）に従って、１０：１〜０．５：１の範囲に及ぶエフェクター
対 標的（Ｅ：Ｔ）比を使用し、標的細胞としてＣａｐａｎ−１を使用して、６時間お
よび２４時間の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイにおいて測定した。
共培養実験。ＰＳＣＡ．ζ ＣＡＲ活性化後の細胞傷害性、活性化、増殖およびサイト
カイン生成を試験するために、共培養アッセイを、Ｃａｐａｎ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞を用
いて、外因性ＩＬ−２の非存在下で、ＴＣＭ中、１０：１、５：１、１：１、１：５およ
び１：１０のＥ：Ｔ比において行った。７日後に、全ての残っている細胞を、トリプシン
処理によって集め、カウントし、ＣＤ３およびＦｃ特異的抗体で染色し、フローサイトメ
トリーによって分析した。さらに、類似の共培養実験を、ＣＤ１９ ＣＡＲを使用して、
ＭＣ共刺激ありおよびなしで行った。ＣＡＲ改変Ｔ細胞を、７日間、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ
細胞株もしくはＤａｕｄｉ細胞株とともに培養し、その後、ＣＤ３＋細胞およびＣＤ１９
＋細胞に関してフローサイトメトリーによって分析した。
統計学。データを、平均±ＳＥＭとして表す。データを、全てのアッセイにおいて２つ
の処置群を比較する場合に、両側もしくは片側のＰ値を計算して差異における統計的有意
性を決定するために、対応のないスチューデントのｔ検定を使用して分析した。データを
、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を
使用して分析した。
（実施例７：誘導性ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、またはＭｙＤ８８／ＣＤ４０での初代Ｔ細
胞の活性化）
本明細書中の方法は、誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０構築物の使用、ならびにＭｙＤ８８
およびＣＤ４０ポリペプチドの両方を１つのキメラ刺激分子へと組み合わせる場合に得ら
れる相乗効果を論じる。これら方法は、適切な改変を伴って、非誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ
４０キメラ刺激分子に関しても使用され得る。
並行した研究において、新規共刺激分子、ｉＭＣは、Ｔ細胞へのコントロールされた共
刺激を提供し得ることが観察された。ＭｙＤ８８、ＣＤ４０または両方の分子が、潜在的
ＣＡＲ構築物の中に内部ドメインとして含まれるべきかどうかを試験するために、４種の
異なるベクターを、ＡＰ１９０３結合ドメインのみ（Ｆｖ’Ｆｖ）を含んで、またはＭｙ
Ｄ８８と遺伝子融合させて（ｉＭｙＤ８８）、ＣＤ４０と遺伝子融合させて（ｉＣＤ４０
）、またはＭｙＤ８８およびＣＤ４０の両方と（ｉＭＣ）遺伝子融合させてデザインした
（図３ａ）。ＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｔ細胞を形質導入し、上記ベクターの各々の形質導
入効率を、ＣＤ３ Ｔ細胞の表面上のＣＤ１９（ＣＤ３＋ＣＤ１９＋）のフローサイトメ
トリー検出によって測定した。これは、上記レトロウイルスの各々が、非形質導入Ｔ細胞
と比べて、初代Ｔ細胞において十分に発現される（５７％〜９５％）ことを示した（図３
ｂ）。次いで、ｉＭｙＤ８８、ｉＣＤ４０またはｉＭＣが、ＡＰ１９０３への曝露後にＴ
細胞を活性化する能力を、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−６生成を測定することによるＥＬＩＳ
Ａによってアッセイした。ｉＭＣ形質導入Ｔ細胞のみが、ＡＰ１９０３活性化後にＩＦＮ
−γおよびＩＬ−６の両方の有意な量を生成することが観察されたのに対して、ＮＴ、ｉ
ＭｙＤ８８、ｉＣＤ４０のいずれも、サイトカイン生成を示さなかった（図３ｃおよびｄ
）。これらデータは、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０が、ヒトＴ細胞において活性化シグナル
伝達分子として相乗作用すること、ならびにＣＡＲ分子が複合ＭＣシグナル伝達ドメイン
を含むことから利益を得るはずであることを示唆する。
（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターおよびキメラ刺激分子の発現）
以下の実施例は、本願において提供されるように、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レ
セプターおよびキメラ刺激分子に関する組成物および方法を論じる。カスパーゼ−９ベー
スの安全スイッチ、およびＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターまたはキメラ刺激
分子を発現する細胞におけるその使用に関する組成物および方法もまた、含まれる。
（実施例８：ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターのデザインおよび活性）
（ＭＣ−ＣＡＲ構築物のデザイン）
本明細書で論じられる誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０実験からの活性化データに基づいて
、従来の内部ドメイン（例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢ）の代わりに、ＣＡＲ分子に
おけるＭＣシグナル伝達の潜在性を試験した。ＭＣ（ＡＰ１９０３結合ＦＫＢＰｖ３６領
域なし）を、ＰＳＣＡ．ζの中にサブクローニングして、ＣＤ２８内部ドメインの位置を
模倣した（図４ａ）。レトロウイルスを、３つの構築物の各々に関して生成し、ヒトＴ細
胞を形質導入し、その後、形質導入効率を測定して、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζが発現され得る
ことを実証した（図４ｂおよび４ｃ）。これらＣＡＲ構築物の各々を有するＴ細胞が、Ｐ
ＳＣＡ＋腫瘍細胞を認識するそれらの能力を保持することを確認するために、６時間の細
胞傷害アッセイを行った。これは、Ｃａｐａｎ−１標的細胞の溶解を示した（図４ｄ）。
従って、ＣＡＲ分子の細胞質領域へのＭＣの付加は、ＣＡＲ発現または標的細胞上の抗原
の認識に影響を及ぼさない。
ＭＣ共刺激は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞におけるＴ細胞殺滅、増殖および生存を増強する。短
期間細胞傷害アッセイにおいて実証されるように、上記３種のＣＡＲデザインの各々は、
Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞を認識および溶解する能力を示した。エフェクターＴ細胞におけ
る細胞溶解エフェクター機能は、腫瘍認識後に予め形成されたグランザイムおよびパーフ
ォリンの放出によって媒介され、ＣＤ３ζを介する活性化は、共刺激の必要性なしにこの
プロセスを誘導するために十分である。第１世代ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３ζ細胞
質領域のみで構築されたＣＡＲ）は、腫瘍細胞を溶解し得る；しかし、生存および増殖は
、共刺激の欠如に起因して損なわれる。よって、ＣＤ２８もしくは４−１ＢＢ共刺激ドメ
イン構築物の付加は、ＣＡＲ Ｔ細胞の生存および増殖の能力を有意に改善した。
ＭＣが生存および増殖に影響を及ぼす共刺激シグナルを同様に提供し得るかどうかを試
験するために、共培養アッセイを、高い腫瘍：Ｔ細胞比（１：１、１：５、１：１０ Ｔ
細胞 対 腫瘍細胞）の下で、ＰＳＣＡ＋ Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞で行った。Ｔ細胞お
よび腫瘍細胞の数が等しかった（１：１）場合、非形質導入コントロールＴ細胞と比べて
全３種の構築物からＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ細胞の効率的な殺滅が存在した（図４ａおよ
びｂ）。しかし、ＣＡＲ Ｔ細胞を、多数の腫瘍細胞（１：１０）でチャレンジした場合
、ＣＡＲ分子がＭＣもしくはＣＤ２８のいずれかを含んだ場合のみ、Ｃａｐａｎ−１−Ｇ
ＦＰ腫瘍細胞の有意な減少が存在した（図４ｃ）。
これら２種のＣＡＲによる共刺激の機構をさらに試験するために、細胞の生存率および
増殖をアッセイした。ＭＣもしくはＣＤ２８を含むＰＳＣＡ ＣＡＲは、非形質導入Ｔ細
胞およびＣＤ３ζのみＣＡＲと比べて改善された生存率を示し、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζおよ
びＰＳＣＡ．２８．ζによるＴ細胞増殖は、有意に増強された（図４ａおよびｂ）。他の
群は、共刺激シグナル伝達領域を含むＣＡＲがＴ細胞の重要な生存および成長分子である
ＩＬ−２（４）を生成することを示したので、ＥＬＩＳＡを、Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞で
チャレンジしたＣＡＲ Ｔ細胞に由来する上清に対して行った。ＰＳＣＡ．２８．ζは、
高レベルのＩＬ−２を生成したが、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζシグナル伝達はまた、有意なレベ
ルのＩＬ−２（これは、これらアッセイにおいて観察されたＴ細胞生存および増殖に寄与
するようである）を生成した（図６ｃ）。さらに、ＣＡＲ改変Ｔ細胞によるＩＬ−６生成
を試験した。なぜならＩＬ−６は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の効力および有効性において重要な
サイトカインとして関与している（１５）からである。ＩＬ−２とは対照的に、ＰＳＣＡ
．ＭＣ．ζは、初代Ｔ細胞におけるｉＭＣ活性化がＩＬ−６を誘導するという観察と一致
して、ＰＳＣＡ．２８．ζと比べてより高レベルのＩＬ−６を生成した（図６ｄ）。まと
めると、これらデータは、ＭＣを介する共刺激が、ＣＤ２８のものに類似の効果を生じ、
それによって、腫瘍細胞認識後に、ＣＡＲ改変Ｔ細胞がＩＬ−２およびＩＬ−６を生成す
る（これは、Ｔ細胞生存を増強する）ことを示唆する。
ＣＡＲ改変Ｔ細胞を使用する免疫療法は、種々の悪性腫瘍の処置に関して大いに有望で
ある。ＣＡＲは、最初に単一のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を用いてデザ
インされた（１６〜１９）一方で、ＣＡＲ免疫療法の実現可能性を評価する臨床試験は、
限られた臨床上の利益を示した（１，２，２０，２１）。これは、腫瘍認識後にＴ細胞の
不完全な活性化（これは、インビボで制限された持続性および増殖をもたらす）に主に起
因した（２２）。この欠陥に対処するために、ＣＡＲを、別の刺激ドメイン（しばしば、
ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０を含むＴ細胞共刺激分子の
細胞質部分に由来した）（４，２３〜３０）を含むように操作した。これは、ＣＡＲ Ｔ
細胞が、標的抗原の結合の際に適切な共刺激を受容することを可能にする。実際に、難治
性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置ための、ＣＤ２８または４−１ＢＢシグナル
伝達ドメインを有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲで行った臨床試験は、養子移入の後に、印象的
なＴ細胞持続性、増殖および一連の腫瘍殺滅を実証した（６〜８）。
ＣＤ２８共刺激は、ＣＤ１９＋リンパ腫の処置に関して明確な臨床上の利点を提供する
。Ｓａｖｏｌｄｏおよび共同研究者らは、第１世代ＣＡＲ（ＣＤ１９．ζ）および第２世
代ＣＡＲ（ＣＤ１９．２８．ζ）を比較するＣＡＲ−Ｔ細胞臨床試験を行ったところ、養
子移入後にＣＤ２８がＴ細胞持続性および増殖を増強することを見出した（３１）。第２
世代ＣＡＲの主な機能のうちの１つは、ＣＤ３ζによるＮＦＡＴ転写因子の活性化（シグ
ナル１）、およびＣＤ２８または４−１ＢＢによるＮＦ−κＢの活性化（シグナル２）を
介してＴ細胞の生存および成長を支持するＩＬ−２を生成する能力である（３２）。これ
は、ＮＦ−κＢを同様に活性化した他の分子が、ＣＡＲ分子内のＣＤ３ζ鎖と対になり得
ることを示唆した。本発明者らのアプローチは、樹状細胞（ＤＣ）ワクチンのアジュバン
トとして本来は開発されたＴ細胞共刺激分子を使用した（１２，３３）。ＤＣの完全な活
性化またはライセンス供与のために、ＴＬＲシグナル伝達は、ＴＮＦファミリーメンバー
、ＣＤ４０（これは、抗原でプライミングされたＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌと相互
作用する）のアップレギュレーションに通常は関与する。ｉＭＣは、ＤＣにおいてＮＦ−
κＢの強力なアクチベーターであったので、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０を組み込んだＣＡ
ＲでのＴ細胞の形質導入は、Ｔ細胞への必要とされた共刺激（シグナル２）を提供し得、
それらの生存および増殖を増強し得る。
一連の実験を行って、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０または両方の成分が、ｉＭＣ分子を使用す
る最適なＴ細胞刺激に必要とされるかどうかを試験した。顕著なことには、ＭｙＤ８８も
ＣＤ４０も、サイトカイン生成（ＩＬ−２およびＩＬ−６）によって測定される場合には
Ｔ細胞活性化を十分に誘導できないが、単一の融合タンパク質として組み合わされた場合
には、強力なＴ細胞活性化を誘導し得ることが見出された（図３）。ＭＣを組み込むＰＳ
ＣＡ ＣＡＲを構築し、その後、第１世代（ＰＳＣＡ．ζ）ＣＡＲおよび第２世代（ＰＳ
ＣＡ．２８．ζ）ＣＡＲに対してその機能を比較した。ここでＭＣは、ＣＡＲ Ｔ細胞の
生存および増殖を、ＣＤ２８内部ドメインと匹敵するレベルへと増強することが見出され
た。このことは、共刺激が十分であったことを示唆した（図４）。ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζ
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＰＳＣＡ．２８．ζより低レベルのＩＬ−２を生成した一方で
、分泌レベルは、非形質導入Ｔ細胞およびＰＳＣＡ．ζ ＣＡＲで形質導入したＴ細胞よ
り有意に高かった（図６）。他方で、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、Ｐ
ＳＣＡ．２８．ζ形質導入Ｔ細胞より有意に高いレベルのＩＬ−６（Ｔ細胞活性化と関連
する重要なサイトカイン）を分泌した。このことは、ＭＣが、インビボで改善された腫瘍
細胞殺滅へと翻訳され得るＣＡＲ機能に特有の特性を付与することを示した。関連するシ
グナル伝達経路の分子分析が行われることはなお必要である一方で、これら実験は、ＭＣ
が、細胞外ＣＡＲドメインによる抗原認識の後に、ＮＦ−κＢを活性化し得る（シグナル
２）ことを示す。
図３。誘導性共刺激分子のデザインおよびＴ細胞活性化に対する効果。Ａ）ＦＫＢＰｖ
３６ ＡＰ１９０３結合ドメイン（Ｆｖ’．Ｆｖ）のみを、またはＭｙＤ８８とともに、
ＣＤ４０とともに、もしくはＭｙＤ８８／ＣＤ４０融合タンパク質とともに組み込む４種
のベクターを、デザインした。Ｂ）ＣＤ３＋ＣＤ１９＋フローサイトメトリー分析を使用
する初代活性化Ｔ細胞の形質導入効率。Ｃ）１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありおよびなしでの
活性化後の改変Ｔ細胞のＩＦＮ−γ生成の分析。Ｄ）１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありおよび
なしでの活性化後の改変Ｔ細胞のＩＬ−６生成の分析。＊は、ｐ値＜０．０５を示す。
図４。ＭＣ−ＣＡＲのデザインおよび機能検証。Ａ）ＣＤ３ζのみ、またはＣＤ２８と
ともにもしくはＭＣ内部ドメインとともに組み込む３種のＰＳＣＡ ＣＡＲ構築物をデザ
インした。Ｂ）形質導入効率（パーセンテージ）を、抗ＣＡＲ−ＡＰＣ（ＩｇＧ１ ＣＨ
２ＣＨ３ドメインを認識する）によって測定した。Ｃ）ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζ ＣＡＲでの
Ｔ細胞の高い形質導入効率を実証するフローサイトメトリー分析。Ｄ）１：１ Ｔ細胞
対 腫瘍細胞の比での６時間のＬＤＨ放出アッセイにおける、ＣＡＲ改変Ｔ細胞によるＰ
ＳＣＡ＋ Ｃａｐａｎ−１腫瘍細胞の特異的溶解の分析。＊は、ｐ値＜０．０５を示す。
図４。ＭＣ−ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、長期間の共培養アッセイにおいてＣａｐａｎ−１腫
瘍細胞を殺滅する。Ａ）１：１比で培養して７日後のＣａｐａｎ−１−ＧＦＰ腫瘍細胞と
ともに培養した、ＣＡＲ改変Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析
。１：１（Ｂ）および１：１０（Ｃ）のＴ細胞 対 腫瘍細胞比での共培養アッセイにお
けるフローサイトメトリーによる生存しているＧＦＰ＋細胞の定量。＊は、ｐ値＜０．０
５を示す。
図６。ＭＣおよびＣＤ２８共刺激は、Ｔ細胞生存、増殖およびサイトカイン生成を増強
する。１：１０ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞の共培養アッセイから単離したＴ細胞を、細胞生
存率（Ａ）および細胞数（Ｂ）に関してアッセイして、腫瘍細胞曝露に応じた生存および
増殖を評価した。共培養アッセイからの上清を、その後、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２（
Ｃ）およびＩＬ−６（Ｄ）の生成に関して測定した。＊は、ｐ値＜０．０５を示す。
生存および成長の利点とは別に、ＭＣ誘導共刺激はまた、ＣＡＲ改変Ｔ細胞にさらなる
機能を提供し得る。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖおよび共同研究者らは近年、ＭｙＤ８８シグナル
伝達が、Ｔｈ１およびＴｈ１７の両方の応答にとって必須であり、それがＩＬ−１を介し
て作用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）駆動阻害に対して不応性にする
ことを実証した（３４）。ｉＭＣでの実験は、ＩＬ−１αおよびβが、ＡＰ１９０３活性
化後に分泌されることを示す（データは示さず）。さらに、Ｍａｒｔｉｎらは、Ｒａｓ、
ＰＩ３ＫおよびプロテインキナーゼＣを介するＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ４０シグナ
ル伝達が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞を溶解する細胞傷害性メディエーターであ
るグランザイムおよびパーフォリンのＮＦ−κＢ依存性誘導を生じることを実証した（３
５）。従って、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０共活性化は、ＣＡＲ−Ｔ細胞をＴｒｅｇ細胞の
免疫抑制効果（固形腫瘍および他のタイプのがんの処置において決定的に重要であり得る
機能）に抵抗性にし得る。
まとめると、ＭＣは、ＣＡＲ分子へと組み込まれ得、レトロウイルスで形質導入された
初代Ｔ細胞は、明確な毒性またはＣＡＲ安定性の問題なしに、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζを発現
し得る。さらに、ＭＣは、類似の共刺激をＣＤ２８の共刺激に提供するようである。ここ
で形質導入されたＴ細胞は、第１世代ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞と比べて改善された
生存率、増殖および腫瘍殺滅を示す。ＭＣがＣＡＲにさらなる利益（例えば、Ｔｒｅｇ細
胞の阻害効果に対する抵抗性）を追加するかどうかを決定するためのさらなる実験が、考
えられ得る。
図１０は、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターのプラスミドマップの一例を提
供する。
（実施例９：キメラ刺激分子は、Ｔ細胞においてＣＡＲＳとともに共発現した）
ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子はまた、ＣＡＲとともに細胞中で発現され得、こ
のＣＡＲは、例えば、ｓｃＦｖポリペプチド、およびＣＤ３−ζ鎖を含み得る。この方法
において、ＣＳＭ分子は、ＣＡＲと組み合わせて使用され、それによって、ＣＡＲシグナ
ル伝達を２種の別個の機能へと分離する。この第２の機能は、ＣＡＲによって提供され、
抗原特異的細胞傷害性を操作されたＴ細胞に提供する。例えば、ＰＳＭＡに対して特異性
を有するＣＡＲは、Ｔ細胞において、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ刺激分子とともに発現
され得る。また、このＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＳＭおよびＣＡＲ部分は、シスで同じベ
クター上、またはトランスで別個のベクター上のいずれかで細胞へとトランスフェクトま
たは形質導入され得る。従って、この２つのポリペプチドは、２つの核酸（例えば、２つ
のプラスミドまたは２つのベクターのような）を使用して発現され得、そのＴ細胞は、例
えば、２回トランスフェクトされてもよいし、特定の実施形態では、その２つの核酸は、
コトランスフェクトされてもよい。他の実施形態において、この２つのポリペプチドは、
１つの核酸（例えば、同じプラスミドもしくはウイルスなど）中で発現され得る。上記核
酸は、２つの別個のプロモーター（一方は、ＣＡＲのため、および一方は、ＣＳＭのため
）を使用して、その２つのポリペプチドを発現し得る。または、他の実施形態において、
その２つのポリペプチドは、同じプロモーターを使用して発現され得る。この実施形態に
おいて、その２つのポリペプチドは、切断可能なポリペプチド（例えば、２Ａ配列のよう
な）によって分離され得る。その操作されたＴ細胞は、例えば、特異的免疫応答（例えば
、前立腺がんの腫瘍に向けられるもの）を生成するために被験体に投与され得る。
いくつかの実施形態において、キメラ刺激分子は、ＣＤ４０を含まない。ＭｙＤ８８／
ＣＤ４０キメラ刺激分子のために提供される方法、構築物、ポリペプチド、および細胞が
、ＭｙＤ８８キメラ刺激分子の発現および使用のために必要であるとして改変され得るこ
とは理解される。
ＭｙＤ８８／ＣＤ４０の基底活性は、ＣＤ１９結合キメラ抗原レセプターを発現するＴ
細胞を刺激するために十分であることが見出された。誘導性キメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０
ポリペプチドを発現するＭｙＤ８８／ＣＤ４０ベクターをアッセイにおいて使用し、ＡＰ
１９０３によって誘導可能であるようにデザインした。ＡＰ１９０３の非存在下では、腫
瘍細胞との遭遇後に、ＣＤ１９−ＣＡＲへの共刺激を提供するために十分な基底活性が存
在した。
ＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激ポリペプチドの例は、キメラ抗原レセプターとして同じベ
クター上で共発現した。
ＳＦＧ−Ｍｙｒ．ＭＣ．２Ａ．ＣＤ１９ｓｃＦｖ．ＣＤ３４ｅ．ＣＤ８ｓｔｍ．ゼータ
配列



（実施例１０：参考文献）
以下の参考文献は、引用されるか、または関連し得るさらなる情報を提供する。
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（実施例１１：Ｔ細胞レセプター発現細胞および腫瘍浸潤リンパ球におけるＭｙＤ８８
／ＣＤ４０共刺激分子の発現）
本明細書で提供されるＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子を発現する改変された細胞はま
た、Ｔ細胞レセプターを発現し得る。これらの例では、このＴ細胞レセプターは、その細
胞に対して内因性であってもよいし、Ｔ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを
含む核酸でのトランスフェクションもしくは形質転換を介してその細胞に提供されてもよ
い。ある特定の例では、このＴ細胞レセプターは、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子と同
じ核酸ベクター上で発現されてもよい。さらなる例では、このＴ細胞レセプターは、誘導
性キメラカスパーゼ−９分子と同じ核酸ベクター上で発現されてもよい。キメラ抗原レセ
プター、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子、または誘導性カスパーゼ−９分子を共発現す
るかまたは別個に発現するベクターを構築するために本明細書で提供される方法は、その
Ｔ細胞レセプター、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激分子、または誘導性カスパーゼ−９分子
の共発現または別個の発現に適切であるように改変され得る。いくつかの例では、その改
変された細胞は、腫瘍浸潤リンパ球である。
（実施例１２：改変された細胞の選択的アポトーシス）
改変された細胞は、患者が有害な作用を経験し、処置を低減するかもしくは中止する必
要がある場合でも、細胞のうちのいくらかまたは全てを除去するための機構を備え得る。
これら細胞は、全てのＣＳＭ発現改変Ｔ細胞またはＣＡＲ発現改変Ｔ細胞のために使用さ
れてもよいし、上記細胞は、ＣＡＲが、標的に対してだけでなくそれ以外の臓器に対する
致死的毒性（ｌｅｔｈａｌ ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ， ｏｆｆ−ｏｒｇａｎ ｔｏｘｉｃｉ
ｔｙ）を以前に引き起こしたかまたは引き起こすリスクがある抗原に向けられる場合に、
治療を迅速に終えるための選択肢が必要である場合に、この能力を備え得る。
改変された細胞において発現され得るキメラポリペプチドの例は、図７に提供される。
この例では、単一のポリペプチドが、核酸ベクターによってコードされる。誘導性カスパ
ーゼ−９ポリペプチドは、ペプチド結合のスキッピングに起因して、翻訳中にＣＡＲポリ
ペプチドから分離される（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， ＭＬ ２００１， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖ
ｉｒｏｌ． ８２：１０１３−２５）。
（ベクター構築および発現の確認）
ヒトＴ細胞において安定してかつ効率的に発現され得る安全スイッチは、本明細書で示
される。ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６のよ
うな）に融合された改変されたヒトカスパーゼ−９活性を含む、治療剤としての使用に適
した発現ベクターを構築した。このカスパーゼ−９／ＦＫＢＰ１２ハイブリッド活性は、
小分子医薬を使用して二量体化され得る。カスパーゼ−９活性の全長、切断型、および改
変されたバージョンを、リガンド結合ドメイン、多量体化する（multimerizing）領域、
二量体化する領域、二量体化領域、または多量体化（multimerization）領域に融合し、
蛍光マーカーＧＦＰの発現も可能にするレトロウイルスベクターＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．Ｇ
ＲＰへと挿入した。
全長誘導性カスパーゼ−９分子（Ｆ’−Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９）は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー（配列番号１１９）で、カスパーゼ分子の小およ
び大サブユニットへと連結される２個、３個、またはこれより多くのＦＫ５０６結合タン
パク質（ＦＫＢＰ−例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６バリアント）を含む。全長誘導性カスパ
ーゼ−９（Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰ）は、全長カスパーゼ−９を有し、Ｆ３
６Ｖ変異を含む２個の１２ｋＤａヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； Ｇｅ
ｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）に連結されたカスパーゼリクルートメントドメイン（
ＣＡＲＤ； ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１ ２２９）をも含む。ＦＫＢＰ（Ｆ’）のうち
の１種もしくは複数種のアミノ酸配列は、レトロウイルスにおいて発現される場合、相同
組換えを防止するために、コドンゆらぎにした（codon-wobbled）（例えば、各アミノ酸
コドンの３番目のヌクレオチドを、本来コードされたアミノ酸を維持するサイレント変異
によって変化させた）。Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ３Ｓは、その活性部位を破壊する２８
７位でのシステインからセリンへの変異を含む。構築物Ｆ’Ｆ−Ｃａｓｐ９、Ｆ−Ｃ−Ｃ
ａｓｐ９、およびＦ’−Ｃａｓｐ９において、カスパーゼ活性化ドメイン（ＣＡＲＤ）、
１個のＦＫＢＰ、またはその両方のいずれかを、それぞれ欠失させた。全ての構築物を、
ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰへとクローニング
した。
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞における予測されるサイズの誘導性カスパーゼ−９
構築物とマーカー遺伝子ＧＦＰとの共発現を、全長および切断型両方のカスパーゼ分子に
存在するアミノ酸残基２９９〜３１８に特異的なカスパーゼ−９抗体、ならびにＧＦＰ特
異的抗体を使用して、ウェスタンブロットによって実証した。
最初の検査では、全長ｉＣａｓｐ９が、おそらく形質導入された細胞が導入遺伝子の基底
活性によって排除されていることに起因して、Ｔ細胞において安定して高レベルで維持で
きないことが示された。ＣＡＲＤドメインは、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１（
Ａｐａｆ−１）とのシトクロムＣおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）駆動の相互作用に
よって、カスパーゼ−９分子の生理学的な二量体化に関与する。二量体化および自殺スイ
ッチの活性化を誘導するためにＣＩＤを使用することが原因で、ＣＡＲＤドメインの機能
は、この状況では不必要であり、ＣＡＲＤドメインの除去を、基底活性を減少するための
方法として調査した。
（半合致（Ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ）幹細胞移植後の同種枯渇Ｔ細胞（Ａｌｌｏ
ｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ）の安全性を改善するためのｉＣａｓｐ９自殺遺伝子の
使用）
この例では、発現構築物を使用して、半合致幹細胞移植後に同種枯渇Ｔ細胞の安全性を
改善するための発現構築物および該発現構築物を使用する方法が示される。類似の方法は
、非同種枯渇細胞においてカスパーゼ−９発現構築物を発現させるために使用され得る。
ｉＣａｓｐ９および選択マーカー（切断型ＣＤ１９）をコードするレトロウイルスベクタ
ーを、ドナーＴ細胞のための安全スイッチとして生成した。（抗ＣＤ２５免疫毒素を使用
する）同種枯渇の後ですら、ドナーＴ細胞は、効率的に形質導入でき、増殖でき、および
その後にＣＤ１９免疫磁性選択によって＞９０％純度へと富化できた。その操作された細
胞は、抗ウイルス特異性および機能性を保持し、調節性の表現型および機能を有するサブ
セットを含んだ。ｉＣａｓｐ９を小分子二量体化剤（small-molecule dimerizer）で活
性化すると、＞９０％アポトーシスが迅速に生じた。導入遺伝子発現は、静止しているＴ
細胞においてダウンレギュレートされたが、ｉＣａｓｐ９は、活性化（同種反応性）Ｔ細
胞において迅速に発現がアップレギュレートされたので、効率的な自殺遺伝子を保持した
。
（材料および方法）
（同種枯渇Ｔ細胞の生成）
同種枯渇細胞を、以前に示されたように、健常志願者から生成した。簡潔には、健常ド
ナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ Ｖ； Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で４０：１のレスポンダー 対 刺激物質比
で、３０Ｇγ照射レシピエントエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽
球様細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細
胞は、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによる共培
養物から枯渇された。同種枯渇を、残っているＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、
３Ｈ−チミジン取り込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に適切であるとみなし
た。
（プラスミドおよびレトロウイルス）
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９は、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒト
ＣＤ１９へと連結された誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９
は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー（配列番号１１９）を介
してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９； ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１２２９）へと接
続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； Ｇｅ
ｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）からなる。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤
ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３へのＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させる。カスパ
ーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）を、ヒトカスパーゼ−９配列から欠失させた
。なぜならその生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられており、その除去は
、導入遺伝子の発現および機能を増大させるからである。この２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅ
ａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸のペプチドをコードし、このペプチド
は、グリシンと末端プロリン残基との間で＞９９％切断を媒介し、ｉＣａｓｐ９のＣ末端
において１９個の余分なアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端において１個の余分なプロリン
残基を生じる。ＣＤ１９は、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）（配列番号２８６）で短
縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７７０）からなり、これは、細胞
質内ドメインを２４２から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化の潜在的部位である全ての保
存されたチロシン残基を除去する。
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）偽型レトロウイルスを生成する安定なＰＧ１
３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品＃ＳＤ３４４４； ＡＴＣ
Ｃ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）をＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９で一過性に
トランスフェクトすることによって作製した。これは、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスを生成
した。ＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏ偽型もしくはレトロウイル
スで３回形質導入して、１細胞あたり複数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９プロ
ウイルス組み込み体を含むプロデューサー株を生成した。単一細胞クローニングを行い、
最高力価を生じたＰＧ１３クローンを増殖させ、ベクター生成のために使用した。
（レトロウイルス形質導入）
Ｔ細胞活性化および増殖のための培養培地は、４５％ ＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）、４５％ クリック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， ＣＡ）および１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ； Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ）からなった。同種枯渇細胞を、固定化抗ＣＤ３（ＯＫＴ３； Ｏｒｔｈｏ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ， ＮＪ）によって４８時間にわたって活性化
し、その後、レトロウイルスベクター選択的同種枯渇での形質導入を、ドナーＰＢＭＣと
レシピエントＥＢＶ−ＬＣＬとを共培養することによって行って、同種反応性細胞を活性
化した：活性化した細胞は、ＣＤ２５を発現し、その後、抗ＣＤ２５免疫毒素によって排
除した。この同種枯渇細胞を、ＯＫＴ３によって活性化し、レトロウイルスベクターで４
８時間後に形質導入した。免疫磁性選択を、形質導入の４日目に行った；陽性画分を、さ
らに４日間増殖させ、凍結保存した。
小規模実験では、非組織培養処理２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を、ＯＫＴ３ １ｇ／ｍｌで２〜４時間、３７℃に
おいてコーティングした。同種枯渇細胞を、１×１０６ 細胞／ウェルで添加した。２４
時間において、１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｐｒｏ
ｌｅｕｋｉｎ； Ｃｈｉｒｏｎ， Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）を添加した。レトロ
ウイルス形質導入を、活性化の４８時間後に行った。非組織培養処理２４ウェルプレート
を、３．５ｇ／ｃｍ２ 組換えフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６； Ｒｅｔ
ｒｏｎｅｃｔｉｎ； Ｔａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）
でコーティングし、そのウェルに、０．５ｍｌ／ウェルのレトロウイルスベクター含有上
清を、３０分間、３７℃において２回負荷した。その後、ＯＫＴ３活性化細胞を、３：１
の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有上清およびＴ細胞培養培地（１００Ｕ／ｍｌ
ＩＬ−２を補充）中に、５×１０５ 細胞／ウェル蒔いた。細胞を２〜３日後に採取し、
５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２の存在下で増殖させた。
（遺伝子改変同種枯渇細胞のスケールアップ生成）
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップは、非組織培養処理Ｔ７５フラス
コ（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を使用し、これを、一晩４℃において、
１０ｍｌのＯＫＴ３ １μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン ７μｇ／ｍｌで
コーティングした。増大した細胞接着のためのコロナ放電処理したフッ化エチレンプロピ
レンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）も使用した。同種枯渇細胞
を、１×１０６ 細胞／ｍｌで、ＯＫＴ３でコーティングしたフラスコの中に播種した。
１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を翌日添加した。レトロウイルス形質導入のために、レトロネ
クチンでコーティングしたフラスコまたはバッグに、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清
を２〜３時間にわたって１回負荷した。ＯＫＴ３活性化Ｔ細胞を、３：１の比の新鮮なレ
トロウイルスベクター含有培地およびＴ細胞培養培地（１００ Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を補
充）の中で、１×１０６ 細胞／ｍｌで播種した。翌朝に細胞を採取し、約５×１０５
細胞／ｍｌ〜８×１０５ 細胞／ｍｌの播種密度で、組織培養処理Ｔ７５またはＴ１７５
フラスコ中の、ＩＬ−２ 約５０〜１００Ｕ／ｍｌを補充した培養培地中で増殖させた。
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナ
ルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）で標識し、小規模実験ではＭＳもしくはＬＳ
カラム上で、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで
選択した。ＣＤ１９選択した細胞を、さらに４日間増殖させ、形質導入後の８日目に凍結
保存した。それらの細胞を、「遺伝子改変同種枯渇細胞」と呼んだ。
（免疫表現型決定およびペンタマー分析）
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフト
ウェア； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行った：ＣＤ
３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４
５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ ４Ｇ７； Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色を与えることが見出されたので、その後の全
ての実験において使用した。非形質導入コントロールを使用して、ＣＤ１９に関する陰性
ゲートを設定した。ＨＬＡ−ペンタマー、ＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬ（配列番号２
８７として開示される「ＲＡＫＦＫＱＬＬ」）（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ， Ｓｐｒｉｎｇｆ
ｉｅｌｄ， ＶＡ）を使用して、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）のエピトープを認識する
Ｔ細胞を検出した。ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペンタマー（配列番号２８８とし
て開示される「ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ」）を使用して、ＣＭＶ−ｐｐ６５抗原のエピトープ
を認識するＴ細胞を検出した。
（二量体化の化学的誘導物質、ＡＰ２０１８７でのアポトーシスの誘導）
自殺遺伝子機能性を、小分子合成ホモ二量体化剤、ＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ； Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）をＣＤ１９免疫磁性選択
の翌日に１０ｎＭ 終濃度で添加することによって評価した。ＡＰ１９０３も使用され得
る。細胞を、２４時間においてアネキシンＶおよび７−アミノアクチノマイシン（７−Ａ
ＡＤ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析し
た。アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両方に関して陰性の細胞を、生存しているとみなし
、アネキシンＶ陽性の細胞をアポトーシスとみなし、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤの両
方が陽性の細胞を壊死とみなした。二量体化によって誘導される殺滅率を、以下のとおり
、基底生存率に関して較正した：殺滅率＝１００％−（ＡＰ２０１８７処理細胞の％生存
率÷非処理細胞の％生存率）。
（長期培養および再活性化後の導入遺伝子発現の評価）
細胞を、形質導入の２２日後まで、５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を含むＴ細胞培地中で維持
した。細胞の一部を、１ｇ／ｍｌ ＯＫＴ３および１ｇ／ｍｌ 抗ＣＤ２８（Ｃｌｏｎｅ
ＣＤ２８．２， ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で４８
〜７２時間コーティングした２４ウェルプレート上で再活性化した。再活性化細胞および
非再活性化細胞の両方でのＣＤ１９発現および自殺遺伝子機能を、形質導入後の２４日目
または２５日目に測定した。
いくつかの実験では、細胞をまた、形質導入後３週間培養し、１：１のレスポンダー：
刺激物質比において、３０Ｇ照射同種異系ＰＢＭＣで刺激した。共培養の４日後、細胞の
一部を、１０ｎＭ ＡＰ２０１８７で処理した。殺滅を、２４時間においてアネキシンＶ
／７−ＡＡＤ染色によって測定し、バイスタンダーウイルス特異的Ｔ細胞に対する二量体
化剤の効果を、ＡＰ２０１８７処理細胞および未処理細胞に対するペンタマー分析によっ
て評価した。
自殺遺伝子改変Ｔ細胞の免疫学的能力を維持するために最適な培養条件を、安全スイッ
チ、選択マーカーおよび細胞タイプの各組み合わせに関して決定して定義しなければなら
ない。なぜなら表現型、レパートリーおよび機能性は、全て、ポリクローナルＴ細胞活性
化のために使用される刺激、形質導入細胞の選択のための方法、および培養の継続時間に
よって影響を及ぼされ得るからである。
（ハプロタイプ同一幹細胞移植後の誘導性カスパーゼ−９自殺遺伝子で形質導入した同
種枯渇Ｔ細胞のフェーズＩ臨床試験）
この例は、代替の自殺遺伝子ストラテジーを使用するフェーズ１臨床試験の結果を示す
。簡潔には、ドナー末梢血単核球を、レシピエントの照射ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細
胞とともに（４０：１）７２時間共培養し、ＣＤ２５免疫毒素で同種枯渇させ、次いで、
ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択マーカー（ΔＣＤ１９）を有するレトロウイルス上清
で形質導入した；ΔＣＤ１９は、免疫磁性選択を介して＞９０％純度への富化を可能にし
た。
（細胞治療製品の生成のためのプロトコルの一例を、本明細書で提供する）
（原材料）
末梢血の２４０ｍｌまで（２回の収集にて）を、確立されたプロトコルに従って移植ド
ナーから得た。場合によっては、ドナーおよびレシピエントのサイズに依存して、白血球
除去を行って、十分なＴ細胞を単離した。１０〜３０ｃｃの血液をまた、レシピエントか
ら採血し、それを使用して刺激細胞（stimulator cell）として使用されるエプスタイン
・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株を生成した。場合によっては、医
療履歴および／またはＢ細胞数が低いという表示に依存して、ＬＣＬを、適切な第１度近
親者（例えば、親、きょうだい、もしくは子孫）の末梢血単核球を使用して生成した。
（同種枯渇細胞の生成）
同種枯渇細胞を、本明細書で示されるように移植ドナーから生成した。健常ドナーの末
梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ Ｖ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中４０：１のレスポンダー対刺激物質比において、照射したレシ
ピエントのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ
）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞を、ＲＦＴ５−Ｓ
ＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって、共培養物から枯渇さ
せた。同種枯渇を、その残りのＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ−チミジン
取り込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に、適切であるとみなす。
（レトロウイルス生成）
レトロウイルスプロデューサー株クローンを、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９構築物のため
に生成した。このプロデューサーのマスター細胞バンクもまた、生成した。このマスター
細胞バンクの試験を行って、複製能のあるレトロウイルスの生成およびＭｙｃｏｐｌａｓ
ｍａ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどによる感染を除外した。このプロデューサー株を、コ
ンフルエントになるまで成長させ、上清を採取し、濾過し、アリコートに分け、急速凍結
し、−８０℃で貯蔵した。さらなる試験を、レトロウイルス上清の全てのバッチに対して
行って、プロトコルに従って、複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）を除外し、分析証
明書を発行した。
（同種枯渇細胞の形質導入）
同種枯渇Ｔリンパ球を、フィブロネクチンを使用して形質導入した。プレートまたはバ
ッグを、組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴ
Ｍ， Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）でコーティングした。ウ
イルスを、コーティングしたプレートまたはバッグ中でプロデューサー上清をインキュベ
ートすることによってレトロネクチンに結合させた。次いで、細胞を、ウイルスコーティ
ングしたプレートまたはバッグに移した。形質導入後、同種枯渇Ｔ細胞を、プロトコルに
従って、これらにＩＬ−２を１週間に２回供給して増殖させて十分な細胞数に到達させた
。
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナ
ルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）で標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自
動化選択デバイスで選択する。臨床での注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞を、
ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に凍結保存するか、またはＩＬ−２でさらに増殖させて形質導
入後の６日目または８日目に凍結保存するかのいずれかを行った。
（凍結）
細胞のアリコートを、ＦＤＡによる最終リリース試験のために必要とされるとおりの形
質導入効率、同一性、表現型および微生物学的培養を試験するために取り出した。この細
胞を、プロトコルに従って投与する前に、凍結保存した。
（研究薬）
（ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ）
ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡは、ヘテロ−−二官能性架橋剤［Ｎ−スクシンイミジルオ
キシカルボニル−α−メチル−ｄ−（２−ピリジルチオ）トルエン］（ＳＭＰＴ）を介し
て化学的に脱グリコシル化したリシンＡ鎖（ｄｇＡ）に結合体化されたマウスＩｇＧ１
抗ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプターα鎖）である。ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡを、０．５
ｍｇ／ｍｌの滅菌溶液として製剤化する。
（合成ホモ二量体化剤ＡＰ１９０３）
作用機構：ＡＰ１９０３誘導性細胞死は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）
由来の薬物結合ドメインに融合されたヒト（カスパーゼ−９）プロテインレセプター（こ
れは、アポトーシス細胞死をシグナル伝達する）のプロドメイン欠失部分を含むキメラタ
ンパク質を発現させることによって達成される。このキメラタンパク質は、ＦＫＢＰドメ
インを架橋し、カスパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを開始するＡＰ１９０３の投
与まで細胞内で静止状態のままである。
毒物学：ＡＰ１９０３は、ＦＤＡによって臨床試験用の新医薬品（ＩＮＤ）として評価
されており、フェーズＩ臨床安全性研究を成功裡に終えた。ＡＰ１９０３を０．０１ｍｇ
／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ 用量範囲にわたって投与した場合に、有意な有害作用は注記
されなかった。
薬理学／薬物動態：患者に、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を、２時間注入として（
０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ用量範囲にわたって１０ｎｇ／ｍＬ〜１２７５ｎ
ｇ／ｍＬの血漿濃度を示し、血漿レベルは、投与後０．５時間および２時間で最大から１
８％および７％へと低下するという、公開されたＰＫデータに基づいて）与えた。
ヒトにおける副作用プロファイル：志願者でのフェーズ１研究の間には、重篤な有害事
象は起こらなかった。有害事象の発生率は、各処置後に非常に低く、全ての有害事象は、
重症度が軽度であった。唯一の有害事象は、おそらくＡＰ１９０３に関連していると考え
られた。これは、１．０ｍｇ／ｋｇ ＡＰ１９０３投与量で１名の志願者について「顔面
紅潮」として示された血管拡張というエピソードであった。この事象は、注入の開始後３
分で起こり、３２分の継続後に消散した（resolved）。この研究の間に報告された全ての
他の有害事象は、研究者によって研究薬には関連しないかまたは関連性がありそうもない
（improbable）と考えられた。これらの事象は、胸痛、インフルエンザ症候群、口臭、頭
痛、注射部位疼痛、血管拡張、咳の増加、鼻炎、発疹、歯肉出血、および斑状出血を含ん
だ。
グレード１ ＧｖＨＤを発症している患者を、２時間注入として、０．４ｍｇ／ｋｇ
ＡＰ１９０３で処置した。患者グレード１ ＧｖＨＤへのＡＰ１９０３の投与プロトコル
を、以下のとおり確立した。同種枯渇Ｔ細胞の注入後にＧｖＨＤを発症している患者を生
検して診断を確定し、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時間の注入として与える。グ
レードＩ ＧｖＨＤを有する患者は、他の治療を最初に何も受けなかったが、彼らがＧｖ
ＨＤの進行を示した場合、従来のＧｖＨＤ治療を、施設のガイドラインに従って投与した
。グレード２〜４ ＧｖＨＤを発症している患者に、施設のガイドラインに従って、ＡＰ
１９０３二量体化薬物に加えて、標準的な全身免疫抑制治療を施した。
調製および注入の指示：注射用ＡＰ１９０３を、３ｍｌ バイアル中、５ｍｇ／ｍｌの
濃度で２．３３ｍｌの濃縮溶液（すなわち、１０．６６ｍｇ／バイアル）として得る。投
与前に、その計算した用量を、注入用０．９％ 生理食塩水中で１００ｍＬへと希釈した
。１００ｍｌ容積中の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰ、非エチ
レンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、２時間かけてＩＶ注入を介し
て投与した。
ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子発現構築物（例えば、ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１
９）は、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）へと連結した
誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙリンカー（配列番号２８９）を介してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９；
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１２２９）へと接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ
５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）を含む
。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対する
ＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させ得る。カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡ
ＲＤ）は、ヒトカスパーゼ−９配列から欠失されており、その生理学的機能は、ＦＫＢＰ
１２によって置き換えられている。ＣＡＲＤをＦＫＢＰ１２で置き換えると、導入遺伝子
発現および機能が増大する。上記２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイル
ス由来の１８アミノ酸のペプチドをコードし、それはグリシンと末端プロリン残基との間
で＞９９％切断を媒介し、ｉＣａｓｐ９のＣ末端において１７個の余分なアミノ酸および
ＣＤ１９のＮ末端において１個の余分なプロリン残基を生じる。ΔＣＤ１９は、アミノ酸
３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）（配列番号２８６）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎ
ｋ ＮＭ ００１７７０）からなり、これは、細胞質内ドメインを２４２から１９アミノ
酸に短縮し、リン酸化の潜在的部位である全ての保存されたチロシン残基を除去する。
（インビボ研究）
３名の患者に、ハプロ−ＣＤ３４＋幹細胞移植（ＳＣＴ）後に、約１×１０６ 細胞／
ｋｇ〜約３×１０６ 細胞／ｋｇの間の用量レベルでｉＣａｓｐ９＋ Ｔ細胞を与えた。
注入したＴ細胞を、注入後７日目の早さで、フローサイトメトリー（ＣＤ３＋ ΔＣＤ
１９＋）またはｑＰＣＲによってインビボで検出し、最大倍数増殖は１７０±５（注入後
２９±９日目）であった。２名の患者は、グレードＩ／ＩＩ ａＧｖＨＤを発症し、ＡＰ
１９０３投与は、注入の３０分以内に、ＣＤ３＋ ΔＣＤ１９＋細胞の＞９０％除去（２
４時間以内にさらなる対数減少を伴う）、および２４時間以内の皮膚および肝臓のａＧｖ
ＨＤの消散を引き起こし、ｉＣａｓｐ９導入遺伝子がインビボで機能することを示した。
エキソビボ実験は、このデータを確認した。さらに、残っている同種枯渇Ｔ細胞は、増
殖でき、ウイルス（ＣＭＶ）および真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
）に対して反応性であった（ＩＦＮ−γ生成）。これらのインビボ研究は、二量体化薬物
の単一用量が、ＧｖＨＤを引き起こすＴ細胞の部分集団を減少または排除し得るが、ウイ
ルス特異的ＣＴＬ（これは、次いで、再増殖し得る）を残し得ることを見出した。
（免疫再構築）
患者細胞および試薬の利用可能性に依存して、免疫再構築研究（免疫表現型決定、Ｔ細
胞およびＢ細胞機能）は、移植後一連の間隔で得られ得る。ｉカスパーゼ形質導入同種枯
渇Ｔ細胞から生じる免疫再構築を測定するいくつかのパラメータを分析する。この分析は
、全リンパ球カウント、Ｔ細胞およびＣＤ１９ Ｂ細胞の数の反復測定、ならびにＴ細胞
サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ
４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、アルファ／ベー
タおよびガンマ／デルタＴ細胞レセプター）のＦＡＣＳ分析を含む。患者Ｔ細胞の利用可
能性に依存して、調節性Ｔ細胞マーカー（例えば、ＣＤ４１ＣＤ２５１ＦｏｘＰ３）もま
た分析する。可能な場合には、注入の４時間後、１ヶ月の間週に１回、月に１回×９ヶ月
間、および次に１年でおよび２年で、およそ１０〜６０ｍｌの患者血液を採取する。採取
される血液量は、レシピエントのサイズに依存し、いずれの１回の採血時にも（臨床上の
ケアおよび研究評価のために血液採取は可能である）合計で１〜２ｃｃ／ｋｇを超えない
。
（より低い基底活性およびリガンドＩＣ５０の最小の損失を有する改変カスパーゼ−９
ポリペプチド）
基底シグナル伝達（アゴニストまたは活性化剤の非存在下でのシグナル伝達）は、多く
の生体分子で一般的である。例えば、複数のサブファミリーに由来する６０を超える野生
型Ｇプロテイン共役レセプター（ＧＰＣＲ）［１］、キナーゼ（例えば、ＥＲＫおよびａ
ｂｌ）［２］、表面免疫グロブリン［３］、およびプロテアーゼにおいて観察されている
。基底シグナル伝達は、胚性幹細胞多能性の維持、Ｂ細胞発生および分化［４〜６］、Ｔ
細胞分化［２， ７］、胸腺細胞発生［８］、エンドサイトーシスおよび薬物耐容性［９
］、自己免疫［１０］から、植物生長および発生［１１］まで、非常に種々の生物学的事
象に寄与すると仮定されている。その生物学的重要性は常に完全に理解されているわけで
も明らかでもないが、欠陥のある基底シグナル伝達は、重大な帰結をもたらし得る。欠陥
のある基底Ｇｓプロテインシグナル伝達は、網膜色素変性、色盲、腎性尿崩症、家族性Ａ
ＣＴＨ抵抗性（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＣＴＨ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、および家族性低
カルシウム尿性高カルシウム血症［１２， １３］）などの疾患をもたらした。
野生型イニシエーターカスパーゼ−９のホモ二量体化がエネルギー的にたとえ不利であ
り、野生型イニシエーターカスパーゼ−９を溶液中で大部分をモノマーにしても［１４〜
１６］、プロセシングされていないカスパーゼ−９の低レベルの生来の基底活性［１５，
１７］は、Ａｐａｆ−１ベースの「アポプトソーム」（その天然のアロステリック調節因
子［６］）の存在下で増強される。さらに、超生理学的発現レベルおよび／または共局在
は、近位にあることで駆動される二量体化（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎ ｄｉｍ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ）をもたらし得、さらには、基底活性化を増強し得る。本出願の改変
された細胞は、より低い基底シグナル伝達活性を有するキメラカスパーゼ−９ポリペプチ
ドをコードする核酸を含み得る。より低い基底シグナル伝達を有するカスパーゼ−９変異
体の例は、以下の表の中に提供される。より低い基底シグナル伝達を有するカスパーゼ−
９変異体を含むポリヌクレオチドは、本明細書中での細胞治療に使用される改変された細
胞において発現され得る。これらの例では、その改変された細胞は、より低い基底シグナ
ル伝達キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む安全スイ
ッチを含み得る。本明細書中のキメラ刺激分子またはキメラ抗原レセプターを含む改変さ
れた細胞の投与後の有害事象という事象では、カスパーゼ−９活性は、患者に二量体化剤
を投与し、従って、改変された細胞のうちのいくらかまたは全てのアポトーシスおよびク
リアランスを誘導することによって誘導され得る。いくつかの例では、投与される二量体
化剤の量は、改変された細胞のうちの最高量、少なくとも８０％または９０％を除去する
ようにデザインされた量として決定され得る。他の例では、投与される二量体化剤の量は
、有害な症候または状態を緩和する一方で患者において治療用の改変された細胞の十分な
量を残しておくために、治療を継続するために、改変された細胞の一部のみを除去するよ
うにデザインされた量として決定され得る。キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを使用し
てアポトーシスを誘導するための方法は、Ｍａｌｃｏｌｍ Ｋ． Ｂｒｅｎｎｅｒらによ
るＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３７３８１（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０１１年５月２０日
出願）およびＭａｌｃｏｌｍ Ｋ． Ｂｒｅｎｎｅｒらによる米国特許出願第１３／１１
２，７３９号（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０１１年５月２０日出願、米国特許第９，０８９，５２０号と
して２０１５年７月２８日発行）において論じられる。改変された基底活性を有するキメ
ラカスパーゼポリペプチドは、Ｄａｖｉｄ ＳｐｅｎｃｅｒらによるＰＣＴ出願番号ＰＣ
Ｔ／ＵＳ２０１４／０２２００４（標題、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ Ｐｏｌｙ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ、２０１４年３月７日出願、ＷＯ
２０１４／１６４３４８として２０１４年１０月９日公開）およびＤａｖｉｄ Ｓｐｅｎ
ｃｅｒらによる米国特許出願第１３／７９２，１３５号（標題、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃａ
ｓｐａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ、２０１４
年３月７日出願）；およびＳｐｅｎｃｅｒらによる米国特許出願第１４／６４０，５５３
号（２０１５年３月６日出願）において論じられる。治療用の改変された細胞の部分的ア
ポトーシスを誘導するための方法は、Ｋｅｖｉｎ ＳｌａｗｉｎらによるＰＣＴ出願番号
ＰＣＴ／ＵＳ１４／０４０９６４（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ
Ｐａｒｔｉａｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ、２０１４年６月４日出願、ＷＯ２０１４／１９７６３８として２０１４年１２
月１１日公開）およびＫｅｖｉｎ Ｓｌａｗｉｎらによる米国特許出願第１４／２９６，
４０４号（標題、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｐａｒｔｉａｌ Ａｐｏ
ｐｔｏｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、２０１４年６
月４日出願）において論じられる。これらの特許出願および刊行物は、それらの全体にお
いて本明細書に全て参考として援用される。
図１０は、カスパーゼ−９ポリペプチドと共発現されるＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗
原レセプターのプラスミドマップを提供する。図１１は、カスパーゼ−９ポリペプチドと
共発現されるキメラ抗原レセプターのプラスミドマップを提供する。

（引用され、本実施例へのさらなる裏付けを提供する参考文献）
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（実施例１３：ＭＣ共刺激は、ＣＤ１９ ＣＡＲの機能および増殖を増強する）
図３４および４０は、ＣＤ１９抗原を認識する抗原認識部分を使用する、本明細書で論
じられるものに類似の実験の結果を示す。本明細書で提供されるベクターは、ＣＤ１９＋
腫瘍細胞を標的化するＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲ構築物（これは、誘導性カスパーゼ
−９安全スイッチも組み込む）を構築するために改変され得ることは、理解される。
ＭＣ共刺激が、他の抗原を標的化するＣＡＲにおいて機能するかどうかを試験するため
に、Ｔ細胞を、ＣＤ１９．ζまたはＣＤ１９．ＭＣ．ζのいずれかで改変した。改変され
た細胞のＣＤ１９＋ バーキットリンパ腫細胞株（ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ）に対する
細胞傷害性、活性化および生存をアッセイした。共培養アッセイにおいて、いずれかのＣ
ＡＲで形質導入したＴ細胞は、１：１程度の低さのエフェクター 対 標的比でＣＤ１９
＋ Ｒａｊｉ細胞の殺滅を示した（図２１ａおよびｂ）。しかし、共培養アッセイからの
サイトカイン生成の分析は、ＣＤ１９．ＭＣ．ζ形質導入Ｔ細胞が、ＣＤ１９．ζと比べ
てより高レベルのＩＬ−２およびＩＬ−６を生成することを示した（図２１ｃおよびｄ）
。これは、ｉＭＣおよびＭＣシグナル伝達ドメインを含むＰＳＣＡ ＣＡＲで観察された
共刺激効果と一致する。さらに、ＣＤ１９．ＭＣ．ζで形質導入したＴ細胞は、Ｒａｊｉ
腫瘍細胞による活性化後に増強された増殖を示した（図２１ｅ）、これらデータは、ＣＡ
Ｒ分子におけるＭＣシグナル伝達が、腫瘍細胞上で発現される標的抗原へのライゲーショ
ン後に、Ｔ細胞活性化、生存および増殖を改善することを実証する先の実験を裏付ける。
ｐＢＰ０５２６−ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９ｗｔ．２Ａ．ＣＤ１９ｓｃＦｖ．ＣＤ３４ｅ．Ｃ
Ｄ８ｓｔｍ．ＭＣ．ゼータ（図２２）






（実施例１４：ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターおよび誘導性カスパーゼ−
９ポリペプチドを共発現するＴ細胞のサイトカイン生成）
種々のキメラ抗原レセプター構築物を作製して、抗原への曝露後の形質導入Ｔ細胞のサ
イトカイン生成を比較した。上記キメラ抗原レセプター構築物は全て、ＣＤ１９に結合さ
れる抗原認識領域を有した。図３０は、アッセイにおいて使用される種々のレトロウイル
ス構築物の模式図を提供する。図１２は、形質導入効率およびキメラ抗原レセプター発現
を比較する。図１３は、形質導入されたＴ細胞がＤａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞に曝
された後のＩＬ−２およびＩＬ−６分泌を比較する。図１４は、形質導入されたＴ細胞が
Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞に曝された後のＩＬ−２およびＩＬ−６分泌を比較する
別のアッセイ結果を提供する。図１５は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞との共培養後のＣＤ１９＋
ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ腫瘍細胞の排除を示す。
（実施例１５：Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞を標的化するためのＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲ
構築物の例）
図１８および１９は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ抗原を認識する抗原認識部分を使用する、本明
細書で論じられるものに類似の実験の結果を示す。本明細書で提供されるベクターが、Ｈ
ｅｒ２＋腫瘍細胞を標的化するＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲ構築物（これは、誘導性カ
スパーゼ−９安全スイッチも組み込む）を構築するように改変され得ることは理解される
。
ＳＦＧ−Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ．ＣＤ３４ｅ．ＣＤ８ｓｔｍ．ＭＣ．ζ配列




（実施例１６：さらなる配列）





ｐＢＰＯ５０９の配列（図２３に表される）
ｐＢＰ０５０９−ＳＦＧ−ＰＳＣＡｓｃＦｖ．ＣＨ２ＣＨ３．ＣＤ２８ｔｍ．ζ．ＭｙＤ
８８／ＣＤ４０配列





ｐＢＰＯ４２５の配列（図２４に表される）
ｐＢＰ０５２１−ＳＦＧ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ．ＣＨ２ＣＨ３．ＣＤ２８ｔｍ．ＭｙＤ８
８／ＣＤ４０．ζ配列





SFG-Myr.MC-2A-CD19.scfv.CD34e.CD8stm.ζ配列 (図25)
SFG-Myr.MC.2A.CD19scFv.CD34e.CD8stm.ζ配列





（実施例１７：ＣＡＲ改変Ｔ細胞におけるＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激ドメインの位置
の改変および細胞質キメラ刺激分子の共刺激活性）
ＣＡＲ−Ｔ細胞においてＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）共刺激の有用性を評価する本明
細書で示される実施例は、共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８またはＯＸ４０のような）
の従来の位置において、ＣＡＲ内にＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドを含めることに焦
点を当てた。本実施例では、このＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを、ＣＤ８膜貫通領域とＣＤ３ζとの間に配置した（図２６）。このＣＡＲデ
ザイン（ＭＣ．ζと称される）は、インビトロ共培養アッセイの間に、有意により高いサ
イトカイン生成（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−６）、増強されたＴ細胞生存および増殖
、ならびに優れた腫瘍殺滅を明らかに示した。しかし、インビボマウス研究は、抗腫瘍活
性が共刺激を欠いているＣＡＲと比べて増強されるが、ＣＤ１９＋またはＨｅｒ２＋腫瘍
に対する長期間の腫瘍コントロールは達成されないことを示した。
レトロウイルス形質導入の後に、ＣＡＲ発現（平均蛍光強度；ＭＦＩ）は、ＭｙＤ８８
／ＣＤ４０シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲで減少する。ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ドメイ
ンからの基底活性またはタンパク質不安定性が、形質導入されたＴ細胞においてより低い
ＭＦＩの原因であり得るかどうかを評価するために、Ｔ細胞を、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０シ
グナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータをコードするベクターで形質導入した（図２７）
。形質導入されたＴ細胞におけるより低いＣＡＲ分子発現が、ＣＡＲの機能および抗腫瘍
特性に悪影響を及ぼす（本発明者らの動物研究において最適状態に及ばない腫瘍コントロ
ールをおそらく与える）かどうかもまた、評価した。
これらの実験では、細胞質キメラ刺激分子、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（構成的に発現され
るが、ＣＡＲ分子とは分離している）を、これが、共刺激特性を保持しながらＣＡＲ発現
および安定性を増大し得るかどうかを決定するために試験した。さらなるベクターをデザ
インした（Ｐ２Ａ自己切断エレメントを使用してＭｙＤ８８／ＣＤ４０を構成的に生成す
るＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＡＲ．ζ．２Ａ．ＭＣ）。このＭｙＤ８８／ＣＤ４０
ポリペプチドは構成的に発現され、構成的に活性である。すなわち、それは、多量体リガ
ンド結合領域を有さずかつ誘導物質の必要性なしに免役活性を刺激する。「ＭＣ」を含む
この例での構築物名称は、ミリストイル化配列をも含むＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列を指す（しかし、このミリストイル化配列の機能性
は、プロリンの付加に起因して破壊される）（Ｒｅｓｈ， Ｍ．Ｄ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ
． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １４５１： １−１６ （１９９９））。最初に、
このデザインの機能を評価する実験を、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３）で、次に、そ
の後、Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）で行った。形質導入後、全てのＴ細胞が、効率的
に形質導入された（＞７５％）が、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０の２Ａ形態を発現するＴ細胞は
、ＭＣ．ζ形式と比べて増大したＣＡＲ ＭＦＩを明らかに示した（図２７）。これは、
ＣＡＲドメインからＭＣを除去すると、ＣＡＲ安定性が回復するか、またはＣＡＲ依存性
ＭｙＤ８８／ＣＤ４０毒性が軽減することを示した。
ＭｙＤ８８／ＣＤ４０の構成的発現がその同種の抗原を有する腫瘍細胞へのＣＡＲ結合
後に共刺激を提供し得るかどうかを試験するために、共培養実験を、ＣＤ１９標的化ＣＡ
ＲとＣＤ１９＋ Ｒａｊｉリンパ腫細胞とを使用して行った。ここで、ＭｙＤ８８／ＣＤ
４０は、ＣＡＲ分子自体の中で発現されるか、または構成的タンパク質として発現される
かに関わらず、Ｔ細胞がＣＤ３ζシグナル伝達に加えて、共刺激を要するＩＬ−２および
ＩＬ−６を分泌することを可能にした（図２８）。フローサイトメトリーを使用してこれ
らの共培養アッセイをさらに分析すると、全てのＣＤ１９特異的ＣＡＲ構築物が、Ｒａｊ
ｉ腫瘍細胞を効率的に殺滅する（図２９）一方で、ＭＣ．ζおよび２Ａ．ＭＣ ＣＡＲ形
式のみが、抗原性刺激に応じてＴ細胞増殖を可能にする（図３０）ことが明らかになった
。これらデータは、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０での構成的な共刺激が、高いＣＡＲ発現レベル
を保ちながら、Ｔ細胞増殖および生存のシグナル伝達を同時に提供し得ることを示唆する
。
ＣＤ１９標的化ＣＡＲに加えて、類似の実験を行って、代替のＭｙＤ８８／ＣＤ４０形
式を有するＨｅｒ２特異的ＣＡＲが、ＣＤ１９特異的ＣＡＲと同様に機能するかどうかを
試験した。ＣＤ１９ ＣＡＲと同様に、２ＡエレメントによってＭｙＤ８８／ＣＤ４０を
構成的に発現させると、Ｈｅｒ２．ＭＣ．ζと比べてＣＡＲ ＭＦＩが改善し（図３１お
よび３２）、サイトカイン生成が増強した（図３３）。次に、共培養アッセイを、Ｈｅｒ
２＋ ＳＫ−ＢＲ−３乳がん細胞株に対して行ったところ、Ｈｅｒ２．ＭＣ．ζならびに
２Ａ．ＭＣ両方が、強力な共刺激と一致して、増強された腫瘍コントロールおよび相当す
るＴ細胞増殖を明らかに示した（図３４および３５）。
この２Ａ形式の抗腫瘍効力を評価するために、腫瘍異種移植動物研究を行った。免疫不
全ＮＳＧマウスに、ＳＫ−ＢＲ−３−ＥＧＦＰルシフェラーゼ腫瘍細胞を移植し、７日後
に、非形質導入（ＮＴ）、またはＨｅｒ２．ζ、Ｈｅｒ２．２８．ζ、Ｈｅｒ２．ＭＣ．
ζもしくはＨｅｒ２．ζ．２Ａ．ＭＣで形質導入したかのいずれかの２用量の１×１０７
Ｔ細胞で腫瘍内注射を介して処置した。Ｈｅｒ２．ζ．２Ａ．ＭＣ改変Ｔ細胞で処置し
たマウスは、Ｔ細胞注射後の１４日目までに完全な腫瘍退縮を示した（図３６）。重要な
ことには、体重減少によって特徴付けられる場合のＴ細胞毒性は、観察されなかった。こ
れらデータは、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０がＣＡＲとともに構成的に共発現され得、Ｔ細胞成
長および抗腫瘍活性を支持し得ることをさらに裏付ける。
まとめると、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０は、ＣＡＲ分子の中に（ｓｃＦｖ．ＭＣ．ζ）、ま
たは構成的に発現されるアクセサリータンパク質として、ともに組みこまれ得る。これは
、初代Ｔ細胞の中に第１世代ＣＡＲ（ｓｃＦｖ．ζ．２Ａ．ＭＣ）とともに導入される場
合、インビトロおよびインビボの両方で、サイトカイン生成、増殖および抗腫瘍活性を増
強する。
（実施例１８：ｐＢＰ０８１３−ＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９．ゼータ．２
Ａ．ＭＣのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）
プラスミドｐＢＰ０８１３−ＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９．ゼータ．２Ａ．
ＭＣは、本技術のキメラ抗原レセプターの一例をコードするポリヌクレオチドを含む；こ
のポリヌクレオチドは、膜標的化領域を含まない。このポリヌクレオチドはまた、誘導性
キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする。




（実施例１９：キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞の生存および増殖を増強す
るためのＭｙＤ８８／ＣＤ４０ベースの共刺激）
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）Ｔ細胞での治療の効力は、インビボ養子移入後の抗原
曝露に応じたＴ細胞増殖、持続性、および複数のサイトカインの生成（ｅｌａｂｏｒａｔ
ｉｏｎ）と関連する。ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、またはＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチド
を含むキメラ刺激分子を、ＣＡＲ Ｔ細胞活性を共刺激するそれらの能力に関してアッセ
イした。誘導性キメラカスパーゼ−９ポリペプチドも共発現する細胞を、安全スイッチと
してのそれらの有効性に関してアッセイした；誘導するリガンドの投与は、インビボ腫瘍
モデルにおいて腫瘍コントロールを喪失することなしに、サイトカインレベルの正常化を
生じた。
共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８およびＣＤ１３７（４−１ＢＢ））を含むキメラ抗
原レセプター分子は、種々の程度の持続性および増殖を示すが、固形腫瘍を処置するため
に使用される場合、制限された抗腫瘍効果を一様に示した。ＣＡＲ分子の一部としてＣＤ
２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含めるよりむしろ、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０か
ら構成されるキメラ共刺激分子融合共刺激分子（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０；「ＭＣ」）は、
ＣＡＲ−Ｔ細胞において発現される場合に増殖および生存を駆動し得る、ヒトＴ細胞にお
ける広い共刺激経路（例えば、ＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫ、Ａｋｔ、ＪＮＫ）を活性化する。
非常に強力なＭＣを使用できるＣＡＲの安全性を担保するために、ｉカスパーゼ−９安全
スイッチ（ｉＣ９）を組み込んで、小分子二量体化薬剤rimiducid（ＡＰ１９０３）の滴
定を介して、ＣＡＲ Ｔ細胞の完全なまたは部分的いずれかの排除を可能にした。この安
全スイッチは、rimiducid注入後にＴ細胞を迅速に一掃し、サイトカインレベルを低下さ
せる。rimiducidの滴定は、ＣＡＲ−Ｔ細胞機能をなお保った部分的Ｔ細胞排除を可能に
した。
レトロウイルスおよび形質導入： 抗ＣＤ３４ ＱＢＥｎｄ−１０最小エピトープ、
ＣＤ８ストークおよび膜貫通領域およびＣＤ３ζ細胞質ドメインを含む、ＣＤ１９（ＦＭ
Ｃ６３）およびＨｅｒ２（ＦＲＰ５）に対して特異的な一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦ
ｖ）を含むＣＡＲ分子を、誘導性キメラカスパーゼ−９コードポリヌクレオチドとインフ
レームでクローニングした。ＣＤ２８共刺激ドメイン、またはＭｙＤ８８、ＣＤ４０もし
くはＭｙＤ８８／ＣＤ４０を含むさらなる構築物を作製した（図３７）。Ｔ細胞を、ＥＧ
ＦＰルシフェラーゼ（増強された緑色蛍光タンパク質ルシフェラーゼ）で形質導入して、
インビボ増殖をモニターした。ＰＢＭＣをαＣＤ３およびαＣＤ２８抗体で活性化し、レ
トロウイルスで形質導入した。１０日後、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ３４抗体を使用し
て、形質導入を測定した。
共培養アッセイ： ＣＡＲベクターで形質導入したＴ細胞を、外因性ＩＬ−２の非存在
下で、ＧＦＰ発現ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉリンパ腫またはＨｅｒ２＋ ＳＫ−ＢＲ−３乳が
ん細胞株と一緒に共培養した。ＥＬＩＳＡを使用して４８時間でサイトカイン生成を評価
した。腫瘍およびＴ細胞の数を、１０日目にフローサイトメトリーおよび細胞カウンティ
ングを使用して測定した。
動物モデル：
ＣＤ１９：５×１０５ Ｒａｊｉ腫瘍細胞を、ＮＳＧマウスへとｉ．ｖ．注射した。３
日目に、ＣＤ１９ ＣＡＲ改変Ｔ細胞を、ｉ．ｖ．注射し、バイオルミネッセンス（ＢＬ
Ｉ）を、ＩＶＩＳイメージングによって１週間に１回を基本に、腫瘍またはＴ細胞のいず
れかに関して測定した。＞２０％体重減少のマウスを、５ｍｇ／ｋｇ rimiducidでｉ．
ｐ．処置した。
ｉＣ９滴定： ＮＳＧマウスに、上記のようにＲａｊｉ腫瘍を移植し、次いで、５×１
０６ ＣＡＲ改変Ｔ細胞をｉ．ｖ．投与した。１５％体重減少後に、マウスを、対数用量
滴定（０．０００５〜５ｍｇ／ｋｇ）を使用して、rimiducidでｉ．ｐ．処置した。
Ｈｅｒ２：１×１０６ ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍細胞を、ＮＳＧマウスにｓ．ｃ．注射した
。７日後に、マウスをＣＡＲ改変Ｔ細胞のｉ．ｔ．注射で処置した。腫瘍成長を、カリパ
ス（２〜３日）およびＢＬＩ（１週間に１回）によって測定した。Ｔ細胞増殖ＢＬＩを、
ＩＶＩＳによって測定した。
ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）共刺激
図３８は、Ｈｅｒ２ ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＭＣ共刺激のアッセイの結果を提供する
。Ａ）ｉＣａｓｐ９−Ｈｅｒ２．ζ−ＭＣ ＣＡＲ構築物での初代Ｔ細胞の形質導入およ
び検出。Ｂ）ＣＡＲ−Ｔ細胞とＨｅｒ２＋ ＳＫ−ＢＲ−３−ＧＦＰ腫瘍細胞（１：１比
）とを混合して４８時間後の共培養実験（ｎ＝４）からのＩＬ−２生成。ＣおよびＤ）培
養の１０日後の異なるＣＡＲ構築物での共培養実験からのＴ細胞およびＳＫ−ＢＲ−３−
ＧＦＰ腫瘍細胞の数。Ｅ）培養して１０日後のＳＫ−ＢＲ−３−ＧＦＰに対する共培養ア
ッセイにおいて、ＣＤ４０のみ、ＭｙＤ８８のみまたはＭＣでのＣＡＲ−Ｔ細胞共刺激を
比較する腫瘍細胞排除の効力。Ｆ）示された共刺激ドメインを有する構築物を使用する共
培養アッセイからのＩＬ−２生成。＊Ｐ値≦０．０１。
ＭＣは、Ｈｅｒ２ ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力をインビボで増強する
図３９は、種々のＨｅｒ−２特異的ＣＡＲ構築物を使用するマウスインビボ効力アッセ
イの結果を提供する。Ａ）Ｔ細胞を、Ｈｅｒ２．ζ、Ｈｅｒ２．２８．ζまたはＨｅｒ２
．ζ−ＭＣ ＣＡＲで形質導入し、ＮＳＧマウス（ｎ＝５）に移植したルシフェラーゼ発
現ｓ．ｃ． Ｈｅｒ２＋ ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍へと直接注射した。腫瘍細胞のバイオルミ
ネッセンス（ＢＬＩ）を、ＩＶＩＳによって測定した。腫瘍サイズ（Ｂ）を、カリパスに
よって測定し、生存率（Ｃ）を、７５日間にわたって計算した。Ｄ）Ｔ細胞を、その後、
ＣＡＲおよびルシフェラーゼで共形質導入し、ＮＳＧマウス（ｎ＝５）へと移植したｓ．
ｃ． Ｈｅｒ２＋ ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍へと直接注射した。Ｅ）ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖を、
ＩＶＩＳイメージングを使用して目的領域ＲＯＩによって計算した。Ｆ）腫瘍サイズを、
カリパス測定値によって計算した。それは、各処置群における個々のマウスを示す。＊Ｐ
値≦０．０５。
ＭＣは、インビボでＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を増強する
図４０は、種々のＣＤ１９特異的ＣＡＲ構築物を使用するマウスインビボ効力アッセイ
の結果を提供する。Ａ）ＮＳＧマウス（ｎ＝５／群）に、Ｒａｊｉ−ルシフェラーゼ腫瘍
細胞を移植し、次いで、非形質導入（ＮＴ）またはｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ ＣＡＲ
改変Ｔ細胞で３日目に処置した。腫瘍成長を、ＩＶＩＳイメージングによって測定し、全
身ＢＬＩによって計算した（Ｂ）。Ｃ）（Ａ）のカプラン・マイアー分析。ｓＣＲＳの客
観的証拠において、rimiducidを投与した（赤いボックス、パネルＡ）ところ、２４時間
以内にサイトカインの正常化および腫瘍コントロールを損なうことなく臨床的ｓＣＲＳの
完全な解決がもたらされた（示さず）。
rimiducidでの誘導性キメラカスパーゼ−９安全スイッチを使用できるＣＡＲの滴定
図４１は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ構築物およびカスパーゼ−９安全スイッチを含むマウ
スインビボアッセイの結果を提供する。ＡおよびＢ）ＮＳＧマウス（ｎ＝５／群）に、Ｃ
Ｄ１９＋ Ｒａｊｉリンパ腫細胞を移植し、５×１０６ ｉＣ９−ＣＤ１９．ζ−ＭＣ／
ルシフェラーゼ形質導入Ｔ細胞で３日目に処置した。６日後に、マウスを、rimiducidの
対数希釈物（０．００００５〜５ｍｇ／ｋｇ）でｉ．ｐ．処置した。ＣＡＲ−Ｔ細胞のＢ
ＬＩを、rimiducid処置の前、注射後２４時間および４８時間で評価した。Ｃ）血清サイ
トカインレベルを、rimiducidの投与前（黒線）および投与の２４時間後（橙色の線）に
、各群から測定した。＊Ｐ値≦０．０１。
まとめ
これらのアッセイでは、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０（「ＭＣ」）が、ＣＤ１９＋「液性
」腫瘍およびＨｅｒ２＋「固形」腫瘍の両方を標的化するＣＡＲ改変Ｔ細胞において強力
な共刺激を提供するように相乗作用することが見出された。このＭＣ共刺激は、標準的な
共刺激分子（例えば、ＣＤ２８）を含むコントロールＣＡＲと比べて、増大したＴ細胞増
殖、サイトカイン生成および抗腫瘍効力をインビボで生じた。誘導性キメラカスパーゼ−
９ポリペプチドもまた発現する構築物は、高レベルで治療の中止を可能にし、万能で、滴
定可能な細胞治療安全スイッチと、ＭＣ駆動ＣＡＲ Ｔ細胞とを組み合わせ、インビボ腫
瘍モデルにおいて腫瘍コントロールの喪失なしに、サイトカインレベルのrimiducid依存
性正常化を可能にした。
（実施例２０：複合レトロウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞におけるＭｙＤ８
８／ＣＤ４０キメラ刺激分子活性）
例えば、細胞質形態（ＭＣ）または膜標的化形態（ｍｙｒ−ＭＣ）のいずれかにあるキ
メラ刺激分子ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）のシグナル伝達活性および物理的発現を比較
し、多量体化リガンド結合ＦＫＢＰ１２領域を含む誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０分子とも
比較した。ＭＣの高レベル発現は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡ
配列に対して５’側であろうと３’側であろうと、実質的な基底活性を生成するために十
分であった。膜局在は、シグナル伝達活性を強力に誘導したが、定常状態のＭＣタンパク
質発現を減少させ得る。ＭＣの３’側でのＦＫＢＰ１２融合物は、基底ＭＣ活性を減弱し
、ＦＫＢＰリガンドとの二量体化は、ｉＭＣ発現を増大させることなく、シグナル伝達活
性を強力に誘導した。
方法
ＤＮＡ構築物のまとめ オペロンとしてＣＡＲおよび／またはＭＣおよび／または誘
導性カスパーゼ−９（ｉＣ９）をコードする遺伝子を形質導入し得るレトロウイルスを生
成するために使用される組換えＤＮＡベクターは、図４８および４９に模式的に概説され
る。各構築物は、ｐＳＦＧレトロウイルスベクター骨格を使用した：
ｐＢＰ０８４４ − ｐＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９−ζ−Ｐ２Ａ−ＭＣ

この構築物は、短い５’ ＭＬＥＭＬＥリンカー（配列番号３４２）を有するヒトＦＫ
ＢＰ１２のＦ３６Ｖ変異体に対して３’側にあるＳＧＧＧＳＧリンカー（配列番号１１９
）と融合されたヒトカスパーゼ−９をコードする。Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ ウイル
ス由来のＴ２Ａ共翻訳切断配列は、ヒンジおよび膜貫通ドメインと融合しその細胞質ドメ
イン上でＴ細胞レセプターＣＤ３複合体のζ鎖とさらに融合した、ＣＤ１９を標的化する
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）から、誘導
性キメラカスパーゼポリペプチド（ｉＣ９）をコードする配列を分断する。ブタテシオウ
イルス−１由来のＰ２Ａ共翻訳切断配列は、ＣＡＲを、ヒトＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ
）融合タンパク質から分断する。
ｐＢＰ０４１４ − ｐＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９−ζは、ｐＢＰ０８
４４に同一であるが、ＣＡＲに対して３’側にＰ２Ａ配列およびＭＣ配列を含まない。
ｐＢＰ１０９９ − ｐＳＦＧ−ＣＤ１９−ζは、ＣＤ１９ ＣＡＲを、以下で論じら
れるプラスミドのものと合うように改変されたとその５’翻訳開始部位とともにコードす
る。これは、ＭＣ機能に関する陰性コントロールとして働いた。
ｐＢＰ１１５１ − ｐＳＦＧ−ＭＣ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９−ζ−Ｐ２Ａは、Ｔ２Ａ共翻
訳切断部位によって分断された２つのポリペプチドを有するＣＡＲ構築物に対して５’側
にＭＣ（ヒトＭｙＤ８８−ＣＤ４０融合物）をコードする。
ｐＢＰ１１５２ − ｐＳＦＧ−ＭｙｒＭＣ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９−ζ−Ｐ２Ａは、ヒト
ｃ−Ｓｒｃに由来する５’ミリストイル化標的化配列を有するＭＣをコードする。ＭＣの
Ｎ末端ミリストイル化は、形質導入細胞の形質膜においてシグナル伝達分子の蓄積をもた
らすと推測される。このＣＡＲ配列は、ｐＢＰ１１５１と同一である。
ｐＢＰ０７７４ − ｐＳＦＧ−ｉＭＣ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９−ζ−Ｐ２Ａは、ヒトＦＫ
ＢＰ１２ｖ３６の２個のタンデムコピーとのカルボキシ末端融合物としてＭＣの可溶性バ
ージョンとしてＭＣをコードし、ＭＣをrimiducid誘導性（ｉＭＣ）にする。
ＭＣ発現構築物によって生成される共刺激活性
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、上記で概説されるＳＦＧベースの組換えレトロウイルス構築
物で、組換えＲＮＡをレトロウイルスとしてパッケージするために必要なｇａｇ−ｐｏｌ
およびｅｎｖ遺伝子をコードするヘルパープラスミドｐＢＰ００４９およびｐＢＰ０１７
５とともに形質導入した。これらレトロウイルスを、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ドナー由来
初代Ｔ細胞へと形質導入した。形質導入Ｔ細胞からのサイトカイン生成を、次いで、構築
物中のＭＣ対立遺伝子（存在する場合には）によって付与された共刺激シグナル伝達活性
の程度を評価するために使用した。
形質導入の３日後に、Ｔ細胞を分け、一方の集団を２ｎＭ rimiducidで処理した。薬
物処理の２４時間後または４８時間後に、培地上清のアリコートを採取し、Ｔ細胞由来サ
イトカインであるＩＬ−２およびＩＬ−６を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）によって定量した。ＩＬ−２生成は、代表的には、ＮＦ−ＡＴ経路を介する抗原
レセプターから（シグナル１）およびＮＦ−κＢ活性化によって最も単純には評価される
共刺激シグナルからの両方のシグナル伝達を要する。この実験では、シグナル１を、Ｔ細
胞の最初の活性化によって提供した。構築物ｐＢＰ１０９９またはｐＢＰ０４１４で形質
導入したＴ細胞が、ＩＬ−２生成をほとんど支援せず、全く形質導入されなかった（しか
し最初に活性化された）Ｔ細胞も支援しないことが見出された（図５０）。対照的に、ｐ
ＢＰ０８４４を有する細胞は、Ｔ細胞由来の媒体を交換した２４時間後に測定可能なＩＬ
−２生成を有した。rimiducid処理は、２４時間でこれら細胞からのＩＬ−２生成をごく
僅か低減した。４８時間までには、ＩＬ−２生成は、１×１０６ 細胞／ｍＬから２ｎｇ
／ｍＬ超で確実であった。この「基底」活性は、４８時間で、ｉカスパーゼ−９でのアポ
トーシスのrimiducid媒介性活性化によって劇的に低下した。
匹敵するＭＣ分子をコードするが、バイシストロンメッセージの５’末端で発現される
ＢＰ１１５１（ＭＣ−ＣＡＲ）での形質導入はまた、２４時間および４８時間で、有意な
基底ＩＬ−２生成を有した。rimiducid処理は、ｉＣ９がこの構築物中に含まれなかった
ので、生成に有意に影響を及ぼさなかった。ＢＰ１１５２（ＭｙｒＭＣ−ＣＡＲ）形質導
入は、非常にロバストなＩＬ−２生成を支援し、繰り返しになるがrimiducid処理とは関
係なく、ＢＰ１１５１（ＭＣ−ＣＡＲ）より顕著に上昇させた。この構築物は、ミリスト
イル化ＭＣおよび従って、膜局在化ＭＣを含み、これは、そのシグナル伝達潜在性をおそ
らく上昇させた。
顕著に異なる基底活性を、細胞をｉＭＣコードＢＰ７７４で形質導入した場合に観察し
た。「基底活性」（rimiducidなしでのＩＬ−２分泌）は最小であったが、rimiducid媒介
性ＭＣ凝集から、高レベルＩＬ−２生成によって認められるとおりのロバストなシグナル
伝達が明らかになった。
炎症性サイトカインＩＬ−６は、持続性の共刺激シグナル伝達（シグナル２）を要する
が、抗原レセプター媒介性ＮＦ−ＡＴ活性の必要性が低下した。ＩＬ−６生成は、形質導
入細胞におけるＭＣ活性の独立した評価である。全体的に、ＭＣ発現は、形質導入された
ヒトＴ細胞におけるＩＬ−２レベルで有したのと同様に、ＩＬ−６生成に対して類似の効
果を有した。ＩＬ−６分泌は、ＭＣ形質導入の非存在下では無視できる程度であった（図
５１、非形質導入細胞またはＢＰ１０９９もしくはＢＰ０４１４で形質導入された細胞）
。実質的な「基底」生成は、ＢＰ０８４４で形質導入された細胞から２４時間または４８
時間で観察された。これは、ｉカスパーゼ９（ｉＣ９）がrimiducidによって活性化され
た場合には、劇的に抑えられた。実質的なＩＬ−６生成が、ＢＰ１１５１によってコード
される非標的化ＭＣ構築物（ＭＣ−ＣＡＲ）によって誘導されたが、ＩＬ−６は、ＭＣが
ミリストイル化標的化ドメインを含んだ（ＢＰ１１５２）（ＭｙｒＭＣ−ＣＡＲ）場合に
は、これらのレベルを超えて高く上昇した。両方のＭＣバージョン（これらは、ＦＫＢＰ
を欠いている）において、ＩＬ−６生成は、予測どおり、rimiducid非依存性であった。
低いが検出可能な基底共刺激活性（約１１０ｐｇ／ｍｌ〜１０６／ｍＬ Ｔ細胞）は、基
底ＭＣ機能と一致して、ＢＰ０７７４形質導入で観察された。２ｎＭ rimiducidでの二
量体化は、ＭＣ活性およびＩＬ−６分泌を、誘導性キメラカスパーゼ−９構築物ＢＰ８４
４によって駆動されるものに類似のレベルへとロバストに活性化した。
まとめ
この実施例は、ＭＣキメラ共刺激分子が有意なサイトカイン生成を支援することを実証
するデータを提供する。ＢＰ１１５２（ＭｙｒＭＣ−ＣＡＲ）で形質導入したＴ細胞から
の高いサイトカイン放出は、高レベルの定常状態タンパク質発現と相関しなかった。ミリ
ステートタグ化を介した膜への局在は、ＭＣシグナル伝達を大いに増強するようである。
完全なＭｙｒ−ＭＣ発現は、抽出物調製の間に膜タンパク質の不完全な可溶化に起因して
、観察されない可能性がある。ＭｙＤ８８およびＣＤ４０は、形質膜に天然に位置してい
るので、それらの分解をコントロールする因子はまた、膜に局在し、低下したＭｙｒ−Ｍ
Ｃ発現をもたらし得る。この低下した、Ｍｙｒ−ＭＣの観察された発現はまた、形質導入
された集団内の個々の細胞に対して選択される高いＭＣ活性に起因し得る。ｐＢＰ１１５
２（ＭｙｒＭＣ−ＣＡＲ）は、減少した、観察された形質導入効率および全体的な細胞生
存率を有した。形質導入された細胞は、ＢＰ１１５１（ＭＣ−ＣＡＲ）で形質導入された
細胞より、その同じＣＡＲの発現が低かった。これはおそらく、ＢＰ１１５２（ＭｙｒＭ
Ｃ−ＣＡＲ）においてより低い組換え遺伝子発現の選択を示す。高い発現に対する提唱さ
れる選択の原は、Ｔ細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）であり得る。高レベルＭＣシグ
ナル伝達は、おそらくフィードバックし得、ＭＣタンパク質発現を負に調節し得る。Ｍｙ
ｒ−ＭＣは、高活性および低タンパク質発現を有する。さらに、ＢＰ０７７４によってコ
ードされるｉＭＣで形質導入されるＴ細胞は、ＭＣ活性が遙かに高いにも拘わらず、rimi
ducid処理での可溶性ｉＭＣの発現を低下させた。非局在化ｉＭＣ 対 ＭＣにおける「
基底」ＭＣ活性の減少は、ＢＰ１１５１（ＭＣ−ＣＡＲ）形質導入細胞およびＢＰ０７７
４形質導入細胞を比較する場合に観察されるタンパク質発現のより穏やかな減少より大き
いようであった。ＦＫＢＰ１２融合物は、自発的ＭＣ活性に負に影響を及ぼすようであっ
た。
（実施例２１：代表的実施形態）
本明細書以下で、上記技術のある特定の実施形態の例が提供される。
Ａ１．キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここ
で該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまた
はＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞
外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子；
および（ｖ）抗原認識部分を含む、核酸。
Ａ１．１．前記キメラ抗原レセプターは、ストークポリペプチドをさらに含む、実施形
態Ａ１に記載の核酸。
Ａ２．前記キメラ抗原レセプターは、ポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｖ）を、
該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）
、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）という順序で含むポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ１．１
のいずれかに記載の核酸。
Ａ３．前記キメラ抗原レセプターは、ポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｖ）を、
該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｖ）、（ｉ）、（ｉｉｉ
）、（ｉｉ）、（ｉｖ）という順序で含むポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ１．１
のいずれかに記載の核酸。
Ａ４．保留（reserved）。
Ａ５．保留。
Ａ６．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施
形態Ａ１〜Ａ３のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ７．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ６の
いずれか１つに記載の核酸。
Ａ８．前記Ｔ細胞活性化分子は、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サ
ブユニットポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ６のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ９．前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ａ１〜Ａ８のいず
れか１つに記載の核酸。
Ａ１０．前記抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実
施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ１１．前記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、
メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より
選択される抗原に結合する、実施形態Ａ１〜Ａ１０のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ１２．前記抗原認識部分は、ＰＳＣＡに結合する、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれか
１つに記載の核酸。
Ａ１３．前記抗原認識部分は、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれか
１つに記載の核酸。
Ａ１４．前記抗原認識部分は、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ａ１
〜Ａ１１のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ１５．前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ａ１〜Ａ１４
のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ１６．前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ａ１〜Ａ１６のいずれ
か１つに記載の核酸。
Ａ１７．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列、またはその
機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ１８．前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号１４７のアミノ酸配列、また
はその機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の核酸
。
Ａ１９．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号１４９のアミノ酸配列、または
その機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ２０．前記抗原認識部分は、ＣＤ１９に結合する一本鎖可変フラグメントである、実
施形態Ａ１〜Ａ１９のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ２０．１．前記抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する一本鎖可変フラグメン
トである、実施形態Ａ１〜Ａ１９のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ２１．前記ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１５１のアミノ酸配列、またはその機
能的フラグメントを有する、含む（ｈａｓ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、実施形態Ａ１〜Ａ２
０．１のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ２２．前記膜貫通領域ポリペプチドは、配列番号１４３のアミノ酸配列、またはその
機能的フラグメントを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ２３．保留。
Ａ２４．保留。
Ａ２５．前記核酸は、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列
を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか１つに記載の核酸。
Ａ２６．前記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれ
か１つに記載の核酸。
Ａ２７．前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態Ａ２６に
記載の核酸。
Ａ２８．前記レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスベクターである、実施
形態Ａ２７に記載の核酸。
Ａ２９．前記レトロウイルスベクターは、ＳＦＧベクターである、実施形態Ａ２８に記
載の核酸。
Ａ３０．前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである、実施形態Ａ２６に
記載の核酸。
Ａ３１．前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態Ａ２６に
記載の核酸。
Ａ３１．１．前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイ
ルス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態Ａ２６に記載の核
酸。
Ａ３１．２．前記核酸は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、もしくはバイ
オリスティックのために調製されるかまたはそのためにデザインされたベクターの中に存
在するか、あるいは化学的脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、もしくはポリプレックスに結
合されるかまたはその中に組み込まれる、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の
核酸。
Ａ３２．前記核酸は、プラスミド内に含まれる、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つ
に記載の核酸。
Ａ３２．１．実施例１８のヌクレオチド配列を含むか、または実施例１８のキメラ抗原
レセプターポリペプチドをコードする、実施形態Ａ１〜Ａ３２のいずれか１つに記載の核
酸。
Ａ３３．実施形態Ａ１〜Ａ３２．１のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる
、キメラ抗原レセプターポリペプチド。
Ａ３４．実施形態Ａ１〜Ａ３２．１のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトま
たは形質導入された、改変された細胞。
Ａ３４．１．前記キメラ抗原レセプターは、Ｔ細胞活性化分子を含まず、Ｔ細胞活性化
分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸をさらに含む、実施形態Ａ３４に記載の改
変された細胞。
Ａ３４．２．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ａ３４
．１に記載の改変された細胞。
Ａ３５．前記改変された細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、またはＮ
Ｋ細胞である、実施形態Ａ３４〜Ａ３４．２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ３６．前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ａ３４〜Ａ３４．２のいずれか１つに記
載の改変された細胞。
Ａ３７．前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態Ａ３４
〜Ａ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ３８．前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態Ａ
３４〜Ａ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ３９．前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態Ａ
３４〜Ａ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ４０．前記細胞は、末梢血単核球から得られるかまたは末梢血単核球から調製される
、実施形態Ａ３４〜Ａ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ４２．前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態Ａ３４〜Ａ４０のいずれか１つに記載
の改変された細胞。
Ａ４２．１．前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリステ
ィック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートラン
スフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用
して、前記核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態Ａ３
４〜Ａ４２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ４３．被験体において標的細胞の集団または組織への細胞媒介性免疫応答を刺激する
ための方法であって、該方法は、実施形態Ａ３４〜Ａ４２．１のいずれか１つに記載の改
変された細胞を該被験体に投与する工程を包含し、ここで抗原認識部分は、該標的細胞上
の抗原に結合する、方法。
Ａ４４．前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ａ４３に記載の方法。
Ａ４５． 前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与
後に減少する、実施形態Ａ４３またはＡ４４に記載の方法。
Ａ４６．前記改変された細胞の投与前に前記被験体から得られた第１のサンプル中の標
的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られ
た第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプル
における標的細胞の数または濃度と比べて、該第２のサンプルにおける標的細胞の数また
は濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、実施形態Ａ４３〜Ａ４５のいずれか
１つに記載の方法。
Ａ４７．前記第２のサンプルにおける標的細胞の濃度は、前記第１のサンプルにおける
標的細胞の濃度と比べて減少する、実施形態Ａ４６に記載の方法。
Ａ４８．前記第２のサンプルにおける標的細胞の濃度は、前記第１のサンプルにおける
標的細胞の濃度と比べて増大する、実施形態Ａ４６に記載の方法。
Ａ４９．さらなる用量の改変された細胞が、前記被験体に投与される、実施形態Ａ４３
〜Ａ４８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ５０．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、実施形態Ａ３
４〜Ａ４２．１のいずれか１つに記載の改変された細胞の有効量を該被験体に投与する工
程を包含する、方法。
Ａ５１．標的抗原の上昇した発現と関連する疾患もしくは状態を有する被験体を処置す
るための方法であって、該方法は、実施形態Ａ３４〜Ａ４２．１のいずれか１つに記載の
改変された細胞の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
Ａ５２．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態Ａ５１に記載の方法。
Ａ５３．前記改変された細胞が、自己のＴ細胞である、実施形態Ａ４３〜Ａ５２のいず
れか１つに記載の方法。
Ａ５４．前記改変された細胞が、同種異系のＴ細胞である、実施形態Ａ４３〜Ａ５２の
いずれか１つに記載の方法。
Ａ５５．被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であって、該方法は、実
施形態Ａ３４〜Ａ４２．１のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与する
工程を包含し、ここで該抗原認識部分は、該腫瘍上の抗原に結合する、方法。
Ａ５６．前記被験体は、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ａ４３〜Ａ５５のい
ずれか１つに記載の方法。
Ａ５７．前記被験体は、がんを有する、実施形態Ａ４３〜Ａ５６のいずれか１つに記載
の方法。
Ａ５８．前記被験体は、固形腫瘍または白血病を有する、実施形態Ａ４３〜Ａ５７のい
ずれか１つに記載の方法。
Ａ５９．前記改変された細胞は、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、実施形態Ａ４
３〜Ａ５８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６０．前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、実施形態Ａ４３〜Ａ５９のいず
れか１つに記載の方法。
Ａ６１．前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、実施形態Ａ５７に記載
の方法。
Ａ６２．前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態Ａ４３〜Ａ５５のい
ずれか１つに記載の方法。
Ａ６３．前記被験体は、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断
されている、実施形態Ａ４３〜Ａ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６４．前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されて
いる、実施形態Ａ４３〜Ａ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６５．前記患者は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）また
は他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨
細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ａ４３〜Ａ５５のい
ずれか１つに記載の方法。
Ａ６６．前記疾患または状態は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（
ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫
症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）もしくはＩＰＥＸ様、ウィ
スコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ
８不全症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ ２欠損症、Ｘ
連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症
候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天
性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、お
よび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ａ４３〜Ａ６５のいずれか１つに記
載の方法。
Ａ６７．さらなる用量の前記改変された細胞が前記被験体に投与されるべきかどうかを
決定する工程をさらに包含する、実施形態Ａ４３〜Ａ６６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６８．さらなる用量の前記改変された細胞を前記被験体に投与する工程をさらに包含
し、ここで前記疾患もしくは状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検
出される、実施形態Ａ４４〜Ａ６７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６９．被験体において状態もしくは疾患の有無またはステージを同定する工程；およ
び
該被験体において同定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、実施形
態２８〜３５のいずれか１つに記載の改変された細胞を投与する指示、該改変された細胞
のその後の投与量を維持する指示、または該患者に投与される該改変された細胞のその後
の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに包含する、実施形態Ａ４４〜Ａ６７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ７０．前記状態は白血病である、実施形態Ａ４４〜Ａ７０のいずれか１つに記載の方
法。
Ａ７１．前記被験体は、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプス
タイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）、およびパピ
ローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、ま
たは肺炎、結核、および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されてい
るか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、および
アメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態
Ａ４４〜Ａ７０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ７２．前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、
実施形態Ａ４４〜Ａ７１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ７３．前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、
実施形態Ａ３４〜Ａ４２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ７４．細胞においてキメラ抗原レセプターを発現するための方法であって、該方法は
、実施形態Ａ１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み
込まれる条件下で接触させ、それによって、該細胞は、該キメラ抗原レセプターを該組み
込まれた核酸から発現する工程を包含する、方法。
Ａ７５．前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態Ａ７４に記載
の方法。
Ａ７６．前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態Ａ７４に記載の
方法。
Ａ７７．前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペ
プチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、実施形態Ａ３４〜Ａ４２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ７７．１．以下を含む核酸：
キメラ抗原レセプターをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ
抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲド
メインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメイン
を欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；（ｉｖ）Ｔ細胞活性化分子；および（ｖ
）抗原認識部分を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−
９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド。
Ａ７７．２．少なくとも１つのプロモーターをさらに含む、実施形態Ａ７７．１に記載
の核酸。
Ａ７７．３．少なくとも２つのプロモーターをさらに含む、実施形態Ａ７７．１に記載
の核酸。
Ａ７７．４．１つのプロモーターは、前記第１および第２のポリヌクレオチドの両方に
作動可能に連結される、実施形態Ａ７７．１に記載の核酸。
Ａ７７．５．前記第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に、リンカ
ーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポ
リペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１および第２のポリヌクレオチドの翻訳産物
を分断する、実施形態Ａ７７．１に記載の核酸。
Ａ７７．６．前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態Ａ７７
．５に記載の核酸。
Ａ７７．７．前記核酸は、キメラ抗原レセプター、２Ａポリペプチド、およびカスパー
ゼ−９ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、実施形態Ａ７７．５に記載の核酸
。
Ａ７７．８．前記第１のポリヌクレオチドは、第１のプロモーターに作動可能に連結さ
れ、前記第２のポリヌクレオチドは、第２のプロモーターに作動可能に連結される、実施
形態Ａ７７．３に記載の核酸。
Ａ７７．９． ２つのＲＮＡ転写産物は、前記２つのポリヌクレオチドに相補的に生成
される、実施形態Ａ７７．２に記載の核酸。
Ａ７７．１０．実施形態Ａ７７．１〜Ａ７７．９のいずれか１つに記載の核酸でトラン
スフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
Ａ７８．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ａ７
７またはＡ７７．１０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ７９．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３、またはＡＰ２０１８７である、実施形
態Ａ７７〜７８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ８０．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表１の中のカスパーゼバリアントからな
る群より選択される、アミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである
、実施形態Ａ７７〜７９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ａ８１．前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペ
プチドを含むキメラカスパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む
、実施形態Ａ４４〜Ａ７１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ８２．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ａ８
１に記載の方法。
Ａ８３．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態
Ａ８１〜Ａ８２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ８４．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表１の中のカスパーゼバリアントからな
る群より選択される、アミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである
、実施形態Ａ８１〜Ａ８３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ８５．前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンドを該被験
体に投与する工程をさらに包含する、実施形態Ａ８１〜Ａ８４のいずれか１つに記載の方
法。
Ａ８６．前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含
む改変された細胞の数が減少する、実施形態Ａ８５に記載の方法。
Ａ８７．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、９０％
減少する、実施形態Ａ８６に記載の方法。
Ａ８８．前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、該被験体が有害な症候を経験
していることを決定する工程、および該有害な症候を減少または緩和するために前記リガ
ンドを投与する工程を包含する、実施形態Ａ８１〜Ａ８７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１．キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここで該キ
メラ刺激分子は、（ｉ）膜標的化領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲド
メインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ド
メインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、核酸。
Ｂ１．１． キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここ
で該キメラ刺激分子は、（ｉ）膜標的化領域；および（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドま
たはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを含む、核酸。
Ｂ１．２． キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ここ
で該キメラ刺激分子は、（ｉ）膜標的化領域；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを
欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、核酸。
Ｂ２．前記キメラ刺激分子は、ポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、該ポ
リペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）
という順序で含むポリペプチドである、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．２のいずれか１つに記載の
核酸。
Ｂ３．前記キメラ抗原レセプターは、ポリペプチドであって、領域（ｉ）〜（ｉｉｉ）
を、該ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって（ｉ）、（ｉｉｉ）、
（ｉｉ）という順序で含むポリペプチドである、実施形態Ｂ１〜Ｂ１．２のいずれか１つ
に記載の核酸。
Ｂ４．前記キメラ刺激分子は、Ｔ細胞活性化分子をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３の
いずれか１つに記載の核酸。
Ｂ５．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実施
形態Ｂ４に記載の核酸。
Ｂ６．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ｂ４に記載の
核酸。
Ｂ６．１．前記Ｔ細胞活性化分子は、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ
）サブユニットポリペプチドである、実施形態Ｂ４に記載の核酸。
Ｂ７．前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号１４７のアミノ酸配列、またはそ
の機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれか１つに記載の核酸。
Ｂ７．１．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列、またはそ
の機能的フラグメントを有する、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の核酸。
Ｂ８．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号１４９のアミノ酸配列、またはそ
の機能的フラグメントを有する、実施形態Ｂ１、またはＢ２〜Ｂ７のいずれか１つに記載
の核酸。
Ｂ９．前記ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１５１のアミノ酸配列、またはその機能
的フラグメントを含む、実施形態Ｂ６〜Ｂ８のいずれか１つに記載の核酸。
Ｂ１０．前記膜標的化領域は、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、プレニル化
領域、およびレセプターの膜貫通配列からなる群より選択される、実施形態Ｂ１〜Ｂ９の
いずれか１つに記載の核酸。
Ｂ１１．前記膜標的化領域は、ミリストイル化領域である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１０のい
ずれか１つに記載の核酸。
Ｂ１１．１．前記キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドは、二量体化または多
量体化分子結合領域を含まない、実施形態Ｂ１〜Ｂ１０のいずれか１つに記載の核酸。
Ｂ１２．前記核酸は、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列
を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１１．１のいずれか１つに記載の核酸。
Ｂ１３．前記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる、実施形態Ｂ１〜Ｂ１２のいずれ
か１つに記載の核酸。
Ｂ１４．前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｂ１３に
記載の核酸。
Ｂ１５．前記レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスベクターである、実施
形態Ｂ１４に記載の核酸。
Ｂ１６．前記レトロウイルスベクターは、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｂ１４に記
載の核酸。
Ｂ１７．前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｂ１３に
記載の核酸。
Ｂ１８．前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｂ１３に
記載の核酸。
Ｂ１８．１．前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイ
ルス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態Ｂ１３に記載の核
酸。
Ｂ１９．前記核酸は、プラスミド内に含まれる、実施形態Ｂ１〜Ｂ１２のいずれか１つ
に記載の核酸。
Ｂ２０．実施形態Ｂ１〜Ｂ１９のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる、キ
メラ刺激分子ポリペプチド。
Ｂ２１．実施形態Ｂ１〜Ｂ１９のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトまたは
形質導入された、改変された細胞。
Ｂ２２．前記改変された細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲ発
現細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態Ｂ２１に記載の改変された細胞。
Ｂ２３．前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ｂ２１に記載の改変された細胞。
Ｂ２４．前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態Ｂ２１
〜Ｂ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ２５．前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態Ｂ
２１〜Ｂ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ２６．前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態Ｂ
２１〜Ｂ２５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ２７．前記細胞は、末梢血単核球から得られるかまたは末梢血単核球から調製される
、実施形態Ｂ２１〜Ｂ２５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ２７．１．以下を含む改変された細胞：
ａ）核酸であって、ここで該核酸は、キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを
含み、ここで該キメラ刺激分子は、（ｉ）膜標的化領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチ
ドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉｉ）
ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、核酸；な
らびに
ｂ）キメラ抗原レセプター。
Ｂ２７．２．以下を含む改変された細胞：
ａ）核酸であって、ここで該核酸は、キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを
含み、ここで該キメラ刺激分子は、（ｉ）膜標的化領域；および（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリ
ペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを含む、核酸
；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプター。
Ｂ２７．３．以下を含む改変された細胞：
ａ）核酸であって、ここで該核酸は、キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドを
含み、ここで該キメラ刺激分子は、（ｉ）膜標的化領域；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外
ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、核酸；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプター。
Ｂ２８．前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態Ｂ２１〜Ｂ２７．３のいずれか１つに
記載の改変された細胞。
Ｂ２９．前記改変された細胞は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチド
をさらに含む、実施形態Ｂ２１〜Ｂ２８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３０．前記キメラ抗原レセプターは、抗原認識部分を含む、実施形態Ｂ２９に記載の
改変された細胞。
Ｂ３０．１．前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ｂ２１〜Ｂ３０のいずれか１つに記
載の改変された細胞。
Ｂ３０．２．前記改変された細胞は、Ｔ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチド
をさらに含む、実施形態Ｂ２１〜Ｂ２８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３０．３．前記改変された細胞は、Ｔ細胞レセプターベースのＣＡＲをコードするポ
リヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｂ２１〜２８のいずれか１つに記載の改変された
細胞。
Ｂ３０．４．改変された細胞は、前記Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベース
のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸でトランスフェクトまたは形質導入さ
れる、実施形態Ｂ３０．２またはＢ３０．３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３１．前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｂ２７．１ま
たはＢ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３１．１．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターは、腫瘍細胞上の抗原
に結合する、実施形態Ｂ２９〜Ｂ３１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３２．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターは、過剰増殖性疾患に関与
する細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｂ２９〜Ｂ３１．１のいずれか１つに記載の改変
された細胞。
Ｂ３３．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターは、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、
ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、および
Ｈｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より選択される抗原に結合する、実施形態Ｂ２９〜Ｂ３１．
１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３４．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターは、ＣＤ１９に結合する、
実施形態Ｂ２９〜Ｂ３３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３５．前記キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターは、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結
合する、実施形態Ｂ２９〜Ｂ３３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３６．前記抗原認識部分は、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ｂ２
９〜Ｂ３３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３６．１．前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリステ
ィック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートラン
スフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用
して、前記核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態Ｂ２
９〜Ｂ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ３７．被験体においてＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法
は、実施形態Ｂ２１〜Ｂ３６．１のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投
与する工程を包含する、方法。
Ｂ３７．１．前記改変された細胞は、標的細胞上の抗原に結合する、キメラ抗原レセプ
ターまたはＴ細胞レセプターを含む、実施形態Ｂ３７に記載の方法。
Ｂ３８．前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ｂ３７．１に記載の方法。
Ｂ３９． 前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与
後に減少する、実施形態Ｂ３７〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４０．前記改変された細胞の投与前に前記被験体から得られた第１のサンプル中の標
的細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られ
た第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプル
における標的細胞の数または濃度と比べて、該第２のサンプルにおける標的細胞の数また
は濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、実施形態Ｂ３７〜Ｂ３９のいずれか
１つに記載の方法。
Ｂ４１．前記第２のサンプルにおける標的細胞の濃度は、前記第１のサンプルにおける
標的細胞の濃度と比べて減少する、実施形態Ｂ４０に記載の方法。
Ｂ４２．前記第２のサンプルにおける標的細胞の濃度は、前記第１のサンプルにおける
標的細胞の濃度と比べて増大する、実施形態Ｂ４０に記載の方法。
Ｂ４３．さらなる用量の改変された細胞が、前記被験体に投与される、実施形態Ｂ４０
〜Ｂ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４４．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、実施形態Ｂ２
１〜Ｂ３６．１のいずれか１つに記載の改変された細胞の有効量を該被験体に投与する工
程を包含する、方法。
Ｂ４５．標的抗原の上昇した発現と関連する疾患もしくは状態を有する被験体を処置す
るための方法であって、該方法は、実施形態Ｂ２１〜Ｂ３６．１のいずれか１つに記載の
改変された細胞の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
Ｂ４６．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態Ｂ４５に記載の方法。
Ｂ４７．前記改変された細胞が、自己のＴ細胞である、実施形態Ｂ３７〜Ｂ４６のいず
れか１つに記載の方法。
Ｂ４８．前記改変された細胞が、同種異系のＴ細胞である、実施形態Ｂ３７〜Ｂ４６の
いずれか１つに記載の方法。
Ｂ５０．被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であって、該方法は、実
施形態Ｂ２９〜Ｂ３６．１のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与する
工程を包含し、ここで該抗原認識部分は、該腫瘍上の抗原に結合する、方法。
Ｂ５１．前記被験体は、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ｂ３７〜Ｂ５０のい
ずれか１つに記載の方法。
Ｂ５２．前記被験体は、がんを有する、実施形態Ｂ３７〜Ｂ５１のいずれか１つに記載
の方法。
Ｂ５３．前記被験体は、固形腫瘍または白血病を有する、実施形態Ｂ３７〜Ｂ５１のい
ずれか１つに記載の方法。
Ｂ５４．前記改変された細胞は、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、実施形態Ｂ３
７〜Ｂ５３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５５．前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、実施形態Ｂ３７〜Ｂ５４のいず
れか１つに記載の方法。
Ｂ５６．前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、実施形態Ｂ５２に記載
の方法。
Ｂ５７．前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態Ｂ３７〜Ｂ５１のい
ずれか１つに記載の方法。
Ｂ５８．前記被験体は、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断
されている、実施形態Ｂ３７〜Ｂ５１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５９．前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されて
いる、実施形態Ｂ３７〜Ｂ５１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６０．前記患者は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）また
は他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨
細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｂ３７〜Ｂ５１のい
ずれか１つに記載の方法。
Ｂ６１．前記疾患または状態は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（
ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫
症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）もしくはＩＰＥＸ様、ウィ
スコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ
８不全症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ ２欠損症、Ｘ
連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症
候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天
性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、お
よび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｂ３７〜Ｂ５１のいずれか１つに記
載の方法。
Ｂ６２．さらなる用量の前記改変された細胞が前記被験体に投与されるべきかどうかを
決定する工程をさらに包含する、実施形態Ｂ３７〜Ｂ６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６３．さらなる用量の前記改変された細胞を前記被験体に投与する工程をさらに包含
し、ここで前記疾患もしくは状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検
出される、実施形態Ｂ３７〜Ｂ６２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６４．被験体において状態もしくは疾患の有無またはステージを同定する工程；およ
び
該被験体において同定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、実施形
態Ｂ３１〜Ｂ３６のいずれか１つに記載の改変された細胞を投与する指示、該改変された
細胞のその後の投与量を維持する指示、または該患者に投与される該改変された細胞のそ
の後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに包含する、実施形態Ｂ３７〜Ｂ６３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６５．前記状態は白血病である、実施形態Ｂ３７〜Ｂ６４のいずれか１つに記載の方
法。
Ｂ６６．保留。
Ｂ６７．前記被験体は、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプス
タイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）、およびパピ
ローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、ま
たは肺炎、結核、および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されてい
るか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、および
アメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態
Ｂ３７〜Ｂ６４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６８．前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、
実施形態Ｂ３７〜Ｂ６７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６９．前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、
実施形態Ｂ２１〜Ｂ６７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ７０．細胞においてキメラ刺激分子を発現するための方法であって、該方法は、実施
形態Ｂ１〜Ｂ２０のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれ
る条件下で接触させ、それによって、該細胞は、該キメラ抗原レセプターを該組み込まれ
た核酸から発現する工程を包含する、方法。
Ｂ７１．前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態Ｂ７０に記載
の方法。
Ｂ７２．前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態Ｂ７０に記載の
方法。
Ｂ７３．前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペ
プチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに
含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３６．１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ７３．１．以下を含む核酸：
キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ刺激分
子は、（ｉ）膜標的化領域；（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠
いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠
いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに
多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−
９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド。
Ｂ７３．２．少なくとも１つのプロモーターをさらに含む、実施形態Ｂ７３．１に記載
の核酸。
Ｂ７３．３．少なくとも２つのプロモーターをさらに含む、実施形態Ｂ７３．１に記載
の核酸。
Ｂ７３．４． １つのプロモーターは、前記第１および第２のポリヌクレオチドの両方
に作動可能に連結される、実施形態Ｂ７３．１に記載の核酸。
Ｂ７３．５．前記第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に、リンカ
ーポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポ
リペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１および第２のポリヌクレオチドの翻訳産物
を分断する、実施形態Ｂ７３．１に記載の核酸。
Ｂ７３．６．前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態Ｂ７３
．５に記載の核酸。
Ｂ７３．７．前記核酸は、キメラ刺激分子、２Ａポリペプチド、およびカスパーゼ−９
ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、実施形態Ｂ７３．５に記載の核酸。
Ｂ７３．８．前記第１のポリヌクレオチドは、第１のプロモーターに作動可能に連結さ
れ、前記第２のポリヌクレオチドは、第２のプロモーターに作動可能に連結される、実施
形態Ｂ７３．３に記載の核酸。
Ｂ７３．９． ２つのＲＮＡ転写産物は、前記２つのポリヌクレオチドに相補的に生成
される、実施形態Ｂ７３．２に記載の核酸。
Ｂ７３．１０．実施形態Ｂ７３．１〜Ｂ７３．９のいずれか１つに記載の核酸でトラン
スフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
Ｂ７４．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｂ７
３またはＢ７３．１０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ７５．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３、またはＡＰ２０１８７である、実施形
態Ｂ７３、Ｂ７３．１またはＢ７４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ７６．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表１の中のカスパーゼバリアントからな
る群より選択される、アミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである
、実施形態Ｂ７３〜Ｂ７５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｂ７７．前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペ
プチドを含むキメラカスパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む
、実施形態Ｂ３７〜Ｂ７２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７８．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｂ７
７に記載の方法。
Ｂ７９．前記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態
Ｂ７７〜Ｂ７８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ８０．前記カスパーゼ−９ポリペプチドは、表１の中のカスパーゼバリアントからな
る群より選択される、アミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである
、実施形態Ｂ７７〜Ｂ７９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ８１．前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンドを該被験
体に投与する工程をさらに包含する、実施形態Ｂ７７〜Ｂ８０のいずれか１つに記載の方
法。
Ｂ８２．前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含
む改変された細胞の数が減少する、実施形態Ｂ８１に記載の方法。
Ｂ８３．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、９０％
減少する、実施形態Ｂ８２に記載の方法。
Ｂ８４．前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、該被験体が有害な症候を経験
していることを決定する工程、および該有害な症候を減少または緩和するために前記リガ
ンドを投与する工程を包含する、実施形態Ｂ７７〜Ｂ８３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１．細胞質キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプ
ロモーターを含む核酸であって、ここで該細胞質キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８
ポリペプチド；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域
を含む、核酸。
Ｃ２．キメラ刺激分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモー
ターを含む核酸であって、ここで該キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポ
リペプチド；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域
を含み、ただし、該キメラ刺激分子は、膜標的化領域を含まない、核酸。
Ｃ３．以下を含む、核酸：
ａ）細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結され
たプロモーターであって、ここで該細胞質キメラ刺激分子は、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドもしくはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８
８ポリペプチド；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域
を含む、プロモーター；ならびに
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド。
Ｃ４．以下を含む核酸：
ａ）キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロ
モーターであって、ここで該キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴ
ＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞
外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、ただし該キメラ刺激分
子は、膜標的化領域を含まない、プロモーター；ならびに
ｂ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド。
Ｃ５．以下を含む核酸：
ａ）細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結され
たプロモーターであって、ここで該細胞質キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプ
チドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）
ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、プロモー
ター；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド。
Ｃ６．以下を含む核酸：
ａ）キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロ
モーターであって、ここで該キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴ
ＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞
外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、ただし該キメラ刺激分
子は、膜標的化領域を含まない、プロモーター；ならびに
ｂ）キメラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド。
Ｃ７．以下を含む核酸：
ａ）細胞質キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結され
たプロモーターであって、ここで該細胞質キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプ
チドまたはＴＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）
ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、プロモー
ター；ならびに
ｂ）Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコード
する第２のポリヌクレオチド。
Ｃ８．以下を含む核酸：
ａ）キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロ
モーターであって、ここで該キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴ
ＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞
外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、ただし該キメラ刺激分
子は、膜標的化領域を含まない、プロモーター；ならびに
ｂ）Ｔ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコード
する第２のポリヌクレオチド。
Ｃ９．以下を含む核酸：
ａ）キメラ刺激分子をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロ
モーターであって、ここで該キメラ刺激分子は、（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴ
ＩＲドメインを欠いている切断型ＭｙＤ８８ポリペプチド；および（ｉｉ）ＣＤ４０細胞
外ドメインを欠いているＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、ただし該キメラ刺激分
子は、膜標的化領域を含まない、プロモーター；ならびに
ｂ）Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプター、またはキメ
ラ抗原レセプターをコードする第２のポリヌクレオチド；ならびに
ｃ）多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパー
ゼ−９ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド。
Ｃ１０．前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子
；および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ｃ５〜Ｃ６またはＣ８〜Ｃ９のいずれ
か１つに記載の核酸。
Ｃ１１．前記キメラ抗原レセプターは、共刺激分子をさらに含む、実施形態Ｃ１０に記
載の核酸。
Ｃ１２．前記共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および４−１ＢＢからなる群より選
択される、実施形態Ｃ１１に記載の核酸。
Ｃ１３．前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターを含
む、実施形態Ｃ１〜Ｃ１２のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ１４．前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターおよ
び前記第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第３のプロモーターを含む、実施
形態Ｃ９に記載の核酸。
Ｃ１５． １つのプロモーターは、前記第１および第２のポリヌクレオチドの両方に作
動可能に連結される、実施形態Ｃ１〜Ｃ８またはＣ１０〜Ｃ１４のいずれか１つに記載の
核酸。
Ｃ１６． １つのプロモーターは、前記第１、第２、および第３のポリヌクレオチドに
作動可能に連結される、実施形態Ｃ９、またはＣ１３〜Ｃ１４のいずれか１つに記載の核
酸。
Ｃ１７．前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間に、リンカ
ーポリペプチドをコードするリンカーポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該第３のポ
リペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌ
クレオチドの翻訳産物を分断する、実施形態Ｃ１５に記載の核酸。
Ｃ１８． ３つのポリヌクレオチドの間に、リンカーポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドをさらに含み、ここで該３つのポリヌクレオチドは、前記第１、第２、および
第３のポリヌクレオチドを含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後
に、該３つのポリヌクレオチドの翻訳産物を分断する、実施形態Ｃ１６に記載の核酸。
Ｃ１９．前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態Ｃ１７また
はＣ１８のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ２０．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実
施形態Ｃ１０〜Ｃ１９のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ２１．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ｃ１０〜Ｃ
１９のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ２２．前記Ｔ細胞活性化分子は、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）
サブユニットポリペプチドである、実施形態Ｃ１０〜Ｃ１９のいずれか１つに記載の核酸
。
Ｃ２３．前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｃ１０〜Ｃ２２
のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ２４．前記抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実
施形態Ｃ１０〜Ｃ２２のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ２５．前記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、
メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より
選択される抗原に結合する、実施形態Ｃ１０〜Ｃ２２のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ２６．前記抗原認識部分は、ＰＳＣＡに結合する、実施形態Ｃ１０〜Ｃ２２のいずれ
か１つに記載の核酸。
Ｃ２７．前記抗原認識部分は、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｃ１０〜Ｃ２２のいずれ
か１つに記載の核酸。
Ｃ２８．前記抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、実施形態Ｃ１０〜Ｃ２２
のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ２９．前記抗原認識部分は、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ｃ１
０〜Ｃ２２のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ３０．前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｃ１０〜Ｃ２
９のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ３１．前記膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域である、実施形態Ｃ１０〜Ｃ３０のい
ずれか１つに記載の核酸。
Ｃ３２．前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ｃ１０〜Ｃ３０のいず
れか１つに記載の核酸。
Ｃ３３．前記キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、実施形態Ｃ
３１〜Ｃ３２のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ３３．１．前記細胞質キメラ刺激分子は、多量体リガンド結合領域を含まないことを
条件とする、実施形態Ｃ１〜Ｃ３３のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ３４．前記切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号１４７のアミノ酸配列、また
はその機能的フラグメントを有する、実施形態Ｃ１〜Ｃ３３．１のいずれか１つに記載の
核酸。
Ｃ３５．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列、またはその
機能的フラグメントを有する、実施形態Ｃ１〜Ｃ３３．１のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ３６．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号１４９のアミノ酸配列、または
その機能的フラグメントを有する、実施形態Ｃ１〜Ｃ３５のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ３７．前記ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１５１のアミノ酸配列、またはその機
能的フラグメントを含む、実施形態Ｃ２１〜Ｃ３６のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ３８．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステ
ロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブ
ユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを
タンデムで含む一本鎖抗体、およびこれらの変異配列からなる群より選択されるリガンド
結合領域である、実施形態Ｃ３〜Ｃ４またはＣ９〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ３９．前記リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｃ３８に記載の
核酸。
Ｃ４０．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｃ３９に
記載の核酸。
Ｃ４１．前記ＦＫＢＰ領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｃ３８に記載の核酸。
Ｃ４２．前記リガンドは、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６アナログリガンド
である、実施形態Ｃ３〜Ｃ４またはＣ９〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ４３．前記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｃ３８
〜Ｃ４２のいずれか１つに記載の核酸。
Ｃ４４．前記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる、実施形態Ｃ１〜Ｃ４３のいずれ
か１つに記載の核酸。
Ｃ４５．前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである、実施形態Ｃ４４に
記載の核酸。
Ｃ４６．前記レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスベクターである、実施
形態Ｃ４５に記載の核酸。
Ｃ４７．前記レトロウイルスベクターは、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｃ４５に記
載の核酸。
Ｃ４８．前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである、実施形態Ｃ４４に
記載の核酸。
Ｃ４８．前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、実施形態Ｃ４４に
記載の核酸。
Ｃ５０．前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス
、およびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態Ｃ４４に記載の核酸。
Ｃ５１．前記核酸は、プラスミド内に含まれる、実施形態Ｃ１〜Ｃ４３のいずれか１つ
に記載の核酸。
Ｃ５２．実施形態Ｃ１〜Ｃ２、またはＣ３４〜Ｃ３６のいずれか１つに記載の核酸によ
ってコードされる、キメラ刺激分子ポリペプチド。
Ｄ１．実施形態Ｃ１〜Ｃ５１のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトまたは形
質導入された、改変された細胞。
Ｄ２．実施形態Ｃ１〜Ｃ２、またはＣ１０〜Ｃ５１のいずれか１つに記載の核酸でトラ
ンスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
Ｄ３．前記核酸は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含まず、キ
メラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないことを条件と
する、実施形態Ｃ１〜Ｃ２、またはＣ１０〜Ｃ５１のいずれか１つに記載の核酸でトラン
スフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
Ｄ４．実施形態Ｃ１〜Ｃ４、またはＣ１０〜Ｃ５１のいずれか１つに記載の核酸でトラ
ンスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
Ｄ５．前記核酸は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含まないこ
とを条件とする、実施形態Ｃ１〜Ｃ４、またはＣ１０〜Ｃ５１のいずれか１つに記載の核
酸でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
Ｄ５．１．前記細胞質キメラ刺激分子は、構成的に発現される、実施形態Ｄ１〜Ｄ５の
いずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ５．２．前記細胞質キメラ刺激分子は、構成的に活性である、実施形態Ｄ１〜Ｄ５．
２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ６．前記改変された細胞は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを
含む核酸をさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ５．２に記載の改変された細胞。
Ｄ７．前記改変された細胞は、キメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む核酸をさらに含み、ここで該キメラカスパーゼ−９ポリペプチドは、多
量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ３に
記載の改変された細胞。
Ｄ８．前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子；
および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ｄ６に記載の改変された細胞。
Ｄ９．前記キメラ抗原レセプターは、共刺激分子をさらに含む、実施形態Ｄ８に記載の
改変された細胞。
Ｄ１０．前記共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４−１ＢＢからなる群より選択
される、実施形態Ｄ９に記載の改変された細胞。
Ｄ１１．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子である、実
施形態Ｄ８〜Ｄ１０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ１２．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＣＤ３ζポリペプチドである、実施形態Ｄ８〜Ｄ１
０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ１３．前記Ｔ細胞活性化分子は、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）
サブユニットポリペプチドである、実施形態Ｄ８〜Ｄ１０のいずれか１つに記載の改変さ
れた細胞。
Ｄ１４．前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原に結合する、実施形態Ｄ８〜Ｄ１３の
いずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ１５．前記抗原認識部分は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原に結合する、実
施形態Ｄ８〜Ｄ１３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ１６．前記抗原認識部分は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、
メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、およびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群より
選択される抗原に結合する、実施形態Ｄ８〜Ｄ１３のいずれか１つに記載の改変された細
胞。
Ｄ１７．前記抗原認識部分は、ＰＳＣＡに結合する、実施形態Ｄ８〜Ｄ１３のいずれか
１つに記載の改変された細胞。
Ｄ１８．前記抗原認識部分は、ＣＤ１９に結合する、実施形態Ｄ８〜Ｄ１３のいずれか
１つに記載の改変された細胞。
Ｄ１９．前記抗原認識部分は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合する、実施形態Ｄ８〜Ｄ１３の
いずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ２０．前記抗原認識部分は、ウイルス抗原または細菌抗原に結合する、実施形態Ｄ８
〜Ｄ１３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ２１．前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態Ｄ８〜Ｄ２０
のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ２２．前記膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域である、実施形態Ｄ８〜Ｄ２１のいず
れか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ２３．前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態Ｄ８〜Ｄ２１のいずれ
か１つに記載の改変された細胞。
Ｄ２４．前記キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８ストーク領域をさらに含む、実施形態Ｄ
２２〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ２５．前記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステ
ロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブ
ユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを
タンデムで含む一本鎖抗体、およびこれらの変異配列からなる群より選択されるリガンド
結合領域である、実施形態Ｄ７に記載の改変された細胞。
Ｄ２６．前記リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｄ２５に記載の
改変された細胞。
Ｄ２７．前記ＦＫＢＰ１２領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態Ｄ２６に
記載の改変された細胞。
Ｄ２８．前記ＦＫＢＰ領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、実施形態Ｄ２５に記載の改変さ
れた細胞。
Ｄ２９．前記リガンドは、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６アナログリガンド
である、実施形態Ｄ２５〜Ｄ２８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ３０．前記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｄ２５
〜Ｄ２８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ３１．前記改変された細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−Ｔ細胞、ＴＣＲ発
現細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態Ｄ１〜Ｄ３０のいずれか１つに記載の改変され
た細胞。
Ｄ３２．前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態Ｄ１〜Ｄ３０のいずれか１つに記載の改
変された細胞。
Ｄ３３．前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態Ｄ１〜
Ｄ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ３４．前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態Ｄ
１〜Ｄ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ３５．前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態Ｄ
１〜Ｄ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ３６．前記細胞は、末梢血単核球から得られるかまたは末梢血単核球から調製される
、実施形態Ｄ１〜Ｄ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｄ３７．前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態Ｄ１〜Ｄ３０のいずれか１つに記載の
改変された細胞。
Ｄ３８．前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティッ
ク（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフ
ェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して
、前記核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態Ｄ１〜Ｄ
３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｅ１．被験体においてＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は
、実施形態Ｄ１〜Ｄ３８のいずれか１つに記載の改変された細胞の有効量を該被験体に投
与する工程を包含する、方法。
Ｅ２．前記改変された細胞は、標的細胞上の抗原に結合する、キメラ抗原レセプターま
たはＴ細胞レセプターを含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．前記標的細胞は、腫瘍細胞である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ４． 前記被験体における標的細胞の数または濃度は、前記改変された細胞の投与後
に減少する、実施形態Ｅ２〜Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５．前記改変された細胞の投与前に前記被験体から得られた第１のサンプル中の標的
細胞の数または濃度を測定する工程、該改変された細胞の投与後に該被験体から得られた
第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定する工程、および該第１のサンプルに
おける標的細胞の数または濃度と比べて、該第２のサンプルにおける標的細胞の数または
濃度の増大または減少を決定する工程を包含する、実施形態Ｅ２〜Ｅ４のいずれか１つに
記載の方法。
Ｅ６．前記第２のサンプルにおける標的細胞の濃度は、前記第１のサンプルにおける標
的細胞の濃度と比べて減少する、実施形態Ｅ５に記載の方法。
Ｅ７．前記第２のサンプルにおける標的細胞の濃度は、前記第１のサンプルにおける標
的細胞の濃度と比べて増大する、実施形態Ｅ５に記載の方法。
Ｅ８．さらなる用量の改変された細胞が、前記被験体に投与される、実施形態Ｅ１〜Ｅ
７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９．被験体に抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、該方法は、実施形態Ｅ１〜
Ｅ９のいずれか１つに記載の改変された細胞の有効量を該被験体に投与する工程を包含す
る、方法。
Ｅ１０．標的抗原の上昇した発現と関連する疾患もしくは状態を有する被験体を処置す
るための方法であって、該方法は、実施形態Ｄ１〜Ｄ３８のいずれか１つに記載の改変さ
れた細胞の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
Ｅ１１．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態Ｅ１０に記載の方法。
Ｅ１２．被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であって、該方法は、実
施形態Ｄ１〜Ｄ３８のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与する工程を
包含し、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含む、キメラ抗原レ
セプターまたはＴ細胞レセプターを含む、方法。
Ｅ１３．前記被験体は、腫瘍を有すると診断されている、実施形態Ｅ１〜Ｅ１２のいず
れか１つに記載の方法。
Ｅ１４．前記被験体は、がんを有する、実施形態Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の
方法。
Ｅ１５．前記被験体は、固形腫瘍または白血病を有する、実施形態Ｅ１〜Ｅ１２のいず
れか１つに記載の方法。
Ｅ１６．前記改変された細胞は、腫瘍浸潤リンパ球またはＴ細胞である、実施形態Ｅ１
〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７．前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、実施形態Ｅ１〜Ｅ１６のいずれ
か１つに記載の方法。
Ｅ１８．前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、実施形態Ｅ１４に記載
の方法。
Ｅ１９．前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態Ｅ１０〜Ｅ１８のい
ずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０．前記被験体は、任意の状態または幹細胞移植によって緩和され得る状態と診断
されている、実施形態Ｅ１０〜Ｅ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２１．前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されて
いる、実施形態Ｅ１０〜Ｅ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２２．前記被験体は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）ま
たは他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破
骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態Ｅ１０〜Ｅ１８の
いずれか１つに記載の方法。
Ｅ２３．前記疾患または状態は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（
ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫
症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）もしくはＩＰＥＸ様、ウィ
スコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ
８不全症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ ２欠損症、Ｘ
連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症
候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天
性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、お
よび大理石骨病からなる群より選択される、実施形態Ｅ１０〜Ｅ１８のいずれか１つに記
載の方法。
Ｅ２４．さらなる用量の前記改変された細胞が前記被験体に投与されるべきかどうかを
決定する工程をさらに包含する、実施形態Ｅ１〜Ｅ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２５．さらなる用量の前記改変された細胞を前記被験体に投与する工程をさらに包含
し、ここで前記疾患もしくは状態の症候は、症候の減少後になおも残っているかまたは検
出される、実施形態Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２６．被験体において状態もしくは疾患の有無またはステージを同定する工程；およ
び
該被験体において同定された状態または疾患の有無またはステージに基づいて、実施形
態Ｄ１〜Ｄ３８のいずれか１つに記載の改変された細胞を投与する指示、該改変された細
胞のその後の投与量を維持する指示、または該患者に投与される該改変された細胞のその
後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに包含する、実施形態Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２７．前記状態は白血病である、実施形態Ｅ１０〜Ｅ２６のいずれか１項に記載の方
法。
Ｅ２８．前記被験体は、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプス
タイン・バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６，Ｉ）、およびパピ
ローマウイルスからなる群より選択されるウイルス病因の感染症と診断されているか、ま
たは肺炎、結核、および梅毒からなる群より選択される細菌病因の感染症と診断されてい
るか、またはマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、および
アメーバ症からなる群より選択される寄生生物病因の感染症と診断されている、実施形態
Ｅ１０〜Ｅ２６のいずれか１項に記載の方法。
Ｅ２９．前記改変された細胞は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペ
プチドを含むキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ２８のいずれ
か１つに記載の方法。
Ｅ３０．前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、前記多量体リガンド結合領域
に結合する多量体リガンドを該被験体に投与する工程をさらに包含する、実施形態Ｅ２９
に記載の方法。
Ｅ３１．前記多量体リガンドの投与後に、前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含
む改変された細胞の数が減少する、実施形態Ｅ３０に記載の方法。
Ｅ３２．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、５０％
減少する、実施形態Ｅ３１に記載の方法。
Ｅ３３．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、７５％
減少する、実施形態Ｅ３１に記載の方法。
Ｅ３４．前記キメラカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変された細胞の数は、９０％
減少する、実施形態Ｅ３１に記載の方法。
Ｅ３５．前記被験体への前記改変された細胞の投与後に、該被験体が有害な症候を経験
していることを決定する工程、および該有害な症候を減少または緩和するために前記リガ
ンドを投与する工程を包含する、実施形態Ｅ２９〜Ｅ３２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３６．前記リガンドは、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、実施形態Ｅ２９
〜Ｅ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３７．前記改変された細胞は、自己Ｔ細胞である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか
１つに記載の方法。
Ｅ３８．前記改変された細胞は、同種異系のＴ細胞である、実施形態Ｅ１〜Ｅ３６のい
ずれか１つに記載の方法。
Ｅ３９．前記改変された細胞は、インビボでトランスフェクトまたは形質導入される、
実施形態Ｅ１〜Ｅ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４０．前記改変された細胞は、エキソビボでトランスフェクトまたは形質導入される
、実施形態Ｅ１〜Ｅ３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
Ｅ４１．細胞においてキメラ刺激分子を発現するための方法であって、該方法は、実施
形態Ｃ１〜Ｃ５２のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれ
る条件下で接触させ、それによって、該細胞は、該キメラ抗原レセプターを該組み込まれ
た核酸から発現する工程を包含する、方法。
Ｅ４２．前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態Ｅ４１に記載
の方法。
Ｅ４３．前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態Ｅ４１に記載の
方法。
* * *
本明細書中で参照された特許、特許出願、刊行物および文書の各々の全体が、参照によ
り本明細書によって援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述
のいずれかが、関連する従来技術であることを自認するものでもないし、これらの刊行物
または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。
本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。
本技術は、１つ以上の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に説明されてきたが、当業
者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更が行われ得るが、これらの
改変および改善が本技術の範囲内および精神内であることを認識する。
本明細書中に例証的に記載された技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意
のエレメント（複数可）の非存在下において、適切に実施され得る。したがって、例えば
、本明細書中の各場合において、用語「〜を含む」、「〜から本質的になる」および「〜
からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用され
てきた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、そのような用
語および表現の使用は、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる等
価物も排除せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変が可能である。エレメント
のうちの１つまたはエレメントのうちの２つ以上が記載されていることが文脈から明らか
でない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、それが修飾するエレメントのうちの１つまた
は複数のことを指し得る（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つ以上の試薬
を意味し得る）。本明細書中で使用される用語「約」は、基となるパラメータの１０％以
内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）のことを指し、一続きの値の始めに用
語「約」を使用することにより、それらの値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２
および３」は、約１、約２および約３のことを指す）。例えば、「約１００グラム」とい
う重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含み得る。さらに、値のリストが、本明細
書中に記載されるとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６
％）、そのリストには、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．
４％）が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および随意の特徴によって
具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示された概念の改変およびバリエーションが
、当業者によって用いられることがあり、そのような改変およびバリエーションは、本技
術の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
この技術のある特定の実施形態は、以下に続く特許請求の範囲に示される。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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