JP2020050672A - 放射性抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

【課題】放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体による抗腫瘍効果を高める技術を提供する。【解決手段】腫瘍の治療を必要とする生体に対し、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体が血液学的パラメータを指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量で複数回投与されるように用いられることを特徴とする、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を有効成分として含有する放射性抗腫瘍剤。前記複数回投与は、前記血液学的パラメータが正常範囲に回復する時間間隔で間欠的に投与されることからなることが好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を用いた腫瘍の放射線治療に関する。

放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は、低酸素部位やミトコンドリア機能障害の診断剤として知られている（例えば、特許文献１）。また、非特許文献１には、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体の一種である放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭが、低酸素領域を標的とした腫瘍の放射線治療剤として有用であることが記載されている。

また、近年、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭは、ＣＤ１３３陽性細胞に集積することが明らかとなった（非特許文献２）。非特許文献３及び４には、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭを用いて、腫瘍中のＣＤ１３３陽性細胞の量を低減し、腫瘍が縮小できたことが報告されている。このため、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭは、がん幹細胞の検出剤、及び、がん幹細胞を標的化したがんの予防・治療剤としての有用性も期待されている（特許文献２〜４）。

特開平８−２４５４２５号公報 特開２０１０−１３３８０号公報 特開２０１４−１４１４５７号公報 特開２０１６−２１０６８８号公報

Ｊａｓｏｎ Ｓ．Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ（２００１），Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ｖｏｌ．９８，１２０６−１２１１ Ｙｕｋｉｅ Ｙｏｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ（２０１０），Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．３７，３９５−４０４ Ｙｕｋｉｅ Ｙｏｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ（２０１１），Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．３８，１５１−１５７ Ｙｕｋｉｅ Ｙｏｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ（２０１６），Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．ｖｏｌ．３７６，７４−８２

しかしながら、最も予後の悪い悪性脳腫瘍の一つである膠芽腫の場合、治療効果が出る用量の放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを投薬すると体重減少や血液毒性が出現することから、用量が制限されてしまうという課題があることがわかった。また、非特許文献１では、大腸癌細胞移植ハムスターに、４ｍＣｉの^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭを７２時間間隔で３回投与を行っているが、治療効果は十分とは言えなかった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体による抗腫瘍効果を高める技術を提供することにある。

本発明者等は、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を低用量で複数回投与することにより、膠芽腫のような腫瘍を効果的に放射線治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の一態様は、腫瘍の治療を必要とする生体に対し、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体が血液学的パラメータを指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量で複数回投与されるように用いられることを特徴とする、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を有効成分として含有する放射性抗腫瘍剤を提供する。
本発明の他の態様は、腫瘍の治療を必要とする生体に対し、血液学的パラメータを指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量で複数回投与されるために用いられる放射性抗腫瘍剤を製造するための放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体の使用を提供する。
本発明のさらに他の態様は、腫瘍の治療を必要とする生体に対し、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を有効成分として含有する放射性抗腫瘍剤を、血液学的パラメータを指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量で複数回投与する方法を提供する。

本発明によれば、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体の１回当たりの用量を血液学的パラメータを指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量として複数回投与することとしたので、毒性と腫瘍抑制効果とのバランスを保ちながら放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体の抗腫瘍効果を継続的に維持することができる。

図１Ａは、実施例で測定した、各投与群の３９日間の腫瘍体積比（０日目の腫瘍体積に対する百分率） の変化を示すグラフである。 図１Ｂは、対照群及び^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ４回投与群（３７ＭＢｑ×４）の０（投与前）、２６、３３及び３９日目における腫瘍外観の代表例を示す写真である。 図２は、実施例における各投与群の８０日間の生存曲線を示すグラフである。 図３は、実施例における各投与群のマウスの３９日目までの体重変化を示すグラフである。図中「＊」は有意差検定した場合における有意差が認められたデータを示す。 図４Ａは、実施例において測定した白血球（ＷＢＣ）の数の変化を示すグラフであり、図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは対照を意味し、ＤａｙＸはＸ日目（ここでＸは整数）を意味する。各日の棒グラフのバーは、左から順に、Ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１８．５ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ７４ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１１１ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１４８ＭＢｑ単回投与、及び^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ４回投与の結果を示す。図中「＊」は有意差検定した場合における有意差が認められたデータを示す。 図４Ｂは、実施例において測定した赤血球（ＲＢＣ）の数の変化を示すグラフであり、図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは対照を意味し、ＤａｙＸはＸ日目（ここでＸは整数）を意味する。各日の棒グラフのバーは、左から順に、Ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１８．５ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ７４ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１１１ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１４８ＭＢｑ単回投与、及び^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ４回投与の結果を示す。図中「＊」は有意差検定した場合における有意差が認められたデータを示す。 図４Ｃは、実施例において測定した血小板（ＰＬＴ）の数の変化を示すグラフであり、図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは対照を意味し、ＤａｙＸはＸ日目（ここでＸは整数）を意味する。各日の棒グラフのバーは、左から順に、Ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１８．５ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ７４ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１１１ＭＢｑ単回投与、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１４８ＭＢｑ単回投与、及び^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ４回投与の結果を示す。図中「＊」は有意差検定した場合における有意差が認められたデータを示す。 図５Ａは、実施例において測定した生化学的パラメータの変化を示すグラフであり、左側は尿素窒素（ＢＵＮ）の変化、右側はクレアチニン（ＣＲＥ）の変化を示す。図中、Ｃｏｎｔは対照を意味する。 図５Ｂは、実施例において測定した生化学的パラメータの変化を示すグラフであり、左側はグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）の変化、右側はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の変化を示す。図中、Ｃｏｎｔは対照を意味する。

［放射性抗腫瘍剤］
本発明において、「抗腫瘍」とは、腫瘍の増加を抑制すること、更には、腫瘍を減少若しくは消滅することをいい、本発明の「抗腫瘍剤」は、腫瘍細胞を殺傷し、腫瘍の増殖を抑制し、更には、腫瘍を減少若しくは消滅できるものを有効成分として含有する剤をいう。

本発明の放射性抗腫瘍剤は、各種の腫瘍に対し適用することができる。本発明の放射性抗腫瘍剤が適用される腫瘍としては、例えば、悪性膠芽腫等の悪性脳腫瘍を含む脳腫瘍の他、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、小腸癌、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌、唾液腺癌、神経鞘腫、肝臓癌、腎臓癌、胆管癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、副甲状腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、骨腫瘍、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形癌、肉腫、白血病などが挙げられる。これらの腫瘍は、原発性であっても転移性であってもよい。

本発明において、「用量制限毒性」とは、７日以上持続する原疾患の増悪に依らない、グレード３（入院や侵襲的治療／画像下治療（ＩＶＲ）／輸血／治療的内視鏡／手術などを要する高度の有害事象）以上の血液毒性、７日以上持続し、対症療法によって軽快しない、原疾患によらないグレード３以上の非血液毒性、あるいは原疾患の増悪に依らないグレード３以上のてんかん発作を除く神経系障害をいう。ここで「グレード」とは有害事象共通用語規準第4版（Common Terminology Criteria for Adverse Events; CTCAE v.4.0）で定義されるグレード１からグレード５の分類を示す。

本発明において、「血液学的パラメータを指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量」とは、臨床検査を行い、任意の有意水準で有意差検定を行った場合に二種以上の血球細胞数に有意な低下を認めない放射能量をいい、好ましくは、白血球数、赤血球数及び血小板数からなる群から選択される二種以上の血球細胞数に有意な低下を認めない放射能量をいう。
具体的にはマウス当たり７．５ＭＢｑ以上１１１ＭＢｑ以下をいい、好ましくは２５ＭＢｑ以上５０ＭＢｑ以下である。これはヒト相当量で３０ＭＢｑ／ｋｇ以上４５０ＭＢｑ／ｋｇ以下であり、好ましくは１００ＭＢｑ／ｋｇ以上２００ＭＢｑ／ｋｇ以下に相当する。
ここで、ヒト相当量とは、マウスの体重を２０ｇ、体表面積換算係数を１２．４として「マウス当たり投与量（ＭＢｑ／ｂｏｄｙ）×（１０００／２０）／１２．４」より算出される数値である。

なお、有意差検定としては、パラメトリック検定又はノンパラメトリック検定が挙げられ、パラメトリック検定としてはStudentのt検定、分散分析（一次元配置分散分析、及び二次元配置分散分析）、多重比較分析などが挙げられ、ノンパラメトリック検定としてはマンホイットニーのU検定、ウィルコクスンの順位和検定、クラスカルウォーリス検定、フリードマン検定、ログランク検定などが挙げられるが、検定手法は周知のデータの平均値又は代表値の差を検定する手法であれば、これらに限定されない。

本発明の放射性抗腫瘍剤は、下記式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体をそのまま、あるいは薬理学的に許容され得る担体、希釈剤、若しくは賦形剤とともに製剤化されていればよい。剤形は、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよいが、例えば注射剤などの非経口投与の剤形が好ましい。

上記式（１）中の置換基Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、及びアルコキシ基からなる群より選ばれたものである。本発明において、上記式（１）中の置換基Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４のアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は、好ましくは１〜５の整数であり、より好ましくは１〜３の整数である。本発明において、上記式（１）中の置換基Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４は、同一又は異なって水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましく、Ｒ_１及びＲ_２が同一又は異なって水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ_３が水素原子であり、Ｒ_４が炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましく、Ｒ_１及びＲ_２が同一又は異なって水素原子又はメチル基であり、Ｒ_３が水素原子であり、Ｒ_４がメチル基であることが更に好ましい。

上記式（１）中の銅の放射性同位体は、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ又は^６７Ｃｕであることが好ましく、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕがより好ましい。^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕは飛程の短いβ線も放出し、細胞を破壊するため、抗腫瘍効果を更に高めることができる。

上記式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は、具体的には、
放射性グリオキザール−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン） 銅錯体、
放射性グリオキザール−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン） 銅錯体、
放射性エチルグリオキザール−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン） 銅錯体、
放射性エチルグリオキザール−ビス（Ｎ４−エチルチオセミカルバゾン） 銅錯体、
放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン） 銅錯体、
放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン） 銅錯体、
放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−エチルチオセミカルバゾン） 銅錯体、
放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン） 銅錯体、
放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン） 銅錯体、
放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−エチルチオセミカルバゾン） 銅錯体
等が示される。中でも、下記式（２）で表される放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体（本明細書において、放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭともいう。）又は放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン）銅錯体（本明細書において、放射性Ｃｕ−ＰＴＳＭともいう。）が好ましく、放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭがより好ましい。

式（２）中、Ｃｕは銅の放射性同位体を示し、好ましくは^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕである。なお、上記式（２）中のＣｕが^６４Ｃｕである放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭを本明細書では^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭともいう。

本発明の放射性抗腫瘍剤は、例えば、以下の方法により製造することができる。

まず、Ｐｅｔｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２４，３６７−３７２，１９６４）に記載の方法によりジチオセミカルバゾン誘導体を合成する。すなわち、α−ケトアルデヒドの１ｍｏｌ水溶液又は５０体積％エタノール溶液を３０〜４０分かけてチオセミカルバジド、Ｎ４−メチルチオセミカルバジド、Ｎ４−ジメチルチオセミカルバジド等の２．２ｍｏｌ含有５％氷酢酸溶液に５０〜６０℃で滴下する。滴下中は反応液を撹拌する。滴下終了後室温で数時間放置した後、冷却して結晶を分離する。結晶はメタノールに溶解して再結晶を行い精製する。

つづいて、放射性銅イオンを製造する。放射性銅イオンは、公知の方法により製造することができるが、６４Ｃｕイオンは例えば、ＭｃＣａｒｔｈｙらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４（１），１９９７，ｐｐ．３５‐４３）、又は、Ｏｂａｔａらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０（５），２００３，ｐｐ．５３５‐５３９）により得ることができる。^６７Ｃｕイオンは例えば、^６８Ｚｎ（ｐ，２ｐ）^６７Ｃｕ反応から^６７Ｃｕを生成した後、イオンクロマトグラフィー等を用いてターゲットから化学的に分離することにより得ることができる。

その後、上記ジチオセミカルバゾン誘導体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液として、上記放射性銅イオンを含む溶液と接触させることにより、上記式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を得ることができる。放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭは、例えば、Ｊａｌｉｌｉａｎらの方法（Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，５９(１），２００９，ｐｐ．４５−５５）、「ＰＥＴ用放射性薬剤の製造および品質管理―合成と臨床使用へのてびき」（ＰＥＴ化学ワークショップ編）第４版（平成２３年改定版）記載の方法、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３３，２００６，ｐｐ．７４３‐５０）、Ｌｅｗｉｓらの方法（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２００１，４２，６５５‐６６１）等により製造することができる。

本発明において、上記放射性抗腫瘍剤は所定の用量で反復投与される。本発明において「複数回投与」とは、一定の時間間隔をおいて２以上の回数投与することを意味し、例えば、１日当たり１回若しくは複数回の投与、又は複数日当たり１回の投与を、２日〜１ヶ月間継続することが挙げられる。本発明において、「複数回投与」は、血液学的パラメータが正常範囲に回復する時間間隔、好ましくは、投与前の血液学的パラメータと同等に回復するまでの時間間隔で間欠的に投与されることによって実施してもよい。

本発明の放射性抗腫瘍剤の投与対象は、腫瘍の治療を必要とする生体であり、例えば哺乳動物であり、好ましくはヒトである。本発明の放射性抗腫瘍剤の１回当たりの投与量は、投与の時間間隔、投与対象となる患者の種別、年齢、性別、体重、症状、投与法などによって異なり特に限定されないが、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体が血液学的パラメータ（たとえば、白血球、赤血球及び血小板の数）を指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量に相当する投与量であればよい。その他、例えば、放射性抗腫瘍剤の投与から次の投与の時間までの体重減少率が１０％以下となるような放射能量に相当する投与量を設定することができる。これにより、放射性抗腫瘍剤の副作用を低減しつつ腫瘍細胞の殺傷効果を高めることができる。体重減少率は、「体重減少率（％）＝｛（放射性抗腫瘍剤の投与開始前の体重−放射性抗腫瘍剤の投与開始後の体重）／放射性抗腫瘍剤の投与開始前の体重｝×１００」で表すことができ、「放射性抗腫瘍剤の投与開始後の体重」は、好ましくは、放射性抗腫瘍剤の投与開始から３日〜２週間後の体重にすることができる。

以下、実施例を記載して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。

（製造例１）^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの調製
（ＡＴＳＭの合成）
ジアセチル‐ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）（ＡＴＳＭ）の合成は、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３３，２００６，ｐｐ．７４３−５０）に準じた。

（^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの合成）
^６４ＣｕはＭｃＣａｒｔｈｙらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４，１９９７，ｐｐ．３５−４３）及びＯｂａｔａらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０，２００３，ｐｐ．５３５−５３９）に準じて製造・精製した。ＡＴＳＭと^６４Ｃｕを用い、Ｔａｎａｋａらの方法（上掲）に準じて^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭを合成した。また、製造後の薬剤は、薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ法）を用いて検定し、放射化学的純度９５％以上のものを以下の実験に使用した。なお、ＴＬＣを用いた^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの分析条件は下記のとおりである。
ＴＬＣプレート：シリカゲルプレート（製品名：Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ６０、メルク）
展開相：酢酸エチル
検出：フルオロイメージアナライザー（形式：ＦＬＡ−７０００，富士フイルム）

（実施例１）Ｕ８７ＭＧ担がんマウスへの^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの投与による抗腫瘍効果
ヒト膠芽腫由来のＵ８７ＭＧ細胞は、ＡＴＣＣより購入したものを増殖させて利用した。Ｕ８７ＭＧ担がんモデルは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（オス，６週齢，体重約２０−２５ｇ，日本エス・エル・シーから入手）の脇腹部皮下にＵ８７ＭＧ細胞１×１０7個を移植して作製した。この担がんマウスは、Ｕ８７ＭＧ細胞の移植後、腫瘍径が５ｍｍ前後に到達した時点で、試験に供した。

上記担がんマウスをランダムに６群（ｎ＝７／群）に分け、それぞれの群に^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭを１８．５、３７、７４、１１１及び１４８ＭＢｑ並びに対照として生理食塩水をそれぞれ静脈内に単回投与した。残りの１群には、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭを３７ＭＢｑの用量で０日目、７日目、２１日目及び２８日目に静脈内に合計４回投与した（３７ＭＢｑ×４）。
また、以下の各評価において、データは平均値±標準偏差で示し、生存曲線を除くデータの有意差検定は二元配置分散分析を用いた。生存曲線のデータについてはログランク検定を用いた。有意水準はいずれも５％を用いた。

［評価１］腫瘍成長
試験開始後、経時的に週２回、マウスの体重を計測するとともに、ノギスで腫瘍の大きさを計測した。腫瘍体積は、腫瘍体積＝長さ×幅２×π／６の式を用いて算出し、各日数目の腫瘍体積は０日目の初期腫瘍体積の百分率として求めた。結果を図１Ａに示す。また、初期腫瘍体積を表１に示す。

図１Ａは、各投与群の３９日間の腫瘍体積比（０日目の腫瘍体積に対する百分率）の変化を示すグラフである。図１Ａから、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭを３７、７４、１１１及び１４８ＭＢｑ単回投与した場合、対照群に比べて腫瘍成長が有意に抑制されたことがわかる。３９日目における対照群の腫瘍体積比に対する^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７、７４、１１１及び１４８ＭＢｑ単回投与群の腫瘍体積比の比率は、それぞれ０．８２、０．３１、０．２８、０．１４及び０．１４であり、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ単回投与の用量依存的な抗腫瘍効果が示され、１１１ＭＢｑでプラトーに達することが示された。^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１８．５ＭＢｑ単回投与の場合、対照群よりも腫瘍成長を抑制するものの、有意差は見られなかった。３７ＭＢｑ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭを４回投与した場合（３７ＭＢｑ×４）、対照群に比べて腫瘍成長の有意に高い抑制効果が見られた。３９日目における対照群の腫瘍体積比に対する３７ＭＢｑ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ４回投与群（３７ＭＢｑ×４）の腫瘍体積比の比率は、０．０４であり、全投与群の中で最も低い値であった。

図１Ｂは、対照群及び３７ＭＢｑ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ４回投与群（３７ＭＢｑ×４）の０（投与前）、２６、３３及び３９日目における腫瘍外観の代表例を示す写真である。図１Ｂから、対照群では、腫瘍は経時的に顕著に成長したのに対し、３７ＭＢｑ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ４回投与（３７ＭＢｑ×４）による複数回投与の後は、腫瘍を目視で観測できず、マウス７匹のうち６匹については、図１Ｂに示されるように、３９日目でも腫瘍をほとんど目視で観測できなかった。

［評価２］生存曲線
試験開始後、腫瘍体積が人道的エンドポイントに至った時点で屠殺した。８０日間の生存可能性（Ｓｕｒｖｉｖａｂｉｌｉｔｙ）を観測し、生存率を算出した。その結果を図２に示す。
図２は、実施例における各投与群の８０日間の生存曲線を示すグラフである。図２から、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７、７４、１１１及び１４８ＭＢｑ単回投与群及び３７ＭＢｑ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ４回投与（３７ＭＢｑ×４）による複数回投与群の生存率は、対照群よりも高かった。加えて、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１１１ＭＢｑ単回投与群及び３７ＭＢｑ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ４回投与（３７ＭＢｑ×４）による複数回投与群は、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１８．５、３７、７４及び１４８ＭＢｑ単回投与群に比べて、有意に長い生存期間を示した。単回投与群のうち、１１１ＭＢｑ単回投与群が最も高い生存効果を示した。３７ＭＢｑ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ４回投与（３７ＭＢｑ×４）による複数回投与群は、１１１ＭＢｑ単回投与群に比べて長い生存期間を示したが、これら２群の間に有意差は見られなかった。

［評価３］体重変化
試験開始後、評価１のとおり測定した各投与群のマウスの体重変化を図３に示す。
図３から、７日目で^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１１１及び１４８ＭＢｑ単回投与群のマウスの体重が対照群に比べて有意に低下したが、その後、１４日目までには正常な体重に戻り、その後は、対照と同様であった。３７ＭＢｑ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ４回投与（３７ＭＢｑ×４）による複数回投与群では体重減少は見られなかった。

［評価４］血液学的パラメータの測定
副作用を評価するため、上記担がんマウスと同様の処置を受けた非担がんマウス（ｎ＝５／群）を用いて血液学的パラメータ測定した。
血液学的パラメータの測定は、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの投与直前の開始時点（０日目）、並びに、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの投与後２、７、１４、２１、２８、３５、４２及び４９日目に、静脈から採取した血液を用いて、白血球、赤血球及び血小板の濃度を血液分析装置（日本光電社製セルタックMEK-6458）で測定することにより行った。結果を図４Ａ〜図４Ｃに示す。

図４Ａのグラフから、投与後２日目に^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ７４及び１１１ＭＢｑ単回投与群で白血球数の有意な低下が見られ、投与後７日目及び１４日目に^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１１１及び１４８ＭＢｑ単回投与群白血球数の有意な低下が見られたが、いずれの数値も２１日目には正常に戻ったことがわかる。
図４Ｂのグラフから、投与後７日目においてのみ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１４８ＭＢｑ単回投与群で赤血球数の有意な低下が見られたが、１４日目には正常に戻ったことがわかる。
図４Ｃのグラフから、投与後２及び７日目に^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１４８ＭＢｑ単回投与群で血小板数の有意な低下が見られ、投与後７日目に^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１１１ＭＢｑ単回投与群で血小板数の有意な低下が見られたが、１４日目には正常に戻ったことがわかる。
図４Ａ、図４Ｂ及び図Ａ４Ｃから、３７ＭＢｑ^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ４回投与（３７ＭＢｑ×４）による複数回投与群では、血液学的毒性の症状は見られず、試験期間を通じて健康な身体所見が維持された。

［評価５］生化学的パラメータの測定
副作用を評価するため、上記担がんマウスと同様の処置を受けた非担がんマウス（ｎ＝５／群）を用いて生化学的パラメータを測定した。
生化学的パラメータの測定は、最初の^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの投与後４９日目に、心臓から採取した血液から調製したマウス血漿を用いて、肝機能についてはグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ及びアルカリホスファターゼの量、腎機能については尿素窒素及びクレアチニンの量を血液生化学分析装置（富士フイルム社製富士ドライケム７０００ＶＺ）で測定することにより行った。結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。

図５Ａ及び図５Ｂから、投与後４９日後、何れの投与群においても、腎機能に関する血中尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチニン（ＣＲＥ）の量並びに肝機能に関するグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の量について、対照（Ｃｏｎｔ）に比べて有意差は見られなかったことがわかる。これは、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの何れの投与群においても肝機能及び腎機能に変化が見られなかったことを意味する。

［考察］
以上から、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの単回投与は用量依存性の治療効果を奏し、腫瘍成長を有意に抑制し、Ｕ８７ＭＧ膠芽腫に対する延命作用もあるが、用量依存性の僅かな血液学的毒性及び体重減少が見られた。これに対し、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの複数回投与（３７ＭＢｑ×４）の場合、腫瘍成長を抑制し、Ｕ８７ＭＧ膠芽腫に対する延命効果もあり、有意な副作用を伴うことなくより良好な抗腫瘍効果を奏した。膠芽腫に有効な治療法が無いことに鑑みれば、本発明による^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの複数回投与は、この致死的な疾患をほとんど副作用無く治療するための新しい治療法となり得る。

より詳細には、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの単回投与は３９日間に用量依存性の治療効果を示し、特に１１１及び１４８ＭＢｑ単回投与群では対照群に比べて有意に腫瘍成長を抑制したが、１１１ＭＢｑ単回投与群だけしか対照群に比べて有意な延命作用を示さなかった。^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１１１及び１４８ＭＢｑ単回投与群は、僅かな体重減少並びに白血球数及び血小板数の有意な減少を示した。さらに、１４８ＭＢｑ単回投与群では、赤血球数の有意な減少といった毒性を示し、この毒性によって、延命効果が損なわれた可能性がある。

本発明による^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの複数回投与（３７ＭＢｑ×４）によれば、対照に比べて有意に腫瘍を抑制し延命する効果が得られ、副作用を低減させた状態又はほとんど伴わない状態で^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭによる治療効果を享受することができる。また、本発明による^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの複数回投与（３７ＭＢｑ×４）では、体重減少も血液、肝、あるいは腎に対する毒性も生じない。したがって、本発明による^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの複数回投与によれば、腫瘍成長を効果的に抑制し、膠芽腫等の腫瘍に対する延命効果を得ることができ、さらには、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ投与による毒性の低下も達成することができる。

膠芽腫は、通常、血管系の機能不全を伴い、低酸素状態を引き起こす。上記実施例でモデルとして使用したＵ８７ＭＧ担がんマウスは、低酸素状態に起因してＨＩＦ−１αを高発現する。膠芽腫組織中の低酸素環境によってＨＩＦ−１αが誘導され、腫瘍の再増殖、転移といった悪性挙動が生じる。ＰＥＴによる臨床研究によれば、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭはＨＩＦ−１αを高度に発現している高い悪性段階にある膠芽腫に集積することが示されている。^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭは、腫瘍組織の低酸素領域を、血液灌流が乏しい場合でも標的にできる。^６４Ｃｕから出されるβ^―粒子やオージェ電子は腫瘍細胞を損傷することができる。
特に、高ＬＥＴオージェ電子は、ＤＮＡに深刻な損傷を与え、腫瘍細胞のポストミトティックアポトーシス(post-mitotic apoptosis)を誘起する。^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭは、このユニークな特徴ゆえに、膠芽腫の治療効果に大きく寄与することができる。

なお、実施例におけるマウス当たり１８．５ＭＢｑ、３７ＭＢｑ、７４ＭＢｑ、１１１ＭＢｑ、１４８ＭＢｑの投与量は、体表面積換算係数を用いてヒト相当量に換算すると、順に７５ＭＢｑ／ｋｇ、１５０ＭＢｑ／ｋｇ、３００ＭＢｑ／ｋｇ、４５０ＭＢｑ／ｋｇ、６００ＭＢｑ／ｋｇに相当する。

ここで、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭによる内部被ばく線量は、肝臓で最大であり、０．１０８ｍＳｖ／ＭＢｑであった。つまり、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭを１５０ＭＢｑ／ｋｇを体重６０ｋｇのヒトに投与した場合、肝臓では１６．２ｍＧｙ／ｋｇ、全身では９７２ｍＳｖの被ばく線量となる。この被ばく線量を通常の放射線治療に当てはめると１．２１５Ｇｙの１回照射と同等の被ばくにあたり、放射線治療における通常分割照射の一回照射線量（１．８〜２．０Ｇｙ）より低い。また、４５０ＭＢｑ／ｋｇを体重６０ｋｇのヒトに投与した場合、肝臓では４８．６ｍＧｙ／ｋｇ、全身では２，９１６ｍＳｖの被ばく線量となる。通常分割照射における肝臓の耐容線量は５年で５％に副作用を生じる線量として３０Ｇｙであるから、３Ｇｙ程度の通常放射線治療にあたる投与を合計４回投与した場合の合計線量は１１．６６Ｇｙとなり、前記肝臓の耐容線量より低い。

また、本発明者等は、正常マウス組織における生体内分布に基づいた^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭのヒトにおける照射線量の見積もりについて報告を行っている（Yoshii Y, Furukawa T, Matsumoto H, Yoshimoto M, Kiyono Y, Zhang MR, Fujibayashi Y, and Saga T (2016) Cu-ATSM therapy targets regions with activated DNA repair and enrichment of CD133 cells in an HT-29 tumor model: Sensitization with a nucleic acid antimetabolite. Cancer Lett 376: 74-82 及び Yoshii Y, Matsumoto H, Yoshimoto M, Furukawa T, Morokoshi Y, Sogawa C, Zhang MR, Wakizaka H, Yoshii H, Fujibayashi Y, and Saga T (2014) Controlled administration of penicillamine reduces radiation exposure in critical organs during ⁶⁴Cu-ATSM internal radiotherapy: a novel strategy for liver protection. PloS one 9: e86996参照）。肝臓、赤色骨髄及び卵巣は、^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ療法において照射線量の低い臓器であることがわかっており、マウス当たり３７ＭＢｑから算出された^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの治療投与量におけるヒトのこれらの組織に対する推定照射線量は、上記報告の許容用量に比べて低い。したがって、本発明によるヒトに対する^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの複数回投与における用量は、本発明におけるマウスにおける治療効果及び毒性のデータに基づいて適宜決定することができる。また、本発明におけるヒトに対する^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ療法の間に腫瘍及び組織の照射線量を監視するために^６４Ｃｕ−ＡＴＳＭのＰＥＴイメージングを行ってもよく、これにより、がんのセラノスティクス（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）を行うことができる。

この出願は、２０１７年１１月１日に出願された日本出願特願２０１７−２１２１８０号を基礎とする優先権を主張し、その開示の総てをここに取り込む。

Claims (11)

1. 腫瘍の治療を必要とする生体に対し、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体が血液学的パラメータを指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量で複数回投与されるように用いられることを特徴とする、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を有効成分として含有する放射性抗腫瘍剤。
2. 前記放射能量が、二種以上の血球細胞数に有意な低下を生じさせない放射能量である、請求項１に記載の放射性抗腫瘍剤。
3. 前記複数回投与が、前記血液学的パラメータが正常範囲に回復する時間間隔で間欠的に投与されることからなる、請求項１又は２に記載の放射性抗腫瘍剤。
4. 前記血液学的パラメータが正常範囲に回復する時間間隔が、投与前の血液学的パラメータと同等に回復するまでの時間間隔である、請求項３に記載の放射性抗腫瘍剤。
5. 前記放射能量が３０ＭＢｑ／ｋｇ以上４５０ＭＢｑ／ｋｇ以下である、請求項１から４のいずれか１項に記載の放射性抗腫瘍剤。
6. 前記放射能量が１００ＭＢｑ／ｋｇ以上２００ＭＢｑ／ｋｇ以下である、請求項５に記載の放射性抗腫瘍剤。
7. 前記放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体の銅がＣｕ−６４又はＣｕ−６７である、請求項１から６のいずれか１項に記載の放射性抗腫瘍剤。
8. 前記腫瘍が悪性脳腫瘍である、請求項１から７のいずれか１項に記載の放射性抗腫瘍剤。
9. 前記悪性脳腫瘍が悪性膠芽腫である、請求項８に記載の放射性抗腫瘍剤。
10. 腫瘍の治療を必要とする生体に対し、血液学的パラメータを指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量で複数回投与されるために用いられる放射性抗腫瘍剤を製造するための放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体の使用。
11. 腫瘍の治療を必要とする生体に対し、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を有効成分として含有する放射性抗腫瘍剤を、血液学的パラメータを指標とした用量制限毒性を生じさせない放射能量で複数回投与する方法。

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