JP2020043858A - タマネギにおける疾病抵抗性遺伝子座 - Google Patents

タマネギにおける疾病抵抗性遺伝子座 Download PDF

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Abstract

【課題】疾病抵抗性および望ましい球根色を有する独特なタマネギ植物およびその子孫を提供する。【解決手段】乾腐病および紅色根腐病に対する抵抗性を含むｃｉｓ結合した連鎖を含むタマネギ植物であって、植物が、さらに該ｃｉｓ結合した連鎖へのピンク補色形質の連鎖を欠失している、タマネギ植物。ある面において、疾病抵抗性および／または望ましい球根色を有する植物または生殖質を産生、育種、同定、選択するなどのための異なる多型性分子マーカーを含む組成物および方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月２７日出願の米国仮出願番号６１／９０９,８８３の利益を主張し、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
発明の分野
本発明は農業の分野、より具体的には、疾病への抵抗性を好ましい球根色と組み合わせて有するタマネギ植物を生産するための方法および組成物に関する。
配列表の取り込み
“SEMB012US_ST25.txt”なるファイル名に含まれ、Microsoft Windowsオペレーティング・システムで測定して６１.３キロバイトであり、２０１４年１１月２０日に作成した配列表を本願と共に電子的に提出し、引用により本明細書に包含させる。
発明の背景
植物の疾病抵抗性は、特に食用作物の生産のための、植物育種において重要な形質である。タマネギ植物に影響する経済的に重要な疾病は、とりわけ乾腐病(フザリウム・オキシスポラム・フォルマ・スペシャリス・セペ(Fusarium oxysporum f. sp. cepae))および紅色根腐病(ホーマ・テレストリス(Phoma terrestris))を含む。これらの疾病は、商業用タマネギ作物に影響を与える植物自体の喪失をもたらし得る。植物の育種における努力が、疾病に抵抗性である多くのタマネギ品種をもたらしているが、このような努力は、多くの場合、遺伝連鎖、不適切な表現型アッセイおよび形質の複雑なまたはほとんど理解されていない問題、例えば遺伝により複雑化している。
米国特許公報第２００５／０２０４７８０号明細書 米国特許公報第２００５／０２１６５４５号明細書 米国特許公報第２００５／０２１８３０５号明細書 米国特許公報第２００６／００５０４５３８号明細書 米国特許６,２０７,３６７号明細書 欧州特許第５０,４２４号明細書 欧州特許第８４,７９６号明細書 欧州特許第２５８,０１７号明細書 欧州特許第２３７,３６２号明細書 欧州特許第２０１,１８４号明細書 米国特許第４,６８３,２０２号明細書 米国特許第４,５８２,７８８号明細書 米国特許第４,６８３,１９４号明細書 米国特許第６,６１３,５０９号明細書 米国特許第６,５０３,７１０号明細書 米国特許第５,４６８,６１３号明細書 米国特許第５,２１７,８６３号明細書 米国特許第５,２１０,０１５号明細書 米国特許第５,８７６,９３０号明細書 米国特許第６,０３０,７８７号明細書 米国特許第６,００４,７４４号明細書 米国特許第６,０１３,４３１号明細書 米国特許第５,５９５,８９０号明細書 米国特許第５,７６２,８７６号明細書 米国特許第５,９４５,２８３号明細書 米国特許第５,４６８,６１３号明細書 米国特許第６,０９０,５５８号明細書 米国特許第５,８００,９４４号明細書 米国特許第５,６１６,４６４号明細書 米国特許第７,３１２,０３９号明細書 米国特許第７,２３８,４７６号明細書 米国特許第７,２９７,４８５号明細書 米国特許第７,２８２,３５５号明細書 米国特許第７,２７０,９８１号明細書 米国特許第７,２５０,２５２号明細書 米国特許第５,４６８,６１３号明細書 米国特許第５,２１７,８６３号明細書 米国特許第６,７９９,１２２号明細書 米国特許第６,９１３,８７９号明細書 米国特許第６,９９６,４７６号明細書
Smith, Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 44:413-16 Duangjit et al., Theor Appl Genet 126(8):2093-2101, 2013 Orita et al., Genomics 8(2):271-278, 1989 Myers, EPO 0273085, 1985 Life Technologies, Inc., Gathersberg, MD 20877 PASA, Sommer, et al., Biotechniques 12(1):82-87, 1992 PAMSA, Dutton and Sommer, Biotechniques, 11(6):700-7002, 1991 Holland et al., PNAS 88:7276-7280, 1991 Mullis et al. 1986 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 Borevitz et al., Genome Res. 13:513-523, 2003; Cui et al., Bioinformatics 21:3852-3858, 2005 R. F. Service Science 2006 311:1544-1546
発明の要約
一つの面において、本発明は、乾腐病および紅色根腐病に対する抵抗性を含むタマネギ植物を提供し、ここで、該植物はさらにピンク補色形質を欠失する(lacks of the complemetary pinks trait)。一つの態様において、タマネギ植物は、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される乾腐病に対する抵抗性、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される紅色根腐病に対する抵抗性および連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与されるピンク補色球根色を欠失する、ｃｉｓ結合した連鎖を含む。他の態様において、ｃｉｓ結合した連鎖を、北米黄タマネギ(North American Yellow)および汎用黄タマネギ(Universal Yellow)から成る群から選択されるタマネギ品種に遺伝子移入する。他の態様において、本発明は、乾腐病および紅色根腐病に対する抵抗性を含むタマネギ植物の部分を提供し、ここで、該植物はさらにピンク補色形質を欠失し、ここで、該植物の部分は、さらに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、球根、幹、芽、種、プロトプラスト、細胞およびカルスとして定義される。さらに他の態様において、タマネギ植物は農学的にエリート系統またはハイブリッドまたは自殖である。
一つの面において、本発明は、ゲノム内に少なくとも１個の遺伝子移入された対立遺伝子座を含むタマネギ植物またはそこからの子孫植物を提供し、ここで、該遺伝子移入された対立遺伝子座は、乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；または赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域を含む。一つの態様において、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される紅色根腐病に対する抵抗性および連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域によりピンク補色球根色を欠失するｃｉｓ結合した連鎖を含むタマネギ植物を提供する。他の態様において、ｃｉｓ結合した連鎖を、北米黄タマネギおよび汎用黄タマネギから成る群から選択されるタマネギ品種に遺伝子移入する。他の態様において、タマネギ植物の部分は花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、球根、幹、芽、種、プロトプラスト、細胞およびカルスとして定義される。他の態様において、タマネギ植物は農学的にエリート系統またはハイブリッドまたは自殖である。
他の面において、本発明は、少なくとも１個のタマネギ植物において疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子型を検出する方法を提供し、該方法は、(ｉ)少なくとも１個のタマネギ植物において疾病抵抗性または球根色と関連する少なくとも１個の多型核酸の対立遺伝子を検出する工程を含み、ここで、該多型核酸は、乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；または赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域内にあるか、遺伝的に連鎖している。一つの態様において、本方法は、さらに(ii)疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子型が検出されている少なくとも１個のタマネギ植物の選択の工程を含む。他の態様において、タマネギ植物は農学的にエリート系統またはハイブリッドまたは自殖または疾病抵抗性を含む少なくとも１個の親植物の交配から得られた子孫植物である。
他の面において、本発明は、ゲノム内に疾病抵抗性または球根色と関連する少なくとも１個の遺伝子座を含むタマネギ植物の生産方法を提供し、該方法は(ｉ)疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子座を欠く第一タマネギ植物と、乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；または赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域により定義される疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子座を含む第二タマネギ植物を交配し；(ii)該交配から得られた子孫において疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子座にあるまたは遺伝的に連結した少なくとも１個の多型座を検出し；そして(iii)疾病抵抗性または球根色と関連する該多型および該座を含むタマネギ植物を選択する工程を含む。一つの態様において、本方法は、さらに(iv)工程(iii)のタマネギ植物とそれ自体または他のタマネギ植物を交配させて、さらなる世代を生産する工程を含む。他の態様において、工程(iii)および(iv)を約３回〜約１０回繰り返す。他の態様において、タマネギ植物は、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される紅色根腐病に対する抵抗性および連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域によりピンク補色球根色を欠失する。他の態様において、タマネギ植物は農学的にエリート系統またはハイブリッドまたは自殖である。
本発明の他の面は、タマネギ植物育種方法を提供し、該方法は、(ｉ)疾病抵抗性または球根色と関連するＱＴＬ内にあるか、遺伝的に連鎖している多型核酸の少なくとも１個の対立遺伝子を含む少なくとも第一タマネギ植物を選択し、ここで、該ＱＴＬは、乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；または赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域にマッピングされており；(ii)第一タマネギ植物をそれ自体または第二タマネギ植物と交配させ、疾病抵抗性または球根色と関連するＱＴＬを含む子孫タマネギ植物を生産する工程を含む。一つの態様において、疾病抵抗性または球根色と関連する該ＱＴＬと遺伝的に連鎖している少なくとも１個の多型核酸は、疾病抵抗性または球根色と関連する該ＱＴＬの４０cM、２０cM、１５cM、１０cM、５cMまたは１cM内にマッピングされる。
他の面において、本発明は、タマネギ植物に対立遺伝子を遺伝子移入する方法を提供し、該方法は、(ｉ)乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；または赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域に位置するまたは遺伝的に連鎖している少なくとも１個の多型核酸に関して、集団内の少なくとも１個のタマネギ植物を遺伝子型判定し；(ii)疾病抵抗性または球根色と関連する少なくとも１個の対立遺伝子を含む少なくとも１個のタマネギ植物を集団から選択する工程を含む。ある態様において、タマネギ植物は農学的にエリート系統またはハイブリッドまたは自殖である。他の態様において、本発明は、このような方法により得られるタマネギ植物を提供する。
他の面において、本発明は、乾腐病および紅色根腐病に対する抵抗性を含むタマネギ植物を提供し、ここで、該植物はさらにピンク補色形質を欠失する。
乾腐病(ＦＢＲ)および紅色根腐病(ＰＲ)のいずれにも耐性である汎用黄タマネギドナー生殖質に関する望ましいハプロタイプ構成を示す。染色体２(６２〜６３位)上の１７０６親対立遺伝子が、乾腐病(ＦＢＲ)および紅色根腐病(ＰＲ)の両者に耐性である北米黄タマネギ生殖質をもたらす。
配列表の簡単な説明
配列番号１〜７４ − タマネギにおける疾病抵抗性および球根色表現型のマーカー利用選抜(ＭＡＳ)に使用したマーカー配列。
配列番号７５〜１１５ − TaqMan(登録商標)アッセイで使用したＶＩＣ標識プローブの配列。
配列番号１１６〜１５６ − TaqMan(登録商標)アッセイで使用したＦＡＭ標識プローブの配列。
配列番号１５７〜１９７および２３９〜２４０ − TaqMan(登録商標)アッセイで使用した順方向プライマーの配列。
配列番号１９８〜２３８ − TaqMan(登録商標)アッセイで使用した逆方向プライマーの配列。
発明の詳細な記戴
本発明は、真菌病原体フザリウム・オキシスポラム・フォルマ・スペシャリス・セペが原因の乾腐病(ＦＢＲ)および／または真菌病原体ホーマ・テレストリスが原因の紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を示し、同時にまたピンク補色(ＣＰ)と呼ばれる形質および／またはここで定義する球根色遺伝子座の欠失による農産物として望ましい球根色(例えば黄色)も示す、疾病抵抗性タマネギ植物を生産するための方法および組成物を提供する。疾病抵抗性タマネギ系統を育種および選択する方法ならびにこのような疾病抵抗性タマネギの植物および植物部分をさらに提供する。またここに開示されるのは、このような植物疾病抵抗性を付与する定量的形質遺伝子座(“ＱＴＬ”)と連鎖している分子マーカーである。これらのマーカーは、これらの遺伝子座の単独でのまたは任意の望む遺伝子座組み合わせでの使用を促進する。
驚くべきことに、本発明者らは、特定の疾病抵抗性を有し、同時に、このような疾病抵抗性遺伝子座と以前関連付けられていた望ましくないＣＰ球根色形質を回避または最小化した、タマネギ植物の効率的生産を可能にする方法および組成物の開発を、初めて可能とした。このような形質は、以前は疾病抵抗性遺伝子座と望ましくないＣＰ形質の有害な連鎖無しには、単一タマネギ植物に組み合わせのために利用不可能であった。本発明は、ＣＰ形質を生じる遺伝的に連鎖した対立遺伝子無しに、ここに記載するとおり望ましい疾病抵抗性形質を有するタマネギ植物の生産を可能にする。これらの形質を単一タマネギ植物で組み合わせる能力は、疾病抵抗性形質とＣＰの間の連鎖の破壊の結果である。本発明の一態様において、２形質間の連鎖の破壊は、望む形質両者を有する植物を産生するための反復減数分裂イベント(すなわち、組み換え)により達成し得る。それゆえに、本発明の一態様は、疾病抵抗性および望む球根色を含むタマネギ植物を提供し、ここで、該望む球根色は、ＣＰを付与する対立遺伝子が存在しない結果である。
本発明は、ある態様において、商業的に望まれる遺伝的背景としての疾病または疾病の組み合わせの選択に対する抵抗または遺伝子移入を可能にする方法および組成物を提供する点で、当分野に顕著な進歩をもたらす。本発明の特定の態様において、ＦＢＲおよびＰＲを含むが、これらに限定されない少なくとも１種の疾病に対する抵抗性を付与し、ＣＰの欠失および／または望ましい球根色を提供するＱＴＬを同定し、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)；連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)；連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)；連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)；連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)；連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)；連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)；または連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)に対応するタマネギゲノムにおける位置により境界される地図区間により定義する。本発明は、さらに、望ましい球根色と共に、疾病抵抗性を付与する１個以上のＱＴＬを含むタマネギ植物を提供し、ここで、該望ましい球根色は、ここに記載するとおりＣＰの欠失または他の球根色遺伝子座により付与され得る。一つの態様において、本発明に従う望ましい球根色は、ＣＰ遺伝子座の欠失、アントシアニン生合成経路中の遺伝子、ジヒドロフラバノール４−レダクターゼ(ＤＦＲ)遺伝子または望ましい球根色を付与する当分野で知られる他の遺伝子または遺伝子座により付与され得る。本発明によって、ここに定義するＱＴＬ区間内のマーカーを、疾病抵抗性植物の同定に使用し得る。特定の態様において、ここに記載する新規ｃｉｓ結合イベントを、さらに望む形質と共に疾病抵抗性を有する植物を生産するために、連鎖群の単一ハプロタイプ、例えばＬＧ２上に組み合わせ得る。
ここに提供する対応するマーカーおよび／またはそれと連鎖し得る他のマーカーの使用により、当業者は、商業的に関連するタマネギ系統に疾病抵抗性形質または他の望ましい形質を遺伝子移入および組み合わせ(“スタック”)するために遺伝子マーカーを使用し得る。特定の態様において、本発明のタマネギ植物を、望む形質を含むハイブリッドタマネギ植物または変種を生産するために交配させ得る。
本発明によって、同定された疾病抵抗性ＱＴＬを任意のタマネギ遺伝的背景に遺伝子移入し得る。一つの態様において、例えば北米黄タマネギまたは汎用黄タマネギを含む、黄色球根のような商業的に好ましい球根色を含むタマネギ系統を、球根色および／またはＣＰの欠失のような任意の付加的な望ましい形質と組み合わせて疾病抵抗性を付与するＱＴＬの遺伝子移入に使用し得る。それゆえに、本発明の方法を使用し、ここに同定されたまたは当分野で利用可能ないずれかの遺伝子源から出発して、任意の付加的形質と組み合わせたＦＢＲおよびＰＲを含む望む疾病抵抗性をさらに含む、任意の遺伝子型のタマネギ植物を生産し得る。さらに、このような植物は、他の望む形質、例えば農学的エリート形質を含むように製造し得る。
ある態様は、さらに、タマネギ植物において、望ましい球根色と結合し得る、疾病抵抗性と関連する遺伝子型を検出する方法を提供する。ある態様はまた、望ましい球根色と結合した疾病抵抗性と関連する遺伝子型をゲノムに含むタマネギ植物の同定および選択方法を提供する。さらなる態様は、望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性と関連する少なくとも１個の遺伝子移入された遺伝子座をそのゲノムに含むタマネギ植物の生産方法およびあるタマネギ品種へのこのような対立遺伝子の遺伝子移入方法を提供する。上記方法のいずれかにより製造したタマネギ植物およびその一部、ならびにこのような植物の生産および同定に使用し得る多型核酸配列も提供される。一つの態様において、本発明は、このようなタマネギ植物または球根またはこのような植物の他の植物部分を含む食品を提供する。
疾病抵抗性または望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性のような目的の表現型を得るためのマーカーの提供により、本発明は、高価で、時間集約的でおそらく信頼できない表現型アッセイに取って代わることが可能となり、顕著な経済化をもたらす。さらに、特定の遺伝子型を標的とすることにより、特定の好ましい表現型の頻度を明確に駆動するように、育種プログラムを設計できる。これらの結合のフィデリティーを、維持された予測能力および情報に基づく育種決定を確実にするために連続的にモニターし得る。
本発明によって、当業者は、ここに記載した望ましい球根色表現型と一体となった望ましい疾病抵抗性表現型を有する候補生殖質源を同定できる。本発明の技術を使用して、望ましい球根色と一体となった望ましい疾病抵抗性表現型を、このような１個または複数個の表現型と関連する遺伝子マーカーを同定でき、またはこのような技術を単独でまたは遺伝子アッセイと組み合わせて望む植物を同定するための表現型アッセイに用い、それによりまたここに記載する方法で新規品種の生産に使用し得る形質と関連するマーカー遺伝子型も同定し得る。
本発明は、ある遺伝的背景への望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性を付与する少なくとも第一遺伝子座の遺伝子移入を提供する。タマネギ生産の成功は、種々の園芸実務に対する注意に依存する。これらは、適切な施肥、適当な隙間を空けた作物定着、雑草防除および受粉用の蜂または他の昆虫の導入、注水および害虫管理への特定の注意を伴う土壌管理を含む。タマネギ作物は、当分野で知られる方法で、とりわけ、種または始動球根から定着させ得る。始動球根は、直接播種から生産した作物と比較して、収穫が早くなり得る。
望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性を有するタマネギ植物の開発
本開示は、タマネギ植物の疾病抵抗性に大きな影響を与える定量的形質遺伝子座(ＱＴＬ)および球根色に大きな影響を与えるＱＴＬ、ならびにマーカー利用選抜(ＭＡＳ)および／またはマーカー利用戻し交配によるような、望ましい生殖質へのＱＴＬの追跡および遺伝子移入に使用できる、このような遺伝子座に遺伝的に連鎖したかつ予測であるマーカーを同定する。本発明はまた、望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性を付与する単一遺伝子座の遺伝子移入も提供する。このような望ましい球根色は、ここに記載するまたは当分野で知られる球根色遺伝子座またはＣＰの遺伝子座の欠失により付与され得る。本発明のタマネギ植物はまた、疾病抵抗性および望む球根色の両者を有するタマネギ植物を生産するために、望ましい球根色を含むタマネギ植物への疾病抵抗性を付与する１個以上のＱＴＬの遺伝子移入によっても製造できる。
実施例に記載するとおり、ＦＢＲおよびＰＲに対する疾病抵抗性に対する５個のＱＴＬが、球根色および／またはＣＰを制御する３個の遺伝子座と共に同定された。これらの色遺伝子座の一つは、アントシアニン生合成経路からの候補遺伝子においてマーカーと共存することが判明した。ＦＢＲおよびＰＲ両者の主作用ＱＴＬは、ＬＧ２上の類似領域に局在し、そこには、ピンク補色の遺伝子座の１個も局在した。これらのマッピング結果は、ＦＢＲ、ＰＲおよびＣＰ形質の連鎖、そしてなぜタマネギ育種の間に、ＣＰ無しでこれらの疾病に対する抵抗性を組み合わせることが困難であったかを確認した。これらの疾病形質のＱＴＬ区間およびマーカーを、本発明で使用して、新タマネギ系統および変種を開発し得る。一つの態様において、例えばここに記載するとおりＬＧ２上の新規ｃｉｓ結合連鎖は、とりわけ、北米黄タマネギおよび汎用黄タマネギのようなドナータマネギ系統における疾病抵抗性の組み合わせを可能にする。
本発明は、このようなＱＴＬおよびそのあらゆる組み合わせの、ある遺伝的背景への追跡および導入を意図する。当業者は、このＱＴＬにより付与される１種以上の疾病に対する抵抗性を、ＭＡＳを介して、ここに記載する遺伝子座を使用して、一つの遺伝子型から他へ遺伝子移入し得ることを理解する。したがって、１種以上の疾病に対する抵抗性を有するタマネギ生殖質源を選択できる。このＱＴＬを使用して、育種家は、ここに記載する領域に対してＭＡＳを使用して、疾病に対する抵抗性または望ましい球根色と一体となった疾病に対する抵抗性を有するタマネギ植物を選択でき、または育種中に表現型を追跡できる。本開示の提供により、当業者は、任意の遺伝的背景に、望む球根色と一体となった１種以上の疾病に対する抵抗性を導入できる。
ここで同定したＱＴＬを、タマネギにおいて、望ましい球根色と一体となった１種以上の疾病に対する抵抗性に対するＭＡＳに使用し得る。望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性と関連するＱＴＬのこの発見は、複数疾病に抵抗性を有する、商業的に価値あるタマネギ植物またはその変種の開発を促進し得る。
ほとんどの育種目標のために、商業用育種家は、“栽培種”または“エリート”としばしば呼ばれる生殖質の範囲内で作業し得る。この生殖質は、園芸性能を評価するときに一般的に良い成績であるために、植物育種で使用が容易である。栽培種がもたらす性能利益は、対立遺伝子多様性の欠如により相殺されることがある。これは、栽培生殖質で作業するときに、育種家が受け入れる代償である − 対立遺伝子多様性欠如を代償に良好な全体的性能を達成。遺伝的に多様な源で育種したときよりも栽培された材料で作業するときの方が進歩が早いために、育種家は、一般的にこの代償を受け入れる。
対照的に、育種家が種内交配または種間交配を行うとき、逆の代償が起こる。これらの例において、育種家は、典型的に栽培生殖質と非栽培種を交配する。このような交配において、育種家は、非栽培種からの新規対立遺伝子の利用を増やし得るが、ドナー親と関連する遺伝子の引きずり(genetic drag)に打ち勝たなければならないかもしれない。この育種戦略の困難さから、このアプローチは、繁殖性および繁殖力問題のためにしばしば失敗する。この育種アプローチの困難さは多くの作物に広がり、１９４４年に最初にトマトで記載された重要な疾病抵抗性表現型が例である(非特許文献１)。この交配において、線虫疾病抵抗性は、リコペルシコン・ペルヴィアヌム(L. peruvianum)(PI128657)から栽培トマトに伝達された。集中的育種にも係わらず、１９７０年代半ばまで、育種家は遺伝子の引きずりに打ち勝つことができず、この形質を持つ系統の発表に成功しなかった。実際、今日でさえ、トマト育種家は、この疾病抵抗性遺伝子を、ただ１種の親のみからハイブリッド品種に伝達している。
今まで、許容される商業用種への新規抵抗性遺伝子の遺伝子移入方法は、長く、しばしば達成が困難な方法であり、形質が多遺伝子性であり得るか、または低遺伝率を有し得るか、連鎖引きずり(linkage drag)またはこれらのいくつかの組み合わせを有し得るため、困難であり得る。いくつかの表現型が、遺伝子型により一遺伝子座で決定されているが、自然に見られるほとんどの多様性は連続的である。単純に遺伝性の形質と異なり、連続的多様性はおそらく多遺伝子性遺伝の結果であり、追跡が困難である。連続的多様性に影響する遺伝子座をＱＴＬと呼ぶ。定量的形質の表現型における多様性は、ＱＴＬの対立遺伝子組成および環境影響の結果である。形質の遺伝率は、０〜１.０で変動する遺伝分散の結果である表現型多様性の比である。それゆえに、約１.０の遺伝率の形質は、環境により大きな影響は受けない。当業者は、高遺伝率園芸形質を有する商業用系統を作る重要性を、これらの栽培品種が、栽培者が均質市場仕様の作物を生産することを可能にするため、認識している。
タマネギにおける疾病抵抗性および好ましい球根色と関連するゲノム領域、ＱＴＬ、多型核酸および対立遺伝子
本発明で有用なマーカーをタマネギゲノムから設計できる。Duangjitらは、タマネギゲノムの最新の公的に入手可能な遺伝子地図を公開した(非特許文献２)。出願人らは、ある対立形質で存在するとき、タマネギにおける疾病抵抗性および好ましい球根色と関連するゲノム領域、ＱＴＬ、対立遺伝子、多型核酸、連鎖マーカーなどを発見した。ここに略記した方法を使用して、タマネギにおいて乾腐病(ＦＢＲ)および紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性と同時に好ましい球根色も示すＱＴＬが同定された。このような形質と関連するゲノム領域は、遺伝子座ＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)により規定されるタマネギ連鎖群２(ＬＧ２)；遺伝子座ＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)により規定されるＬＧ２；遺伝子座ＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)により規定されるＬＧ２；遺伝子座ＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)により規定されるＬＧ３；遺伝子座ＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)により規定されるＬＧ４；遺伝子座ＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)により規定されるＬＧ４；遺伝子座ＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)により規定されるＬＧ４；または遺伝子座ＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)により規定されるＬＧ６に位置した。
本開示の種々の態様のいくつかは、このようなゲノム領域にまたは領域内に位置するＱＴＬまたは多型核酸マーカーまたは対立遺伝子を使用する。複数疾病に対する抵抗性または好ましい球根色と関連するゲノム領域を同定したＬＧ２上のフランキングマーカーは、ＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)を含む。複数疾病に対する抵抗性または好ましい球根色と関連するゲノム領域を同定したＬＧ２上の介在マーカーは、少なくとも配列番号４〜２８のいずれかを含み得る。疾病に対する抵抗性または好ましい球根色と関連するゲノム領域を同定したＬＧ３上のフランキングマーカーは、ＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)を含む。疾病に対する抵抗性または好ましい球根色と関連するゲノム領域を同定したＬＧ３上の介在マーカーは、少なくとも配列番号３１〜３５のいずれかを含み得る。複数疾病に対する抵抗性または好ましい球根色と関連するゲノム領域を同定したＬＧ４上のフランキングマーカーは、ＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)を含む。複数疾病に対する抵抗性または好ましい球根色と関連するゲノム領域を同定したＬＧ４上の介在マーカーは、少なくとも配列番号３８〜６２のいずれかを含み得る。疾病に対する抵抗性または好ましい球根色と関連するゲノム領域を同定したＬＧ６上のフランキングマーカーは、ＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)を含む。疾病に対する抵抗性または好ましい球根色と関連するゲノム領域を同定したＬＧ６上の介在マーカーは、少なくとも配列番号６５〜７３のいずれかを含み得る。疾病抵抗性および／または好ましい球根色と関連するこれらのゲノム領域またはその小領域は、ここに記載するマーカーのいずれかが隣接するまたはこれにより規定されると言うことができるが、当業者は、さらなるマーカーも同様に使用できることを認識する。
上記マーカーおよび対立遺伝子状態の例である。当業者は、本開示に一致して、タマネギにおける疾病抵抗性または望ましい球根色と関連する他の多型核酸マーカーおよびその対立遺伝子状態を有するタマネギ植物をどのように同定するか認識する。当業者はまた、タマネギにおける疾病抵抗性または望ましい球根色との関連を決定するために、ここで同定されたゲノム領域に位置するまたはＱＴＬまたは他のマーカーと連鎖している他の多型核酸マーカーの対立遺伝子状態をどのように同定するかも知っている。
当業者は、同定されたゲノム領域に位置する多型核酸を、本発明の方法のある態様において使用できることを理解する。ここで同定されたゲノム領域、ＱＴＬおよび多型性マーカーのここでの条件を考慮して、本表現型と関連する、ここに記載したゲノム領域内またはゲノム領域付近に位置するさらなるマーカーを、種々の生殖質における新規マーカーのタイピングにより得ることができるかもしれない。ここで同定されたゲノム領域、ＱＴＬおよび多型性マーカーはまた、公的に入手可能な物理または遺伝子地図のいずれかに対してマッピングして、このような地図上にここに記載した領域を配置することもできる。当業者はまた、タマネギにおける疾病抵抗性または望ましい球根色と関連するＱＴＬと遺伝的に連鎖し、タマネギにおける疾病抵抗性または望ましい球根色と関連するＱＴＬまたはマーカーの約４０cM、２０cM、１０cM、５cMまたは１cM内に位置するさらなる多型核酸も使用してよいことも理解する。
タマネギにおける疾病抵抗性および／または望ましい球根色と関連するゲノム遺伝子座の遺伝子移入
ここに提供されるのは、疾病抵抗性および／または望ましい球根色と関連する１個以上の遺伝子移入されたゲノム領域を含むタマネギ植物およびそれを得る方法である。マーカー利用遺伝子移入は、１個以上のマーカーにより規定される染色体領域の、ある生殖質から第二の生殖質への伝達を含む。遺伝子移入されたゲノム領域を含む、交配の子孫を、第一生殖質(例えば、タマネギにおける疾病抵抗性または望ましい球根色を有する生殖質)からの望む遺伝子移入されたゲノム領域のマーカー特性および第二の生殖質の望む遺伝的背景の連鎖および非連鎖マーカー特性の両者の組み合わせにより同定できる。
これらのゲノム区間のいずれかのテロメア近位末端およびセントロメア近位末端に位置するフランキングマーカーは、タマネギにおける望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性と関連するゲノム領域の、他の表現型と関連する遺伝子型を通常含む生殖質と関連するマーカーを含む遺伝的背景に遺伝子移入することを含むが、これに限定されない、多様な育種アプローチに有用であり得る。
同定された疾病抵抗性および／または望ましい球根色ＱＴＬと連鎖し、それと直接隣接しているかまたは隣接しており、該ＱＴＬを含む源生殖質からの外来性の連鎖ＤＮＡの非存在下でのＱＴＬの遺伝子移入を可能にするマーカーを、ここに提供する。当業者は、ここに記載するタマネギにおける疾病抵抗性および／または望ましい球根色と関連するＱＴＬを含む小ゲノム領域の遺伝子移入を探求するとき、該ＱＴＬを含む大ゲノム領域に直接隣接したテロメア近位またはセントロメア近位マーカーのいずれかを、小ゲノム領域の遺伝子移入に使用できることを認識する。
ここに記載する疾病抵抗性ＱＴＬまたは望ましい球根色ＱＴＬのマーカーから約４０cM以内のマーカーは、例えば、タマネギにおける望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性と関連するゲノム領域の、他の表現型と関連する遺伝子型を通常含む生殖質と関連するマーカーを含む遺伝的背景に遺伝子移入することを含むが、これに限定されない種々の育種アプローチに有用であり得る。例えば、ここに記載する疾病抵抗性ＱＴＬまたは望ましい球根色ＱＴＬまたはマーカーと４０cM、２０cM、１５cM、１０cM、５cM、２cMまたは１cM以内またはそれ未満であるマーカーを、タマネギにおける望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性のマーカー利用遺伝子移入に使用できる。
ここに記載するＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ４および／またはＬＧ６上の疾病抵抗性または望ましい球根色表現型ＱＴＬマーカーと連鎖不平衡のマーカーを、したがって、タマネギにおける疾病抵抗性または望ましい球根色のマーカー利用遺伝子移入のために使用できる。例えば、ここに記載するＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ４および／またはＬＧ６上の疾病抵抗性または望ましい球根色ＱＴＬマーカーの４０cM、２０cM、１５cM、１０cM、５cM、２cMまたは１cM以内のを、疾病抵抗性または望ましい球根色のマーカー利用遺伝子移入に使用できる。上記のとおり、ＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ４および／またはＬＧ６上の疾病抵抗性または望ましい球根色ＱＴＬマーカーは、配列番号１〜７４のいずれかまたはここに記載するいずれかの遺伝子座または小領域、ならびにこれらの同一領域にあり、遺伝的に連鎖する他の既知マーカーを含み得る。
分子利用育種技法
本発明の実施に際して使用できる遺伝子マーカーは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)、増幅断片長多型(ＡＦＬＰ)、単純反復配列(ＳＳＲ)、単純配列長多型(ＳＳＬＰｓ)、一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)、挿入／欠失多型(Ｉｎｄｅｌｓ)、タンデム反復数(ＶＮＴＲ)および 無作為増幅多型ＤＮＡ(ＲＡＰＤ)、アイソザイムおよび当業者に知られるその他を含むが、これらに限定されない。作物におけるマーカー発見および開発は、マーカー利用育種活動への応用のための初期構想を提供する(特許文献１〜４)。得られた“遺伝子地図”は、特徴付けられた遺伝子座(多型核酸マーカーまたは対立遺伝子が同定され得る任意の他の遺伝子座)の互いの相対位置を表す。
できるだけ少ない単一ヌクレオチド変化を含む多型を、幾つかの方法でアッセイできる。例えば、一本鎖高次構造多型分析(非特許文献３)、変性勾配ゲル電気泳動(非特許文献４)または切断断片長多型(非特許文献５)を含む電気泳動技法により検出できるが、ＤＮＡ配列解読装置の普及により、しばしば直接増副産物を配列決定することが容易となる。多型性配列差異が判明したら、典型的に特定の対立遺伝子のＰＣＲ増幅のあるバージョン(非特許文献６)または複数特定対立遺伝子のＰＣＲ増幅(非特許文献７)を含む、迅速なアッセイを子孫試験のために設計できる。
一組のものとして、多型性マーカーは、系統または品種の同一性の情報のために植物をフィンガープリンティングする有益なツールとして働く(特許文献５)。これらのマーカーは、表現型との関連を決定する基礎を構成し、遺伝獲得を駆動し得る。本発明の方法のある態様において、多型核酸を使用して、タマネギ植物において、望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性と関連する遺伝子型を検出し、望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性と関連する遺伝子型を有するタマネギ植物を同定し、望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性と関連する遺伝子型を有するタマネギ植物を選択できる。本発明の方法のある態様において、多型核酸を使用して、ゲノムに望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性と関連する遺伝子移入された遺伝子座を含むタマネギ植物の生産に使用できる。本発明のある態様において、多型核酸を使用して、望ましい球根色と一体となった疾病抵抗性と関連する遺伝子座を含む子孫タマネギ植物を育種できる。
ある遺伝子マーカーは、“優性”または“共優性”マーカーを含み得る。“共優性”マーカーは、２個以上の対立遺伝子(二倍体個体あたり２個)の存在を明らかにする。“優性”マーカーは単一対立遺伝子のみの存在を明らかにする。マーカーは、好ましくは共優性形態で遺伝性であり、それにより二倍体遺伝子座における両対立遺伝子または三倍体または四倍体遺伝子座における複数対立遺伝子の存在が容易に検出可能であり、環境性多様性がなく、すなわち、その遺伝率は１である。マーカー遺伝子型は、典型的に二倍体生物における各遺伝子座に２個のマーカー対立遺伝子を含む。各遺伝子座のマーカー対立遺伝子組成はホモ接合またはヘテロ接合であり得る。ホモ接合性は、遺伝子座における両対立遺伝子が同じヌクレオチド配列により特徴付けられる状態である。ヘテロ接合性は、遺伝子座の対立遺伝子の異なる状態をいう。
遺伝子多型の存在または不在を決定するための核酸ベース分析(すなわち遺伝子型判定のため)を、同定、選択、遺伝子移入などのために育種プログラムに使用できる。遺伝子多型を分析するための広範な遺伝子マーカーが利用可能であり、当業者に知られる。本分析を使用して、疾病抵抗性または望ましい球根色表現型と連鎖しているまたは関連する遺伝子マーカーを含むまたは連鎖している遺伝子、遺伝子の部分、ＱＴＬ、対立遺伝子またはゲノム領域を選択し得る。
ここで使用する、核酸分析方法は、ＰＣＲベースの検出方法(例えば、TaqManアッセイ)、マイクロアレイ方法、マススペクトロメトリーベースの方法および／または全ゲノム配列決定を含む核酸配列決定方法を含む。ある態様において、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡサンプル中の多型部位検出は、核酸増幅方法の使用を介して促進され得る。このような方法は、特に多型部位に及ぶポリヌクレオチド濃度を上げるまたはそれに遠位または近位に位置する部位および配列を含む。このような増幅分子を、ゲル電気泳動、蛍光検出方法または他の手段により容易に検出できる。
ＰＣＲにおけるTaqMan(登録商標)プローブの使用は当分野で知られ(例えば、非特許文献８参照)、フルオロフォアベースの検出によるＰＣＲアッセイの特異性増加を可能にする。本発明の一態様において、表３に示すもののようなTaqMan(登録商標)プローブを使用して、疾病抵抗性を付与するＳＮＰを検出できる。TaqMan(登録商標)アッセイは、ＳＮＰ部位に隣接する領域を標的とする２個の特定のプライマーおよびプローブの５’末端に共有結合した各々異なるフルオロフォア(ＶＩＣまたは６−ＦＡＭ)で標識された２個の蛍光プローブを含む。３’末端近位の非蛍光クエンチャーは、プローブが分解されないならば、蛍光遊離を妨げる。ＰＣＲ中、ＤＮＡフラグメントと特異的にハイブリダイズするプローブが破壊され、対応するフルオロフォアの蛍光が遊離される。
このような増幅を達成する一つの方法は、多型を規定する近位配列に、その二本鎖形態でハイブリダイズできるプライマー対を使用する、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用する(非特許文献９；および特許文献６〜１３)。マススペクトロメトリーに基づきＤＮＡをタイピングする方法も使用できる。このような方法は、特許文献１４および１５ならびにその中に記載された引用文献に開示される。
ＤＮＡ配列の多型は、全て引用によりその全体を本明細書に包含させる特許文献１５〜２５に開示されているものを含むが、これらに限定されない種々の有効な周知の方法により検出または分類できる。しかしながら、本発明の組成物および方法は、ゲノムＤＮＡサンプルにおける多型を分類するための何れかの多型タイピング方法と組み合わせて使用できる。使用したこれらのゲノムＤＮＡサンプルは、植物から直接単離したゲノムＤＮＡ、クローン化ゲノムＤＮＡまたは増幅ゲノムＤＮＡを含むが、これらに限定されない。
例えば、ＤＮＡ配列における多型は、特許文献３６および３７に開示されたとおり、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)プローブとのハイブリダイゼーションにより検出できる。特許文献３６は、ヌクレオチド多様性を含む配列を増幅し、膜上にスポットし、そして標識配列特異的オリゴヌクレオチドプローブで処理する工程により、核酸において、核酸配列中の単一または複数ヌクレオチド多様性が検出できる、対立遺伝子特定のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを開示する。
標的核酸配列もまた、目的の配列を増幅し、プローブとハイブリダイズし、続いてプローブの標識部分をライゲーションする、特許文献２８に開示するプローブライゲーション方法により検出できる。
マイクロアレイも多型検出に使用でき、ここで、オリゴヌクレオチドプローブセットを、標的配列における一点の差が部分的プローブハイブリダイゼーションをもたらすように、単一配列を表すように重複形態で集合させる(非特許文献１０)。任意の１個のマイクロアレイ上で、複数の標的配列が存在することが予測され、これは、遺伝子および／または非コード領域を表し、ここで、各標的配列は単一プローブよりも一連の重複オリゴヌクレオチドにより表される。このプラットホームは、複数の多型のハイスループットスクリーニングを提供する。マイクロアレイベースの方法による標的配列のタイピングは、特許文献３８〜４０に開示されている。
標的核酸配列を、標的核酸配列の隣接部分に相同な配列を有し、プローブと標的核酸配列の塩基対形成により幹を形成するように非共有結合的に結合する側鎖を有する、少なくとも１対のプローブを用いる、特許文献２９に開示されたとおりのプローブ連結方法によっても検出できる。側鎖の少なくとも１個は光活性化可能基を有し、これは幹の他の側鎖メンバーと共有結合架橋を形成できる。
ＳＮＰおよびＩｎｄｅｌｓを検出する他の方法は、一塩基伸長(ＳＢＥ)方法を含む。ＳＢＥ方法の例は、特許文献２１〜特許文献２５に開示のものを含むが、これらに限定されない。ＳＢＥ方法は、ヌクレオチドプライマーの伸長に基づき、これは、該プライマーの伸長により多型に隣接する検出可能なヌクレオチド残基を取り込むことができる。ある態様において、ＳＢＥ方法は、３個の合成オリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドの２個はＰＣＲプライマーとして働き、アッセイすべき多型を含む領域に隣接するゲノムＤＮＡの遺伝子座の配列に相補的である。多型を含むゲノム領域の増幅後、ＰＣＲ産物を、ＤＮＡポリメラーゼおよび２種の異なって標識されたジデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下に多型に隣接する増幅ＤＮＡとハイブリダイズするように設計された第三のオリゴヌクレオチド(伸長プライマーと呼ばれる)と混合する。多型が鋳型に存在するならば、標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸の１個を、一塩基鎖伸長でプライマーに付加できる。存在する対立遺伝子を、その後、２個の異なった標識のいずれが伸長プライマーに付加したかの決定により推測する。ホモ接合サンプルでは、２個の標識塩基の１個しか取り込まれず、ゆえに、２個の標識中１個しか検出されない。ヘテロ接合サンプルは、存在する両対立遺伝子を有し、ゆえに、両標識の直接取り込み(伸長プライマーの異なる分子に)、したがって両標識が検出される。
多型を検出する他の方法において、ＳＮＰおよびＩｎｄｅｌｓは、５’蛍光レポーター色素および３’クエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドプローブが、プローブの５’および３’末端に共有結合する、特許文献１８；特許文献１９；および特許文献２０に開示された方法で検出できる。プローブが無傷であるとき、レポーター色素のクエンチャー色素への近接が、例えばフェルスター型エネルギー移動により、レポーター色素蛍光を抑制する。ＰＣＲ中、順方向および逆方向プライマーは、多型に隣接した標的ＤＮＡの特定の配列とハイブリダイズし、一方ハイブリダイゼーションプローブは、増幅ＰＣＲ産物内の多型含有配列とハイブリダイズする。その後のＰＣＲサイクルにおいて、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼはプローブを開裂し、レポーター色素をクエンチャー色素から離し、レポーターの蛍光を増大させる。
他の態様において、目的の１個または複数個の遺伝子座を、核酸配列決定テクノロジーを使用して直接配列決定できる。核酸配列決定の方法は当分野で知られ、454 Life Sciences(Branford、CT)、Agencourt Bioscience(Beverly、MA)、Applied Biosystems(Foster City、CA)、LI-COR Biosciences(Lincoln、NE)、NimbleGen Systems(Madison、WI)、Illumina(San Diego、CA)およびVisiGen Biotechnologies(Houston、TX)により提供されるテクノロジーを含む。このような核酸配列決定テクノロジーは、非特許文献１１に概説されるとおり、平行ビーズアレイ、ライゲーションによる配列決定、キャピラリー電気泳動、電子マイクロチップ、“バイオチップ”、マイクロアレイ、平行マイクロチップおよび単一分子アレイのような形態を含む。
本発明の方法で使用するマーカーは、その後の集団に関して推測するために好ましくは起源を示すものでなければならない。今までの経験により、ＳＮＰマーカーは、特定のＳＮＰ対立遺伝子が特定の種の現存集団の独立した起源に由来する可能性が極めて低いため、マッピングに理想的であろうことが示唆される。そのようなものとして、ＳＮＰマーカーは、ＱＴＬの遺伝子移入の追跡および補助に有用であると考えられる。
定義
次の定義を、本発明をよりよく特定し、本発明の実施に際し当業者の指針となるように提供する。特に断らない限り、用語は、関連分野の当業者の一般的使用と一致すると理解されるべきである。
ここで使用する、“望む球根色”または“望ましい球根色”または“好ましい球根色”は、黄色のような商業的に許容される色を示し、ピンク補色(ＣＰ)により付与されるような有害なまたは望ましくない着色を欠くタマネギ球根をいう。
ここで使用する、用語“植物”は、植物細胞、植物プロトプラスト、タマネギ植物を再生できる組織培養の植物細胞、植物カルス、植物凝集塊および植物で無傷の植物細胞または花粉、花、種、葉、幹などのような植物の一部を含む。
ここで使用する、用語“集団”は、共通親起源を共有する植物の遺伝的に異種性のコレクションを意味する。
ここで使用する、用語“品種”および“栽培品種”は、遺伝子系統および性能により、同一種内の他品種から同定できる類似植物群を意味する。
ここで使用する、“対立遺伝子”は、染色体上のある遺伝子座のゲノム配列の２個以上の代替形態の一つをいう。
“定量的形質遺伝子座(ＱＴＬ)”は、表現型の発現度に影響する少なくとも第一対立遺伝子をコードする染色体位置である。
ここで使用する、“反発”または“反発相”は、２個の遺伝子からの対立遺伝子の遺伝であって、２個の遺伝子座の各々での望む対立遺伝子が異なる相同染色体に見られる場合をいう。これは対立遺伝子の“ｔｒａｎｓ”配置ともいう。
ここで使用する、“マーカー”は、生物間を区別するために使用できる検出可能特性をいう。このような特性の例は、遺伝子マーカー、生化学的マーカー、代謝物、形態学的特性および農学的特性を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する、用語“表現型”は、遺伝子発現により影響を受け得る細胞または生物の検出可能特性を意味する。
ここで使用する、用語“遺伝子型”は、植物の特定の対立遺伝子構造をいう。
ここで使用する、用語“遺伝子移入された”は、遺伝子座と関連して使用するとき、戻し交配を介するような、新規遺伝的背景に導入されている遺伝子座をいう。遺伝子座の遺伝子移入は、ゆえに、植物育種方法および／または分子遺伝学的方法により達成できる。このような分子遺伝学的方法は、種々の植物形質転換技法および／または相同組み換え、非相同組み換え、部位特異的組み換えを提供する方法および／または遺伝子座置換または遺伝子座変換を提供するゲノム修飾を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する、用語“連鎖した”は、核酸マーカーおよび／またはゲノム領域の文脈で使用するとき、マーカーおよび／またはゲノム領域が、減数分裂に一緒に分離する傾向となるように、同一連鎖群または染色体に位置することを意味する。
ここで使用する、用語“表す”は、植物遺伝子型と関連して使用したとき、植物がある遺伝子型を有することを示す、何らかの方法をいう。これは、ある遺伝子型を有する植物を同定するあらゆる手段を含む。ある遺伝子型の指標は、植物の遺伝子型が提供される、書面または電子媒体またはデータベースのいずれかのタイプへの任意のエントリーを含み得るが、これらに限定されない。ある遺伝子型の指標はまた、植物が物理的に印を付されるまたは標識される何らかの方法も含み得るが、これらに限定されない。本発明で有用な物理的マーキングまたは標識は、バーコード、無線周波数認識装置(ＲＦＩＤ)、ラベルなどを含むが、これらに限定されない。
次に開示する態様は、本発明の単なる代表例であり、これは種々の形態に具現化し得る。それゆえに、下の実施例に開示する特定の構造的、機能的および方法的詳細は、限定的と見なしてはならない。
実施例１
タマネギにおける疾病マッピング
起始タマネギ系統SYG-75-1706/Serranaからの大Ｆ２：３マッピング集団(約６２０系統群、複数疾病にわたり選択的に表現型分類した)を作製し、種々の形質について表現型分類した。これにより、タマネギにおける乾腐病(ＦＢＲ)および紅色根腐病(ＰＲ)の２種の重要な疾病のＱＴＬが同定された。デフォレスト(ウィスコンシン州)(ＦＢＲおよびＰＲについての播種実生栽培箱試験)およびドンナ(テキサス州)(ＰＲについての成熟植物／球根実地評価)で行った表現型に基づき、これらの形質についての数個の主要なＱＴＬが同定された(表１)。最も顕著なことは、ＦＢＲおよびＰＲ抵抗性が、連鎖群２(ＬＧ２)上の類似領域に対する反発相に、ピンク補色(ＬＧ２上の６２.５にマッピング)の第三の有害形質もこの集団に位置づけられている場所である遺伝子位置で、マッピングされた。ピンク補色とのこの反発連鎖は、在来種ドナーSerranaからのＦＢＲ抵抗性がエリートタマネギ生殖質に育種することが極めて困難であった理由と見なされた。従って、ＦＢＲ抵抗性、ＰＲ抵抗性および球根色遺伝子座を、育種プログラムへの同時遺伝子移入のために正しい相で連鎖させる努力をした。この試みにより同定されたＱＴＬを下の表１に示す。
上記ＱＴＬ研究に加えて、ＰＲ抵抗性も、不完全優性制御下の単一遺伝子として予測される行動のために、同じ集団(SYG-75-1706/Serrana)におけるバイナリー形質としてマッピングした。バイナリーマッピングは、ＰＲ抵抗性を、ＬＧ２上の５６.３cMに確認した。
実施例２
タマネギにおける球根色マッピング
タマネギの色を制御する３遺伝子座を、ＬＧ２、ＬＧ４およびＬＧ６にマッピングした。２個の上位遺伝子座により制御されることが報告されているピンク補色(ＣＰ)を、実施例１に記載のとおり、同じSYG-75-1706/Serrana集団でＬＧ６およびＬＧ２にマッピングした。ピンク補色は、エリートタマネギ系統と、ある種のより外来性の生殖質を含む広い交配種にそれ自体顕在化する球根色現象である。これは伝統的に、Serranaのようなブラジル産タマネギ在来種に存在する、ＦＢＲのようなある疾病抵抗性に近づくバリアを作っていた。ＣＰ遺伝子座は、バイナリー形質(黄色対薄紅色球根表現型)としてＬＧ６：〜２２.４cMおよびＬＧ２：〜６２.５cMの位置にマッピングされた。ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ(ＤＦＲ)遺伝子に基づく候補遺伝子マーカーを開発し、ＬＧ６上の同じ領域にマッピングし、球根色を制御するＲ遺伝子座であることが疑われる。
球根色について分離した(黄色、白色、赤色、ピンク色球根について分離)第二の、エリート×エリートＦ２マッピング集団(SWL-74-14197-DH/HRL-77-5225B)において、２個のＱＴＬが球根色について同定された。親SWL-74-14197は白色球根であり、HRL-77-5225Bは赤色球根である。ＬＧ４上の〜５３cMのＱＴＬが、色素の生産／阻害を制御しているように見え、一方ＬＧ６上の〜２２.４cM遺伝子のＱＴＬが赤色色素生産を制御しているように見える。
色についてのまたはＣＰと球根色の両者についてのＬＧ６遺伝子座が両集団／形質で同じように見え、おそらくＲ遺伝子座またはＤＦＲ遺伝子であり、それに対して、アントシアニン生合成経路に対するこの候補遺伝子からのマーカーをマッピングする(ＮＡＣＥＰ００９０８９３６９およびＮＡＣＥＰ００９０９０９６９、それぞれＬＧ６：２２.３cMおよび２２.６cMにマッピング)。
実施例３
ＦＢＲ、ＰＲおよび色のＣｉｓ結合連鎖
SYG-75-1706/Serrana Ｆ２：３集団内で、北米黄タマネギおよび汎用黄タマネギタマネギ系統の両者において、ＦＢＲ抵抗性とＰＲ抵抗性を合わせる機会がある。色および疾病抵抗性の根底を成す主ＱＴＬ／遺伝子の同定と共に、表現型および遺伝子型情報を使用して、形質の組み合わせに使用できる組み換え系統群を同定できる。連鎖群２の連続的ハプロタイプストレッチに一緒に組み合わさった複数疾病抵抗性を有する、新規ｃｉｓ結合イベントが同定された。ＱＴＬ情報に基づき、次のハプロタイプが、汎用黄タマネギ球根において高レベルのＦＢＲおよびＰＲ抵抗性を有するための(すなわちＦＢＲ、ＰＲに対する抵抗性を有し、ＣＰを欠く単一タマネギ系統)最も望ましい配置であると見なされる。汎用黄タマネギ球根は、北米および南米生殖質の両方と交配でき、(補色)薄紅色球根を製造しないため、有利である。ＬＧ２での二重組み換えイベントがこの表現型を得るために必要である(図１)。北米黄タマネギドナーも、この生殖質を北米生殖質と交配したとき、ＣＰを生じないために、また望ましい。北米黄タマネギは、ＬＧ２上の１７０６対立遺伝子(６２〜６３位)により定義され、連鎖群２上の一組み換えしか必要としない。
それゆえに、ＦＢＲおよびＰＲに対する疾病抵抗性の５個のＱＴＬが、球根色および／またはＣＰを制御する３個の遺伝子座と共に同定された。これらの色遺伝子座の一つは、アントシアニン生合成経路からの候補遺伝子におけるマーカーと共存することが判明した。ＦＢＲおよびＰＲ両者の主作用ＱＴＬは、ＬＧ２上の同一領域に局在し、そこには、ピンク補色の遺伝子座の１個も局在した。これらのマッピング結果は、ＦＢＲ、ＰＲおよびピンク補色の疑われた連鎖および育種で全形質を組み合わせることの困難な理由を証明した。全体として、この情報は、これらの重要なタマネギ形質の遺伝子制御の見通しをもたらし、その結果エリートタマネギ系統に全形質を組み合わせるためのより制御されたアプローチを可能にする。これらの疾病形質についてのＱＴＬ区間およびマーカーが、新規開発的交配し、ＨＡＰＱＴＬ ＭＡＳアプローチにおいて生じる分離集団における使用を可能にする。さらに、イベント生成(event creation)が、北米黄タマネギおよび汎用黄タマネギ球根ドナーの両者におけるＦＢＲおよびＰＲ抵抗性を組み合わせるための、ＬＧ２上の新規ｃｉｓ結合連鎖の生成を可能にし得る。北米黄タマネギにＦＢＲおよびＰＲを合わせる組み換え事象も達成している。
実施例４
マーカーを利用する選択のためのマーカー
ＱＴＬ結果および区間に基づき、新開発交配におけるＨＡＰ ＱＴＬアプローチのための重要な疾病抵抗性遺伝子座のためのマーカーをここで提供する。タマネギ育種はＨＡＰ ＱＴＬアプローチしやすい。開発交配種ケージは、一植物×一植物交配パターンから成るため、各開発交配種に行く各植物の親マーカー遺伝子型を得ることができる。親遺伝子型を、マーカー利用選抜(ＭＡＳ)のための標的である可能性があると見なされる形質領域にあるコアセットのマーカーを使用して得ることができる(“マスター遺伝子座”として同定)。それゆえに、ケージあたり、選択した数の同じ多型性マーカー(二親性に基づき同定)を、繁殖×繁殖(Ｆ×Ｆ)交配における真性Ｆ１同定、ならびに目的の形質について分離される分離集団におけるその後の形質ＭＡＳに使用できる。これは、主流育種ワークフローを可能にする。表２は、ＭＡＳおよびＦ×Ｆワークフローで使用できるマーカーの例の一覧である。これらのマーカー配列を、ハイスループット実験室設定で使用するためのTaqMan(登録商標)アッセイ開発に使用した(表３)。これらのマーカーは、新規開発的交配における親遺伝子型判定のために使用できる“マスター遺伝子座”におけるマーカー、ならびにＦ×Ｆスクリーニングにおける各Ｆ１の同定およびまた得られた分離世代(典型的にＦ１Ｍ１)におけるＭＡＳ選択に使用できることが同定されている続く多型性マーカーとして働くことが意図される。
実施例５
タマネギ乾腐病(ＦＢＲ) ＬＧ２ ＱＴＬ精細マッピング
Ｆ３球根を、実施例１に記載の起始G-75-1706/Serrana-FBRマッピング集団から得た。分離Ｆ２：３系統群を、主作用ＦＢＲ ＱＴＬ領域を＞１２cMから５cM未満に狭めるために、ＬＧ２上のＦＢＲのＱＴＬ領域における望む遺伝子型データに基づき選択した。選択したＦ３系統群のＬＧ２ ＱＴＬ領域におけるＦ２遺伝子型を表４に記載する。表４に見られるとおり、F2:3 segpop系統群を、Ｆ２世代におけるＱＴＬ領域の“階段的”セクションのためにＦＢＲ ＱＴＬ ＬＧ２領域において組み換えおよびヘテロ接合(網掛け)を有するように選択した。Ｆ２個体におけるヘテロ接合領域を、好ましい対立遺伝子についてホモ接合および好ましくない対立遺伝子についてホモ接合のＦ３個体(球根)を、精細マッピングを可能にするためにＦ３世代におけるさらなる実験で選択できるように選択した。
表４における６種の系統群の各々からのＦ３球根のＬＧ２ ＱＴＬにおける遺伝子型に基づいて、ホモ接合の好ましいおよび好ましくない対立遺伝子の球根を選択した。例えば、分離集団RV_SYG-75-1706/SERRANA-FBR:01.0113交配種について、ＬＧ２上の４９.８位の位置でおよびそこから左でSerrana対立遺伝子について固定ホモ接合である１０種のＦ３球根およびＦＢＲ ＱＴＬ領域全体にわたりSYG-75-1706対立遺伝子交配種について固定ホモ接合である１０種のＦ３球根を選択した(表５参照)。６種の分離集団の各々について選択した球根(各対立遺伝子“群”について１個ずつの隔離ケージ)を、ウッドランド北部のケージ領域で１２月に１６個のヘッドケージに移植した。各“階段”での好ましいおよび好ましくない対立遺伝子のＦ３球根選択を別に集め、残りのゲノム異種性を維持しながら(近交弱勢および背景ＱＴＬ効果の機会を減少させ)、目的の組み換えＱＴＬ領域のみに固定した種を生産した。
集団採種の種を収穫し、ＦＢＲについて試験した。６系統群の各々について、その系統群の２個の集団採種した対立遺伝子“群”を表す２エントリー間の統計学的差異は、そのＦ３系統群を分離した各遺伝子区間にＦＢＲ抵抗性が位置するか否かの決定を可能とする。
その後、２９種のさらなるＦ２：３系統群を、ＬＧ２上のＦＢＲ ＱＴＬのさらなる精細マッピング、ならびにＬＧ３およびＬＧ４上のＦＢＲのＱＴＬの検証のために選択した。
ＦＢＲ ＱＴＬ精細マッピングプロジェクトのためのＦ３系統群は、ＬＧ２上のＦＢＲ ＱＴＬ領域をさらに狭めることを可能とする個体を生産するために、ＬＧ２上のＦＢＲ ＱＴＬ領域の多くの範囲を表す。
ＦＢＲ ＱＴＬ検証のためのＦ３系統群は、ＬＧ２上の主ＦＢＲ ＱＴＬ領域においてはSerrana好ましい対立遺伝子に固定されているが、ＬＧ３およびＬＧ４上の副ＱＴＬ領域についてはヘテロ接合である系統群により表される。副ＱＴＬの両対立遺伝子の種々の組み合わせについてホモ接合である個体を同様に選択して(ＬＧ２ ＱＴＬが固定されていると仮定して)、上記のとおり、副ＱＴＬがＦＢＲに重要なさらなる抵抗性をもたらすか否かを決定するために試験できる集団採種した種のエントリーを生産する。
実施例６
タマネギＦＢＲ−ＰＲ抵抗性形質結合プロジェクト
精細マッピングプロジェクトに準じて、ＦＢＲおよびＰＲ抵抗性の結合を、利用可能なＦ３球根を使用する２段アプローチならびにSYG-75-1706/Serrana集団からの遺伝子原料のＦ３種源の植え付けのを介して達成できた。球根を、ＬＧ２上のSerranaからのＦＢＲ ＱＴＬについての好ましい対立遺伝子と北米黄タマネギ球根(または汎用黄タマネギ)におけるＬＧ２上のSYG-75-1706からのＰＲについての好ましい対立遺伝子を組み合わせた個体を同定するためにサンプリングする。
挿木(steckling)／種源アプローチのために、７種のＦ３系統群を、ＬＧ２形質領域およびＬＧ６色ＱＴＬ領域における対立遺伝子の好ましい組み合わせ、ならびに好ましい表現型疾病源を有するようにＦ２植物マーカーデータに基づき選択した。Ｆ３種を植え、得られたＦ３植物を、ＬＧ２上のＦＢＲの主ＱＴＬ、ＬＧ３およびＬＧ４上のＦＢＲの副ＱＴＬ、ＬＧ２上のＰＲ ＱＴＬ領域と、ＬＧ２およびＬＧ６上の色ＱＴＬ領域を包含する、TaqManマーカーで遺伝子型分類した。各Ｆ３系統群からの組み換え個体は、固定されたまたはヘテロ接合状態のいずれかでできるだけ多くの形質の全装備を含むと同定され、“同類”個体をさらなる集団採種のためにヘッドケージに一緒に入れた。
表６は、最初に追跡のために選択されたＦ２系統群の代表的遺伝子型、および、形質の組み合わせのための望ましい組み換えを有するとして選択された得られたＦ３植物の選択を示す。ＬＧ２上のＦＢＲ抵抗性(ＦＢＲＲ)の好ましい対立遺伝子を示すマーカーを主基準として使用し、続いてＬＧ２上のＰＲ抵抗性(ＰＲＲ)の好ましい対立遺伝子、そして、最後に、ＬＧ２上のSerrana色対立遺伝子およびＬＧ６上のSYG-75-1706色対立遺伝子を組み合わせる、理想的には汎用黄タマネギの好ましい色対立遺伝子であった。しかしながら、北米黄タマネギの獲得もまた目標であり、これは、ＬＧ２およびＬＧ６色領域／ＱＴＬの両者でSYG-75-1706色対立遺伝子を必要とした。これらのケージからの集団採種した種を回収し、形質が組み合わさっていることを確認するために試験した。汎用黄タマネギＦＢＲ＋ＰＲ組み合わせの場合、これはＬＧ２上に二重組み換えを含み、それゆえにこれらは、全形質を固定するためにさらに一世代のＭＡＳが必要であった。
目的のＱＴＬ領域のＦ２遺伝子型を示しており、各Ｆ２前駆細胞の下は、形質ドナーを作製するためにケージ中での集団採種のために選択した(数)Ｆ３子孫の代表的遺伝子型である。望むハプロタイプは、ＦＢＲ＋ＰＲ抵抗性を有する北米または汎用黄タマネギであった。数ケージが北米黄タマネギＦＢＲ＋ＰＲドナーを提供し、数ケージが汎用黄タマネギＦＢＲ＋ＰＲドナーを提供した(さらに１ラウンドのＭＡＳを必要とした)。
実施例７
全て組み合わさったＦＢＲおよびＰＲ抵抗性を有する、汎用黄タマネギおよび北米黄タマネギドナーを達成するための必要な遺伝子組み合わせを有するリーディング生殖質イベントドナーは、連鎖群０２の標的領域における組み換えにより可能となった(表７)。この表のイベントドナーは、先に記載した表４および表６に示す選択の小集団である。表４および６系統群の起源は、本表では前駆細胞源番号(接頭辞“ＨＣＳ”)を介して同定できる。病理試験は、２種の汎用ドナーおよび３種の北米黄タマネギドナーが、抵抗性親Serranaと明らかに同等な高レベルのＦＢＲ抵抗性を有することを示す。同様に、球根色および／または紅色根腐病抵抗性は、先の世代のデータから、各表カラムに“黄色”または“抵抗”により示されるとおり、これらのドナーの幾つかで好ましく固定されていることが表現型分類により確認された。全例で、望む組み換えイベント(北米または汎用黄タマネギドナーそれぞれでＬＧ０２領域において必要な一または二組み換えイベント)が産生され、ＦＢＲ抵抗性が固定され、表現型分類により確認された。北米黄タマネギドナーイベントの２種は望むＬＧ０２およびＬＧ０６配置に固定された。本データセットで分離されている遺伝子型領域(表で“ＳＥＧ”と示す)は、固定された色遺伝子座配置またはＰＲ抵抗性を得るために、示す分子マーカーと共に、１回を超える育種サイクルで固定される。

Claims (29)

  1. 乾腐病および紅色根腐病に対する抵抗性を含むタマネギ植物であって、さらにピンク補色形質が欠失している、タマネギ植物。
  2. 連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される乾腐病に対する抵抗性、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される紅色根腐病に対する抵抗性および連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域によりピンク補色球根色が欠失しているｃｉｓ結合した連鎖を含む、請求項１に記載のタマネギ植物。
  3. 該ｃｉｓ結合した連鎖を北米黄タマネギおよび汎用黄タマネギから成る群から選択されるタマネギ品種に遺伝子移入する、請求項２に記載のタマネギ植物。
  4. さらに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、球根、幹、芽、種、プロトプラスト、細胞およびカルスとして規定される、請求項１に記載のタマネギ植物の部分。
  5. 農学的にエリート系統である、請求項１に記載のタマネギ植物。
  6. ハイブリッドまたは自殖である、請求項１に記載のタマネギ植物。
  7. ゲノム内に少なくとも１個の遺伝子移入された対立遺伝子座を含むタマネギ植物であって、該遺伝子移入された対立遺伝子座が：
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    または
    赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    を含む、タマネギ植物またはそこからの子孫植物。
  8. 連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される紅色根腐病に対する抵抗性および連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域によりピンク補色球根色を欠失しているｃｉｓ結合した連鎖を含む、請求項７に記載のタマネギ植物。
  9. 該ｃｉｓ結合した連鎖を北米黄タマネギおよび汎用黄タマネギから成る群から選択されるタマネギ品種に遺伝子移入する、請求項８に記載のタマネギ植物。
  10. さらに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、球根、幹、芽、種、プロトプラスト、細胞およびカルスとして規定される、請求項７に記載のタマネギ植物の部分。
  11. 農学的にエリート系統である、請求項７に記載のタマネギ植物。
  12. ハイブリッドまたは自殖である、請求項７に記載のタマネギ植物。
  13. 少なくとも１個のタマネギ植物において疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子型を検出する方法であって、(ｉ)少なくとも１個のタマネギ植物において疾病抵抗性または球根色と関連する少なくとも１個の多型核酸の対立遺伝子を検出する工程を含み、ここで、該多型核酸が、
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    または
    赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域内にあるか、遺伝的に連鎖している、方法。
  14. さらに(ii)疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子型が検出されている少なくとも１個のタマネギ植物を選択する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. タマネギ植物が農業生産的にエリート系統である、請求項１３に記載の方法。
  16. タマネギ植物がハイブリッドまたは自殖である、請求項１３に記載の方法。
  17. タマネギ植物が疾病抵抗性を含む少なくとも１個の親植物の交配から得られた子孫植物である、請求項１３に記載の方法。
  18. ゲノム内に疾病抵抗性または球根色と関連する少なくとも１個の遺伝子座を含むタマネギ植物の生産方法であって、
    (ｉ)疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子座を欠く第一タマネギ植物と：
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    または
    赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域
    により定義される疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子座を含む第二タマネギ植物を交配させ；
    (ii)該交配から得られた子孫において疾病抵抗性または球根色と関連する遺伝子座にあるまたは遺伝的に連結した少なくとも１個の多型座を検出し；そして
    (iii)疾病抵抗性または球根色と関連する該多型および該座を含むタマネギ植物を選択することを含む、方法。
  19. さらに(iv)工程(iii)のタマネギ植物とそれ自体または他のタマネギ植物を交配させて、さらなる世代を生産する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 工程(iii)および(iv)を約３回〜約１０回繰り返す、請求項１９に記載の方法。
  21. タマネギ植物が連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性、連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域により付与される紅色根腐病に対する抵抗性および連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義される該タマネギゲノム領域によりピンク補色球根色が欠失している、請求項１８に記載の方法。
  22. タマネギ植物が農業生産的にエリート系統である、請求項１８に記載の方法。
  23. タマネギがハイブリッドまたは自殖である、請求項１８に記載の方法。
  24. タマネギ植物育種方法であって、
    (ｉ)疾病抵抗性または球根色と関連するＱＴＬ内にあるか、遺伝的に連鎖している多型核酸の少なくとも１個の対立遺伝子を含む少なくとも第一タマネギ植物を選択し、ここで、該ＱＴＬが、
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    または
    赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域
    にマッピングされ；
    (ii)第一タマネギ植物とそれ自体または第二タマネギ植物を交配させて、疾病抵抗性または球根色に関連するＱＴＬを含む子孫タマネギ植物を生産することを含む、方法。
  25. 疾病抵抗性または球根色と関連する該ＱＴＬと遺伝的に連鎖している少なくとも１個の多型核酸が、疾病抵抗性または球根色と関連する該ＱＴＬの４０cM、２０cM、１５cM、１０cM、５cMまたは１cM内にマッピングされる、請求項２４に記載の方法。
  26. タマネギ植物に対立遺伝子を遺伝子移入する方法であって、
    (ｉ)次の領域に位置するまたは遺伝的に連鎖している少なくとも１個の多型核酸に関して、集団内の少なくとも１個のタマネギ植物を遺伝子型判定し：
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０３４５０３８(配列番号３)およびＮＱ０２５７３２６(配列番号２３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２７７(配列番号２２)およびＮＱ０２５８４５３(配列番号２７)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    ピンク補色球根色を欠失させる連鎖群２(ＬＧ２)上のＮＱ０２５７２２０(配列番号２６)およびＮＱ０２５７６９２(配列番号２９)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群３(ＬＧ３)上のＮＱ０２５８５２３(配列番号３０)およびＮＱ０３４５２０６(配列番号３６)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    乾腐病(ＦＢＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４５５６４(配列番号３８)およびＮＱ０２５７９１７(配列番号６３)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    紅色根腐病(ＰＲ)に対する抵抗性を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０３４４９７８(配列番号４９)およびＮＱ０３４４７６６(配列番号５５)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    球根色の発色または阻止を付与する連鎖群４(ＬＧ４)上のＮＱ０２５８３６１(配列番号３７)およびＮＱ０３４４７７８(配列番号６１)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    または
    赤色色素球根色を付与する連鎖群６(ＬＧ６)上のＮＱ０２５７３７８(配列番号６４)およびＮＱ０３４５７３４(配列番号７４)の遺伝子座により定義されるタマネギゲノム領域；
    (ii)疾病抵抗性または球根色と関連する少なくとも１個の対立遺伝子を含む少なくとも１個のタマネギ植物を集団から選択することを含む、方法。
  27. タマネギ植物が農業生産的にエリート系統である、請求項２６に記載の方法。
  28. タマネギがハイブリッドまたは自殖である、請求項２６に記載の方法。
  29. 請求項２６に記載の方法により得られる、タマネギ植物。
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