JP2020020642A

JP2020020642A - 被検体分析方法

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Publication number: JP2020020642A
Application number: JP2018143931A
Authority: JP
Inventors: 一彦藤原; Kazuhiko Fujiwara; 芳弘丸山; Yoshihiro Maruyama
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2020-02-06
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Abstract

【課題】より多くの種類の被検体について高効率なＳＥＲＳ分光による分析を容易に行うことができる方法を提供する。【解決手段】本発明の第１態様の被検体分析方法は、(1) 被検体、金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製する混合ステップＳ１１と、(2) 混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、被検体または被検体由来の物質を金属微小構造に付着させる金属微小構造生成ステップＳ１２と、(3) 支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップＳ１５と、(4) ラマン散乱光のスペクトルに基づいて被検体を分析する分析ステップＳ１６と、を備える。【選択図】図１

Description

本発明は、被検体分析方法に関するものである。

被検体を分析する方法として、該被検体に励起光を照射したときに発生するラマン散乱光のスペクトルに基づく方法が知られている。ラマン散乱スペクトルは被検体の分子振動を反映したものであることから、ラマン散乱スペクトルの形状に基づいて被検体を分析することができる。しかし、この分析方法では、通常、ラマン散乱の効率が非常に小さく、被検体が微量である場合には分析が困難である。このことから、従来、この分析方法が実用的に適用される被検体は、鉱物や高密度なプラスチックなどの物質に限定されてきた。

一方、表面増強ラマン散乱（Surface Enhanced Raman Scattering：ＳＥＲＳ）分光は、ラマン散乱効率の大幅な向上により高感度の測定が可能であり、低濃度試料の分析が可能であるとして注目されている。ＳＥＲＳ分光では、励起光が照射された金属微小構造において増強された電場（光子場）を発生させること（第１条件）、および、その増強された電場が到達する金属微小構造のごく近傍に定常的に被検体が存在すること（第２条件）、の２つの主条件が満たされることにより、被検体から高強度のラマン散乱光を発生させることができる。

第１条件を効率よく達成するために、ナノメートルオーダーのサイズの多様な形状の金属微小構造配列体が設計され、この金属微小構造配列体を表面に備える基板（ＳＥＲＳ基板）を利用し、このＳＥＲＳ基板に被検体を滴下するなどして、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが提案されている。また、金属コロイド（例えば、銀コロイド粒子、金コロイド粒子）が分散した分散液を利用し、この金属コロイド分散液に被検体を入れることで、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが提案されている。

ＳＥＲＳ基板を利用する場合および金属コロイド分散液を利用する場合の何れにおいても、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うには上記第２条件が満たされることが必要である。すなわち、増強された電場が得られる領域は、金属微小構造に依存して空間的に制限されており、多くの場合は金属微小構造の間隙に位置する。したがって、第２条件をも満たしてＳＥＲＳ光を効率よく発生させるためには、この制限された間隙に被検体が存在することが必要である。

第２条件を満たすためには、被検体は、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が高く吸着し易いことが必要である。しかし、増強された電場を効率よく発生させることができるＳＥＲＳ基板により第１条件を満たすことができたとしても、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が低く吸着し難い被検体は、金属微小構造の狭隘な間隙に入り込むことができず、第２条件を満たすことができないので、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが困難である。

ＳＥＲＳ基板や金属コロイド分散液を利用して行うＳＥＲＳ分光による被検体の分析は、予めＳＥＲＳ基板や金属コロイド分散液を用意しておく必要がある。ＳＥＲＳ光は特に銀（Ａｇ）を用いる場合に効率よく発生するものの、銀は酸化し易い。分光測定時にＳＥＲＳ基板上の銀の微小構造や銀コロイドの表面に酸化膜が形成されていると、効率的なＳＥＲＳ分光による被検体の分析ができない。また、分光測定時までにＳＥＲＳ基板や金属コロイドが汚染されないようにする必要があり、これらの扱いは容易でない。

特許文献１には、以上のような従来技術が有する問題点を解消することを意図した発明が開示されている。この文献に開示された発明は、高効率なＳＥＲＳ分光による分析を容易に行うことができる。

特開２０１８−２５４３１号公報

特許文献１に開示された発明は、高効率なＳＥＲＳ分光による被検体の分析を容易に行うことができるものの、分析の対象となる被検体が限られている。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、より多くの種類の被検体について高効率なＳＥＲＳ分光による分析を容易に行うことができる方法を提供することを目的とする。

本発明の第１態様の被検体分析方法は、(1) 被検体、金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、(2) 混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、被検体または被検体由来の物質を金属微小構造に付着させる金属微小構造生成ステップと、(3) 支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、(4) ラマン散乱光のスペクトルに基づいて被検体を分析する分析ステップと、を備える。

本発明の第２態様の被検体分析方法は、(1) 金属イオンの溶液および還元剤を混合して中間混合液を作製する混合ステップと、(2) 混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させる金属微小構造生成ステップと、(3) 金属微小構造生成ステップの後に被検体および中間混合液を混合して混合液を作製する第２混合ステップと、(4) 混合液中において被検体または被検体由来の物質を支持体上の金属微小構造に付着させる付着ステップと、(5) 付着ステップの後に支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、(6) ラマン散乱光のスペクトルに基づいて被検体を分析する分析ステップと、を備える。

本発明の第３態様の被検体分析方法は、(1) 金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、(2) 混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させる金属微小構造生成ステップと、(3) 支持体上の金属微小構造を乾燥させる乾燥ステップと、(4) 乾燥ステップの後に被検体または被検体由来の物質を支持体上の金属微小構造に付着させる付着ステップと、(5) 付着ステップの後に支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、(6) ラマン散乱光のスペクトルに基づいて被検体を分析する分析ステップと、を備える。

本発明の第１〜第３の態様では、混合ステップにおいて、ｐＨ調整剤をも混合して混合液を作製するのが好適である。混合ステップにおいて、塩をも混合して混合液を作製するのが好適である。金属微小構造生成ステップにおいて、加湿環境下で支持体を所定時間に亘って静置して金属微小構造を支持体上に生成させるのが好適である。また、測定ステップにおいて、支持体上において金属微小構造を液体に浸漬させた状態とし、その浸漬した金属微小構造に励起光を照射するのが好適である。

本発明によれば、より多くの種類の被検体について高効率なＳＥＲＳ分光による分析を容易に行うことができる。

図１は、第１実施形態の被検体分析方法のフローチャートである。図２は、第２実施形態の被検体分析方法のフローチャートである。図３は、第３実施形態の被検体分析方法のフローチャートである。図４は、各実施例の測定ステップにおいてＳＥＲＳ光スペクトルの測定の際に用いた顕微分光装置１の光学系を示す図である。図５は、各実施例で用いた試料を纏めた表である。図６は、実施例１で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図７は、実施例１〜４で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図８は、実施例５，６で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図９は、実施例７，８で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図１０は、実施例９で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図１１は、実施例１０で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図１２は、実施例１１で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図１３は、実施例１２で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

本実施形態の被検体分析方法は、金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製し、この混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させ、この金属微小構造に被検体または被検体由来の物質を付着させる。そして、支持体上の金属微小構造に励起光を照射して当該励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定し、そのラマン散乱光のスペクトルに基づいて被検体を分析する。以下に、第１〜第３の実施形態の被検体分析方法について説明する。

図１は、第１実施形態の被検体分析方法のフローチャートである。第１実施形態の被検体分析方法は、混合ステップＳ１１、金属微小構造生成ステップＳ１２、洗浄ステップＳ１３、測定ステップＳ１５および分析ステップＳ１６を順に行うことで被検体の分析を行う。第１実施形態の被検体分析方法では、混合ステップＳ１１において、被測定溶液を含む混合液を作製する。

混合ステップＳ１１では、被検体を含む被測定溶液、金属イオンの溶液および還元剤を十分に混合して、混合液を作製する。更にｐＨ調整剤をも混合して混合液を作製してもよい。被測定溶液、金属イオン溶液、還元剤およびｐＨ調整剤の混合の仕方または順序として様々な態様があり得る。被測定溶液、金属イオン溶液、還元剤およびｐＨ調整剤を同時に混合してもよい。また、被測定溶液、金属イオン溶液および還元剤を混合して中間混合液を作製し、次に、この中間混合液およびｐＨ調整剤を混合して最終的な混合液を作製してもよい。また、更に塩をも混合してもよい。ｐＨ調整剤を加えた後に完全な金属微小構造の生成を待たずに被検体を加えてもよい。

被検体は、還元作用の有無を問わず任意であり、例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、4,4'-ビピリジル等である。金属イオンは、還元剤の還元作用により還元され得るものであれば任意であり、例えば金イオンや銀イオン等である。還元剤は、例えば、グルコース水溶液、硫酸鉄(II)水溶液、水素化ホウ素ナトリウム水溶液、ホルムアルデヒド水溶液などである。ｐＨ調整剤は、混合液をアルカリ性とするために混合されるものであり、例えば水酸化カリウム水溶液などである。塩は、金属微粒子の凝集を促すために混合されるものであり、例えば塩化ナトリウムなどである。最終的な混合液として混合される金属イオン溶液、還元剤およびｐＨ調整剤それぞれの量および濃度は、被測定溶液の量および被測定溶液中の被検体の濃度に応じて適切に調製される。

金属微小構造生成ステップＳ１２では、混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、被検体または被検体由来の物質を金属微小構造に付着させる。支持体上の金属微小構造とは、金属微粒子が析出してその凝集体が支持体上に島状に分布している構造である。このとき、混合液の蒸発を防止するために加湿環境下で支持体を所定時間に亘って静置するのが好ましい。

支持体は、中間混合液または混合液を作製する際に用いた容器であってもよいが、容器とは別に用意された基板であってもよく、基板として例えばスライドガラスであってもよい。また、所定パターンで撥水処理したスライドガラスを用いて、このスライドガラス上の撥水処理していない領域において混合液を作製して金属微小構造を生成させてもよい。容器とは別に用意された基板を支持体として用いる場合には、中間混合液およびｐＨ調整剤それぞれを適量だけ基板上に滴下して、マイクロピペット等を用いて基板上で中間混合液とｐＨ調整剤とを十分に混合して最終的な混合液を作製し、基板上で金属微小構造を生成させる。

洗浄ステップＳ１３では、支持体上において金属微小構造が生成されている領域を水（好適には超純水）により洗浄する。この洗浄により、後の測定ステップＳ１５での測定に不要な溶液を除去することができる。なお、この洗浄ステップＳ１３は試料によっては行わなくてもよい。

測定ステップＳ１５では、支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する。励起光照射方向に対してラマン散乱光測定方向は任意であり、後方散乱光および前方散乱光の何れを測定してもよいし、他の方向への散乱光を測定してもよい。また、測定光学系の途中に、ラマン散乱光を選択的に透過させる光フィルタを設けるのが好ましい。励起光は好適にはレーザ光である。励起光が照射された金属微小構造において増強された電場が発生し（第１条件）、その増強された電場が到達する金属微小構造に被検体または被検体由来の物質が付着している（第２条件）ので、測定されるラマン散乱光は、被検体または被検体由来の物質から発生したＳＥＲＳ光である。

支持体上の狭い領域に金属微小構造が生成されている場合には、顕微分光装置を用いて励起光を照射するとともにＳＥＲＳ光スペクトルを測定するのが好ましい。支持体上の金属微小構造が生成されている領域が乾燥している状態で、励起光を照射してＳＥＲＳ光スペクトルを測定してもよい。金属微小構造に付着した被検体または被検体由来の物質が励起光照射により焼損することを抑制する為には、支持体上において金属微小構造を液体（例えば水）に浸漬させた状態とし、その浸漬した金属微小構造に励起光を照射するのが好ましい。この場合、液浸対物レンズを用いるのが好ましい。

分析ステップＳ１６では、ラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルに基づいて被検体を分析する。具体的には、得られたＳＥＲＳ光スペクトルにおいてピークが現れるラマンシフト量の位置および該ピークの高さに基づいて、被検体を分析する。

図２は、第２実施形態の被検体分析方法のフローチャートである。第２実施形態の被検体分析方法は、混合ステップＳ２１、金属微小構造生成ステップＳ２２、第２混合ステップＳ２３、付着ステップＳ２４、測定ステップＳ２５および分析ステップＳ２６を順に行うことで被検体の分析を行う。第２実施形態の被検体分析方法では、金属微小構造生成ステップＳ２２後の第２混合ステップＳ２３において、被測定溶液を含む混合液を作製する。以下では、第１実施形態の被検体分析方法と異なる点について主に説明する。

混合ステップＳ２１では、金属イオンの溶液および還元剤を十分に混合して、中間混合液を作製する。更にｐＨ調整剤または塩をも混合して中間混合液を作製してもよい。混合ステップＳ２１では、被検体を含む被測定溶液を混合しない。

金属微小構造生成ステップＳ２２では、混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させる。

第２混合ステップＳ２３では、金属微小構造生成ステップＳ２２の後に、被検体を含む被測定溶液および中間混合液を混合して混合液を作製する。なお、このときの中間混合液は、金属微小構造生成ステップＳ２２において金属微粒子を生成した後のものであるので、混合ステップＳ２１直後の中間混合液とは濃度が相違する。

付着ステップＳ２４では、混合液中において被検体または被検体由来の物質を支持体上の金属微小構造に付着させる。なお、付着ステップＳ２４後に、支持体上において金属微小構造が生成されている領域を水（好適には超純水）により洗浄してもよい。

第２実施形態における測定ステップＳ２５は、第１実施形態における測定ステップＳ１５と同じである。第２実施形態における分析ステップＳ２６は、第１実施形態における分析ステップＳ１６と同じである。

図３は、第３実施形態の被検体分析方法のフローチャートである。第３実施形態の被検体分析方法は、混合ステップＳ３１、金属微小構造生成ステップＳ３２、乾燥ステップＳ３３、付着ステップＳ３４、測定ステップＳ３５および分析ステップＳ３６を順に行うことで被検体の分析を行う。第３実施形態の被検体分析方法では、乾燥ステップＳ３３後の付着ステップＳ３４において、被検体または被検体由来の物質を乾燥した支持体上の金属微小構造に付着させる。以下では、第２実施形態の被検体分析方法と異なる点について主に説明する。

第３実施形態における混合ステップＳ３１は、第２実施形態における混合ステップＳ２１と同じである。第３実施形態における金属微小構造生成ステップＳ３２は、第２実施形態における金属微小構造生成ステップＳ２２と同じである。

乾燥ステップＳ３３では、支持体上の金属微小構造を乾燥させる。付着ステップＳ３４では、乾燥ステップＳ３３の後に被検体または被検体由来の物質を支持体上の金属微小構造に付着させる。

第３実施形態における測定ステップＳ３５は、第２実施形態における測定ステップＳ２５と同じである。第３実施形態における分析ステップＳ３６は、第２実施形態における分析ステップＳ２６と同じである。

次に、実施例１〜１２について説明する。図４は、各実施例の測定ステップにおいてＳＥＲＳ光スペクトルの測定の際に用いた顕微分光装置１の光学系を示す図である。何れの実施例においても、金属微小構造を支持する支持体としてスライドガラスを用いた。支持体（スライドガラス）２１の表面に、金属微粒子が析出してその凝集体が島状に分布している金属微小構造２２を形成した。この金属微小構造２２に被検体（または被検体由来の物質）２３を付着させた。これら金属微小構造２２および被検体２３を水２４に浸漬させた。

励起光源１１として、波長６３２.８ｎｍのレーザ光を励起光Ｌ_Ｐとして出力するＨｅ-Ｎｅレーザ光源を用いた。励起光源１１から出力された励起光Ｌ_Ｐは、ダイクロイックミラー１２により反射された後、水浸対物レンズ１３を経て金属微小構造２２および被検体２３に照射された。水浸対物レンズ１３の倍率は２０倍であり、開口数は０.４であった。水浸対物レンズ１３を経て試料面に照射されたレーザ光のパワーは７０μＷであった。

励起光Ｌ_Ｐの照射により発生して水浸対物レンズ１３により捕集されたラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）Ｌ_Ｓは、ダイクロイックミラー１２および光フィルタ１４を透過して、分光器１５に入射された。分光器１５は冷却ＣＣＤ検出器を備えたものであり、この分光器１５によりＳＥＲＳ光のスペクトルが測定された。

図５は、各実施例で用いた試料を纏めた表である。実施例１〜９は、第１実施形態の被検体分析方法によるものである。実施例１０〜１２は、第３実施形態の被検体分析方法によるものである。

実施例１〜４では、金属イオン溶液として硝酸銀水溶液（濃度１０ｍＭ）を用い、還元剤としてグルコース水溶液（濃度５ｍＭ）を用い、ｐＨ調整剤として水酸化カリウム水溶液（濃度１０ｍＭ）を用いた。実施例１では、被検体を含む被測定溶液としてアデニン水溶液（濃度０.１２, ０.５９, １.１７, ５.８５, １１.７μＭ）を用いた。実施例２では、被検体を含む被測定溶液としてグアニン水溶液（濃度２４.５μＭ）を用いた。実施例３では、被検体を含む被測定溶液としてチミン水溶液（濃度３８.９μＭ）を用いた。実施例４では、被検体を含む被測定溶液としてシトシン水溶液（濃度３６.０μＭ）を用いた。

実施例１〜４の手順は、図１のフローチャートによるものであり、次のとおりであった。混合ステップＳ１１では、被測定溶液、金属イオン溶液およびｐＨ調整剤それぞれを所定濃度に調整した。支持体としてのスライドガラス上に金属イオン溶液１０μＬを滴下し、この滴下スポットに対して被測定溶液５μＬを更に滴下して、これらをスライドガラス上で混合した。この滴下スポットに対して還元剤５μＬを更に滴下して、これらをスライドガラス上で混合した。そして、この滴下スポットに対してｐＨ調整剤５μＬを更に滴下して、これらをスライドガラス上で混合して混合液を作製した。

金属微小構造生成ステップＳ１２では、加湿環境下でスライドガラス上の液滴を１時間に亘って静置して、混合液中において還元剤の還元作用により金属イオンを還元して金属微小構造をスライドガラス上に生成させるとともに、被検体または被検体由来の物質を金属微小構造に付着させた。

測定ステップＳ１５では、スライドガラス上の金属微小構造に励起光（波長６３２.８ｎｍのＨｅ-Ｎｅレーザ光）を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルを測定した。このとき、顕微分光装置を用いるとともに、スライドガラス上において金属微小構造を超純粋に浸漬させた状態とし、水浸対物レンズを介して、その浸漬した金属微小構造に励起光を照射した。

図６は、実施例１で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。この図において、横軸はラマンシフト量（単位ｃｍ^-1）を表し、縦軸はラマン散乱強度（任意単位）を表す。また、この図において、ＳＥＲＳ光スペクトル毎に縦軸のゼロ点は異なっている。以降のＳＥＲＳ光スペクトルの図においても同様である。この図に示されるように、ＳＥＲＳ光スペクトルにはアデニンに特有のピークが明確に認められ、アデニンが高濃度であるほどピーク値が高い。このピーク値から被検体の定量が可能である。

図７は、実施例１〜４で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。この図では、実施例１の場合のアデニンの濃度は１１.７μＭとした。この図に示されるように、被検体の構造によってＳＥＲＳ光スペクトルの形状は異なる。したがって、ＳＥＲＳ光スペクトルの形状から、被検体の判別が可能であり、また、被測定溶液における化合物の存在比の判別も可能である。なお、通常、これらの実施例で用いた被検体を含む被測定溶液の場合、ここに示した低濃度では、増強効果無しにはラマンスペクトル取得は困難であるが、本法ではラマンスペクトルの取得が可能である。

実施例５，６では、被検体を含む被測定溶液としてアデニン水溶液（濃度１０μＭ）を用い、金属イオン溶液として硝酸銀水溶液（濃度２０ｍＭ）を用いた。実施例５では、還元剤として硫酸鉄(II)水溶液（濃度１００ｍＭ）を用い、ｐＨ調整剤として水酸化カリウム水溶液（濃度１０ｍＭ）を用いた。実施例６では、還元剤として水素化ホウ素ナトリウム水溶液（濃度１０ｍＭ）を用い、ｐＨ調整剤を用いなかった。実施例５，６の手順は、実施例１〜４の手順と同じであった。ただし、実施例６では、混合ステップＳ１１においてｐＨ調整剤を混合しなかった。

図８は、実施例５，６で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。この図に示されるように、還元剤として硫酸鉄(II)水溶液よび水素化ホウ素ナトリウム水溶液の何れを用いた場合にも、スライドガラス上に銀の微小構造が作製され、ＳＥＲＳ光スペクトルにはアデニンに特有のピークが明確に認められた。

実施例７，８では、被検体を含む被測定溶液としてアデニン水溶液（濃度１０μＭ）を用い、金属イオン溶液として硝酸銀水溶液（濃度２０ｍＭ）を用い、還元剤としてホルムアルデヒド水溶液（濃度０.３５％(v/v)）を用い、ｐＨ調整剤として水酸化カリウム水溶液（濃度１０ｍＭ）を用いた。実施例８では、更に塩として塩化ナトリウム水溶液（濃度１００ｍＭ）を用いた。実施例７，８の手順は、実施例１〜４の手順と同じであった。ただし、実施例８では、ｐＨ調整剤を混合した後に３０分間に亘って静置し、その後に塩を更に混合した。

図９は、実施例７，８で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。この図に示されるように、塩化ナトリウムを添加した場合には、ＳＥＲＳ光スペクトルにおけるアデニンに特有のピークが増強された。

実施例９，１０では、被検体を含む被測定溶液としてアデニン水溶液（濃度１０μＭ）を用い、金属イオン溶液として硝酸銀水溶液（濃度１ｍＭ）を用い、還元剤としてグルコース水溶液（濃度１ｍＭ）を用い、ｐＨ調整剤として水酸化カリウム水溶液（濃度１０ｍＭ）を用いた。実施例９の手順は、図１のフローチャートによるものであり、実施例１〜４の手順と同じであった。

実施例１０の手順は、図３のフローチャートによるものであり、次のとおりであった。混合ステップＳ３１では、金属イオン溶液およびｐＨ調整剤それぞれを所定濃度に調整した。支持体としてのスライドガラス上に金属イオン溶液１０μＬを滴下し、この滴下スポットに対して還元剤５μＬを更に滴下して、これらをスライドガラス上で混合した。そして、この滴下スポットに対してｐＨ調整剤５μＬを更に滴下して、これらをスライドガラス上で混合して混合液を作製した。

金属微小構造生成ステップＳ３２では、加湿環境下でスライドガラス上の液滴を１時間に亘って静置して、混合液中において還元剤の還元作用により金属イオンを還元して金属微小構造をスライドガラス上に生成させた。この１時間静置の後に、乾燥ステップＳ３３で、スライドガラス上の上澄を除去して、スライドガラス上の金属微小構造を乾燥させた。その後の付着ステップＳ３４で、スライドガラス上の金属微小構造に対して被測定溶液５μＬを滴下して、被検体または被検体由来の物質を金属微小構造に付着させた。

測定ステップＳ３５では、スライドガラス上の金属微小構造に励起光（波長６３２.８ｎｍのＨｅ-Ｎｅレーザ光）を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルを測定した。このとき、顕微分光装置を用いるとともに、スライドガラス上において金属微小構造を超純粋に浸漬させた状態とし、水浸対物レンズを介して、その浸漬した金属微小構造に励起光を照射した。

図１０は、実施例９で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図１１は、実施例１０で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。これらの図に示されるように、図１および図３の何れのフローチャートによる場合であっても、ＳＥＲＳ光スペクトルにはアデニンに特有のピークが明確に認められた。また、図３のフローチャートによる手順より、図１のフローチャートによる手順の方が、アデニンに特有のピークがより明確であった。

実施例１１では、被検体を含む被測定溶液として4,4'-ビピリジル水溶液（濃度１, １０, １００μＭ）を用い、金属イオン溶液として硝酸銀水溶液（濃度１０ｍＭ）を用い、還元剤としてホルムアルデヒド水溶液（濃度０.３７％(v/v)）を用い、ｐＨ調整剤として水酸化カリウム水溶液（濃度１０ｍＭ）を用いた。実施例１１の手順は、図３のフローチャートによるものであり、実施例１０の手順と同じであった。ただし、金属微小構造生成ステップＳ３２における静置の時間を３０分間とした。

図１２は、実施例１１で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。この図に示されるように、被検体が4,4'-ビピリジルである場合にも、ＳＥＲＳ光スペクトルには4,4'-ビピリジルに特有のピークが明確に認められ、4,4'-ビピリジルが高濃度であるほどピーク値が高い。このピーク値から被検体の定量が可能である。

実施例１２では、被検体を含む被測定溶液として4,4'-ビピリジル水溶液（濃度１０μＭ）を用い、金属イオン溶液として硝酸銀水溶液（濃度１ｍＭ）を用い、還元剤としてグルコース水溶液（濃度１ｍＭ）を用い、ｐＨ調整剤として水酸化カリウム水溶液（濃度１０ｍＭ）を用いた。実施例１１に対して、実施例１２では、金属イオン溶液の濃度を１０分の１とした。実施例１２の手順は、図３のフローチャートによるものであり、実施例１０の手順と同じであった。

図１３は、実施例１２で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。この図に示されるように、実施例１１と比較して金属イオン溶液の濃度が１０分の１であっても、ＳＥＲＳ光スペクトルには4,4'-ビピリジルに特有のピークが明確に認められた。

以上のとおり、本実施形態の被検体分析方法は、混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させ、この金属微小構造に被検体または被検体由来の物質を付着させ、これに対する励起光照射により発生するラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルを測定して、このスペクトルに基づいて被検体を分析する。従来の分析方法と比べると、本実施形態の被検体分析方法は簡便かつ迅速に分析を行うことができる。

従来の分析方法においては、ＳＥＲＳ分光が可能な被検体は、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が高く吸着し易いものに限られている。また、特許文献１に開示された発明では、ＳＥＲＳ分光が可能な被検体は還元作用を有するものに限られている。これに対して、本実施形態の被検体分析方法では、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が低く吸着し難い被検体であっても、また、還元作用を有しない被検体であっても、金属微小構造を作製することができ、その金属微小構造の狭隘な間隙に被検体または被検体由来の物質が入り込むことができ、第２条件を満たすことができるので、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが可能となる。

従来の分析方法においては、ＳＥＲＳ光スペクトル測定に際して事前にＳＥＲＳ基板や金属コロイドを用意しておくことが必要である。これに対して、本実施形態の被検体分析方法は、ＳＥＲＳ光スペクトル測定の直前に、金属微小構造の生成および被検体（または被検体由来の物質）の金属微小構造への付着を行うことができる。したがって、本実施形態の被検体分析方法は、酸化しやすい銀による金属微小構造を生成する場合であっても、銀の酸化の問題を抑制することができ、効率的なＳＥＲＳ分光を行うことができる。

本実施形態の被検体分析方法は、ＳＥＲＳ基板や金属コロイドの事前用意が不要であるので、これらの汚染が問題となることはなく、被検体の分析を容易に行うことができる。また、本実施形態の被検体分析方法は、ＳＥＲＳ基板や金属コロイドと比べて安価に入手可能な金属イオン溶液を用いるので、この点でも容易に被検体の分析を行うことができる。

また、従来の金属コロイド分散液を利用する分析方法は、被検体が微量である場合にはＳＥＲＳ分光が困難である。これに対して、本実施形態の被検体分析方法は、被検体が微量であってもＳＥＲＳ分光が可能である。

１…顕微分光装置、１１…励起光源、１２…ダイクロイックミラー、１３…水浸対物レンズ、１４…光フィルタ、１５…分光器、２１…支持体、２２…金属微小構造、２３…被検体（または被検体由来の物質）、２４…水。

Claims

被検体、金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、
前記混合液中の前記還元剤の還元作用により前記混合液中の前記金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、前記被検体または前記被検体由来の物質を前記金属微小構造に付着させる金属微小構造生成ステップと、
前記支持体上の前記金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、
前記ラマン散乱光のスペクトルに基づいて前記被検体を分析する分析ステップと、
を備える被検体分析方法。
金属イオンの溶液および還元剤を混合して中間混合液を作製する混合ステップと、
前記混合液中の前記還元剤の還元作用により前記混合液中の前記金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させる金属微小構造生成ステップと、
前記金属微小構造生成ステップの後に被検体および前記中間混合液を混合して混合液を作製する第２混合ステップと、
前記混合液中において前記被検体または前記被検体由来の物質を前記支持体上の前記金属微小構造に付着させる付着ステップと、
前記付着ステップの後に前記支持体上の前記金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、
前記ラマン散乱光のスペクトルに基づいて前記被検体を分析する分析ステップと、
を備える被検体分析方法。
金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、
前記混合液中の前記還元剤の還元作用により前記混合液中の前記金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させる金属微小構造生成ステップと、
前記支持体上の前記金属微小構造を乾燥させる乾燥ステップと、
前記乾燥ステップの後に被検体または前記被検体由来の物質を前記支持体上の前記金属微小構造に付着させる付着ステップと、
前記付着ステップの後に前記支持体上の前記金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、
前記ラマン散乱光のスペクトルに基づいて前記被検体を分析する分析ステップと、
を備える被検体分析方法。
前記混合ステップにおいて、ｐＨ調整剤をも混合して前記混合液を作製する、
請求項１〜３の何れか１項に記載の被検体分析方法。
前記混合ステップにおいて、塩をも混合して前記混合液を作製する、
請求項１〜４の何れか１項に記載の被検体分析方法。
前記金属微小構造生成ステップにおいて、加湿環境下で前記支持体を所定時間に亘って静置して前記金属微小構造を前記支持体上に生成させる、
請求項１〜５の何れか１項に記載の被検体分析方法。
前記測定ステップにおいて、前記支持体上において前記金属微小構造を液体に浸漬させた状態とし、その浸漬した前記金属微小構造に励起光を照射する、
請求項１〜６の何れか１項に記載の被検体分析方法。